MXPA04006327A - Metodos para generar agentes multivalentes, multiespecificos de dominios vh y vl. - Google Patents

Abstract

Esta invencion se refiere a proteinas de union multivalentes, multiespecificas y metodos para generar estos agentes de dominios VH y VL. La proteina de union tiene tres o mas sitios de union donde al menos un sitio de union se une con una porcion de hapteno y al menos dos sitios se unen con antigenos objetivo. La presente invencion se refiere ademas a heterodimeros trivalentes, biespecificos que tienen al menos un sitio de union con afinidad hacia las moleculas que contienen una porcion de histamina-succinilo-glicilo (HSG) y al menos dos sitios de union con afinidad hacia antigeno carcinoembrionico (CEA), y a heterodimeros trivalentes, triespecificos que tienen al menos un sitio de union con afinidad hacia moleculas que contiene una porcion HSG, al menos un sitio de union con afinidad hacia CEA, y al menos un sitio de union que tiene afinidad hacia un complejo de metal-quelato indio-DTPA. Ademas, esta invencion se refiere a vectores recombinantes utiles par la expresion de estos heterodimeros funcionales en un huesped adecuado.

Description

MÉTODOS PARA GENERAR AGENTES ULTI VAL ENTES, MULTIESPECÍFICOS DE DOMINIOS VH Y VL CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a proteínas de unión multivalentes, multi-específicas, y métodos para generar estos agentes de dominios VH y VL. La proteína de unión tiene tres o más sitios de unión en donde al menos un sitio de unión se une con una porción hapteno y al menos dos sitios se unen con antígenos objetivo. La presente invención además se relaciona a heterod ímeros trivalentes, biespecíficos que tienen al menos un sitio de unión con afin idad hacia las moléculas q ue contienen una porción de histamina-succini lo-glicilo (H SG) y al menos dos sitios de unión con afinidad hacia antígeno carcinoembriónico (CEA), y a heterodímeros trivalentes , triespecíficos que tienen al menos un sitio de unión con afinidad hacia las moléculas q ue contienen una porción de H SG, al menos uno de los sitios de unión con afinidad hacia CEA, y al menos un sitio de unión que tiene afin idad hacia un complejo de metal-quelato indio-DTPA. Además , esta invención se refiere a vectores recombinantes útiles para la expresión de estas proteínas recombinantes funcionales en una célula huésped.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las proteínas de unión elaboradas por el hombre, en anticuerpos monoclonales particulares y anticuerpos elaborados o fragmentos de anticuerpo, se han probado ampliamente y mostrado que son de valor en la detección y tratamiento dé varios desórdenes humanos, incluyendo cánceres, enfermedades autoinmunes, enfermedades infecciosas, enfermedades inflamatorias, y enfermedades cardiovasculares [Filpula y McGuire, Exp. Opin. Ther. Patentes (1999) 9:231 -245]. Por ejemplo, los anticuerpos marcados con isótopos radioactivos se han probado que visualizan tumores después de la inyección a un paciente utilizando detectores disponibles en la materia. La utilidad clínica de un anticuerpo o un agente derivado de anticuerpo es principalmente dependiente de su habilidad de unión a un antígeno de objetivo específico. La selectividad es valuable para suministrar un agente terapéutico o de diagnóstico, tales como isótopos, fármacos, toxinas, citoquinas, hormonas, factores de crecimiento, conjugados, radionúclidos, o metales, hacia una locación objetivo durante las fases de tratamiento y detección de un desorden humano, particularmente si el agente terapéutico o de diagnóstico es tóxico a tejido normal en el cuerpo. Las limitaciones principales de los sistemas de anticuerpo se discuten en Goldenberg, The American Journal of Medicine ( 1993) 94:298-299. Los parámetros preferidos en las técnicas de tratamiento y detección son la cantidad de la dosis inyectadas específicamente localizada en el (los) sitio (s) én donde las células objetivo se presentan y la proporción de toma, es decir, la proporción de la concentración de anticuerpo específicamente unido a aquella radioactividad presente en los tejidos normales circundantes. Cuando un anticuerpo se inyecta en la corriente sanguínea, este pasa a través de un número de compartimientos a medida que se metaboliza y excreta. El anticuerpo debe ser capaz de localizar y unirse al antígeno de célula objetivo mientras que pasa a través del resto del cuerpo. Los factores que controlan el antígeno objetivo incluyen la locación , tamaño, densidad de antígeno, accesibi lidad de antígeno, composición celular de tejido patológico, y la farmacocinética de los anticuerpos objetivo. Otros factores q ue afectan específicamente el tumor objetivo mediante anticuerpos incluyen la expresión de los antígenos objetivo, tanto en tejidos tumorales como otros , y toxicidad de médula ósea que se da como resultado de depuración de sangre lenta de los anticuerpos radiomarcados . La cantidad de anticuerpos objetivo aumentados por adicción mediante las células de tumor objetivo se influye por la vascularización y las barreras a la penetración de anticuerpo de los tumores, así como también la presión ¡ntratumoral . La toma no específica por órganos no objetivo tales como el h ígado, ríñones o médula ósea es otra limitación potencial de la técnica, especialmente para radioinmunoterapia , en donde la irrad iación de la médu la ósea frecuentemente origina la toxicidad limitante de dosis. Una solución sugerida , referida como "Sistema de Mejoramiento por Afinidad" (AES), es una técnica especialmente diseñada para superar las deficiencias del tumor objetivo med iante anticuerpos que llevan rad ioisótopos terapéuticos o de d iag nósticos [U S-5,256,395 ( 1993), Barbet et al. , Cáncer Biotherapy & Radiopharmaceuticals ( 1999) 14: 153-166] . El AES req uiere un hapteno bivalente radiomarcado y un anticuerpo ibiespecífico anti-tu mor/anti-hapteno q ue reconoce tanto el tumor objetivo como el hapteno radioactivo. La técnica incl uye inyectar el anticuerpo específico al paciente y permitir al anticuerpo bié§pecífico localizarse en el tumor objetivo. Después de una cantidad suficiente de tiempo para que el anticuerpo no unido se limpie de la corriente sangu ínea, se administra el hapteno radiomarcado. El hapteno se une al complejo de anticuerpo-antígeno localizado en el sitio de la célula objetivo para obtener beneficios terapéuticos o de diagnósticos. El hapteno no unido limpia el cuerpo. Barbet menciona la posibilidad de q ue un hapteno bivalente puede degradarse con un anticuerpo biespecífico, cuando el último se une a la superficie de tumor. Como resultado, el complejo radiomarcado es más estable y permanece en el tumor por un período más largo de tiempo. Adicionalmente, los métodos actuales para generar triacuerpos triespecíficos o biespecíficos poseen problemas. Estos métodos enseñan la síntesis de tres polipéptidos d istintitos , cada u no consistiendo de un dominio VH directamente unido a un dominio VL. Para un triacuerpo biespecífico que es bivalente para la especificidad de Hi VLi y monovalente para la especificidad de VH2/ L2. los tres polipéptidos podrían ser VHI -VL2 , VH2-VLI , y VHi -VL 1 . Para un triacuerpo triespecífico que es monovalente para cada una de las tres especificidades (VHi/VLi , VH2 L2. y H3 VL3) , los tres polipéptidos podrían ser VHI -VL2. H2-VL3. y H3- L I - Ya que cada poli péptido de cualquier diseño tiene el potencial de formar un triacuerpo por asociarse consigo mismo o con los otros dos polipéptidos , hasta 1 0 triacuerpos d istintos pueden prod ucirse, con solamente uno siendo la estructura correcta. Los procedimientos similares para producir tetrámeros multiespecíficos basados en el concepto de tetracuerpo podrían solamente mag nificar el n úmero productos laterales potenciales al agregar un cuarto polipépti'do. Además, los diseños multivalentes, multiespecíficos, tales como el diacuerpo en serie, también sufren de deficiencia potencial. Es improbable que con otros anticuerpos de elección, un homodímero pueda no formarse fácilmente si el polipéptido que consiste tanto de dominios VH como VL de dos diferentes anticuerpos puede plegarse de regreso sobre sí mismo para producir una cadena única biespecífica con monovalencia para cada especificidad. De hecho, se han elaborado pocas construcciones basadas sobre el diseño de diacuerpo en serie que produjo una estructura de cadena única biespecífica, en lugar de un diacuerpo en serie, en cada caso (Rossi y Chang, resultados no publicados). Por lo tanto, el acoplamiento entre cadenas de los dominios VH y VL es una posibilidad distinta cuando ambos tipos se presentan en el mismo polipéptido, especialmente cuando la distancia entre el los dominios VH y VL cognados es lo suficientemente larga y flexible. Los anticuerpos multivalentes, biespecíficos preparados al degradar químicamente dos diferentes fragmentos Fab' se han empleado exitosamente, junto con haptenos bivalentes aplicables, para validar la utilidad del AES para tumor objetivo mejorado tanto en modelos de animal como en pacientes humanos. Sin embargo, permanece una necesidad en la matera de producción de anticuerpos biespecíficos mediante tecnología de ADN recombinante que son útiles en un AES. Específicamente, permanece una necesidad de un anticuerpo que muestre la toma de anticuerpo mejorado en antígenos objetivo, anticuerpo reducido en la sangre, protección óptima de tejidos normales y células de preparaciones farmacéuticas tóxicas. Además, existe la necesidad de proteínas de unión que superen los problemas asociados con la generación de agentes basados en scFv de multivalencia y multiespecificidad.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a proteínas de unión multivalentes, multi-específicas y métodos para generar estos agentes de dominios VH y VL. La proteína de unión tiene tres o más sitios de unión en donde al menos un sitio de unión se une con una porción de hapteno y al menos dos sitios se unen con antígenos objetivo. La presente invención además se refiere a proteínas trivalentes, biespecíficos que tienen al menos un sitio de unión con afinidad hacia las moléculas que contienen una porción de histamina-succinilo-glicilo (HSG) y al menos dos sitios de unión con afinidad hacia antígeno carcinoembriónico (CEA), y a proteínas de unión trivalentes, triespecíficas, que tienen al menos un sitio de unión con afinidad hacia las moléculas que contienen una porción HSG, al menos uno de los sitios de unión con afinidad hacia CEA, y al menos un sitio de unión que tiene afinidad hacia un complejo de metal-quelato indio-DTPA. Además, esta invención se refiere a vectores recombinantes útiles para la expresión de estas proteínas de unión funcionales en un huésped (preferentemente un huésped microbiano). Una modalidad de la presente invención se refiere a heterodímeros trivalentes, biespecíficos, que se unen con porciones de hapteno y antígenos objetivo y a vectores recombinantes útiles para la expresión de estas proteínas recombinantes funcionales en un huésped (preferentemente huésped microbiano). Una segunda modalidad es un heterod ímero trivalente, biespecífico que tiene al menos un sitio de unión con afinidad hacia las moléculas que contienen una porción de HSG y al menos dos sitios de unión con afinidad hacia CEA, y a vectores recombinantes útiles para la expresión de estos heterodímeros funcionales en un huésped (preferentemente un huésped microbiano). Estos heterodímeros se producen por medio de tecnología de ADN recombinante y crean un nuevo AES que muestra afinidad específica para HSG y CEA. Una tercera modalidad es un heterodímero trivalente, triespecífico que tiene al menos un sitio de unión con afinidad hacia las moléculas que contienen una porción de HSG, al menos un sitio de unión con afinidad hacia CEA, y al menos un sitio de unión que tiene afinidad hacia un complejo de metal-quelato indio-DTPA. Esta modalidad incluye a vectores recombinantes útiles para la expresión de estos heterodímeros funcionales en un huésped microbiano. Estos heterodímeros se producen por medio de tecnología de ADN recombinante y crean un nuevo AES. Una cuarta modalidad de esta invención se refiere a un método para suministrar un agente de diagnóstico, un agente terapéutico, o una combinación del mismo a un objetivo. El método incluye administrar a un sujeto en necesidad del agente con la proteína de unión, esperar una cantidad suficiente de tiempo para que una cantidad de la proteína de no unión limpie la corriente sanguínea del sujeto, y administrar la molécula vehículo. Una modalidad adicional de la presente invención es un método para detectar o tratar un desorden humano con el método para suministrar el agente a un objetivo. Un objeto de la presente invención es producir una proteína de unión que sea capaz de unirse con porciones de hapteno y antígenos. Todavía un objeto más de esta invención es producir vectores que contengan secuencias de ADN que se codifiquen para los anticuerpos multi-específicos y que se expresen fácilmente en células huésped microbianas. Además, esta invención incluye un método para producir un heterod ímero mediante tecnología de ADN recombinante. El método incluye cultivar la célula huésped en un medio adecuado y separar el heterodímero del medio. Además, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo de clones de cADN que consisten de un polinucleótido que codifica los polipéptidos contenidos en las Figuras 4-7 (Seq I Ds). La secuencia codificadora de ADN de ácidos nucleicos y los aminoácidos codificados correspondientes para 679-scFv-L5 y hMN14-scFv-L5 se contienen en las Figuras 4 y 6 (Seq IDs), respectivamente. El ADN que se codifica para m734 VH y VL se encuentran en la Figura 7.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra una representación esquemática del polipéptido Fv (scFv) de cadena única 679 que se sintetiza en E. coli del plásmido de expresión 679-scFv-L5 y forma un heterod ímero 679. La construcción de gen para el polipéptidó no procesado contiene el péptido de señal pe1 B, las secuencias codificadoras 679 VH y VL acopladas por un enlazador de aminoácidos 5, Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (G4S), y la etiqueta de afinidad de histidina (His) dé seis terminales dé c'arboxi. La figura también muestra un dibujo de figura de adhesión del polipéptido maduro después de la remoción proteolítica del péptido conductor pe1B y un dibujo de figura de adhesión de un heterodímero 679, incluyendo los sitios de unión HSG. La Figura 2 muestra una representación esquemática del polipéptido h N14scFv que se sintetiza en E. coli del plásmido de expresión hMN14-scFv-L5 y forma un heterodímero hMN14. La construcción de gen para el polipéptido no procesado contiene el péptido de señal pe1B, secuencias codificadoras de hMN14VH y VK acoplados por un enlazador de 5 aminoácidos, la etiqueta de afinidad de histidina de 6 terminales carboxilo. La figura también muestra un dibujo de figura de adhesión del polipéptido maduro que sigue la remoción proteolítica del péptido conductor pe1B, y un dibujo de figura de adhesión de un heterodímero hMN14, incluyendo sitios de unión CEA. La Figura 3 muestra una representación esquemática del polipéptido m734-scFv que se sintetizará en E. coli del plásmido de expresión 734-scFv-L5 y puede formar un heterodímero 734. La construcción de gen para el polipéptido no procesado contiene el péptido de señal pe1B, secuencias codificadoras acopladas por un enlazador de 5 aminoácidos, y la etiqueta de afinidad de histidina de 6 terminales carboxilo. La figura también muestra un dibujo de figura de adhesión del polipéptido maduro que sigue la remoción proteolítico del péptido conductor peí B, y un dibujo de figura de adhesión de un heterodímero 734, incluyendo sitios de unión de complejo de metal-quelato indio-DTPA.

La Figura 4 es la ¡secuencia codificadora de ácidos nucleicos y aminoácidos codificados para 679-scFv-L5. 1 .66 es la secuencia codificadora para el péptido conductor pe 1 B. 70-426 es la secuencia codificadora para 679-VH- 427-441 es la secuencia cod ificadora para péptido enlazador (GGGGS) 442-780 es la secuencia cod ificadora para 679V . 787-804 es la secuencia cod ificadora para la etiqueta de afinidad de histidina 6. La Figura 5 es la secuencia codificadora de ácidos nucleicos y aminoácidos codificados para h679-scFv-L5. 1 .66 es la secuencia codificadora para el péptido conductor pe1 B. 70-426 es la secuencia cod ificadora para h679VH. 427-444 es la secuencia codificadora para el péptido enlazador (GGGGS). 442-780 es la secuencia codificadora para h679VK. 787-804787-804 es la secuencia codificadora para la etiqueta de afinidad de histidina 6. La Figura 6 es la secuencia codificadora de ácidos nucleicos y aminoácidos codificados para h MN 1 -scFv-L5. 1 -66 es la secuencia codificadora para el péptido conductor pe1 B. 70-243 es la secuencia codificadora para h M N 14VH. 424-438 es la secuencia codificadora para el péptido enlazador (GGGGS). 439-759 es la secuencia cod ificadora para hMN 14VK. 766-783 es la secuencia cod ificadora para la etiqueta de afinidad de histid ina 6. La Figura 7 es la secuencia codificadora de ácidos nucleicos y aminoácidos codificados para m734 VH y VL. La Figura 8A-8B es la secuencia codificadora de AD N y secuencia de aminoácidos reducida para la cadena VH de TS 1 . 1 -63 es la secuencia codificadora para péptido conductor pe1 B. 90-405 es la secuencia cod ificadora para h MN 14VK. 469-81 9 es la secuencia cod ificadora para m734VH. 866-1222 es la secuencia codificadora para m679VH. La Figura 9A-9B es la secuencia codificadora de ADN y secuencia de aminoácidos ded ucido para la cadena VL de TS 1 . 1 -63 es la secuencia codificadora para el péptido conductor pe 1 B. 70-408 es la secuencia cod ificadora para m679VK. 452-768 es la secuencia codificadora para m734Vu. 829- 1 149 es la secuencia codificadora para hMN 14V«.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS Al menos q ue se especifiq ue de otra forma, "un" o "uno" significa "u no o más". U na modalidad de esta invención se refiere a proteínas de unión multivalentes , multi-específicas, y métodos para generar estos agentes de dominios VH y VL. La proteína de unión tiene tres o más sitios de unión en donde al menos un sitio de unión se une con una porción de hapteno y al menos dos sitios se unen con antígenos objetivo. La presente invención además se refiere a heterod ímeros trivalentes, biespecíficos que tienen al menos un sitio de unión con afinidad hacia las moléculas que contienen una porción de histamina-succinilo-glicilo (HSG) y al menos dos sitios de unión con afinidad hacia antígeno carcinoembriónico (CEA), y a heterod ímeros trivalentes, triespecíficos q ue tienen al menos un sitio de unión con afinidad hacia las moléculas q ue contienen una porción H SG , al menos uno de los sitios de limón con afinidad Hacia CEA, y al menos un sitio de un ión q ue tiene afin idad hacia un complejo de metal-quelato indio-DTPA. Además, esta invención se refiere a vectores recombinantes útiles para la expresión de estos heterodímeros funcionales en un huésped microbiano. Estructuralmente, los anticuerpos completos se componen de una o más copias de una unidad en forma de Y que contiene cuatro cadenas de polipéptidos. Dos cadenas son copias idénticas de un polipéptido, referidas como cadena pesada, y dos cadenas son copias idénticas, referidas como cadena ligera. Cada polipéptido se cod ifica por ADN individ ual o por secuencias de ADN conectadas. Las dos cadenas pesadas se en lazan juntas por uno o más en laces de disulfuro y cada cadena ligera se enlaza a una de las cadenas pesadas med iante u n enlace de disulfuro. Cada cadena tiene domi nios variables de una Terminal N, referidos como VH y VL para las cadenas, ligera y pesada , respectivamente, y la asociación no covalente de un par de VH y VL, referida como el fragmento Fv, forma un sitio de unión de antígeno. Los fragmentos Fv discretos son propensos a la disociación en concentraciones bajas en prote ína y bajo cond iciones fisiológicas [Glockshuber et al. Biochemistry ( 1 990) 29: 1 362- 1 367] , y tienen uso limitado. Para mejorar la estabilidad y mejorar la utilidad potencial, se han producido y estudiado extensivamente los fragmentos Fv de cadena única recombinantes (scFv), en los cuales la terminal C del dominio VH (o VL) se une a la terminal N del dominio VL (o VH) mediante un en lazador de péptido de longitud variable. [Para una revisión reciente, ver Hudson y Kortt, J .

Immunological methods (1999) 231: 177-189]. ScFv puede producirse por métodos descritos en US-4,946,778 (1990) y US-5, 132,405 (1992). ScFvs con enlazadores mayores a 12 residuos de aminoácidos en longitud (por ejemplo, enlazadores de 15 o 18 residuos) permiten la interacción entre los dominios VH y VL sobre la misma cadena y generalmente forman una mezcla de monómeros, heterodímeros y cantidades pequeñas de multímeros más altos en masa [US-4,642,334 (1987); Kortt et al., Eur. J. Biochem. (1994) 221:151-157]. ScFvs con enlazadores de 5 residuos de aminoácidos o menos, sin embargo, prohiben el acoplamiento intramolecular de los dominios VH y VL sobre la misma cadena, forzando el acoplamiento con dominios VH y VL sobre una cadena diferente. Los enlazadores entre 3 y 12 residuos forman predominantemente dímeros [Atwell et al., Protein Engineering (1999) 12:597-604]. Con enlazadores entre 0 y 2 residuos, las estructuras triméricas (denominadas triacuerpos), tetraméricas (denominadas tetracuerpos) u oligoméricas más altas de scFvs son útiles; sin embargo, los modelos exactos de oligomerización parecen depender de la composición así como también de la orientación de los dominios V, además de la longitud del enlazador. Por ejemplo, scFvs del anticuerpo anti-neuraminidasa NC10 formaron predominantemente trímeros (orientación VH y VL) o tetrámeros (orientación VL o VH) con enlazadores de 0 residuos [Dolezal et al., Protein Engineering (2000) 13:556-574]. Para los scFvs construidos de NC10 con enlazadores de 1 o 2 residuos, la orientación de VH a VL formó predominantemente heterodímeros [Atwell et al., Protein Engineering (1999) 12:597-604]; en contraste, la orientación Vu a VH formó una mezcla de tetrámeros, trímeros; dímeros, y multímeros más altos en masa [Dolezal et al., Protein Engineering (2000) 13:565-574]. Para los scFvs construidos del anticuerpo anti-CD19 HD37 en la orientación de VH a VL, el enlazador de 0 residuos formó exclusivamente trímeros y el enlazador de 1 residuo formó exclusivamente tetrámeros [Le Gall et al., FEBS Letters (1999) 453:164-168]. A medida que la asociación no covalente de dos ó más moléculas de scFv puede formar anticuerpos funcionales, triacuerpos y tetracuerpos, que son multivalentes pero monoespecíficos, una asociación similar de dos o más diferentes moléculas de scFv, si se construye adecuadamente, puede formar multímeros de scFv multiespecíficos funcionales. Los diacuerpos, triacuerpos, y tetracuerpos monoespecíficos con valencias múltiples se han obtenido utilizando enlazadores de péptido que consisten de 5 residuos de aminoácidos o menos. Los diacuerpos biespecíficos son generalmente heterodímeros de dos diferentes scFvs, cada scFv comprende el dominio VH de un anticuerpo conectado por un enlazador corto al dominio VL de otro anticuerpo. Se han elaborado varios diacuerpos biespecíficos utilizando un vector de expresión di-cistrónico que contiene en un cistrón, una construcción de gen recombinante que comprende VHi-enlazador-VL2 y en el otro cistrón una segunda construcción de gen recombinante que comprende VH2-enlazador-VLi. [Ver Holliger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1993) 90:6444-6448; Atwell et al., Molecular Immunology (1996) 33:1301-1302; Holliger et al., Nature Biotechnology (1997) 15:632-631; Helfrich et al., Int. J. Cáncer (1998)76: 232-239; Kipriyanov et al., Int. J. Cáncer (1998)77: 763-772; Holiger et al, Cáncer Research ( 1 999)59: 2909-291 6]. Los métodos para construir scFvs se describen en US-4, 946, 778 ( 1990) y US-5, 1 32,405 ( 1992). Los métodos para producir proteínas de unión multivalentes, multiespecíficas en base a scFv se describen en US-5,837,242 ( 1 998), US-5,844, 094 ( 1998) y WO-98/44001 ( 1 998), se describen en diacuerpos, y en PCT/DE99/01350 para diacuerpos en serie. Los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse mediante tales métodos como tecnología de elaboración recombinante, conjugación química, y cuadroma. Los métodos para elaborar los agentes en base a scFv de multivalencia y multiespecificidad al construir dos cadenas de polipéptido, uno comprendiendo los dominios VH de al menos dos anticuerpos y el otro los dominios correspondientes VL, se describen en US-5,989,830 ( 1 999) y US-6, 239,259 (2001 ). Los métodos alternativos para elaborar proteínas de unión de antígeno multivalentes y multiespecíficas de dominios VH y VL se describen en Pat. de E. U . No. 5,989,830 y Pat. de E. U . No. 6, 239 ,259. Tales proteínas de unión de antígeno multiespecíficas y multivalentes se obtienen al expresar un vector discistrónico que codifica dos cadenas de polipéptido, con una cadena de polipéptido consistiendo de dos o más dominios VH (de los mismos o diferentes anticuerpos) conectados en serie por un enlazador de péptido y la otra cadena de polipéptido consistiendo de dominios VL complementarios conectados en serie mediante un enlazador de péptido. Más recientemente , un d iacuerpo en serie tetravalente (denominado tandab) con especificidad dual, también se ha reportado [Cochlovius et al. , Cáncer Research (2000) 60: 4336-4341 ] . El tandab biespecífico es un dímero de dos polipéptidos idénticos, cada uno conteniendo cuatro dominios variables de dos diferentes anticuerpos (VHi , n , H2 , L2) enlazados en una orientación para facilitar la formación de dos sitios de unión potenciales para cada una de las dos especificidades diferentes en la auto asociación. Una modalidad de la presente invención es una proteína objetivo trivalente, biespecífica que comprende dos cadenas de polipéptido heterólogas asociadas no covalentemente para formar tres sitios de unión, dos de los cuales tienen afinidad por un objetivo y un tercero qué tiene afinidad por un hapteno que puede unirse a un vehículo para un agente terapéutico y/o de diagnóstico. En una modalidad preferida, la proteína de unión tiene dos sitios de unión CEA y un sitio de unión HSG. Los agentes objetivo trivalentes, biespecíficos tienen dos diferentes scFvs, un scFv contiene dos dominios VH de un anticuerpo conectado por un enlazador corto al dominio VL de otro anticuerpo y el segundo scFv contiene dos dominios VL del primer anticuerpo conectado por un enlazador corto al dominio VH del otro anticuerpo. Los métodos para generar agentes multiespecíficos, multivalentes de dominios VH y VL con la condición de que cadenas individuales se sinteticen de un plásmido de ADN en un organismo huésped se componen completamente de dominios VH (la cadena VH) en tal forma que cualquier agente de multivalencia y multiespecificidad puede producirse mediante asociación no covalente de una cadena VH con una cadena VL. Por ejemplo, la formación de un agente triespecífico, trivalente, la cadena VH consistirá de las secuencias de aminoácido de tres dominios VH, cada uno de un anticuerpo de diferente especificidad, unido por enlázádores de péptidó de longitudes variables, y la cadena VL consistirá de dominios Vu complementarios, unidos a enlazadores de péptido similares a aquellos utilizados para la cadena VH.

Ya que los dominios de VH y VL de anticuerpos se asocian en una forma anti-paralela, el método preferido en esta invención tienen los dominios VL en la cadena VL ordenada en el orden inverso de los dominios VH en la cadena VH > según se muestra en el diagrama de abajo. cadena VH: NH2 VH1 -La-VH2-Lb-VH3 COOH cadena VL: NH2 VL3-Lb-VL2-La-VL1 COOH Los enlazadores de péptido La y Lb pueden ser los mismos o diferentes. Los dominios más variables pueden incluirse para aumentar la valencia del número de especificidades. Por ejemplo, los dos polipéptidos mostrados abajo pueden formar un dimero biespecífico tetravalente que es bivalente para cada una de las dos especificidades. cadena VH: NH2 VH 1 -La-VH 1 -Lb-VH2-Lc-VH2 COOH cadena VL: NH2 VL2-Lc-VL2-Lb-VL1 -La-VL1 COOH Los enlazadores de péptido La, Lb, y Le pueden ser los mismos o diferentes. Queda determinarse si el orden de los dominios variables en cada cadena puede ser crítico para retener la actividad funcional de cada especificidad . Una modalidad adicional de la presente invención utiliza tres anticuerpos monoclonales, 679, hMN 14, y 734, para producir los dominios VH y VL para construir heterod ímeros específicos de antígeno. Los métodos para elaborar y utilizar hMN 14 y 734 se describen en las Nos. de Serie 09/337,756 , 09/823,746 y 10/1 50,654, ios contenidos de las cuales se incorporan en la presente para referencia en su totalidad . El anticuerpo monoclonal de murinp designado 679 (un IgG I, K) se une con alta afinidad a las moléculas que contienen porción de tres péptidos histamina succinilo glicilo (HSG) (Morel et al. , Molecular immunology, 27, 995- 1 000, 1 990). La secuencia de nucleótidos que pertenece a los dominios variables (VH y VK) de 679 se ha determinado (Qu ef al. resultados no publicados) VK es uno de dos isotipos de las cadenas ligeras de anticuerpo, Vu. La función de los dos isotipos es idéntica . Según se representa en la Figura 1 , el d iseño de la construcción de gen (679-scFv-L5) para expresar un heterodímero 679 posee las siguientes características: 1 ) El extremo de terminal carboxilo de VH se enlaza al extremo de terminal amino de VK mediante el enlazador de péptido Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (G4S). El uso del enlazador de péptido G4S permite al polipéptido secretado dimerizarse en un heterod ímero, formando dos sitios de un ión para HSG . 2) Una secuencia de péptido de señal de conductor pe 1 B precede el gen VH para facilitar la síntesis del polipéptido en el espacio periplásmico de E. coli. 3) Se agregan seis residuos de histidina (His) a la terminal carboxilo para permitir la purificación por IMAC. La secuencia cod ificadora de ADN de ácidos nucleicos y los aminoácidos cod ificados correspondientes para 679-scFv-L5 se contienen en la Figura 4 (Seq IDs) . La Figura 1 también incluye un dibujo de figura de ad hesión del polipéptido maduro después de la remoción proteol ítica del péptido conductor pe1 B y un d ibujo de figura de ad hesión de un heterod ímero 679 , incluyendo los sitios de unión HSG . 679 puede ser humanizado o completamente humano para ayudar a evitar una respuesta adversa al anticuerpo murinó; hMN14 es un anticuerpo monoclonal humanizado (Mab) que se une específicamente a CEA (Shevitz et al., J. Nucí. ed., suppl., 34.217P, 1993; US-6,254,868 (2001)). Mientras que los Mabs fueron murino, ahora se utilizan los reactivos de anticuerpo humanizado para reducir la respuesta de anticuerpo de anti-ratón humano. Las regiones variables de este anticuerpo se elaboraron en una construcción de expresión (hMN14-scFv-15). Según se representa en la Figura 2, el diseño de la construcción de gen (hMN14-scFv-L5) para expresar un heterodímero hMN14 posee las siguientes características: 1) El extremo de terminal carboxilo de VH se enlaza al extremo de terminal amino de VK mediante el enlazador de péptido Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (G4S). El uso del enlazador de péptido G4S permite al polipéptido secretado dimerizarse en un heterodímero, formando dos sitios de unión para CEA. 2) Una secuencia de conductor pe1B precede el gen VH para facilitar la síntesis del polipéptido en el espacio periplásmico de E. coli. 3) Se agregan seis residuos de histidina (His) a la terminal carboxilo para permitir la purificación por IMAC. La secuencia codificadora de ADN de ácidos nucleicos y los aminoácidos codificados correspondientes para hMN14-scFv-L5 se contienen en la Figura 6 (Seq IDs). La Figura 2 también incluye un dibujo de figura de adhesión del polipéptido maduro que sigue a la remoción proteolítica del péptido conductor pe1B y un dibujo de figura de adhesión de un heterodímero hMN14, incluyendo los sitios de unión CEA. 734 es un anticuerpo monoclonal humanizado diseñado que se une con alta afinidad al complejo de metal-quelato indio-DTPA (ácido dietilenotriamina-pentaacéticü). Según se representa en la Figura 2, el diseño de la construcción de gen (734-scFv-L5) para expresar un heterodímero 734 posee las siguientes características: 1 ) El extremo de terminal carboxilo de VH se enlaza al extremo de terminal amino de VK mediante el enlazador de péptido Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (G4S). El uso del enlazador de péptido G4S permite al polipéptido secretado dimerizarse en un heterod ímero, formando dos sitios de unión para HSG. 2) Una secuencia de péptido de señal de conductor pe1 B precede el gen VH para facilitar la síntesis del polipéptido en el espacio periplásmico de E. coli. 3) Se agregan seis residuos de histidina (His) a la terminal carboxilo para permitir la purificación por I MAC. La secuencia codificadora de ADN de ácidos nucleicos y los aminoácidos codificados correspondientes para 734-scFv-L5 se contienen en la Figura 7 (Seq IDs). La Figura 3 también incluye un dibujo de figura de adhesión del polipéptido maduro después de la remoción proteolítica del péptido conductor pe 1 B y un dibujo de figura de adhesión de un heterodímero 734, incluyendo los sitios de unión In-DTPA. 734 puede ser humanizado o completamente humano para ayudar a evitar una respuesta adversa al anticuerpo murino. Los vectores de expresión di-cistrónica se construyeron a través de una serie de procedimientos de sub-clonación. El cásete de expresión di-cistrónica para 679xhMN14xhMN 14 biespecífico trivalente puede contenerse en un plásmido, el cual es un ADN de doble filamento, pequeño, que forma un elemento genético de auto replicación extra-cromosomal en una célula huésped. Un vector de clonación es una molécula de ADN que puede replicarse en sí mismo en una célula huésped microbiana . Esta invención además incluyé un vector que expresa heterod ímeros trivalentes, biespecíficos . Una célula h uésped acepta un vector para la reproducción y el vector se replica cada vez que la célula huésped se divide. Una célula huésped comúnmente utilizada es Escherichia coli (E . Coli), sin embargo, se encuentran dispon ibles otras células huésped . La gran producción de frag mentos de anticuerpo recombinante disponibles a través de la reproducción de célula huésped hace de estos anticuerpos un sistema de suministro viable. Cuando el cásete d i-cistrón ico se expresa en E. coli, algunos de los polipéptidos se pliegan y forman espontáneamente heterod ímeros trivalentes , biespecíficos, solubles. El heterodímero trivalente, biespecífico, mostrado tiene dos polipéptidos que i nteractúan entre sí para formar un sitio de unión HSG q ue tiene alta afinidad para HSG y cuatro polipéptidos que se asocian para formar los dos sitios de unión CEA que tienen alta afinidad para antígenos CEA. Los antígenos se unen mediante anticuerpos específicos para formar complejos de antígeno-anticuerpo, los cuales se mantienen juntos mediante las i nteracciones no covalentes del antígeno degradado y las moléculas de anticuerpo. El heterodímero trivalente, triespecífico, tiene dos polipéptidos que interactúan entre sí para formar un sitio de unión H SG que tiene alta afinidad para HSG , dos polipéptidos que se asocian para formar un sitio de u nión CEA que tiene alta afinidad para a ntígenos CEA, y dos polipéptidos q ue se asocian para formar un sitio de unión de complejo de metal-q uelato ind ió-DTPA q ue tiene alta afinidad para complejo de metal-quelato ind io-DTPA. Dos construcciones para la expresión de heterod ímeros biespecíficos de 679xhMN Í 4xhMN14, se han diseñado, construido y probado. BS6 o BS8 (-80 kDa) contienen dos sitios de unión para CEA y un sitio de unión para HSG. BS6 difiere de BS8 en el ordenamiento de dominios V respectivos sobre los dos polipéptidos. Los polipéptidos constituyentes BS6 son h N 14VH-(La)-hMN 14VK-(Lb)-679VH-6His y 679VK-(Lb)-h N14VH-(La)-hMN 14VK-6His. Los polipéptidos que comprenden BS8 son hMN14VH-(L5)-hMN 14VH-(Lb)-679VH-6His y 679VK-(Lb)-hMN14VK-(La)-hMN 14V«-6H¡s. Para BS6, el polipéptido VH del MAb hMN 14 se conecta al polipéptido VK del MAb hMN 14 mediante un enlazador de oligopéptido, el cual se conecta al polipéptido VH del MAb 679 mediante un enlazador de oligopéptido, y el polipéptido VK del MAb 679 se conecta al polipéptido VH del MAb hMN 14 mediante un enlazador de oligopéptido q ue se conecta al polipéptido V« del MAB hMN 14 mediante un enlazador de oligopéptido. Cada cadena forma una mitad del heterodímero trivalente, biespecífico 679xhMN14xhMN 14. BS8 se compone del polipéptido VH del MAb hMN 14 conectado al polipéptido VH del MAb hMN 14 mediante un enlazador de oligopéptido, el cual se conecta al polipéptido VH del MAb 679 mediante un enlazador de oligopéptido y el polipéptido VK del MAb 679 conectado al polipéptido VK del MAb hMN 14 mediante un enlazador de oligopéptido, el cual se conecta al polipéptido VK del MAb hMN 14 mediante un enlazador de oligopéptido. Cada cadena forma una mitad del heterodímero 679xhMN 14xhMN14. Los enlazadores de oligopéptido en BS6 y BS8 pueden ser idénticos o diferentes. La secuencia codificadora de ADN de ácidos nucleicos y los aminoácidos codificados correspondientes para las secuencias de polipéptidos, primera y segunda, de BS6 son hMN 14VH-(La)- hMN14VK-(Lb)-679VH-6His y 679VK-(Lb)-hMN 4VH-(La)-hMN 14VK-6H¡s, y para BS8 son hMN 14VH-(La)-hMN 14VH-(Lb)-679VH-6His y 679VK-(Lb)-hMN14VK-(La)-hMN14VK-6His, en donde VH y VK hMN 14, y VH y VK 679 se encuentran en las Figuras 6 y 4 (SEQ ID), respectivamente. La proteína de unión trivalente, triespecífica, TS1 , tiene un sitio de unión para CEA, un sitio de unión para HSG, y un sitio de unión para metal-quelato indio-DTPA. Los polipéptidos constituyentes TS1 son hMN 14VH— (La)— 734VH— (Lb)— 679VH y 679VK— (Lb)— 734VK— (La)— hMN14VK. Para TS 1 , el polipéptido VH del MAb hMN 14 se conecta al polipéptido VH del MAb 734 mediante un enlazador de polipéptido, el cual se conecta al polipéptido VH del MAb 679 mediante un enlazador de oligopéptido, y el polipéptido VK del MAb 679 se conecta al polipéptido VK del MAb 734 mediante un enlazador de oligopéptido que se conecta al polipéptido VK del MAB hMN 14 mediante un enlazador de oligopéptido. Cada cadena forma una mitad del heterodimero trivalente, triespecífico, hMN 14x734x679. Los enlazadores pueden ser idénticos o diferentes. VH y VK m734 se encuentran en la Figura 7 (SEQ ID). El último uso de estas proteínas de unión trivalentes, biespecíficos, es para pre-objetivar los tumores positivos CEA para el suministro específico subsecuente de agentes terapéuticos o de diagnóstico llevados por los péptidos que contienen HSG. Estos heterodímeros se unen selectivamente a dos antígenos objetivo que se permiten para la afinidad aumentada y un tiempo de residencia más largo en la locación deseada. BS6 y BS8 son agentes pre-objetivo atractivos debido a su habilidad para lograr los niveles más altos de toma de tumor debido a la unión CEA divalente y los tiempos de circulación más largos. Además, los heterodímeros unidos no antígeno se limpian del cuerpo rápidamente y se minimiza la exposición de tejidos normales. Los agentes terapéuticos y de diagnóstico pueden incluir isótopos, fármacos, toxinas, citoquinas, hormonas, factores de crecimiento, conjugados, radionúclidos, y metales. Por ejemplo, se utiliza el metal gadolinio para la representación por imágenes de resonancia magnética y MRI , CT, y agentes de contraste de ultrasonido, también se utilizan. Los ejemplos de radionúclidos son, por ejemplo, 90Y, 1 1 1 ln, 13 l , 99mTc, 186Re, 188Re, 177Lu, 67Cu, 2 2B¡, y 211At. Otros radionúclidos también se encuentran disponibles como agentes terapéuticos o de diagnóstico. Dependiendo de las especificidades elaboradas en estos agentes, las aplicaciones potenciales son cáncer, terapia de enfermedad autoinmune e infecciosa, las cuales pueden lograrse al invocar respuestas inmunes o en combinación con tecnología AES utilizando haptenos radioactivos o conjugados de hapteno de fármaco. Los agentes tetraespecíficos y triespecíficos pueden ser útiles en la detección y diferenciación de células objetivo específicas en las muestras sanguíneas. Además, la presente invención evita el problema de formar múltiples productos laterales debido a que solamente necesita que dos polipéptidos complementarios se combinen para formar estructuras funcionales, y los polipéptidos idénticos nunca pueden asociarse. Por lo tanto, pueden formarse contaminantes no inactivos debido al acoplamiento inadecuado de las cadenas de polipéptido. La presente invención evita el problema de acoplamiento intramolecular debido a q ue cada cadena de polipéptido contiene solamente los dominios VH o VL y por lo tanto, pueden formar estructuras solamente cuando se asocian con la otra cadena de polipéptido. La presente invención evita el problema de acoplamiento intramolecular debido a q ue cada cadena de polipéptido contiene solamente domin ios VH o VL (BS8 y TS 1 ) , o puede consistir de un número desigual de dominios VH y VL (BS6), y por lo tanto puede formar solamente estructuras funcionales cuando se asocia con la cadena complementaria. A pesar de que Davis et al. , describieron un procedimiento similar (US-5,989,830 (1 999) y U S-6 ,239,259 (2001 )) para construir proteínas multiespecíficas, mu ltivalentes a base del acoplamiento de dos cadenas de polipéptido, una comprendiéndose de los dominios VH de al menos dos anticuerpos y la otra los dominios VL correspondientes, se proporcionó poca evidencia que establece la identidad molecular de cada molécula multiespecífica multivalente. El suministro de un agente terapéutico o de diagnóstico hacia un objetivo para diagnosis o tratamiento de acuerdo con la invención incluye admin istrar un paciente con la proteína de unión , esperar una cantidad suficiente de tiempo por una cantidad de la proteína no unida para limpiar la corriente sangu ínea del paciente, y administrar un agente terapéutico o de diagnóstico que se una a un sitio de unión de la protema de unión. El diagnóstico además req uiere la etapa de detectar las proteínas de unión con técnicas conocidas. La molécula de vehículo terapéutico o de diagnóstico comprende un agente diag nóstica o terapéuticamente eficiente, una porción de enlace, y una o más porciones de hapteno. Las porciones de hapteno se coióban para permitir la unión simultánea de las porciones de hapteno con la proteína de unión. La administración de la proteína de unión y agentes terapéuticos o de diagnóstico de la presente invención a un mamífero puede ser intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intrapleural, intratecal, por perfusión a través de un catéter regional, o por inyección intralesional directa. Cuando se administra la porción de unión mediante inyección, la administración puede ser por infusión continua o por bolos múltiples o únicos. El agente terapéutico o de diagnóstico no mezclado y anticuerpo específico pueden proporcionarse como un equipo para el uso diagnóstico o terapéutico humano en un vehículo de inyección farmacéuticamente aceptable, preferentemente salina regulada por fosfato (PBS) en pH fisiológico y concentración. La preparación preferentemente será estéril, especialmente si se pretende que es utilice en humanos. Los componentes opcionales de tales equipos incluyen estabilizadores, reguladores, reactivos de marcado, radioisótopos, compuestos paramagnéticos, segundo anticuerpo para depuración mejorada, y jeringas convencionales, columnas, frascos, y lo similar. La proteína de unión multi-específica, multivalente, es útil para diagnosticar y tratar varios desordenes humanos, incluyendo cáncer, enfermedades autoinmunes, enfermedades infecciosas, enfermedades cardiovasculares y enfermedades inflamatorias. En esta modalidad, el antígeno objetivo es un sitio de unión asociado por desorden humano, tal como un sitio de unión de cáncer, un sitio de unión de enfermedad autoinmune, un sitio de unión de enfermedad infecciosa, un sitio de unión de enfermedad cardiovascular, y un sitio de unión de enfermedad inflamatoria. Los anticuerpos y antígenos útiles dentro del alcance de la presente invención incluyen mAbs con propiedades según se describen anteriormente, y contemplan el uso de, pero no se limitan a, cáncer, los siguientes mAbs: LL1 (ant¡-CD74), LL2 (anti-CD22), RS7 (glicoproteína-1 anti-epitelial (EGP-1 )), PAM-4 y KC4 (ambos anti-MUCI), MN-14 (antígeno anti-carcinoembriónico (CEA)), Mu-9 (antígeno-p anti-colon-específico), Immu 31 (una anti-alfa-fetoproteína), TAG-72 (por ejemplo, CC49), Tn, J591 (anti-PSMA) y G250 (un mAb anhidrasa IX anti-carbónica). Otros antígenos útiles que pueden ser objetivos que utilizan estos conjugados incluyen HER-2/neu, BrE3, CD19, CD20 (por ejemplo, Mabs C2B8, hA20, 1 F5) CD21 , CD23, CD80, alfa-fetoproteína (AFP), VEGF, receptor EGF, PIGF, MUC1 , MUC2, MUC3, MUC4, PSMA, gangliósidos, HCG, EGP-2 (por ejemplo, 17-1 A), CD37, HLD-DR, CD30, la, A3, A33, Ep-CAM, KS-1 , Le(y), S100, PSA, tenascin, receptor folato, antígenos Thomas-Friedenreich, antígenos de necrosis tumoral, antígenos de angiogénesis tumoral, Ga 733, IL-2, ? 01 , MAGE, L243 o una combinación de los mismos. Un número de los anticuerpos anteriormente mencionados, así como también anticuerpos adicionales y antígenos útiles dentro del alcance de la invención (por ejemplo, anticuerpos anti-CSAP, MN-3, y anti-granulocito), se describen en la Solicitud Provisional de E. U . No. de Serie 60/426,379, titulada "Uso de Complejos No covalentes, iMulti-específicos para Suministro Objetivo de Terapéuticos", presentada el 15 de Noviembre de 2002, la Solicitud Provisional de E. U. No. de Serie 60/360,229, titulada "Anticuerpos RS7", presentada el 1 de Marzo de 2002, la Solicitud Provisional de E. U. No. de Serie 60/356, 132, titulada "Anticuerpos Anti-CD20 y Proteínas de Fusión de los mismos y Métodos de Uso", presentada el 14 de Febrero de 2002, la Solicitud Provisional de E.U . No. de Serie 60/333,479, titulada "Anticuerpo Anti-DOTA", presentada el 28 de Noviembre de 2001 , la Solicitud Provisional de E. U. No. de Serie 60/308,605, titulada "Sistemas de Suministro Polimérico", presentada el 31 de Julio de 2001 , la Solicitud Provisional de E. U . No. de Serie 60/361 ,037, titulada "Mutaciones de punto de anticuerpo para mejorar la velocidad de depuración", presentada el 1 de Marzo de 2002, la Solicitud Provisional de E.U . No. de Serie 60/360,259 titulada "Anticuerpos Ant-CD-74 De Internación y Métodos de Uso", presentada el 1 de Marzo de 2002, la Solicitud Provisional de E. U. No. de Serie 09/965,796, titulada "Inmunoterapia de malignidades célula B que utilizan anticuerpos anti-CD22", presentada el 1 de Octubre de 2001 , la Solicitud Provisional de E. U. No. de Serie 60/60/342, 104, titulada "Agentes Objetivo de Marcado con Galio 68 y Galio 67", presentada el 12 de Diciembre de 2001 , la Solicitud Provisional de E. U. No. de Serie 10/1 16, 1 16, titulada "Agentes Objetivo de Marcado con Galio 68 y Galio 67", presentada el 5 de Abril de 2002, la Solicitud Provisional de E.U. No. de Serie 60/399,707, titulada "Anticuerpos Immu31 Alfa-Fetoproteína y Proteínas de Fusión y Métodos de Uso de los mismos", presentada el 1 de Agosto de 2002, la Solicitud Provisional de ¡E. U. No. de Serie 60/388,314, titulada "Anticuerpo ¡Monoclonal hPAM4", presentada el 14 de Junio de 2002, y la Solicitud Provisional de E. U. No. de Serie 60/414,341 , titulada "Anticuerpos Anti-granulocito Humanizado y Humano, Quimérico y Métodos de Uso", presentada el 30 de Septiembre de 2002, los contenidos de las cuales se incorporan en la presente en su totalidad. En otra modalidad preferida de la presente invención, se utilizan anticuerpos que se internan rápidamente y se vuelven a expresar así, procesarse y presentarse sobres superficies de célula, permitiendo la toma continua y aumento por adicción del inmunoconjugado circulante por la célula. Un ejemplo de un par de anticuerpo/antígeno más preferido es LL1 y mAb anti-CD74 (cadena no variante, chaperona específica de clase I I, li). El antígeno CD74 se expresa altamente en linfomas de célula B, ciertos linfomas de célula T, melanomas y ciertos otros cánceres (Ong et al., Immunology 98:296-302 (1999)), así como también ciertas enfermedades autoinmunes. Las enfermedades que se tratan preferentemente con anticuerpos anti-CD74 incluyen, pero no se limitan a, linfoma no Hodgkin, melanoma y mieloma múltiple. La expresión continua del antígeno CD74 por cortos períodos de tiempo sobre la superficie de las células objetivo, seguida por la internación del antígeno, y re-expresión del antígeno, permite al anticuerpo objetivo LL1 internarse junto con cualquier otra porción quimioterapéutico que se lleva como "carga útil". Esto permite que una concentración alta, y terapéutica de inmunoconjugado de fármaco quimioterapéutico LL1 se acumule dentro de tales células. Los inmunoconjugados de fármaco quimioterapéutico LL1 internados se someten a un ciclo a través de lisosomas y endosomas, y la porción q uimioterapéutica se libera en u na forma activa dentro de las células objetivo. En otro aspecto, la invención se refiere a un método para tratar un sujeto, comprendiendo administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado terapéutico de las modalidades preferidas de la presente invención a un sujeto. Las enfermedades que pueden tratarse con los conjugados terapéuticos de las modalidades preferidas de la presente invención incluyen , pero no se limitan a, malignidades de célula B (por ejemplo, linfoma non-Hodgkins y leucemia linfocítica crónica utilizando, por ejemplo, mAb LL2; ver Patente de E. U. No. 6, 1 83,744), adenocarcinomas de epitelia de sistema digestivo derivado de manera endodérmica , cánceres tales como cáncer de mama y cáncer de pulmón de célula no pequeña , y otros carcinomas, sarcomas, tumores gliales, leucemias mieolides, etc. En particular, los anticuerpos contra un antígeno, por ejemplo, un antígeno oncofetal , producido o asociado con el neoplasma hematopoyético o tumor sólido maligno, por ejemplo, un tumor gastrointestinal , de pulmón , mama , próstata, ovario, testículos, cerebral o li nfático, un sarcoma , o u n melanoma, se utilizan ventajosamente.

EJEMPLOS Los ejemplos de abajo son ilustrativos de las modalidades de la invención actual y no deberán utilizarse, en ninguna manera, para limitar el alcance de las reivindicaciones .

Ejemplo 1 - Construcción de Plásmidos para la expresión de BS8 en E. coli Utilizando el concepto introducido en la presente invención, una molécula trivalente biespecífica (BS8) que es bivalente para CEA y monovalente para HSG se obtuvo por dimerización de los siguientes dos polipéptidos: Cadena VH: h N14VH— GGGGSGGGGSGGGGSM— h N14VH— GGGGS— 679VH Cadena VL: 679VK— GGGGS— hMN14VK— LEGGGGSGGGGSGGGS— hMN14V Las secuencias de ADN para los dos polipéptidos se elaboraron en vector pET-ER, un plásmido de expresión bacteriana di-cistrónica, utilizando técnicas de biología molecular estándares. En la expresión, cada polipéptido posee una secuencia de conductor pe1B de terminal amino que dirige la síntesis al espacio periplásmico de E. coli y una etiqueta de afinidad de seis His de terminal carboxilo para la purificación por IMAC. Hemos demostrado por BIAcore con un chip sensor acoplado por HSG al medir el aumento adicional en unidades de respuesta en inyecciones sucesivas del agente biespecífico seguido por CEA o W12 (un anticuerpo monoclonal anti-id de rata para hMN14) que los dos polipéptidos a su vez forman un heterodímero biespecífico que une CEA divalentemente y HSG monovalentemente. En esta modalidad, el polipéptido VH del MAb HMN14 se conecta al polipéptido VK del MAb hMN14 mediante un enlazador de cinco residuos de aminoácido, el cual se conecta al polipéptido VH del MAb 679 mediante un enlazador de dieciséis residuos de aminoácido, y el polipéptido VK del MAb 679 se conecta al polipéptido VH del MAb MN14 mediante un enlazador de dieciséis residuos dé aminoácido, el cual se conecta al polipéptido VK del MAB hMN 14 mediante un enlazador de cinco residuos de aminoácido. Cada cadena forma una mitad del heterod ímero trivalente, biespecífico 679xh MN 14xhMN 14. Alternativamente, las cadenas individuales compuestas tanto de dominios VH como VL también pueden elaborarse para formar sitios de unión multiespecíficos , multivalentes cuando se acoplan. Tal ejemplo se proporciona por BS6 según se describe abajo.

Ejemplo 2 - Construcción de Piásmidos para la expresión de BS6 en E. co/ Utilizando una modificación del concepto introducido en la presente invención , una molécula trivalente biespecífica adicional (BS6) que es bivalente para CEA y monovalente para HSG se obtuvo por dimerización de los siguientes dos polipéptidos: h MN 14VH— GGGGS— hMN 14VK— LEGGGGSGGGGSGGGS— 679VK 679VK— GGGGSGGGGSGGGGSM— h N 14VH— GGGGS— h MN 14VK BS6 d ifiere de BS8 en el ordenamiento de los dominios en las cadenas de polipéptido específico. Cada cadena de BS8 consiste completamente ya sea de dominios VH o VL. Las cadenas de polipéptido de BS6 en lugar de consistir de dos VH y un VL o un VH y dos VL. En BS6, el en lazador entre el h M N 1 4VK y h MN 14VK es solamente 5 residuos de aminoácido a fin de preven ir su asociación entre cadenas. Las secuencias de AD N para los dos pol ipéptidos de BS6 se elaboraron en vector pET-ER utilizando técnicas de biología molecular estándares. En la expresión, cada polipéptidó posee una secuencia de conductor pe 1 B de terminal amino y una etiqueta de afinidad de seis His de terminal carboxilo. Hemos demostrado por B IAcore que los dos polipéptidos a su vez forman un heterod ímero biespecífico q ue une CEA divalentemente y HSG monovalentemente. En esta modalidad , BS6 se compone del polipéptidó VH del MAb hMN 14 conectado al polipéptidó VK del MAb h N 14 mediante un enlazador de cinco residuos de aminoácido, el cual se conecta al polipéptidó VH del MAb 679 mediante un enlazador de dieciséis residuos de aminoácido, y el polipéptidó V« del MAb 679 conectado al polipéptidó VH del MAb h M N 14 media nte un enlazador de d ieciséis residuos de aminoácido, el cual se conecta al polipéptidó VK del MAB hMN 14 mediante un enlazador de cinco residuos de aminoácido. Cada cadena forma una mitad del heterodímero trivalente, biespecífico 679xhMN 14xhMN 14. Ejemplo 3 - Construcción de Plásmidos para la expresión de TS1 en E. coli Utilizando el concepto introducido en la presente invención , una molécula trivalente triespecífica (TS 1 ) que tiene porciones de unión para CEA, HST e I n-DTPA se obtuvo por dimerización de los siguientes dos polipéptidos: Cadena VH: hMN 14VH— (L 1 5)— 734VH— (L1 5)— 679VH Cadena VL: 679VK— (L1 5)— 734VK— (L15)— hMN 14VK Las secuencias de AD N para los dos polipéptidos se elaboraron en vector pET-ER, utilizando técnicas de biolog ía moleculares estándares. (Ver Fig uras 8 y 9). En la expresión , cada polipéptidó posee una secuencia de conductor pe1B de terminal ámino que dirige la síntesis al espacio periplásmico de E. coli y una etiqueta de afinidad de seis His de terminal carboxilo para la purificación por IMAC. Hemos demostrado por BIAcore y ELISA que los dos polipéptidos a su vez forman un heterodímero biespecífico con capacidades de unión para CEA, HSG e In-DPTA. En esta modalidad, el polipéptido VH del Ab hMN14 se conecta al polipéptido VH del MAb 734 mediante un enlazador de quince residuos de aminoácido, el cual se conecta al polipéptido VH del MAb 679 mediante un enlazador de quince residuos de aminoácido, y el polipéptido VK del MAb 679 se conecta al polipéptido VK del MAb hMN14 mediante un enlazador de quince residuos de aminoácido, que se conecta al polipéptido V« del MAB hMN14 mediante un enlazador de quince residuos de aminoácido. Para TS1, cada enlazador de residuo de 15 aminoácidos tiene la secuencia Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser. Cada cadena forma una mitad del heterodímero trivalente, triespecífico hMN14x734x679. Ejemplo 4 - Usos de Agentes Multivalentes, ultiespecíficos La presente invención se utiliza mejor para la generación de agentes objetivo in vivo que puede ser biespecífico trivalente, triespecífico trivalente, biespecífico tetravalente, triespecífico tetravalente, o tetraespecífico tetravalente. Los agentes biespecíficos trivalentes (3-2S) se derivarán de los dominios variables de dos diferentes anticuerpos (VHi/VL1 y VH2 L2) y serán capaces de unirse a los antígénos o epítopos reconocidos por los dos anticuerpos. La unión será bivalente para una especificidad y monovalente para la otra especificidad . Los agentes 3-2S se producirán mediante dimerización de las dos cadenas de polipéptido heterologas mostradas en el Diagrama 1 . Diagrama 1 . Agentes Biespecíficos Trivalentes Cadena VH: VHi-La-VHi-Lb-VH2 Cadena VL: VL2-Lc-VL 1 -Ld-VL1 El orden específico de los tres dominios VH o VL puede variarse y los enlazadores de péptido (La , Lb, Le, Ld) pueden ser idénticos o diferentes. Los agentes triespecíficos trivalentes (3-3S) se derivarán de los domin ios variables de tres diferentes anticuerpos (VHi/VL1 , y H3/ L3) y serán capaces de unirse a los antígenos o epítopos reconocidos por los tres anticuerpos. La unión será monovalente para cada una de las tres diferentes especificidades. Los agentes 3-3S se producirán mediante dimerización de las dos cadenas de polipéptido heterologas mostradas en el Diagrama 2. Diag rama 2. Agentes Triespecíficos Trivalentes Cadena VH: VHi-La-VH2-Lb-VH3 Cadena VL: VL3-Lc-VL2-Ld-VLi El orden específico de los tres dominios VH o VL puede variarse y los enlazadores de péptido (La, Lb, Le, Ld) pueden ser idénticos o diferentes. Los agentes biespecíficos tetravalentes (4-2S) se derivarán de los dominios variables de dos diferentes anticuerpos (VHi VLi y VH2/VL2) y serán capaces de unirse a los antígenos o epítopos reconocidos por los dos anticuerpos. La unióH será bivalente para cada una de las dos diferentes especificidades. Los agentes 4-2S se producirán mediante dimerizacion de las dos cadenas de polipéptido heterologas mostradas en el Diagrama 3. Diagrama 3. Agentes Biéspecíficos Tetravalentes Cadena VH: Vm-La-Vm-Lb-V^-Lc- Cadena VL: El orden específico de los cuatro dominios VH o VL puede variarse y los enlazadores de péptido (La, Lb, Le, Ld, Le y Lf) pueden ser idénticos o diferentes. Los agentes triespecíficos tetravalentes (4-3S) se derivarán de los dominios variables de tres diferentes anticuerpos (VHI/VLI, VH2 L2 y VH3/ 1.3) y serán capaces de unirse a los antígenos o epítopos reconocidos por los tres anticuerpos. La unión será bivalente para una de las tres especificidades y monovalente para cada una de las otras dos especificidades. Los agentes 4-3S se producirán mediante dimerizacion de las dos cadenas de polipéptido heterologas mostradas en el Diagrama 4. Diagrama 4. Agentes Triespecíficos Tetravalentes Cadena VH: VHi-La-VHi-Lb- H2-Lc-VH3 Cadena VL: VL3-Ld-VL2-Le-VLi-Lf-VL1 El orden específico de los cuatro dominios VH o VL puede variarse y los enlazadores de péptido (La, Lb, Le, Ld, Le y Lf) pueden ser idénticos o diferentes. Los agentes tetraespecíficos tetravalentes (4-4S) se derivarán de los dominios variables de cuatro diferentes anticuerpos (VHI/ LI, VH2/ |_2, VH3/VL3 y H4/VL4) y serán capaces dé unirse a los antígenos o epítopos reconocidos por los cuatro anticuerpos. La unión será monovalente para una de las cuatro especificidades. Los agentes 4-4S se producirán mediante d imerización de las dos cadenas de polipéptido heterólogas mostradas en el Diagrama 5. Diagrama 5. Agentes Tetraespecíficos Tetravalentes Cadena VH: VHi-La-VH2-Lb-VH3-Lc-VH4 Cadena VL: VL4-Ld-VL3-Le-VL2-Lf-VL 1 El orden específico de los cuatro dominios VH o VL puede variarse y los enlazadores de péptido (La, Lb, Le, Ld , Le y Lf) pueden ser idénticos o diferentes. Los anticuerpos de interés para producir estos agentes multiespecíficos, multivalentes, incluyen anticuerpos que muestran alta afinidad para antígenos asociados por tumor, tales como CEA y MUC 1 , antígenos que muestran alta afinidad para q uelatos de metal , tales como indio-DTPA, itrio-DOTA, anticuerpos que muestran alta afinidad para péptidos específicos, tales como histamina-succinilo-g l icina , anticuerpos que muestran alta afin idad para antígenos de d iferenciación de célula, tales como CD20, CD22, CD74, anticuerpos q ue muestran alta afinidad ¡para enzimas, tales como fosfatasa alcalina, y anticuerpos q ue muestran alta afinidad para marcadores de superficie de célula de utilidad cl ínica potencial, tal como H LA-DR. Será aparente para aquellos expertos en la materia que varias mod ificaciones y variaciones pueden elaborarse para las composiciones y ¡procesos de esta invención . De esta manera , se pretende que la presente invención cubra tales modificaciones y variaciones, con la condición de que vienen dentro del alcance de las reivindicaciones anexas y sus equivalentes. La descripción de todas las publicaciones citadas anteriormente se incorporan expresamente en la presente para referencia en sus totalidades al mismo grado que si cada una se incorporara para referencia de manera individual.

Claims (1)

1. REIVI NDICACIONES 1 . Un equipo para suministrar un agente de diagnóstico, un agente terapéutico, o una combinación del mismo a un objetivo, comprendiendo a. una prote ína de unión multi-específica, multivalente q ue comprende tres o más sitios de unión, en donde al menos un sitio de unión tiene una afinidad hacia una porción de hapteno y al menos dos sitios de unión tienen afinidad hacia un antígeno objetivo; y b. una molécula de vehículo comprendiendo un agente de diagnóstico, un agente terapéutico, o una combinación de los mismos, una molécula enlazadora, y al menos dos porciones de hapteno para permitir la unión simultánea de d ichas porciones de hapteno con dos de d ichas proteínas de unión. 2. Una prote ína de unión multi-específica, multivalente, que comprende un primer sitio de unión q ue tiene una afinidad hacia una porción de hapteno y un segundo y un tercer sitio de unión cada uno teniendo afinidad hacia un antígeno objetivo, el cual puede ser el mismo o un antígeno objetivo diferente. 3. La proteína de unión seg ún la reivindicación 2, caracterizada porque dicho antígeno objetivo es un sitio de unión asociado por desorden humano. 4. La proteína de unión según la reivindicación 3, caracterizada porque dicho sitio de unión asociado por desorden humano se selecciona del grupo que consiste de sitios de unión de cáncer, sitios de unión de enfermedad autoinmune, sitios de unión de enfermedad infecciosa, sitios de unión de enfermedad cardiovascular, y sitios de unión de enfermedad inflamatoria. 5. La proteína de unión según la reivindicación 2, caracterizada porque dicho primer sitio de unión tiene una afinidad hacia las moléculas que contienen una porción de histamina-succinilo-glicilo (HSG) y los sitios de unión, dicho segundo y dicho tercero, tienen cada uno afinidad hacia antígeno cardioembriónico (CEA). 6. La proteína de unión según la reivindicación 5, caracterizada porque dicha proteína de unión comprende secuencias humanas, humanizadas o murino, o una combinación de las mismas. 7. La proteína de unión según la reivindicación 5, caracterizada porque dicho primer sitio de unión comprende un primer y segundo polipéptido que se asocian entre sí para formar dicho sitio de unión de antígeno HSG. 8. La proteína de unión según la reivindicación 7, caracterizada porque dicho primer polipéptido comprende un polipéptido VH de MAb 679 (Figura 4, SEQ ID), y dicho segundo polipéptido comprende un polipéptido VK de MAb 679 (Figura 4, SEQ ID). 9. La proteína de unión según la reivindicación 7, caracterizada porque dicho primer polipéptido comprende un polipéptido VH de MAb h679 (Figura 5, SEQ ID), y dicho segundo polipéptido comprende un polipéptido VK de MAb h679 (Figura 5, SEQ ID). 10. La proteína de unión según la reivindicación 8, caracterizada porque dicho Seg undo sitio de unión comprende un tercer y cuarto polipéptido que se asocian entre sí para formar dicho primer sitio de unión de antígeno CEA. 1 1 . La proteína de unión según la reivindicación 10, caracterizada porque dicho tercer polipéptido comprende un polipéptido VH de MAb hMN 14 (Figura 6, SEQ ID), y dicho cuarto polipéptido comprende un polipéptido VK de hMN 14 (Figura 4, SEQ ID). 12. La proteína de unión según la reivindicación 8, caracterizada porque dicho tercer sitio de unión comprende un quinto y sexto polipéptido que se asocian entre sí para formar dicho segundo sitio de unión de antígeno CEA. 1 3. La proteína de unión según la reivindicación 12, caracterizada porque dicho quinto polipéptido comprende un polipéptido VH de MAb hMN 14 (Figura 6, SEQ ID), y dicho sexto polipéptido comprende un polipéptido VK de MAb hMN 14 (Figura 6, SEQ ID). 14. La proteína de unión según la reivindicación 12, caracterizada porque dichos polipéptidos, primero y cuarto, se conectan por un primer enlazador, dichos polipéptidos, cuarto y quinto, se conectan por un segundo enlazador, y dichos polipéptidos, segundo y tercero se conectan por un tercer enlazador y dichos polipéptidos, tercero y sexto, se conectan por un cuarto enlazador. 1 5. La proteína de unión según la reivindicación 14, caracterizada porque dicho primer enlazador y dicho tercer enlazador cada uno comprenden dieciséis residuos de aminoácido y dicho segundo enlazador y dicho cuarto enlazador cada uno comprenden cinco residuos de aminoácido. 16. La proteína de unión según la reivindicación 12, caracterizada porque dichos polipéptidos, primero y tercero, se conectan por un primer enlazador, dichos polipéptidos, tercero y cuarto, se conectan por un segundo enlazador, y dichos polipéptidos, segundo y cuarto, se conectan por un tercer enlazador y dichos polipéptidos, cuarto y sexto, se conectan por un cuarto enlazador. 17. La proteína de unión según la reivindicación 16, caracterizada porque dicho primer enlazador y dicho tercer enlazador cada uno comprenden dieciséis residuos de aminoácido y dicho segundo enlazador y dicho cuarto enlazador cada uno comprenden cinco residuos de aminoácido. 18. La proteína de unión según la reivindicación 5, caracterizada porque dicha proteína de unión es un heterod ímero. 1 9. La proteína de unión según la reivindicación 12, caracterizada porque dichos polipéptidos, primero, segundo, tercero, cuarto, quinto y sexto cada uno codificándose por un cADN primero, segundo, tercero, cuarto, quinto y sexto, respectivamente. 20. La proteína de unión según la reivindicación 19, caracterizada porque dicho cADN primero, segundo, tercero, cuarto, quinto y sexto comprenden secuencias mostradas en las Figuras 4 y 6 (SEQ ID). 21 . Una molécula de ácido nucleico comprendiendo los cADNS, primero, cuarto y quinto, que codifican la proteína de unión de la reivindicación 20. 22. Una molécula de ácido nucleico que comprende los cADNs segundo, tercero y sexto que codifican Íá proteína de unión de la reivind icación 20. 23. U n cásete de expresión que comprende las secuencias de nucleótido que codifican la proteína de unión de la reivindicación 20. 24. El cásete de expresión según la reivindicación 23 , caracterizado porque dicho cásete de expresión es un plásmido 25. Una célula huésped que comprende el plásmido de la reivindicación 24. 26. Un método para producir una proteína de unión , comprendiendo cultivar la célula huésped de la reivindicación 25 en un medio adecuado, y separar dicha proteína de unión de d icho medio. 27. La proteína de unión según la reivindicación 14, caracterizada porque d ichos polipéptidos primero, segundo, tercero, cuarto, quinto y sexto, se codifican cada uno por un cADN, primero, segundo, tercero, cuarto quinto y sexto, respectivamente. 28. La proteína de unión según la reivindicación 27, caracterizada porque dicho cADN primero, segundo, tercero, cuarto, quinto y sexto, comprenden secuencias de nucleotidos mostradas en las Figuras 4 y 6 (SEQ ID). 29. La proteína de u nión según la reivindicación 27, caracterizada porq ue dichos cAD Ns primero, tercero y quinto se encuentran sobre una primer molécula de ácido n ucleico única. 30. La proteína de unión según la reivindicación 29, caracterizada porq ue d ichos cAD Ns segundo, cuarto, y sexto, se encuentran sobre una seg unda molécula de ácido n ucleico único. 31 . Un cásete cíe expresión qué comprende las moléculas de ácido nucleico que codifican la proteína de unión de la reivindicación 30. 32. El cásete de expresión según la reivindicación 31 , caracterizado porque dicho cásete de expresión es un plásmido. 33. Una célula huésped comprendiendo el plásmido según la reivindicación 32. 34. Un método para producir una proteína de unión, comprendiendo cultivar la célula huésped de la reivindicación 33 en un medio adecuado, y separar dicha proteína de unión de dicho medio. 35. Una molécula de vehículo, comprendiendo un agente de diagnóstico, un agente terapéutico, o una combinación de los mismos, una porción enlazadora, y dos o más porciones de hapteno, en donde dichas porciones de hapteno se colocan para permitir la unión simultánea de dichas porciones de hapteno con sitios de unión de una o más proteínas de unión. 36. Un método de selección para determinar la proporción de sustitución molar de hapteno a molécula de vehículo, comprendiendo purificar una mezcla de molécula de vehículo que sigue una reacción de enlace de hapteno y exponer la mezcla purificada a un ensayo de unión por metal para determinar dicha proporción de sustitución molar. 37. Un método para suministrar un agente de diagnóstico, un agente terapéutico, o una combinación del mismo a un objetivo, comprendiendo: a. administrar a un sujeto en necesidad del mismo la proteína de unión de la reivindicación 5; b. esperar que una cantidad suficiente de tiempo por una cantidad de la proteína de no unión limpie la corriente sanguínea del sujeto; y c. administrar a dicho sujeto una molécula de vehículo comprendiendo un agente de diagnóstico, un agente terapéutico, o una combinación de los mismos, que se une a un sitio de unión de la proteína de unión. 38. El método según la reivindicación 37, caracterizado porque dicha molécula se une a un sitio de unión de una primer proteína de unión y a un segundo sitio de unión de una segunda proteína de unión. 39. El método según la reivindicación 37, caracterizado porque dicho agente de diagnóstico o dicho agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste de isótopos, fármacos, toxinas, citoquinas, hormonas, factores de crecimiento, conjugados, radionúclidos, y metales. 40. El método según la reivindicación 39, caracterizado porque dichos isótopos se seleccionan del grupo que consiste de 90Y, 1 1 ln, 1 31 , f 99mT C ) 1 86 R e j 1 88 ^ 1 77^ 67 ^ 21 2 ß | > 21 3 ^ y 21 1 ^ 41 . El método según la reivindicación 39, caracterizado porque dichos fármacos son cualquiera de las preparaciones farmacéuticas que se unen con una molécula de vehículo. 42. El método según la reivindicación 39, caracterizado porque dichos metales se seleccionan del grupo que consiste de gadolinio y agentes de contraste. 43. El método según la reivindicación 42, caracterizado porque dichos agentes de contraste se seleccionan del grupo que consiste de agentes de contraste MRI , agentes de contraste CT, y agentes de contraste de ultrasonido. 44. Un método para detectar o tratar un desorden humano, comprendiendo: a. administrar a un sujeto en necesidad del mismo con la proteína de unión de la reivindicación 2; b. esperar que una cantidad suficiente de tiempo por una cantidad de proteína de unión no unida limpie la corriente sanguínea de sujeto; y c. administrar a dicho sujeto una molécula de vehículo que comprende un agente de diagnóstico, un agente terapéutico, o una combinación de los mismos, que se une a un sitio de unión de la proteína de unión. 45. El método según la reivindicación 40, caracterizado porque dicho desorden humano se selecciona del grupo que consiste de cáncer, enfermedades autoinmunes, enfermedades infecciosas, enfermedades cardiovasculares, y enfermedades inflamatorias. 46. Una proteína de unión multi-específica, multivalente que comprende un sitio de unión de histamina-succinilo-glicilo (HSG) que tiene una afinidad hacia las moléculas que contienen una porción HSG, un sitio de unión de complejo de metal-quelato indio-DTPA que tiene una afinidad hacia el complejo metal-quelato indio-DTPA y un sitio de unión de antígeno carcinoembriónico (CEA) cada uno teniendo afinidad hacia CEA. 47. La proteína de unión según la reivindicación 42, caracterizada porque dicha proteína de unión comprende secuencias humanas, humanizadas o murino. 48. La proteína de unión según la reivindicación 42, caracterizada porque se codifica por las secuencias de nucleotidos de las Figuras 8 y 9. 49. Una molécula de ácido nucleico que comprende las secuencias de nucleotidos de las Figuras 8 y 9. 50. Un cásete de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 49. 51 . El cásete de expresión de la reivindicación 50, caracterizado porque dicho cásete de expresión es un plásmido. 52. Una célula huésped que comprende el plásmido según la reivindicación 24.