ES2313783T3 - Inhibidor para el diagnostico y el tratamiento de pacientes con hemofilia a. - Google Patents
Inhibidor para el diagnostico y el tratamiento de pacientes con hemofilia a. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2313783T3 ES2313783T3 ES99921292T ES99921292T ES2313783T3 ES 2313783 T3 ES2313783 T3 ES 2313783T3 ES 99921292 T ES99921292 T ES 99921292T ES 99921292 T ES99921292 T ES 99921292T ES 2313783 T3 ES2313783 T3 ES 2313783T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- factor viii
- polypeptide
- antibodies
- antibody
- recombinant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/36—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against blood coagulation factors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Temperature Or Quantity Of Heat (AREA)
- Measuring And Recording Apparatus For Diagnosis (AREA)
Abstract
Polipéptido, que comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de EL-14 o IT-2 representadas en la figura 4A, siendo dicho polipéptido capaz de neutralizar la actividad inhibidora de los anticuerpos inhibidores del factor VIII, sin interferir con la actividad procoagulante del factor VIII.
Description
Inhibidor para el diagnóstico y el tratamiento
de pacientes con hemofilia A.
La presente invención se enmarca en los campos
del diagnóstico y del tratamiento médico. Más en particular, la
presente invención da a conocer medios y procedimientos para el
diagnóstico de la presencia de anticuerpos inhibidores dirigidos
contra el factor VIII en la sangre de los humanos, y da a conocer
medios, composiciones farmacéuticas y procedimientos para el
tratamiento de humanos en los que aparezcan dichos anticuerpos
inhibidores.
La hemofilia A es un trastorno hemorrágico
ligado al cromosoma X, caracterizado por la ausencia funcional del
factor VIII de la coagulación sanguínea. Dependiendo de la actividad
residual del factor VIII en el plasma del paciente, la hemofilia A
se puede clasificar como grave (factor VIII < 1%), moderada
(factor VIII 1-5%) o leve (>5%). Los episodios
hemorrágicos en pacientes con hemofilia A se pueden controlar de
forma eficaz mediante la administración intravenosa de concentrados
del factor VIII purificados. Estos concentrados del factor VIII
pueden obtenerse a partir de mezclas de plasma humano. De forma
alternativa, se puede utilizar factor VIII recombinante producido
mediante células eucariotas modificadas mediante ingeniería genética
como material de partida para la preparación de concentrados del
factor VIII.
Una importante complicación del tratamiento
actual de la hemofilia A consiste en el desarrollo de anticuerpos
neutralizantes dirigidos contra el factor VIII. Estos anticuerpos,
denominados comúnmente inhibidores del factor VIII, aparecen en
aproximadamente el 25% de los pacientes aquejados de hemofilia A
grave, por lo general tras 5-20 días de exposición
(Ehrenforth y otros, 1992, Lancet 339: 594-598). En
los pacientes aquejados con hemofilia A moderada y leve, los
anticuerpos contra el factor VIII aparecen con menor frecuencia, y
esto se debe, muy probablemente, a la inducción de tolerancia por
parte del factor VIII endógeno presente en el plasma de este grupo
de pacientes (McMillan y otros. 1988, Blood 71:
344-348). Los anticuerpos contra el factor VIII se
pueden desarrollar, con baja frecuencia, en personas sanas.
El diagnóstico de los inhibidores del factor
VIII se lleva a cabo habitualmente mediante el denominado ensayo
Bethesda (Kasper y otros. 1975, Thromb. Diath. Haemorrh. 34:
869-872). En este ensayo, se incuban cantidades
iguales de plasma normal y diluciones de plasma con inhibidor
durante dos horas a 37ºC. Seguidamente, se determina la actividad
residual del factor VIII y se compara con una incubación de control,
en la que se incuba plasma normal con imidazol 0,1 M durante 2
horas a 37ºC. La cantidad de inhibidor se expresa en unidades
Bethesda; una unidad Bethesda corresponde a la cantidad de inhibidor
que es capaz de reducir un 50% la actividad del factor VIII en el
plasma normal. Un estudio reciente ha propuesto diversas
adaptaciones al sistema de ensayo original, que sirven para mejorar
la estabilidad del factor VIII durante el ensayo (Verbruggen y
otros. 1995, Thromb. Haemostas. 73: 247-251). Esto
se denomina la "modificación Nijmegen" del ensayo Bethesda, y
resulta particularmente útil para la detección de inhibidores del
factor VIII de bajo título. Es necesario indicar que el ensayo
Bethesda no aporta información sobre los epítopos de los anticuerpos
inhibidores del factor VIII.
La aparición de los anticuerpos inhibidores del
factor VIII hace que la terapia de sustitución del factor VIII
resulte inadecuada. Los médicos disponen de varias opciones de
tratamiento. Los inhibidores presentes en bajo título (hasta
5-10 UB/ml) se suelen tratar mediante infusión de
altas dosis de factor VIII. Un subconjunto de inhibidores del
factor VIII no presenta reacción cruzada con el factor VIII porcino.
El factor VIII porcino se ha utilizado para el tratamiento de los
pacientes que presentan un inhibidor. La administración del factor
VIII porcino puede provocar efectos secundarios. Tras el tratamiento
múltiple, el 30-50% de los pacientes desarrollan
anticuerpos que neutralizan la actividad del factor VIII porcino
administrado.
Un tratamiento alternativo de los pacientes con
inhibidor del factor VIII comprende el uso de agentes de
"bypass" del factor VIII. Los concentrados de complejo
protrombínico activado (APCC) se han utilizado para eludir la
actividad del factor VIII. Los APCC se han utilizado con éxito para
controlar los episodios hemorrágicos en un amplio número de
pacientes que presentan un inhibidor. No obstante, el tratamiento no
resulta eficaz en todos los casos, y en una serie de pacientes se
han documentado aumentos anamnésicos del título del inhibidor tras
la administración de APCC (debidos, muy probablemente, a cantidades
traza de factor VIII en la preparación). En los últimos 5 años, se
ha desarrollado el factor VIIa recombinante como nuevo agente de
"bypass" del factor VIII para el tratamiento de pacientes que
presentan un inhibidor (Lusher y otros. 1996. Haemostasis
[Hemostasia] 26 (suppl. 1): 124-130). El factor VIIa
recombinante se han utilizado con éxito para controlar los
episodios hemorrágicos en pacientes que presentan un inhibidor. No
obstante, el tratamiento con este agente está limitado por la corta
vida media de este compuesto en la circulación, lo que requiere
realizar infusiones múltiples en intervalos relativamente cortos.
El factor V resistente a APC se ha sugerido recientemente como
medio alternativo para eludir la actividad biológica de los
inhibidores del factor VIII (WO 95/29259). Los agentes descritos
anteriormente no actúan directamente como inhibidores del factor
VIII, sino que sirven meramente para eludir el factor VIII mediante
infusión de grandes cantidades de concentrados de factor de
coagulación con mayor actividad procoagulante.
\newpage
Se han propuesto otros métodos de neutralización
del inhibidor, pero no se ha demostrado su eficacia de manera
convincente. Se han propuesto las preparaciones de inmunoglobulina
derivadas de plasma de donantes sanos como supresoras activas de
los inhibidores del factor VIII (Sultan y otros. 1984, Lancet 333,
765-768). Sultan 1997, Blood Coagulation and
Fibrinolysis [Coagulación sanguínea y fibrinólisis] Vol 8,
S15-S18. A pesar del éxito observado en pacientes
con hemofilia A adquirida e inhibidores con alto título, las
preparaciones de inmunoglobulina no se aplican de forma universal
para el tratamiento de pacientes que presentan un inhibidor. Los
efectos beneficiosos de las preparaciones de inmunoglobulina en
estos pacientes se han atribuido la presencia de anticuerpos
antiidiotípicos que neutralizan la actividad de los inhibidores del
factor VIII. De hecho, en algunos pacientes, el descenso del nivel
de los inhibidores del factor VIII coincidió con la aparición de
anticuerpos antiidiotípicos (Sultan y otros. 1987, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 84: 828-831). Algunos investigadores han
defendido con intensidad el control mediante anticuerpos
antiidiotípicos de los inhibidores del factor VIII en pacientes con
hemofilia A y en personas sanas (Gilles y otros. 1996, J. Clin. Inv.
97: 1382-1388). El mismo grupo ha propuesto que la
infusión de complejos antígeno-anticuerpo a
pacientes que presenten inhibidores puede acelerar la reducción de
los anticuerpos contra el factor VIII (Patente U.S.A. nº 5.543.145).
Se ha propuesto que este descenso está mediado por un aumento en el
número de anticuerpos antiidiotípicos inducido por los complejos
antígeno-anticuerpo infundidos. El anticuerpo
específico contra el factor VIII utilizado en este protocolo de
tratamiento se obtiene a partir de plasma de pacientes que presentan
un inhibidor. Obviamente, esta preparación presenta una mezcla
heterogénea de anticuerpos y no se dispone de detalles con respecto
a la especificidad epitópica de estos anticuerpos. Asimismo, no se
ha dado a conocer la estructura primaria de los anticuerpos de
estas preparaciones antígeno-anticuerpo.
La presente invención se refiere a
procedimientos para el diagnóstico y el tratamiento de anticuerpos
inhibidores dirigidos contra el factor VIII. Se han dado a conocer
procedimientos que muestran cómo llegar a secuencias de nucleótidos
y de aminoácidos que codifican para anticuerpos específicos contra
el factor VIII. La presente invención da a conocer pruebas
diagnósticas que permiten detectar secuencias de nucleótidos y de
aminoácidos que codifican para anticuerpos específicos contra el
factor VIII dentro de una mezcla heterogénea de secuencias de
nucleótidos o de aminoácidos que codifican para anticuerpos. La
presente invención da a conocer, además, la forma de utilizar
fragmentos de anticuerpos recombinantes que se unen específicamente
al factor VIII como nuevos agentes terapéuticos para el tratamiento
de pacientes que presenten inhibidores del factor VIII.
Se da a conocer un polipéptido que comprende una
cadena pesada que comprende la secuencia de EL-14 o
IT-2 representadas en la figura 4A, siendo dicho
polipéptido capaz de neutralizar la actividad inhibidora de los
anticuerpos inhibidores del factor VIII, sin interferir con la
actividad procoagulante del factor VIII.
También se da a conocer un polinucleótido que
codifica para un polipéptido de la presente invención.
Además, la presente invención da a conocer un
procedimiento para la producción de un polipéptido recombinante de
la presente invención, que comprende la preparación de un
polinucleótido que codifica para dicho polipéptido, la preparación
de un vector recombinante que contiene dicho polinucleótido unido de
forma funcional a una secuencia de control capaz de promover la
expresión del polinucleótido por parte de una célula huésped, la
transformación de una célula huésped mediante dicho vector
recombinante, el cultivo de dicha célula huésped en condiciones que
promuevan la expresión del polinucleótido y, de forma opcional, el
aislamiento del polipéptido producido de este modo.
La presente invención da a conocer además una
composición farmacéutica para el tratamiento de la inhibición del
factor VIII en un humano, que comprende un polipéptido, según lo
definido anteriormente, junto con un excipiente farmacéuticamente
aceptable. De forma opcional, la composición también contiene factor
VIII;
La presente invención también da a conocer un
procedimiento para el tratamiento de la inhibición del factor VIII
en un humano, que comprende la administración (de una cantidad
eficaz para reducir o evitar dicha inhibición del factor VIII) de
un polipéptido, según se define en la presente invención,
opcionalmente junto con factor VIII o un sustituto del factor
VIII.
En la técnica anterior no se dan a conocer ni se
sugieren polipéptidos según la presente invención, que sean capaces
de neutralizar la actividad inhibidora de los anticuerpos
inhibidores del factor VIII sin interferir con la actividad del
factor VIII.
La patente WO 93/12232 se refiere a un
anticuerpo monoclonal recombinante que se une a la glucoproteína
gp120 del VIH y que bloquea la unión de gp120 al receptor CD4. Este
documento no hace referencia a los anticuerpos contra el factor
VIII.
Gilles y otros. (Blood Vol. 82, 1993, pp
2452-2461) dan a conocer anticuerpos contra el
factor VIII de pacientes hemofílicos. No se mencionan lo
polipéptidos que comprendan la secuencia de EL-14 o
IT-2, y que presente la combinación única de
propiedades ventajosas, según se describe en la presente
invención.
La patente WO 96/05860 da a conocer un
procedimiento para prevenir o reducir la formación de anticuerpos
inhibidores del factor VIII en pacientes con hemofilia A. Este
procedimiento comprende la administración de una formulación de
inmunoglobulinas antes o durante el tratamiento inicial con factor
VIII. La formulación de inmunoglobulinas puede ser un concentrado
preparado a partir de plasma obtenido de donantes normales. La
patente WO 96/05860 no explica ni sugiere un polipéptido que
comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de
EL-14 o IT-2 representado en la
figura 4A, según se da a conocer en la presente invención.
Hoyer (American Journal of Medicine 1991, Vol.
91, páginas 405-445) resume varias estrategias para
el tratamiento de pacientes que presenten inhibidores del factor
VIII adquiridos. No se mencionan los polipéptidos según la presente
invención, que sean capaces de neutralizar la actividad inhibidora
de los anticuerpos inhibidores del factor VIII sin interferir con
la actividad del factor VIII.
Fijnvandraat y otros. (Blood, Vol. 91, 1998, pp.
2347-2352) describen la caracterización de los
anticuerpos presentes en pacientes con hemofilia A tratados con
factor VIII. Los anticuerpos descritos se unen predominantemente a
regiones específicas, incluidas la región C2 y A3. Se menciona que
se puede utilizar la administración de péptidos sintéticos que se
solapan con epítopos de los inhibidores para resolver el problema de
los inhibidores del factor VIII. En el documento, no se da a
conocer ni se sugiere la solución dada a conocer en la presente
invención, a saber, la selección de fragmentos de anticuerpo con
capacidad para unirse al factor VIII y bloquear los inhibidores del
factor VIII, pero sin interferir con la actividad procoagulante del
factor VIII.
La figura 1 muestra la especificidad por la
cadena ligera de 12 clones obtenidos tras cuatro rondas de cribado
de la colección específica de IgG4 descrita en el ejemplo 2. Se
incubaron fagos que expresan anticuerpos recombinantes en
micropocillos que contenían la cadena ligera del factor VIII (barras
negras; +80K). Para corregir la unión de fondo, también se
incubaron fagos en micropocillos que no contenían la cadena ligera
del factor VIII (barras grises; -80K). En el eje Y, se representa
la DO (450-540 nm). Dos clones (c) expresan
fragmentos de anticuerpo que no se unen específicamente a la cadena
ligera del factor VIII.
La figura 2 muestra la especificidad por la
cadena ligera de 12 clones elegidos aleatoriamente tras la primera
ronda de cribado de la colección específica de IgG4 descrita en el
ejemplo 2. Los clones 7, 8 y 10 expresan fragmentos de anticuerpo
con especificidad por la cadena ligera del factor VIII. Los demás
clones no se unen específicamente a la cadena ligera del factor
VIII. Sólo se observa una unión de fondo del fago a los
micropocillos (barras grises). Dos clones (c) expresan fragmentos
de anticuerpo que no se unen específicamente a la cadena ligera del
factor VIII.
La figura 3 muestra la secuencia de nucleótidos
del clon EL 14 y del clon IT2. La secuencia de nucleótidos de ambos
clones se alinea con la secuencia de nucleótidos de las secuencias
de estirpe bacteriana DP-10 (para EL14) y
DP-14 (para IT2). Las distintas regiones de la parte
variable de la cadena pesada se indican en el siguiente orden:
región estructural 1, CDR1, región estructural 2, CDR2, región
estructural 3, CDR3 y región estructural 4. La homología de los
clones EL14 y IT2 con las secuencias de estirpe bacteriana
DP-10 y DP-14 se indica mediante
barras horizontales (-). Las diferencias vienen indicadas por los
nucleótidos que aparecen en las secuencias de estirpe bacteriana
DP-10 y DP-14. Obsérvese que tanto
CDR3 como la región estructural 4 no se derivan de las secuencias
de estirpe bacteriana DP-10 y DP-14.
Consecuentemente, no se indica homología para esta parte de la
secuencia de nucleótidos.
La figura 4A representa la secuencia de
aminoácidos derivada de la secuencia de nucleótidos del clon el 14
y IT2. En las líneas inferiores se indican las desviaciones de la
secuencia de aminoácidos de los segmentos de estirpe bacteriana
DP-10 y DP-14. La región estructural
se abrevia como "FR" (del inglés framework).
La figura 4B compara la secuencia de aminoácidos
de tres clones relacionados derivados del segmento de estirpe
bacteriana DP-14. La secuencia de aminoácidos del
clon IT2, del clon EL5 y del clon E25 se compara con la del
segmento de estirpe bacteriana DP-14. Se indican las
desviaciones de la secuencia de aminoácidos para cada clon.
Obsérvese que los tres clones distintos comparten algunas
sustituciones de aminoácidos.
La figura 4C compara las secuencias de
aminoácidos del tercer dominio variable (CDR3) de la cadena pesada
del clon EL14 y IT2. Los residuos de aminoácidos homólogos están
indicados por las líneas verticales. Los puntos denotan aminoácidos
relacionados con la carga o la hidrofobicidad.
La figura 5 muestra la especificidad de unión de
scFv-EL14 y scFv-IT2 a la cadena
ligera del factor VIII evaluada mediante los anticuerpos
monoclonales murinos CLB-CAg A y
CLB-CAg 117. ScFv-EL14 se une
específicamente a la cadena ligera del factor VIII cuando se
utiliza CLB-CAg A (80K/Apo) marcado con peroxidasa
como anticuerpo indicador (barras con tramas). De igual forma,
scFv-IT2 se une a la cadena ligera del factor VIII
en estas condiciones (barras con tramas). Por el contrario, cuando
se utiliza CLBCAg 117 (80K/117po) marcado con peroxidasa como
anticuerpo indicador, se reduce en gran medida la unión de
scFv-EL 14 y scFv-IT2 (barras
negras). No se observa unión en ausencia de la cadena ligera del
factor VIII (-/117po; -/Apo). El clon 04 no se une al factor VIII
en estas condiciones experimentales. Estos experimentos muestran que
los epítopos de scFv-EL 14 y
scFv-IT2 se solapan con el de
CLB-CAg 117. En el eje Y, se representa la DO
(450-540 nm) de la absorbancia. En el eje X, se
representan scFv-EL14, scFv-IT2 y
scFv-O4.
La figura 6 muestra la unión de diferentes
diluciones de scFv-EL14 (círculos abiertos),
scFv-IT2 (círculos cerrados) y
scFv-O4 (control negativo) purificados. En el eje X,
se indican las distintas concentraciones de las proteínas
analizadas (\mug/ml)en el eje Y se representa la DO
(450-540 nm) de la absorbancia. El clon
scFv-O4 no se une a la cadena ligera del factor VIII
en las concentraciones de proteínas evaluadas en este experimento.
Tanto scFv-IT2 como scFv-EL14 se
unen específicamente a la cadena ligera del factor VIII.
ScFv-EL14 se une con mayor afinidad a la cadena
ligera del factor VIII, en comparación con
scFv-IT2.
La figura 7A muestra la neutralización de la
actividad inhibidora del anticuerpo monoclonal murino
CLB-CAg 117 por scFv-EL14. El
anticuerpo CLB-CAg 117 se diluyó hasta un valor de 2
UB/ml, que corresponde a una actividad residual del factor VIII de
aproximadamente 25%. Mayores cantidades de scFv-EL14
fueron capaces de neutralizar la actividad inhibidora de
CLB-CAg 117 (círculos cerrados). Una concentración
de 0,75 \mug/ml es suficiente para devolver la actividad del
factor VIII a su nivel original. ScFv-EL14 no afectó
a la actividad inhibidora del anticuerpo monoclonal murino
CLB-CAg A. En el eje Y, se representa la actividad
residual del factor VIII. En el eje X, se representa la cantidad de
scFv añadido en \mug/ml.
La figura 7B muestra la neutralización de la
actividad inhibidora de CLB-CAg 117 por
scFv-IT2 (círculos cerrados). Se necesita una
concentración de 65 \mug/ml para devolver la actividad del factor
VIII a su nivel original. ScFv-IT2 no afectó a la
actividad inhibidora de CLB-CAg A (barras abiertas).
En el eje Y, se representa la actividad residual del factor VIII.
En el eje X, se representa la cantidad de scFv añadido en
\mug/ml.
La figura 8A muestra la especificidad epitópica
de 15 clones obtenidos tras cuatro rondas de cribado de la
colección específica de IgG4 descrita en el ejemplo 8. El cribado se
llevó a cabo utilizando factor VIII inmovilizado en inmunotubos. Se
incubaron fagos que expresan anticuerpos recombinantes en
micropocillos que contenían la cadena ligera del factor VIII
(barras negras) o el dominio A3-C1 (barras con
tramas). Para corregir la unión de fondo, también se incubaron
fagos en micropocillos que no contenían la cadena ligera del factor
VIII o el dominio A3-C1 (barras blancas). En el eje
Y, se representa la DO (450-540 nm).
La figura 8B muestra la especificidad epitópica
de 15 clones obtenidos tras cuatro rondas de cribado de la
colección específica de IgG4 descrita en el ejemplo 8. El cribado se
realizó utilizando una cadena ligera del factor VIII que se había
inmovilizado sobre micropocillos empleando CLB-CAg
117. Se incubaron fagos que expresan anticuerpos recombinantes en
micropocillos que contenían la cadena ligera del factor VIII (barras
negras) o el dominio A3-C1 (barras con tramas).
Para corregir la unión de fondo, también se incubaron fagos en
micropocillos que no contenían la cadena ligera del factor VIII o el
dominio A3-C1 (barras blancas). En el eje Y, se
representa la DO (450-540 nm).
La figura 9A muestra la secuencia de aminoácidos
deducida de los fragmentos de anticuerpos recombinantes específicos
del dominio A3-C1. Se proporciona la secuencia de
aminoácidos de los segmentos de genes de la cadena pesada variable
de estirpe bacteriana DP15, DP31, DP49 y DP77. Se indican las
desviaciones de la secuencia de aminoácidos de estos segmentos de
genes de estirpe celular para cada clon B38, B 18, B35 y B04.
Asimismo, se indica el aminoácido de CDR3 y FR4 de los anticuerpos
recombinantes específicos de A3-C1 codificados por
el clon B38, B18, B35 y B04.
Las figuras 9B-E indican las
secuencias de nucleótidos y de aminoácidos del dominio variable de
la cadena pesada del clon B38, B 18, B35 y B04.
La figura 10A muestra la especificidad epitópica
de 20 clones obtenidos tras cuatro rondas de cribado de la
colección específica de IgG4 descrita en el ejemplo 9. El cribado se
realizó utilizando una cadena pesada del factor VIII (90K+) que se
había inmovilizado sobre micropocillos empleando
CLB-CAg 9. Se incubaron fagos que expresan
anticuerpos recombinantes en micropocillos que contenían la cadena
pesada del factor VIII que se inmovilizaron utilizando el
Anticuerpo monoclonal contra la cadena pesada ESH5 (barras negras).
Para corregir la unión de fondo, también se incubaron fagos en
micropocillos que no contenían la cadena pesada del factor VIII
(barras blancas). En el eje Y, se representa la DO
(450-540 nm).
La figura 10B muestra la especificidad epitópica
de 20 clones obtenidos tras cuatro rondas de cribado de la
colección específica de IgG4 descrita en el ejemplo 9. El cribado se
realizó utilizando una cadena pesada del factor VIII (90K+) que se
había inmovilizado sobre inmunotubos. Se incubaron fagos que
expresan anticuerpos recombinantes en micropocillos que contenían
la cadena pesada del factor VIII que se inmovilizaron utilizando el
Anticuerpo monoclonal contra la cadena pesada ESH5 (barras negras).
Para corregir la unión de fondo, también se incubaron fagos en
micropocillos que no contenían la cadena pesada del factor VIII
(barras blancas). En el eje Y, se representa la DO
(450-540 nm).
La figura 11A muestra la secuencia de
aminoácidos deducida de los fragmentos de anticuerpos recombinantes
específicos de la cadena pesada del factor VIII. Se proporciona la
secuencia de aminoácidos de los segmentos de genes de la cadena
pesada variable de estirpe bacteriana DP10 y DP47. Se indican las
desviaciones de la secuencia de aminoácidos de estos segmentos de
genes de estirpe celular para dos clones que codifican para
anticuerpos recombinantes que se unen a la cadena pesada del factor
VIII. Asimismo, se indica el aminoácido de CDR3 y FR4 de los
anticuerpos recombinantes específicos de la cadena pesada del factor
VIII codificados por los dos clones.
Las figuras 11B y C indican las secuencias de
nucleótidos y de aminoácidos del dominio variable de la cadena
pesada de dos clones que codifican para anticuerpos recombinantes
que se unen específicamente a la cadena pesada del factor VIII.
Varios investigadores han abordado la
especificidad epitópica y el modo de acción de los anticuerpos
inhibidores del factor VIII. La clonación molecular del ADNc del
factor VIII reveló que el factor VIII consta de una serie de
dominios repetidos que aparecen en el orden
A1-A2-B-A3-C1-C2.
En el plasma, el factor VIII circula en forma de un heterodímero
que consiste en una cadena pesada de longitud variable
(90-220 kDa) y una cadena ligera de 80 kDa. La
cadena ligera del factor VIII consta de los dominios
A3-C1-C2, mientras que la cadena
pesada del factor VIII comprende los dominios
A1-A2-B. La heterogeneidad de la
cadena pesada del factor VIII tiene su origen en la limitada
proteólisis que se produce dentro del dominio B, que contiene varios
sitios que son sensibles a la degradación proteolítica. En el
plasma, el factor VIII circula formando un complejo con el factor
de von Willebrand, una proteína multimérica de gran tamaño implicada
en las etapas iniciales de la adherencia de las plaquetas a la
pared vascular dañada. La unión al factor de von Willebrand protege
al factor VIII frente a la degradación proteolítica. La importancia
fisiológica de esta interacción adquiere mayor importancia debido a
los niveles reducidos de factor VIII en el plasma de los pacientes
que carecen de factor de von Willebrand. El factor VIII es una
molécula precursora que, tras su activación, actúa como cofactor del
factor IXa en la conversión dependiente de fosfolípidos y de
Ca^{2+} del factor X al factor Xa. La activación del factor VIII
implica cortes proteolíticos tanto en la cadena pesada como la
cadena ligera del factor VIII. Se considera que la trombina es el
activador fisiológico del factor VIII y realiza cortes en los
residuos Arg^{372}, Arg^{740} y Arg^{1689} del factor VIII.
Así pues, el factor VIII activado por trombina consiste en un
heterotrímero de los dominios A1 y A2 separados y de la cadena
ligera del factor VIII (A3-C1-C2)
cortada. El corte por el residuo de Arg^{1689} de la cadena
ligera del factor VIII tiene como resultado la eliminación de la
secuencia de aminoácidos Glu^{1649}-Arg^{1689},
que resulta fundamental para la unión del factor VIII al factor de
von Willebrand. Hasta el momento, se han caracterizado tres
principales sitios de unión de los inhibidores del factor VIII
(Scandella y otros. 1994, Blood 86: 1811-1819;
Healey y otros. 1995, J. Biol. Chem. 270:
14505-14509; Fijnvandraat y otros. 1998, Blood 91:
2347-2352).
Los residuos de aminoácidos
Val^{2248}-Ser^{2312} del dominio C2 constituyen
un sitio de unión para los inhibidores del factor VIII. El gran
tamaño de este epítopo sugiere que, en el plasma de los pacientes
que presenten inhibidores con especificidad por C2, aparecen varios
anticuerpos que se unen a diferentes regiones de aminoácidos de
este área. Se ha explorado con considerable detalle el mecanismo de
acción de los anticuerpos contra C2. La mayor parte de estos
anticuerpos interfieren con la unión del factor VIII a los
fosfolípidos. Además, algunos de los anticuerpos con especificidad
por C2 también inhiben la interacción del factor VIII con su
portador, el factor de von Willebrand. Recientemente, se ha descrito
un nuevo mecanismo para la inhibición del factor VIII por acción de
un aloanticuerpo humano (Saenko y otros. 1996, J. Biol. Chem. 271:
27424-27431). Se ha demostrado que un aloanticuerpo
humano que se une exclusivamente a la parte amino terminal
(Val^{2248}-Gly^{2285}) del epítopo C2 inhibe
la liberación inducida por trombina del factor VIII del factor de
von Willebrand.
Los residuos de aminoácidos
Arg^{484}-Ile^{508} presentes en el dominio A2
del factor VIII constituyen un epítopo importante para los
inhibidores del factor VIII. Los estudios sobre los mecanismos de
inhibición de los anticuerpos contra A2 han demostrado que los
anticuerpos contra A2 interfieren con la conversión del factor X a
Xa por acción del complejo factor VIIIa-factor IXa
unido a lípidos (Lollar y otros, 1995). Los anticuerpos contra A2
no interfieren con la unión del factor X al complejo factor
VIIIa-factor IXa, sino que simplemente limitan la
conversión del factor X.
Se ha encontrado un tercer epítopo importante de
los inhibidores del factor VIII en el dominio A3 del factor VIII.
La unión de los anticuerpos inhibidores dependió de la presencia de
los aminoácidos Gln^{1778}-Met^{1823}. Estudios
previos han demostrado que este sitio representa un sitio de unión
para el factor IXa y, de hecho, los anticuerpos que se unen a este
sitio interfirieron con la formación del complejo del factor VIIIa
con el factor IXa (Fijnvandraat y otros. 1998. Blood 91:
2347-2352). En varios pacientes que presentan un
inhibidor, se ha observado la presencia de anticuerpos inhibidores
dirigidos contra otros epítopos. Un estudio reciente ha demostrado
que los anticuerpos inhibidores pueden reconocer la región de los
aminoácidos Met^{336}-Arg^{372} del factor VIII
(Ware y otros. 1988. Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:
3165-3169). Aún no se ha investigado el mecanismo
de inhibición, pero recientemente se ha propuesto la presencia de un
sitio de unión del factor X en esta parte de la molécula del factor
VIII (Lapan, K.A. y Fay, P.J. 1997. J. Biol. Chem. 272:
2082-2088).
La especificidad epitópica restringida de los
inhibidores del factor VIII sugiere que un número limitado de
epítopos dominantes de los linfocitos B están implicados en la
respuesta inmunitaria al factor VIII. Aparentemente, los
anticuerpos humanos contra el factor VIII sintetizados por los
clones de linfocitos B de numerosos pacientes, resultan
sorprendentemente similares por cuanto respecta a la especificidad
epitópica. Esto sugiere que la secuencia primaria de aminoácidos y
de nucleótidos de los anticuerpos con especificidad por el factor
VIII es similar a nivel molecular. Basándose en esto, resulta
deseable definir la presencia y la especificidad epitópica de los
anticuerpos contra el factor VIII analizando simplemente la
presencia de secuencias de nucleótidos que correspondan con
anticuerpos con capacidad de inhibición del factor VIII. Hasta el
momento, no se han definido correctamente las secuencias primarias
de los anticuerpos contra el factor VIII. Davies y colaboradores
han sugerido una asociación entre los inhibidores del factor VIII y
la utilización del segmento de gen VH DP73 (Davies y otros. 1997.
Thromb. Haemostas, supplement: 2352A). No se ha dado a conocer la
secuencia de nucleótidos y la secuencia primaria de aminoácidos de
estos anticuerpos, y no se dispone de detalles con respecto a la
especificidad epitópica de estos anticuerpos. Existe una clara
necesidad de definir con mayor detalle la secuencia primaria de
aminoácidos y de nucleótidos de los anticuerpos contra el factor
VIII. Dicha información sobre la secuencia puede servir para
diseñar pruebas diagnósticas que se puedan utilizar para monitorizar
la aparición de clones de linfocitos B que produzcan inhibidores
del factor VIII en pacientes con hemofilia A. Estas pruebas
diagnósticas pueden resultar extremadamente sensibles y aportar
información sobre la especificidad epitópica de los inhibidores del
factor VIII.
Los estudios dirigidos a definir la
especificidad epitópica y el modo de acción de estos anticuerpos
están limitados por la heterogeneidad de estos anticuerpos en el
plasma de estos pacientes. Resulta claro que sería necesario contar
con unos criterios diagnósticos más restrictivos a fin de definir
las propiedades de los inhibidores del factor VIII con mayor
detalle.
Un incremento repentino de la frecuencia del
desarrollo de inhibidores, observado en un grupo de pacientes
previamente tratados, se ha asociado con un concentrado del factor
VIII pasteurizado particular fabricado en los Países Bajos
(Roosendaal y otros. 1993. Blood 81: 2180-2186).
Estos inhibidores del factor VIII se dirigen contra la cadena
ligera del factor VIII y el mapeo epitópico reveló que la mayor
parte de los inhibidores reaccionó con epítopos de los dominios
A3-C1 y C2 del factor VIII (Sawamoto y otros. 1998.
Thromb. Haemostas. 79: 62-68). Recientemente, un
segundo concentrado del factor VIII pasteurizado se ha visto
implicado en el desarrollo de inhibidores en un grupo de pacientes
que habían sido tratados anteriormente. Asimismo, en este caso los
anticuerpos inhibidores presentaron predominantemente especificidad
por la cadena ligera del factor VIII (Peerlinck y otros. 1997.
Thromb. Haemostas. 77: 80-86). Se ha sugerido que el
desarrollo de inhibidores en estos pacientes es debido a pequeñas
alteraciones en la molécula del factor VIII, que se han inducido
durante el proceso de fabricación. Este hecho puede indicar que los
anticuerpos que se desarrollaron en estos pacientes presentan
propiedades distintas en comparación con los anticuerpos
inhibitorios del factor VIII que se desarrollan en otros pacientes.
Resulta claro que el conocimiento de las secuencias de nucleótidos y
de aminoácidos de los anticuerpos específicos contra el factor VIII
podría aportar información adicional sobre la etiología de los
inhibidores del factor VIII, lo que resulta deseable para la
caracterización de la respuesta de los anticuerpos en pacientes que
hayan recibido estos concentrados del factor VIII.
Hasta el momento, no se han dado a conocer las
secuencias primarias de nucleótidos y de aminoácidos de los
anticuerpos contra el factor VIII. La presente invención da a
conocer las secuencias de nucleótidos que codifican para los
anticuerpos humanos con especificidad por el factor VIII. Basándose
en la secuencia primaria de estos anticuerpos, se diseñan cebadores
oligonucleótidos que permiten detectar linfocitos B que producen
anticuerpos con afinidad por el factor VIII. La detección de los
linfocitos B específicos del factor VIII se puede conseguir
mediante ARNm, ADNc o ADN derivados de los linfocitos de los
pacientes. Los ADN, ARN y ADNc genómicos se preparan a partir de
linfocitos mediante procedimientos conocidos en la técnica. A
continuación se enumeran algunos de los procedimientos para la
detección de los clones de los linfocitos B específicos del factor
VIII.
La amplificación selectiva de las secuencias
variables de la cadena pesada (genes VH) se puede utilizar para
detectar secuencias de nucleótidos que codifican para anticuerpos
que forman parte del repertorio de anticuerpos humanos que pueden
unirse específicamente al factor VIII. La parte variable de la
cadena pesada humana se forma a partir de las regiones de cadena
pesada (VH), las regiones de diversidad (D) y las regiones de unión
(J). La fusión de estos tres segmentos de genes distintos no es un
suceso preciso, y esta denominada "diversidad de unión", junto
con el proceso de adición y eliminación de nucleótidos, desemboca en
la generación de la región determinante complementaria
hipervariable 3 (CDR3). La cadena ligera humana se forma de manera
similar, pero carece de la región de diversidad D. Un procedimiento
de hipermutación somática, junto con los mecanismos descritos
anteriormente, genera una diversidad de secuencias adicional, tanto
de las secuencias de cadena pesada como de cadena ligera, lo que
tiene como resultado final la generación de anticuerpos de alta
afinidad. El conocimiento de las secuencias de nucleótidos que
codifican para los anticuerpos específicos contra el factor VIII
permite detectar estos anticuerpos específicos en el repertorio de
los pacientes que corren el riesgo de desarrollar anticuerpos
específicos contra el factor VIII (tales como pacientes con
hemofilia A que reciban tratamiento con el factor VIII o pacientes
con hemofilia adquirida). La amplificación se puede llevar a cabo
mediante una combinación de cebadores oligonucleótidos dirigidos
contra las regiones constantes o las regiones variables de las
cadenas pesada y ligera de los anticuerpos específicos contra el
factor VIII. La detección de los anticuerpos específicos contra el
factor VIII se puede realizar utilizando un cebador oligonucleótido
derivado de las partes variables de la secuencia de nucleótidos que
codifica para los anticuerpos contra el factor VIII y un cebador
oligonucleótido derivado de las regiones constantes de los
anticuerpos específicos contra el factor VIII. La detección también
se puede realizar utilizando dos cebadores oligonucleótidos
específicos para las partes variables de la secuencia de nucleótidos
que codifica para un anticuerpo que se une al factor VIII. Los
métodos descritos en la presente invención también incluyen la
amplificación de genes de inmunoglobulina mediante cebadores
oligonucleótidos dirigidos contra las regiones constantes de los
genes de inmunoglobulina. La detección subsiguiente de las
secuencias de nucleótidos de los anticuerpos específicos contra el
factor VIII se puede realizar mediante hibridación selectiva con
cebadores oligonucleótidos (radiomarcados) dirigidos contra las
partes variables de la secuencia de nucleótidos que codifica para
los cebadores oligonucleótidos anticuerpos específicos contra el
factor VIII. A partir de la descripción anterior, se puede deducir
que los cebadores oligonucleótidos se dirigen preferentemente, pero
no exclusivamente, hacia las regiones constante y variable de los
anticuerpos específicos contra el factor VIII. En el ejemplo 5, se
dan a conocer procedimientos que pueden utilizarse para detectar la
presencia de anticuerpos específicos contra el factor VIII en una
mezcla de secuencias de nucleótidos. La combinación de cebadores
oligonucleótidos derivados de la secuencia de nucleótidos de los
anticuerpos específicos contra el factor VIII se puede utilizar para
evaluar directamente la presencia de los anticuerpos específicos
contra el factor VIII en el repertorio de anticuerpos de los
pacientes. De manera alternativa, se puede utilizar el análisis
mediante procedimientos que incluyen, entre otros, el análisis por
secuenciación, la reamplificación de fragmentos obtenidos con
cebadores oligonucleótidos más específicos, la digestión con
enzimas de restricción y la hibridación selectiva, a fin de evaluar
la presencia de anticuerpos contra el factor VIII. La
cuantificación de la cantidad de secuencias de nucleótidos que
codifican para anticuerpos contra el factor VIII se puede obtener
mediante diversos procedimientos conocidos generalmente en la
materia, que incluyen, pero no se limitan a los siguientes. Se
puede determinar la cantidad de radiactividad incorporada en un
fragmento de PCR que codifica para parte de un anticuerpo específico
contra el factor VIII. Además, se pueden utilizar sondas
oligonucleótidas marcadas radioactivamente para estimar la cantidad
de secuencias de nucleótidos que codifican para un anticuerpo
específico contra el factor VIII en una mezcla de fragmentos de ADN
que codifica para parte del repertorio de anticuerpos de un
paciente. La amplificación mediante PCR cuantitativa puede llevarse
a cabo, por ejemplo, utilizando cebadores oligonucleótidos
modificados con colorantes que permitan monitorizar directamente la
cantidad del producto de PCR generado durante la amplificación.
Un técnico en la materia puede diseñar otros
procedimientos que permitan detectar y cuantificar selectivamente
secuencias de nucleótidos específicas que codifiquen para los
anticuerpos específicos contra el factor VIII.
En los ejemplos 1-10 se incluyen
detalles sobre la identificación y detección de secuencias de
nucleótidos que codifican para anticuerpos específicos contra el
factor VIII en pacientes con hemofilia. Estos ejemplos explican
cómo llegar a las secuencias de nucleótidos de los inhibidores del
factor VIII y aportan detalles acerca de la utilización de esta
información para la detección de anticuerpos específicos contra el
factor VIII.
La presente invención da a conocer las
secuencias de nucleótidos y la secuencia primaria de aminoácidos de
los anticuerpos específicos contra el factor VIII. Los inhibidores
del factor VIII se dirigen, por lo general, contra tres epítopos
principales del factor VIII que se encuentran dentro del dominio
A2-A3 y C2 del factor VIII. En el ejemplo 4, se dan
a conocer las secuencias primarias de nucleótidos y de aminoácidos
de los anticuerpos contra C2. En los ejemplos 8 y 9, se dan a
conocer las secuencias primarias de nucleótidos y de aminoácidos de
los anticuerpos contra A2 y contra A3-C1. La
presente invención explica cómo llegar a las secuencias de
nucleótidos y de aminoácidos de los anticuerpos específicos contra
el factor VIII y los procedimientos dados a conocer en la presente
invención se pueden utilizar para obtener las secuencias de
nucleótidos y de aminoácidos de los anticuerpos contra el factor
VIII con especificidad para otros dominios del factor VIII, que
sirvan como diana para los inhibidores del factor VIII. Los
anticuerpos contra el factor VIII codificados por las secuencias de
nucleótidos dadas a conocer en la presente invención, se pueden
utilizar en el desarrollo de agentes terapéuticos que sean capaces
de limitar la actividad biológica de los inhibidores del factor
VIII. Estos agentes terapéuticos contienen preferentemente, sin
constituir limitación:
1. Los fragmentos de anticuerpo (o agentes
basados en la secuencia de nucleótidos o de aminoácidos) puede
utilizarse para la generación de anticuerpos antiidiotípicos. Los
fragmentos de anticuerpo se pueden administrar o bien junto con el
factor VIII o bien administrarse solos. Asimismo, se pueden utilizar
péptidos o agentes relacionados, que estén basados en la secuencia
primaria de aminoácidos de las partes variables de los anticuerpos
específicos contra el factor VIII para inducir la formación de
anticuerpos antiidiotípicos dirigidos contra los inhibidores del
factor VIII. Los anticuerpos antiidiotípicos también se pueden
obtener cribando colecciones de gran tamaño (semisintéticas) que
codifiquen para una amplia variedad de anticuerpos recombinantes. La
preparación de anticuerpos antiidiotípicos también puede tener
lugar en animales, entre los que se incluyen, sin constituir
limitación, ratones, mediante inyección del anticuerpo recombinante
dado a conocer en la presente invención. Seguidamente, los
anticuerpos antiidiotípicos se pueden obtener mediante
procedimientos conocidos por los expertos en la materia. También se
puede obtener una respuesta antiidiotípica a los anticuerpos
específicos contra el factor VIII mediante la inyección de la parte
codificante del ADN de las secuencias de nucleótidos de los
anticuerpos específicos contra el factor VIII, que se puede obtener
mediante los procedimientos descritos en la presente invención. Se
considera que la inmunización conseguida mediante la inyección del
ADN es sólo ligeramente inmunógena, y es necesario utilizar otros
agentes para obtener una respuesta inmunitaria lo suficientemente
elevada. La inyección conjunta de ADN plasmídico que codifica para
IL-2, GM-CSF y toxoide tetánico se
ha utilizado para potenciar la respuesta inmunitaria al ADN
inyectado (Spellerberg y otros. 1997. J. Immunol.
15:1885-1892). Es posible utilizar procedimientos
similares para potenciar la respuesta inmunitaria hacia los
fragmentos de ADN que codifican para los anticuerpos específicos
contra el factor VIII.
2. Los fragmentos de anticuerpos recombinantes
descritos en la presente invención se pueden utilizar como agentes
terapéuticos para el tratamiento de pacientes que presentan un
inhibidor. Los ejemplos 7 y 10 dan a conocer que los fragmentos de
anticuerpos recombinantes (denominados scFv's) que se unen
específicamente al dominio C2, interfieren con la unión de los
anticuerpos inhibidores contra el factor VIII. Estos scFv's se
pueden utilizar para el tratamiento de pacientes que presenten
anticuerpos inhibidores dirigidos contra el dominio C2. La presente
invención da a conocer un procedimiento para conseguir fragmentos de
anticuerpos recombinantes que se unan específicamente a los
dominios A2, A3-C1 y C2 del factor VIII. Utilizando
los procedimientos descritos en la presente invención, se pueden
obtener fragmentos de anticuerpo adicionales dirigidos contra estas
y otras regiones del factor VIII. Estas regiones incluyen, entre
otras, Arg^{484}-Ile^{508} en el dominio A2,
Gln^{1778}-Met^{1823} en el dominio A3 y
Val^{2248}-Ser^{2312} en el dominio C2.
Preferentemente, una preparación farmacéutica incluirá anticuerpos
recombinantes dirigidos contra múltiples epítopos, dado que la
mayoría de los pacientes presentan anticuerpos inhibidores dirigidos
contra múltiples epítopos del factor VIII. La actividad
neutralizante de los inhibidores propia de los fragmentos de
anticuerpos recombinantes descritos en la presente invención, se
puede modificar mediante la introducción de mutaciones puntuales en
las partes constante y variable de estos fragmentos. Además, los
fragmentos de anticuerpos recombinantes descritos en la presente
invención se pueden clonar en vectores que permitan la expresión de
estos fragmentos, por ejemplo, en forma de fragmento Fab. Un
técnico en la materia conocerá otros vectores que pueden utilizarse
para la expresión de los anticuerpos y de los fragmentos de
anticuerpos (véase, por ejemplo: "Antibody Engineering; A
Practical Approach" [Ingeniería de anticuerpos: un enfoque
práctico] editado por Mc Cafferty y otros. 1996. Oxford University
Press). Existen procedimientos para incrementar la afinidad de los
anticuerpos recombinantes o de los fragmentos de anticuerpos, que
pueden utilizarse para modular las actividades biológicas de los
fragmentos de anticuerpos recombinantes descritos en la presente
invención. Se pueden utilizar péptidos o agentes relacionados con
péptidos, que se hayan diseñado sobre la base de la secuencia de
aminoácidos de los anticuerpos recombinantes descritos en la
presente invención (por ejemplo, péptidos derivados de la secuencia
de aminoácidos de CDR3), para interferir con la actividad de los
inhibidores del factor VIII.
En resumen, la presente invención da a conocer
un procedimiento mejorado para definir anticuerpos inhibidores del
factor VIII. Los procedimientos descritos tienen como resultado la
definición de una secuencia de nucleótidos de los inhibidores del
factor VIII y explican cómo utilizar esta información para
desarrollar procedimientos mejorados para la detección de los
inhibidores del factor VIII. La presente invención también da a
conocer preparaciones farmacéuticas, derivadas de la secuencia de
nucleótidos y/o de la secuencia primaria de aminoácidos de los
anticuerpos específicos contra el factor VIII, que se pueden
utilizar en el tratamiento de pacientes con hemofilia A con
anticuerpos inhibidores dirigidos contra el factor VIII. La dosis de
los agentes terapéuticos que se administrará un paciente depende,
obviamente, de la afinidad del agente terapéutico por el factor
VIII. La afinidad de los fragmentos de anticuerpos recombinantes
descritos en la presente invención puede variar considerablemente,
según se describe en los ejemplos 6 y 7. La dosis que se
administrará también depende del peso corporal del paciente, del
título del inhibidor del factor VIII y de las actividades biológicas
de los distintos componentes del agente terapéutico utilizado. La
dosis que se administrará se puede estimar según los procedimientos
que se dan a conocer los ejemplos 7 y 10. Estos procedimientos se
pueden complementar con estudios de ajuste de la dosis, que
consisten en la administración de los agentes terapéuticos en
modelos animales y en pacientes sanos. En general, la dosis
administrada variará entre 10 \mug - 5 g/kg y más preferentemente
entre 100 \mug - 1g/kg de peso corporal por día.
El agente terapéutico se puede administrar en
combinación con el factor VIII (o con un sustituto del factor
VIII). La dosis del factor VIII administrada junto con el agente
terapéutico puede variar entre 0,1 y 2000 unidades por kg y más
preferentemente entre 1 y 200 unidades por kg de peso corporal por
día.
Las palabras "forma sustancialmente
aislada", según se emplean en el presente documento, se refieren
a una forma del material que se encuentra en una forma distinta a
cualquier forma natural de dicho material, es decir, diferente al
material en su entorno natural. En particular, las palabras
pretenden definir la ausencia relativa de las sustancias acompañan
al material en su forma natural.
Ejemplo
1
Los anticuerpos contra el factor VIII presentes
en el plasma de un paciente con hemofilia adquirida se
caracterizaron mediante experimentos de inmunoprecipitación y
neutralización. La construcción de fragmentos de factor VIII
recombinantes correspondientes al dominio A2,
A3-C1-C2 y C2 del factor VIII se ha
descrito anteriormente (Fijnvandraat y otros. 1997. Blood 89:
4371-4377; Fijnvandraat y otros. 1998. Blood 91:
2347-2352). Estos fragmentos de factor VIII
recombinantes se marcaron metabólicamente con
[^{35}S]-metionina y se utilizaron posteriormente
para la detección de anticuerpos contra el factor VIII mediante
inmunoprecipitación utilizando los procedimientos que se han
descrito anteriormente (Fijnvandraat y otros. 1998. Blood 91:
2347-2352). Se observó reactividad con todos los
dominios A2, A3-C1-C2 y C2 marcados
metabólicamente (datos no mostrados). Esto indica que el plasma del
paciente contenía al menos dos clases de anticuerpos dirigidos
contra el factor VIII. Para determinar la contribución de los
distintos anticuerpos presentes en el plasma del paciente al título
del inhibidor, medida según el ensayo Bethesda, realizamos
experimentos de neutralización. Se mezclaron concentraciones
crecientes de fragmentos de factor VIII recombinantes con muestras
que contenían anticuerpos contra el factor VIII diluidas hasta una
capacidad inhibidora final de 2 UB/ml. La adición tanto de la cadena
ligera del factor VIII recombinante
(A3-C1-C2) como del dominio C2 tuvo
como resultado un descenso de la actividad inhibidora del 50 y el
20%, respectivamente. La adición de la cadena pesada del factor
VIII (dominios A1-A2-B) tuvo como
resultado una neutralización del 45% de la inhibición en el plasma
del paciente. A la vista de estos datos, hemos concluido que los
anticuerpos inhibidores dirigidos contra la cadena pesada
contribuyen al 45% de la capacidad inhibidora de los anticuerpos
contra el factor VIII del paciente, mientras que los anticuerpos
contra A3-C1-C2 son responsables de
la otra mitad de la capacidad inhibidora. Nuestros resultados
aportan pruebas sobre la presencia, como mínimo, de tres clases de
anticuerpos inhibidores en el plasma del paciente. Posteriormente,
determinamos la subclase de los anticuerpos contra el factor VIII
utilizando procedimientos que se han descrito anteriormente
(Fijnvandraat y otros. 1997. Blood 89: 4371-4377).
Los anticuerpos con especificidad por A2 comprendieron
predominantemente la subclase IgG4; además, se observaron pequeñas
cantidades de la subclase IgG2. Los anticuerpos dirigidos contra la
cadena ligera del factor VIII comprendieron exclusivamente la
subclase IgG4. Los procedimientos descritos anteriormente portan un
punto de partida para una caracterización adicional de los
anticuerpos humanos con especificidad por el factor VIII. Se pueden
realizar análisis similares en muestras derivadas de otros
pacientes que se analicen para evaluar la presencia de inhibidores
del factor VIII.
Ejemplo
2
Se aislaron linfocitos de sangre periférica de
una muestra de sangre de un paciente con hemofilia adquirida. El
título del inhibidor fue de 1250 UB/ml. Se aisló ARN de los
linfocitos mediante RNAzol (WAK Chemie, Alemania), siguiendo las
instrucciones del fabricante. Se procedió a transcribir el ARN en
ADNc utilizando cebadores de hexámeros aleatorios (Gibco, Breda,
Países Bajos). Dado que la mayor parte de los anticuerpos contra el
factor VIII descritos en el ejemplo 1 fueron de la subclase IgG4, se
amplificaron los fragmentos de ADN correspondientes a la cadena
pesada de las inmunoglobulinas de la subclase IgG4 utilizando el
siguiente conjunto de cebadores oligonucleótidos:
- conIgG1-4
- 5' CTTGTCCACCTTGGTGTTGCTGGG 3'
- huIgG4
- 5' ACGTTGCAGGTGTAGGTCTTC 3'
- huVH1aback
- 5' CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG 3'
- huVH2aback
- 5' CAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGG 3'
- huVH3aback
- 5' GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG 3'
- huVH4aback
- 5' GAGGTGCAGCTGTTGCAGTCGGG 3'
- huVH5aback
- 5' GAGGTACAGCTGCAGCAGTCTGC 3'
- huVH6aback
- 5' CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG 3'
- huJH1-2forSal
- 5' GAGTCATTCTCGT\underbar{GTCGAC}ACGGTGACCAGGGTGCC 3'
- huJH3forSal
- 5' GAGTCATTCTCGT\underbar{GTCGAC}ACGGTGACCATTGTCCC 3'
- huJH4-5forSal
- 5' GAGTCATTCTCGT\underbar{GTCGAC}ACGGTGACCAGGGTTCC 3'
- huJH6forSal
- 5' GAGTCATTCTCGT\underbar{GTCGAC}ACGGTGACCGTGGTCCC 3'
- huVH1backNco
- 5' AAT\underbar{CCATGG}CCCAGGTGCAGCTGGTGCA 3'
- huVH2backNco
- 5' AAT\underbar{CCATGG}CCCAGGTCAACTTAAGGGA 3'
- huVH3backNco
- 5' AAT\underbar{CCATGG}CCGAGGTGCAGCTGGTGGA 3'
- huVH4backNco
- 5' AAT\underbar{CCATGG}CCGAGGTGCAGCTGTTGCA 3'
- huVH5backNco
- 5' AAT\underbar{CCATGG}CCGAGGTACAGCTGCAGCA 3'
- huVH6backNco
- 5' AAT\underbar{CCATGG}CCCAGGTACAGCTGCAGCA 3'
\vskip1.000000\baselineskip
Los cebadores oligonucleótidos
huVHa(1-6)back y
huJH(1-6)forSal se han descrito
anteriormente (Marks y otros. 1991. J. Mol. Biol. 222:
581-597). Los cebadores oligonucleótidos
huVH(1-6)backNco se han adaptado a
partir de cebadores oligonucleótidos descritos en la misma
publicación. La primera serie de amplificación se llevó a cabo con
cebadores huVH(1-6)back junto con el
cebador conIgG1-4. Se obtuvieron seis fragmentos de
ADN distintos de unas 700 pb, correspondiente cada uno de ellos a
una familia de genes VH individuales. Se aislaron seis fragmentos
distintos y se reamplificaron con los cebadores
huVH(1-6)back y con el cebador huIgG4.
Se obtuvieron seis productos de aproximadamente 660 bp. Los seis
fragmentos de 660 bp diferentes, que representaron el repertorio
IgG4 del paciente, se reamplificaron con los cebadores
huVH(1-6)backNco y
huJH(1-6)forSal a fin de preparar
estos fragmentos para su clonación. Los 24 fragmentos resultantes se
mezclaron según la familia de genes VH y los seis fragmentos
distintos se digirieron con NcoI y SalI. Estos fragmentos digeridos
se purificaron y se disolvieron en TE (10 mM
Tris-HCl pH=8,0; 0,1 mM EDTA). El vector
pHEN-1-VLrep se ha descrito
previamente (Griffin, H.M. y Ouwehand, W.H. 1995. Blood 86,
4430-4436; Schier y otros. 1996. J. Mol. Biol. 255:
28-43) y contiene un repertorio de cadena ligera
derivado de dos donantes no inmunizados. Se ha demostrado que la
inserción de un repertorio de cadena pesada en este vector tiene
como resultado la producción de fragmentos de anticuerpos que
constan de los dominios variables tanto de la cadena pesada como de
la cadena ligera. Estos fragmentos de anticuerpo se han denominado
fragmento Fv (scFv) de cadena sencilla (Hoogenboom, H.R. y otros.
1991. Nucleic Acid Res. 19: 4133-4137). El vector
pHEN-1-VLrep (cedido amablemente por
el Dr. W.H. Ouwehand, Departamento de medicina de transfusión,
Universidad de Cambridge, Reino Unido) se digirió con XhoI y NcoI y
se insertaron los seis fragmentos correspondientes al repertorio de
cadena pesada específico de IgG4 del paciente con hemofilia
adquirida. La mezcla de ligación se transformó en E. coli TG1
y se obtuvo una colección de 1.500.000-2.500.000 de
clones independientes. Las colonias se rascaron y se resuspendieron
en medio 2TY enriquecido con un 15% de glicerol, 100 \mug/ml de
ampicilina y 1% de glucosa. De forma similar a los procedimientos
descritos anteriormente, se pueden crear colecciones que representen
el repertorio de inmunoglobulina de otros pacientes.
La selección de los clones que codifican para
los fragmentos de anticuerpo (scFvs) con especificidad por el
factor VIII se realizó según lo que se describe a continuación. Se
extendieron disoluciones de partida de glicerol en placas con 2TY
que contenían ampicilina (100 \mug/ml) y 1% de glucosa. Las
colonias se dejaron crecer toda la noche y se rascaron al día
siguiente, y se disolvieron en medio 2TY enriquecido con 100
\mug/ml de ampicilina y 1% de glucosa. Estas células se
disolvieron en medio 2TY enriquecido con ampicilina (100 \mug/ml)
y 1% de glucosa hasta una densidad óptica final (DO) de 0,3
(determinada a 600 nm). Las células se dejaron crecer a 37ºC hasta
alcanzar una DO de 0,5. Posteriormente, se diluyó 1 ml de cultivo 10
veces en medio 2TY con ampicilina (100 \mug/ml) y 1% de glucosa.
A continuación, se añadieron 20 \mul de fago coadyuvante (VCSM13;
1 x 10^{11} ufp/ml) y la mezcla se incubó durante 45 minutos a
37ºC sin agitación. A continuación, las células se incubaron a 37ºC
con agitación a 150 rpm durante otros 45 minutos. Las células se
precipitaron mediante centrifugación a baja velocidad y se
resuspendieron en 100 ml de medio 2TY enriquecido con ampicilina
(100 \mug/ml), 0,1% de glucosa y 25 \mug/ml de kanamicina. Las
células se incubaron toda la noche a 30 ºC. Al día siguiente, las
células se precipitaron mediante centrifugación a 10000 rpm durante
30 minutos. Se recogió el sobrenadante y se dejó que el fago
recombinante precipitase durante 2 horas a 4ºC tras la adición de
1/5 volumen de PEG6000 al 20%/NaCl 2,5 M. Los fagos se precipitaron
mediante centrifugación (30 minutos a 10000 rpm) y se
resuspendieron en 5 ml de TBS (Tris-HCl 50 mM pH
7,4, NaCl 150 mM). Esta preparación se precipitó mediante
centrifugación durante 5 minutos a 14000 rpm y el sobrenadante se
conservó a 4ºC.
La selección de los fagos con capacidad de unión
al factor VIII se realizó según lo descrito a continuación. Se
recubrieron micropocillos durante toda la noche a 4ºC con 5
\mug/ml del anticuerpo monoclonal murino CLB-CAg
12 específico contra la cadena ligera del factor VIII, que se diluyó
en NaHCO_{3} 50 mM (pH 9,5). Los pocillos se bloquearon durante 1
hora a 37ºC con TBS enriquecida con un 3% de HSA. La solución del
fago (1 x 10^{12} ufp/ml) se diluyó 1 a 1 en TBS enriquecida con
un 6% de HSA y un 1% de Tween-20 y se incubó
durante 2 horas a temperatura ambiente con micropocillos que
contenían CLB-CAg 12 inmovilizado. La solución del
fago se retiró y se transfirió a un segundo micropocillo (también
recubierto con CLB-CAg 12) que se había preincubado
con 1 \mug/ml de la cadena ligera del factor VIII. Los fagos se
incubaron con la cadena ligera del factor VIII durante 2 horas a
temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron 20 veces con TBS/0,1%
de Tween-20 y 20 veces con TBS y el fago unido se
eluyó con trietilamina 100 mM (pH 12). El fago eluido (volumen de 1
ml) se neutralizó mediante la adición de 500 \mul de
Tris-HCl 1 M pH 7,4 y, posteriormente, se añadieron
a 5 ml de E. coli TGl (DO 600 = 0,5). Las células se
incubaron durante 1/2 hora a 37ºC (sin agitación) y 10 minutos a
37ºC (con agitación a 200 rpm). Las células se recogieron mediante
centrifugación durante 10 minutos a 4000 rpm durante 7 minutos.
Posteriormente, las células TG1 infectadas se extendieron en placas
con agar 2TY enriquecidas con ampicilina (100 \mug/ml) y 1,0% de
glucosa. Las células se dejaron crecer toda la noche a 30ºC. Las
células se rascaron en medio 2TY enriquecido con ampicilina (100
\mug/ml), 1% de glucosa y 15% de glicerol. Las ampollas se
conservaron a -70ºC.
De forma alternativa, la cadena ligera del
factor VIII (5 \mug/ml en NaHCO_{3} 50 mM (pH 9.6)) se
inmovilizó en inmunotubos (Nunc, Life Technologies, Breda, Países
Bajos). En primer lugar, 1 ml de solución de fago diluida en TBS
enriquecida con un 3% de HSA se incubó durante 2 horas a temperatura
ambiente en inmunotubos no recubiertos. A continuación, se retiró 1
ml de solución de fago y se incubó durante 2 horas a temperatura
ambiente en inmunotubos recubiertos con la cadena ligera del factor
VIII. Los inmunotubos se lavaron 20 veces con TBS/0,1% de
Tween-20 y 20 veces con TBS. El fago unido eluyó
con trietilamina 100 mM (pH 12) y se procesó según lo descrito
anteriormente.
Se inició la segunda ronda de cribado inoculando
50 \mul de solución de partida de glicerol obtenida tras la
primera selección en 10 ml de medio 2TY enriquecido con ampicilina
(100 \mug/ml) y 1% de glucosa hasta una DO600 final de 0,3. Las
células se dejaron crecer hasta una DO600 de 0,5, se diluyeron 1 a
10 en medio 2TY enriquecido con ampicilina (100 \mug/ml),
kanamicina (25 \mug/ml) y 1% de glucosa y posteriormente se
infectaron con un exceso de 20 veces de VCSM13. Las células se
dejaron crecer toda la noche a 30ºC. El sobrenadante, que contenía
el fago, se recogió según lo descrito anteriormente y de nuevo se
evaluó su unión a la cadena ligera del factor VIII inmovilizada.
Tras cuatro rondas de cribado, se cultivaron 30 clones seleccionados
mediante ELISA y 30 clones que se obtuvieron tras un cribado con la
cadena ligera del factor VIII inmovilizada en inmunotubos, y se
analizó su unión a la cadena ligera del factor VIII. Las colonias se
recogieron y se dejaron crecer toda la noche en 2 ml de medio 2TY
enriquecido con 100 \mug/ml de ampicilina y 1% de glucosa. Al día
siguiente, los cultivos se diluyeron 200 veces y se dejaron crecer
hasta una DO600 de aproximadamente 0,5. A continuación, las células
se infectaron con VCSM13 durante 45 minutos a 37ºC (sin agitación) y
45 minutos a 37ºC (con agitación a 200 rpm). Los cultivos
infectados se diluyeron 1 a 10 en medio 2TY enriquecido con 100
\mug/ml de ampicilina, 0,1% de glucosa y 25 \mug/ml de
kanamicina, y las células se dejaron crecer toda la noche a la
30ºC. El sobrenadante, que contenía el fago, se recogió tras su
centrifugación y se analizó su unión a la cadena ligera del factor
VIII, según lo descrito a continuación. El anticuerpo monoclonal
murino CLB-CAg 12 no inhibitorio, dirigido contra
el epítopo del dominio A3-C1 del factor VIII, se
inmovilizó en pocillos a una concentración de 5 \mug/ml en
NaHCO_{3} 50 mM (pH 9,5). Los pocillos se bloquearon durante 1
hora en TBS enriquecida con 3% de HSA. Los pocillos se incubaron con
la cadena ligera del factor VIII a una concentración de 1 \mug/ml
en Tris HCl 50 mM (pH 7,4), NaCl 1 M, y 2% de HSA durante 2 horas a
37ºC. Se añadieron cincuenta \mul de solución de fago y un
volumen igual de TBS enriquecida con 1% de Tween-20
y 6% de HSA a los pocillos que contenían la cadena ligera del factor
VIII. Para monitorizar la unión específica de los fagos, los
pocillos que no contenían la cadena ligera del factor VIII se
incubaron simultáneamente con la misma solución de fago. Los fagos
se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas y se agitaron a
intervalos regulares. Posteriormente, los pocillos se lavaron
intensamente 5 veces con TBS enriquecida con 0,1% de
Tween-20 y 5 veces con TBS. La presencia de fago
unido se monitorizó mediante incubación con un anticuerpo
policlonal dirigido contra M13 marcado con peroxidasa
(Pharmacia-LKB, Woerden, Países Bajos) en una
dilución de 1 a 4000 en TBS enriquecida con 1% de HSA y 0,1% de
Tween-20. Las placas se lavaron 5 veces con TBS
enriquecida con 0,1% Tween-20 y 5 veces con TBS. La
unión del anticuerpo contra M13 marcado con peroxidasa se cuantificó
mediante incubación con
3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB). La conversión
del sustrato se detuvo mediante la adición de 100 \mul de
H_{2}SO_{4} 2N. Parte de los resultados de este análisis se
incluyen en la figura 1. Se aporta un ejemplo de 12 clones que
presentan unión específica a la cadena ligera del factor VIII.
Resulta claro que el fago codificado por los clones 1 a 12 presenta
unión a la cadena ligera del factor VIII (barras negras). Se puede
observar cierta unión de fondo, que no depende de la presencia de la
cadena ligera del factor VIII (barras grises). Las barras marcadas
con c representan dos clones que expresan fragmentos de anticuerpo
que no se unen específicamente a la cadena ligera del factor VIII.
Estos clones se han derivado de la colección inicial y no se han
seleccionado sobre la cadena ligera del factor VIII. Para garantizar
el incremento de la cantidad de fragmentos de anticuerpos
recombinantes específicos contra el factor VIII durante las rondas
subsiguientes de cribado, analizamos 12 clones obtenidos tras la
primera ronda de cribado en cuanto a su unión a la cadena ligera
del factor VIII (figura 2). Sólo 3 de los 12 clones se unen
específicamente a la cadena ligera del factor VIII. En 9 de 12
clones, la unión del fago no depende de la presencia de la cadena
ligera del factor VIII. Estos resultados indican con claridad que,
durante el cribado, se puede incrementar selectivamente la cantidad
de fagos que expresan anticuerpos específicos contra el factor VIII.
En resumen, hemos descrito un protocolo específico para la
selección de anticuerpos específicos contra el factor VIII que se
corresponden con el espectro de los anticuerpos contra el factor
VIII presentes en el paciente con hemofilia adquirida. En los
primeros dos ejemplos, nuestro análisis está limitado al material
derivado de un único paciente, y sólo se han analizado los
anticuerpos dirigidos contra la cadena ligera del factor VIII.
Mediante los procedimientos descritos en estos dos ejemplos, se
puede obtener fácilmente el repertorio de anticuerpos contra el
factor VIII de otros pacientes que presentan un inhibidor. Además,
se pueden obtener los anticuerpos contra el factor VIII dirigidos
contra epítopos localizados fuera de la cadena ligera del factor
VIII adaptando los procedimientos de selección utilizados en el
ejemplo 1 y 2. Se pueden seleccionar los anticuerpos dirigidos
contra la cadena pesada inmovilizando la cadena pesada del factor
VIII utilizando el anticuerpo monoclonal CLB-CAg 9.
En estos dos ejemplos, nos hemos centrado en el repertorio IgG4 del
paciente. De forma similar, se pueden investigar otras subclases
utilizando los cebadores apropiados. Por ejemplo, la subclase
IgG1-4 se puede detectar simplemente utilizando el
cebador conIgG1-4 descrito en el ejemplo 1. De
igual forma, se pueden utilizar otros cebadores específicos de IgA,
IgM, IgE e IgD para crear repertorios de anticuerpos que incluyan
anticuerpos específicos contra el factor VIII.
Ejemplo
4
En los ejemplos anteriores, se han descrito
procedimientos para obtener anticuerpos recombinantes con
especificidad por el factor VIII. Para obtener información sobre
las propiedades de estos anticuerpos, seleccionamos 30 clones que
habían sido seleccionados mediante factor VIII inmovilizado en
inmunotubos. Asimismo, se analizaron 30 clones que habían sido
seleccionados utilizando la cadena ligera del factor VIII con el
anticuerpo monoclonal CLB-CAg 12. Los clones se
cultivaron según lo descrito en el ejemplo 2 y se aisló el ADN
plasmídico. La secuencia de nucleótidos de la parte variable de la
cadena pesada (dominio VH) de 55 clones se determinó utilizando el
cebador inverso M13 marcado con fluorescencia en un secuenciador de
ADN ABI-Prism 377. Las secuencias obtenidas se
alinearon con secuencias de la cadena pesada incluidas en la base de
datos"V BASE" del MRC Centre of Protein Engineering
(Cambridge, Reino Unido). Los 55 clones analizados estaban
codificados por dos segmentos de genes VH distintos
DP-10 y DP-14 (Cook y Tomlinson,
Immunology Today 16: 237-242). Los 41 clones
codificados por la secuencia de estirpe bacteriana DP 14
consistieron en tres grupos de anticuerpos recombinantes que
difirieron principalmente en las secuencias de nucleótidos de las
regiones constantes del gen VH. Treinta y tres clones fueron
representados por el clon IT2, 5 clones fueron representados por
EL25 y 3 clones fueron representados por el clon EL5 (Tabla I). Se
seleccionaron dos clones codificados por DP10 (EL 14) y DP14 (IT2)
para su análisis posterior. En las figuras 3 y 4 se incluyen las
secuencias de nucleótidos y las secuencias primarias de aminoácidos
de estos clones. En la tabla I se incluyen las características de
las dos secuencias. Es muy probable que parte del clon EL 14 se
derive del segmento D D6-13 y del segmento J
JH-3b. Se ha producido una hipermutación somática
durante la respuesta inmunitaria, hecho puesto en evidencia por el
gran número de cambios de nucleótidos observados, en comparación
con las secuencias de estirpe bacteriana de los segmentos VH. La
parte de la cadena pesada variable del clon IT2 contiene 20
sustituciones de nucleótidos, en comparación con el segmento de
estirpe bacteriana DP-14. Estas 20 sustituciones de
nucleótidos tienen como resultado unos cambios totales de 13
aminoácidos (tabla I). La parte de la cadena pesada variable del
clon EL 14 contiene 18 sustituciones de nucleótidos, en comparación
con el segmento de estirpe bacteriana DP-10. Estas
18 sustituciones de nucleótidos tienen como resultado 12 cambios de
aminoácidos (tabla I). El clon IT2 se ha obtenido en parte a partir
de los segmentos de genes D3-3 y JH6b. Es importante
destacar que se observa una elongación de residuos G entre las
secuencias de estirpe bacteriana DP 14 y D3-3 para
el clon IT2 que codifica para una rama flexible de residuos de
glicina. La inspección de la secuencia de aminoácidos del clon EL14
y IT2 revela varias características interesantes. Ambas regiones
CDR3 contienen varios residuos de glicina en sus partes amino
terminales, que vienen seguidos, en ambos casos, de tirosina y
ácido glutámico (GG-YE). Además, parece conservarse
una prolina, una alanina y un ácido aspártico en la parte carboxilo
terminal de CRD3 (P- - -A-D). Se pueden
derivar un patrón común de las secuencias de aminoácidos de las
regiones CDR3 del clon EL14 y IT2, que se indica en la figura 4B.
Estas características pueden determinar la especificidad de estos
anticuerpos por la cadena ligera del factor VIII. En este ejemplo,
se han dado a conocer las secuencias de nucleótidos y las secuencias
primarias de aminoácidos de dos anticuerpos recombinantes contra el
factor VIII. Mediante procedimientos similares a los descritos en
este ejemplo, se pueden analizar anticuerpos recombinantes dirigidos
contra otras regiones de la molécula del factor VIII. Las
características comunes de estos anticuerpos se pueden identificar
según lo descrito en este ejemplo, y se pueden utilizar agentes
terapéuticos y diagnósticos derivados de estas características
comunes para el diagnóstico y tratamiento de pacientes que presenten
inhibidores del factor VIII.
Ejemplo
5
Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos
descritos en el ejemplo anterior se pueden utilizar para detectar
específicamente los anticuerpos contra el factor VIII con
especificidad por C2 en mezclas heterogéneas de anticuerpos. Esto
se puede lograr desarrollando reactivos, por ejemplo, anticuerpos
que reconocen específicamente los anticuerpos contra el factor VIII
descritos en la presente invención. La detección de los anticuerpos
específicos contra el factor VIII también se puede realizar mediante
un análisis de la presencia de secuencias de nucleótidos
específicas que codifican para anticuerpos específicos contra el
factor VIII. En la presente invención se dan a conocer
procedimientos para la obtención de secuencias de nucleótidos que
codifican para anticuerpos específicos contra el factor VIII. En
este ejemplo, se da a conocer la detección de secuencias de
nucleótidos que codifican para uno de los anticuerpos específicos
contra el factor VIII descritos en el ejemplo anterior (EL 14). Se
obtuvieron linfocitos del paciente con hemofilia adquirida descrito
en el primer ejemplo. Se aisló el ARN y se preparó el ADNc.
Posteriormente, los fragmentos de ADN se amplificaron con los
cebadores oligonucleótidos
huVH(1-6)aback y
conIgG1-4 (véase el ejemplo 2). Los seis fragmentos
de 700 pb distintos obtenidos se aislaron y se utilizaron en una
segunda PCR con los cebadores oligonucleótidos
huVH(1-6)back y huIgG4. Esta
operación dio como resultado un fragmento de 660 bp que se clonó en
el vector pGEM-T (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Se
evaluó la presencia de secuencias de nucleótidos correspondientes a
la del clon EL 14 mediante secuenciación de nucleótidos. Uno de los
sesenta clones analizados comprendió secuencias de nucleótidos
idénticas a las obtenidas en el clon EL 14. Este análisis muestra
que, utilizando como punto de partida las secuencias de nucleótidos
dadas a conocer en la presente invención, es posible monitorizar la
presencia de anticuerpos específicos contra el factor VIII en
muestras de pacientes. En este ejemplo, se utilizan cebadores
oligonucleótidos que también se han utilizado para la construcción
de la colección específica de IgG4. Se pueden diseñar otras
combinaciones de cebadores oligonucleótidos que se basen en las
secuencias de nucleótidos del clon EL 14 e IT2, que pueden incluir,
entre otros, cebadores oligonucleótidos que se basen en la región
CDR3 de estos anticuerpos. En este ejemplo, la detección de
anticuerpos específicos contra el factor VIII se realizó mediante
análisis de secuencia de nucleótidos. De forma alternativa, la
detección de secuencias específicas del factor VIII también se
puede realizar mediante hibridación selectiva utilizando sondas que
se basen en la secuencia de nucleótidos de los anticuerpos
específicos contra el factor VIII dados a conocer en la presente
invención.
Los procedimientos dados a conocer en la
presente invención permiten aislar anticuerpos contra el factor VIII
y determinar sus secuencias de nucleótidos y de aminoácidos. En
este ejemplo, hemos descrito procedimientos que detectan los
anticuerpos específicos contra el factor VIII que aparecen en el
repertorio de un paciente que presente un inhibidor del factor
VIII. En los ejemplos 8 y 9, se incluye la secuencia de nucleótidos
de los fragmentos de anticuerpo que se unen al dominio A2- y
A3-C del factor VIII. Se pueden utilizar
procedimientos similares a los descritos en este ejemplo para
detectar secuencias de nucleótidos que codifiquen para los
inhibidores del factor VIII con especificidad por A2, A3, C1 o por
otro epítopo distinto.
Ejemplo
6
Las propiedades bioquímicas de los anticuerpos
específicos contra el factor VIII IT2 y EL14 se caracterizaron del
siguiente modo. En primer lugar, los plásmidos
pHEN-1-VL-EL14 y
pHEN-1-VL-IT2 se
digirieron con NcoI y NotI y los fragmentos de anticuerpos
recombinantes se aislaron y se clonaron en el vector
pUC119-sfi/Not-His6 (cedido
amablemente por el Dr. W.H. Ouwehand, Departamento de medicina de
transfusión, Universidad de Cambridge, Reino Unido). Se
identificaron los clones positivos y se dejaron crecer hasta que
alcanzaron una DO600 de 0,8-1,0 en medio 2TY
enriquecido con 1% de glucosa y 100 \mug/ml de ampicilina.
Seguidamente, se añadió
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido
(IPTG) hasta una concentración final de 1 mM y se dejaron crecer
las células durante 3 horas para 30ºC. Las células se recogieron
mediante centrifugación durante 15 minutos a 4000 g a 4ºC. El
precipitado se disolvió en 10 ml de Tris-HCl 30 mM
(pH 8,0), EDTA 1 mM y sacarosa al 20% para liberar el contenido del
periplasma. La mezcla se incubó a 4ºC durante 20 minutos y,
posteriormente, las células se recogieron mediante centrifugación
(15 min., 10800 g a 4ºC). Se recogió el sobrenadante, que consistió
principalmente en las proteínas presentes en el periplasma. El
precipitado se resuspendió en 10 ml de MgSO_{4} 5 mM y se incubó
durante 20 minutos a 4ºC. Los desechos celulares residuales se
recogieron mediante centrifugación durante 15 minutos a 10800 g. El
sobrenadante (designado fracción de choque osmótico) se recogió y
se añadió a la fracción que contenía las proteínas derivadas del
periplasma. Las fracciones mezcladas se centrifugaron durante 20
minutos a 30000 g a 4ºC y se recogió el sobrenadante. El
sobrenadante se filtró sobre un filtro de 0,22 \mum. Se añadió
una mezcla de inhibidores de la proteasa (Complete^{TM} Mini,
Boehringer Mannheim, Alemania) y las fracciones mezcladas se
dializaron toda la noche frente a un tampón que contenía NaPi 50 mM
(pH 7,4), imidazol 20 mM y NaCl 500 mM. Los ScFv's se purificaron
mediante una resina de afinidad de níquel Ni-NTA
(QIAGEN, Alemania) según se describe a continuación: se equilibró 1
ml de matriz Ni-NTA con NaPi 50 mM (pH 7,4),
imidazol 250 mM, NaCl 500 mM y, posteriormente, con NaPi 50 mM (pH
7,4), imidazol 20 mM y NaCl 500 mM. A continuación, el sobrenadante
dializado que contenía los scFv's específicos contra el factor VIII
se incubó de forma discontinua con la matriz Ni-NTA
durante 3 horas a 4ºC. A continuación, el Ni-NTA se
transfirió a una columna y se lavó con 7 ml de NaPi 50 mM (pH 7,4),
imidazol 20 mM, NaCl 500 mM y 7 ml de NaPi 50 mM (pH 7,4), imidazol
35 mM y NaCl 500 mM. Los ScFv's se eluyeron con NaPi 50 mM (pH
7,4), imidazol 250 mM, NaCl 500 mM y se conservaron a 4ºC. La pureza
de las distintas preparaciones de scFv se evaluó mediante
SDS-PAGE, seguido de una tinción con Azul brillante
de Coomassie. Todos los ScFv's purificados resultaron ser
homogéneos, como mínimo, en un 90%, y migraron con un peso molecular
aparente de 30 kDa. En las preparaciones obtenidas, se observó una
pequeña cantidad de proteínas con un menor peso molecular. Se
investigó la identidad de esta banda mediante inmunotransferencia
con el anticuerpo monoclonal 9E 10. El epítopo de este anticuerpo
está presente en el extremo carboxilo terminal de los scFv's. Tanto
la proteína que migra con un peso molecular de 30 kDa como la de 15
kDa reaccionaron con el anticuerpo monoclonal 9E10 en una
inmunotransferencia de tipo Western. Esto indica que, con alta
probabilidad, el fragmento 15 kDa corresponde a la cadena ligera de
los scFv's. Los scFv's correspondientes al clon IT2 y EL 14 se
purificaron según lo descrito anteriormente. Un scFv derivado del
clon 04, un clon presente en la colección del paciente que no se
unió a la cadena ligera del factor VIII, se incluyó como control
negativo. Se evaluó la unión tanto de scFv-IT2 como
de scFv-EL14 a la cadena ligera del factor VIII
mediante el siguiente ensayo ELISA. El anticuerpo monoclonal 9E10 (5
\mug/ml), disuelto en NaHCO_{3} 50 mM pH 9,5, se inmovilizó
sobre pocillos toda la noche a 4ºC. Posteriormente, se añadieron
los scFv's purificados diluidos en Tris-HCl 50 mM
(pH 7,4), NaCl 150 mM, 1% de HSA y 0,2% de Tween-20
y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Las
microplacas se lavaron 5 veces con TBS, 0,1% de
Tween-20. A continuación, se añadió la cadena ligera
del factor VIII purificada (5 \mug/ml) junto con el anticuerpo
monoclonal CLB-CAg A marcado con peroxidasa (0,5
\mug/ml). La mezcla (diluida en TBS, 0,1% de
Tween-20) se incubó durante 2 horas a temperatura
ambiente. Los micropocillos se lavaron 5 veces con solución salina
en tampón Tris (TBS) enriquecida con 0,1% de
Tween-20 y 5 veces con TBS. La cantidad de
anticuerpo monoclonal CLB-CAg A marcado con
peroxidasa que se había unido se cuantificó mediante el sustrato
TMB. Los resultados de este análisis se incluyen en la figura 5.
Tanto scFv-EL14 como scFv-IT2
reaccionan específicamente con la cadena ligera del factor VIII,
mientras que scFv-04 no reaccionó con la cadena
ligera del factor VIII. Seguidamente, utilizamos el anticuerpo
monoclonal murino inhibidor del factor VIII CLB-CAg
117 para la detección de la cadena ligera del factor VIII unida. Se
realizó un ensayo ELISA según lo descrito anteriormente. En lugar
de CLB-CAg A marcado con peroxidasa, utilizamos
CLB-CAg 117 marcado con peroxidasa para la detección
de la cadena ligera del factor VIII inmovilizada. No observamos
unión de CLB-CAg 117 cuando la cadena ligera del
factor VIII se encuentra inmovilizada por scFv-EL14
y scFv-IT2 (figura 5). Estos resultados muestran que
el epítopo de scFv-EL14 y scFv-IT2
se solapa con el de CLB-CAg 117. Anteriormente,
habíamos demostrado que el anticuerpo inhibidor
CLB-CAg 117 se dirige contra el dominio C2 del
factor VIII (Fijnvandraat y otros. 1998. Blood 91:
2347-2352). Aparentemente, ambos scFv's se unen a un
epítopo en el dominio C2 del factor VIII que se solapa con el del
anticuerpo monoclonal murino inhibitorio CLB-CAg
117.
A continuación, se evaluó la unión de diferentes
diluciones de scFv-EL14 y scFv-IT2 a
la cadena ligera del factor VIII inmovilizada, según lo descrito
anteriormente, utilizando el anticuerpo CLB-CAg A
como anticuerpo de detección (figura 6). A partir de este análisis,
se observó que ScFv-EL14 se une con mayor afinidad a
la cadena ligera del factor VIII, en comparación con
scFv-IT2. Estos resultados se complementaron
mediante experimentos de inmunoprecipitación para
scFv-EL14. Los experimentos de inmunoprecipitación
utilizando un fragmento marcado metabólicamente correspondiente al
dominio C2 se realizaron esencialmente según lo descrito en
publicaciones anteriores (Fijnvandraat y otros. 1998. Blood 91:
2347-2352). El anticuerpo monoclonal 9E10 se enlazó
de forma covalente a sefarosa 4B activada con CNBr, y esta matriz
se utilizó para unir el scFv-EL14. Se detectó la
unión específica del scFv-EL14 al dominio C2 marcado
metabólicamente y esto confirma la especificidad por C2 de este
fragmento de anticuerpo recombinante. En este ejemplo, se han dado a
conocer procedimientos para caracterizar anticuerpo recombinantes
con especificidad por el dominio C2. En los ejemplos 8 y 9,
describimos la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos de los
fragmentos de anticuerpos recombinantes que se unen específicamente
al dominio A2- y A3-C1 del factor VIII. Un técnico
en la materia podrá adaptar fácilmente los procedimientos descritos
en este ejemplo de forma que permitan caracterizar los anticuerpos
recombinantes dirigidos contra A2, A3-C1 u otro
epítopo del factor VIII.
Ejemplo
7
En el ejemplo anterior, hemos mostrado que
scFv-EL14 y scFv-IT2 se unen a la
cadena ligera del factor VIII para competir por la unión con el
anticuerpo monoclonal murino inhibitorio CLB-CAg
117. Estas observaciones sugieren que el epítopo tanto de
scFv-EL14 como de scFv-IT2 se solapa
con el de CLB-CAg 117. Se espera que, al igual que
CLB-CAg 117, scFv-EL14 y
scFv-IT2 inhiban la actividad biológica del factor
VIII. Se evaluó la capacidad de inhibición de cantidades crecientes
de scFv's purificados mediante el ensayo Bethesda.
Sorprendentemente, la adición de hasta 170 \mug/ml de scFv no
tuvo como resultado la inhibición del factor VIII, según las
mediciones realizadas en el ensayo Bethesda. Por el contrario,
CLB-CAg 117 inhibió rápidamente el factor VIII,
según las determinaciones realizadas con el mismo ensayo.
Aparentemente, la unión de scFv-EL 14 y
scFv-IT2 al factor VIII no interfiere con la
actividad biológica del factor VIII. Este descubrimiento nos llevó a
investigar la capacidad tanto de scFv-EL14 como de
scFv-IT2 para impedir la inhibición causada por
CLBCAg 117. El anticuerpo monoclonal CLB-CAg 117 se
diluyó hasta alcanzar una actividad inhibidora final de 2 UB/ml.
Este valor corresponde a una actividad residual del factor VIII del
25% en el ensayo Bethesda. A continuación, se añadieron
concentraciones crecientes de scFv-EL14 y de
scFv-IT2. De forma sorprendente, tanto
scFv-EL 14 como scFv-IT2 lograron
impedir la actividad inhibidora del factor VIII propia de
CLB-CAg 117 (figura 7). ScFv-EL14
(panel A) resultó ser más eficaz que scFv-IT2
(panel B) al ahora de neutralizar la actividad inhibidora de
CLB-CAg 117. Tanto scFv-EL14 como
scFv-IT2 no fueron capaces de neutralizar la
actividad inhibidora del anticuerpo monoclonal
CLB-CAg A, dirigido contra los residuos de
aminoácidos Glu^{1811}-Lys^{1818} de la cadena
ligera del factor VIII (Lenting y otros. 1996. J. Biol. Chem. 271:
1935-1940). Estos resultados muestran, por primera
vez, que los fragmentos de anticuerpo con especificidad por el
factor VIII se pueden utilizar para interferir con la actividad de
los inhibidores del factor VIII. La administración de estos
fragmentos de anticuerpo resultará beneficiosa en el tratamiento de
pacientes que presenten anticuerpos inhibidores dirigidos contra el
factor VIII. En este ejemplo, se da a conocer la actividad
biológica de los fragmentos de anticuerpo con especificidad por C2.
En los ejemplos 8 y 9, se da a conocer la secuencia de nucleótidos y
de aminoácidos de los fragmentos de anticuerpos recombinantes que
se unen al dominio A2- y A3-C1 del factor VIII. Un
técnico en la materia podrá adaptar fácilmente los procedimientos
descritos en este y en el ejemplo anterior, de forma que permitan
determinar la capacidad de fragmentos de anticuerpos recombinantes
dirigidos contra el dominio A2, A3-C1 para
neutralizar a los inhibidores del factor VIII. De forma similar a
lo descrito en este ejemplo, es posible evaluar la capacidad de
neutralización de los inhibidores del factor VIII mostrada por los
fragmentos de anticuerpos recombinantes que se unen a otras
regiones. De forma similar a lo descrito en este ejemplo para
scFv-EL14 y scFv-IT2, los fragmentos
de anticuerpo que se unen a A2, A3-C1 y a otros
dominios del factor VIII se pueden utilizar en el tratamiento de
pacientes que presenten inhibidores del factor VIII.
Ejemplo
8
(No forma parte de la presente
invención, según las
reivindicaciones)
Estudios previos han indicado que el plasma de
un número importante de pacientes que presentan inhibidores
contiene anticuerpos contra el factor VIII que se unen
específicamente a los dominios A3-C1 del factor VIII
(Fijnvandraat y otros. 1998. Blood 91: 2347-2352:
Zhong y otros. 1998. Blood 92: 136-142). En el
presente documento, hemos utilizado la tecnología de visualización
de fagos para aislar los anticuerpos contra el factor VIII del
repertorio total de inmunoglobulina de un paciente con hemofilia A
que presente un inhibidor. Previamente, habíamos mostrado que en el
plasma de este paciente existen anticuerpos contra el factor VIII
dirigidos contra la cadena ligera del factor VIII. La mayor parte
de los anticuerpos contra el factor VIII de este paciente están
dirigidos contra el dominio A3-C1, mientras que una
pequeña parte de los anticuerpos contra el factor VIII reaccionan
con el dominio C2 (Fijnvandraat y otros. 1998. Blood 91:
2347-2352). La mayor parte de los anticuerpos
contra el factor VIII fueron de la subclase Ig4. Se construyó una
colección específica de IgG4 utilizando linfocitos de sangre
periférica del paciente como material de partida. Se obtuvo una
colección formada por 1,9 x 10^{6} clones independientes
siguiendo los procedimientos descritos en el ejemplo 2. La
selección del fago recombinante que se une específicamente al factor
VIII se realizó básicamente según lo descrito en el ejemplo 3.
Se recubrieron micropocillos durante toda la
noche a 4ºC con 5 \mug/ml del anticuerpo monoclonal murino
CLB-CAg 117 específico contra la cadena ligera del
factor VIII, que se diluyó en NaHCO_{3} 50 mM (pH 9,5). El
anticuerpo monoclonal CLB-CAg 117 se dirige contra
el dominio C2 del factor VIII. La utilización de
CLB-CAg 117 en el protocolo de selección puede
tener como resultado la eliminación de los fagos recombinantes que
expresan los fragmentos de inmunoglobulina dirigidos contra el
dominio C2 del factor VIII. Se prepararon fagos recombinantes que
expresan el repertorio de inmunoglobulina específico de IgG4 según
lo descrito en el ejemplo 3. Los fagos recombinantes se incubaron
inicialmente en micropocillos que contenían CLB-CAg
117 inmovilizado durante 2 horas en TBS enriquecido con 3% de HSA y
0,5% de Tween-20. La solución del fago se retiró y
se transfirió a un segundo micropocillo (también recubierto con
CLB-CAg 117) que se había preincubado con 1
\mug/ml de la cadena ligera del factor VIII. Se dejó que los
fagos se unieran a la cadena ligera del factor VIII inmovilizada
durante 2 horas a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron
intensamente, según lo descrito en el ejemplo 3, y el fago unido se
eluyó con trietilamina 100 mM (pH 12). El fago eluido se neutralizó
mediante la adición de Tris-HCl 1 M pH 7,4 y la
solución resultante se utilizó para infectar células E. coli
TG1, según lo descrito en el ejemplo 3.
De forma alternativa, el factor VIII purificado
(5 \mug/ml en NaHCO_{3} 50 mM (pH 9,6)) se inmovilizó en
inmunotubos (Nunc, Life Technologies, Breda, Países Bajos). En
primer lugar, los fagos recombinantes diluidos en TBS enriquecido
con un 3% de HSA se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente
en inmunotubos no recubiertos. A continuación, se retiró 1 ml de
solución de fago y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente
en inmunotubos recubiertos con el factor VIII. Tras un lavado
intenso (20 veces con TBS/0,1% de Tween-20 y 20
veces con TBS), el fago unido se eluyó con trietilamina 100 mM (pH
12) y se procesó según lo descrito anteriormente.
La segunda, tercera y cuarta rondas de cribado
se realizaron siguiendo el protocolo de selección descrito
anteriormente. Tras la cuarta ronda de cribado, se recogieron 15
clones individuales y se analizó la unión del fago recombinante a
la cadena ligera del factor VIII y al dominio A3-C1.
La cadena ligera del factor VIII se purificó según lo descrito
anteriormente. Se preparó una construcción que expresó el dominio
A3-C1 recombinante, siguiendo básicamente el
procedimiento descrito en publicaciones anteriores (Sawamoto y
otros. 1998. Thrombosis and Haemostasis (Trombosis y hemostasia)
vol. 78, 62-68) y se expresó en células CHO. El
anticuerpo monoclonal murino CLB-CAg 12 no
inhibitorio, dirigido contra el epítopo del dominio
A3-C 1 del factor VIII, se inmovilizó en pocillos a
una concentración de 5 \mug/ml en NaHCO_{3} 50 mM (pH 9,5). Los
pocillos se bloquearon durante 1 hora en TBS enriquecido con 3% de
HSA. Posteriormente, los pocillos se incubaron con la cadena ligera
del factor VIII (1 \mug/ml) o con el dominio
A3-C1 recombinante (0,06 nM) en Tris HCl 50 mM (pH
7,4), NaCl 1 M, y 2% de HSA durante 2 horas a 37ºC. Se añadieron
cincuenta \mul de solución de fago y un volumen igual de TBS
enriquecido con 1% de Tween-20 y 6% de HSA a los
pocillos que contenían la cadena ligera del factor VIII o el
dominio A3-C1 inmovilizados. Para monitorizar la
unión específica del fago, los pocillos que no contenían la cadena
ligera del factor VIII o el dominio A3-C1 se
incubaron simultáneamente con la solución de fago. El fago se
incubó a temperatura ambiente durante 2 horas y se agitó a
intervalos regulares. Los pocillos se lavaron intensamente con TBS
enriquecido con 0,1% de Tween-20. La presencia del
fago unido se monitorizó según lo descrito en el ejemplo 3. Los
resultados del análisis se muestran en la figura 8. En el panel A,
se representan 15 clones seleccionados en inmunotubos que contenían
el factor VIII. De los 15 clones analizados, 1 clon (clon 20) no
reaccionó con la cadena ligera del factor VIII ni con el dominio
A3-C1 recombinante, lo que sugiere que este clon no
codifica para un fragmento de anticuerpo con especificidad por el
dominio A3-C1 del factor VIII. Tres clones (clones
17, 23 y 24) reaccionaron con la cadena ligera del factor VIII, pero
no reaccionaron con el dominio A3-C1 recombinante.
Aparentemente, epítopo de estos fragmentos de anticuerpos
recombinantes se localiza en el dominio C2 del factor VIII. Los 11
clones restantes reaccionan tanto con la cadena ligera del factor
VIII como con el dominio A3-C1 recombinante. En el
panel B, se representan 15 clones seleccionados en micropocillos
que contenían CLB-CAg 117 y la cadena ligera del
factor VIII. Los clones 31-45 interaccionan con la
cadena ligera del factor VIII (barras negras) y con el dominio
A3-C1 recombinante (barras en tramas). Este
análisis muestra que el fago derivado de los clones
31-45 codifica para fragmentos de anticuerpos que
se unen específicamente al dominio A3-C1 del factor
VIII.
Estos resultados muestran que el protocolo
descrito anteriormente resulta adecuado para la selección de
fragmentos de anticuerpos recombinantes que se unen específicamente
al dominio A3-C1 del factor VIII. Utilizando los
procedimientos dados a conocer en este ejemplo, es posible aislar
fagos recombinantes que codifiquen para fragmentos de anticuerpos
específicos para el dominio A3-C1 de otros pacientes
que presenten inhibidores del factor VIII.
La secuencia de nucleótidos de los fragmentos de
cadena pesada variables de 26 clones que reaccionaron
específicamente con el dominio A3-C1 recombinante
se determinó esencialmente según lo descrito en el ejemplo 4. La
secuencia obtenida se alineó con secuencias de la cadena pesada
incluidas en la base de datos "V BASE" del MRC Centre of
Protein Engineering (Cambridge, Reino Unido). Los 26 clones
analizados estaban codificados por cuatro segmentos de genes VH
distintos DP15, DP31 y DP49 y DP77. La secuencia de aminoácidos de
los fragmentos de cadena pesada variables de los clones B38, B18,
B35 y B04 se recoge en la figura 9A. En las figuras
9B-E se presenta la secuencia de nucleótidos de
estos cuatro clones.
Ejemplo
9
(No forma parte de la presente
invención, según las
reivindicaciones)
Se ha localizado en el dominio A2 del factor
VIII una región inmunodominante que constituye un sitio de unión
para los inhibidores del factor VIII (Healey y otros. 1995, J. Biol.
Chem. 270: 14505-14509). Hemos caracterizado los
anticuerpos contra el factor VIII presentes en el plasma de un
paciente con hemofilia A leve y un inhibidor, esencialmente según
lo descrito en el ejemplo 1. Los fragmentos de factor VIII
recombinantes, correspondientes al dominio A2,
A3-C1-C2 y C2 del factor VIII, se
marcaron metabólicamente con [^{35}S]-metionina y
se utilizaron para la detección de anticuerpos contra el factor
VIII presentes en el plasma del paciente. Se observó reactividad
con los dominios A2 y A3-C1-C2
marcados metabólicamente, mientras que se observó únicamente una
reactividad débil con el dominio C2 marcado metabólicamente (datos
no mostrados). Para determinar la capacidad inhibidora tanto de los
anticuerpos contra A2 como los anticuerpos contra
A3-C1-C2, realizamos experimentos de
neutralización. El inhibidor del factor VIII se diluyó hasta
alcanzar un valor final de 2 UB/ml y, posteriormente, se añadieron
cantidades crecientes de A2 o
A3-C1-C2 recombinante. La adición
del dominio A2 recombinante tuvo como resultado la neutralización
prácticamente completa de los inhibidores del factor VIII presentes
en el plasma del paciente. La adición del
A3-C1-C2 recombinante sólo
neutralizó el inhibidor del factor VIII en cierto grado (<10%).
Estos resultados muestran que la mayor parte de los inhibidores del
factor VIII están dirigidos contra el dominio A2 del factor VIII.
Hemos evaluado una subclase de los anticuerpos contra el factor VIII
mediante un análisis enzimático de adsorción. Ambos anticuerpos
contra A2 y contra A3-C1-C2
comprendieron forma predominante la subclase IgG4.
Se utilizaron los linfocitos de sangre
periférica del paciente para construir una colección específica de
IgG4, según lo descrito en el ejemplo 2. Se obtuvo una colección
formada por 1.9 x 10^{6} clones. Se preparó un fago recombinantes
que expresa el repertorio de inmunoglobulina específico de IgG4 del
paciente según lo descrito en el ejemplo 3. La selección de los
fagos con capacidad de unión al dominio A2 del factor VIII se
realizó siguiendo uno de los procedimientos descritos a
continuación:
1. La cadena pesada del factor VIII purificada
(10 \mug/ml) se inmovilizó en inmunotubos (Nunc, Life
Technologies, Breda, Países Bajos) en NaHCO_{3} 50 mM (pH 9,6).
En primer lugar, los fagos recombinantes diluidos en TBS
enriquecido con un 3% de HSA se incubaron durante 2 horas a
temperatura ambiente en inmunotubos no recubiertos. El fago no
unido se transfirió a un inmunotubo recubierto con el factor VIII.
Tras un lavado intenso (20 veces con TBS/0,1%
Tween-20 y 20 veces con TBS), el fago unido se eluyó
con trietilamina 100 mM (pH 12). El fago eluido se neutralizó
mediante la adición de Tris-HCl 1 M pH 7,4 y se
utilizó para infectar células E. coli TG1, según lo descrito
en el ejemplo 3.
2. De forma alternativa, el anticuerpo
monoclonal murino CLB-CAg 9, dirigido contra la
secuencia de aminoácidos 713-740 del dominio A2 del
factor VIII, se inmovilizó en pocillos a una concentración de 5
\mug/ml en NaHCO_{3} 50 mM (pH 9,6). A continuación, se añadió
la cadena pesada del factor VIII purificada (1 \mug/ml) y se dejó
que se uniese a CLB-CAg 9. Inicialmente, el fago
recombinante diluido en TBS con 3% de HSA y 0,5% de Tween 20 se
incubó en micropocillos que contenían únicamente
CLB-CAg 9 inmovilizado. Tras 2 horas, el fago no
unido se transfirió a un micropocillo que contenía la cadena pesada
del factor VIII inmovilizada. Se dejó que el fago se uniera a la
cadena pesada del factor VIII durante 2 horas a temperatura
ambiente. Los pocillos se lavaron intensamente (véase la
explicación anteriormente) y, finalmente, el fago unido se eluyó con
trietilamina 100 mM (pH 12) y se procesó según lo descrito
anteriormente.
Tras cuatro rondas de selección, se recogieron
los clones individuales y se evaluó la unión del fago recombinante
a la cadena pesada del factor VIII mediante un enzimoinmunoanálisis
de adsorción. El anticuerpo monoclonal ESH5 (American Diagnostica,
Greenwich, CT, EE.UU.) se inmovilizó en pocillos a una concentración
de 5 \mug/ml en NaHCO_{3} 50 mM (pH 9,6). A continuación, se
añadió la cadena pesada del factor VIII (1 \mug/ml) y se incubó
durante 2 horas a 37ºC. Posteriormente, se añadió el fago
recombinante, diluido 1 a 1 en Tris-HCl 50 mM pH
7,4, NaCl 1 mM y 2% de HSA y se incubó durante 2 horas a temperatura
ambiente. La cantidad del fago recombinante unido se determinó
según lo descrito en el ejemplo 3. Los resultados del análisis se
incluyen en la figura 10. Se analizaron 20 clones que se habían
seleccionado en pocillos en los que se había inmovilizado la cadena
pesada del factor VIII mediante CLB-CAg 9. Once de
los 20 clones se unieron específicamente a la cadena pesada del
factor VIII (figura 10A). Asimismo, se analizaron clones que se
seleccionaron mediante la cadena pesada del factor VIII en
inmunotubos. Quince de los 20 clones se unieron específicamente a la
cadena pesada del factor VIII (figura 10B). Estos resultados
muestran que el protocolo descrito anteriormente permite aislar los
anticuerpos contra el factor VIII dirigidos contra la cadena pesada
(A1-A2) del factor VIII. Utilizando los
procedimientos dados a conocer en este ejemplo, es posible aislar
los anticuerpos contra el factor VIII del repertorio de otros
pacientes que presenten inhibidores del factor VIII dirigidos contra
el dominio A2.
La secuencia de nucleótidos de los fragmentos de
cadena pesada variables de 26 clones que reaccionaron
específicamente con la cadena pesada del factor VIII se determinó
esencialmente según lo descrito en el ejemplo 4. La secuencia
obtenida se alineó con secuencias de la cadena pesada incluidas en
la base de datos "V BASE" del MRC Centre of Protein
Engineering (Cambridge, Reino Unido). Los 26 clones analizados
estaban codificados por dos segmentos de genes VH distintos DP10 y
DP47 (figura 11A). En las figuras 11B y C se incluyen la secuencia
de nucleótidos de la cadena pesada variable de estos clones.
Ejemplo
10
En el ejemplo 7, hemos mostrado que
scFv-EL14 y scFv-IT2 neutralizan la
actividad inhibidora del anticuerpo monoclonal murino
CLB-CAg 117. Hemos investigado si
scFv-EL14 también es capaz de neutralizar los
inhibidores del factor VIII presentes en el plasma de los pacientes
con hemofilia A. Inicialmente, evaluamos el plasma del paciente con
hemofilia adquirida del que se habían derivado los fragmentos de
anticuerpos recombinantes. Según lo descrito en el ejemplo 1, el
dominio C2 fue capaz de neutralizar el 20% del inhibidor del factor
VIII presente en el plasma del paciente (tabla III). El efecto de
scFv-EL14 se evaluó mediante un ensayo similar. Se
diluyó el plasma hasta un volumen final de 2 UB/ml y se añadieron
cantidades crecientes de scFv-EL14.
ScFv-EL14 fue capaz de neutralizar aproximadamente
el 20% de la actividad total del inhibidor del factor VIII presente
en el plasma del paciente. Estos resultados sugieren que el scFv
dirigido contra el dominio C2 previene la unión de los anticuerpos
inhibidores del factor VIII que se unen al dominio C2 del factor
VIII.
Seguidamente, evaluamos dos muestras de plasma
procedentes de pacientes con hemofilia A congénita e inhibidores
del factor VIII. La contribución relativa del dominio C2 a la
cantidad total del inhibidor del factor VIII para ambas muestras se
encontró comprendida entre el 40% y el 90%. Los experimentos de
neutralización indican que la adición de concentraciones crecientes
de scFv-EL14 conducen a una reducción significativa
de los niveles de inhibidor del factor VIII presentes en el plasma
de estos dos pacientes con hemofilia A congénita. Estos resultados
confirman que scFv-EL14 reduce la unión de los
inhibidores del factor VIII humano al dominio C2. Nuestros
descubrimientos revelan que scFv-EL14 protege los
sitios antigénicos que están presentes en el dominio C2 del factor
VIII. Esta propiedad del scFv-EL14 se puede utilizar
para evitar la unión de los inhibidores del factor VIII al dominio
C2 del factor VIII administrado a pacientes con hemofilia A que
presentan un inhibidor. Se ha determinado firmemente que los
inhibidores del factor VIII reconocen con frecuencia varios epítopos
que se han localizado en el dominio A2, A3 y C2 del factor VIII. En
este ejemplo, se describe la actividad neutralizante ejercida por
el scFv-EL14 específico del dominio C2 sobre la
actividad biológica de los inhibidores del factor VIII.
En los ejemplos 8 y 9, hemos dado a conocer
procedimientos para la obtención de anticuerpos recombinantes que
reaccionan específicamente con el dominio A3-C1 y la
cadena pesada (A1-A2) del factor VIII. En este
ejemplo, hemos mostrado que los anticuerpos recombinantes dirigidos
contra el dominio C2 del factor VIII son capaces de proteger los
sitios antigénicos del factor VIII. De igual forma, se puede evaluar
la capacidad de los anticuerpos contra A3-C1 y de
los anticuerpos contra A2 descritos en los ejemplos 8 y 9 para
competir con los inhibidores del factor VIII por la unión al factor
VIII. Los anticuerpos contra A3-C1 y contra
A1-A2 dados a conocer en la presente invención
también se pueden utilizar para el tratamiento de pacientes que
presenten inhibidores que reaccionen con el dominio
A3-C1 y/o con el dominio A1-A2.
Tabla I: Secuencias de nucleótidos de clones que expresan los
anticuerpos recombinantes con especificidad por la cadena ligera del
factor VIII. Basándose en la secuencia de nucleótidos, 55 de los 60
clones analizados podrían ordenarse según se muestra a continuación.
En la primera columna, los clones con la misma secuencia de
nucleótidos se ordenan en cuatro grupos. El número de clones
correspondientes este grupo se indica entre paréntesis. Los clones
EL5, EL25 y IT2 están relacionados, según se indica en la figura
4B. En la segunda columna, se muestra la familia de cadena pesada a
la que pertenecen estos clones. Todos los clones analizados
pertenecen a la familia VH1. En la tercera columna, se muestra el
segmento de estirpe bacteriana. Los clones EL5, E125 y IT2
pertenecen al segmento de estirpe bacteriana DP-14,
mientras que el clon EL14 pertenece a la secuencia de estirpe
bacteriana DP-10. En la cuarta columna, se muestra
el número de mutaciones de los distintos clones. El primer número
corresponde al número de mutaciones de nucleótidos, mientras que el
segundo corresponde al número de cambios de aminoácidos. La
secuencia se compararon con las secuencias de nucleótidos y de
aminoácidos de los segmentos de estirpe bacteriana indicados en la
tabla.
Claims (12)
1. Polipéptido, que comprende una cadena pesada
que comprende la secuencia de EL-14 o
IT-2 representadas en la figura 4A, siendo dicho
polipéptido capaz de neutralizar la actividad inhibidora de los
anticuerpos inhibidores del factor VIII, sin interferir con la
actividad procoagulante del factor VIII.
2. Polipéptido, según la reivindicación 1, en el
que dicho polipéptido es un fragmento Fv de cadena sencilla.
3. Polipéptido, según la reivindicación 1 ó 2,
en el que dicho polipéptido es un anticuerpo.
4. Polipéptido, según cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, en el que dicho polipéptido se
une específicamente a la cadena ligera del factor VIII.
5. Polipéptido, según la reivindicación 4, en el
que dicho polipéptido se une específicamente a una región de la
cadena ligera del factor VIII consistente en el dominio A3, en el
dominio C1 y en el dominio C2 del factor VIII.
6. Composición farmacéutica para el tratamiento
de la inhibición del factor VIII en un humano, que comprende un
polipéptido, según cualquiera de las reivindicaciones
1-5, junto con un excipiente farmacéuticamente
aceptable.
7. Composición farmacéutica, según la
reivindicación 6, que además contiene factor VIII.
8. Utilización de un polipéptido, según
cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la
fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento de
la inhibición del factor VIII en un humano.
9. Polinucleótido en forma sustancialmente
aislada, que codifica para un polipéptido, según cualquiera de las
reivindicaciones 1-5.
10. Procedimiento para la producción de un
polipéptido recombinante, que comprende la preparación de un
polinucleótido que codifica para dicho polipéptido, la preparación
de un vector recombinante que contiene dicho polinucleótido unido
de forma funcional a una secuencia de control capaz de promover la
expresión del polinucleótido por parte de una célula huésped, la
transformación de una célula huésped mediante dicho vector
recombinante, el cultivo de dicha célula huésped en condiciones que
promuevan la expresión del polinucleótido, en el que dicho
polinucleótido codifica para un polipéptido, según una de las
reivindicaciones 1-5.
11. Procedimiento, según la reivindicación 10,
que además comprende el aislamiento del polipéptido producido.
12. Procedimiento para obtener un fragmento de
anticuerpo recombinante específico contra el factor VIII adecuado
para su utilización en el tratamiento de pacientes que presenten
anticuerpos inhibidores dirigidos contra el factor VIII,
comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
a) obtención de un fragmento de anticuerpo
específico contra el factor VIII dirigido contra el factor VIII;
b) selección de un fragmento de anticuerpo capaz
de competir con la unión al factor VIII de un anticuerpo monoclonal
inhibidor del factor VIII; y
c) selección de un fragmento de anticuerpo cuya
unión al factor VIII no interfiera con la actividad procoagulante
del factor VIII.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP98201543 | 1998-05-08 | ||
| EP98201543 | 1998-05-08 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2313783T3 true ES2313783T3 (es) | 2009-03-01 |
Family
ID=8233706
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES99921292T Expired - Lifetime ES2313783T3 (es) | 1998-05-08 | 1999-05-07 | Inhibidor para el diagnostico y el tratamiento de pacientes con hemofilia a. |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7364735B1 (es) |
| EP (1) | EP1095143B1 (es) |
| JP (1) | JP2002514422A (es) |
| AT (1) | ATE405649T1 (es) |
| AU (1) | AU760678B2 (es) |
| CA (1) | CA2327587C (es) |
| CY (1) | CY1108568T1 (es) |
| DE (1) | DE69939379D1 (es) |
| DK (1) | DK1095143T3 (es) |
| ES (1) | ES2313783T3 (es) |
| PT (1) | PT1095143E (es) |
| WO (1) | WO1999058680A2 (es) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6197526B1 (en) * | 1999-01-04 | 2001-03-06 | Dyax Corp. | Polypeptides for binding human factor VIII and fragments of human factor VIII |
| US7112438B2 (en) | 1999-01-04 | 2006-09-26 | Dyax Corp. | Binding molecules for human factor VIII and factor VIII-like proteins |
| US7829085B2 (en) | 1999-07-14 | 2010-11-09 | Life Sciences Research Partners Vzw | Methods of treating hemostasis disorders using antibodies binding the C1 domain of factor VIII |
| CA2424794A1 (en) * | 2000-10-13 | 2002-04-18 | Baxter Aktiengesellschaft | Xenogeneic antibody containing plasma reagents and associated methods |
| DK1497330T3 (da) * | 2002-04-29 | 2010-06-14 | Sanquin Bloedvoorziening | Antagonister af faktor-VIII-interaktion med lav-densitets- lipoproteinreceptor-relateret protein |
| EP1388544A1 (en) * | 2002-07-31 | 2004-02-11 | D. Collen Research Foundation vzw | Anti-idiotypic antibodies against factor VIII inhibitor and uses thereof |
| JP4934796B2 (ja) | 2003-08-14 | 2012-05-16 | トロンボジェニクス・ナムローゼ・フエンノートシャップ | 可変抗体 |
| FR2889534B1 (fr) * | 2005-08-04 | 2012-11-02 | Lab Francais Du Fractionnement | Anticorps anti-idiotypique neutralisant l'activite inhibitrice d'un anticorps inhibiteur du facteur viii |
| KR101989779B1 (ko) * | 2016-12-14 | 2019-06-17 | (주) 팬젠 | 항-혈액응고 제viii인자 항체 및 그 용도 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4731245A (en) * | 1983-12-29 | 1988-03-15 | Kitasato Kenkyusho | Vaccine, antigen and antibody for treating microorganisms of the MCLS-type streptococcus sanguis |
| ATE66249T1 (de) * | 1984-01-12 | 1991-08-15 | Chiron Corp | Hybridom-zellinien und monoklonale antikoerper gegen faktor-viii-c. |
| US5543145A (en) * | 1984-09-17 | 1996-08-06 | Baxter International, Inc. | Pharmaceutical composition and method for the suppression of factor VIII inhibitor production |
| US5149637A (en) * | 1987-04-06 | 1992-09-22 | Scripps Clinic & Research Foundation | Recombinant Factor VIIIC fragments |
| US5859205A (en) * | 1989-12-21 | 1999-01-12 | Celltech Limited | Humanised antibodies |
| DK0597960T3 (da) * | 1991-08-10 | 1999-09-13 | Medical Res Council | Behandling af cellepopulationer |
| AU668374B2 (en) | 1991-12-10 | 1996-05-02 | Dana-Farber Cancer Institute | Reactive neutralizing human anti-GP120 recombinant antibody, DNA coding the same and use thereof |
| WO1995008336A1 (en) * | 1993-09-22 | 1995-03-30 | Nichols Institute Diagnostics | Graves' ophthalmopathy associated antibodies, graves' ophthalmopathy orbital antigen, and methods of use thereof |
| EP0659766A1 (en) | 1993-11-23 | 1995-06-28 | Schering-Plough | Human monoclonal antibodies against human cytokines and methods of making and using such antibodies |
| WO1996005860A1 (en) * | 1994-08-19 | 1996-02-29 | Novo Nordisk A/S | A method of treating a patient with a biologically active compound |
| US6258529B1 (en) * | 1994-12-01 | 2001-07-10 | Oravax, Inc. | PCR amplification of rearranged genomic variable regions of immunoglobulin genes |
| MA24512A1 (fr) * | 1996-01-17 | 1998-12-31 | Univ Vermont And State Agrienl | Procede pour la preparation d'agents anticoagulants utiles dans le traitement de la thrombose |
| US5916771A (en) * | 1996-10-11 | 1999-06-29 | Abgenix, Inc. | Production of a multimeric protein by cell fusion method |
-
1999
- 1999-05-07 US US09/674,752 patent/US7364735B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-05-07 DK DK99921292T patent/DK1095143T3/da active
- 1999-05-07 EP EP99921292A patent/EP1095143B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-05-07 AT AT99921292T patent/ATE405649T1/de active
- 1999-05-07 CA CA2327587A patent/CA2327587C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-05-07 WO PCT/NL1999/000285 patent/WO1999058680A2/en active IP Right Grant
- 1999-05-07 ES ES99921292T patent/ES2313783T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-05-07 AU AU38538/99A patent/AU760678B2/en not_active Ceased
- 1999-05-07 PT PT99921292T patent/PT1095143E/pt unknown
- 1999-05-07 JP JP2000548471A patent/JP2002514422A/ja active Pending
- 1999-05-07 DE DE69939379T patent/DE69939379D1/de not_active Expired - Lifetime
-
2008
- 2008-11-17 CY CY20081101315T patent/CY1108568T1/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE405649T1 (de) | 2008-09-15 |
| DK1095143T3 (da) | 2009-01-05 |
| WO1999058680A2 (en) | 1999-11-18 |
| US7364735B1 (en) | 2008-04-29 |
| DE69939379D1 (de) | 2008-10-02 |
| AU3853899A (en) | 1999-11-29 |
| CA2327587A1 (en) | 1999-11-18 |
| AU760678B2 (en) | 2003-05-22 |
| EP1095143A2 (en) | 2001-05-02 |
| WO1999058680A3 (en) | 2001-02-22 |
| PT1095143E (pt) | 2008-11-28 |
| CA2327587C (en) | 2011-09-13 |
| JP2002514422A (ja) | 2002-05-21 |
| EP1095143B1 (en) | 2008-08-20 |
| CY1108568T1 (el) | 2014-04-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2288873T3 (es) | Anticuerpos de activacion del factor ix/factor ixa. | |
| ES2323056T3 (es) | Anticuerpos dirigidos contra factor tisular como anticoagulantes. | |
| AU2009335643B2 (en) | Anti-fXI antibodies and methods of use | |
| ES2279646T3 (es) | Anticuerpos de integrina monoclonales humanizados. | |
| CN104105708A (zh) | PDGF受体β结合多肽 | |
| KR20200121926A (ko) | 혈장 칼리크레인 결합 단백질 | |
| JP2009528285A (ja) | ファクターｖｉｉｉのｃ１ドメインに対する阻害抗体の阻害活性を中性化する抗イデオタイプ抗体 | |
| CN110325211A (zh) | 采用抗因子XI/XIa抗体治疗的方法 | |
| JP2010104374A (ja) | 粥状動脈硬化の治療用のペプチドベースの受動免疫療法 | |
| ES2313783T3 (es) | Inhibidor para el diagnostico y el tratamiento de pacientes con hemofilia a. | |
| JP2018058871A (ja) | 黄色ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）疾患の間にコアグラーゼ活性を中和する抗体に関連した組成物および方法 | |
| CN110325550A (zh) | 因子xi抗体和使用方法 | |
| US7858089B2 (en) | Antibodies binding to the A2 domain of FVIII and inhibiting coagulation activity | |
| ES2377128T3 (es) | Anticuerpo antiidiotípico que neutraliza la actividad inhibidora de un anticuerpo inhibidor del factor VIII | |
| CN104812402A (zh) | 针对活化蛋白C (aPC)的单克隆抗体 | |
| JP2001502895A (ja) | アルファ―２―抗プラスミンに対するキメラ、ヒト化および一本鎖抗体 | |
| KR100925348B1 (ko) | 인간형 항-혈액 응고 인자 ⅷ 항체 | |
| CA2494698C (en) | Anti-idiotypic antibodies against factor viii inhibitor and uses thereof | |
| CN109651509A (zh) | 抗cd20的人源化单抗及其制剂 |