KR20040091616A

KR20040091616A - Ｖｈ 및 ｖｌ 도메인으로부터 멀티특이성, 다원자가제제를 제조하는 방법

Info

Publication number: KR20040091616A
Application number: KR10-2004-7010211A
Authority: KR
Inventors: 로씨에드먼드; 장치엔-씽켄; 골든베르그다비드
Original assignee: 이뮤노메딕스, 인코오포레이티드; 아이비씨 파마슈티컬스
Priority date: 2001-12-26
Filing date: 2002-12-26
Publication date: 2004-10-28
Also published as: IL162732A0; EP1468097A2; CA2471868A1; EP1468097A4; MXPA04006327A; WO2003057829A2; WO2003057829A3; RU2004122702A; PL372144A1; JP2005514030A; BR0215403A; US20030162709A1; AU2002364531A1

Abstract

본 발명은 멀티특이성(multi-specific), 다원자가(multivalent) 결합 단배질 및 V_H및 V_L도메인으로부터 이들을 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 결합 단백질은 헵텐 부분과 결합하는 적어도 하나 이상의 결합 부위 및 표적 항원과 결합하는 적어도 둘 이상의 결합 부위, 즉 적어도 세 개 이상의 결합 부위를 가진다. 또 본 발명은 히스타민-숙시닐-글리실(histamine-succinyl-glycyl, HSG) 부분을 포함하는 분자에 대하여 친화력을 가지는 적어도 하나 이상의 결합 부위 및 암태아성 항원(carcinoembryonic antigen, CEA)에 대하여 친화력을 가지는 적어도 둘 이상의 결합 부위를 가지는 양특이성, 삼원자가의 헤테로다이머(trivalent heterodimers), 및 HSG 부분을 포함하는 분자에 대하여 친화력을 가지는 적어도 하나 이상의 결합 부위, CEA에 대하여 친화력을 가지는 적어도 하나 이상의 결합 부위 및 금속 킬레이트 화합물 인듐-DTPA에 대하여 친화력을 가지는 적어도 하나의 결합 부위를 가지는 삼특이성(trispecific), 삼원자가의 헤테로다이머에 관한 것이다. 또한 본 발명은 숙주 세포 내에서 상기의 기능성 재조합 단백질을 발현하기 위해 사용되는 재조합 벡터에 관한 것이다.

Description

ＶＨ 및 ＶＬ 도메인으로부터 멀티특이성, 다원자가 제제를 제조하는 방법{Methods of generating multispecific, multivalent agents from VH and VL domains}

특정한 모노클로날 항체 및 설계된 항체 또는 항체 단편인 인체에서 제조되는 결합 단백질(Man-made binding protein)은 암, 자가면역 질환, 감염성 질환, 염증성 질환 및 심장혈관 질환을 포함하는 여러 가지 인간 질병의 검출 및 치료에서 그 가치를 보이고 있으며, 폭넓게 시험되고 있다[Filpula and McGuire, Exp. Opin. Ther. Patents(1999) 9: 231-245]. 예를 들면, 방사성 동위원소로 라벨된 항체를 통상적으로 사용하는 검출기를 사용하여 환자에게 주입한 후 종양을 가시화하였다. 항체 또는 항체-유래 제제(antibody-derived agent)의 임상적 이용은 그들의 특이 표적 항체에 결합하는 능력에 첫 번째로 의지한다. 특히 진단용 또는 치료용 제제가 인체내 정상 조직에 독성이 있을 경우, 선택성은 동위원소, 약물, 독소, 사이토카인, 호르몬, 성장인자, 접합체 방사성 핵종, 또는 금속과 같은 진단용 또는 치료용 제제를 인간 질병의 검출 또는 치료 단계에서 표적 위치에 운반하기 위해 필수적이다.

항체 시스템의 주요 제한은 Goldenberg, The American Journal of Medicine(1993) 94: 298-299에서 논의하고 있다. 검출 및 치료 기술에서 바람직한 매개변수는 표적 세포가 존재하고 정상세포 주변에서 방사성이 있는 물질과 특이적으로 결합하는 항체의 농도 비율과 같은 섭취율이 존재하는 부위에 특이적으로 위치하는 주입약물의 투여량이다. 항체가 혈류로 주입될 경우, 대사되고 분비된 많은 분획들을 통과한다. 상기 항체는 인체의 나머지 부분을 통과하는 동안 표적 세포 항원에 부착하고 결합할 수 있어야 한다. 항원 표적화를 조절하는 요소는 항원위치, 크기, 항원 농도, 항원 접근 가능성(accessibility), 병리 조직의 세포 구성 및 표적화 항체들의 약물 동력학을 포함한다. 항체에 의한 종양세포 표적화에 특이적으로 작용하는 다른 요소들은 종양세포 및 다른 조직 내에서의 표적 항체 발현 및 방사성 동위원소로 라벨된 항체의 느린 혈액-제거율(blood-clearance)로 인한 골수 독성을 포함한다.

표적화된 종양세포에 의해 촉진되는 표적화 항체의 양은 종양내 압력(intratumoral pressure) 뿐만 아니라 종양세포의 항체 침투에서 혈관신생(vascularization) 및 문맥(barrier)에 의해 영향을 받는다. 간, 신장 또는 골수와 같은 비표적 기관(non-target organs)에 의한 비특이적 섭취는 방사성면역치료(radioimmunotherapy)와 같은 기술에서 또 다른 주요 제한이 있다. 특히, 골수의 조사(irradiation)는 종종 투여량-제한 독성을 유발한다.

"친화력 증강 시스템(Affinity Enhancement System, 이하 'AES'라 한다)"으로 알려진 한 용액은 항체 운반 진단용 또는 치료용 방사성 동위원소에 의해 종양세포를 표적화하는 결손들을 극복하기 위해 설계된 것이다[미국특허 제5,256,395호 (1993), Barbetet al., Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals (1999) 14 : 153-166]. 상기 AES는 방사성 동위원소로 라벨된 이원자가(bivalent) 헵텐 및 표적 종양세포와 방사성 헵텐을 모두 인지하는 항-종양/항-헵텐 양특이성항체(bispecific antibody)를 요구한다. 이 기술은 환자에게 양특이성 항체를 주입하고 표적 종양세포에 국한된 양특이성 항체를 허용하는 것을 포함한다. 혈류로부터 결합되지 않은 항체를 충분한 시간 동안 제거한 후 방사성 동위원소로 라벨된 헵텐을 투여한다. 상기 헵텐은 진단용 또는 치료용 이익을 얻기 위한 표적 세포 부위에 위치하는 항체-항원 복합체에 결합한다. Barbet은 나중에 종양세포 표면에 결합할 때 이원자가 헵텐이 양특이성 항체와 가교결합할 수 있다는 가능성을 언급하고 있다. 결과적으로, 방사성 동위원소로 라벨된 복합체는 보다 안정적으로 보다 오랜 기간 동안 종양세포에 머물러 있다.

부가적으로, 양특이성 또는 삼특이성 트리아바디(triabodies)를 생성하기 위한 지금까지의 방법에서 문제들이 제기되었다. 이러한 종래 방법은 각각 V_L도메인에 직접 결합된 V_H도메인으로 이루어진 세 가지 별개의 폴리펩티드의 합성을 말한다. V_H1/V_L1의 특이성에 대하여 이원자가이고 V_H2/V_L2의 특이성에 대하여 일원자가인 양특이성 트리아바디를 제조하기 위하여, V_H1-V_L2, V_H2-V_L1및 V_H1-V_L1가 되는 세 개의 폴리펩티드를 합성하여야 한다. 세 가지 특이성(V_H1/V_L1, V_H2/V_L2및 V_H3/V_L3)의 각각에 대하여 일원자가인 삼특이성 트리아바디를 제조하기 위하여, V_H1-V_L2, V_H2-V_L3및 V_H3-V_L1가 되는 세 개의 폴리펩티드를 합성하여야 한다. 각 폴리펩티드의 어느 하나의 디자인이 자기 자신과 또는 다른 두 개의 폴리펩티드와 결합하여 가능한 트리아바디를 생성하기 때문에, 10개의 다른 트리아바디가 제조되어도 그 중에서 하나만이정확한 구조를 가지게 된다. 테트라바디 개념에 기초한 멀티특이성 테트라머(tetramer)를 제조하기 위한 동일한 접근은 네 번째 폴리펩티드를 첨가하여 가능한 부산물의 수만 늘어가게 된다.

더욱이, 직렬 디아바디(tandem diabody)와 같은 멀티특이성, 다원자가 디자인은 잠재적 결점을 제공하기도 한다. 다른 항체들의 선택으로 인해 두 개의 다른 항체의 두 개의 V_H및 V_L도메인으로 이루어진 폴리펩티드가 각각의 특이성에 대하여 일원자가로 양특이성 단일 사슬을 생성하기 위해 스스로 변형될 수 있다면 쉽사리 호모다이머(homodimer)를 생성하지 못할 것이다. 결국, 소수의 구성체는 각각의 경우에 직렬 디아바디 대신에 양특이성 단일 사슬 구조를 생성하는 직렬 디아바디 디자인을 기초로 제조되어 왔다(Rossi and Chang, 비공개된 결과임). 따라서, V_H및 V_L도메인 사슬내의 쌍은 같은 폴리펩티드에 두 개의 유형이 존재할 경우, 특히, 동종의 V_H및 V_L도메인 사이의 거리가 충분히 멀고 유동적일 경우에 별개의 가능성이 존재한다.

두 개의 다른 Fab 단편의 화학적 가교결합에 의해 제조한 양특이성, 다원자가 항체는 동물 모델 및 인간 환자에서 종양세포 표적화를 개선하기 위한 AES의 사용을 확인하기 위하여 적당한 이원자가 헵텐과 함께 성공적으로 사용하여 왔다. 그러나, 상기와 같이 설계된 항체가 AES를 위한 장점을 가지는지 알아보기 위한 재조합 DNA 기술에 의한 양특이성 항체의 제조를 위한 기술의 필요성이 대두되고 있다. 특히, 표적화된 항원, 혈액에서의 빠른 제거율, 및 독성 약학에서의 정상 조직과세포의 최적 방어에서 섭취를 증가시키는 항체-기반 제제(antibody-based agent)의 필요성이 대두되고 있다. 더욱이, 다원자가 및 멀티특이성의 scFv-기저 제제를 생성하는 것과 관련된 문제를 극복한 결합 단백질에 대한 필요성이 대두되고 있다.

본 발명은 멀티특이성(multi-specific), 다원자가(multivalent) 결합 단배질 및 V_H및 V_L도메인으로부터 이들을 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 결합 단백질은 헵텐 부분과 결합하는 적어도 하나 이상의 결합 부위 및 표적 항원과 결합하는 적어도 둘 이상의 결합 부위, 즉 적어도 셋 이상의 결합 부위를 가진다. 또 본 발명은 히스타민-숙시닐-글리실(histamine-succinyl-glycyl, HSG) 부분을 포함하는 분자에 대하여 친화력을 가지는 적어도 하나 이상의 결합 부위 및 암태아성 항원(carcinoembryonic antigen, CEA)에 대하여 친화력을 가지는 적어도 둘 이상의 결합 부위를 가지는 양특이성, 삼원자가의 헤테로다이머(trivalent heterodimers), 및 HSG 부분을 포함하는 분자에 대하여 친화력을 가지는 적어도 하나 이상의 결합 부위, CEA에 대하여 친화력을 가지는 적어도 하나 이상의 결합 부위 및 금속 킬레이트 화합물 인듐-DTPA에 대하여 친화력을 가지는 적어도 하나의 결합 부위를 가지는 삼특이성(trispecific), 삼원자가의 헤테로다이머에 관한 것이다. 또한 본 발명은 숙주(바람직하게는 미생물 숙주) 내에서 상기의 기능성 결합 단백질을 발현하기 위해 사용되는 재조합 벡터에 관한 것이다.

또한 본 발명은 헵텐 부분 및 표적 항원에 결합하는 양특이성, 삼원자가 헤테로다이머 및 숙주(바람직하게는 미생물 숙주) 내에서 상기의 기능성 재조합 단백질을 발현하기 위해 사용되는 재조합 벡터에 관한 것이다.

또 본 발명은 HSG 부분을 포함하는 분자에 대하여 친화력을 가지는 적어도 하나 이상의 결합 부위 및 CEA에 대하여 친화력을 가지는 적어도 둘 이상의 결합 부위를 가지는 양특이성, 삼원자가 헤테로다이머 및 숙주(바람직하게는 미생물 숙주) 내에서 상기의 기능성 헤테로다이머를 발현하기 위해 사용되는 재조합 벡터에 관한 것이다. 이러한 헤테로다이머는 재조합 DNA 기술을 통해 제조되고, HSG 및 CEA에 대하여 특이 친화력을 보이는 신규한 AES를 제작한다.

또한 본 발명은 HSG 부분을 포함하는 분자에 대하여 친화력을 가지는 적어도 하나 이상의 결합 부위, CEA에 대하여 친화력을 가지는 적어도 하나 이상의 결합 부위 및 금속 킬레이트 화합물 인듐-DTPA에 대하여 친화력을 가지는 적어도 하나 이상의 결합 부위를 가지는 삼특이성, 삼원자가 헤테로다이머에 관한 것이다. 본 발명에서는 미생물 숙주 내에서 상기의 기능성 헤테로다이머를 발현하기 위해 사용되는 재조합 벡터를 포함한다. 이러한 헤테로다이머는 재조합 DNA 기술을 통해 제조되고, 신규한 AES를 제작한다.

또한 본 발명은 표적에 대한 진단용 제제, 치료용 제제 또는 이들의 조합을 운반하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 제제의 필요에서 피시험체에 결합하는 단백질을 투여하는 단계, 피시험체의 혈류를 제거하기 위한 비결합 단백질의 양에 대한 충분한 시간의 준비하는 단계 및 진단용 또는 치료용 제제를 포함하는 운반 물질을 투여하는 단계를 포함한다. 더 나아가 본 발명은 표적에 제제를 운반하는방법으로 인간 질병을 검출하거나 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 목적은 헵텐 부분과 항원에 결합하는 능력을 가지는 결합 단백질을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 멀티특이성 항체를 인코딩하는 DNA의 서열을 포함하고 미생물 숙주 세포에서 쉽게 발현되는 벡터를 제공하는 것이다. 또한 본 발명의 목적은 재조합 DNA 기술에 의해 헤테로다이머를 제조하는 방법을 제공하는 것이다. 상기 방법은 적절한 배지에서 숙주 세포를 배양하는 방법 및 헤테로다이머를 분리하는 방법을 포함한다. 또한 본 발명은 도 4 내지 도 7(Seq IDs)에서 특정한 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 cDNA 클론의 그룹에서 선택된 핵산 분자에 관한 것이다. 679-scFv-L5 및 hMN14-scFv-L5의 핵산을 코딩하는 DNA 서열 및 이에 상응하여 인코드되는 아미노산 서열은 각각 도 4 및 도 6(Seq IDs)에 나타내었다. m734 V_H및 V_L을 코딩하는 DNA는 도 7에 나타내었다.

본 발명의 분야

도 1은E. coli에서 679-scFv-L5 발현 플라스미드로부터 합성되고 679 헤테로다이머를 생성하는 679 단일 사슬 Fv(scFv) 폴리펩티드의 모식도이다. 프로세싱(processing)되지 않은 폴리펩티드의 유전자 구조는 pelB 단일 펩티드, 5개의 아미노산 연결기인 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(G₄S)에 의해 커플된 679V_H및 V_K코딩 서열, 및 카르복실 말단의 6개의 히스티딘 친화성 테그를 포함한다. 또한 상기 도면은 pelB 리더 펩티드의 단백질 가수분해 제거 후 성숙한 폴리펩티드를 보여주고, HSG 결합 부위를 포함하는 679 헤테로다이머를 보여준다.

도 2는E. coli에서 hMN14-scFv-L5 발현 플라스미드로부터 합성되고 hMN14 헤테로다이머를 생성하는 hMN14-scFv 폴리펩티드의 모식도이다. 프로세싱(processing)되지 않은 폴리펩티드의 유전자 구조는 pelB 단일 펩티드, 5개의 아미노산 연결기인 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(G₄S)에 의해 커플된 hMN14 V_H및 V_K코딩 서열, 및 카르복실 말단의 6개의 히스티딘 친화성 테그를 포함한다. 또한 상기 도면은 pelB 리더 펩티드의 단백질 가수분해 제거 후 성숙한 폴리펩티드를 보여주고, CEA 결합 부위를 포함하는 hMN14 헤테로다이머를 보여준다.

도 3은E. coli에서 734-scFv-L5 발현 플라스미드로부터 합성되고 734 헤테로다이머를 생성하는 m734-scFv 폴리펩티드의 모식도이다. 프로세싱(processing)되지 않은 폴리펩티드의 유전자 구조는 pelB 단일 펩티드, 5개의 아미노산 연결기인 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(G₄S)에 의해 커플된 734 V_H및 V_K코딩 서열, 및 카르복실 말단의 6개의 히스티딘 친화성 테그를 포함한다. 또한 상기 도면은 pelB 리더 펩티드의 단백질 가수분해 제거 후 성숙한 폴리펩티드를 보여주고, 금속 킬레이트 화합물 인듐-DTPA 결합 부위를 포함하는 734 헤테로다이머를 보여준다.

도 4는 679-scFv-L5를 코딩하는 핵산 서열 및 인코드되는 아미노산 서열을 보여준다. 1-66은 pelB 리더 펩티드를 코딩하는 서열이다. 70-426은 679V_H를 코딩하는 서열이다. 427-441은 연결기 펩티드(GGGGS)를 코딩하는 서열이다. 442-780은679V_K를 코딩하는 서열이다. 787-804는 6개의 히스티딘 친화성 테그를 코딩하는 서열이다.

도 5는 h679-scFv-L5를 코딩하는 핵산 서열 및 인코드되는 아미노산 서열을 보여준다. 1-66은 pelB 리더 펩티드를 코딩하는 서열이다. 70-426은 h679V_H를 코딩하는 서열이다. 427-441은 연결기 펩티드(GGGGS)를 코딩하는 서열이다. 442-780은 h679V_K를 코딩하는 서열이다. 787-804는 6개의 히스티딘 친화성 테그를 코딩하는 서열이다.

도 6은 hMN14-scFv-L5를 코딩하는 핵산 서열 및 인코드되는 아미노산 서열을 보여준다. 1-66은 pelB 리더 펩티드를 코딩하는 서열이다. 70-423은 hMN14 V_H를 코딩하는 서열이다. 424-438은 연결기 펩티드(GGGGS)를 코딩하는 서열이다. 439-759은 hMN14 V_K를 코딩하는 서열이다. 766-783는 6개의 히스티딘 친화성 테그를 코딩하는 서열이다.

도 7은 m734 V_H및 V_L을 코딩하는 핵산 서열 및 인코드되는 아미노산 서열을 보여준다.

도 8A 및 도 8B는 TS1의 V_H사슬을 코딩하는 핵산 서열 및 추정된 아미노산 서열을 보여준다. 1-63은 pelB 리더 펩티드를 코딩하는 서열이다. 90-405는 hMN14 V_H를 코딩하는 서열이다. 469-819는 m734 V_H를 코딩하는 서열이다. 866-1222는 m679V_H를 코딩하는 서열이다.

도 9A 및 도 9B는 TS1의 V_L사슬을 코딩하는 핵산 서열 및 추정된 아미노산 서열을 보여준다. 1-63은 pelB 리더 펩티드를 코딩하는 서열이다. 70-408은 m679 V_K를 코딩하는 서열이다. 452-768은 m734 V_L을 코딩하는 서열이다. 829-1149는 hMN14 V_K를 코딩하는 서열이다.

본 발명의 하나의 실시예는 멀티특이성(multi-specific), 다원자가(multivalent) 결합 단배질 및 V_H및 V_L도메인으로부터 이들을 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 결합 단백질은 헵텐 부분과 결합하는 적어도 하나 이상의 결합 부위 및 표적 항원과 결합하는 적어도 둘 이상의 결합 부위, 즉 적어도 세 개 이상의 결합 부위를 가진다. 또 본 발명은 히스타민-숙시닐-글리실(histamine-succinyl-glycyl, HSG) 부분을 포함하는 분자에 대하여 친화력을 가지는 적어도 하나 이상의 결합 부위 및 암태아성 항원(carcinoembryonic antigen, CEA)에 대하여 친화력을 가지는 적어도 둘 이상의 결합 부위를 가지는 양특이성, 삼원자가의 헤테로다이머(trivalent heterodimers), 및 HSG 부분을 포함하는 분자에 대하여 친화력을 가지는 적어도 하나 이상의 결합 부위, CEA에 대하여 친화력을 가지는 적어도 하나 이상의 결합 부위 및 금속 킬레이트 화합물 인듐-DTPA에 대하여 친화력을 가지는 적어도 하나의 결합 부위를 가지는 삼특이성(trispecific), 삼원자가의 헤테로다이머에 관한 것이다. 또한 본 발명은 미생물 숙주 세포 내에서 상기의 기능성 헤테로다이머를 발현하기 위해 사용되는 재조합 벡터에 관한 것이다.

구조적으로, 모든 항체들은 네 개의 폴리펩티드 사슬을 함유하는 Y 모양의 유닛 하나 또는 그 이상의 복사 서열들로 이루어진다. 두 개의 사슬은 중쇄(重鎖, heavy chain)라 불리는 폴리펩티드의 복사 서열과 일치하고, 두 개의 사슬은 경쇄(輕鎖, light chain)라 불리는 폴리펩티드의 복사 서열과 일치한다. 두 개의 중쇄는 하나 또는 그 이상의 이황화물 결합(disulfide bond)으로 연결되어 있고, 각각의 경쇄는 하나의 이황화물 결합으로 중쇄 중 하나와 연결되어 있다. 각 사슬은 각각 중쇄 및 경쇄에 대한 V_H및 V_L이라는 N-말단 가변 도메인 및 하나의 항원 결합 부위를 형성하는 Fv 단편이라는 V_H및 V_L한 쌍의 비공유 결합을 가진다.

분리된 Fv 단편은 낮은 단백질 농도 및 생리조건[Glockshuberet al., Biochemistry (1990) 29: 1362-1367]에서 분리되는 경향이 있어서 실제로 많이 사용되지 않는다. 안정성을 개선하고 잠재적 사용을 증가하기 위하여, 재조합 단일사슬 Fv(scFv) 단편을 제조하고, V_H도메인(또는 V_L도메인)의 C-말단이 가변 길이의 펩티드 연결기를 통해 V_L도메인(또는 V_H도메인)과 연결되어 있음을 광범위하게 연구하였다[Hudson and Kortt, J. Immunological methods (1999) 231: 177-189 참조]. scFv는 미국 특허 제4,946,778호(1990) 및 제5,132,405호(1992)에 개시되어 있는 방법으로 제조할 수 있다.

12개 이상의 아미노산 잔기의 연결기를 가지는 길이의 scFv(예를 들면, 15- 또는 18-잔기 연결기)는 같은 사슬의 V_H및 V_L도메인 사이에서 상호작용하고, 일반적으로 모노머, 헤테로다이머 및 적은 양의 고분자량 다량체(multimer)의 혼합물을 생성한다[미국 특허 제4,642,334호(1987); Korttet al., Eur. J. Biochem. (1994) 221: 151-157]. 그러나, 5개 이하의 아미노산 잔기의 연결기를 가지는 scFv는 다른 사슬의 V_H및 V_L도메인과 쌍을 이루려는 힘에 의해 같은 사슬의 V_H및 V_L도메인이 분자내에서 쌍을 이루는 것을 방해한다[Atwellet al., Protein Engineering (1999) 12: 597-604]. 0에서 2개의 아미노산 잔기의 연결기와 트리머(trimeric, '트리아바디(triabodies)'라 한다), 테트라머(tetrameric, '테트라바디(tetrabodies)'라 한다) 또는 scFv의 올리고머 구조가 유리하지만, 올리고머화 반응의 정확한 패턴은 연결기 길이 이외에 V-도메인들의 방향(orientation) 및 조성물에 의존하여 나타난다. 예를 들면, O-잔기 연결기와 예비도메인으로 트리머(V_H에서 V_L방향) 또는 테트라머(V_L에서 V_H방향)를 생성하는항-뉴라미니다제(anti-neuraminidase) 항체 NC10의 scFv가 있다[Dolezalet al., Protein Engineering (2000) 13: 565-574]. 1- 및 2-잔기 연결기와 NC10로 구성된 scFv을 제조하기 위하여, V_H에서 V_L방향으로 예비도메인 디아바디를 생성하였고[Atwellet al., Protein Engineering (1999) 12: 597-604]; 대조적으로, V_L에서 V_H방향의 테트라머, 트리머, 다이머 및 고분자량 멀티머의 혼합물을 생성하였다[Dolezalet al., Protein Engineering (200) 13: 565-574]. V_H에서 V_L방향의 항-CD19 항체 HD37로 구성된 scFv를 제조하기 위하여, O-잔기 연결기는 전적으로 트리머만을 생성하였고, 1-잔기 연결기는 전적으로 테트라머만을 생성하였다[Le Gallet al., FEBS Letters (1999) 453: 164-168].

둘 이상의 동일한 scFv 분자들의 비공유결합은 단량체이지만 단일특이성이고, 둘 이상의 다른 scFv 분자의 유사 결합으로 적당히 구성된다면, 기능성 멀티특이성(multispecific) scFv 멀티머를 생성할 수 있는 기능성 디아바디, 트리아바디(triabody) 및 테트라바디를 생성할 수 있다. 다원자가를 가지는 단일 특이성 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디는 5개 이하의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드 연결기를 사용하여 얻을 수 있다. 일반적으로 양특이성 디아바디는 하나의 항체로부터 또 다른 항체의 V_L도메인에 짧은 연결기로 연결되는 각각의 V_H도멘인으로 구성되는 두 개의 다른 scFv의 헤테로다이머이다. 여러 가지 양특이성 디아바디는 V_H1-연결기-V_L2를 포함하는 재조합 유전자 구조물의 하나의 시스트론 및 V_H2-연결기-V_L1을 포함하는 두번째 재조합 유전자 구조물을 가지는 또 다른 시스트론을 포함하는 다이-시스트론(di-cistronic) 발현 벡터를 사용하여 제조하였다[Holligeret al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90: 6444-6448; Atwellet al., Molecular Immunology (1996) 33: 1301-1302; Holligeret al., Nature Biotechnology (1997) 15: 632-631; Helfrichet al., Int. J. Cancer (1998) 76: 232-239; Kipriyanovet al., Int. J. Cancer (1998) 77: 763-772; Holigeret al., Cancer Research (1999) 59: 2909-296]. scFv를 구성하는 방법은 미국특허 제4,946,778호(1990) 및 제5,132,405호(1992)에 개시되어 있다. 상기에서 언급한 다가 및 멀티특이성의 scFv 기초 제제를 제조하는 방법은 미국특허 제5,837,242호(1998) 및 제5,844,094호(1998) 및 국제특허 제WO 98/44001호(1998)에서 양특이성 디아바디를 기재하고 있으며, PCT 국제출원 제PCT/DE99/01350호에서는 직렬 디아바디에 대하여 기재하고 있다. 양특이성 항체는 재조합 기술, 화학작용의 접합 및 콰드로마(quadroma) 기술과 같은 방법으로 제조할 수 있다. 적어도 두 개의 항체에서 유래하는 V_H도메인을 포함하는 하나의 사슬과 이에 상응하는 V_L도메인을 포함하는 또 다른 사실인 두 개의 폴리펩티드 사슬을 구성하여 다원자가 멀티특이성 scFv 기저 제제를 제조하는 방법은 미국특허 제55,989,830호(1999) 및 제6,239,259호(2001)에 개시되어 있다.

V_H및 V_L도메인으로부터 멀티특이성 및 다가 항원 결합 단백질을 제조하는 또 다른 방법은 미국특허 제5,989,830호 및 제6,239,259호에 개시되어 있다. 이러한 다원자가 및 멀티특이성 항원 결합 단백질은 펩티드 연결기에 의한 시리즈에서 연결되는 둘 이상의 V_H도메인(같거나 또는 다른 항체로부터)으로 구성된 하나의 폴리펩티드 사슬 및 펩티드 연결기에 의한 시리즈에서 연결되는 상보적인 V_L도메인을 포함하는 다른 폴리펩티드 사슬로 이루어진 두 개의 폴리펩티드 사슬을 인코드하는 다이시스트론(discistronic) 벡터를 발현하여 획득한다.

더욱 최근에는, 양특이성을 가지는 사원자가 직렬(tetravalent tandem) 디아바디(이하 "탄다브(tandab)"라 한다)가 보고되었다[Cochloviuset al., Cancer Research (2000) 60: 4336-4341]. 양특이성 탄다브는 자가결합에서 각각 두 개의 다른 특이성을 가지기 위해 두 개의 잠재 부위의 생성을 촉진하는 방향으로 연결된 두 개의 다른 항체(V_H1, V_L1, V_H2, V_L2)의 네 개의 가변 도메인을 각각 포함하는 두 개의 폴리펩티드의 호모다이머(homodimer)이다.

본 발명의 하나의 실시예는 두 개는 하나의 표적에 대하여 친화력을 가지고 세 번째는 진단용 및/또는 치료용 제제용 담체에 부착할 수 있는 헵텐에 대하여 친화력을 가지는 세 개의 결합 부위를 생성하여 비공유 결합을 하는 두 개의 이종 폴리펩티드 사슬을 포함하는 양특이성, 삼원자가 표적 단백질에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 두 개의 CEA 결합 부위 및 하나의 HSG 결합 부위를 가지는 결합 단백질을 제공한다. 양특이성, 삼원자가 표적화 제제는 두 개의 다른 scFvs, 즉 하나의 항체에서 유래하고 또 다른 항체의 V_L도메인에 짧은 연결기로 결합되는 두 개의 V_H도메인을 포함하는 첫번째 scFv 및 하나의 항체에서 유래하고 또 다른 항체의 V_H도메인에 짧은 연결기로 결합되는 두 개의 V_L도메인을 포함하는 두번째 scFv를 가진다. V_H및 V_L도메인에서 유래하는 다원자가, 멀티특이성 제제를 생성하는 위하여, 하나의 V_H사슬을 하나의 V_L사슬과 비공유결합시켜 다원자가 및 멀티특이성 임의의 제제를 제조하는 것과 같은 방법으로 숙주 세포내 DNA 플라스미드로부터 합성되는 각 사슬이 전체가 V_H도메인(V_H사슬)으로 구성되거나 또는 전체가 V_L도메인(V_L사슬)으로 구성되도록 하는 방법으로 제조한다. 예를 들면, 삼원자가의 삼특이성 제제를 생성하는 경우, V_H사슬은 각각 다른 특이성을 가지는 하나의 항체에서 유래하고, 가변 길이(variable length)의 펩티드 연결기에 의해 결합되는 세 개의 V_H도메인의 아미노산 서열로 이루어지게 될 것이고, V_L사슬은 V_H사슬에 사용되는 것과 동일한 펩티드 연결기에 의해 결합되는 상보적인 V_L도메인으로 이루어지게 될 것이다. 항체의 V_H및 V_L도메인이 반대 방향(anti-parallel)으로 결합하려는 경향이 있기 때문에, 본 발명에서는 아래에서 보여지는 바와 같이 V_H사슬 내에 V_H도메인을 역순으로 배열된 V_L사슬내 V_L도메인을 가지도록 하였다.

V_H사슬 : NH2----V_H1-La-V_H2-Lb-V_H3----COOH

V_L사슬 : NH2----V_L3-Lb-V_L2-La-V_L1----COOH

상기에서 펩티드 연결기인 La 및 Lb는 같거나 또는 다른 것을 사용할 수 있다.

더 높은 가변 도메인은 원자가 또는 특이성의 수가 증가하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들면, 아래에 기재된 두 개의 폴리펩티드는 두 가지 특이성의 각각에 대하여 이원자가인 사원자가의 양특이성 다이머를 생성할 수 있다.

V_H사슬 : NH2----V_H1-La-V_H1-Lb-V_H2-Lc-V_H2----COOH

V_L사슬 : NH2----V_L2--Lc-V_L2-Lb-V_L1-La-V_L1----COOH

상기에서 펩티드 연결기인 La, Lb 및 Lc는 같거나 또는 다른 것을 사용할 수 있다. 각 사슬에서 가변 도메인의 순서가 각 특이성의 기능적 활성을 유지하기 위한 임계가 되는지를 결정한다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 항원 특이성 헤테로다이머를 구성하기 위한 V_H및 V_L도메인을 제조하는데 679, hMN14 및 734, 세 개의 항체를 사용한다. hMN14 및 734를 제조하는 방법 및 사용하는 방법은 미국특허출원 제09/337,756호, 제09/823,746호 및 제10/150,654호에 기재되어 있으며, 본 명세서에서 전체를 참고문헌으로 통합하여 수록하였다. 679(IgG1,K)로 제작한 쥐의 모노클로날 항체는 히스티딘-숙시닐-글리실(HSG) 부분을 함유하는 분자에 높은 친화력으로 결합한다[Morelet al., Molecular Immunology, 27, 995-1000, 1990). 679 가변 도메인(V_H및 V_K)에 속하는 뉴클레오타이드 서열이 결정되었다[Qu et al., 비공개된결과]. V_K는 항체 경쇄(V_L)의 두 개의 이소타입(isotype) 중 하나이다. 상기 두 이소타입의 기능은 동일하다. 도 1에서 보여지는 것과 같이, 679 헤테로다이머를 발현하기 위한 유전자 구조물(679-scFv-L5)의 제작은 다음과 같은 특징을 가진다: 1) V_H의 카르복실 말단이 V_K의 아미노 말단과 펩티드 연결기 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(G₄S)에 의해 연결되어 있다. G₄S 펩티드 연결기의 사용은 HSG에 대한 두 개의 결합 부위를 생성하여 헤테로다이머로 다이머화하기 위하여 폴리펩티드를 분비할 수 있다. 2) pelB 리더(leader) 신호 펩티드 서열은E. coli의 주변강(periplasmic space)에서 폴리펩티드의 운반을 촉진하는 V_H유전자에 앞선다. 3) 6개의 히스티딘(His) 잔기가 IMAC에 의해 정제된 카르복실 말단에 첨가된다. 679-scFv-L5 핵산의 DNA 코딩 서열 및 이에 상응하여 인코드된 아미노산은 도 4(Seq IDs)에 나타내었다. 또한 도 1은 pelB 리더 펩티드의 단백질 가수분해 제거후 성숙한 폴리펩티드를 보여주고 HSG 결합 부위를 포함하는 679 헤테로다이머를 보여준다. 679는 쥐의 항체에 대한 부작용을 막아주도록 인간화되거나 또는 완전히 인간이 될 수 있다.

hMN14는 CEA에 특이적으로 결합하는 인간화 모노클로날 항체(humanized monoclonal antibody, Mab)이다[Shevitzet al., Nucl. Med., Suppl., 34, 217P, 1993; 미국특허 제6,254,868호(2001)]. 현재 본래 Mab가 쥐인 경우, 인간화 항체 시약은 인간 항-마우스 항체 반응을 감소하는데 사용된다. 상기 항체의 가변 영역은 발현 구조물(hMN14-scFv-L5)로 설계된다. 도 2에서 보여지는 것과 같이, hMN14 헤테로다이머를 발현하기 위한 유전자 구조물(hMN14-scFv-L5)의 설계는 다음과 같은 특징을 가진다: 1) V_H의 카르복실 말단이 펩티드 연결기 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(G₄S)에 의해 V_K의 아미노 말단에 연결되어 있다. G₄S 펩티드 연결기의 사용은 CEA에 대한 두 개의 결합부위를 생성하는 헤테로다이머로 다이머화하기 위하여 폴리펩티드를 분비할 수 있다. 2) pelB 리더(leader) 서열은E. coli의 주변강(periplasmic space)에서 폴리펩티드의 운반을 촉진하는 V_H유전자에 앞선다. 3) 6개의 히스티딘(His) 잔기가 IMAC에 의해 정제된 카르복실 말단에 첨가된다. hMN14-scFv-L5 핵산의 DNA 코딩 서열 및 이에 상응하여 인코드된 아미노산은 도 6(Seq IDs)에 나타내었다. 또한 도 2는 pelB 리더 펩티드의 단백질 가수분해 제거후 성숙한 폴리펩티드를 보여주고 CEA 결합 부위를 포함하는 hMN14 헤테로다이머를 보여준다.

734는 금속 킬레이트 화합물 인듐-DTPA(diethylenetriamine-pentaacetic acid)에 높은 친화력으로 결합하도록 설계된 쥐의 모노클로날 항체이다. 도 2에서 보여지는 것과 같이, 734 헤테로다이머를 발현하기 위한 유전자 구조물(734-scFv-L5)의 설계는 다음과 같은 특징을 가진다: 1) V_H의 카르복실 말단이 펩티드 연결기 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(G₄S)에 의해 V_K의 아미노 말단에 연결되어 있다. G₄S 펩티드 연결기의 사용은 HSG에 대한 두 개의 결합부위를 생성하는 헤테로다이머로 다이머화하기 위하여 폴리펩티드를 분비할 수 있다. 2) pelB 리더(leader) 서열은E. coli의 주변강(periplasmic space)에서 폴리펩티드의 운반을 촉진하는 V_H유전자에앞선다. 3) 6개의 히스티딘(His) 잔기가 IMAC에 의해 정제된 카르복실 말단에 첨가된다. 734-scFv-L5 핵산의 DNA 코딩 서열 및 이에 상응하여 인코드된 아미노산은 도 7(Seq IDs)에 나타내었다. 또한 도 3은 pelB 리더 펩티드의 단백질 가수분해 제거후 성숙한 폴리펩티드를 보여주고, 인듐-DTPA 결합 부위를 포함하는 734 헤테로다이머를 보여준다. 734는 쥐의 항체에 대한 부작용을 막아주도록 인간화되거나 또는 완전히 인간이 될 수 있다.

다이-시스트론(Di-cistronic) 발현 벡터는 서브클로닝(sub-cloning) 과정의 시리즈를 통해 제조한다. 삼원자가의 양특이성 679xhMN14xhMN14 용 다이-시스트론 발현 카세트는 숙주세포에서 염색체 이외의 자가-복제하는 유전요소를 생성하는 작은 이중가닥 DNA의 플라스미드를 포함한다. 클로닝 벡터는 미생물 숙주 세포 내에서 스스로 복제가 가능한 DNA 분자이다. 또한 본 발명에서는 양특이성 삼원자가 헤테로다이머를 발현하는 벡터를 제공한다. 숙주 세포는 숙주 세포 분열의 각 시기에 복제용 벡터와 벡터 복제물을 수용한다. 일반적으로 사용되는 숙주 세포는Escherichia coli(E. coli)이지만, 다른 숙주 세포들도 사용가능하다. 생육가능한 운반 시스템에서 숙주세포가 생식하여 항체를 제조하는 과정을 통해 재조합 항체 단편의 대량생산이 가능하다.

다이-시스트론 카세트가E. coli에서 발현되는 경우, 폴리펩티드의 일부가 접히고 자발적으로 가용성 양특이성 삼원자가 헤테로다이머를 생성한다. 상기 양특이성 삼원자가 헤테로다이머는 각각 HSG에 대한 높은 친화력을 가지는 HSG 결합 부위를 생성하도록 서로 상호작용하는 두 개의 폴리펩티드 및 CEA 항원에 대하여 높은 친화력을 가지는 두 개의 CEA 결합 부위를 생성하여 결합하는 네 개의 폴리펩티드를 가진다. 항원은 교차 결합된 항원과 항체 분자의 비공유 상호작용에 의해 같이 유지되는 항원-항체 복합체를 생성하는 특이 항체에 의해 결합된다. 삼특이성 삼원자가 헤테로다이머는 HSG에 높은 친화력을 가지는 HSG 결합 부위를 생성하기 위하여 서로 상호작용하는 두 개의 폴리펩티드, CEA 항원에 대한 높은 친화력을 가지는 CEA 결합 부위를 생성하기 위하여 결합하는 두 개의 폴리펩티드, 및 금속 킬레이트 화합물 인듐-DTPA에 대한 높은 친화력을 가지는 금속 킬레이트 화합물 인듐-DTPA 결합 부위를 생성하기 위하여 결합하는 두 개의 폴리펩티드를 가진다.

679xhMN14xhMN14 양특이성 헤테로다이머의 발현을 위한 두 개의 구조물을 설계, 제조 및 검토하였다. BS6 또는 BS8(∼80kDa)은 CEA에 대한 두 개의 결합 부위 및 HSG에 대한 하나의 결합 부위를 가진다. BS6은 두 개의 폴리펩티드에서 각각의 V 도메인 배열이 BS8과 다르다. BS6을 구성하는 폴리펩티드는 hMN14V_H-(La)-hMN14V_K-(Lb)-679V_H-6His 및 679V_K-(Lb)-hMN14V_H-(La)-hMN14V_K-6His 이다. BS8이 포함하는 폴리펩티드는 hMN14V_H-(L5)-hMN14V_H-(Lb)-679V_H-6His 및 679V_K-(Lb)-hMN14V_K-(La)-hMN14V_K-6His 이다. BS6에서, hMN14 MAb의 V_H폴리펩티드는 올리고펩티드 연결기에 의해 hMN14 MAb의 V_K폴리펩티드와 결합하고, 상기 hMN14 MAb의 V_K폴리펩티드는 올리고펩티드 연결기에 의해 679 MAb의 V_H폴리펩티드와 결합하며, 679 MAb의 V_K폴리펩티드는 올리고펩티드 연결기에 의해 hMN14 MAb의 V_H폴리펩티드와 결합하고,상기 hMN14 MAb의 V_H폴리펩티드는 올리고펩티드 연결기에 의해 hMN14MAb의 V_K폴리펩티드와 결합한다. 각 사슬은 679xhMN14xhMN14 양특이성, 삼원자가 헤테로다이머의 하나 반을 생성한다. BS8은 올리고펩티드 연결기에 의해 hMN14 MAb의 V_H폴리펩티드와 결합하는 hMN14 MAb의 V_H폴리펩티드, 올리고펩티드 연결기에 의해 679 MAb의 V_H폴리펩티드와 결합하는 hMN14 MAb의 V_H폴리펩티드, 올리고펩티드 연결기에 의해 hMN14 MAb의 V_K폴리펩티드와 결합하는 679 MAb의 V_K폴리펩티드, 및 올리고펩티드 연결기에 의해 hMN14MAb의 V_K폴리펩티드와 결합하는 hMN14 MAb의 V_K폴리펩티드로 구성된다. 각 사슬은 679xhMN14xhMN14 헤테로다이머의 하나 반을 생성한다. BS6 및 BS8의 올리고펩티드 연결기는 동일하거나 또는 다른 것을 사용한다. BS6의 첫 번째 및 두 번째 폴리펩티드 서열에 대한 핵산의 DNA 코딩 서열 및 이에 상응하여 인코드되는 아미노산 서열은 hMN14V_H-(La)-hMN14V_K-(Lb)-679V_H-6His 및 679V_K-(Lb)-hMN14V_H-(La)-hMN14V_K-6His 이고, BS8의 첫 번째 및 두 번째 폴리펩티드 서열에 대한 핵산의 DNA 코딩 서열 및 이에 상응하여 인코드되는 아미노산 서열은 hMN14V_H-(La)-hMN14V_H-(Lb)-679V_H-6His 및 679V_K-(Lb)-hMN14V_K-(La)-hMN14V_K-6His 이며, 여기에서, hMN14 V_H와 V_K, 및 679 V_H와 V_K는 각각 도 6 및 도 4(SEQ ID)에 나타내었다.

삼특이성 삼원자가 결합 단백질인 TS1은 하나의 CEA 결합 부위, 하나의 HSG결합 부위 및 하나의 금속 킬레이트 인듐-DTPA 결합 부위를 가진다. TS1을 구성하는 폴리펩티드는 hMN14V_H-(La)-734V_H-(Lb)-679V_H및 679V_K-(Lb)-734V_K-(La)-hMN14V_K이다. TS1에서, hMN14 MAb의 V_H폴리펩티드는 올리고펩티드 연결기에 의해 734 MAb의 V_H폴리펩티드와 결합하고, 상기 734 MAb의 V_H폴리펩티드는 올리고펩티드 연결기에 의해 679 MAb의 V_H폴리펩티드와 결합하며, 679 MAb의 V_K폴리펩티드는 올리고펩티드 연결기에 의해 734 MAb의 V_K폴리펩티드와 결합하고, 상기 734 MAb의 V_K폴리펩티드는 올리고펩티드 연결기에 의해 hMN14MAb의 V_K폴리펩티드와 결합한다. 각 사슬은 hMN14x734x679 삼특이성, 삼원자가 헤테로다이머의 하나 반을 생성한다. 상기 연결기는 같거나 또는 다른 것을 사용한다. m734 V_H와 V_K는 도 7(SEQ ID)에 나타내었다.

상기 양특이성 삼원자가 결합 단백질의 궁극적인 용도는 펩티드를 포함하는 HSG에 의해 운반되는 진단용 또는 치료용 제제의 계속되는 특이 운반을 위한 CEA 양성 종양을 예비-표적(pre-targeting)하는데 사용된다. 상기 헤테로다이머는 원하는 위치에서 친화력이 증가하고 잔류 시간이 길어지면서 두 개의 표적화된 항원에 선택적으로 결합한다. BS6 및 BS8은 이원자가 CEA에 결합하여 오랜 순환시간으로 인해 종양 흡수의 높은 수준을 획득할 수 있기 때문에 흥미있는 예비표적화 제제가된다. 더욱이 비항원과 결합한 헤테로다이머는 신체에서 신속히 제거되어 정상조직의 노출이 최소화된다. 상기 진단용 및 치료용 제제는 동위원소, 약물, 독소, 사이토카인, 호르몬, 성장인자, 접합체, 방사성 핵종(Radionuclide) 및 금속을 포함한다. 예를 들면, 가돌리늄(Gadolinium) 금속은 자기공명영상(magnet resonance imaging)에 사용되고, 또한 MRI, CT 및 초음파 조영제(ultrasound contrast agent)도 사용된다. 방사성 핵종의 예로는⁹⁰Y,¹¹¹In,¹³¹I,^99mTc,¹⁸⁶Re,¹⁸⁸Re,¹⁷⁷Lu,⁶⁷Cu,²¹²Bi,²¹³Bi 및²¹¹At를 들 수 있다. 또한 다른 방사성 핵종들도 진단용 및 치료용 제제로 이용할 수 있다. 상기 제제들의 특이성에 의존하여 면역반응을 초래하거나 또는 방사성 헵텐 또는 약물-헵텐 접합체를 사용하는 AES 기술과 조합하여 암, 자가 면역 및 감염성 질환 치료에 잠재적으로 적용할 수 있다. 삼특이성 및 사원자가 제제들은 혈액 검체내의 특이 표적 세포를 검출 및 분화하는데 사용할 수 있다.

더욱이 본 발명에서는 기능성 구조를 생성하기 위하여 결합되는 두 개의 상보적인 폴리펩티드만을 필요로 하고 동일한 폴리펩티드가 결합하지 않기 때문에 다수의 부산물이 생성되는 문제를 해결할 수 있다. 따라서, 폴리펩티드 사슬의 부적절한 쌍으로 인한 불활성 오염물질이 생성되지 않는다. 본 발명에서는 각 폴리펩티드 사슬이 V_H또는 V_L도메인만을 포함하고 있어 다른 폴리펩티드 사슬과 결합할 경우에만 기능성 구조를 생성할 수 있기 때문에 분자내에서 쌍을 이루는 문제를 해결할 수 있다. 본 발명에서는 각 폴리펩티드 사슬이 V_H또는 V_L도메인(BS8 및 TS1)만을 포함하고 있거나 또는 홀수의 V_H또는 V_L도메인(BS6)으로 이루어져 있어 상보적인 사슬과 결합하는 경우에만 기능성 구조를 생성할 수 있기 때문에 분자내에서 쌍을 이루는 문제를 해결할 수 있다. 비록 Daviset al.에 적어도 두 개의 항체에서 유래한 V_H도메인을 포함하는 폴리펩티드 및 V_L도메인에 상응하는 폴리펩티드, 이 두 개의 폴리펩티드 사슬이 쌍을 이루는 것을 기본으로 하는 다원자가, 멀티특이성 단백질을 구성하는 유사한 방법(미국특허 제5,989,830호(1999) 및 제6,239,259호(2001))이 기재되어 있으나, 각 다원자가의 멀티특이성 분자의 분자 동정을 확립하는 근거를 전혀 제공하고 있지 않다.

본 발명에 의하여 진단 또는 치료를 위해 표적에 진단용 또는 치료용 제제를 운반하는 방법은 결합 단백질과 함께 환자에게 투여하는 단계, 환자의 혈류에서 비결합 단백질을 제거하기 위해 충분한 시간을 기다리는 단계, 및 결합 단백질의 결합 부위에 결합하는 진단용 또는 치료용 제제를 투여하는 단계를 포함한다. 또한 당업계에 알려진 결합 단백질을 검출하는 단계를 포함하여 진단한다. 상기 진단용 또는 치료용 운반 분자는 진단용으로 또는 치료용으로 유효한 제제, 연결 부분(linking moiety) 및 하나 또는 그 이상의 헵텐 부분을 포함한다. 상기 헵텐 부분은 결합하는 단백질과 헵텐 부분이 동시에 결합 가능한 위치를 말한다.

본 발명에 의한 결합 단백질 및 진단용 또는 치료용 제제를 포유동물에 투여하는 방법으로는 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 피하내, 흉막내, 경막내, 국부적 도뇨관을 통한 관류 또는 직접적인 병변내 주사로 투여할 수 있다. 주사에 의해 결합 부분에 투여하는 경우, 지속적인 주입 또는 단일 또는 다수의 환(boluses)으로 투여할 수 있다.

혼합되지 않은 진단용 또는 치료용 제제 및 양특이성 항체는 약제학적으로 허용가능한 주사 운반제, 바람직하게는 생리적인 pH 및 농도에서 인산 완충액(PBS)을 이용하여 인간 치료용 및 진단용 키트로 제조할 수 있다. 특히 사람에게 사용하는 경우에는 살균하여 사용하는 것이 바람직하다. 상기 키트의 최적 구성은 안정화제, 완충액, 라벨된 시약, 방사성 동위원소, 상자성 조성물(paramagnetic composition), 제거를 증강시키는 이차 항체, 통상적인 주입기, 컬럼 및 바이얼(vial)을 포함한다.

다원자가, 멀티특이성 결합 단백질은 암, 자가면역 질환, 감염성 질환, 심혈관 질환 및 염증 질환과 같은 여러 가지 인간 질병을 진단 및 치료하는데 사용된다. 본 발명의 실시예에서 표적 항원은 암결합 부위, 자가면역 질환 결합 부위, 감염성 질환 결합 부위, 심혈관 질환 결합 부위 및 염증 질환 결합 부위와 같이 인간 질병과 관련된 결합 부위가 된다.

본 발명의 범주 내에서 사용하는 항체 및 항원은 상기에 기재된 특성을 가지는 mAbs를 포함하며, 특별히 한정되는 아니지만 암의 경우 다음과 같은 mAbs를 사용할 것으로 생각된다: LL1(항-CD74), LL2(항-CD22), RS7(항-상피세포내 당단백질-1(EGP-1)), PAM-4 및 KC4(둘다 항-MUC1), MN-14(항-암태아성 항원(CEA)), Mu-9(항-콜론 특이성 항원-p), Immu31(항-알파-태아단백질), TAG-72(e.g., CC49), Tn, J591(항-PSMA), 및 G250(항-탄산탈수효소 IX mAb). 이들 접합체를 사용하여 표적화될 수 있는 다른 사용 가능한 항원으로는 HER-2/neu, BrE3, CD19,, CD20(C2B8, hA20, 1F5 Mabs), CD21, CD23, CD80, 알파-태아단백질(AFP), VEGF, EGF 수용체,P1GR, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, PSMA, 갱글리오사이드(gangliosides), HCG, EGP-1(17-1A), CD37, HLD-DR, CD30, Ia, A3, A33, Ep-CAM, KS-1, Le(y), S100, PSA, 테나신(tenascin), 엽산 수용체, Thomas-Friedenreich 항원, 종양 괴사 항원, 종양의 혈관신생 항원, Ga 733, IL-2, T101, MAGE, L243 또는 이들의 조합을 사용할 수 있다. 앞서 기재한 다수의 항체 및 항원 뿐만 아니라 본 발명의 범주 내에서 사용하는 부가적인 항체 및 항원은 2002년 11월 15일자로 출원된 "치료법의 표적화된 운반을 위한 멀티특이성, 비공유 복합체의 용도"라는 제목의 미국 가출원 제60/426,379호; 2002년 3월 1일자로 출원된 "RS7 항체"라는 제목의 미국 가출원 제60/360,229호; 2002년 2월 14일자로 출원된 "항-CD20 항체 및 이들의 융합 단백질 및 사용방법"이란 제목의 미국 가출원 제60/356,132호; 2001년 11월 28일자로 출원된 "항-DOTA 항체"라는 제목의 미국 가출원 제60/333,479호; 2001년 7월 31일자로 출원된 "고분자 운반체"라는 제목의 미국 가출원 제60/308,605호; 2002년 3월 1일자로 출원된 "소거 증가율을 위한 항체 점 돌연변이"라는 제목의 미국 가출원 제60/361,037호; 2002년 3월 1일자로 출원된 "흡수하는 항-CD-74 항체 및 사용방법"이라는 제목의 미국 가출원 제60/360,259호; 2001년 10월 1일자로 출원된 "항-CD22 항체를 사용하는 B 세포 악성종양의 면역 치료법"이라는 제목의 미국출원 제09/965,796호; 2001년 12월 26일자로 출원된 "갈륨-68 및 갈륨-67으로 라벨하고 표적화한 제제"라는 제목의 미국 가출원 제60/342,104호; 2002년 4월 5일자로 출원된 "갈륨-68 및 갈륨-67으로 라벨하고 표적화한 제제"라는 제목의 미국출원 제10/116,116호; 2002년 8월 1일자로 출원된 "알파-태아 단백질 IMMu31 항체 및 융합 단백질 및 이들의 사용방법"이라는 제목의 미국 가출원 제60/399,707호; 2002년 6월 14일자로 출원된 "모노클로날 항체 hPAM4"라는 제목의 미국 가출원 제60/388,314호; 및 2002년 9월 30일자로 출원된 "가공한, 인간의 및 인간화된 항-과립구 항체 및 사용방법"이라는 제목의 미국 가출원 제60/414,341호에 개시되어 있으며, 본 명세서에서 전체를 참고문헌으로 통합하여 수록하였다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시예에서는 항체가 빠르게 흡수된 다음 재발현되고, 작용하여 지속적인 흡수 및 세포에 의해 순환하는 면역접합체(immunoconjugate)의 부가물을 허용하여 세포 표면으로 표출된다. 가장 바람직한 항체/항원 쌍은 LL1 및 항-CD74 mAb(불변의 사슬, class Ⅱ 특이성 샤프론, Ii)이다. CD74 항원은 B 세포 임파종, 특정 T 세포 임파종, 흑색종 및 특정 다른 암(Ong et al.,Immunology98:296-302 (1999)) 뿐만 아니라 자가면역 질환에서 높게 발현된다.

항-CD74 항체로 바람직하게 치료되는 질환으로는 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's Lymphoma), 흑색종 및 다수의 골수종을 들 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. CD74 항원은 표적 세포의 표면에서 짧은 시간동안 항원의 내재화(internalization) 및 "페이로드(payload)"로 운반하는 임의의 화학요법 부분과 함께 내재화되는 LL1 항체를 표적할 수 있는 항원의 재발현으로 인해 지속적으로 발현된다. 상기 세포 내부에서 축적되는 LL1-화학요법 약물 면역접합체의 치료적 농도가 높아된다. 내재화된 LL1-화학요법 약물 면역접합체는 리포좀 및 엔도좀(endosome)을 통해 순환되고, 화학요법 약물 부분은 표적 세포내에서 활성화 형태로 방출된다.

또 다른 관점에서 본 발명은 환자에게 본 발명의 바람직한 실시예에서 제조한 치료용 접합체를 치료학적으로 유효한 양을 투여하여 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 실시예에서 제조한 치료용 접합체로 치료되는 질환은 B 세포 악성종양(예를 들면, LL2 mAb를 비호지킨 림프종 및 만성 림프성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia)에 사용한다; 미국특허 제6,183,744호 참조), 내배엽성으로 유도된 소화기계 상피의 선암, 유방암 및 비소세포 폐암과 같은 암, 및 다른 암종, 육종, 신경교(glial) 종양, 골수성 백혈병 등을 들 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 특히 위, 폐, 유방, 전립선, 난소, 고환, 뇌 또는 임파선 종양, 욱종 또는 흑색종 등의 악성 고형 종양 또는 조혈성 종양(hematopoietic neoplasm)과 결합하여 생성되는 태아성 암 항원(oncofetal antigen)과 같은 항원에 대한 항체는 편리하게 사용된다.

하기 예들은 본 발명을 구체적으로 설명하는 것이며, 청구의 범위를 어느 한국면으로 제한하려는 것은 아니다.

[실시예 1]E. coli에서 BS8을 발현하기 위한 플라스미드의 제조

본 발명에서 도입한 구상을 사용하여, CEA에 대하여 이원자가이고, HSG에 대하여 일원자가인 양특이성 삼원자가 분자(BS8)는 아래의 두 폴리펩티드를 다이머화하여 획득하였다:

V_H사슬 : hMN14V_H--GGGGSGGGGSGGGGSM--hMN14V_H-GGGGS-679V_H

V_L사슬 : 679V_K--GGGGS-hMN14V_K--LEGGGGSGGGGSGGGS-hMN14V_K

상기 두 폴리펩티드를 위한 DNA 서열은 표준 분자 생물 기술을 사용하여 다이-시스트론 세균 발현 플라스미드인 pET-ER 벡터에서 설계하였다. 발현 직후 각폴리펩티드는E. coli의 주변강에서 합성을 지시하는 아미노 말단의 pelB 리더 서열 및 IMAC에 의한 정제를 위한 카르복실 말단의 여섯 개의 His 친화성 테그를 가진다. 본 발명에서는 HSG 커플된 센서칩을 가지는 BIAcore로 CEA 이원자가 및 HSG 일원자가와 결합하여 실제로 양특이성 헤테로다이머를 생성하는 두 개의 폴리펩티드인 CEA 또는 WI2에 따른 양특이성 제제의 계속적인 주입으로 반응 유닛에서 부가적 증가량을 측정하여 증명하였다.

본 실시예에서 hMN14 MAb의 V_H폴리펩티드는 다섯 개의 아미노산 잔기 연결기에 의해 hMN14 MAb의 V_K폴리펩티드에 결합하고, 상기 hMN14 MAb의 V_K폴리펩티드는 16개의 아미노산 잔기 연결기에 의해 679 MAb의 V_H폴리펩티드에 결합하며, 679 MAb의 V_K폴리펩티드는 16개의 아미노산 잔기 연결기에 의해 hMN14 MAb의 V_H폴리펩티드에 결합하고, 상기 hMN14 MAb의 V_H폴리펩티드는 다섯 개의 아미노산 잔기 연결기에 의해 hMN14 MAb의 V_K폴리펩티드에 결합한다. 각 사슬은 679xhMN14xhMN14 양특이성 삼원자가 헤테로다이머의 하나 반을 생성한다.

또한 V_H및 V_L도메인으로 구성된 각각의 사슬은 쌍을 이루는 경우 다원자가, 멀티특이성 결합 부위를 생성하도록 만들 수도 있다. 이러한 실시예는 아래에 기재된 BS6에서 제공한다.

[실시예 2]E. coli에서 BS6을 발현하기 위한 플라스미드의 제조

본 발명에서 도입한 구상을 변형하여, CEA에 대하여 이원자가이고, HSG에 대하여 일원자가인 부가적 양특이성 삼원자가 분자(BS6)는 아래의 두 폴리펩티드를 다이머화하여 획득하였다:

V_H사슬 : hMN14V_H--GGGGS--hMN14V_K-LEGGGGSGGGGSGGGS-679V_H

V_L사슬 : 679V_K--GGGGSGGGGSGGGGSM-hMN14V_H--GGGGS-hMN14V_K

BS6은 특이적 폴리펩티드 사슬에서 도메인 배열이 BS8과 다르다. BS8의 각 사슬은 오로지 V_H또는 V_L도메인 중 하나로 이루어진다. 반면에 BS6의 폴리펩티드 사슬은 두 개의 V_H및 하나의 V_L도메인 또는 하나의 V_H및 두 개의 V_L도메인으로 이루어진다. BS6에서 hMN14V_H및 hMN14V_L사이의 연결기는 내부-사슬 결합을 막기 위하여 5개의 아미노산 잔기로만 이루어진다.

BS6의 두 폴리펩티드를 위한 DNA 서열은 표준 분자 생물 기술을 사용하는 pET-ER 벡터에서 설계하였다. 발현 직후 각 폴리펩티드는 아미노 말단의 pelB 리더 서열 및 카르복실 말단의 여섯 개의 His 친화성 테그를 가진다. 본 발명에서는 두 개의 폴리펩티드가 CEA 이원자가 및 HSG 일원자가와 결합하여 실제로 양특이성 헤테로다이머를 생성하는 것을 BIAcore로 증명하였다.

본 실시예에서 BS6는 다섯 개의 아미노산 잔기 연결기에 의해 hMN14 MAb의 V_K폴리펩티드와 결합하는 hMN14 MAb의 V_H폴리펩티드, 16개의 아미노산 잔기 연결기에 의해 679 MAb의 V_H폴리펩티드와 결합하는 hMN14 MAb의 V_K폴리펩티드, 16개의아미노산 잔기 연결기에 의해 hMN14 MAb의 V_H폴리펩티드와 결합하는 679 MAb의 V_K폴리펩티드, 다섯 개의 아미노산 잔기 연결기에 의해 hMN14 MAb의 V_K폴리펩티드와 결합하는 hMN14 MAb의 V_H폴리펩티드로 구성된다. 각 사슬은 679xhMN14xhMN14 양특이성 삼원자가 헤테로다이머의 하나 반을 생성한다.

[실시예 3]E. coli에서 TS1을 발현하기 위한 플라스미드의 제조

본 발명에서 도입한 구상을 사용하여, CEA, HSG 및 In-DTPA에 결합하는 부분을 가지는 삼특이성 삼원자가 분자(TS1)는 아래의 두 폴리펩티드를 다이머화하여 획득하였다:

V_H사슬 : hMN14V_H--(L15)--734V_H-(L15)-679V_H

V_L사슬 : 679V_K--(L15)-734V_K--(L15)-hMN14V_K

상기 두 폴리펩티드를 위한 DNA 서열은 표준 분자 생물 기술을 사용하는 pET-ER 벡터에서 설계하였다(도 8 및 도 9 참조). 발현 직후 각 폴리펩티드는E. coli의 주변강에서 합성을 지시하는 아미노 말단의 pelB 리더 서열 및 IMAC에 의한 정제를 위한 카르복실 말단의 여섯 개의 His 친화성 테그를 가진다. 본 발명에서는 실제로 두 개의 폴리펩티드가 CEA, HSG 및 In-DTPA에 결합하는 특성을 가지는 양특이성 헤테로다이머를 생성하는 것을 BIAcore 및 ELISA로 증명하였다.

본 실시예에서 hMN14 MAb의 V_H폴리펩티드는 15개의 아미노산 잔기 연결기에의해 734 MAb의 V_H폴리펩티드에 결합하고, 상기 734 MAb의 V_H폴리펩티드는 15개의 아미노산 잔기 연결기에 의해 679 MAb의 V_H폴리펩티드에 결합하며, 679 MAb의 V_K폴리펩티드는 15개의 아미노산 잔기 연결기에 의해 hMN14 MAb의 V_K폴리펩티드에 결합하고, 상기 hMN14 MAb의 V_K폴리펩티드는 15개의 아미노산 잔기 연결기에 의해 hMN14 MAb의 V_K폴리펩티드에 결합한다. TS1에서 각 15개의 아미노산 잔기 연결기는 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser 서열을 가진다. 각 사슬은 hMN14x734x679 삼특이성 삼원자가 헤테로다이머의 하나 반을 생성한다.

[실시예 4] 멀티특이성, 다원자가 제제의 사용

본 발명은 삼원자가 양특이성, 삼원자가 삼특이성, 사원자가 양특이성, 사원자가 삼특이성 또는 사원자가 사특이성(tetraspecific)이 될 수 있는 생체내 표적화 제제를 생성하기 위하여 최상으로 사용된다. 상기 삼원자가 양특이성(3-2S) 제제는 두 개의 다른 항체(V_H1/V_L1및 V_H2/V_L2)의 가변 도메인으로부터 유도되고, 두 개의 항체에 의해 인지되는 항원 또는 에피토프에 결합하는 특성을 가진다. 상기 결합은 하나의 특이성에 대한 이원자가 및 다른 특이성에 대한 일원자가가 된다. 두 개의 이종 폴리펩티드 사슬의 다이머화에 의해 제조되는 3-2S 제제를 하기 도식 1에 나타내었다.

[도식 1] 삼원자가 양특이성 제제

V_H사슬 : V_H1-La-V_H1-Lb-V_H2

V_L사슬 : V_L2-Lc-V_L1-Ld-V_L1

세 개의 V_H또는 V_L도메인의 특이성 순서는 가변적이며 폴리펩티드 연결기(La, Lb, Lc 및 Ld)는 동일하거나 또는 다른 것이다.

상기 삼원자가 삼특이성(3-3S) 제제는 세 개의 다른 항체(V_H1/V_L1, V_H2/V_L2및 V_H3/V_L3)의 가변 도메인으로부터 유도되고, 세 개의 항체에 의해 인지되는 항원 또는 에피토프에 결합하는 특성을 가진다. 상기 결합은 세 가지 특이성 각각에 대한 일원자가가 된다. 두 개의 이종 폴리펩티드 사슬의 다이머화에 의해 제조되는 3-3S 제제를 하기 도식 2에 나타내었다.

[도식 2] 삼원자가 삼특이성 제제

V_H사슬 : V_H1-La-V_H2-Lb-V_H3

V_L사슬 : V_L3-Lc-V_L2-Ld-V_L1

상기 사원자가 양특이성(4-2S) 제제는 두 개의 다른 항체(V_H1/V_L1및 V_H2/V_L2)의 가변 도메인으로부터 유도되고, 두 개의 항체에 의해 인지되는 항원 또는 에피토프에 결합하는 특성을 가진다. 상기 결합은 두 개의 다른 특이성 각각에 대한 이원자가가 된다. 두 개의 이종 폴리펩티드 사슬의 다이머화에 의해 제조되는 4-2S 제제를 하기 도식 3에 나타내었다.

[도식 3] 사원자가 양특이성 제제

V_H사슬 : V_H1-La-V_H1-Lb-V_H2-Lc-V_H2

V_L사슬 : V_L2-Ld-V_L2-Le-V_L1-Lf-V_L1

네 개의 V_H또는 V_L도메인의 특이성 순서는 가변적이며 폴리펩티드 연결기(La, Lb, Lc, Ld, Le 및 Lf)는 동일하거나 또는 다른 것이다.

상기 사원자가 삼특이성(4-3S) 제제는 세 개의 다른 항체(V_H1/V_L1, V_H2/V_L2및 V_H3/V_L3)의 가변 도메인으로부터 유도되고, 세 개의 항체에 의해 인지되는 항원 또는 에피토프에 결합하는 특성을 가진다. 상기 결합은 세 가지 특이성 중 하나에 대한 이원자가 및 두가지 다른 특이성 각각에 대한 일원자가가 된다. 두 개의 이종 폴리펩티드 사슬의 다이머화에 의해 제조되는 4-3S 제제를 하기 도식 4에 나타내었다.

[도식 4] 사원자가 삼특이성 제제

V_H사슬 : V_H1-La-V_H1-Lb-V_H2-Lc-V_H3

V_L사슬 : V_L3-Ld-V_L2-Le-V_L1-Lf-V_L1

상기 사원자가 사특이성(4-4S) 제제는 네 개의 다른 항체(V_H1/V_L1, V_H2/V_L2,V_H3/V_L3및 V_H4/V_L4)의 가변 도메인으로부터 유도되고, 네 개의 항체에 의해 인지되는 항원 또는 에피토프에 결합하는 특성을 가진다. 상기 결합은 네 가지 특이성 각각에 대한 일원자가가 된다. 두 개의 이종 폴리펩티드 사슬의 다이머화에 의해 제조되는 4-4S 제제를 하기 도식 5에 나타내었다.

[도식 5] 사원자가 사특이성 제제

V_H사슬 : V_H1-La-V_H2-Lb-V_H3-Lc-V_H4

V_L사슬 : V_L4-Ld-V_L3-Le-V_L2-Lf-V_L1

이러한 다원자가 멀티특이성 제제를 제조하는데 있어서 중요한 항체는 CEA 및 MUC1과 같이 종양과 관련된 항원에 대하여 높은 친화력을 보이는 항체, 인듐-DTPA 및 이트륨(yttrium)-DOTA와 같이 금속 킬레이트에 대하여 높은 친화력을 보이는 항체, 히스타민-숙시닐-글리신과 같이 특이 펩티드에 대하여 높은 친화력을 보이는 항체, CD20, CD22 및 CD74와 같이 세포 분화 항원에 대하여 높은 친화력을 보이는 항체, 알카라인 포스파타아제와 같이 효소에 대하여 높은 친화력을 보이는 항체 및 HLA-DR과 같이 기능성 임상적 사용의 세포 표면 지표에 대하여 높은 친화력을 보이는 항체를 포함한다.

본 발명의 조성 및 과정으로 다양한 변화과 변형이 제조될 수 있음은 당업자에게 있어서 자명한 사실일 것이다. 따라서, 첨부된 청구범위내에서 제공되는 다양한 변화 및 변형을 포함하는 것이다.

상기에서 공개된 모든 자료들은 각각이 개별적으로 예를 포함하고 있다면 동일한 범위로 여기서 기재되는 예들을 명백히 포함하고 있는 것이다.

<110> IMMUNOMEDICS, INC. IBC PHARMACEUTICALS <120> METHODS OF GENERATING MULTISPECIFIC, MULTIVALENT AGENTS FROM VH AND VL DOMAINS <130> 042418/0116 <140> PCT/US02/38985 <141> 2002-12-26 <150> 60/342,103 <151> 2001-12-26 <160> 19 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 807 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 679-scFv-L5 nucleotide sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(804) <400> 1 atg aaa tac ctg ctg ccg acc gct gct gct ggt ctg ctg ctc ctc gct 48 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 gcc cag ccg gcg atg gcc atg gaa gtg cag ctg gtg gag tca ggg gga 96 Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly 20 25 30 gac tta gtg aag cct gga ggg tcc ctg aaa ctc tcc tgt gca gcc tct 144 Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser 35 40 45 gga ttc act ttc agt att tac acc atg tct tgg ctt cgc cag act ccg 192 Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr Thr Met Ser Trp Leu Arg Gln Thr Pro 50 55 60 gga aag ggg ctg gag tgg gtc gca acc ctg agt ggt gat ggt gat gac 240 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr Leu Ser Gly Asp Gly Asp Asp 65 70 75 80 atc tac tat cca gac agt gtg aag ggt cga ttc acc atc tcc aga gac 288 Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 85 90 95 aat gcc aag aac agc cta tat ctg cag atg aac agt cta agg gct gag 336 Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu 100 105 110 gac acg gcc ttg tat tac tgt gca agg gtg cga ctt ggg gac tgg gac 384 Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Arg Leu Gly Asp Trp Asp 115 120 125 ttc gat gtc tgg ggc caa ggg acc acg gtc tcc gtc tcc tca gga ggt 432 Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Ser Val Ser Ser Gly Gly 130 135 140 ggc gga tcc gac att gtg atg aca caa tct cca tcc tcc ctg gct gtg 480 Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val 145 150 155 160 tca ccc ggg gag agg gtc act ctg acc tgc aaa tcc agt cag agt ctg 528 Ser Pro Gly Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu 165 170 175 ttc aac agt aga acc cga aag aac tac ttg ggt tgg tac cag cag aaa 576 Phe Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys 180 185 190 cca ggg cag tct cct aaa ctt ctg atc tac tgg gca tct act cgg gaa 624 Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu 195 200 205 tct ggg gtc cct gat cgc ttc tca ggc agt gga tcc gga aca gat ttc 672 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 210 215 220 act ctc acc atc aac agt ctg cag gct gaa gac gtg gca gtt tat tac 720 Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr 225 230 235 240 tgc act caa gtt tat tat ctg tgc acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg 768 Cys Thr Gln Val Tyr Tyr Leu Cys Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu 245 250 255 gag ctg aaa cgg ctc gag cac cac cac cac cac cac tga 807 Glu Leu Lys Arg Leu Glu His His His His His His 260 265 <210> 2 <211> 268 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 2 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly 20 25 30 Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser 35 40 45 Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr Thr Met Ser Trp Leu Arg Gln Thr Pro 50 55 60 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr Leu Ser Gly Asp Gly Asp Asp 65 70 75 80 Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 85 90 95 Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu 100 105 110 Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Arg Leu Gly Asp Trp Asp 115 120 125 Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Ser Val Ser Ser Gly Gly 130 135 140 Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val 145 150 155 160 Ser Pro Gly Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu 165 170 175 Phe Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys 180 185 190 Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu 195 200 205 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 210 215 220 Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr 225 230 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Gly Asp Asp 65 70 75 80 atc tac tat cca gac agt gtg aag ggt cga ttc acc atc tcc aga gac 288 Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 85 90 95 aat gcc aag aac agc cta tat ctg cag atg aac agt cta agg gct gag 336 Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu 100 105 110 gac acg gcc ttg tat tac tgt gca agg gtg cga ctt ggg gac tgg gac 384 Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Arg Leu Gly Asp Trp Asp 115 120 125 ttc gat gtc tgg ggc caa ggg acc acg gtc tcc gtc tcc tca gga ggt 432 Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Ser Val Ser Ser Gly Gly 130 135 140 ggc gga tcc gac att gtg atg aca caa tct cca tcc tcc ctg gct gtg 480 Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val 145 150 155 160 tca ccc ggg gag agg gtc act ctg acc tgc aaa tcc agt cag agt ctg 528 Ser Pro Gly Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu 165 170 175 ttc aac agt aga acc cga aag aac tac ttg ggt tgg tac cag cag aaa 576 Phe Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys 180 185 190 cca ggg cag tct cct aaa ctt ctg atc tac tgg gca tct act cgg gaa 624 Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu 195 200 205 tct ggg gtc cct gat cgc ttc tca ggc agt gga tcc gga aca gat ttc 672 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 210 215 220 act ctc acc atc aac agt ctg cag gct gaa gac gtg gca gtt tat tac 720 Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr 225 230 235 240 tgc act caa gtt tat tat ctg tgc acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg 768 Cys Thr Gln Val Tyr Tyr Leu Cys Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu 245 250 255 gag ctg aaa cgg ctc gag cac cac cac cac cac cac tga 807 Glu Leu Lys Arg Leu Glu His His His His His His 260 265 <210> 4 <211> 268 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 4 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly 20 25 30 Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser 35 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288 Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 85 90 95 aac gcc aag aac aca ttg ttc ctg caa atg gac agc ctg aga ccc gaa 336 Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu 100 105 110 gac acc ggg gtc tat ttt tgt gca agc ctt tac ttc ggc ttc ccc tgg 384 Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys Ala Ser Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp 115 120 125 ttt gct tat tgg ggc caa ggg acc ccg gtc acc gtc tcc gga ggc ggt 432 Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Gly Gly Gly 130 135 140 gga tcc gac atc cag ctg acc cag agc cca agc agc ctg agc gcc agc 480 Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 145 150 155 160 gtg ggt gac aga gtg acc atc acc tgt aag gcc agt cag gat gtg ggt 528 Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly 165 170 175 act tct gta gcc tgg tac cag cag aag cca ggt aag gct cca aag ctg 576 Thr Ser Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 180 185 190 ctg atc tac tgg aca tcc acc cgg cac act ggt gtg cca agc aga ttc 624 Leu Ile Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe 195 200 205 agc ggt agc ggt agc ggt acc gac ttc acc ttc acc atc agc agc ctc 672 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu 210 215 220 cag cca gag gac atc gcc acc tac tac tgc cag caa tat agc ctc tat 720 Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Leu Tyr 225 230 235 240 cgg tcg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa cgt ctc gag cac 768 Arg Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Leu Glu His 245 250 255 cac cac cac cac cac tga 786 His His His His His 260 <210> 6 <211> 261 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 6 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser 35 40 45 Gly Phe Asp Phe Thr Thr Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro 50 55 60 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile His Pro Asp Ser Ser Thr 65 70 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Gly Gln Gly Thr Gln 100 105 110 gtc act gtc tct tcg 351 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 8 Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ile Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Thr Tyr Ile Thr Asn Gly Gly Val Ser Ser Tyr His Pro Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys 85 90 95 Thr Arg His Ala Val Tyr Ala Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 9 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: m734VL nucleotide sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 9 cag act gtg gtg act cag gaa tct gca ctc acc aca tca cct ggt gaa 48 Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu 1 5 10 15 aca gtc aca ttc act tgt cgc tca agt gct ggg gct gtt aca act agt 96 Thr Val Thr Phe Thr Cys Arg Ser Ser Ala Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 aac tat gcc aac tgg gtc caa gaa aaa cca gat cat tta ttc tct ggt 144 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Ser Gly 35 40 45 cta ata ggt ggt acc acc aac cga gct cca ggt gtt cct gcc aga ttc 192 Leu Ile Gly Gly Thr Thr Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe 50 55 60 tca ggc tcc ctg att gga gac aag gct gcc ctc acc atc aca ggg gca 240 Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 cag act gag gat gag gca ata tat ttc tgt gtt cta tgg tac agc gac 288 Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asp 85 90 95 cgc tgg gtg ttc ggt gga gga gcc aaa ctg act 321 Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Ala Lys Leu Thr 100 105 <210> 10 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 10 Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Thr Phe Thr Cys Arg Ser Ser Ala Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Ser Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Thr Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asp 85 90 95 Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Ala Lys Leu Thr 100 105 <210> 11 <211> 1245 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: nucleotide sequence for Vh-chain of TS1 <220> <221> CDS <222> (1)..(1245) <400> 11 atg aaa tac ctg ctg ccg acc gct gct gct ggt ctg ctg ctc ctc gct 48 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 gcc cag ccg gcg atg gcc atg gag gtc caa ctg gtg gag agc ggt gga 96 Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly 20 25 30 ggt gtt gtg caa cct ggc cgg tcc ctg cgc ctg tcc tgc tcc gca tct 144 Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser 35 40 45 ggc ttc gat ttc acc aca tat tgg atg agt tgg gtg aga cag gca cct 192 Gly Phe Asp Phe Thr Thr Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro 50 55 60 gga aaa ggt ctt gag tgg att gga gaa att cat cca gat agc agt acg 240 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile His Pro Asp Ser Ser Thr 65 70 75 80 att aac tat gcg ccg tct cta aag gat aga ttt aca ata tcg cga gac 288 Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 85 90 95 aac gcc aag aac aca ttg ttc ctg caa atg gac agc ctg aga ccc gaa 336 Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu 100 105 110 gac acc ggg gtc tat ttt tgt gca agc ctt tac ttc ggc ttc ccc tgg 384 Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys Ala Ser Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp 115 120 125 ttt gct tat tgg ggc caa ggg acc ccg gtc acc gtc tcc gga ggc ggt 432 Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Gly Gly Gly 130 135 140 gga tct ggc ggc ggt gga tct ggt gga ggc ggg agt gat gtg aaa ctg 480 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Lys Leu 145 150 155 160 gtg gag tct ggg gga ggt ttt gtg cag cct gga ggg tcc ctg aaa ctc 528 Val Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu 165 170 175 tcc tgt ata gcc tcc gga ttc acc ttc agt cac tat acc atg tct tgg 576 Ser Cys Ile Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr Thr Met Ser Trp 180 185 190 gtc cgc cag aca cca gag aag aga ctg gag tgg gtc aca tac att aca 624 Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Thr Tyr Ile Thr 195 200 205 aat ggt ggt gtt tcc tcc tac cat ccc gac act gtg aag ggc cga ttc 672 Asn Gly Gly Val Ser Ser Tyr His Pro Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe 210 215 220 acc gtc tcc aga gac aat gcc aag aac acc cta tac ctg caa atg aac 720 Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn 225 230 235 240 agt ctg acg tct gag gac acg gcc atc tac ttt tgt aca aga cat gct 768 Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys Thr Arg His Ala 245 250 255 gtc tac gcc ttt gct tac tgg ggc cag ggg act cag gtc act gtc tct 816 Val Tyr Ala Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser 260 265 270 tcg ggt ggc gga ggt tca ggc gga ggc ggt tcc ggc ggt ggc gga tcc 864 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 275 280 285 gaa gtg cag ctg gtg gag tca ggg gga gac tta gtg aag cct gga ggg 912 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 290 295 300 tcc ctg aaa ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc act ttc agt att tac 960 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr 305 310 315 320 acc atg tct tgg ctt cgc cag act ccg gaa aag agg ctg gag tgg gtc 1008 Thr Met Ser Trp Leu Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 325 330 335 gca acc ctg agt ggt gat ggt gat gac atc tac tat cca gac agt gtg 1056 Ala Thr Leu Ser Gly Asp Gly Asp Asp Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 340 345 350 aag ggt cga ttc acc atc tcc aga gac aat gcc aag aac aac cta tat 1104 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr 355 360 365 ctg caa atg aac agt cta agg tct gcg gac acg gcc ttg tat tac tgt 1152 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Ala Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 370 375 380 gca agg gtg cga ctt ggg gac tgg gac ttc gat gtc tgg ggc caa ggg 1200 Ala Arg Val Arg Leu Gly Asp Trp Asp Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly 385 390 395 400 acc acg gtc tcc gtc tcc tca ctc gag cac cac cac cac cac cac 1245 Thr Thr Val Ser Val Ser Ser Leu Glu His His His His His His 405 410 415 <210> 12 <211> 415 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 12 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser 35 40 45 Gly Phe Asp Phe Thr Thr Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro 50 55 60 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile His Pro Asp Ser Ser Thr 65 70 75 80 Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 85 90 95 Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu 100 105 110 Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys Ala Ser Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp 115 120 125 Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Lys Leu 145 150 155 160 Val Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu 165 170 175 Ser Cys Ile Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr Thr Met Ser Trp 180 185 190 Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Thr Tyr Ile Thr 195 200 205 Asn Gly Gly Val Ser Ser Tyr His Pro Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe 210 215 220 Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn 225 230 235 240 Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys Thr Arg His Ala 245 250 255 Val Tyr Ala Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser 260 265 270 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 275 280 285 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 290 295 300 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr 305 310 315 320 Thr Met Ser Trp Leu Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 325 330 335 Ala Thr Leu Ser Gly Asp Gly Asp Asp Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 340 345 350 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr 355 360 365 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Ala Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 370 375 380 Ala Arg Val Arg Leu Gly Asp Trp Asp Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly 385 390 395 400 Thr Thr Val Ser Val Ser Ser Leu Glu His His His His His His 405 410 415 <210> 13 <211> 1173 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Nucleotide sequence for VL-chain of TS1 <220> <221> CDS <222> (1)..(1173) <400> 13 atg aaa tac ctg ctg ccg acc gct gct gct ggt ctg ctg ctc ctc gct 48 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 gcc cag ccg gcg atg gcc atg gac att gtg atg tca caa tct cca tcc 96 Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser 20 25 30 tcc ctg gct gtg tca cca gga gag aag gtc act atg acc tgc aaa tcc 144 Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Lys Ser 35 40 45 agt cag agt ctg ttc aac agt aga acc cga aag aac tac ttg ggt tgg 192 Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Gly Trp 50 55 60 tac cag cag aaa cca ggg cag tct cct aaa ctt ctg atc tac tgg gca 240 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala 65 70 75 80 tct act cgg gaa tct ggg gtc cct gat cgc ttc aca ggc agt gga tct 288 Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser 85 90 95 ggg aca gat ttc act ctc acc atc aac agt gtg cag tct gaa gac ctg 336 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Gln Ser Glu Asp Leu 100 105 110 gca gtt tat tac tgc act caa gtt tat tat ctg tgc acg ttc ggt gct 384 Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Gln Val Tyr Tyr Leu Cys Thr Phe Gly Ala 115 120 125 ggg acc aag ctg gag ctg aaa cgg gga ggt ggc gga tcc ggc ggc ggt 432 Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 gga agc gga ggt ggc ggt tcc cag act gtg gtg act cag gaa tct gca 480 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Ser Ala 145 150 155 160 ctc acc aca tca cct ggt gaa aca gtc aca ttc act tgt cgc tca agt 528 Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu Thr Val Thr Phe Thr Cys Arg Ser Ser 165 170 175 gct ggg gct gtt aca act agt aac tat gcc aac tgg gtc caa gaa aaa 576 Ala Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys 180 185 190 cca gat cat tta ttc tct ggt cta ata ggt ggt acc acc aac cga gct 624 Pro Asp His Leu Phe Ser Gly Leu Ile Gly Gly Thr Thr Asn Arg Ala 195 200 205 cca ggt gtt cct gcc aga ttc tca ggc tcc ctg att gga gac aag gct 672 Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala 210 215 220 gcc ctc acc atc aca ggg gca cag act gag gat gag gca ata tat ttc 720 Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe 225 230 235 240 tgt gtt cta tgg tac agc gac cgc tgg gtg ttc ggt gga gga gcc aaa 768 Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asp Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Ala Lys 245 250 255 ctg act gtc cta ggc ggt gga ggc ggc agc gga ggc ggt ggt tct ggc 816 Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 260 265 270 gga ggt gga tcc gac atc cag ctg acc cag agc cca agc agc ctg agc 864 Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 275 280 285 gcc agc gtg ggt gac aga gtg acc atc acc tgt aag gcc agt cag gat 912 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp 290 295 300 gtg ggt act tct gta gct tgg tac cag cag aag cca ggt aag gct cca 960 Val Gly Thr Ser Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 305 310 315 320 aag ctg ctg atc tac tgg aca tcc acc cgg cac act ggt gtg cca agc 1008 Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser 325 330 335 aga ttc agc ggt agc ggt agc ggt acc gac ttc acc ttc acc atc agc 1056 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser 340 345 350 agc ctc cag cca gag gac atc gcc acc tac tac tgc cag caa tat agc 1104 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser 355 360 365 ctc tat cgg tcg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa cgt ctc 1152 Leu Tyr Arg Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Leu 370 375 380 gag cac cac cac cac cac cac 1173 Glu His His His His His His 385 390 <210> 14 <211> 391 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 14 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser 20 25 30 Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Lys Ser 35 40 45 Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Gly Trp 50 55 60 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala 65 70 75 80 Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser 85 90 95 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Gln Ser Glu Asp Leu 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Gln Val Tyr Tyr Leu Cys Thr Phe Gly Ala 115 120 125 Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Ser Ala 145 150 155 160 Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu Thr Val Thr Phe Thr Cys Arg Ser Ser 165 170 175 Ala Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys 180 185 190 Pro Asp His Leu Phe Ser Gly Leu Ile Gly Gly Thr Thr Asn Arg Ala 195 200 205 Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala 210 215 220 Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe 225 230 235 240 Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asp Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Ala Lys 245 250 255 Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 260 265 270 Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 275 280 285 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp 290 295 300 Val Gly Thr Ser Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 305 310 315 320 Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser 325 330 335 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser 340 345 350 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser 355 360 365 Leu Tyr Arg Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Leu 370 375 380 Glu His His His His His His 385 390 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic linker peptide <400> 15 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 16 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 6-His tag <400> 16 His His His His His His 1 5 <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic linker peptide <400> 17 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met 1 5 10 15 <210> 18 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic linker peptide <400> 18 Leu Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 19 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic linker peptide <400> 19 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15

Claims

하기의 물질을 포함하는 진단용 제제, 치료용 제제 또는 이들의 조합을 표적으로 운반하기 위한 키트:

1) 적어도 하나 이상의 헵텐 부분(hapten moiety) 쪽에 친화력을 가지는 결합 부위 및 적어도 둘 이상의 표적 항원 쪽에 친화력을 가지는 결합 부위, 즉 세 개 이상의 결합 부위를 포함하는 다원자가, 멀티특이성 결합 단백질; 및

2) 진단용 제제, 치료용 제제 또는 이들의 조합, 연결 분자, 및 상기 1)의 결합 단백질 두 개가 상기 헵텐 부분에 동시에 결합하는 것을 허용하기 위해 정해진 적어도 두 개 이상의 헵텐 부분을 포함하는 운반 물질.
헵텐 부분에 대한 친화력을 가지는 첫 번째 결합 부위 및 동일하거나 또는 다른 표적 항원에 대한 친화력을 각각 가지는 두 번째 및 세 번째 결합 부위를 포함하는 다원자가 멀티특이성 결합 단백질.
제 2항에 있어서, 상기 표적 항원은 인간 질병과 관련된 결합 부위임을 특징으로 하는 결합 단백질.
제 3항에 있어서, 상기 인간 질병과 관련된 결합 부위는 암 결합 부위, 자가면역 질환 결합 부위, 감염성 질환 결합 부위, 심혈관 질환 결합 부위 및 염증 질환 결합 부위로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 결합 단백질.
제 2항에 있어서, 상기 첫 번째 결합 부위는 히스타민-숙시닐-글리실(HSG) 부분을 포함하는 분자에 대한 친화력을 가지고, 두 번째 및 세 번째 결합 부위는 각각 암종배아성 항원(carcinoembryonic antigen, CEA)에 대한 친화력을 가지는 결합 부위임을 특징으로 하는 결합 단백질.
제 5항에 있어서, 상기 결합 단백질은 쥐, 인간화, 인간 서열 또는 이들의 조합을 포함함을 특징으로 하는 단백질.
제 5항에 있어서, 상기 첫 번째 결합 부위는 상기 HSG 항원 결합 부위를 생성하기 위하여 서로 결합하는 첫 번째 및 두 번째 폴리펩티드를 포함함을 특징으로 하는 결합 단백질.
제 7항에 있어서, 상기 첫 번째 폴리펩티드는 도 4에 도시된 679 MAb의 V_H폴리펩티드를 포함하고, 두 번째 폴리펩티드는 도 4에 도시된 679 MAb의 V_K폴리펩티드를 포함하는 것임을 특징으로 하는 결합 단백질.
제 7항에 있어서, 상기 첫 번째 폴리펩티드는 도 5에 도시된 679 MAb의 V_H폴리펩티드를 포함하고, 두 번째 폴리펩티드는 도 5에 도시된 679 MAb의 V_K폴리펩티드를 포함하는 것임을 특징으로 하는 결합 단백질.
제 8항에 있어서, 상기 두 번째 결합 부위는 상기 첫 번째 암종배아성 항원 결합 부위를 생성하기 위하여 서로 결합하는 세 번째 및 네 번째 폴리펩티드를 포함하는 것임을 특징으로 하는 결합 단백질.
제 10항에 있어서, 상기 세 번째 폴리펩티드는 도 6에 도시된 hMN14 MAb의 V_H폴리펩티드를 포함하고, 네 번째 폴리펩티드는 도 6에 도시된 hMN14 MAb의 V_K폴리펩티드를 포함하는 것임을 특징으로 하는 결합 단백질.
제 8항에 있어서, 상기 세 번째 결합 부위는 상기 두 번째 암종배아성 항원 결합 부위를 생성하기 위하여 서로 결합하는 다섯 번째 및 여섯 번째 폴리펩티드를 포함하는 것임을 특징으로 하는 결합 단백질.
제 12항에 있어서, 상기 다섯 번째 폴리펩티드는 도 6에 도시된 hMN14 MAb의 V_H폴리펩티드를 포함하고, 여섯 번째 폴리펩티드는 도 6에 도시된 hMN14 MAb의 V_K폴리펩티드를 포함하는 것임을 특징으로 하는 결합 단백질.
제 12항에 있어서, 상기 첫 번째 및 네 번째 폴리펩티드는 첫 번째 연결기에 의해 결합되고, 상기 네 번째 및 다섯 번째 폴리펩티드는 두 번째 연결기에 의해 결합되며, 상기 두 번째 및 세 번째 폴리펩티드는 세 번째 연결기에 의해 결합되고, 및 상기 세 번째 및 여섯 번째 폴리펩티드는 네 번째 연결기에 의해 결합됨을 특징으로 하는 결합 단백질.
제 14항에 있어서, 상기 첫 번째 연결기 및 세 번째 연결기는 각각 16개 아미노산 잔기를 포함하고 상기 두 번째 연결기 및 네 번째 연결기는 각각 5개의 아미노산 잔기를 포함함을 특징으로 하는 결합 단백질.
제 12항에 있어서, 상기 첫 번째 및 세 번째 폴리펩티드는 첫 번째 연결기에 의해 결합되고, 상기 세 번째 및 다섯 번째 폴리펩티드는 두 번째 연결기에 의해 결합되며, 상기 두 번째 및 네 번째 폴리펩티드는 세 번째 연결기에 의해 결합되고, 및 상기 네 번째 및 여섯 번째 폴리펩티드는 네 번째 연결기에 의해 결합됨을 특징으로 하는 결합 단백질.
제 16항에 있어서, 상기 첫 번째 연결기 및 세 번째 연결기는 각각 16개 아미노산 잔기를 포함하고 상기 두 번째 연결기 및 네 번째 연결기는 각각 5개의 아미노산 잔기를 포함함을 특징으로 하는 결합 단백질.
제 5항에 있어서, 상기 결합 단백질은 헤테로다이머임을 특징으로 하는 결합 단백질.
제 12항에 있어서, 상기 첫 번째, 두 번째, 세 번째, 네 번째, 다섯 번째 및 여섯 번째 폴리펩티드는 각각 첫 번째, 두 번째, 세 번째, 네 번째, 다섯 번째 및 여섯 번째 cDNA에 의해 인코드되는 것임을 특징으로 하는 결합 단백질.
제 19항에 있어서, 상기 첫 번째, 두 번째, 세 번째, 네 번째, 다섯 번째 및 여섯 번째 cDNA는 도 4 및 도 6에 도시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것임을 특징으로 하는 결합 단백질.
제 20항에 의한 결합 단백질을 인코딩하는 첫 번째, 네 번째 및 다섯 번째 cDNA를 포함하는 핵산 분자.
제 20항에 의한 결합 단백질을 인코딩하는 두 번째, 세 번째 및 여섯 번째 cDNA를 포함하는 핵산 분자.
제 20항에 의한 결합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 카세트.
제 23항에 있어서, 상기 발현 카세트는 플라스미드임을 특징으로 하는 발현 카세트.
제 24항에 의한 플라스미드를 포함하는 숙주세포.
적절한 배지에서 제 25항에 의한 숙주세포에서 배양하는 단계; 및

상기 배지로부터 결합 단백질을 분리하는 단계;

를 포함하는 결합 단백질의 제조 방법.
제 14항에 있어서, 상기 첫 번째, 두 번째, 세 번째, 네 번째, 다섯 번째 및 여섯 번째 폴리펩티드는 각각 첫 번째, 두 번째, 세 번째, 네 번째, 다섯 번째 및 여섯 번째 cDNA에 의해 인코드되는 것임을 특징으로 하는 결합 단백질.
제 27항에 있어서, 상기 첫 번째, 두 번째, 세 번째, 네 번째, 다섯 번째 및 여섯 번째 cDNA는 도 4 및 도 6에 도시된 핵산 서열을 가짐을 특징으로 하는 결합 단백질.
제 27항에 있어서, 상기 첫 번째, 세 번째 및 다섯 번째 cDNA는 첫 번째 단일 핵산 분자임을 특징으로 하는 결합 단백질.
제 29항에 있어서, 상기 두 번째, 네 번째 및 여섯 번째 cDNA는 두 번째 단일 핵산 분자임을 특징으로 하는 결합 단백질.
제 30항에 의한 결합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 발현 카세트.
제 31항에 있어서, 상기 발현 카세트는 플라스미드임을 특징으로 하는 발현 카세트.
제 32항에 의한 플라스미드를 포함하는 숙주세포.
적절한 배지에서 제 33항에 의한 숙주세포에서 배양하는 단계; 및

상기 배지로부터 결합 단백질을 분리하는 단계;

를 포함하는 결합 단백질의 제조 방법.
진단용 제제, 치료용 제제 또는 이들의 조합, 연결 분자, 및 하나 이상의 결합 단백질의 결합 부위가 상기 헵텐 부분에 동시에 결합하는 것을 허용하기 위해 정해진 적어도 두 개 이상의 헵텐 부분을 포함하는 운반 물질.
헵텐 연결 반응에 따른 운반 물질의 혼합물을 정제하는 단계; 및

상기 기질 농도 비를 결정하기 위하여 금속 결합 분석에서 정제된 혼합물을 노출하는 단계;

를 포함하여 운반 물질에 대한 헵텐의 기질 몰 농도를 결정함으로써 스크리닝하는 방법.
하기와 같은 단계를 포함하는 진단용 제제, 치료용 제제 또는 이들의 조합을 표적에 운반하는 방법:

1) 제 5항의 결합 단백질을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계;

2) 환자의 혈류에서 비결합된 단백질을 제거하기 위해 충분한 시간만큼 기다리는 단계; 및

3) 결합 단백질의 결합 부위에 결합하는 진단용 제제, 치료용 제조 또는 이들의 조합을 포함하는 운반물질을 상기 환자에게 투여하는 단계.
제 37항에 있어서, 상기 운반 물질은 첫 번째 결합 단백질의 하나의 결합 부위 및 두 번째 결합 단백질의 두 번째 결합 부위에 결합하는 것임을 특징으로 하는 방법.
제 37항에 있어서, 상기 진단용 제제 또는 치료용 제제는 동위원소, 약물, 독소, 사이토카인, 호르몬, 성장 인자, 접합체, 방사성 핵종 및 금속으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
제 39항에 있어서, 상기 동위원소는⁹⁰Y,¹¹¹In,¹³¹I,^99mTc,¹⁸⁶Re,¹⁸⁸Re,¹⁷⁷Lu,⁶⁷Cu,²¹²Bi,²¹³i 및²¹¹At로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
제 39항에 있어서, 상기 약물은 운반물질과 결합하는 제약임을 특징으로 하는 방법.
제 39항에 있어서, 상기 금속은 가돌리늄(Gadolinium) 및 조영제로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
제 42항에 있어서, 상기 조영제는 MRI 조영제, CT 조영제 및 초음파 조영제로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
하기와 같은 단계를 포함하는 인간 질병을 검출 또는 치료하기 위한 방법:

1) 제 2항의 결합 단백질을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계;

2) 환자의 혈류에서 비결합된 단백질을 제거하기 위해 충분한 시간만큼 기다리는 단계; 및

3) 결합 단백질의 결합 부위에 결합하는 진단용 제제, 치료용 제제 또는 이들의 조합을 포함하는 운반물질을 상기 환자에게 투여하는 단계.
제 40항에 있어서, 상기 인간 질병은 암, 자가면역 질환, 감염성 질환, 심혈관 질환 및 염증성 질환으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
히스타민-숙시닐-글리실 부분을 포함하는 분자에 대하여 친화력을 가지는 히스타민-숙시닐-글리실(HSG) 결합 부위; 금속 킬레이트 화합물 인듐-DTPA에 대한 친화력을 가지는 금속 킬레이트 화합물 인듐-DTPA 결합 부위; 및 암종배아성 항원에 대한 친화력을 가지는 암종배아성 항원 결합 부위를 포함하는 다원자가 멀티특이성 결합 단백질.
제 42항에 있어서, 상기 결합 단백질은 쥐, 인간화, 인간 서열 또는 이들의 조합을 포함함을 특징으로 하는 단백질.
제 42항에 있어서, 상기 결합 단백질은 도 8 및 도 9에 도시된 뉴클레타이드 서열에 의해 인코드되는 것임을 특징으로 하는 결합 단백질.
도 8 및 도 9에 도시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자.
제 49항에 의한 핵산 분자를 포함하는 발현 카세트.
제 50항에 있어서, 상기 발현 카세트는 플라스미드임을 특징으로 하는 발현 카세트.
제 24항에 의한 플라스미드를 포함하는 숙주세포.