ES2288873T3

ES2288873T3 - Anticuerpos de activacion del factor ix/factor ixa.

Info

Publication number: ES2288873T3
Application number: ES00967666T
Authority: ES
Inventors: Friedrich Scheiflinger; Randolf Kerschbaumer; Falko-Guenter Falkner; Friedrich Dorner; Hans Peter Schwarz
Original assignee: Baxter AG
Current assignee: Baxter AG
Priority date: 1999-09-14
Filing date: 2000-09-13
Publication date: 2008-02-01
Anticipated expiration: 2020-09-13
Also published as: US20050196397A1; JP2003509049A; CZ2002935A3; SK3662002A3; RU2002109586A; ATA157699A; AT411997B; EP1220923A2; JP2006111638A; WO2001019992A3; DE60035356D1; HUP0203750A3; ATE365799T1; PL354976A1; EP1220923B1; JP4313531B2; US7279161B2; DE60035356T2; HUP0203750A2; WO2001019992A2

Abstract

Anticuerpo frente al factor IX/factor IXa que tiene una actividad tipo cofactor del factor VIIIa y que incrementa la actividad procoagulante del factor FIXa.

Description

Anticuerpos de activación del factor IX/factor IXa.

Los coágulos sanguíneos (trombos) se forman por una serie de activaciones cimógenas conocidas, tales como la cascada de coagulación. Durante el curso de dicha cascada de coagulación, la forma activada de cada uno de estos zimógenos (conocidos como factores) cataliza la activación del siguiente. Los trombos son depósitos de componentes sanguíneos sobre la superficie de la pared de un vaso sanguíneo y consisten principalmente en la agregación de plaquetas sanguíneas y de fibrina insoluble reticulada. La formación de fibrina se lleva a cabo mediante la trombina, por proteolisis limitada del fibrinógeno. La trombina es el producto final de la cascada de coagulación (K.G. Mann, Blood, 1990, Vol. 76, pp.: 1-16).

La activación del factor X por el complejo del factor activado IX (FIXa) y el factor activado VIII (FVIIIa) es un paso clave en la coagulación. La ausencia de los componentes de este complejo o una alteración de sus funciones se asocia a un trastorno de la coagulación sanguínea conocido como hemofilia (J.E. Sadler & E. W. Davie: Hemophilia A, Hemophilia B and Von Willebrand disease, G. Stamatoyannopoulos y col. (Eds.): The molecular basis of blood diseases, Saunders Co., Filadelfia, 1987, pp.: 576-602). La hemofilia A implica una ausencia (funcional) de actividad del factor VIII, mientras que la hemofilia B se caracteriza por una ausencia de actividad del factor IX. En la actualidad, el tratamiento de la hemofilia A se lleva a cabo con terapias de sustitución, administrando concentrados de factor VIII. No obstante, aproximadamente entre el 20-30% de los enfermos de hemofilia A desarrolla inhibidores del factor VIII (es decir, anticuerpos contra el factor VIII), los cuales inhiben el efecto de los preparados de factor VIII administrados. El tratamiento de enfermos con inhibidores del factor VIII es muy difícil y conlleva bastantes riesgos, por lo que hasta el momento sólo existe un número muy limitado de tratamientos para estos enfermos.

En el caso de enfermos con un nivel bajo de inhibidores de FVIII, es posible, aunque caro, administrarles dosis elevadas de factor VIII y de este modo neutralizar los anticuerpos contra el factor VIII. Una cantidad de factor VIII superior a la necesaria para neutralizar los anticuerpos inhibidores tiene entonces una acción hemostática. En muchos casos, se puede conseguir una desensibilización, con lo cual posteriormente se puede aplicar de nuevo un tratamiento estándar con factor VIII. No obstante, dichos tratamientos con dosis elevadas de factor VIII exigen grandes cantidades de factor VIII, son lentos y pueden conllevar graves reacciones anafilácticas. Opcionalmente, el tratamiento se puede realizar con moléculas de factor VIII porcino.

Otro método caro requiere eliminar los inhibidores del factor VIII mediante inmunoabsorción extracorpórea de las lectinas que se unen a las inmunoglobulinas (proteína A, proteína G) o al factor VIII inmovilizado. Debido a que durante este tratamiento el enfermo tiene que estar conectado a una máquina de aféresis, dicho tratamiento también constituye una gran carga para el enfermo. Tampoco es posible tratar una hemorragia aguda de este modo.

En la actualidad, una posible terapia consiste en administrar concentrados de complejos de protrombina activada (CCPAs), tales como FEIBA® y AUTOPLEX®, que son apropiados para tratar hemorragias agudas incluso en pacientes que tienen un nivel de inhibidor alto (DE 31 27 318).

En el sistema intravascular de coagulación sanguínea, el último paso es la activación del factor X. Esta reacción es estimulada por la unión del factor VIIIa al factor IXa y por la formación de un complejo-"tenasa", consistente en los factores IXa, VIIIa, X y fosfolípido. Sin la unión de FVIIIa, FIXa presenta una nula o sólo ligera actividad enzimática con respecto al FX. A lo largo de los últimos años se han caracterizado algunos posibles sitios de unión del factor VIIIa al factor IXa, demostrándose que los anticuerpos o péptidos que se unen a estas regiones inhiben la actividad de FIXa (Fay y col., J. Biol.. Chem., 1994, Vol. 269, pp.: 20522-20527, Lenting y col., J. Biol. Chem., 1996, Vol. 271, pp.: 1935-1940, Jorquera y col., Circulation, 1992, Vol. 86, Abstract 2725). También se ha logrado la inhibición de los factores de coagulación, tales como el factor IX, utilizando anticuerpos monoclonales, con el fin de prevenir la formación de trombos (WO 97/26010). El efecto opuesto, es decir el incremento de la activación del factor X mediada por el factor IXa, ha sido descrito por Liles D.K. y col. (Blood, 1997, Vol. 90, supl. 1, 2054) mediante la unión de un péptido de factor VIII (aminoácidos 698-712) al factor IX. Aun así, este efecto sólo se produce en ausencia de factor VIIIa, mientras que en presencia del factor VIIIa, la disociación del factor X mediada por el factor IXa/factor VIIIa es inhibida por este péptido.

Además, el documento WO 86/06101 describe una serie de proteínas que presentan propiedades procoagulantes.

En vista de los posibles riesgos y efectos secundarios que pueden darse durante el tratamiento de los enfermos de hemofilia, es necesario desarrollar una terapia que permita el tratamiento eficaz de los enfermos con inhibidor del FVIII. Por tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar un preparado para el tratamiento de trastornos de coagulación sanguínea, que implique ventajas especiales para los enfermos, con inhibidores del factor VIII. Según la presente invención, este objetivo se logra empleante anticuerpos contra el factor IX/factor IXa que tienen actividad cofactor-factor VIIIa y que conduzcan a un incremento de la actividad procoagulante del factor IXa. Sorprendentemente, la acción de estos anticuerpos de la invención activadores del factor IX/factor IXa no se ve negativamente afectada por la presencia de inhibidores, tales como los aquellos contra el factor VIII/factor VIIIa, sino que, en su lugar, en este caso también aumenta la actividad procoagulante del factor IXa.

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Otra ventaja de esta invención es que la administración del preparado según la invención permite la rápida coagulación de la sangre incluso en ausencia del factor VIII o del factor VIIIa, hasta incluso en caso de tratarse de enfermos con inhibidor FVIII. Sorprendentemente, estos agentes también son eficaces en presencia del factor VIIIa.

Por tanto, los anticuerpos según la presente invención tienen actividad de tipo cofactor-FVIII, que, en un ensayo de FVIII (por ejemplo un ensayo COATEST® o un test Immunochrom), después de 2 horas de incubación, presentan un índice de ruido de fondo con un valor de al menos 3. El cálculo de este índice se puede realizar, por ejemplo, conforme al esquema siguiente:

\frac{\text{Medida de anticuerpos (OD405) – valor blanco del reactivo}}{\text{Medida de IgG de ratón (OD405) – valor blanco del reactivo}}\geq 3,

después de dos horas de incubación.

Preferentemente, los anticuerpos según la invención tienen una vida media in vivo de al menos 5 días, en especial de al menos 10 días, aunque es particularmente preferente que la vida media sea de al menos 20 días.

Otro aspecto de la presente invención consiste en una preparación que comprende anticuerpos contra el factor IX/factor IXa y un excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico. Más aún, la preparación según la invención puede además comprender factor IX y/o factor IXa.

Otro aspecto de la invención consiste en la utilización de los anticuerpos para aumentar la actividad amidolítica del factor IXa.

Fig. 1: muestra los resultados de un screening de sobrenandantes de cultivos celulares de hibridoma para la actividad de tipo FVIII. Se analizaron los clones preseleccionados de los experimentos de fusión #193, #195 y #196 en un ensayo cromogénico.

Fig. 2: muestra los resultados de un screening de la actividad de tipo factor VIII mediada por IgG en sobrenadantes de un cultivo celular de hibridomas de una placa inicial.

Fig. 3: muestra la subclonación del clon 193/CO, concretamente los resultados de la primera ronda de clonación.

Fig. 4: comparación entre la actividad de tipo FVIII cromogénica y la reactividad medida por ELISA del factor IX en cultivos de hibridoma derivados del clon de partida 193/CO.

Fig. 5: muestra los resultados de la medida de la actividad cromogénica de algunos clones inciales y subclones.

Fig. 6A: muestra la actividad de tipo FVIII de los anticuerpos anti FIX/ FIXa 193/AD3 y 196/AF2 comparada con la actividad de FVIII humano, el tampón TBS y el medio de cultivo celular. Tras una fase de latencia, ambos anticuerpos dieron lugar a una disociación del sustrato cromogénico, como se puede apreciar por la cada vez mayor densidad óptica.

Fig. 6B: comparación entre la actividad cromogénica del factor VIII, 196/AF1, 198/AC1/1 e IgG-ratón.

Fig. 7A: comparación entre la cinética de obtención de factor Xa mediante el factor VIII y 196/AF2 con y sin la adición de un inhibidor específico de factor Xa.

Fig. 7B: comparación entre la cinética de obtención de factor Xa mediante el factor VIII, IgG-ratón y antifactor IX/IXa-anticuerpo 198/AM1 con y sin adición de un inhibidor específico del factor Xa Pefabloc Xa®.

Fig. 8A: medida de la dependencia de la actividad tipo factor VIII de antifactor IX/IXa-anticuerpo purificado 198/AC1/1 en presencia o ausencia de fosfolípidos, FIXa/ FX e iones calcio.

Fig. 8B: medida de la dependencia de la obtención de FXa mediante el anticuerpo anti-FIXa 196/AF1 en presencia de fosfolípidos, Ca^{2+} en FIXa/FX.

Fig. 8C: muestra la obtención de FXa mediante anticuerpos IgG de ratón no específicos.

Fig. 9: representación gráfica de los tiempos de coagulación de un plasma deficiente en factor VIII en un ensayo APTT utilizando varias concentraciones de antifactor IX/IXa-anticuerpo 193/AD3.

Fig. 10A: demuestra que en presencia del factor IXa, el anticuerpo 193/AD3 conduce a una disminución del tiempo de coagulación de un plasma deficitario en factor VIII.

Fig. 10B: muestra una reducción dosis-dependiente del tiempo de coagulación debida al anticuerpo 193/AD3 en presencia de inhibidores del factor IXa y del factor VIII.

Fig. 11: muestra la actividad cromogénica de los anticuerpos 198/A1, 198/B1 y 198/AP1 en presencia y ausencia de FIXa\beta humano.

Fig. 12: muestra las secuencias cebadoras para la amplificación de los genes de la cadena pesada variable del anticuerpo de ratón.

Fig. 13: muestra las secuencias cebadoras para la amplificación de los genes de la cadena ligera (kappa) variable del anticuerpo de ratón.

Fig. 14: muestra el ADN y la secuencia de proteínas derivadas de scFv a partir de la línea celular de hibridoma 193/AD3 (SEQ ID NOs 81 y 82).

Fig. 15: muestra el ADN y la secuencia de proteínas derivadas de scFv de la línea celular de hibridoma 193/K2 (SEQ ID NOs 83 y 84).

Fig. 16: muestra el ADN y la secuencia de proteínas derivadas de scFv de la línea celular de hibridoma 198/AB2 (subclon de 198/B1) (SEQ ID NOs 85 y 86).

Fig. 17: muestra el ADN y la secuencia de proteínas deducida de scFv derivada de la línea celular 198/A1 (SEQ ID NOs 87 y 88).

Fig. 18: demuestra la actividad de tipo FVIII cromogénica del péptido A1/3 en presencia de 2,9nM de FIXa humano. La versión desordenada del péptido A1/3, el péptido A1/5, no da lugar a ninguna generación de FXa.

Fig. 19: demuestra la dependencia de la actividad de tipo FVIII cromogénica del péptido A1/3 en presencia de FIXa humano. En ausencia de FIXa, el péptido A1/3 no da lugar a ninguna generación de FXa. El tampón control, tampón imidazol puro, se designa como IZ.

Fig. 20: demuestra que la quiralidad de los residuos Arg no tiene un papel significativo en la actividad cromogénica de los péptidos A1/3-rd y A1/3-Rd-srmb.

Fig. 21: muestra que la adición de 2,4 \muM de péptido B1/7 a la mezcla de reacción llevó a una generación apreciable de FXa.

Fig. 22: muestra que la adición de un inhibidor específico de FX da lugar a una disminución significativa de la reacción. Si no había FIXa y se añadía FX a la mezcla de reacción, no se sintetizaba FXa.

Fig. 23: muestra el vector pBax-IgGI.

Fig. 24: muestra el incremento de la actividad amidolítica del FIXa en presencia del anticuerpo 198/B1 (Fig. 24A) y del anticuerpo IgM 198/AF1 (Fig. 24B).

Fig. 25: demuestra la actividad de tipo FVIII cromogénica del fragmento Fab del anticuerpo 198/A1 en presencia de 2,3 nM de FIXa humano. Como control positivo se utilizó el anticuerpo intacto 198/A1, así como 7,5 pM de FVIII. Como control negativo se utilizó el tampón de control (IZ).

Fig. 26: muestra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la proteína de fusión 198AB2 scFv-fosfatasa alcalina (ORF- marco de lectura abierta del vector de expresión pADP2-198AB2#100, SEQ ID NOs 89 y 90). Se obtuvieron los genes de los dominios VL y VH del anticuerpo 198/AB2 (198/AB2 es un subclon idéntico a 198/B1) a partir de las correspondientes células de hibridoma tal como se describe en el Ejemplo 10. El producto PRC del gen VH fue digerido con SfiI-AscI y el producto PCR del gen VL fue digerido con AscI y NotI. Se ligaron los genes VH y VL vía el sitio AscI y se insertaron en el vector digerido SfiI-NotI pDAP2 (Kerschbaumer R.J. y col., Immunotechnology 2, 145-150, 1996; Nº de acceso al Banco de Genes: U35316). Líder PelB: secuencia líder de Erwinia carotovora Pectate Lyase B, His tag, marcador Histidina para la cromatografía de iones metálicos.

Fig. 27: demuestra la actividad de tipo FVIII cromogénica de las proteínas de fusión de dos fragmentos scFv de anticuerpos 198/B1 (subclon AB2) (198AB2#1 y 198AB2#100)-fosfatasa-alcalina en presencia de 2,3 nM de FIXa humano. Como control positivo se utilizó 7,5 pM de FVIII.

Fig. 28: muestra la secuencia de aminoácidos y de nucleótidos de pZip198AB2#102 (SEQ ID NOs 91 y 92).

Fig. 29: muestra la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos de la proteína de fusión de mAB#8860 scFv-fosfatasa-alcalina (vector pDAP2-8860scFv#11) (SEQ ID NOs 93 y 94). Se obtuvieron los genes de los dominios VL y VH del anticuerpo #8860 de las correspondientes células de hibridoma tal como se describe en el Ejemplo 10. El producto PRC del gen VH fue digerido con SfiI- AscI y el producto PCR del gen VL fue digerido con AscI y NotI. Se ligaron los genes VH y VL vía el sitio AscI y se insertaron en el vector digerido SfiI-NotI pDAP2 (Kerschbaumer R.J. y col., Immunotechnology 2, 145-150, 1996; Nº de acceso al Banco de Genes: U35316).

Fig. 30: muestra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la proteína de fusión de mAB #8860 scFv-cierre de leucina (minianticuerpo; vector p8860-Zip#1.2, SEQ ID NOs 95 y 96). El gen del fragmento scFv se obtuvo de mAB #8860 y se cambió desde el vector pDAP2-8860scFv#11 al pZipl plásmido digerido con SfiI-NotI (Kerschbaumer R.J. y col., Analytical Biochemistry 249, 219-227, 1997; Nº de acceso al Banco de Genes: U94951).

Fig. 31: demuestra la actividad tipo FVIII cromogénica del minianticuerpo (subclon AB2) de 198/B1 198AB-Zip#102 en presencia de 2,3 nM de FIXa humano. Como control positivo se utilizaron 4,8 pM de FVIII, mientras que un minianticuerpo no relacionado (8860-Zip#1.2) y un tampón de reacción puro (IZ) sirvieron como control negativo.

Fig. 32: representación esquemática del plásmido pMycHis6.

Fig. 33: muestra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de parte del plásmido pMycHis6 que difiere del vector pCOCK (SEQ ID NOs. 97 y 98). El vector pMycHis6 se construyó por separación del vector pCOCK (Engelhardt y col., 1994, Biotechniques, 17:44-46) con NotI y EcoRI e inserción de los oligonucleótidos:

mychis6-co:
5'ggccgcagaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatggggcggcacatcaccatcaccatcactaataag 3'	(SEQ ID NO 79)

y

mycchis-ic:
5'aattcttattagtgatggtgatggtgatgtgccgccccattcagatcctcttctgagatgagtttttgttctgc	(SEQ ID NO 80).

Fig. 34: muestra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de scFv 198AB2 (ligada al marcador c-myc y al marcador His6): ORF- marco de lectura abierta del vector de expresión pMycHis6-198AB2#102. El vector pMycHis6 fue construido por separación del vector pCOCK (Engelhardt O. y col., Biotechniques, 17, 44-46, 1994) con NotI y EcoRI e insertando los siguientes oligonucleótidos fijados:

5'-GGCCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATGGGGC
GGCACATCACCATCACCATCACTAATAAG-3'	(SEQ. ID. No. 103)

y

5'-TTATTAGTGATGGTGATGGTGATGTGCCGCCCCATTCAGATCCTCTT
CTGAGATGAGTTTTTGTTCTGC-3'	(SEQ ID NO 104).

El vector resultante, denominado pMycHis6, se separó con SfiI-NotI y el gen de 198AB2 scFv se cambió a este vector desde el vector pDAP2-198AB2#100.

Fig. 35: muestra la secuencia de oligonucleótidos y aminoácidos de scFv #8860 mAB ligado al marcador c-myc y al marcador His-6 (vector p8860-M/H#4c, SEQ ID NOs 101 y 102). El plásmido pMycHis6 se separó con SfiI y NotI y la secuencia de ADN que codifica la proteína 8860#11 scFv se insertó desde pADP2-8860scFv#11 (véase la Fig. 29) dando el plásmido p8860-M/H#4c.

Fig. 36: demuestra la actividad de tipo FVIII cromogénica del fragmento scFv 198/B1 (subclon AB2) (MycHis-198AB2#102) en presencia de 2,3 nM de FIXa humano. Como control positivo se utilizó 4,8 pM de FVIII, miestras que un scFv no relacionado (8860-M/H#4c) y un tampón de reacción puro (IZ) sirvieron como control negativo.

Anticuerpos

La presente invención también comprende los ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos de la invención, los vectores de expresión, las líneas celulares de hibridoma y los métodos para producirlos.

Los anticuerpos son moléculas de inmunoglobulina que tienen una secuencia de aminoácidos específica y que sólo se une a antígenos que inducen sus síntesis (o a su inmunógeno, respectivamente) o a antígenos (o inmunógenos), siendo éstos parecidos a los anteriores. Cada molécula de inmunoglobulina consiste en dos tipos de cadena polipeptídica. Cada molécula consiste en cadenas pesadas idénticas grandes (cadenas H) y dos cadenas ligeras también idénticas (cadenas L). Los polipéptidos están conectados mediante puentes disulfuro y enlaces no covalentes. In vivo, las cadenas pesada y ligera se forman en diferentes ribosomas, se unen a la célula y se segregan como inmunoglobulinas intactas (Roitt I. y col., Immunology, segunda edición, 1989).

Los anticuerpos de la invención y los compuestos orgánicos derivados de los mismos comprenden anticuerpos monoclonales humanos y animales o fragmentos de los mismos, anticuerpos de cadena sencilla y fragmentos de los mismos y minianticuerpos, anticuerpos biespecíficos, dicuerpos, tricuerpos o bi-, oligo- o multímeros de los mismos. También incluyen peptidomiméticos o péptidos derivados de los anticuerpos según la invención; por ejemplo, comprenden una o varias regiones CDR, preferiblemente la región CDR3.

Además, se incluyen anticuerpos monoclonales humanos y secuencias de péptidos que, en base a una conexión estructura-actividad, se obtienen a través de un procedimiento de modelación artificial (Greer J. y col., J. Med. Chem., 1994, Vol. 37, pp.: 1035-1054).

El término anticuerpo activador de factor IX/IXa también puede incluir aquellas proteínas producidas por expresión de una región codificadora de inmunoglobulina alterada de una célula huésped, por ejemplo "anticuerpos modificados técnicamente" tales como anticuerpos sintéticos, anticuerpos quiméricos o humanizados, o mezclas de los mismos, o fragmentos de anticuerpos que carecen parcial o totalmente de la región constante, por ejemplo Fv, Fab, Fab' o F(ab)'_{2}, etc. En estos anticuerpos modificados técnicamente, por ejemplo se pueden sustituir una o varias partes de la cadena ligera y/o pesada. Dichas moléculas pueden comprender, por ejemplo, anticuerpos que constan de una cadena pesada humanizada y una cadena ligera no modificada (o cadena ligera quimérica), o viceversa. Los términos Fv, Fc, Fd, Fab, Fab' o F(ab)_{2} son utilizados tal como se describe en el estado de la técnica (Harlow E. y Lane D., "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).

La presente invención también comprende la utilización de fragmentos de Fab o de F(ab)_{2} que se derivan de anticuerpos monoclonales (mAb), que están dirigidos contra el factor IX/factor IXa y causan un aumento de la actividad del factor IXa.

Preferentemente se seleccionan las regiones estructurales heterólogas y las regiones constantes de clases de inmunoglobulinas humanas e isotipos, tales como IgG (subtipos 1 a 4), IgM, IgA e IgE. En el curso de la respuesta inmune, se puede producir un cambio de clase de la inmunoglobulina; por ejemplo de IgM a IgG; en ese sentido, se intercambian las regiones constantes, por ejemplo de \mu a \gamma. También se puede producir un cambio de clase de forma dirigida utilizando métodos de ingeniería genética ("recombinación de cambio de clase dirigido"), tal como se conoce en el estado de la técnica (Esser C. y Radbruch A., Annu. Rev. Immunol., 1990, Vol. 8, pp.: 717-735). Sin embargo, no es necesario que los anticuerpos según la invención comprendan exclusivamente secuencias humanas de proteínas inmunoglobulina.

En una realización concreta, un anticuerpo humanizado comprende regiones complemento determinantes (CDRs) de anticuerpos monoclonales murinos que son insertadas en las regiones estructurales de las secuencias seleccionadas de anticuerpos humanos. No obstante, también se pueden utilizar regiones CDR humanas. Preferentemente, las regiones variables de las cadenas humanas ligera y pesada se modifican técnicamente mediante uno o más intercambios de CDR. También es posible utilizar las seis CDRs o combinaciones varaibles de menos de seis CDRs.

El anticuerpo humanizado, según la presente invención preferentemente tiene la estructura de un anticuerpo humano o de un fragmento del mismo y comprende la combinación de características necesarias para poder una aplicación terapéutica, por ejemplo el tratamiento de trastornos de la coagulación en enfermos, en particular en enfermos con inhibidores de factor VIII.

Un anticuerpo quimérico difiere de un anticuerpo humanizado en que comprende todas las regiones variables, incluyendo las regiones estructurales de las cadenas pesada y ligera de origen no humano en combinación con las regiones constantes de ambas cadenas de inmunoglobulina humana. Se puede producir, por ejemplo, un anticuerpo quimérico que conste de secuencias humanas y murinas.

Según la presente invención, los anticuerpos pueden ser también de cadena sencilla o minianticuerpos (fragmentos scFv, que, por ejemplo, son ligados a secuencias ricas en prolina y dominios de oligomerización, véase por ejemplo Pluckthun A. y Pack P., Immunotechnology, 1997, Vol. 3, pp.: 83-105) o Fv de cadena sencilla (sFv), que incorporan toda la región de unión al anticuerpo en una única cadena de polipéptidos. Por ejemplo, los anticuerpos de cadena sencilla se pueden formar ligando los V-genes a un oligonucleótido que se ha construido como una secuencia de unión (Linker) y une concecta el C-terminal de la primera región V con N-terminal de la segunda región V; esto es, en el orden VH-Linker-VL o VL-Linker-V_{H}; ambos V_{H} y v_{L} representan así el dominio N-terminal (Huston J.S. y col., Int. Rev. Immunol., 1993, Vol. 10, pp.: 195-217; Raag R. y Whitlow M., FASEB J., 1995, Vol. 9, pp.: 73-80). La proteína que se puede utilizar como secuencia de unión (Linker) puede tener, por ejemplo, una longitud de hasta 150 \ring{A}, preferentemente de hasta 80 \ring{A} y en especial de hasta 40 \ring{A}. En particular, son preferentes las secuencias de unión (Linker) que contienen glicina y serina por su flexibilidad, o aquellas que contienen glutamina y lisina, respectivamente, por su solubilidad. La elección del aminoácido se rige según criterios de inmunogenicidad y estabilidad, también dependiendo de si dichos anticuerpos de cadena sencilla van a ser apropiados o no para aplicaciones fisiológicas e industriales (por ejemplo cromatografía de inmunoafinidad). Los anticuerpos de cadena sencilla también pueden estar presentes en forma de agregados, por ejemplo como trímeros, oligómeros o multímeros. Sin embargo, la secuencia de unión (Linker) puede no aparecer y la unión de las cadenas V_{H} y V_{L} se puede producir de forma directa.

Los anticuerpos biespecíficos son reticulantes macromoleculares heterobifuncionales que tienen dos diferentes especificidades de unión dentro de una única molécula. A este grupo pertenecen, por ejemplo, IgGs bioespecífico (bs), IgM-IgAs bs, dímeros-IgA bs, (Fab')_{2} bs, (scFv)_{2} bs, dicuerpos y Fc Fab bi bs (Cao Y. y Suresh M.R., Bioconjugate Chem., 1998, Vol. 9, pp.: 635-644).

Por peptidomiméticos se entienden aquellos componentes de la proteína de bajo peso molecular que imitan la estructura de un componente pepetídico natural o de un molde que induce una formación estructural específica en una secuencia pepetídica adyacente (Kemp DS, Trends Biotechnol., 1990, pp.: 249-255). Por ejemplo, los peptidomiméticos pueden derivarse de los dominios CDR3. El análisis mutacional metódico de una secuencia peptídica dada, es decir el análisis mutacional de exploración de alanina o ácido glutámico, permite identificar residuos peptídicos determinantes para la actividad procoagulante. Otra posibilidad de mejorar la actividad de una secuencia peptídica determinada el utilizar librerías de péptidos junto con un screening de alto rendimiento.

El término anticuerpos puede comprender también a aquellos agentes que han sido obtenidos por análisis de los datos relativos a las relaciones estructura-actividad. Estos compuestos se pueden utilizar también como peptidomiméticos (Grassy G. y col., Nature Biotechnol., 1998, Vol. 16, pp.: 748-752; Greer J. y col., J. Med. Chem., 1994, Vol. 37, pp.: 1035-1054).

El 9 de septiembre de 1999 se depositaron ejemplos de células de hibridoma que expresan anticuerpos según la invención con los números 99090924 (#198/A1), 99090925 (198/B1) y 99090926 (#198/BB1) y el 16 de diciembre de 1999 con los números 99121614 (#193/A0), 99121615 (#196/C4), 99121616 (#198/D1), 99121617 (198/T2), 99121618 (#198/G2), 99121619 (#198/AC1) y 99121620 (#198/U2) según el Tratado de Budapest.

Métodos de producción

Los anticuerpos de la presente invención se pueden preparar por métodos conocidos del estado de la técnica, por ejemplo mediante las técnicas de hibridoma convencionales o mediante librerías génicas de visualización en fagos, técnicas de reestructuración de la cadena de inmunoglobulina o técnicas humanizadoras (Harlow E. y Lane D., Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). La producción de los anticuerpos de la invención y de sus derivados se puede llevar a cabo, por ejemplo, por técnicas de hibridoma convencionales (Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, Ediciones Harlow y Lane, pp.: 148-242). Por tanto, según la presente invención, se pueden emplear especies no humanas tales como ganado, cerdos, monos, pollos y roedores (ratones y ratas).

Por ejemplo, se pueden utilizar ratones normales, ratones Balb/c inmunocompetentes o ratones con déficit en FIX (gracias al Dr. Darrel Stafford de la Universidad de Carolina del Norte, Chapel Hill, se pueden obtener ratones con déficit en factor IX). La inmunización se puede llevar a cabo, por ejemplo, con factor IX, factor IXa\alpha o factor IXa\beta completamente activado, o con fragmentos de los mismos.

Los hibridomas se seleccionan con el objeto de que los anticuerpos en los sobrenadantes de las células de hibridoma se unan al factor IX/factor IXa y provoquen un incremento de la actividad procoagulante del factor IXa. El aumento de la actividad procoagulante del factor IXa se puede comprobar, por ejemplo, por métodos de ensayo tales como los conocidos en el estado de la técnica para la medida de la actividad del factor VIII, por ejemplo ensayos cromogénicos.

Como alternativa, los anticuerpos de la invención pueden obtenerse por métodos de producción recombinante. En este caso, la secuencia de ADN de los anticuerpos según la invención puede determinarse por técnicas conocidas y se puede expresar todo el ADN del anticuerpo o partes del mismo en los sistemas adecuados. Se pueden utilizar métodos de producción recombinante, tales como los que implican la visualización en fagos, librerías sintéticas y naturales, expresión de las proteínas del anticuerpo en sistemas de expresión conocidos o expresión en animales transgénicos (Jones y col., Nature, 1986, Vol. 321, pp.: 522-525; Phage Display of Peptides and Proteins, A Laboratory Manual, Ed. Kay y col., pp.: 127-139; US 4,837,316; Vaughan T.J. y col., Nature Biotechnology, 1998, pp.: 535-539; Persic L. y col., Gene, 1997, pp.: 9-18; Ames R.S. y col., J. Immunol. Methods, 1995, pp.: 177-186).

La expresión de los anticuerpos producidos de forma recombinante se puede realizar por medio de vectores de expresión convencionales, tales como vectores bacterianos como pBr322 y sus derivados, vectores pSKF o eucarióticos como los vectores pMSG y SV40. Se pueden proporcionar secuencias que codifican el anticuerpo con secuencias reguladoras que regulan la replicación, expresión y secreción desde la célula huésped. Dichas secuencias reguladoras comprenden promotores, por ejemplo CMV o SV40, y secuencias señal.

Los vectores de expresión también pueden comprender marcadores de selección y de amplificación, tales como el gen dihidrofolato-reductasa (DHFR), higromicina-B-fosfotransferasa, timidina-quinasa, etc.

Los componentes de los vectores utilizados, tales como los marcadores de selección, replicones, intensificadores, etc., se pueden obtener en el mercado o se pueden preparar según métodos convencionales. Para su expresión, los vectores se pueden construir en varios cultivos celulares, por ejemplo en caso de células de mamíferos CHO, COS, fibroblastos, células de insectos, levaduras o bacterias como E.coli. Preferentemente se utilizan aquellas células que permiten una glicosilación óptima de la proteína expresada. En particular, es preferente el vector pBax (cf. Fig, 17) expresado en células CHO o SK-Hep. La producción de fragmentos Fab o F(ab)_{2} se puede llevar a cabo según métodos conocidos del estado de la técnica, por ejemplo disociando un mAB con enzimas proteóliticas tales como papaína y/o pepsina o por métodos recombinantes. Estos fragmentos Fab y F(ab)_{2} también se pueden preparar a partir de una librería de genes de visualización en fagos (Winter y col., 1994, Ann, Rev, Immunol., 12:433-455).

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La purificación de los anticuerpos de la invención también se puede realizar por los métodos descritos en el estado de la técnica, por ejemplo por precipitación en sulfato amónico, purificación por afinidad (proteína G-Sefarosa), cromatografía de intercambio iónico o cromatografía en gel. Para demostrar que los anticuerpos de la presente invención se unen al factor IX/factor IXa, aumentan la actividad procoagulante del factor IXa o tienen actividad de tipo factor VIII, se pueden utilizar los siguientes métodos de análisis: análisis de coagulación en una etapa (Mikaelsson y Oswalson, Scand. J. Haematol., Suppl., 33, pp.: 79-86, 1984) o análisis cromogénicos tales como COATEST VIII:C® (Chromogenix) o Immunochrom (IMMUNO). En principio, se pueden utilizar todos los métodos habituales para determinar la actividad del factor VIII. Como valor control blanco para las medidas se pueden utilizar, por ejemplo, anticuerpos IgG-ratón no específicos.

Los presentes anticuerpos son adecuados para su uso terapéutico en el tratamiento de trastornos de la coagulación; por ejemplo en caso de hemofilia A, en enfermos con inhibidores del factor VIII, etc. La administración se puede llevar a efecto por cualquier método de administración del agente terapéutico al paciente eficaz; por ejemplo vía oral, subcutánea, intramuscular, intravenosa o intranasal.

Los agentes terapéuticos según la invención se pueden fabricar en forma de preparados que comprenden una cantidad suficiente de anticuerpos como agente activo en un excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico. Dichos agentes pueden estar presentes tanto en forma líquida como en polvo. Además, los preparados según la invención también pueden comprender mezclas de diferentes anticuerpos, derivados de los mismos y/o compuestos orgánicos derivados de los mismos, así como mezclas compuestas de anticuerpos y factor IX y/o factor IXa. El factor IXa puede estar presente como factor IXa\alpha y/o como factor IXa\beta. Un ejemplo de excipiente acuoso es un salino. Las soluciones son estériles, habiéndose realizado la esterilización por métodos convencionales.

Los anticuerpos según la invención pueden estar presentes en forma liofilizada antes de su envasado y ser suspendidos en un disolvente adecuado antes de ser administrados. Se ha demostrado que este método es, en general, favorable para inmunoglobulinas convencionales, en cuyo caso, se pueden aplicar métodos de liofilización y reconstitución conocidos.

Además, los anticuerpos según la invención se pueden utilizar también para aplicaciones industriales, por ejemplo para la purificación del factor IX/factor IXa mediante cromatografía por afinidad, como componente en métodos de detección (por ejemplo ensayos ELISA) o como agente para identificar e interactuar con dominios funcionales de una proteína diana.

A continuación se describe más detalladamente la presente invención por medio de los siguientes ejemplo y figuras.

Ejemplos Ejemplo 1 Inmunización de ratones inmunocompetentes y generación de células de hibridoma que segregan el anticuerpo anti-FIX/IXa

Se inmunizó con 100 \mug de antígeno (dosis de 100 \mul), vía intraperitoneal (i.p.), a grupos de 1-3 ratones Balb/c normales inmunocompetentes de 2-8 semanas de edad. En un experimento típico, los ratones fueron inoculados con factor de coagulación humana recombinante (F) IX (Benefix^{TM}), con FIXa\alpha humano activado o con FIX\alpha\beta (Enzyme Research Laboratories, Lot: HFIXA\alpha\beta 1332 AL), con coadyuvante Al(OH)_{3} o KFA.

Se administró una vacuna de refuerzo de 100 \mug de antígeno (dosis de 100 \mul, i.p.) a cada uno de los ratones en diversos momentos y se les sacrificó dos días después. Se extrajeron las células del bazo y se fundieron con células de mieloma P3 X63-Ag8 6.5.3, básicamente tal como describe Lane y col., 1985 (J. Immunol. Methods, Vol. 81, pp.: 223-228). Se numeró individualmente cada experimento de fusión; esto es: #193, 195, 196 o 198.

Se cultivaron células de hibridoma en placas de 96 pocillos sobre una capa de alimentación de macrófagos (aplicación 10^{5} células/ml) y se seleccionaron en medio-HAT (medio RPMI-1640 suplementado con antibióticos, 10% de FCS, Na-piruvato, L-glutamina, 2-mercaptoetanol y HAT (HAT 100x: 1,0x10^{-2}M de hipoxantina en H_{2}O (136,1 mg/100 ml de H_{2}O), 4,0x10^{-5}M de aminopterina en H_{2}O (1,76 mg/100 ml de H_{2}O) y 1,6x10^{-3}M de timidina en H_{2}O (38,7 mg/100 ml de H_{2}O)). Se cambió el medio tras 6 días y después cada dos semanas. Tras 2-3 semanas se cambió el medio a medio-HT (RPMI-1640 suplementado con antibióticos, 10% de FCS, Na-piruvato, L-glutamina, 2-mercaptoetanol y HT) y después (tras otras 1-2 semanas) a medio de cultivo normal (medio RPMI-1640 suplementado con 10% de FCS, Na-piruvato, L-glutamina, 2-mercaptoetanol) (véase: HYBRIDOMA TECHNIQUES, EMBO, SKMB Course 1980, Basel).

En otra serie de experimentos, se utilizaron ratones C57B16 con déficit en FIX (Lin y col., 1997, Blood, 90:3962) para la inmunización y posterior producción de hibridomas. Debido a que los ratones noqueados (KO) no expresan FIX endógeno, se supone que la variedad de anticuerpos anti (a)-FIX que se puede lograr es diferente comparada con la de los ratones Balb/c normales (debido a la falta de tolerancia).

Ejemplo 2 Análisis de la actividad en sobrenadantes de células de hibridoma que segregan el anticuerpo anti-FIX/FIXa

A fin de analizar la actividad del tipo FVIII de los anticuerpos anti-FIXa segregados por las células de hibridoma, se empleó el aparato de ensayo comercializado como COSTEST VIII:C/4® (Chromogenix). El análisis se llevó a cabo básicamente como describe el fabricante, con las siguientes modificaciones:

Para permitir un screening de alto rendimiento, se subescaló el análisis a un formato de placa microtítulada. Brevemente: se transfirieron 25 \mul de alícuotas de sobrenadante de hibridoma a pocillos de una placa microtitulada (Costar, # 3598) y se calentaron a 37ºC. Se reconstituyeron en agua esterilizada el sustrato cromogénico (S-2222), un inhibidor de la trombina sintético (I-2581), factor (F) IXa y FX, y se mezcló FIXa/FX con fosfolípidos según el protocolo del proveedor. Para la reacción, se combinaron 50 \mul de una solución de fosfolípidos/FIXa/FX con 25 \mul de CaCl_{2} (25 mM) y 50 \mul de un cóctel de sustrato/inhibidor. Para iniciar la reacción se añadieron 125 \mul de la premezcla al sobrenadante de hibridoma en placas microtituladas y se incubaron a 37ºC. Se leyó la absorbancia de las muestras a 405 nm y 490 nm en varios momentos (30 min a 12 horas) en comparación con el reactivo blanco (MLW, medio de cultivo celular en vez de sobrenadante de hibridoma) en un lector de placas microtituladas Labsystems iEMS Reader MF^{TM}. Se calculó la actividad tipo FVIII de las muestras comparando la absorbancia de un patrón de referencia FVIII diluido (IMMUNO AG#5T4AR00) utilizando el software GENESIS^{TM}.

En la Fig. 1 se muestran los resultados del screening de la actividad tipo FVIII en sobrenadantes de cultivo celular de hibridomas. Los clones preseleccionados obtenidos de los experimentos de fusión #193, #195, #196 (véase arriba) se analizaron en un ensayo FVIII cromogénico tal como se ha descrito. Los clones 193/M1, 193/N1 y193/P1 son subclones obtenidos del clon original 193/C0 (véase más abajo). El clon original 195/10 se obtuvo del experimento de fusión #195 y los clones 196/A0, 196/B0 y 196/C0 se obtuvieron del experimento de fusión #196. En un experimento de selección típico, se preanalizaron aproximadamente 1.000 clones (en 96 pocillos) en un solo experimento de fusión para ver la actividad tipo FVIII. A continuación, se cultivaron los clones seleccionados a mayor escala (3-5 ml de sobrenadantes) y se volvieron a analizar en un ensayo cromogénico. Como control negativo se analizó el medio de cultivo celular en cada placa (MLW).

Los pocillos que mostraron una alta actividad de tipo FVIII o una actividad de tipo FVIII significativa se sometieron a procedimientos de subclonación. El procedimiento de selección y subclonación es ilustrativo de la selección y subclonación de una línea celular productora de IgG (es decir: 193/C0), pero se ha efectuado exactamente igual con un clon productor de IgM (es decir, 196/C0, véase abajo en la Fig. 5).

El procedimiento de selección se llevó a cabo cultivando inicialmente todos los clones de células de hibridoma obtenidos de un solo experimento de fusión en placas de 96 pocillos, creándose así las llamadas "placas patrón". Las posiciones singulares (pocillos) en la placa patrón normalmente contenían más de un clon de células de hibridoma (normalmente de 3 a 15 clones diferentes). A continuación, se analizó el anticuerpo segregado tan sólo por varios miles de células. Dichas células crecieron bajo condiciones subóptimas para la producción de anticuerpos, que se sabe es la mejor para las células que van a morir. Así, la concentración de anticuerpo anti-FIX específico en el sobrenadante debe estar comprendida entre 10^{-12} y 10^{-14} M. Esto explica porqué los periodos de incubación tuvieron que alargarse en comparación con los de los ensayos estándar de FVIII.

En la Fig. 2 se muestran los resultados del screening de la actividad tipo FVIII mediada por IgG en sobrenadantes de un cultivo celular de hibridomas de una placa patrón. Se analizaron los sobrenadantes en un ensayo FVIII cromogénico. Se muestran los resultados obtenidos de la quinta placa patrón del experimento de fusión #193 (ratones Balb/c inmunizados con FIXa\alpha). Se leyó la absorbancia después de 4 horas de incubación a 37ºC. Se vio que la posición ES mostraba una actividad de tipo FVIII considerablemente superior a la del banco (MLW). Se denominó a esta reserva de células 193/C0 y posteriormente se subclonó (Figura 3). Debido a que cada pocillo de la placa patrón contenía más de un clon de células de hibridoma, se expandieron las células de un solo pocillo positivo y se cultivaron en placas a una densidad celular calculada de 2-0,2 células/pocillo en una placa de 96 pocillos. Se volvieron a analizar los sobrenadantes para ver si tenían actividad tipo FVIII y se sometieron las posiciones positivas a otro ciclo de subclonación. En general, se llevaron a cabo de tres a cuatro ciclos de subclonación con cada clon que mostraba actividad de tipo FVIII para obtener poblaciones celulares homogéneas. Aquí se muestran los resultados del ensayo cromogénico de los subclones 193/C0. Se leyó la absorbancia tras un periodo de incubación de 4 horas a 37ºC. Las posiciones A6 y D5 mostraron una actividad significativa de tipo FVIII y se las denominó 193/M1 y 193/P1, respectivamente. Se sometió a estos dos clones a otro ciclo de subclonación. Como control negativo se analizó el medio de cultivo de células puras en cada placa (MLW (H1)).

En la Fig. 4 se muestra una comparación entre la actividad tipo FVIII cromogénica y la reactividad FIX-ELISA de cultivos de hibridoma a pequeña escala (3 ml). Antes de decidir si se iba subclonar posteriormente un clon original (o subclon), se cultivaron clones a una escala de 3-5 ml y se comprobaron de nuevo los sobrenadantes. Este gráfico muestra los resultados ELISA específicos de FIX y la actividad cromogénica tipo FVIII del clon original 193/C0 y de todos sus subclones, que fueron identificados como positivos y vueltos a comprobar. En el caso de ELISA, se sustrajeron los blancos (la absorbancia del propio reactivo cromogénico) y las lecturas del ensayo cromogénico aquí representado. Se subclonó el clon 193/M1 dando los clones 193/V2, 193/M2 y 193/U2. Se subclonaron los otros clones del segundo ciclo procedentes de 193/P1, 193/AB2 y 193/P2. 193/AF3, 193/AB3 y 193/AE3 son subclones de 193/AB2. Los otros clones del tercer ciclo procedían de 193/P2. Finalmente se subclonaron los clones 193/AF3 (\rightarrow193/AF4), AE3 (\rightarrow193/AE4), 193/AL4, 193/AN4 y 193/AO4) y 193/AD3 (\rightarrow193/AG4, 193/AH4, 193/AD4, 193/AI4, 193/AK4).

En cada experimento de fusión se identificaron y sometieron a subclonación a varios (5-15) clones originales (seleccionados de la placa patrón). Tras 3 ciclos de subclonación, la mayor parte de las líneas celulares eran homogéneas, como se demostró mediante el ensayo ELISA y de actividad cromogénica (véase la Fig. 4) y mediante el análisis de la secuencia de ADNc. Un clon original específico y todos sus subclones producen el mismo anticuerpo de unión FIX/FIXa. Sin embargo, existen grandes diferencias en las secuencias de proteínas de anticuerpos de los clones obtenidos a partir de diferentes clones originales (véase el Ejemplo 11). La mayor parte de las líneas celulares expresan anticuerpos de las subclases IgG (es decir, clones #193, #198, como 198/A1, 198/B1 198/BB1). No obstante, pudimos seleccionar algunos clones que expresan anticuerpos IgM.

Se determinó la actividad cromogénica del sobrenadante de hibridoma de algunos clones originales importantes y subclones. Se midió la absorbancia después de un periodo de incubación de 1 hora y 30 min y de 3 horas 30 min, a 37ºC (Fig. 5). A diferencia de todos los clones de la fusión 193, el clon 196/C0 y su subclon 196/AP2 produjeron un anticuerpo IgM específico FIX/FIXa que dio fuerte actividad cromogénica incluso tras un corto periodo de incubación.

De acuerdo con el Tratado de Budapest se han depositado las siguientes líneas celulares en la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC): 98/B1 (Nº ECACC: 99090925); 198/A1 (Nº ECACC: 99090924), 198/BB1 (Nº ECACC: 99090926); 193/AO (Nº ECACC: 99121614); 196/C4 (Nº ECACC: 99121615); 198/D1 (Nº ECACC: 99121616); 198/T2 (Nº ECACC: 99121617); 198/G2 (Nº ECACC: 99121618); 198/AC1 (Nº ECACC: 99121619); y 198/U2 (Nº ECACC: 99121620).

A fin de efectuar un análisis más minucioso de las propiedades bioquímicas de determinados anticuerpos, se expandieron líneas celulares de hibridoma homogéneas que expresaban diferentes anticuerpos con actividad tipo FVIII y se utilizaron para expresar el anticuerpo en cuestión a mayor escala (100-1.000 ml). Se purificaron por afinidad dichos anticuerpos (véase el Ejemplo 3) antes de ser utilizados en experimentos posteriores.

Ejemplo 3 Propiedades de unión al Factor IX/FIXa_{(\alpha,\beta)} de anticuerpos que muestran actividad activadora de FIX/FIXa

Se diluyeron en TBS (25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,5) Factor IX y las dos formas activadas de FIX, FIXa\alpha y FIXa\beta (FIX/FIXa_{(\alpha,\beta)}) a una concentración final de 2 \mug/ml. Se recubrieron con una solución de 100 \mul de FIX/FIXa_{(\alpha,\beta)} placas para ELISA Nunc Maxisorp siguiendo los procedimientos habituales (4ºC, durante toda la noche) y se lavaron varias veces con TBST (TBS, 0,1% (v/v) Tween 20). Se diluyeron 50 \mul de sobrenadante de hibridoma en una proporción 1:1 con 50 \mul de TBST/2% de BSA y se añadieron a la placa para ELISA recubierta. Después de un periodo de incubación de 2 horas a temperatura ambiente (TA), se lavaron las placas 4 veces con TBST y se incubaron (2 horas, a TA) con 100 \mul/pocillo de una dilución en una proporción 1: 25.000 (en TBS/1% de BSA) de un anticuerpo conjugado peroxidasa (Fc-específico) IgG anti-ratón (Sigma, # A-0168). Se lavaron los pocillos 5 veces con TBST y al final se colorearon con 100 \mul de una solución colorante recién preparada (10 ml de citrato sódico 50 mM, pH 5, suplementada con 100 \mul de OPD (60 mg de OPD/ml) y 10 \mul de H_{2}O_{2} al 30%). Se detuvo la reacción por adición de 50 ml de H_{2}SO_{4} y se registró la densidad óptica a 492 nm y 620 nm en un lector de placas microtituladas Labsystems iEMS Reader MF^{TM} utilizando el software GENESIS^{TM}.

En algunos casos, en lugar de utilizar un ensayo ELISA IgG anti-ratón se llevó a cabo un ELISA IgM anti-ratón.

Purificación de IgG de sobrenadantes de cultivos celulares de hibridomas

Se suplementaron 100-50 ml de sobrenadante de hibridoma con 200 mM de una solución tampón Tris/HCl (pH 7,0) y NaCl sólido hasta obtener una concentración final 20 mM de Tris y 3M de NaCl, respectivamente. A continuación se clarificó el sobrenadante por centrifugación a 5.500 g durante 10 minutos. Una columna de cromatografía por afinidad de proteína G de 1 ml (Proteína G Sepharose Fast Flow, Amersham-Pharmacia) con 15 ml de Tris/Cl 20 mM, pH 7,0 y después se equilibró con 10 ml de una solución tampón Tris/Cl 20 mM, pH 7,0, que contenía NaCl 3M. Entonces se cargó el sobrenadante de hibridoma que contenía NaCl 3M en la columna por gravedad. Se lavó la columna con 15 ml de una solución tampón Tris/Cl 20 mM, pH 7,0, que contenía NaCl 3M. A continuación se eluyó el IgG unido con 12 ml de una solución tampón de glicina/HCl, pH 2,8, y se recogió 1 ml de fracciones. Se añadieron 100 \mul de Tris 1M, pH 9,0, a cada fracción para su neutralización. Se identificaron las fracciones que contenían la IgG mezclando 50 \mul con 150 \mul de una solución colorante (concentrado BioRad, en una proporción 1:5, diluido con agua) en pocillos de una microplaca. Se reservaron las fracciones positivas y se concentraron hasta que se obtuvo 1 ml en un concentrador de ultrafiltración (Centricon Plus 20, Amicon) según las instrucciones del fabricante. Se diluyó el concentrado con 19 ml de TBS (solución tampón 20 Mm Tris/Cl, pH 7,0, que contenía NaCl 150 mM) y se concentró de nuevo hasta que se obtuvo 1 ml. Se repitió el paso dilución-concentración dos veces más para integrar la IgG en TBS.

Purificación de IgM-ratón de sobrenadantes de células de hibridoma

Se concentraron 100-500 ml de sobrenadante del cultivo de células de hibridoma hasta obtenerse 5-10 ml en un concentrador de ultrafiltración (Centricon Plus 20, Amicon) según las instrucciones del fabricante o por precipitación en sulfato amónico (40% de saturación, 0ºC) y se redisolvió el precipitado con 5-10 ml de TBS. En cada caso, se dializó el concentrado frente a una solución tampón 20 mM Tris/Cl, pH 7,4, que contenía NaCl 1,25M y entonces se concentró hasta que se obtuvo 1 ml en un concentrador de ultrafiltración Centricon Plus 20 (Amicon). Se purificó el IgM de este concentrado con el kit de purificación de IgM ImmonoPure (Pierce) según las instrucciones del fabricante. Se analizaron las fracciones recogidas durante la elución de la columna de proteínas de unión a la maltosa para ver si había IgM, se reservaron, concentraron e integraron en TBS, tal como se ha descrito para la IgG.

Determinación de las concentraciones de IgG en preparados purificados

Se midió el contenido total de IgG a 280 nm- extinción de las diluciones apropiadas. El E280 = 1,4 corresponde a 1 mg/ml de proteína.

IgG específico del factor IXa (ELISA cuantitativo)

Se incubaron pocillos de una microplaca (Nunc Maxisorp) con 2 \mul de factor IXa diluido en TBS (25 mM Tris/HCl, pH 7,5, conteniendo NaCl 150 mM) durante una noche a 4ºC. Se lavaron los pocillos cuatro veces con TBST (25 mM Tris/Hcl, pH 7,5, que contenía NaCl 150 mM y 0,1% (v/v) de Tween 20). Como AB monoclonal estándar se utilizó anti-FIX HIX1 (exacto). Se diluyeron las diluciones estándar y las muestras en TBST que contenía un 2% (w/v) de BSA. Se incubaron las series de dilución estándar y las debidas diluciones de las muestras en placas para ELISA durante 2 horas a temperatura ambiente. Se lavaron las placas 4 veces con TBS y se incubaron (2 horas, TA) con 100 \mul/pocillo de una dilución en una proporción de 1:25.000 (en TBS/1% de BSA) de FIXa de un anticuerpo conjugado con peroxidasa (Fc-específica) IgG anti-ratón (Sigma, # A-0168). Se lavaron los pocillos 5 veces con TBST y al final se colorearon con 100 \mul de una solución colorante recién preparada (10 ml de citrato sódico 50 mM, pH 5, suplementado con 100 \mul de OPD (60 mg de OPD/ml) y 10 \mul de H_{2}O_{2} al 30%)). Se detuvo la reacción por adición de 50 ml de H_{2}SO_{4} y pasados 30 minutos se registró la densidad óptica a 492 nm y 620 nm en un lector de placas microtituladas Labsystems iEMS Reader MF^{TM} utilizando el software GENESIS^{TM}.

Ejemplo 4 Anticuerpos anti-FIX/FIXa que muestran actividad de tipo FVIII en un ensayo de FVIII cromogénico

Se subclonaron varios clones de hibridoma productores de anticuerpo anti-FIX/FIXa hasta cuatro veces y se utilizó la línea celular de hibridomas monoclonales resultante para producir un sobrenadante que contenía anticuerpos monoclonales. Se purificaron en columnas de afinidad los anticuerpos del isotipo IgG obtenidos de estos sobrenadantes y se dializaron frente a TBS (véase arriba). Los anticuerpos IgM se utilizaron como fracciones de sobrenadante no purificadas. Se hicieron los siguientes experimentos con dos series de anticuerpos representativos: 193/AD3 y 198/AC1/1 (isotipo de IgG, el anticuerpo 198/AC1/1 es un preparado del clon del hibridoma 198/AC1 parental; es decir que se cultiva un vial (congelado) que contiene células 198/AC1 y se producen los anticuerpos. Luego se utiliza el sobrenandante para estos experimentos) y 196/AF2 y 196AF1 (isotipo de IgM) (Fig. 6A y Fig. 6B). Brevemente: se transfirieron 25 \mul de alícuotas de una muestra que contenía el anticuerpo monoclonal (sobrenadante de hibridoma no purificado o, cuando se indica, una cierta cantidad de anticuerpo específico FIX) a pocillos de una placa microtitulada y se calentaron a 37ºC. Se reconstituyeron en agua esterilizada el sustrato cromogénico (S-2222), un inhibidor de la trombina sintético (I-2581), factor (F) IXa y FX, y se mezcló FIXa/FX con fosfolípidos según el protocolo del proveedor. Se combinaron 50 \mul de una solución de fosfolípidos/ FIXa/ FX por reacción con 25 \mul de CaCl_{2} (25 mM) y 50 \mul de un cóctel sustrato/inhibidor. Para iniciar la reacción, se añadieron 125 \mul de la premezcla a la solución de anticuerpos monoclonales en placas microtituladas y se incubaron a 37ºC. Se leyó la absorbancia de las muestras a 405 nm y 490 nm en varios momentos (5 min a 6 horas) frente al blanco reactivo (medio de cultivo celular en vez de sobrenadante de hibridoma) en un lector de placas microtituladas Labsystems iEMS Reader MF^{TM} utilizando el software GENESIS^{TM}.

En la Fig. 6A se muestra el transcurso del tiempo de actividad de tipo FVIII mostrada por los anticuerpos monoclonales 193/D3 (isotipo IgG) y 196/AF2 (isotipo IgM) en comparación con FVIII humano (12 y 16 mU/ml), TBS y con el medio de cultivo celular. Tras una fase de latencia, ambos anticuerpos dan lugar a una disociación del sustrato cromogénico, como se puede apreciar por la densidad óptica cada vez mayor medible a 405 nm de longitud de onda.

En la Fig. 6B se muestra el transcurso del tiempo de actividad de tipo FVIII mostrada por los anticuerpos monoclonales 198/AC1/1 (isotipo IgG, 10 \mug/ml) y 196/AF1 (isotipo IgM, sobrenadante no purificado) en comparación con el FVIII humano (16 mU/ml) y 10 \mug/ml de IgG-ratón. Tras una fase de latencia, ambos anticuerpos dan lugar a una disociación del sustrato cromogénico, como se puede apreciar por la densidad óptica cada vez mayor medible a 405 nm de longitud de onda.

Ejemplo 5 La actividad tipo FVIII mostrada por los anticuerpos anti-FIX/FIXa genera el factor Xa y es dependiente de los fosfolípidos, FIXa/FX y Ca^{2+}

La actividad del factor VIII normalmente se determina en un ensayo cromogénico y/o en un ensayo de factores coagulación basados en un ensayo de coagulación APTT. Ambos tipos de ensayos se basan en la generación de factor Xa cromogénico mediado por FVIII/FIXa. En el caso del ensayo FVIII cromogénico, el factor Xa producido reaccionará posteriormente con un sustrato cromogénico que se puede controlar vía espectroscopía, por ejemplo en un lector ELISA. En el ensayo de factores coagulación basados en el ensayo de coagulación APTT, el factor Xa libre se unirá con el FVa en una superficie fosfolipídica en el llamado complejo protrombinasa, que convierte la protrombina en trombina. La trombina, a cambio, da lugar a la generación de fibrina y por último a la formación de coágulos. La generación de factor Xa por el complejo FVIII/FIXa es fundamental en los dos sistemas de ensayo.

A fin de demostrar que la actividad tipo FVIII mostrada por los anticuerpos anti-FIX/FIXa genera en efecto factor Xa, se llevó a cabo el siguiente experimento. Se transfirieron varios alícuotas de 25 \mul de sobrenadante de hibridoma no purificado 196/AF2 (isotipo IgM) a pocillos de placas microtituladas y se calentaron a 37ºC. Como control positivo, se diluyeron 16 mU de Recombinate^{TM} en un medio de hibridoma (196 HM 007/99) y se trataron exactamente del mismo modo que el sobrenadante de hibridomas. Como control negativo, se utilizó un medio de hibridoma puro. Se reconstituyeron el sustrato cromogénico (S-2222), el inhibidor de la trombina sintético (I-2581), el factor IXa y el FX en agua esterilizada y se mezcló FIXa/fx con fosfolípidos según el protocolo del proveedor. Se reconstituyó con agua Pefabloc Xa®, un inhibidor de proteinasa específico del factor Xa (Pentapharm, LTD) hasta que se obtuvo una concentración final de 1 Mm/l. Se combinaron 50 \mul de una solución de fosfolípido/FIXa/FX con 25 \mul de CaCl_{2} (25 mM) y 50 \mul del cóctel sustrato-trombina-inhibidor. Para iniciar la reacción, se añadieron 125 \mul de la premezcla a las muestras en placas microtituladas y se incubaron a 37ºC. Cuando se indicaba, se añadieron 35 \muM de Pefabloc Xa®. Se leyó la absorbancia a 405 nm y 490 nm en varios momentos (cada 5 minutos a 6 horas) frente al blanco reactivo (medio de cultivo celular) en un lector de placas microtituladas Labsystems iEMS Reader MF^{TM} utilizando un software GENESIS^{TM}.

En la Fig. 7A se muestran los resultados de la estimulación del factor IXa por la actividad de tipo FVIII mostrada por el anticuerpo anti-FIX/FIXa IgM 196/AF2 a la hora de generar factor Xa, como se puede apreciar por la disociación fácilmente cuantificable del sustrato cromogénico S-2222 (comparar "16 mU FVIII y "196/AF2"). La actividad del factor Xa se ve efectivamente bloqueada por el inhibidor específico FXa "Pefabloc Xa®" (comparar "196/AF2 frente a 196/AF2 35\muM de "Pefabloc Xa®"), lo que indica que, en efecto, se generó FXa.

Se realizó el mismo experimento utilizando preparados de IgG purificado de clones 198/AM1 (Fig. 7B). Se diluyó el IgG purificado en TBS hasta que se obtuvo una concentración final de 0,4 ml mg/ml y 25 \mul (es decir, un total de 10 \mug) se transfirió a pocillos de placas microtituladas y se calentó a 37ºC. Como control positivo se utilizaron 6 mU de FVIII derivado de plasma. Como control negativo se utilizaron 10 \mug de IgG de ratón no específica (Sigma, I-5381). El ensayo se llevó a cabo como se describe arriba.

Ulteriores experimentos demuestran que la estimulación del factor IXa por la actividad de tipo FVIII mostrada por el anticuerpo anti-FIX/FIXa IgG 198/AM1 genera factor Xa, como se puede apreciar por la disociación fácilmente cuantificable del sustrato cromogénico S-2222 (Fig. 7B). De nuevo el factor VIII y el anticuerpo 198/AM1 generan FXa, que se ve efectivamente bloqueado por el inhibidor específico FXa "Pefabloc Xa®". Como control negativo, se analizó IgG de ratón no específica (Sigma, I5381).

En otra serie de experimentos, se demostró la dependencia de la actividad de tipo FVIII bien de los anticuerpos anti-FIX/FIXa purificados (IgM, Fig. 8A) o de los anticuerpos no purificados derivados de los sobrenadantes del cultivo celular (IgG, Fig. 8B) en presencia de fosfolípidos (PL), FIXa/FX y Ca^{2+}. Se analizó la actividad de tipo factor VIII básicamente tal como se describe arriba. Cuando se indicaba, se omitió de la reacción la mezcla FIXa/FX, el PL o el Ca^{2+}. Se leyó la absorbancia de las muestras a 405 nm y 490 nm en varios tiempos frente al blanco reactivo (solución tampón en lugar de anticuerpo purificado) en un lector de placas microtituladas Labsystems iEMS Reader MF^{TM}. Los resultados se muestran en las Figuras 8A, 8B y 8C.

Más adelante en la Fig. 8A, se muestra la dependencia de la actividad de tipo FVIII del anticuerpo anti-FIXa purificado 198/AC1/1 (isotipo IgG, la concentración utilizada en el ensayo fue de 10 \mug/ml) en presencia de fosfolípidos (PL), FIXa/FX y Ca^{2+}. Como será fácilmente reconocible, solamente el ensayo completo, incluyendo el anticuerpo, PL, Ca^{2+} y FIXa/FX da lugar a una generación razonable de FXa. En la Fig. 8B se muestra la dependencia de la actividad de tipo FVIII del sobrenadante del cultivo celular que contiene anticuerpo anti-FIX/FIXa del isotipo IgM (196/AF1) en presencia de fosfolípidos, FIXa/FX y Ca^{2+}. De nuevo, tal como se ha mostrado para el preparado IgG purificado (Fig. 8A), el anticuerpo 198/AC1/1, solamente en el ensayo completo, incluyendo PL, Ca^{2+} y FIXa/FX, se dará lugar a una cantidad razonable de FXa. Para demostrar la especificidad de la reacción, se analizó el IgG total preparado a partir de plasma de ratón bajo las mismas condiciones descritas arriba. En la Fig. 8C se muestran los resultados. No se detectó actividad de tipo FVIII. Como cabía esperar, no había actividad apreciable en ausencia de fosfolípidos, FIXa/FX y Ca^{2+}. Todos los experimentos se realizaron en una placa microtitulada y la OD405 se evaluó cada 5 minutos durante 6 horas.

Ejemplo 6 Determinados anticuerpos anti-FIX/FIXa son procoagulantes en presencia de FIXa

Durante la hemostasis normal, el FIX es inicialmente activado por la vía del factor tisular (TF)/factor VIIa o más tarde por el factor activado XI (FXIa). Después de su activación, FIXa se asocia a la superficie plaquetaria en un complejo unido a la membrana con el FVIII activado. El propio factor IXa tiene poca o ninguna actividad enzimática hacia FX, pero se vuelve muy activo en presencia de FVIIIa. Para demostrar que determinados anticuerpos anti-FIX/FIXa tienen actividad tipo FVIII y que, por tanto, son procoagulantes en plasma humano con déficit en FVIII, se llevó a cabo el siguiente experimento.

Se utilizaron diferentes cantidades de anticuerpo 193/AD3 o IgG (como control) de ratón en un ensayo estándar de factor de coagulación en una etapa basado en el ensayo de coagulación APTT. Brevemente: se incubaron 100 \mul de muestras que contenían anticuerpos con 100 \mul de plasma deficitario en FVIII (DP) y con 100 \mul de reactivo DAPTTIN (reactivo PTT para determinar el tiempo de trombloplastina activada; IMMUNO AG), en un analizador de coagulación KC10A. Cuando se indicaba, se incluyó en la mezcla de reacción una cantidad total de 50 ng de FIX activado. Después de 4 minutos de incubación, se inició la reacción por adición de 100 \mul de CaCl_{2} (25 mM). En la Tabla 1 y en la Fig. 9 se muestran los resultados.

Tiempo de coagulación (segundos)

1

Tabla 1

Tiempos de coagulación de plasma deficitario en FVIII en un ensayo de factor de coagulación basado en la prueba APTT empleando varias cantidades de procoagulantes (193/AD3) y anticuerpos de control (IgG de ratón) en presencia de 50 ng de FIX activado (0,01U FIX). La proporción molar entre el anticuerpo en la reacción y el FIX activado es 10:1. La proporción molar entre el anticuerpo y el FIX total (FIX y FIXa, dando por hecho que el plasma humano deficitario en FVIII contiene 1 U (5\mug) de FIX) varía entre 6:1 (9 \mug de anticuerpo en la reacción) y 1:6 (0,23 \mug de anticuerpo en la reacción). En una disminución óptima del tiempo de reacción, la proporción molar entre el anticuerpo y el FIX total es 1:1. El tiempo de coagulación sin adición de FIXa está comprendido dentro de los 120 segundos.

La Fig. 9 es una representación gráfica de los tiempos de coagulación de plasma deficitario en FVIII en un ensayo de factor de coagulación basado en la prueba APTT empleando varias cantidades de procoagulantes (193/AD3) y anticuerpos (IgG de ratón) de control en presencia de 50 ng de FIX activado. Hay una clara disminución dosis-dependiente del tiempo de coagulación en muestras suplementadas con el anticuerpo 193/AD3. Estos resultados dan a entender que el anticuerpo 193/AD3 es procoagulante en presencia de FIXa.

Ejemplo 7 Los anticuerpos anti-FIX/FIXa son procoagulantes en presencia de inhibidores de FVIII y FIXa

Una complicación grave de la habitual terapia de sustitución con FVIII es el desarrollo de aloanticuerpos dirigidos frente a FVIII, que llevan a la neutralización del FVIII y a un estado en el que la sangre del paciente no coagula.

Para demostrar que determinados anticuerpos anti-FIXa tienen actividad de tipo FVIII incluso en presencia de inhibidores de FVIII, se llevó a cabo el siguiente experimento. Se utilizaron diferentes cantidades de anticuerpos 193/AD3 o, como control, IgG de ratón, en un ensayo estándar de factor de coagulación en una fase basado en la prueba APTT. Brevemente: se incubaron 100 \mul de muestras de anticuerpos con 100 \mul de plasma deficitario en FVIII (Fig. 10A) o plasma con inhibidor de FVIII (potencia del inhibidor de 400 BU/ml, Fig. 10B), así como con 100 \mul de reactivo DAPTTIN, en un analizador de coagulación KC10A. Además, se incubó una cantidad total de 50 ng de FIXa activado en la mezcla de reacción. Después de 4 minutos de incubación, se inició la reacción por adición de 100 \mul de CaCl_{2} (25mM). Para asegurar que las condiciones eran iguales, se hicieron los experimentos con plasma deficitario en FVIII y plasma con inhibidor de FVIII uno al lado del otro. Como se muestra en la Fig. 6, hay una clara disminución dosis-dependiente del tiempo de coagulación en muestras suplementadas con anticuerpos 193/AD3 en presencia de inhibidores de FVIII.

Ejemplo 8 Los anticuerpos anti-FIX/FIXa son procoagulantes en presencia de FVIII defectuoso y FIXa

Para demostrar que determinados anticuerpos anti-FIXa tienen actividad de tipo FVIII incluso en presencia de inhibidores de FVIII defectuoso, se puede llevar a cabo el siguiente experimento. Se utilizan cantidades cada vez mayores de anticuerpos 193/AD3 o, como control, IgG de ratón en un ensayo estándar de factor de coagulación en una fase basado en la prueba APTT. En dicho ensayo de coagulación se utiliza plasma de un enfermo de hemofilia A con baja actividad de coagulación debido a la presencia de FVIII defectuoso (DF8). Brevemente: se incubaron 100 \mul de muestras de anticuerpos con 100 \mul de plasma DF8 o plasma deficitario en FVIII, así como con 100 \mul de reactivo de DAPTTIN, en una analizador de coagulación KC10A. Además, se añadió una cantidad total de 50 ng de FIXa activado a la mezcla de reacción. Después de una corta incubación, se inicia la reacción por adicción de 100 \mul de CaCl_{2} (25mM). Para asegurar que las condiciones son iguales, se efectúa el experimento que emplea plasma deficitario en FVIII y plasma DF8 uno al lado del otro.

Ejemplo 9 Los anticuerpos anti-FIX/FIXa con actividad procoagulante en presencia de FIXa distinguen entre FIXa humano y bovino

Se purificaron anticuerpos monoclonales específicos FIX/FIXa seleccionados del experimento de fusión 198 a partir del sobrenadante del hibridoma respectivo y se cuantificaron como se describe en el Ejemplo 3. Se analizaron dichos anticuerpos en un ensayo de coagulación en una fase modificado (como se describe en el Ejemplo 6) y se vió que algunos mostraban actividad procoagulante.

La actividad cromogénica de estos preparados de anticuerpos se midió en el siguiente ensayo cinético de generación de FXa: se transfirieron 10 \mug de anticuerpos monoclonales (en 25 \mul) a pocillos de placas microtituladas y se calentaron a 37ºC. Se reconstituyeron en agua esterilizada el sustrato cromogénico (S-2222), el inhibidor de la trombina sintético (I-2581), el factor (F) IXa y FX, y se mezclaron FIXa/FX (ambos bovino) con fosfolípidos según el protocolo del proveedor. Se combinaron 50 \mul de una solución de fosfolípidos/FIXa/FX, por reacción, con 25 \mul de CaCl_{2} (25 mM) y 50 \mul de un cóctel sustrato/inhibidor. Para iniciar la reacción, se añadieron 125 \mul de la premezcla a la solución de anticuerpos monoclonales en placas microtituladas y se incubaron a 37ºC. Se leyó la absorbancia de las muestras a 405 nm y 490 nm en varios momentos (5 min a 2 horas) frente al blanco reactivo (25 ml de TBS en lugar de anticuerpos monoclonales) en un lector de placas microtituladas Labsystems iEMS Reader MF^{TM} utilizando el software GENESIS^{TM}.

En paralelo, se llevaron a cabo las mismas reacciones salvo que se añadieron 50 ng de FIXa humano por reacción. En el caso del FIX bovino, los anticuerpos que mostraban actividad procoagulante no tenían actividad cromogénica, pero cuando el FIXa humano estaba presente, sí mostraban alta actividad.

La Fig. 11 muestra el transcurso de tiempo de la actividad de tipo FVIII mostrada por los anticuerpos monoclonales 198/A1, 198/B1 y 198/AP1 con (+) y sin (-) adición de 50 ng de FIXa\beta humano. Como control, se utilizó IgG de ratón policlonal no específico. Los anticuerpos 198/A1 y 198/B1 muestran actividad procoagulante (similar a la de 193/AD3 en el Ejemplo 6) mientras que el anticuerpo 198/AP1 no. El anticuerpo 198/BB1 tenía el mismo patrón de actividad (datos no mostrados).

Entre otros anticuerpos monoclonales seleccionados del experimento de fusión 198 se incluyen: 198/D1 (Nº ECACC 99121616), 198/T2 (Nº ECACC 99121617), 198/G2 (Nº ECACC 9912118), 198/U2 (Nº ECACC 99121620).

Ejemplo 10 Estructura y actividad procoagulante de derivados de anticuerpos derivados de anticuerpos anti-FIX/FIXa; subclonación de dominios variables de anticuerpos a partir de las líneas celulares de hibridoma 193/AD3, 193/K2, 198/A1 y 198/B1 (clon AB2)

Procedimiento de clonación: se preparó ARN mensajero a partir de 1x10^{6} células de hibridoma de la línea celular respectiva (o 193/AD3, 193/K2, 198/A1 o 198/B1 (clon AB2)) utilizando el "kit de purificación de ARNm Micro QickPrep®" (Pharmacia) según las instrucciones del fabricante. Se obtuvo el correspondiente ADNc por retro-transcripción del ARNm utilizando el kit de síntesis "Ready-To-Go-You-Prime-First-Strand Beads" (Pharmacia) según las instrucciones del fabricante. Las secuencias codificadoras de cadenas pesada y ligera se convirtieron en el ADNc correspondiente empleando una serie de cebadores. Para invertir la transcripción del ARNm específico de cadena pesada (VH), se utilizó una mezcla equimolar de oligonucleótidos MOCG1-2FOR (5' CTC AAT TTT CTT GTC CAC CTT GGT GC 3') (SEQ ID NO 1), MOCG3FOR (5' CTC GAT TCT CTT GAT CAA CTC AGT CT 3') (SEQ ID NO 2) y MOCMFOR (5' TGG AAT GGG CAC ATG CAG ATC TCT 3') (SEQ ID NO 3) (RTmix1). En el mismo tubo de reacción se sintetizó ADNc específico de cadena ligera (VL) utilizando el cebador MOCKFOR- (5' CTC ATT CCT GTT GAA GCT CTT GAC 3') (SEQ ID NO 4).

Se amplificaron las secuencias codificadoras de VH por PCR utilizando los cebadores representados en la Fig. 12 y el ADNc específico derivado de la mezcla de transcripción inversa (RTmix1) descrita arriba como molde. Se amplificaron los genes de la cadena VK utilizando los cebadores representados en la Fig. 13 y empleando también RTmix1 como molde. Se separó el producto VH-PCR con SfiI-AscI y se insertó en el vector digerido SfiI-AscI pDAP2 (Nº de acceso al Banco de Genes: U35316). Se designaron los constructos pDAP2-VH así obtenidos como: pDAP2-193AD3/VH, pDAP2-198A1/VH, pDAP2-198AB2/VH (derivados del anticuerpo 198/B1) y pDAP2-193/K2/VH, respectivamente. Posteriormente se separaron los plásmidos con AscI-NotI y se insertó el producto PCR del gen VK digerido AscI-NotI correspondiente. Se designó a los vectores resultantes de la siguiente manera: pDAP2-193AD3scFv pDAP2-198/A1scFv, pDAP2-198AB2scFv (derivados del anticuerpo 198/B1) y pDAP2-193/K2scFv y se codificó el gen VH y el gen VL de los anticuerpos monoclonales 193/AD3, 198/A1, 198AB2 (derivados del anticuerpo 198/B1) y 193/K2. Las cadenas pesada y ligera se unen por la secuencia codificadora en una unión flexible artificial (G_{4}SGGRASG_{4}S; Engelhardt y col., 1994), permitiendo la expresión de la variante scFv del anticuerpo respectivo.

En la Fig. 14 están representados el ADN y la secuencia de proteínas deducidas del scFv derivado de la línea celular de hibridoma 193/AD3. Los nucleótidos 1 a 357 codifican el dominio variable de la cadena pesada, los nucleótidos 358 a 402 codifican la unión flexible artificial y los nucleótidos 403 a 726 codifican la región variable de la cadena ligera. La secuencia de proteínas de la región CDR3 de la cadena pesada tiene la secuencia YGNSPKGFAY (SEQ ID NO 5) y aparece en letras negritas. Se muestra la secuencia de unión artificial (G_{4}SGGRASG_{4}S).

En la Fig. 15 se muestra el ADN y la secuencia de proteínas deducidas del scFv derivado de la línea celular de hibridoma 193/K2. Los nucleótidos 1 a 363 codifican el dominio variable de la cadena pesada, los nucleótidos 364 a 408 codifican la unión flexible artificial y los nucleótidos 409 a 747 codifican la región variable de la cadena ligera. La secuencia de proteínas de la región CDR3 de la cadena pesada tiene la secuencia DGGHGYGSSFDY (SEQ ID NO 6) y aparece en letras negritas. Se muestra la secuencia de unión artificial (G_{4}SGGRASG_{4}S).

En la Fig. 16 están representados el ADN y la secuencia de proteínas deducidas del scFv derivado de la línea celular de hibridoma 198/AB2. Los nucleótidos 1 a 366 codifican el dominio variable de la cadena pesada, los nucleótidos 367 a 411 codifican la unión flexible artificial y los nucleótidos 412 a 747 codifican la región variable de la cadena ligera. La secuencia de proteínas de la región CDR3 de la cadena pesada tiene la secuencia EGGGFTVNWYFDV (SEQ ID NO 7) y aparece en letras negritas. Se muestra la secuencia de unión artificial (G_{4}SGGRASG_{4}S).

En la Fig. 17 están representados el ADN y la secuencia de proteínas deducidas del scFv derivado de la línea celular de hibridoma 198/A1. Los nucleótidos 1 a 366 codifican el dominio variable de la cadena pesada, los nucleótidos 367 a 411 codifican la unión flexible artificial y los nucleótidos 412 a 747 codifican la región variable de la cadena ligera. La secuencia de proteínas de la región CDR3 de la cadena pesada tiene la secuencia EGGGYYVNWYFDV (SEQ ID NO 8) y aparece en letras negritas. Se muestra la secuencia de unión artificial (G_{4}SGGRASG_{4}S).

Ejemplo 11 Actividad procoagulante de los péptidos derivados de las regiones CDR3 de los anticuerpos anti-FIX/FIXa

En principio, se puede ver la molécula anticuerpo como un mecanismo biológico para la presentación de una red combinatoria de elementos peptídicos en un espacio tridimensional (véase Gao y col., 1999, PNAS, 96:6025). Por tanto, un anticuerpo (o un derivado de anticuerpo, por ejemplo scFv, Fab, etc...) se puede utilizar tanto como herramienta para la detección de dominios importantes desde el punto de vista funcional de una proteína diana específica, como por otra parte, para la delineación de secuencias de aminoácidos que median de manera específica determinadas interacciones, es decir que activan o mejoran la actividad de FIXa hacia el sustrato fisiológico FX. Este último procedimiento ha llevado a evaluar a algunas regiones CDR3 de cadenas pesadas (CDR3_{H}) derivadas de las secuencias peptídicas como agentes intensificadores.

La intensificación de la actividad procoagulante de los péptidos que muestran dicha actividad se puede lograr mediante la variación de la secuencia dentro de las regiones del péptido decisivas para mediar el aumento de la actividad de FIXa. Como posible paso hacia secuencias de péptidos con mayor actividad procoagulante, se mapea el sitio de unión de un anticuerpo, es decir 198/A1 o 198/B1, en la molécula de FIXa empleando un análisis de comparación de secuencias, ensayos de unión competitiva, análisis Western blot y análisis ELISA competitivos. Puesto que se conoce la estructura cristalina del FIX, posteriormente se utiliza un modelo molecular para mejorar el ajuste de, por ejemplo, los péptidos derivados de 198/B1 en el sitio de unión 198/B1 del FIXa humano.

Por otra parte, el análisis mutacional metódico de una secuencia peptídica dada, por ejemplo secuencias peptídicas derivadas de CDR3_{H} 198/A1 o 198/B1, por ejemplo mediante "análisis mutacional con examen de alanina" permite identificar residuos péptidos decisivos para la actividad procoagulante. Otra forma de mejorar la actividad de determinadas secuencias peptídicas es el uso de librerías peptídicas junto con un screening de alto rendimiento.

El sitio de unión al antígeno de un anticuerpo se obtiene de la yuxtaposición de las seis regiones determinantes complemento (CDRs) en el extremo N-terminal del dímero VL-HL (o región Fv). La contribución de un único CDR a la especificidad del anticuerpo para un antígeno dado puede variar de manera considerable, pero, en general, se piensa que la región CDR3 de la cadena pesada (CDR3_{H}) tiene especial influencia; es decir, la secuencia de proteínas particulares de la región CDR3_{H} puede tener mucha importancia en el reconocimiento del antígeno. Se ha descrito que la longitud de las regiones CDR3_{H} varía considerablemente y está comprendida entre 4-25 aminoácidos (Borrebaeck, p.: 16).

A continuación se da un ejemplo de un análisis mutacional metódico de secuencias peptídicas. Para mejorar la solubilidad/eficacia procoagulante de los péptidos derivados de la región CD3 de los anticuerpos anti-FIX/FIXa, se cambiaron las secuencias de aminoácidos N-terminales así como C-terminales. Además, se construyó y analizó una serie de péptidos mutados. El principio de dicho estudio se ilustra mediante una serie de péptidos derivados de la región CDR3_{H} de los anticuerpos 198/A1 y 198/B1. El péptido original A1 (véase la Tabla 2) se deriva de la región CDR3_{H} del anticuerpo 198/A1 y el péptido B1 se deriva de la región CDR3_{H} del anticuerpo 198/B1, respectivamente (véase el Ejemplo 10, Fig. 16 y 17). El término "versión desordenada" significa que un péptido tiene los mismos aminoácidos pero en un orden aleatorio.

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TABLA 2 Lista de una serie de péptidos derivados del anticuerpo 198/A1

2

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Tabla 2

Se muestra la longitud del péptido (aa, aminoácidos #), el peso molecular calculado (PM, en Dalton (D)) y el punto isoeléctrico estadístico (pI). D-Arg se abrevia como Rd.

En una primera serie de experimentos, mejoramos la solubilidad de la secuencia peptídica CDR3_{H} original (A1; EGGGYYVNWYFDV) eliminando el residuo Val C-terminal y añadiendo varios residuos cargados en el extremo N-terminal y C-terminal del péptido. Los residuos resultantes, A1/2 (pI ácido), A1/3 (pI básico) y sus respectivas versiones desordenadas A1/4, A1/5 y A1/3scr3 eran fácilmente solubles en varios sistemas tampón a pH fisiológico.

Para analizar la actividad de tipo FVIII (activadora de FIXa) de los péptidos se desarrolló un sistema de ensayo basado en un ensayo FVIII ya comercializado (véanse los Ejemplos 2 y 4). El principio básico es que, sin cofactor, el FIXa tendrá una actividad muy limitada hacia su sustrato natural FX. Solamente en presencia de un sustrato que tiene propiedades de activación del FIXa, es decir FVIII o una sustancia que muestra actividad de tipo FVIII, se produce una cantidad considerable de FXa por disociación del factor FX a través del complejo activador/FIXa. La cantidad de FXa generada es controlada por disociación de un sustrato cromogénico. En la Tabla 2 se describe el principio del ensayo cromogénico revisado para dos péptidos representativos: A1/3 y A1/5. Brevemente: se transfirieron 25 \mul de alícuotas de una solución peptídica madre (en un tampón imidazol (IZ), 50 mM de imidazol, 100 mM NaCl, pH 7,2) a pocillos de placas microtituladas y se calentaron a 37ºC. Se reconstituyeron en agua esterilizada el sustrato FXa cromogénico (S-2222), el inhibidor de la trombina sintético (I-2581), factor FIXa bovino y factor FX bovino y se mezcló el FIXa/FX con fosfolípidos según el protocolo del proveedor.

Puesto que los péptidos no reaccionan con el FIXa bovino (que viene mezclado con FX bovino en el kit de ensayo), se añadieron 2,9 nM (en la mayoría de los casos 2,3 nM) de FIXa humano (ERL) (véase el Ejemplo 11, Fig. 19). Se combinaron 50 \mul de una solución de fosfolípidos/FIXa/FX, por reacción, con 25 \mul de CaCl_{2} (25 mM) y 50 \mul de un cóctel sustrato/inhibidor. Para iniciar la reacción, se añadieron 125 \mul de premezcla a la solución peptídica en placas microtituladas y se incubaron a 37ºC. Se leyó la absorbancia de las muestras a 405 nm y 490 nm en varios momentos (5 min a 2 horas) frente al blanco reactivo en un lector de placas microtituladas Labsystems iEMS Reader MF^{TM} utilizando el software GENESIS^{TM}. En el Ejemplo 11, Fig. 18, se muestra el resultado de este experimento. El péptido A1/3 indujoo una generación de FXa fácilmente cuantificable en presencia de 2,9 nM de FIXa humano, mientras que la versión desordenada de A1/5 permaneció inactiva. Además, el péptido ácido A1/2 así como las versiones desordenadas de A1/4 y A1/3-scr3 no dieron una actividad cromogénica significativa cuando ésta se analizó bajo condiciones comparables (datos no mostrados). Para probar que el péptido A1/3 al igual que el anticuerpo parental 198/A1 no reacciona con los FIXa y FX bovinos, se llevó a cabo el experimento mostrado en la Fig. l9. Se incubó el péptido A1/3 como se describe arriba con A1/3 (24 \muM), +hFIXa y sin A1/3 (24 \muM), sin hFIXa, 2,3 nM de FIXa humano (hFIXa). En un experimento control, añadimos una solución tampón pura (IZ) suplementada con 2,3 nM de hFIXa a la mezcla de reacción. Como muestra la Fig. 19, la reacción únicamente tiene lugar en presencia de FIXa humano.

La Fig. 18 prueba la actividad cromogénica de tipo FVIII del péptido A1/3 en presencia de 2,9 nM de FIXa humano (hFIXa). La versión desordenada del péptido A1/3, el péptido A1/5, no genera FXa. La Fig. 19 prueba la dependencia de la actividad cromogénica de tipo FVIII del péptido A1/3 en presencia de FIXa humano (hFIXa). En ausencia de FIXa, el péptido A1/3 no da lugar a ninguna generación de FXa. El tampón control, tampón de imidazol puro, se designa IZ.

También se analizó la posibilidad de que los péptidos redujeran el tiempo de coagulación en un plasma deficitario en FVIII. Se llevó a cabo el ensayo de factor de coagulación en una fase basado en la prueba APTT básicamente como se describe en el Ejemplo 6. Los tiempos de coagulación (el tiempo desde el inicio de la reacción hasta la formación del "coágulo") se comparó con el del factor FVIII, con un tampón control (IZ) o con un péptido control (versión desordenada). En las Tablas 3A y 3B se muestran los resultados de dos experimentos típicos hechos con dos reactivos APTT diferentes (DAPTTIN y Pathromtin SL).

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 3A Actividad de coagulación de los péptidos A1/3 y A1/3-scr (versión desordenada de A1/3) en plasma deficitario en FVIII en presencia o ausencia (sin) de FIXa humano 2,2 nM

4

Tabla 3A

Se muestran dos experimentos representativos independientes (el experimento 1 y el experimento 2). Todos los experimentos de coagulación se realizan por duplicado. Se dan los tiempos de coagulación de los experimentos individuales y el tiempo medio de coagulación en segundos. Los experimentos mostrados en la tabla 3A se han realizado empleando el reactivo APTT DAPTTIN (Baxter Hyland Immuno).

En comparación con el tampón control (IZ, tampón imidazol), el péptido A1/3 dió lugar a una disminución dosis-dependiente del tiempo de coagulación. La disminución del tiempo de coagulación dependiente de la dosis resultó mucho más acusada con la adición de FIX humano 2,2 nM a la mezcla de reacción. La versión desordenada de los péptidos A1/3, A1/3-scr no mostró ninguna disminución del tiempo de coagulación. De hecho, a concentraciones superiores a 2,5 \muM, el péptido desordenado se hizo inhibidor y, por tanto, prolongó el tiempo de coagulación. Los péptidos A1/1, A/1/2, A1/4 y A/15 no disminuyeron el tiempo de coagulación, lo que indica que carecen de actividad procoagulante (datos no mostrados).

TABLA 3B Actividad de coagulación del péptido A1/3 en plasma deficitario en FVIII cuando se utiliza Pathromtin SL (DADE Nehring) como reactivo APTT

5

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Tabla 3B

Los experimentos se realizaron por duplicado en presencia o ausencia (sin) de FIXa humano 2,2 nM. Se dan los tiempos de coagulación de los experimentos individuales y el tiempo medio de coagulación en segundos. Se incluyeron factor VIII y tampón imidazol (IZ) como control positivo y negativo, respectivamente.

A diferencia de los experimentos mostrados en la Tabla 3A, los experimentos mostrados en la Tabla 3B se realizan empleando el reactivo APTT Pathromtin SL. En presencia de FIXa, el péptido A1/3 dió lugar a una disminución dosis-dependiente del tiempo de coagulación, mientras que en ausencia de FIXa no se detectó ninguna disminución del tiempo de coagulación.

En otra serie de experimentos, nos dispusimos a mejorar la estabilidad en plasma (protección, por ejemplo, frente a la degradación proteolítica) del péptido A1/3. Un método fue sustituir los residuos L-Arg N-terminal y C-terminal por residuos D-Arg (ejemplificada por los péptidos A1/3-rd y A1/3-Rd-srmb). Luego se analizaron los péptidos A1/3-rd y A1/3-Rd-srmb (versión desordenada del péptido) en un ensayo cromogénico así como en un ensayo de factores de coagulación basados en la prueba APTT. Estos experimentos pusieron de manifiesto que el intercambio de residuos L-Arg terminales por residuos D-Arg no modificaba la actividad de tipo FVIII, como se vió en el ensayo cromogénico, lo que indica que la quiralidad de los residuos Arg no desempeña un papel importante en la actividad cromogénica (Fig. 20). Además, la actividad de los factores coagulación en una fase basados en la prueba APTT, aunque disminuida en cierta medida, seguía fácilmente detectable (Tabla 4).

TABLA 4 Actividad de los factores coagulación en una fase de los péptidos A1/3, A1/3-Rd y A1/3-Rd-srmb (para las secuencias véase la Tabla 2). IZ, tampón control

6

La Fig. 20 prueba la actividad cromogénica no modificada del péptido A1/3-Rd. Se incubaron péptidos a una concentración final de 12 \muM o el tampón control (IZ) en presencia de FIXa humano (+) 2,3 nM. Se vió que la actividad el péptido A1/3 y A1/Rd estaba prácticamente sin modificar, dando idénticos resultados en el ensayo cromogénico. La versión desordenada de los péptidos A1/3, A1/5, así como la solución tampón, no dieron lugar a ninguna generación significativa de FXa.

En la siguiente serie de experimentos, nos dispusimos a determinar el papel individual de cualquier aminoácido de la secuencia peptídica central sustituyendo cada residuo por el aminoácido Alanina (Tabla 5).

TABLA 5

7

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Tabla 5

Se enumeran los péptidos diseñados para elucidar el papel de cualquier aminoácido sencillo dentro de la secuencia peptídica central (E_{1}G_{2}G_{3}G_{4}Y_{5}Y_{6}V_{7}N_{8}W_{9}Y_{10}F_{11}D_{12}). Los números más bajos describen la posición del aminoácido dentro del péptido. La alanina, aminoácido pequeño no cargado, fue sustituida por cada aminoácido ("barrido de alaninas"). También se enumeran las longitudes de los péptidos (aminoácidos #), los pesos moleculares calculados (PW, en Dalton (D)) y los puntos isoeléctricos estadísticos (pI).

Se disolvió cada uno de los péptidos por separado en un tampón imidazol (50 mM imidazol, 100 mM NaCl, pH 7,2) y posteriormente se diluyeron en un tampón de coagulación (50 mM imidazol, 100 mM NaCl, 1% de albúmina humana, pH 4) hasta que se obtuvo la concentración final deseada. Se analizaron los péptidos para ver su actividad cromogénica, así como su posibilidad de reducir el tiempo de coagulación en un plasma deficitario en FVIII. El ensayo de coagulación en una fase se realizó básicamente como se describe en el Ejemplo 6. Los tiempos de coagulación (el tiempo desde el inicio de la reacción hasta la formación del "coágulo") se comparó con el control tampón o con un péptido control (versión desordenada).

Se dan algunos de los resultados del "barrido de alaninas" para los péptidos A1/3-2 y A1/3-3. El cambio de G_{3}-A_{3} pone de manifiesto la alta actividad cromogénica del péptido A1/3-2 y la fuerte reducción del tiempo de coagulación en una fase (34 segundos a una concentración de 12,5 \muM) en presencia de 2,2 nM de FIXa. El péptido A1/3-3 (G_{4}-A_{4}) muestra una actividad cromogénica óptima a una concentración final de aproximadamente 12 \muM con un descenso de la actividad a concentraciones altas o bajas. El péptido es, en cierto modo, inhibidor en un ensayo de coagulación en una fase a concentraciones altas (12,5 \muM) en ausencia de FIXa, pero se hace muy activo en presencia de 2,2 nM de FIXa (31 segundos, 12,5 \muM).

En la siguiente serie de experimentos, nos dispusimos a determinar el papel individual de cualquier aminoácido de la secuencia peptídica central sustituyendo cada residuo central por aminoácido ácido glutámico (E) (véase la

\hbox{Tabla
6).}

TABLA 6

9

Tabla 6

Se enumeran los péptidos diseñados para elucidar el papel de cualquier aminoácido sencillo dentro de la secuencia peptídica central (E_{1}G_{2}G_{3}G_{4}Y_{5}Y_{6}V_{7}N_{8}W_{9}Y_{10}F_{11}D_{12}). Los números más bajos describen la posición del aminoácido dentro del péptido. El ácido glutámico, aminoácido grande cargado negativamente, fue sustituido por cada aminoácido de la secuencia central ("barrido de ácido glutámico"). También se enumeran las longitudes de los péptidos (aminoácidos #), los pesos moleculares calculados (MW, en Dalton (D), y los puntos isoeléctricos estadísticos (pI).

Se disolvió cada uno de los péptidos por separado en un tampón imidazol (50 mM imidazol, 100 mM NaCl, pH 7,2) y posteriormente se diluyeron en un tampón de coagulación (50 mM imidazol, 100 mM NaCl, 1% de albúmina humana, pH 4) hasta que se obtuvo la concentración final deseada. Se analizaron los péptidos derivados del "barrido de ácido glutámico" para ver su actividad de tipo FVIII cromogénica, así como su posibilidad de reducir el tiempo de coagulación en un plasma deficitario en FVIII. El ensayo de coagulación en una fase se realizó básicamente como se describe en el Ejemplo 6.

El péptido A1/3-24 mostró algunas propiedades interesantes. La molécula presentaba una alta actividad cromogénica tipo FVIII a concentraciones comprendidas entre 6,5 \muM - 12 \muM, pero perdía actividad a concentraciones mayores (de hasta 24 \muM). El péptido no tenía actividad procoagulante en ausencia de FIXAa humano, pero era muy activo en presencia de 2,2 nM de hFIXa.

En una segunda serie de experimentos, no dispusimos a mejorar la actividad procoagulante de la secuencia peptídica B1 derivada del anticuerpo 198/B1 CDR3H. En un primer paso, mejoramos la solubilidad de la secuencia peptídica original (B1; EGGGFTVNWYFDV) eliminando el residuo Val C-terminal y añadiendo varios residuos cargados en los extremos N-terminal y C-terminal del péptido. Los péptidos resultantes B1/4, B1/6 (pI ácido), B1/7 (pI ácido) y sus versiones desordenadas B1/5, B1/7scr3 son fácilmente solubles en diversos sistemas tampón a pH fisiológico.

TABLA 7 Lista de una serie de péptidos derivados del anticuerpo 198/B1

10

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Tabla 7

Se cita la longitud del péptido (aa, aminoácidos #), el peso molecular calculado (PM, en Dalton (D) y el punto isoeléctrico estadístico (pI).

Los péptidos B1/4 y B1/5 eran solubles en 50 mM Tris, 100 mM de NaCl, pH= 6,5. Se analizaron ambos péptidos en un ensayo FVIII cromogénico y se vió que el péptido B1/4, pero no la versión desordenada B1/5, tenía cierta actividad cromogénica (datos no mostrados).

Posteriormente se analizaron los péptidos B1/6, B1/7 y B1/7scr3. Se disolvió cada uno de los péptidos por separado en 50 mM imidazol, 100 mM NaCl, pH 7,2, y luego se diluyeron en un tampón de coagulación (50 mM imidazol, 100 mM NaCl, 1% albúmina humana, pH 4) o en un tampón imidazol, hasta que se obtuvo la concentración final deseada. Se analizaron los péptidos para ver su actividad cromogénica, así como su posibilidad de reducir el tiempo de coagulación en un plasma deficitario en FVIII (Tablas 8 y 9). El ensayo de coagulación en una fase se realizó básicamente como se describe en el Ejemplo 6. Los tiempos de coagulación (el tiempo desde el inicio de la reacción hasta la formación del "coágulo") se comparó con un control tampón o con un péptido control (versión desordenada).

Primero se midió la actividad activadora de FIXa (actividad tipo cofactor FVIII) del péptido B1/7 en el ensayo cromogénico descrito arriba.

Como muestra la Fig. 21, la adición del péptido B1/7 2,4 \muM a la mezcla de reacción llevó a una generación muy notable de FXa. Por el contrario, la adición de Pefabloc Xa 35 \muM inhibidor específico de la actividad de la proteasa FXa dio lugar a una disminución significativa de la reacción de disociación del sustrato cromogénico (Fig. 22), probando, por tanto, que en realidad existía generación de FXa mediada por el péptido-FIXa. Si no se añadía FIXa y FX a la mezcla de reacción, no se sintetizaba FXa (Fig. 22). El péptido B1/6 y los péptidos control B1/5 y B1/7scr3 no mostraron ninguna actividad (datos no mostrados).

La Fig. 21 prueba la actividad cromogénica del péptido B1/7. El péptido, a una concentración total de 2,4 \muM, o el control tampón (IZ) se incubaron en presencia de FIXa humano 2,3 nM.

En la Fig. 22, el péptido B1/7, a una concentración final de 2,4 \muM, o el control tampón (IZ) se incubaron en presencia de FIXa humano 2,3 nM (indicado como: "+2,3 nM hFIXa" o "+"). Se vió que la actividad cromogénica del péptido B1/7 dependía de la presencia de FIXa y FX, puesto que no se detecta ninguna reacción cuando se deja FIXa y FX fuera de la reacción (sin FIXa/FX). Para demostrar que el péptido B1/7, en efecto, media la generación de FXa, se añadió inhibidor de la proteasa específica FXa, Pefabloc Xa, a la mezcla de reacción (Pefabloc Xa 35 \muM).

En una segunda serie de experimentos, se analizó el efecto procoagulante de los péptidos B1/6, B1/7 y B1/7scr3 en un ensayo de coagulación en una fase basado en la prueba APTT. Los experimentos se realizaron básicamente como se describe en el Ejemplo 6. Los resultados se muestran en las Tablas 8 y 9.

TABLA 8

12

Tabla 8

Se incubó plasma deficitario en FVIII con los péptidos B1/6, B1/7scr3 o B1/7 en ausencia de FIX humano activado. Como control negativo, se añadió un tampón puro al plasma deficitario. Se dan los tiempos de coagulación de las diferentes combinaciones. Bajo estas condiciones, el péptido B1/7 en su concentración más alta (12,5 \muM) se convierte en inhibidor del procedimiento de coagulación, como indica el prolongado tiempo de coagulación de 157 segundos.

TABLA 9

13

Tabla 9

Se incubó plasma deficitario en FVIII con los péptidos B1/6, B1/7scr3 o B1/7 en presencia de FIX humano activado. Como control negativo, se añadió un tampón puro al plasma deficitario. Se dan los tiempos de coagulación de las diferentes combinaciones. En presencia de FIXa, el péptido B1/7 se convierte en procoagulante, como indica el reducido tiempo de coagulación (83 segundos en comparación con los 102 segundos del péptido desordenado y los 100 segundos del tampón control).

Ejemplo 12 Actividad procoagulante de los derivados peptídicos obtenidos de las regiones CDR3 de los anticuerpos anti-FIX/FIXa en plasma inhibidor de FVIII

Con el fin de demostrar la actividad procoagulante del péptido A1/3 en plasma inhibidor de FVIII, se llevó a cabo el siguiente experimento. Realizamos un ensayo estándar de factor de coagulación en una fase basado en la prueba APTT, pero en lugar de emplear plasma deficitario en FVIII empleamos plasma inhibidor de FVIII. La potencia inhibidora del plasma fue de 8,1 Unidades Bethesda por ml.

TABLA 10

14

Tabla 10

Se añadieron diversas cantidades de péptido A1/3 (12,5 \muM-1,25 \muM) al plasma inhibidor de FVIII (o en presencia de FIXa 2,2 nM o en ausencia (sin) FIXa). Como control negativo, se añadió un tampón puro al plasma (IZ). Los experimentos se realizaron por duplicado y se calculó la media. Se muestran los tiempos de coagulación (en segundos) de las diferentes combinaciones. Como se puede apreciar, el péptido A1/3 reduce (dependiendo de la dosis) el tiempo de coagulación del plasma inhibidor FVIII en presencia de FIXa, pero, aunque en menor medida, también en ausencia de FIXa.

Ejemplo 13 Conversión del IgM 196/C4 en IgG1

Debido a que algunos anticuerpos IgM presentan una alta actividad de tipo FVIII en ensayos cromogénicos, se trató de convertir dichos anticuerpos IgM en anticuerpos IgG (a través de derivados de anticuerpos tales como Fab, F(ab)_{2}, scFv, etc..., que también se podrían producir). A continuación, se describe detalladamente el rescate de los genes de la región variable IgM. Primero se construyó el vector de expresión pBax-IgG1 (Fig. 23) a partir de los vectores pSI (Promega) y pEF/Bsd (Invitrogen) a través de múltiples etapas de clonación. Se purificaron los linfocitos-B del donante de sangre y el ARNm maduro de estas células utilizando un kit de purificación de ARNm (Pharmacia). Se preparó el ADNc de una cadena kappa humana y el de una cadena 1 gamma humana empleando el kit de síntesis de ADNc "you-primefirst-strand" utilizando cebadores específicos.

Se amplificó la secuencia codificadora de un dominio constante de una cadena ligera kappa humana del ADNc por PCR utilizando cebadores específicos.

Se amplificó el gen de una región constante de una cadena 1 gamma humana (CH1-hinge(bisagra)-CH2-CH3) del ADNc por PCR utilizando cebadores específicos.

El producto PCR del dominio constante de la cadena ligera fue digerido con XbaI y NheI e insertado en pSI digerido. El vector resultante se separó con EcoRI y XbaI y se insertaron los oligonucleótidos fijados, dando lugar al vector pSI-Ckappa. Los oligonucleótidos fijados permitían al líder y a SacI-XbaI sitios de inserción de la región variable de la cadena kappa. El producto PCR de la región constante de la cadena 1 gamma humana se digirió con SpeI y BamHI y se insertó en pSI digerido. El vector resultante se separó con SpeI y NotI y se insertaron los oligonucleótidos fijados, dando lugar al vector pSI-Cgamma. Los oligonucleótidos fijados permitían al líder y a XhoI-BstEI sitios de inserción de la región variable de la cadena pesada. El vector pEF/Bsd se digirió con NheI y SfiI, se enromó por tratamiento Klenow y se insertó todo el cassette de expresión de pSI-Ckappa, eliminado con BglII y BamH1 (después de ser tratado con Klenow). El vector resultante se digirió con EcoRI y HindIII y se trató con Klenow. Se excindió todo el cassette de expresión de pSI-Cgamma con BglII y BamH1 y se insertó (después de ser tratado con Klenow). Al vector resultante se le denomina pBax-IgG1.

La región variable de la cadena ligera puede ser insertada entre los sitios SacI-XbaI, generando la secuencia codificadora completa de una cadena ligera kappa. La región variable de la cadena pesada puede ser clonada entre los sitios XhoI-BstEI, dando lugar a un gen de la cadena pesada IgG1 completa. Ambos marcos de lectura abiertos son expresados bajo el control del promotor-SV40 y contienen la secuencia codificadora de un péptido señal en el extremo 5' de los genes para la secreción de las cadenas pesada y ligera en el retículo endoplasmático. La transfección en células COS permite la expresión de un IgG1 con las mismas propiedades de unión que el IgM parental. Más adelante se llevó a cabo la construcción del plásmido pBax-196/C4 amplificando el VH del scFv 196/C4 (subclonado como se escribe en el Experimento 10), por PCR, utilizando cebadores específicos. El producto PCR se digirió con XhoI y BstEII y se insertó en IgG1 pBax digerido con XhoI y BstEII. El VL del scFv 196/C4 se amplificó por PCR utilizando cebadores específicos. El producto PCR se digirió con SacI y XbaI y se insertó en IgG1-VH pBax digerido con SacI y XbaI. El vector resultante (pBax-196/C4) se transfectó en células COS por electroporación, expresándose moléculas IgG1 híbridas (región variable murina y región constante humana) con la misma especificidad del IgM parental.

Ejemplo 14 Activación de la actividad amidolítica de FIXa por anticuerpos anti-FIXa

Brevemente: se incubaron 20 \mul de factor IXa (que contenía 200 mU de FIXa (Stago)) a 37ºC con 200 \mul de un tampón de reacción (50 mM Tris HCl, pH 7,4, 100 mM NaCl, 5 mM CaCl_{2} y 40% etilenglicol), 25 \mul de sustrato FIXa (CH_{3}SO_{2}-D-CHG-Gly-Arg-pNA, AcOH 10 \muM/ml, Pentapharm LTD) en ausencia o presencia de diversas cantidades de anticuerpos anti-FIX 198/B1 (isotipo IgG) o 196/AF1 (isotipo IgM). Se controló la disociación específica de un sustrato FIXa a 405 nm en un lector ELISA. La presencia de anticuerpos anti-FIX mejoró la actividad amidolítica de FIXa al menos en dos.

La Fig. 24 muestra el incremento de la actividad amidolítica de FIXa en presencia del anticuerpo 198/B1 (Fig. 24A) y del anticuerpo 198/AF1 (Fig. 24B).

Ejemplo 15 Actividad de tipo FVIII mostrada por fragmentos Fab derivados de anticuerpos anti-FIX/FIXa

Se prepararon fragmentos Fab de anticuerpos anti-FIX/FIXa y se purificaron según los protocolos estándar. Brevemente: se incubó 1 ml de anticuerpo 198/A1 (4 mg/ml en imidazol 50 mM, 100 mM NaCl, pH 7,4) durante toda la noche con 87 \mul de un tampón de fragmentación (1M acetato de sodio, 10 mM EDTA, 67,5 mg/ml de L-cisteína) y 0,25 mg de papaína (inmovilizada en perlas de agarosa), a 37ºC. Se filtró el preparado para eliminar la papaína. Se añadió L-histidina (en una concentración final de 50 mM) y después se ajustó el pH a 7,0. Por último, se añadió NaCl sólido hasta una concentración final de 1M.

Posteriormente, se purificó el fragmento Fab 198/A1 uniéndolo a la proteína L: utilizamos PROTEIN L Plus inmovilizada con ImmunoPure (Pierce) en una columna 16/20 XK PHARMACIA (volumen de gel: 2 ml). Las soluciones tampón cromatográficas eran: 1) tampón de equilibrio: 50 mM L-histidina, pH 7,0; 1M NaCl; 0,1% (p/v) NaN_{3}; 2) tampón de lavado: 50 mM L-Histidina, pH 7,0, 0,1% (p/v) NaN_{3}; 3) tampón de elución: 100 mM glicina, pH 2,5, 0,1% (p/v) NaN_{3}, y 4) tampón de neutralización: 2M Tris/Cl, pH 8,0.

La cromatografía se efectuó básicamente siguiendo los pasos 1 a 7 descritos en la Tabla 11. Para neutralizar el bajo pH de la solución tampón de elución, se precargaron tubos de fracción con 0,2 ml de 2M Tris, pH 8,0.

TABLA 11

15

Se dializó el preparado Fab 198/A1 final frente a imidazol 50 mM, 100 mM NaCl, pH 7,4 y se analizó en un ensayo FVIII cromogénico como el descrito arriba (Fig. 25). En comparación con un anticuerpo intacto, el fragmento Fab 198/A1 tiene, en cierto modo, menor actividad, el fragmento Fab aún así da lugar a una generación de FXa dependiente de FIX. La Fig. 25 evidencia la actividad de tipo FVIII cromogénica del fragmento Fab del anticuerpo 198/A1 en presencia de FIXa humano 2,3 nM. Como control positivo utilizamos el anticuerpo intacto 198/A1 y FVIII 7,5 pM. Como control negativo, se utilizó un tampón control (IZ) en lugar del fragmento Fab 198/A1 o FVIII.

Ejemplo 16 Actividad tipo FVIII mostrada por proteínas de fusión entre fragmentos scFv de anticuerpos anti-FIX/FIXa y fosfatasa alcalina de E. coli

Se fusionó el fragmento Fv de cadena sencilla (véase el Ejemplo 10) del anticuerpo 198/B1 (subclón AB2) al extremo N de la fosfatasa alcalina de E. coli empleando el sistema de vectores pDAP2 (Kerschbaumer y col., 1996). Se aislaron dos clones idénticos y se les denominó pDAP2-198AB2#1 y pDAP2-198AB2#100 (Fig. 26). Las proteínas de fusión resultantes se expresaron en E. coli, se purificaron por cromatografía de afinidad metálica (Kerschbaumer y col. 1997) y se analizaron en un ensayo cromogénico estándar (Fig. 27).

La Fig. 27 evidencia la actividad de tipo FVIII de dos proteínas de fusión con la fosfatasa alcalina del fragmento scFv del anticuerpo 198/B1 (subclón AB2) (198AB2#1 y 198AB2#100) en presencia de FIXa humano 2,3 nM. Como control positivo utilizamos FVIII 7,5 pM.

Ejemplo 17 Actividad tipo FVIII mostrada por un minianticuerpo bivalente

A fin de obtener un minianticuerpo bivalente, se fusionó el fragmento scFv del anticuerpo 198/B1 (subclón AB2) con una estructura helicoidal anfipática empleando el sistema de vectores pZip1 (Kerschbaumer y col., Analytical Biochemistry 249, 219-227, 1997). Brevemente: Se aisló el gen del fragmento scFv 198/B1 del plásmido pDAP-198AB2#100 (Ejemplo 16) por digestión con SfiI y NotI. Se purificó en gel el fragmento de ADN y se insertó en el vector digerido con SfiI/NotI pZip1. Se secuenció el plásmido resultante y se le denominó pZip-198AB#102 (Fig. 28). En paralelo construimos una versión del minianticuerpo a partir de un anticuerpo monoclonal irrelevante denominado #8860. En un primer paso, se unió el fragmento Fv de cadena sencilla del anticuerpo #8860 al vector pDAP2. La clonación se realizó básicamente como se describe en el Ejemplo 10. Se denominó al constructo pDAP2-8860scFv#11 (Fig. 29). La subclonación del fragmento scFv contenida dentro de pADP2-8860scFv#11 en el plásmido pZip1 (véase arriba) produjo el constructo de minianticuerpo p8860-Zip#1,2 (Fig. 30). Puesto que el anticuerpo #8860 no reacciona con FIX/FIXa (como se puede apreciar en el análisis Western blot y en el análisis ELISA), éste es un control negativo apropiado. Posteriormente, las proteínas del minianticuerpo fueron expresadas en E. coli y se purificaron de sobrenadantes bacterianos mediante unión a la la Proteína L conforme al siguiente protocolo: Para la cromatografía de afinidad utilizamos PROTEIN L Plus inmovilizada con ImmunoPure (Pierce) en una columna 16/20 XK PHARMACIA, que tenía un volumen de gel de 4 ml. Las soluciones tampón utilizadas fueron: tampón de equilibrio: 50 mM L-Histidina, pH 7,0, 1M NaCl, 0,1% (p/v) NaN_{3}; tampón de lavado: 50 mM L-Histidina, pH 7,0, 0,1% (p/v) NaN_{3}; tampón de elución: 100 mM glicina, pH 2,5, 0,1% (p/v) NaN_{3} y tampón de neutralización: 2 M Tris/Cl, pH 8,0.

Las muestras se prepararon de la siguiente manera: el sobrenadante del cultivo bacteriano se obtuvo por centrifugación del cultivo de expresión bacteriano (11.000g, 4ºC, 10 minutos). Se añadieron 470 g de sulfato amónico a 1 litro del sobrenadante y se agitó la solución en hielo durante 1 hora, hasta que precipitó la proteína. Se granuló el precipitado a 14.000g durante 35 minutos a 2ºC y se volvió a disolver en 100 ml de Tris 20 mM, pH 7,0. Posteriormente, se dializó el concentrado frente a Tris 20 mM, pH 7,0, se añadió L-Histidina en una concentración final de 50 mM y se ajustó el pH a 7,0. Por último, se añadió NaCl sólido hasta que se obtuvo una concentración final de 1M. Antes de cargarlo en la columna, se centrifugó una muestra a 16.000g durante 15 minutos a temperatura ambiente y luego se filtró a través de un filtro estéril de 0,45 \mum.

La cromatografía se efectuó básicamente siguiendo los pasos 1 a 7 descritos en la Tabla 12. Para neutralizar el bajo pH de la solución tampón de elución, se precargaron tubos de fracción con 0,2 ml de Tris 2M, pH 8,0.

TABLA 12

16

Se dializaron el preparado final de minianticuerpo (subclon AB2) 198/B1 (denominado 198AB-Zip#102) y el control negativo 8860-Zip#1,2 frente a imidazol 50 mM, 100 mM NaCl, pH 7,4 y se analizaron en un ensayo FVIII cromogénico como el descrito arriba (Fig. 31).

Como se puede ver en la Fig. 31, el constructo de minianticuerpo 198AB-Zip#102 da lugar a una generación considerable de FXa (comparar con FVIII), mientras que no es así con el minianticuerpo control negativo 8860-Zip#1,2.

La Fig. 31 prueba la actividad tipo FVIII cromogénica del minianticuerpo (subclón AB2) de 198/B1 198AB-Zip#102 en presencia de FIXa humano 2,3 nM. Como control positivo utilizamos FVIII 4,8 pM, mientras que un minianticuerpo no relacionado (8860-Zip#1,2) y un tampón de reacción puro (IZ) sirvieron de control negativo.

Ejemplo 18 Actividad tipo FVIII mostrada por fragmentos scFv de anticuerpos anti-FIXa/FIX

El fragmento Fv de cadena sencilla del anticuerpo 198/B1 (subclón AB2) así como el fragmento scFv del anticuerpo #8860 fueron expresados empleando el sistema de vectores pMycHis6. El vector pMycHis6 se construyó (Fig. 32 y 33) disociando el vector pCOCK (Engelhardt y col., 1994, Biotechniques, 17: 44-46) con NotI y EcoRI e insertando los siguientes oligonucleótidos:

mychis6-co:
5'ggccgcagaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatggggcggcacatcaccatcaccatcactaataag 3'	(SEQ ID NO 49)

y

mychis-ic:
5'aattcttattagtgatggtgatggtgatgtgccgccccattcagatcctcttctgagatgagtttttgttctgc 3'	(SEQ ID NO 80).

La Fig. 32 muestra una representación esquemática del plásmido pMycHis6. La secuencia c-myc-tag se utiliza para detectar el fragmento scFv en un análisis Western blot o en un análisis ELISA (Evan y col., Mol. Cell. Biol., 1985, 5(12), pp.: 3610-6). La secuencia His6-tag se incluyó para facilitar la purificación de los fragmentos scFv por cromatografía de iones metálicos (Hochuli y col., 1988. Biotechnology, 6:1321-1325). El plásmido contiene el promotor del gen lacZ (PlacZ), la secuencia líder PelB (véase la leyenda de la Fig. 26), un origen de replicación de E. coli (colE1ori) y un origen de replicación bacteriófaga M13 (M13ori). Para permitir la selección específica, el plásmido también porta el gen de la enzima \beta-lactamasa (AmpR) que media la resistencia frente al antibiótico ampilicina.

El gen del 198/B1 (clon AB2)-scFv fue rescatado del plásmido pDAP2-198AB2#100 (Ejemplo 16) por digestión con SfiI y NotI y fue insertado en pMycHis6 disociado con SfiI/NotI. Se denominó al plásmido resultante pMycHis-198AB#102. La Fig. 34 muestra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de 198AB2 scFv (ligada a c-myc-tag e His6-tag): se denomina al ORF (marco de lectura abierto) resultante del vector de expresión pMycHis6-198AB#102. Se construyó el vector pMycHis6 disociando el vector pCOCK (Engelhardt y col., 1994, Biotechniques, 17:44-46, 1994) con NotI y EcoRI e insertando los siguientes oligonucleótidos fijados:

5'GGCCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATGGGGC
GGCACATCACCATCACCATCACTAATAAG3'	(SEQ ID NO 103)

y

5'TTATTAGTGATGGTGATGGTGATGTGCCGCCCCATTCAGATCCTCTT
CTGAGATGAGTTTTTGTTCTGC 3'	(SEQ ID NO 104).

El vector resultante, denominado pMycHis6, fue disociado con SfiI- NotI y el gen scFv 198AB2 fue convertido en este vector a partir del vector pDAP2-198AB#100.

Por analogía con el constructo 198AB2, el fragmento #8860 scFv fue clonado a partir del clon 11 de un plásmido denominado pDAP2-8860scFv. Se denominó a la proteína scFv pura de #8860 como 8860-M/H#4c (plásmido p8860-M/H#4c, Fig. 35). Las proteínas scFv fueron expresadas en E. coli y purificadas por afinidad de los sobrenadantes bacterianos en columnas de Proteína L (véase el Ejemplo17). Se dializaron los preparados finales MycHis-198AB2#102 y 8860-M/H#4c frente a imidazol, 100 mM NaCl, pH 7,4 y se analizaron en una ensayo FVIII cromogénico como se describe arriba (Fig. 36).

Como se puede ver en la Fig. 36, el constructo scFv MycHis-198AB#102 dio lugar a una generación considerable de FXa, mientras que los controles negativos 8860-M/H#4c y el tampón de reacción (IZ) no.

La Fig. 36 prueba la actividad tipo FVIII cromogénica del fragmento scFv (subclón AB2) 198/B1 (MycHis-198AB2#102) en presencia de FIXa humano 2,3 nM. Como control positivo utilizamos FVIII 4,8 pM, mientras que un scFv no relacionado (8860-M/H#4c) y un tampón de reacción puro (IZ) sirvieron como control negativo.

<110> Baxter AG

\hskip1.05cmSheiflinger, Friedrich

\hskip1.05cmKerschbaumer, Randolf

\hskip1.05cmFalkner, Falko-Guenter

\hskip1.05cmDorner, Friedrich

\vskip0.400000\baselineskip

<120>

\vskip0.400000\baselineskip

<130>

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.1

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\hskip1.05cm

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctcaattttc ttgtccacct tggtgc

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctcgattctc ttgatcaact cagtct

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggaatgggc acatgcagat ctct

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctcattcctg ttgaagctct tgac

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Gly Asn Ser Pro Lys Gly Phe Ala Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Gly Gly His Gly Tyr Gly Ser Ser Phe Asp Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Gly Gly Gly Phe Thr Val Asn Trp Tyr Phe Asp Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Gly Gly Gly Tyr Tyr Val Asn Trp Tyr Phe Asp Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Gly Gly Gly Tyr Tyr Val Asn Trp Tyr Phe Asp Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Tyr Gly Phe Gly Trp Gly Tyr Glu Val Asn Asp Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Glu Glu Glu Gly Gly Gly Tyr Tyr Val Asn Trp Tyr Phe Asp Glu}

\sac{Glu Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Arg Arg Glu Gly Gly Gly Tyr Tyr Val Asn Trp Tyr Phe Asp Arg}

\sac{Arg Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Tyr Gly Glu Gly Tyr Gly Glu Val Asn Glu Tyr Asp Glu Phe Glu}

\sac{Trp Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Arg Tyr Arg Asn Arg Tyr Arg Trp Gly Tyr Arg Gly Arg Phe Gly}

\sac{Asp Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Arg Arg Gly Glu Tyr Glu Val Tyr Trp Asn Gly Asp Phe Tyr Arg}

\sac{Arg Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región CDR3

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Arg Arg Glu Gly Gly Gly Tyr Tyr Val Asn Trp Tyr Phe Asp Arg}

\sac{Arg Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Arg Arg Gly Glu Tyr Gly Val Tyr Trp Asn Gly Asp Phe Tyr Arg}

\sac{Arg Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Arg Arg Glu Gly Gly Gly Tyr Tyr Val Asn Trp Tyr Phe Asp Arg}

\sac{Arg Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Arg Arg Ala Gly Gly Gly Tyr Tyr Val Asn Trp Tyr Phe Asp Arg}

\sac{Arg Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Arg Arg Glu Ala Gly Gly Tyr Tyr Val Asn Trp Tyr Phe Asp Arg}

\sac{Arg Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Arg Arg Glu Gly Ala Gly Tyr Tyr Val Asn Trp Tyr Phe Asp Arg}

\sac{Arg Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Arg Arg Glu Gly Gly Ala Tyr Tyr Val Asn Trp Tyr Phe Asp Arg}

\sac{Arg Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Arg Arg Glu Gly Gly Gly Ala Tyr Val Asn Trp Tyr Phe Asp Arg}

\sac{Arg Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Arg Arg Glu Gly Gly Gly Tyr Ala Val Asn Trp Tyr Phe Asp Arg}

\sac{Arg Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Arg Arg Glu Gly Gly Gly Tyr Tyr Ala Asn Trp Tyr Phe Asp Arg}

\sac{Arg Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Arg Arg Glu Gly Gly Gly Tyr Tyr Val Ala Trp Tyr Phe Asp Arg}

\sac{Arg Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región CDR3

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Arg Arg Glu Gly Gly Gly Tyr Tyr Val Asn Ala Tyr Phe Asp Arg}

\sac{Arg Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Arg Arg Glu Gly Gly Gly Tyr Tyr Val Asn Trp Ala Phe Asp Arg}

\sac{Arg Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Arg Arg Glu Gly Gly Gly Tyr Tyr Val Asn Trp Tyr Ala Asp Arg}

\sac{Arg Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Arg Arg Glu Gly Gly Gly Tyr Tyr Val Asn Trp Tyr Phe Ala Arg}

\sac{Arg Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región CDR3

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Arg Arg Tyr Val Tyr Asn Gly Trp Gly Tyr Phe Glu Gly Ala Arg}

\sac{Arg Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Arg Arg Glu Glu Gly Gly Tyr Tyr Val Asn Trp Tyr Phe Asp Arg}

\sac{Arg Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Arg Arg Glu Gly Glu Gly Tyr Tyr Val Asn Trp Tyr Phe Asp Arg}

\sac{Arg Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Arg Arg Glu Gly Gly Glu Tyr Tyr Val Asn Trp Tyr Phe Asp Arg}

\sac{Arg Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Arg Arg Glu Gly Gly Gly Glu Tyr Val Asn Trp Tyr Phe Asp Arg}

\sac{Arg Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

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<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Arg Arg Glu Gly Gly Gly Tyr Glu Val Asn Trp Tyr Phe Asp Arg}

\sac{Arg Arg}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

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<211> 18

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región CDR3

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Arg Arg Glu Gly Gly Gly Tyr Tyr Glu Asn Trp Tyr Phe Asp Arg}

\sac{Arg Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región CDR3

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Arg Arg Glu Gly Gly Gly Tyr Tyr Val Glu Trp Tyr Phe Asp Arg}

\sac{Arg Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Arg Arg Glu Gly Gly Gly Tyr Tyr Val Asn Glu Tyr Phe Asp Arg}

\sac{Arg Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Arg Arg Glu Gly Gly Gly Tyr Tyr Val Asn Trp Glu Phe Asp Arg}

\sac{Arg Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Arg Arg Glu Gly Gly Gly Tyr Tyr Val Asn Trp Tyr Glu Asp Arg}

\sac{Arg Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Arg Arg Glu Gly Gly Gly Tyr Tyr Val Asn Trp Tyr Phe Glu Arg}

\sac{Arg Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Arg Arg Gly Glu Tyr Gly Glu Tyr Trp Asn Gly Asp Phe Tyr Arg}

\sac{Arg Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Gly Gly Gly Phe Thr Val Asn Trp Tyr Phe Asp Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Glu Gly Gly Gly Phe Thr Val Asn Trp Tyr Phe Asp Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Gly Val Gly Tyr Arg Gly Glu Thr Arg Asn Phe Asp Trp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Glu Glu Glu Gly Gly Gly Phe Thr Val Asn Trp Tyr Phe Asp Glu}

\sac{Glu Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Arg Arg Glu Gly Gly Gly Phe Thr Val Asn Trp Tyr Phe Asp Arg}

\sac{Arg Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Arg Arg Phe Gly Val Gly Tyr Gly Glu Thr Asn Phe Asp Trp Arg}

\sac{Arg Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catgccatga ctcgcggccc agccggccat ggccsaggts marctgcags agtcwgg

\hfill

57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gccgaggtgc agcttcagga gtcagg

\hfill

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gccgatgtgc agcttcagga gtcrgg

\hfill

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gcccaggtgc agctgaagsa gtcagg

\hfill

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gccgaggtyc agctgcarca rtctgg

\hfill

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gcccaggtyc arctgcagca gyctgg

\hfill

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gccgargtga agctggtgga rtctgg

\hfill

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gccgaggttc agcttcagca gtctgg

\hfill

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gccgaagtgc agctgktgga gwctgg

\hfill

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gcccagatcc agttgctgca gtctgg

\hfill

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

200

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

accgccagag gcgcgcccac ctgaaccgcc tccacctgag gagacggtga ccgtggtccc

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

accgccagag gcgcgcccac ctgaaccgcc tccacctgag gagactgtga gagtggtgcc

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

accgccagag gcgcgcccac ctgaaccgcc tccacctgca gagacagtga ccagagtccc

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

accgccagag gcgcgcccac ctgaaccgcc tccacctgag gagacggtga ctgaggttcc

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggttcagatg ggcgcgcctc tggcggtggc ggatcggaca ttgagctcac ccagtctcca

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggttcagatg ggcgcgcctc tggcggtggc ggatcggaca ttgtgatgwc acagtctcc

\hfill

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggttcagatg ggcgcgcctc tggcggtggc ggatcggatg ttktgatgac ccaaactcc

\hfill

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggttcagatg ggcgcgcctc tggcggtggc ggatcggata ttgtgatrac bcaggcwgc

\hfill

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggttcagatg ggcgcgcctc tggcggtggc ggatcggaca ttgtgctgac mcartctcc

\hfill

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggttcagatg ggcgcgcctc tggcggtggc ggatcgsaaa wtgtkctcac ccagtctcc

\hfill

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggttcagatg ggcgcgcctc tggcggtggc ggatcggaya tyvwgatgac mcagwctcc

\hfill

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtcagatg ggcgcgcctc tggcggtggc ggatcgcaaa ttgttctcac ccagtctcc

\hfill

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggttcagatg ggcgcgcctc tggcggtggc ggatcgtcat tattgcaggt gcttgtggg

\hfill

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagtcattct gcggccgccc gtttgatttc cagcttggtg cc

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagtcattct gcggccgccc gttttatttc cagcttggtc cc

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagtcattct gcggccgccc gttttatttc cagtctggtc cc

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagtcattct gcggccgccc gttttatttc caactttgtc cc

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagtcattct gcggccgccc gtttcagctc cagcttggtc cc

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: mychis 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

201

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: mycchis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

202

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 726

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región scFv

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

\vskip1.000000\baselineskip

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 242

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región scFv

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

19

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 747

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región scFv

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

\vskip1.000000\baselineskip

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 249

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región scFv

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

\vskip1.000000\baselineskip

203

21

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 747

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región scFv

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

\vskip1.000000\baselineskip

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 249

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región scFv

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

23

204

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 747

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región scFv

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

\vskip1.000000\baselineskip

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 249

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región scFv

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

\vskip1.000000\baselineskip

25

205

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2199

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región scFv

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

\vskip1.000000\baselineskip

26

27

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 732

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región scFv

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 90

28

29

30

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 978

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región scFv

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

\vskip1.000000\baselineskip

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 325

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región scFv

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 92

\vskip1.000000\baselineskip

33

34

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2190

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región scFv

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

\vskip1.000000\baselineskip

35

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 729

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región scFv

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

\vskip1.000000\baselineskip

37

38

39

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 969

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región scFv

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 95

\vskip1.000000\baselineskip

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 322

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región scFv

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 96

\vskip1.000000\baselineskip

42

43

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 270

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región scFv

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 97

\vskip1.000000\baselineskip

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región scFv

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 98

\vskip1.000000\baselineskip

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 888

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región scFv

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 99

\vskip1.000000\baselineskip

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 294

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región scFv

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 100

47

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 876

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región scFv

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 101

\vskip1.000000\baselineskip

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 291

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región scFv

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 102

\vskip1.000000\baselineskip

50

51

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 103

207

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 104

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 104

208

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 105

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Xaa Xaa Tyr Gly Asn Ser Pro Lys Gly Phe Ala Tyr Xaa Xaa Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región CDR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 106

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asx}

Claims

1. Anticuerpo frente al factor IX/factor IXa que tiene una actividad tipo cofactor del factor VIIIa y que incrementa la actividad procoagulante del factor FIXa.

2. Anticuerpo según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho anticuerpo aumenta la actividad procoagulante del FIXa en presencia de inhibidores del FVIII.

3. Anticuerpo según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque dicho anticuerpo se selecciona de entre el grupo formado por los anticuerpos IgG, IgM, IgA y IgE.

4. Anticuerpo según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho anticuerpo se selecciona de entre el grupo formado por anticuerpos monoclonales, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos biespecíficos, diacuerpos, scFv, Fab, F(ab)_{2} y bi-, oligo- o multímeros de los mismos.

5. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el péptido que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR) es un péptido CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo formado por:

\vskip1.000000\baselineskip

Tyr-Gly-Asn-Ser-Pro-Lys-Gly-Phe-Ala-Tyr y

Asp-Gly-Gly-His-Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser-Phe-Asp-Tyr.

\vskip1.000000\baselineskip

6. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de dicho anticuerpo comprende los nucleótidos 1 a 357 y los nucleótidos 403 a 726 conforme a la Fig. 14.

7. Anticuerpo según la reivindicación 6, caracterizado porque dicho anticuerpo además comprende una secuencia de unión (linker) artificial.

8. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de dicho anticuerpo comprende los nucleótidos 1 a 363 y los nucleótidos 409 a 747 conforme a la Fig. 15.

9. Anticuerpo según la reivindicación 8, caracterizado porque dicho anticuerpo además comprende una secuencia de unión (linker) artificial.

10. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de dicho anticuerpo comprende los nucleótidos 1 a 366 y los nucleótidos 412 a 747 conforme a la Fig. 16.

11. Anticuerpo según la reivindicación 10, caracterizado porque dicho anticuerpo comprende además una secuencia de unión (linker) artificial.

12. Línea celular de hibridoma que expresa un anticuerpo contra el factor IX/factor IXa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

13. Línea celular de hibridoma según la reivindicación 12, caracterizado porque dicha línea celular se selecciona de entre el grupo formado por Nº ECACC de 198/B1: 99090925; Nº ECACC de 198/A1: 99090924; Nº ECACC de 198/BB1: 99090926; Nº ECACC de 193/A0: 99121614; Nº ECACC de 196/C4: 99121615; Nº ECACC de 198/D1: 99121616; Nº ECACC de 198/T2: 99121617; Nº ECACC de 198/G2: 99121618; Nº ECACC de 198/AC1: 99121619; Nº ECACC de 198/U2: 99121620.

14. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque es expresado por una línea celular de hibridoma según la reivindicación 12 o 13.

15. Molécula de ADN caracterizado porque dicha molécula de ADN codifica un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

16. Preparación farmacéutica que comprende un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y un excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico.

17. Preparación según la reivindicación 16, caracterizada porque además comprende factor IXa\alpha y/o factor IXa\beta.

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18. Método para obtener un anticuerpo según la reivindicación 1 que comprende los pasos de:

-: inmunizar a un mamífero no humano con un antígeno seleccionado de entre el grupo formado por factor IX, factor IXa\alpha, factor IXa\beta o fragmentos de los mismos;

-: aislar células del bazo del mamífero inmunizado;

-: producir clones de hibridoma;

-: analizar los sobrenadantes de células de hibridoma para ver si hay un aumento de la actividad procoagulante del factor IXa;

-: aislar los clones de hibridoma que expresen los anticuerpos; y

-: aislar los anticuerpos.

19. Utilización de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de pacientes con trastornos de coagulación sanguínea.

20. Utilización según la reivindicación 19, caracterizada porque el trastorno de coagulación sanguínea se selecciona de entre el grupo formado por: hemofilia A y diátesis hemorrágica.

21. Utilización según las reivindicaciones 19 o 20, caracterizado porque los pacientes son inhibidores de hemofilia.