ES2320665T3 - Anticuerpos especificos del factor ixa que presentan una actividad analoga a la del factor viiia. - Google Patents

Abstract

Anticuerpo que comprende un dominio VH que tiene una CDR1 incluyendo la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:6, una CDR2 incluyendo la secuencia según se muestra en la SEQ ID NO:7 y una CDR3 incluyendo la secuencia mencionada en la SEQ ID NO:8, así como un dominio V L que tiene una CDR1 que comprende la secuencia tal como se enuncia en la SEQ ID NO:3, una CDR2 que comprende la secuencia según se expone en la SEQ ID NO:4 y una CDR3 que comprende la secuencia mencionada en la SEQ ID NO:5, que pueden unirse al Factor IX/Factor IXa humano y bovino y aumentar la actividad de procoagulación del Factor IXa.

Description

Anticuerpos específicos del factor IXa que presentan una actividad análoga a la del factor VIIIa.

Campo de la invención

La invención se refiere a ligandos que pueden unirse al factor IX/factor IXa y activar la actividad procoagulante del factor IXa (FIXa), a derivados de estos ligandos, a composiciones farmacéuticas que contienen dichos ligandos, a procedimientos que implican la administración de dichos ligandos para tratar pacientes que padecen trastornos de la coagulación sanguínea, a ácidos nucleicos que codifican ciertos ligandos que son proteínas y a células que expresan dichos ligandos.

Antecedentes

Uno de los eventos clave durante la hemostatis normal es la conversión del factor X (FX) zimógeno en su forma enzimáticamente activa FXa, un proceso que lleva posteriormente a la activación de la protrombina y a la formación de coágulos. La activación del FX in vivo se consigue inicialmente vía factor tisular/factor VIIa. El complejo factor tisular/factor VIIa es fácilmente inhibido por el inhibidor de la vía del factor tisular. La activación de la mayor parte del FX se produce posteriormente a través de la vía intrínseca de la coagulación y requiere la formación del complejo activador intrínseco del factor X. Este complejo se compone de los factores de coagulación, el Factor IXa (FIXa) y el Factor VIIIa (F VIIIa) ensamblados sobre una superficie fosfolipídica en presencia de iones Ca^{2+}. El complejo activador intrínseco del factor X produce FXa a un nivel que permite la formación de un coágulo estable.

El FVIIIa funciona como activador del factor IXa (F IXa), que aumenta la velocidad de formación del FXa en aproximadamente 200.000 veces (van Dieijen y col., (1981) J. Biol. Chem. 256: 3433-3442). El mecanismo exacto por el que el FVIIIa mejora la actividad catalítica del FIXa hacia FX sigue sin conocerse. Los mutantes de origen natural, la mutagénesis sitio-dirigida, así como el análisis de complejos análogos cofactor/enzima, tal como el complejo protrombinasa, sugieren que existen al menos dos regiones de contacto entre FVIIIa y FIXa. Ambas regiones desempeñan un papel importante en la mejora de la actividad enzimática del FIXa. En general se cree que el FVIII posee tres funciones dentro del complejo activador intrínseco del factor X: (i) el FVIII estabiliza una conformación del FIXa que incrementa la actividad proteasa hacia el FX, (ii) el FVIIIa actúa como receptor para el FIXa sobre plaquetas activadas que proporcionan in vivo la superficie fosfolipídica procoagulante y (iii) datos recientes indican que el FVIIIa orienta los sitios de fragmentación de FX hacia el sitio activo de FIXa.

La WO 01/19992 A2 describe una preparación para el tratamiento de los trastornos de la coagulación sanguínea que tiene ventajas particulares en pacientes con inhibidor del factor VIII (véase por ejemplo la página 4, líneas 3 a 6).

El papel crucial del FVIII en la hemostasis se pone de manifiesto en la hemofilia A, trastorno severo de la coagulación sanguínea de carácter recesivo ligado al cromosoma X, que se caracteriza por la ausencia de actividad del factor FVIII de coagulación. Los pacientes con hemofilia A son tratados mediante la administración de FVIII al paciente a través de una inyección intravenosa de FVIII derivado de plasma o recombinante. Aunque estos métodos son eficaces, tienen varios inconvenientes. En primer lugar, la vida media relativamente corta del FVIII implica que es necesario administrar altas dosis de FVIII de dos a tres veces por semana. En segundo lugar, la producción de FVIII es muy cara; por consiguiente, sólo está disponible esencialmente en el mundo industrializado. Finalmente, aproximadamente un 30% de los pacientes gravemente afectados desarrollan anticuerpos que inhiben la actividad de FVIII ("pacientes con inhibidor de hemofilia" o simplemente "pacientes con inhibidor"), lo que es una complicación seria y pone en peligro la vida.

Considerando el papel clave que desempeña el FVIII en la hemostasis en conjunto con los inconvenientes anteriormente mencionados en su suministro a pacientes con trastornos de la coagulación sanguínea, sigue existiendo una necesidad significativa de compuestos que tengan actividades análogas al FVIII pero que superen algunas de sus limitaciones.

Sumario

La invención proporciona, en parte, ligandos que funcionan como sustitutos del factor VIIIa en el tratamiento de trastornos de la coagulación sanguínea (por ejemplo, hemofilia y diátesis hemorrágica). Así, estos ligandos pueden unirse al factor IXa y estimulan la actividad procoagulante del factor IXa.

En particular, la presente invención proporciona un anticuerpo que comprende un dominio V_{H} que tiene una CDR1 incluyendo la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:6, una CDR2 incluyendo la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:7 y una CDR3 incluyendo la secuencia mencionada en la SEQ ID NO:8, así como un dominio V_{L} que tiene una CDR1 que comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:3, una CDR2 que comprende la secuencia según se expone en la SEQ ID NO:4 y una CDR3 que comprende la secuencia mencionada en la SEQ ID NO:5, el cual puede unirse al Factor IX/Factor IXa y aumentar la actividad de procoagulación del Factor IXa.

Se proporcionan también células que expresan estos ligandos y los ácidos nucleicos que codifican estos ligandos, así como métodos para producir tales ligandos y procedimientos para utilizar estas células o ácidos nucleicos.

Se describen también aquí composiciones farmacéuticas para el tratamiento de trastornos de la coagulación sanguínea tales como la hemofilia A y la diátesis hemorrágica (por ejemplo, en el ser humano). Ciertas composiciones farmacéuticas contienen, por ejemplo, uno o más de los ligandos que se revelan aquí y un vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra la cinética de interacción entre el FIXa y los anticuerpos 198B1 (véase la WO 01/19992) y 224F3 en presencia de 5 mM CaCl_{2}, tal como se mide mediante la tecnología de Resonancia de Plasmón de Superficie (SPR) utilizando un instrumento BIACORE 300 (Biacore AG, Uppsala, Suecia). Más específicamente, esta figura muestra la unión de 5,56 nM FIXa a estos dos anticuerpos monoclonales diferentes (Mabs) capturados por Fc\gamma (RAMFc) anti-ratón en presencia de 5 mM CaCl_{2}. Durante el análisis, se inyectaron 5,56 nM de FIXa, se siguió la asociación durante 5 minutos y se controló la disociación durante 12 minutos. El tiempo en segundos se muestra en la abscisa; la respuesta relativa en unidades arbitrarias se muestra en la ordenada.

La Figura 2 muestra el efecto del anticuerpo procoagulante 224F3 sobre la activación de FX catalizada por FIXa. La Fig. 2A es el período de tiempo de generación de FXa a distintas concentraciones de anticuerpos (abscisa: t [min]; ordenada: FXa [nM]; cruz: 15 pM FVIIIa; rombo en negro: 10 nM 224F3; cuadrado en blanco: 5 nM; cuadrado en negro: 4 nM; triángulo en blanco: 3 nM; triángulo en negro: 2 nM; círculo en blanco: 1 nM; círculo en negro: tampón). La Fig. 2B es una curva de valoración de anticuerpos (abscisa: 224F3 [nM]; ordenada: velocidad de formación de FXa [nM/min.]).

La Figura 3 muestra un análisis cinético de la activación de FX catalizado por FIXa por un complejo anticuerpo-FIXa; un complejo FVIIIa-FIXa; y FIXa sin efector. Los parámetros cinéticos se resumen en la Tabla 1 a continuación (Abscisa: FX [nM]; ordenada: velocidad de formación de FXa [nM/min.]; círculo en negro: 25 nM IgG de ratón; triángulo en negro: 25 nM anticuerpo 198B1; triángulo en blanco: 25 nM anticuerpo 224F3; cuadrado en negro: 5 nM FVIIIa)

La Figura 4 muestra los períodos de tiempo de generación de trombina en plasma pobre en FVIII con y sin anticuerpos (línea continua: plasma pobre en FVIII; círculo en negro: 40 nM anticuerpo 198B1; triángulo en blanco: 40 nM anticuerpo 224F3; triángulo en negro: 20 mU/ml FVIII. Abscisa: t [min.]; ordenada: trombina [nM]).

La Figura 5 muestra los períodos de tiempo de generación de trombina en plasma con inhibidor de FVIII. Los gráficos muestran la generación de trombina en plasma con inhibidor de FVIII con distintas concentraciones de FEIBA^{TM} o anticuerpo procoagulante 224F3. Como control negativo, se muestran las generaciones de trombina en plasma con inhibidor de FVIII con IgG de ratón no específico y sin suplementación. Gráfico superior: abscisa: t [min.]; ordenada: trombina [nM]; cuadrado en blanco: 0,5 U/ml FEIBA^{TM}; cuadrado en negro: 0,3 U/ml FEIBA^{TM}; triángulo en blanco: 0,2 U/ml FEIBA^{TM}; triángulo en negro: 0,1 U/ml FEIBA^{TM}; línea continua: 0 nM FEIBA^{TM}. Gráfico inferior: abscisa: t [min.]; ordenada: trombina [nM]; cuadrado en blanco: 250 nM anticuerpo 224F3; cuadrado en negro: 60 nM anticuerpo 224F3; triángulo en blanco: 25 nM anticuerpo 224F3; triángulo en negro: 6,25 nM anticuerpo 224F3; línea continua: 100 nM IgG de ratón no específico.

Las Figuras 6 y 7 muestran la secuencia de la variable cadena pesada, V_{H}, (SEQ ID NO: 1) y de la variable cadena ligera, V_{L}, (SEQ ID NO: 2) del anticuerpo 224F3.

La Figura 8 muestra las secuencias de las CDR (regiones determinantes complementarias) L1 a L3 (SEQ ID NOs: 3 a 5) y H1 a H3 (SEQ ID NOs: 6 a 8) del anticuerpo 224F3. Los índices en cada residuo aminoácido identifican la posición de cada residuo de aminoácido en la cadena polipeptídica respectiva del anticuerpo 224F3. Los números variarán con la estructura en la que se introduzcan las secuencias L1 a L3 y H1 a H3, a saber SEQ ID NO: 3 a 8. En consecuencia, los índices no forman parte de las secuencias de acuerdo con SEQ ID NO: 3 a 8. Así, los índices no se considerarán limitativos de las secuencias.

La Figura 9 muestra la pérdida de sangre en \mul (ordenada) en función del intervalo de tiempo indicado (abscisa) para ratones noqueados por FIX que fueron tratados con plasma de cabra normal y FIX humano (sin inmunodepleción, casillas negras); con plasma con inhibidor, FIX humano y anticuerpo 224F3 como ligando (casillas grises); y con plasma con inhibidor, FIX humano e IgG no específico (casillas sombreadas).

La Figura 10 muestra la pérdida total de sangre en \mul (ordenada) en función del tiempo para ratones noqueados por FIX que son tratados con plasma de cabra normal y FIX humano (sin inmunodepleción, círculos en blanco); con plasma con inhibidor, FIX humano y anticuerpo 224F3 como ligando (triángulos en negro); y con plasma con inhibidor, FIX humano e IgG no específico (cuadrados en negro).

Descripción detallada I. Definiciones

"Factor VIII" tal como se emplea aquí tiene el significado habitual en la técnica y se refiere a varios polipéptidos procedentes de un producto genético único (véase por ejemplo, Andersson y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 2979-2983, mayo 1986; Gitschier, J. y col., (1984) Nature 312, 326-330; Wood, W.I. y col., (1984) Nature 312, 330-337; Vehar, G.A. y col., (1984) Nature 312, 337-342; y Toole, J.J. y col., (1984) Nature 312, 342-347), se deriva del plasma sanguíneo o se obtiene aplicando técnicas de ADN sintético o recombinante. El Factor VIII existe naturalmente en varias formas, como proteína de longitud completa y en formas más pequeñas que se forman mediante segmentación de la forma de longitud completa. El Factor VIII de longitud completa se describe, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos Nº 5.633.150 y 4.757.006. El mARN del Factor VIII codifica una proteína precursora de 2.351 aminoácidos, incluyendo un péptido señal de 19 aminoácidos; así, la proteína madura del Factor VIII tiene una longitud de 2.332 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos prevé una estructura de dominios compuesta por un dominio A triplicado, un dominio B único y un dominio C duplicado, dispuestos en el orden A1:A2:B:A3:C1:C2. Durante la coagulación, el dominio B se elimina por activación de la trombina de la molécula. Ejemplos de preparaciones terapéuticas comerciales que contienen Factor VIII recombinante incluyen aquellas vendidas con los nombres comerciales HEMOFIL M^{TM}, ADVATE^{TM} y RECOMBINATE^{TM} (de Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, III., U.S.A.) y KOGENATE (de Bayer, Carolina del Norte).

El término Factor VIII incluye también varias formas, incluyendo proteínas con sustituciones, adiciones o deleciones que conservan la actividad procoagulante. Algunas moléculas que están incluidas en el término Factor VIII carecen de un dominio procedente del factor VIII de longitud completa. Por ejemplo, el Factor VIII que carece del dominio B (r-VIII SQ) es producido por Wyeth, Massachusetts (véase por ejemplo, Berntorp, E. (1997) Thrombosis and Haemostasis 78, 256-260; véase también la EP-A-0506757). Esta proteína particular se compone de una cadena pesada de 90 kDa (dominios A1:A2) y de una cadena ligera de 80 kDa (dominio A3:C1:C2) conectadas por un péptido de enlace. El término Factor VIII incluye moléculas que tienen una identidad sustancial de secuencia con respecto a las del Factor VIII de origen natural y que tienen la actividad del Factor VIII.

El Factor IX tal como se utiliza aquí tiene el significado habitual en la técnica e incluye formas de origen natural y variantes de éstas producidas por medios sintéticos, recombinantes u otros que conservan la actividad del Factor IX/IXa. Diversos grupos han descrito el cADN que codifica para el Factor IX humano (véase por ejemplo, Choo y col., Nature 299:178-180 (1982); Fair y col., Blood 64:194-204 (1984); y Kurachi y col., Proc. Nat. Acad. Sci., U.S.A. 79:6461-6464 81982)). En la patente de Estados Unidos Nº 4.770.999 se describen métodos para producir el Factor IX mediante técnicas de ADN recombinante. El término incluye proteínas con sustituciones, adiciones o deleciones relativas al Factor IX de origen natural que conserva la capacidad de activar el Factor X. Por ejemplo, en la patente de Estados Unidos Nº 6.599.724 se describe una proteína de Factor IX con una sustitución. El término puede incluir también diversas formas procesadas, tales como Factor IXa\alpha y Factor IXa\beta. Para tener una visión general del Factor IX, véase por ejemplo, Limentani, S.A., y col., "The Biochemistry of Factor IX", in Hemostasis and Thrombosis: Basic Principles and Clinical Practice, 3rd. ed. (Colman, R.W., y col., Eds) cap. 5, J.B. Lippincott Co., Philadelphia, 1994.

"Actividad procoagulante" tal como se utiliza aquí tiene el significado habitual en la técnica y se refiere en general a una actividad que favorece la formación de coágulos. Esta actividad puede ser controlada con muestras de sangre u otros ensayos conocidos en la técnica (véase por ejemplo, los ensayos descritos en los ejemplos). Los anticuerpos aquí descritos tienen actividad procoagulante en lo que pueden interactuar con el Factor IXa para incrementar la velocidad a la cual el Factor IXa convierte el Factor X en Factor Xa. Se pueden medir los incrementos de la actividad de procoagulación mediante ensayos tales como los descritos en los ejemplos. Los ensayos para el aumento de actividad se comparan en general con respecto a un control o nivel base (por ejemplo, una muestra procedente de un paciente hemofílico que carece del Factor VIII).

Tal como se emplea aquí, en general se entiende que "anticuerpo" se refiere a una molécula de inmunoglobulina que es inmunológicamente reactiva con un antígeno particular, e incluye anticuerpos tanto policlonales como monoclonales. El término incluye también formas diseñadas genéticamente, tales como anticuerpos quiméricos (por ejemplo, anticuerpos murino humanizados) y anticuerpos heteroconjugados (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos). El término "anticuerpo" incluye también formas de unión de anticuerpos a antígeno, incluyendo fragmentos con capacidad de unión a antígeno [por ejemplo, Fab', F(ab')_{2}, Fab, Fv y rlgG. Véase por ejemplo, Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Kuby, J., Immunology, 3^{rd} Ed., W.H. Freeman & Co., New York (1998)]. El término abarca también fragmentos Fv recombinantes de cadena única (scFv). El término incluye además moléculas bivalentes o biespecíficas, diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos. Moléculas bivalentes y biespecíficas se describen en, por ejemplo, Kostelny y col., (1992) J. Immunol. 148:1547, Pack and Pluckthun (1992) Biochemistry 31:1579, Hollinger y col., 1993, supra, Gruber y col., (1994) J. Immunol.: 5368, Zhu y col., (1997) Protein Sci., 6:781, Hu y col., (1996) Cancer Res. 56:3055, Adams y col., (1993) Cancer Res. 53:4026, y McCartney y col., (1995) Protein Eng. 8:301.

Puede obtenerse un anticuerpo inmunológicamente reactivo con un antígeno particular mediante métodos recombinantes tales como la selección de librerías de anticuerpos recombinantes en fago o vectores similares, véase por ejemplo, Huse y col., Science 246:1275-1281 (1989); Ward y col., Nature 341:544-546 (1989); y Vaughan y col., Nature Biotech., 14:309-314 (1996), o mediante la inmunización de un animal con el antígeno o con ADN que codifica el antígeno.

Típicamente una inmunoglobulina tiene una cadena pesada y una ligera. Cada cadena pesada y ligera contiene una región constante y una región variable (las regiones se conocen también como "dominios"). Las regiones variables de cadena pesada y ligera contienen cuatro regiones con "marco" interrumpidas por tres regiones hipervariables, también denominadas "regiones determinantes de complementariedad" o "CDRs". La extensión de las regiones con marco y las CDRs ya se han definido. Las secuencias de las regiones marco de distintas cadenas pesadas o ligeras se conservan relativamente dentro de una especie. La región marco de un anticuerpo, es decir las regiones combinadas marco de las cadenas pesadas y ligeras constituyentes, sirve para posicionar y alinear las CDRs en el espacio tridimensional.

Las CDRs son esencialmente responsables de la unión a un epítope de un antígeno. Las CDRs de cada cadena se denominan normalmente CDR1, CDR2 y CDR3, numeradas secuencialmente empezando a partir del N-término, y habitualmente son identificadas también por la cadena en la que se localiza la CDR particular. Así, una CDR3 de V_{H} está localizada en el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo en la que se encuentra, mientras que una CDR1 de V_{L} es la CDR1 procedente del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo en la que se encuentra.

Las referencias a "V_{H}" o "VH" se refieren a la región variable de una cadena pesada de inmunoglobulina de un anticuerpo, incluyendo la cadena pesada de un Fv, scFv o Fab. La referencia a "V_{L}" o "VL" se refiere a la región variable de una cadena ligera de inmunoglobulina, incluyendo la cadena ligera de un Fv, scFv, dsFv o Fab.

La expresión "Fv de cadena única" o "scFv" se refiere a un anticuerpo en el cual los dominios variables de la cadena pesada y de la cadena ligera de un anticuerpo tradicional de dos cadenas se han unido para formar una cadena. Normalmente se inserta un péptido de enlace entre las dos cadenas para permitir el plegamiento adecuado y la creación de un sitio de unión activo.

Un "anticuerpo quimérico" es una molécula de inmunoglobulina en la cual (a) la región constante, o una parte de la misma, es alterada, sustituida o intercambiada para que el sitio de unión al antígeno (región variable) se enlace a una región constante de una clase diferente o alterada, función de efector y/o especies, o una molécula totalmente diferente que confiera nuevas propiedades al anticuerpo quimérico, por ejemplo, una enzima, toxina, hormona, factor de crecimiento, medicamento, etc.; o (b) la región variable, o una parte de la misma, es alterada, sustituida o intercambiada con una región variable que tiene una especificidad de antígeno diferente o alterada.

Un "anticuerpo humanizado" es una molécula de inmunoglobulina que contiene la secuencia mínima procedente de inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las cuales los residuos procedentes de una región determinante complementaria (CDR) del receptor son sustituidos por residuos procedentes de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como de ratón, rata o conejo con la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos marco de Fv de la inmunoglobulina humana son sustituidos por los residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados pueden comprender también residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en la CDR importada o en secuencias marco. En general, una anticuerpo humanizado comprende sustancialmente el conjunto de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los cuales todas o sustancialmente todas las regiones CDR se corresponden con aquellas de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones marco (FR) son aquellas de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado comprende también óptimamente al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana (Jones y col., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann y col., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)). La humanización se puede realizar, por ejemplo, siguiendo el método de Winter y colegas [(véase, por ejemplo, Jones y col., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann y col., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen y col., Science 239:1534-1536 (1988)], y mediante la sustitución de secuencias de CDR o CDRs de roedores por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. En consecuencia, estos anticuerpos humanizados son anticuerpos quiméricos (patente de Estados Unidos Nº 4.816.567), en los cuales sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente procedente de una especie no humana.

"Epítope" o "determinante antigénico" se refiere a un sitio en un antígeno al que se une un anticuerpo. Los epítopes pueden formarse tanto a partir de aminoácidos contiguos como de aminoácidos no contiguos yuxtapuestos mediante un plegamiento terciario de una proteína. Típicamente, los epítopes formados a partir de aminoácidos contiguos se conservan al ser expuestos a disolventes desnaturalizantes, mientras que los epítopes formados por plegamiento terciario normalmente se pierden al ser tratados con disolventes desnaturalizantes. Un epítope incluye típicamente al menos 3, y de forma más habitual, al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única. Entre los métodos para determinar la conformación espacial de los epítopes se incluyen, por ejemplo, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear bidimensional. Véase por ejemplo, Epitope Mapping Protocols en Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996).

Los términos "idénticos" o porcentaje de "identidad" en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias polipeptídicas se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o que tienen un porcentaje específico de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales (es decir, una identidad de aproximadamente un 60%, preferentemente una identidad del 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más en una región específica, cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima en una ventana de comparación o en una región designada), tal como se mide mediante algoritmos de comparación de secuencias BLAST o BLAST 2.0 con los parámetros por defecto descritos más abajo, o mediante alineamiento manual e inspección visual. Entonces se dice que estas secuencias son "sustancialmente idénticas". Esta definición se refiere también, o se puede aplicar, para cumplimentar una secuencia de prueba. La definición incluye también secuencias que tienen deleciones y/o adiciones, así como aquellas que tienen sustituciones, de origen natural, por ejemplo variantes polimórficas o alélicas, y variantes artificiales. Tal como se describe a continuación, los algoritmos preferentes pueden tener en cuenta vacíos. Preferentemente, existe identidad en una región que tiene una longitud de al menos aproximadamente 5, 6, 7, 8 o 9 aminoácidos o nucleótidos, o especialmente en una región que tiene una longitud de 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 aminoácidos o nucleótidos.

Para la comparación de secuencias normalmente una secuencia actúa como secuencia de referencia con la que se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencias, se introducen en un ordenador las secuencias de prueba y de referencia, se designan coordenadas de las subsecuencias, si es necesario, y se diseñan los parámetros de programa del algoritmo de secuencias. Preferentemente, se pueden utilizar parámetros de programa por defecto o se pueden designar parámetros alternativos. El algoritmo de comparación de secuencias calcula entonces el porcentaje de identidad de secuencia para las secuencias de ensayo con respecto a la secuencia de referencia en base a los parámetros del programa.

El alineamiento óptimo de las secuencias para su comparación se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineamiento por homología de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante la búsqueda del método de similitud de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), mediante implementaciones informatizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA, Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante alineamiento manual e inspección visual (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel y col., eds. suplemento de 1995)).

Ejemplos de algoritmos adecuados para determinar el porcentaje de identidad de las secuencias y la similitud entre ellas incluyen los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul y col., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977) y Altschul y col., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). Se utilizan BLAST y BLAST 2.0 con los parámetros descritos aquí para determinar el porcentaje de identidad de las secuencias para los ácidos nucleicos y las proteínas de la invención. Se dispone públicamente del software para realizar los análisis BLAST del National Center for Biotechnology Information. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para las secuencias de nucleótidos) utiliza como valor por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una esperanza (E) de 10, M=5, N=4 y una comparación de ambas hebras. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza como valor por defecto una longitud de palabra de 3 y una esperanza (E) de 10 y la matriz de puntuaciones BLOSUM62 (véase Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 89:10915 (1989)), alineaciones (B) de 50, esperanza (E) de 10, M=5, N=4, y una comparación de ambas hebras.

El algoritmo de BLAST realiza también un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad mínima de suma (P(N)), lo cual proporciona una indicación sobre la probabilidad a la cual se produciría por azar una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad mínima de suma en una comparación del ácido nucleico de prueba con respecto al ácido nucleico de referencia es inferior a aproximadamente 0,2, preferentemente inferior a aproximadamente 0,01 y especialmente inferior a aproximadamente 0,001. Los valores log pueden ser números negativos altos, por ejemplo, 5, 10, 20, 30, 40, 40, 70, 90, 110, 150 ó 170.

Una "célula huésped" es una célula de origen natural o una célula transformada que contiene un vector de expresión y soporta la replicación o expresión del vector de expresión. Células huésped incluyen, por ejemplo, células cultivadas, explantes y células in vivo. Las células huésped pueden ser células procarióticas, tales como E. coli, o células eucarióticas, tales como células de levadura, insecto, anfibios o mamíferos, por ejemplo CHO y HeLa.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan de forma intercambiable aquí para referirse a un polímero de residuos aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los cuales uno o más residuos aminoácidos son una imitación química artificial de un aminoácido correspondiente de origen natural, así como a los polímeros de aminoácidos de origen natural, aquellos que contienen residuos modificados, así como a polímeros de aminoácidos de origen no natural.

El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos de origen natural y sintético, así como a análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan del mismo modo que los aminoácidos de origen natural. Los aminoácidos de origen natural son aquellos codificados por el código genético, así como aquellos aminoácidos modificados posteriormente, por ejemplo hidroxiprolina, \gamma-carboxiglutamato y O-fosfoserina. Los análogos de aminoácidos se refieren a compuestos que tienen la misma estructura química básica de un aminoácido de origen natural, por ejemplo un carbono \alpha unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino, y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, metionina sulfóxido, metionina metil sulfonio. Estos análogos pueden tener grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o esqueletos peptídicos modificados, pero conservan la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural. Los miméticos de aminoácidos se refieren a compuestos químicos que tienen una estructura diferente a la estructura química general de un aminoácido, pero que funciona de forma similar a un aminoácido de origen natural.

Se hace referencia aquí a los aminoácidos por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. Igualmente, los nucleótidos se mencionan por los códigos de una sola letra comúnmente aceptados.

El término "variantes modificadas conservativamente" se aplica tanto a secuencias de aminoácidos como a ácidos nucleicos. Con respecto a las secuencias particulares de ácidos nucleicos, las variantes modificadas conservativamente se refieren a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o cuando el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias esencialmente idénticas o asociadas, por ejemplo naturalmente contiguas. Debido a la degeneración del código genético, gran cantidad de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican la mayoría de las proteínas. Por ejemplo, todos los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican el aminoácido alanina. Así, en cada posición en la que una alanina es especificada por un codón, el codón puede ser cambiado por otro de los codones correspondientes descritos sin cambiar el polipéptido codificado. Estas variaciones del ácido nucleico son "variaciones silenciosas", que son una especie de variaciones modificadas conservativamente. Cada secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido describe también las variaciones silenciosas del ácido nucleico. Un especialista reconocerá que, en ciertos contextos, cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que es normalmente el único codón para la metionina, y TGG, que es normalmente el único codón para el triptófano) puede ser modificado para producir una molécula funcionalmente idéntica. En consecuencia, las variaciones silenciosas de un ácido nucleico que codifica un polipéptido con frecuencia están implícitas en una secuencia descrita con respecto al producto de expresión, pero no con respecto a las presentes secuencias sonda.

En cuanto a las secuencias de aminoácidos, un especialista reconocerá que sustituciones individuales, deleciones o adiciones a una secuencia de ácidos nucleicos, péptidos, polipéptidos o proteínas que altere, añada o suprima un único aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante modificada conservativamente" cuando la alteración resulta en la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustitución conservativa que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Estas variantes modificadas conservativamente son, además de y no excluyen, las variantes polimórficas, homólogos interespecies y alelos de la invención. Sustituciones típicamente conservativas una por otra: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido Glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); y 8) Cisteína (C), Metionina (M) (véase por ejemplo, Creighton, Proteins (1984)).

La expresión "se une específicamente (o selectivamente)" a un anticuerpo o "específicamente (o selectivamente) inmunorreactivo con", cuando hace referencia a una proteína o a un péptido, se refiere a la reacción de unión que es determinante de la presencia de la proteína en una población heterogénea de proteínas y otros compuestos biológicos. Así, en determinadas condiciones de inmunoensayo, los anticuerpos especificados se unen a una secuencia particular de proteínas al menos dos veces en fondo y más típicamente más de 10 a 100 veces en fondo. Un ligando (por ejemplo un anticuerpo) que se une específicamente a una proteína, en general tiene una constante de asociación de al menos 10^{3} M^{-1} ó 10^{4} M^{-1}, a veces 10^{5} M^{-1} ó 10^{6} M^{-1}, en otros casos 10^{6} M^{-1} ó 10^{7} M^{-1}, preferentemente 10^{8} M^{-1} a 10^{9} M^{-1}, y especialmente de 10^{10} M^{-1} aproximadamente a 10^{11} M^{-1} o más. Se pueden utilizar diversos formatos de inmunoensayo para seleccionar anticuerpos específicamente inmunorreactivos con una proteína en particular. Por ejemplo, habitualmente se emplean inmunoensayos ELISA en fase sólida para seleccionar anticuerpos monoclonales específicamente inmunorreactivos con una proteína. Véase por ejemplo, Harlow y Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York, para una descripción de formatos y condiciones de inmunoensayo que se pueden utilizar para determinar la inmunorreactividad específica.

Los términos "aislado", "purificado" o "biológicamente puro" se refieren a un material (por ejemplo, un anticuerpo) que está sustancial o esencialmente libre de los componentes que lo acompañan normalmente, tal como se puede encontrar en su estado nativo. La pureza y homogeneidad se determinan típicamente utilizando técnicas de química analítica, tal como electroforesis en gel de poliacrilamida o cromatografía líquida de alta resolución. Una proteína o un ácido nucleico que sea la especie predominante presente en una preparación está sustancialmente purificado. En particular, un ácido nucleico aislado está separado de algunos marcos de lectura abiertos que flanquean naturalmente el gen y codifican proteínas distintas de la proteína codificada por el gen. El término "purificado" en algunas realizaciones indica que un ácido nucleico o una proteína da lugar a esencialmente una banda en un gel electroforético. Significa preferentemente que el ácido nucleico o proteína es al menos pura en un 85%, con más preferencia al menos pura en un 95% y especialmente al menos pura en un 99%. "Purificar" o "purificación" en otras realizaciones significa la eliminación de al menos un contaminante de la composición que ha de ser purificada. En este sentido, la purificación no necesita que el compuesto purificado sea homogéneo, por ejemplo puro en un 100%.

Una "etiqueta" o una "parte detectable" es una composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, químicos u otros medios físicos. Por ejemplo, etiquetas útiles incluyen tintes fluorescentes, reactivos de densidad electrónica, enzimas (por ejemplo, tal como se utilizan comúnmente en un ELISA), biotina, digoxigenina o haptenos y proteínas u otras entidades que pueden volverse detectables, por ejemplo mediante la incorporación de una radioetiqueta en el péptido, o que se utilizan para detectar anticuerpos específicamente reactivos con el péptido. El radioisótopo puede ser, por ejemplo, ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{35}S ó ^{125}I.

II. Ligandos, Incluyendo Anticuerpos A. Estructura y Actividad

Se describen aquí ligandos que funcionan como sustitutos o complementos de FVIIIa en la activación de FIXa. Estos ligandos tienen diversas utilidades, incluyendo el uso directo o como parte de una composición farmacéutica para tratar un individuo con varios trastornos de coagulación sanguínea, y en la purificación y detección de FIX/FIXa. Se ha descubierto que sorprendentemente los ligandos que se proporcionan tienen una mayor afinidad para el FIX/FIXa que se une a FIX/FIXa (véanse, por ejemplo, los Ejemplos 4 y 5 más abajo) e incrementan la actividad de procoagulación del FIXa (véanse, por ejemplo, los Ejemplos 6 y 7 más abajo) en comparación con otros anticuerpos.

Tal como se emplea aquí, el término "ligando" se refiere a un anticuerpo que comprende un dominio V_{H} que tiene una CDR1 incluyendo la secuencia tal como se muestra en la SEQ ID NO:6, una CDR2 incluyendo la secuencia según se muestra en la SEQ ID NO:7 y una CDR3 incluyendo la secuencia mencionada en la SEQ ID NO:8, así como un dominio V_{L} que tiene una CDR1 que comprende la secuencia tal como se muestra en la SEQ ID NO:3, una CDR2 que comprende la secuencia según se expone en la SEQ ID NO:4 y una CDR3 que comprende la secuencia mencionada en la SEQ ID NO:5, que pueden unirse al Factor IX/Factor IXa humano y bovino y aumentar la actividad de procoagulación del Factor IXa.

Las SEQ ID NOs: 1 y 2 son secuencias peptídicas procedentes de las regiones VH y VL, respectivamente, del anticuerpo 224F3 (véanse las Fig. 6 y 7). Las SEQ ID NOs: 3 a 8 son secuencias peptídicas procedentes de las secuencias CDR de la cadena ligera, L1 a L3, y de la cadena pesada, H1 a H3, respectivamente, del anticuerpo 224F3 (véase la Fig. 8).

La función específica de los ligandos se define como una proporción de más de 5:1, preferentemente más de 6:1, en especial más de 6,5:1 o en particular más de 6,8:1, en la eficacia catalítica en términos de cinética de Michaelis-Menten (k_{cal}/K_{M}) de FIXa en presencia del ligando con relación a la ausencia del ligando y de cualquier otro efector (para más detalles véase más abajo).

Algunos de los anticuerpos que se proporcionan son anticuerpos policlonales, mientras que otros son monoclonales. Otros polipéptidos que se proporcionan se obtienen mediante tecnología de genes recombinantes ("anticuerpo recombinante"). En consecuencia, algunos ligandos comprenden anticuerpos monoclonales humanos y animales o fragmentos de los mismos o anticuerpos de cadena única y fragmentos de los mismos (incluyendo minianticuerpos, biespecíficos, diacuerpos, triacuerpos, o los dímeros, oligo- o multi-meros de los mismos).

Algunos ligandos comprenden proteínas producidas por la expresión de una región alterada codificadora de inmunoglobulina en una célula huésped. Ejemplos de ligandos de este tipo son "anticuerpos técnicamente modificados". Los anticuerpos de esta clase incluyen, por ejemplo, anticuerpos sintéticos, anticuerpos quiméricos o humanizados o mezclas de los mismos, o fragmentos de anticuerpos que carecen parcial o completamente de una región constante (por ejemplo Fv, Fab, Fab' o F(ab)'_{2}). En los anticuerpos técnicamente modificados, una o más partes de la cadena ligera y/o pesada puede ser sustituida. Estas moléculas pueden comprender anticuerpos compuestos por una cadena pesada humanizada y una cadena ligera no modificada (o cadena ligera quimérica) o viceversa (para el término "humanizado" véase más abajo). Los términos Fv, Fc, Fd, Fab, Fab' o F(ab)_{2} tienen el significado habitual en la técnica (véase por ejemplo, Harlow E. y Lane D., "Antibodies, A laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).

Ciertos ligandos incluyen fragmentos Fab o fragmentos F(ab)_{2} que proceden de anticuerpos monoclonales (mAb) dirigidos contra el Factor IX/Factor IXa y que provocan un aumento de la actividad procoagulante del Factor IXa.

Algunos ligandos son anticuerpos humanizados que comprenden CDRs de anticuerpos monoclonales murinos que han sido insertados en las regiones marco heterólogas de secuencias de anticuerpos humanos seleccionadas. Las regiones marco comprenden regiones que están implicadas en la visualización de la CDR.

Las regiones constantes, si están presentes en el ligando, se seleccionan típicamente de entre las clases e isotipos de inmunoglobulina humana, tales como IgG (subtipos 1 a 4), IgM, IgA e IgE. Durante la respuesta inmune, puede tener lugar un cambio de clase de las inmunoglobulinas (por ejemplo, en un cambio de IgM a IgG se intercambian las regiones constantes de \mu a \gamma). Un cambio de clase también puede ser provocado de manera directa por medio de métodos de ingeniería genética ("recombinación dirigida de cambio de clase"), tal como se conoce de la técnica anterior (véase por ejemplo, Esser C. y Radbruch A., Annu. Rev. Immunol., 1990, Vol. 8, pp. 717-735). Por supuesto, también en los anticuerpos humanizados, otras secuencias que están involucradas en la unión del anticuerpo a otras moléculas celulares como las regiones constantes son normalmente humanas.

En ciertos ligandos, las regiones variables en las cadenas ligera y pesada humanas se alteran técnicamente mediante el intercambio de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 CDRs por CDRs de origen murino, especialmente aquellas CDRs relacionadas en las SEQ. ID. NOs 3 a 8, o derivados de las mismas. Se pueden utilizar las seis CDRs o combinaciones variantes de menos de seis CDRs.

Un anticuerpo totalmente humanizado tiene las regiones marco de un anticuerpo humano y CDRs de origen murino. Este anticuerpo se comporta, en términos de respuesta antigénica, como un anticuerpo humano y comprende la combinación y características necesarias para una aplicación terapéutica, por ejemplo para el tratamiento de trastornos de la coagulación en pacientes tales como aquellos con inhibidor del Factor VIII. Una ventaja de un anticuerpo humanizado es que cuando se administra a un paciente humano normalmente se reduce la respuesta antigénica en comparación con la respuesta generada cuando se administra un anticuerpo murino.

Algunos ligandos proporcionados son anticuerpos quiméricos que se componen de secuencias murinas y humanas. Estos anticuerpos quiméricos difieren de un anticuerpo totalmente humanizado en que comprenden la totalidad de las regiones variables tal como se relacionan en las SEQ ID NOs:1 y/o 2 en combinación con las regiones constantes de ambas cadenas de una inmunoglobulina humana.

Otros ligandos son anticuerpos de cadena única que comprenden una secuencia de enlace artificial que conecta las regiones V_{L} y V_{H} de un anticuerpo, resultando en una cadena única de residuos aminoácidos que contiene ambas regiones V_{L} y V_{H}. Así, los ligandos de este tipo incluyen: (1) anticuerpos de cadena única que incluyen minianticuerpos (es decir, fragmentos de scFv, que, por ejemplo, están enlazados a secuencias ricas en prolina y dominios de oligomerización; véase, por ejemplo, Plückthun A. y Pack P., Immunotechnology, 1997, Vol. 3, pp. 83-105, cuya descripción se incorpora aquí como referencia), y (2) Fv (scFv) de cadena única, que incorpora la totalidad de la región de unión a anticuerpo en una única cadena polipeptídica.

Por ejemplo, los anticuerpos de cadena única pueden formarse mediante el enlace de los genes V a un oligonucleótido que ha sido construido como una secuencia de enlace que conecta el C-término de la primera región V con el N-término de la segunda región V. Así, en una configuración, la disposición puede representarse como V_{H}-Enlazador-V_{L}. Otra disposición puede representarse como: V_{L}-Enlazador-V_{H}. Por tanto, ambos V_{H} y V_{L} pueden estar presentes en el dominio del N-término (Huston JS y col., Int. Rev. Immunol., 1993, Vol. 10, pp. 195-217; Raag R. and Whitlow M., FASEB J., 1995, Vol. 9, pp. 73-80). La secuencia que se utiliza como secuencia de enlace puede tener, por ejemplo, una longitud de hasta 150 \ring{A}, y preferentemente de hasta 40 \ring{A} (medido en el estado alargado).

Los enlazadores peptídicos y su utilización son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Huston y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 8:5879 (1988); Bird y col., Science 242:4236 (1988); Glockshuber y col., Biochemistry 29:1362 (1990); patente de Estados Unidos Nº 4.946.778, patente de Estados Unidos Nº 5.132.405 y Stemmer y col., Biotechniques 14:256-265 (1993). En algunos casos, el enlazador peptídico no tiene una actividad biológica específica distinta que la de unir las regiones o conservar cierta distancia mínima u otra relación espacial entre el V_{H} y el V_{L}. Sin embargo, pueden seleccionarse los aminoácidos constituyentes del enlazador peptídico para influir en alguna propiedad de la molécula, tal como el plegamiento, su carga neta o la hidrofobicidad. Los anticuerpos de cadena única Fv (scFv) incluyen opcionalmente un enlazador peptídico de no más de 50 aminoácidos, en general de no más de 40 aminoácidos, preferentemente no más de 30 aminoácidos, y en especial de no más de 20 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, el enlazador peptídico es un concatámero de secuencia Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, preferentemente 2, 3, 4, 5 ó 6 de tales secuencias. Sin embargo, se debe apreciar que se pueden realizar algunas sustituciones de aminoácidos dentro del enlazador. Por ejemplo, una glicina puede ser sustituida por una valina.

Las secuencias de enlace que contienen glicina y serina son útiles debido a su flexibilidad. La glutamina y la lisina son útiles debido a su solubilidad en solución acuosa. Los anticuerpos de cadena única pueden ser también agregados (por ejemplo, como trímeros, oligómeros o multímeros). En algunos anticuerpos, sin embargo, la secuencia de enlace se omite, en cuyo caso las cadenas V_{H} y V_{L} están conectadas directamente. Los anticuerpos biespecíficos son enlazadores cruzados macromoleculares, heterobifuncionales, que tienen dos especificaciones distintas de unión dentro de una molécula única [los biespecíficos (bs) IgGs, bs IgM-IgAs, bs IgA-dímeros, bs (Fab')_{2}, bs(scFv)_{2}, diacuerpos, y bs bis Fab Fc (véase, por ejemplo, Cao Y. y Suresh M.R., Bioconjugate Chem., 1998, Vol. 9, pp. 635-644, cuya descripción se incorpora aquí como referencia) pertenecen a este grupo].

Los ligandos de anticuerpos proporcionados típicamente tienen un vida media in vivo de al menos 5 días, preferentemente de al menos 10 días, especialmente de al menos 20 días.

B. Determinación de la Actividad de los Ligandos

Tal como se ha indicado anteriormente, los ligandos que se describen aquí tienen una actividad de cofactor de Factor VIIIa o una actividad activadora del Factor IXa. Por ello, favorecen la actividad procoagulante del Factor IXa. La función de los ligandos no requiere la presencia de Factor VIII o de Factor VIIIa. En consecuencia, la función de los ligandos no se ve afectada negativamente por la presencia de inhibidores contra el Factor VIII/Factor VIIIa. En su lugar, estos ligandos pueden favorecer la actividad procoagulante del Factor IXa, incluso en presencia de estos inhibidores.

La actividad de los ligandos, a saber la capacidad de aumentar la actividad procoagulante de FIXa, se puede medir por medio del ensayo de FVIII siguiente:

Se llevan a cabo reacciones de ensayo en tubos PPN (Micronic, Holanda) en una baño de agua a 37ºC como sigue para ensayar la función de los ligandos: 220 \mul de tampón HNaBSA5 (25 mM Hepes, 175 mM NaCl, 5 mg/ml BSA, pH 7,35) que contiene 13,6 \muM de fosfolípidos (vesículas: 60% de 1-2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina, 40% de 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoserina) y 6,8 mM de Ca^{2+} se precalientan a 37ºC. Se añaden 20 \mul de FX, 20 \mul de FIXa y 40 \mul del cofactor respectivo, obteniéndose una mezcla de reacción que contiene 10 \muM de fosfolípido y 5 mM de CaCl_{2}. Después de 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20, 25 y 30 minutos, se toman partes alícuotas de 20 \mul de esta mezcla de reacción y se trasladan a 500 \mul del tampón EDTA enfriado con hielo (50 mM Tris, pH 8,3, 9 mM EDTA, 428 mM NaCl) para interrumpir la formación de FXa. La cantidad de FXa generada se determina mediante la mezcla de 210 \mul de la parte alícuota diluida con 40 \mul de una mezcla sustrato -\alphaNAPAP (5 mM FXa Pefachrome (Pefa-5523) + 6 \muM \alphaNAPAP; Pentapharm)- en una microplaca de 96 pocillos y midiendo la velocidad de segmentación del sustrato cromogénico (OD/[min]) a 405 nm, a 37ºC, en un lector de microplacas. La concentración de FXa se calcula para cada momento a partir de una curva de calibración estándar elaborada con cantidades conocidas de FXa. Este experimento se realiza con 11 nM FIXa (concentración final en la mezcla de reacción) y la concentración óptima de anticuerpos (normalmente 25 nM) en combinación con diversas concentraciones diferentes de FX (sustrato) (FX 0, 10, 20, 30, 40, 60, 80, 100, 125, 150, 200, 250 nM). Las velocidades de formación de FXa resultantes se dibujan en función de la concentración de FX y las constantes de Michaelis-Menten (V_{máx.} y K_{M}) calculadas mediante el ajuste de la curva a una hipérbola utilizando la función de solución de Windows Excel. K_{cat} se calcula de acuerdo con V_{máx.} = K_{cat} [FIXa] y la eficacia catalítica de acuerdo con cat.eff.=k_{cat}/K_{M}.

El anticuerpo 198B1 activador del Factor IXa ("FIXa") (descubierto en la WO 01/19992) y el anticuerpo 224F3 se caracterizaron mediante la determinación de los parámetros cinéticos de activación del Factor X ("FX") por los complejos FIXa-anticuerpo. Se midieron las velocidades de activación de FX en distintos sustratos (es decir, concentraciones de FX humano) en una mezcla de reacción que contenía 11 nM FIXa, 25 nM del anticuerpo respectivo y concentraciones de FX entre 0 nM y 150 nM. Se dibujó la velocidad de activación de FX (nM/min) en función de la concentración de FX y las constantes de Michaelis-Menten (K_{m} y V_{máx.}) se obtuvieron ajustando la curva a una hipérbola mediante la función de solución de Windows Excel (Fig. 3). El número de renovación, k_{cat}, se calculó dividiendo V_{máx.} entre la concentración del complejo enzimático. Los anticuerpos 198B1 y 224F3 aumentaron el k_{cat} de activación de FX por FIXa en aproximadamente 10 veces (véase la Tabla 1 y el texto a continuación). El FIXa sin cofactor, así como el FIXa en presencia de 25 nM de IgG policlonal no-específico de ratón, produjeron hipérbolas idénticas y permitieron calcular los parámetros cinéticos de FIXa sin efector. Para la comparación, se determinaron también las hipérbolas de Michaelis-Menten a distintas concentraciones del Factor VIIIa ("FVIIIa"). La V_{máx.} obtenida con los anticuerpos 198B1 y 224F3 era similar a la que se determinó en presencia de 5 pM del Factor VIII ("FVIII"), una cantidad de FVIII que corresponde a una actividad de FVIII de 16 mU/ml o un 1,6% de la concentración plasmática. Además, el FVIII disminuyó la K_{m} del FIXa en aproximadamente 2,5 veces (independientemente de la concentración real de FVIIIa). El 224F3 no influyó significativamente en la K_{m} de FX para FIXa, pero 198B1 provocó un aumento del doble para K_{m}. Sin embargo, en todos los casos, las K_{m} se situaban muy por debajo de la concentración de FX en plasma humano (136 nM). Además, sólo K_{cat} pero no K_{m} fue afectada por la concentración de anticuerpos. Finalmente, el anticuerpo 224F3 que contenía todas las secuencias mostradas en las SEQ ID NOs 1 y 2, y por tanto también SEQ ID NOs 3 a 8, mostró la máxima eficacia catalítica (k_{cat}/K_{M}), convirtiéndolo en el anticuerpo más eficaz (véase la Tabla 1, aquí a continuación). La eficacia catalítica en términos de cinética de Michaelis-Menten (k_{cat}/K_{M}) aumenta en un 688% en comparación con el FIXa sin efector.

Parámetros cinéticos de la activación de FX por FIXa sin efector y complejos FIXa-anticuerpo:

TABLA 1

1

Para demostrar que los ligandos proporcionados aquí (por ejemplo, anticuerpos y derivados de anticuerpos) muestran también una actividad análoga a FVIII en plasma humano, se realizaron experimentos de generación de trombina en plasma carente de FVIII. Este sistema de ensayo implicaba a toda la cascada de coagulación vía intrínseca, desde FXIIIa hasta la formación de trombina, así como la inactivación de los factores de coagulación por los inhibidores de proteasa en plasma, antitrombina y a_{2}-macroglobulina. Se caracterizó el período de tiempo de generación de trombina mediante una fase lag (fase de retardo) que refleja el inicio de la coagulación, seguida de una explosión de la formación de trombina. La trombina, así como otras serina-proteasas, fueron inhibidas posteriormente por antitrombina y a_{2}-macroglobulina. En primer lugar, se estudió el efecto de los anticuerpos activadores de FIXa sobre la generación de trombina en plasma carente de FVIII obtenido después de la inmunodepleción de plasma normal con un anticuerpo contra FVIII. Para su comparación, se realizaron experimentos con FVIII (Fig. 4). La adición de FVIII tuvo dos efectos sobre la generación de trombina en plasma pobre en FVIII: (i) la explosión de la formación de trombina ocurrió antes, lo que indica una reducción del tiempo de coagulación, y (ii) aumentó la cantidad de trombina que se había generado. Los anticuerpos 198B1 y 224F3 muestran los mismos efectos generales (Fig. 4), aunque con distinto alcance. Aquí, también, se demostró que el anticuerpo 224F3 (triángulo en blanco) era más eficaz que el otro anticuerpo. Como en los sistemas modelo, se encontró que el efecto de los anticuerpos sobre la generación de trombina dependía de la concentración de anticuerpos. Para ambos anticuerpos, el efecto óptimo sobre la generación de trombina a 40-60 pmol anticuerpo/ml de plasma, que es igual a la concentración de FIX (40 pmol/ml), se determinó en plasma depletado con un ELISA cuantitativo.

El plasma inmunodepletado carente de FVIII contiene actividad residual de FVIII. Por el contrario, el plasma con inhibidor de FVIII con una titulación > 10 BU no sólo contiene anticuerpos neutralizantes de FVIII, sino que carece también de actividad de FVIII. Para investigar si la actividad de los anticuerpos procoagulantes se ve afectada por la presencia de inhibidores de FVIII, se repitieron los experimentos de generación de trombina en plasma con inhibidor de FVIII. Debido a la presencia de inhibidores, no fue posible comparar la actividad de los anticuerpos procoagulantes con FVIII. Así, la actividad procoagulante de los anticuerpos se comparó con FEIBA^{TM} (Baxter Healthcare Corp. o Baxter AG), una terapia de complejo de protrombina activada frecuentemente utilizada para tratar episodios de sangrado en pacientes con inhibidor. En plasma procedente de pacientes con inhibidor, las cantidades en aumento de FEIBA^{TM} tienen el mismo efecto sobre la generación de trombina que el FVIII en plasma depletado de FVIII (Fig. 5). Cuando los anticuerpos procoagulantes se aplicaron como agentes estimulantes de FIXa, sus efectos fueron aun más pronunciados en el plasma con inhibidor que en plasma depletado de FVIII. La Figura 5 muestra el tiempo de generación de trombina obtenido en presencia del anticuerpo 224F3. En condiciones óptimas, la formación de trombina tuvo lugar 10 min antes que en ausencia de anticuerpo. De nuevo, las concentraciones de anticuerpos equimolares a la concentración de FIX en plasma muestran el máximo potencial de formación de trombina.

C. Producción de Ligandos

Los ligandos de anticuerpos pueden prepararse por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo por técnicas convencionales de hibridoma o por medio de librerías de genes con visualización de fagos, intercambio de cadenas de inmunoglobulina o técnicas humanizantes (véase, por ejemplo, Harlow E. y Lane D., en: Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory.

Por ejemplo, los anticuerpos policlonales pueden proceder de un mamífero, por ejemplo, mediante una o más inyecciones de un agente inmunizante y, si se deseara, un adyuvante. Típicamente, el agente inmunizante y/o adyuvante se inyectará al mamífero por múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales. El agente inmunizante puede incluir una proteína codificada por un ácido nucleico de las figuras o un fragmento del mismo o una proteína de fusión del mismo. Puede resultar útil conjugar el agente inmunizante a una proteína conocida por ser inmunogénica en el mamífero que se está inmunizando. Como ejemplos de estas proteínas inmunogénicas se incluyen, pero no se limitan a, hemocianina de lapa californiana, seroalbúmina, tiroglobulina bovina e inhibidor de tripsina de soja. Ejemplos de adyuvantes que se pueden emplear incluyen el adyuvante completo de Freund y el adyuvante MPL-TDM (monofosforil Lípido A, trehalosa dicorinomicolato sintética). El protocolo de inmunización puede ser seleccionado por un especialista en la técnica con la experiencia debida.

Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse utilizando métodos convencionales de hibridomas (véase, por ejemplo, Kohler & Milstein, Nature 256:495 (1975); y Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, Eds. Harlow and Lane, pp. 148-242). En un método de hibridomas, un ratón, un hámster u otro animal huésped apropiado es inmunizado típicamente con un agente inmunizante para obtener linfocitos que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente al agente inmunizante. La inmunización puede llevarse a cabo, por ejemplo, con Factor IX, Factor IXa\alpha o Factor IXa\beta completamente activado, o con fragmentos del mismo. Los hibridomas están seleccionados con objeto de que los ligandos en los sobrenadantes de las células hibridomas se unan al Factor IX/Factor IXa y provoquen un aumento de la actividad procoagulante del Factor IXa. El aumento de la actividad procoagulante se puede demostrar, por ejemplo, por métodos de ensayo conocidos en la técnica para la medida de la actividad análoga a la del Factor VIII, por ejemplo ensayos cromogénicos (véase, por ejemplo, el Ejemplo 2 más abajo). Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro. En general, se utilizan linfocitos de sangre periférica ("PBLs") si se desean células de origen humano o se utilizan células del bazo o células de los nodos linfáticos si se desean fuentes mamíferas no humanas. Luego se fusionan los linfocitos con una línea celular inmortalizada utilizando un agente fusionante adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (1986)).

Las líneas celulares inmortalizadas son habitualmente células de mamífero transformadas, en particular células de mieloma de roedor, bovino y origen humano. Normalmente, se emplean líneas celulares de mieloma de rata o ratón. Las células hibridoma se pueden cultivar en un medio de cultivo adecuado que contiene preferentemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células no fusionadas, inmortalizadas. Por ejemplo, si las células parentales carecen de la enzima hipoxantina-guanina-fosforibosil-transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluirá típicamente hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"), sustancias que impiden el crecimiento de células carentes de HGPRT.

Alternativamente, los ligandos proteináceos de aquellos revelados pueden obtenerse también por métodos de producción recombinante. En esta realización, la secuencia de ADN de los ligandos puede ser determinada por técnicas conocidas y todo el anticuerpo ADN o partes del mismo se pueden expresar en los sistemas adecuados. Se pueden utilizar métodos de producción recombinante, tales como aquellos que implican la visualización de fagos, librerías sintéticas y naturales, expresión de los anticuerpos proteínas en sistemas de expresión conocidos o expresión en animales transgénicos (Jones y col., Nature, 1986, Vol. 321, pp. 522-525; Phage Display of Peptides and Proteins, A Laboratory Manual, 1996, Eds. Kay y col., pp. 127-139; US 4.873.316; Vaughan T.J. y col., Nature Biotechnology, 1998, pp. 535-539, Persic L. y col., Gene, 1997, pp. 9-18; Ames R.S. y col., J. Immunol. Methods, 1995, pp. 177-186).

Los anticuerpos producidos de forma recombinante como ligandos se pueden obtener por medio de vectores de expresión convencionales, tales como vectores bacterianos (por ejemplo pBr322 y sus derivados), pSKF o vectores eucarióticos (por ejemplo los vectores pMSG y SV40). Aquellas secuencias que codifican el anticuerpo se pueden proporcionar con secuencias reguladoras que regulan la replicación, expresión y/o secreción de la célula huésped. Estas secuencias reguladoras comprenden, por ejemplo, promotores (por ejemplo., CMV o SV40) y secuencias señal. Los vectores de expresión pueden comprender también marcadores de selección y de amplificación, tales como el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR), higromicin-B-fosfotransferasa y timidina-quinasa. Los componentes de los vectores utilizados, tales como los marcadores de selección, replicones, intensificadores, se pueden obtener comercialmente o prepararse por medio de métodos convencionales. Los vectores se pueden construir para la expresión en varios cultivos celulares, por ejemplo en células de mamífero tales como CHO, COS, fibroblastos, células de insecto, levadura o bacterias tales como E. coli. En algunos casos, se utilizan células que tienen en cuenta la glicosilación óptima de la proteína expresada.

Los fragmentos de Fab o F(ab)_{2} como ligandos se pueden producir de acuerdo con métodos conocidos de la técnica anterior, por ejemplo mediante segmentación de un anticuerpo con enzimas proteolíticas, tales como la papaína y/o la pepsina, o mediante métodos recombinantes. Los fragmentos de Fab y F(ab)_{2} se pueden preparar también por métodos de librería de genes con visualización de fagos (Winter y col., 1994, Ann. Rev. Immunol., 12:433-455).

Se han descrito métodos para fabricar anticuerpos scFv. Véase, Huse y col., supra; Ward y col., supra, y Vaughan y col., supra. En resumen, el mARN de células-B de un animal inmunizado se aísla y se prepara el cADN. El cADN se amplifica utilizando cebadores específicos para las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras de las inmunoglobulinas. Los productos PCR se purifican y se reúnen las secuencias de ácido nucleico. Si se deseara un péptido de enlace, las secuencias de ácido nucleico que codifican el péptido se insertan entre las secuencias de ácido nucleico de las cadenas pesada y ligera. El ácido nucleico que codifica el scFv se inserta en un vector y se expresa en la célula huésped apropiada. Los scFv que se unen específicamente al antígeno deseado normalmente se encuentran en la panorámica de una librería de visualización de fagos. La panorámica se puede obtener por medio de cualquiera de varios métodos. La panorámica se puede obtener apropiadamente utilizando células que expresan el antígeno deseado en su superficie o utilizando una superficie sólida recubierta del antígeno deseado. Adecuadamente, la superficie puede ser una microesfera magnética. Los fagos no unidos se eliminan mediante lavado de la superficie sólida y los fagos unidos se eluyen.

Los anticuerpos humanos pueden obtenerse mediante diversas técnicas conocidas, incluidas las librerías con visualización de fagos (Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991); Marks y col., J. Mol. Biol. 222:581 (1991)). Se dispone también de las técnicas de Cole y col., y de Boerner y col., para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cole y col., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, p. 77 (1985) y Boerner y col., J. Immunol. 147(1):86-95 (1991)). De forma similar, se pueden elaborar anticuerpos humanos mediante la introducción de loci de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, por ejemplo ratones en los cuales los genes endógenos de inmunoglobulina han sido parcial o completamente inactivados. Bajo estimulación se observa la producción de anticuerpos humanos, que se parece estrechamente a los que se ven en humanos en todos los aspectos, incluida la reorganización de genes, el ensamblado y el repertorio de anticuerpos. Esta aproximación se describe por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos Nº 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625,126; 5.633.425; 5.661.016; y en las siguientes publicaciones científicas: Marks y col., Bio/Technology 10:779-783 (1992); Lonberg y col., Nature 368:856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild y col., Nature Biotechnology 14:845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996); Lonberg & Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995).

Se pueden preparar otros ligandos proteicos utilizando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo mediante modelación molecular (véase, por ejemplo, Grassy G. y col., Nature Biotechnol., 1998, Vol. 16, pp. 748-752; Greer J. y col., J. Med. Chem., Vol. 37, pp. 1035-1054; o Rees A. y col., en: "Protein Structure Prediction: A practical approach", (Sternberg M.J.E., ed.) IRL press, 1996, cap. 7-10, pp. 141-261).

Los ligandos se pueden purificar mediante varios métodos descritos en la técnica, por ejemplo por precipitación de sulfato de amonio, purificación por afinidad (por ejemplo proteína G-Sefarosa), cromatografía de intercambio iónico, o cromatografía en gel. Se puede utilizar diversos métodos para mostrar que los ligandos descubiertos aquí se unen al Factor IX/Factor IXa y/o aumentan la actividad procoagulante del Factor IXa y/o tienen una actividad análoga al Factor VIII, incluyendo, por ejemplo, la prueba de coagulación en una etapa (véase, por ejemplo, Mikaelsson y Oswaldson, Scand. J. Haematol., Suppl., 33, pp. 79-86, 1984), o pruebas cromogénicas tales como COATEST VIII: C® (Chromogenix) o Immunochrom (IMMUNO). En principio, se pueden emplear todos los métodos utilizados para determinar la actividad del Factor VIII. Como valor de control blanco para las medidas se puede utilizar, por ejemplo, el anticuerpo IgG de ratón no específico.

III. Ácidos Nucleicos y Células Transformadas

También se proporcionan ácidos nucleicos (por ejemplo un ADN o un ARN) que codifican los ligandos que se revelan aquí. Ciertos ácidos nucleicos, por ejemplo, incluyen una o las dos secuencias de ADN reveladas en las Fig. 6 y 7.

Se proporcionan también células huésped que contienen estos ácidos nucleicos y expresan un ligando tal como se revela aquí. Estas células son preferentemente inmortalizadas. Normalmente, estas células forman una línea celular uniforme. La célula puede ser también una célula hibridoma.

Se proporcionan asimismo métodos para producir un ligando, tal como un anticuerpo o un derivado de anticuerpo, utilizando una célula y/o un ácido nucleico tal como se ha descrito anteriormente. Estos métodos implican generalmente la inserción de un ácido nucleico que codifica un ligando en un vector de expresión para formar un constructo de expresión. El constructo resultante se introduce entonces en una célula huésped utilizando métodos convencionales para expresar el ligando proteico. El ligando proteico se separa luego de al menos otro componente de la célula huésped. Típicamente, la proteína se purifica para que el ligando sea biológicamente puro, tal como se ha definido anteriormente.

IV. Utilidades Típicas A. Métodos de Tratamiento/Composiciones Farmacéuticas

Los ligandos proporcionados son adecuados para el uso terapéutico en el tratamiento de trastornos de la coagulación, por ejemplo en el tratamiento de la hemofilia A y de pacientes con inhibidor del Factor VIII. Los ligandos se pueden administrar mediante cualquier método adecuado para administrar eficazmente el agente terapéutico al paciente, por ejemplo por administración oral, subcutánea, intramuscular, intravenosa o intranasal.

Un "paciente" es típicamente un paciente humano, pero puede incluir otros mamíferos. Así, los métodos son aplicables tanto a la terapia humana como a aplicaciones veterinarias. En la realización preferente, el paciente es un mamífero, preferentemente un primate, y en la realización todavía más preferente el paciente es un ser humano.

Los agentes terapéuticos se pueden producir como composiciones que comprenden una cantidad farmacéuticamente eficaz de los ligandos definidos anteriormente, como agente activo, en un soporte y/o diluyente farmacéuticamente aceptable. Por tanto, se proporcionan también composiciones farmacéuticas que comprenden un ligando tal como se ha definido anteriormente y un soporte y/o diluyente farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones farmacéuticas pueden estar presentes en forma de líquido o de polvo. Además, las composiciones farmacéuticas pueden comprender mezclas de distintos ligandos o derivados de los mismos. El Factor IX y/o factor IXa, Factor IXa pueden estar presentes como Factor IXa\alpha y/o Factor IXa\beta y/o Factor IX\alpha. Un ejemplo de líquido para soporte o diluyente es salino. Las soluciones son estériles, llevándose a cabo la esterilización por métodos convencionales.

La presente invención comprende también la utilización de un ligando tal como se ha definido anteriormente para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de pacientes que sufren de trastornos de la coagulación sanguínea.

Los ligandos descritos aquí se pueden utilizar de varias formas para desarrollar medicamentos contra la hemofilia A. Una aproximación implica la reducción de un anticuerpo a un formato que carece de la región Fc (por ejemplo a una forma Fab o F(ab')_{2}) y la humanización de los anticuerpos. Se pueden emplear fragmentos de anticuerpos quiméricos o totalmente humanizados en el ensayo clínico. Otra opción consiste en diseñar una pequeña molécula a partir de un sitio de unión del anticuerpo. La función efectora del anticuerpo se desarrolla mediante la unión del anticuerpo que induce cambios conformacionales en FIXa. Estos efectos se pueden obtener también mediante un pequeño proteomimético o peptidomimético que corresponde al paratope del anticuerpo. Debido a que un anticuerpo es esencialmente una molécula biológica que presenta una colección combinatoria de elementos peptídicos en un espacio tridimensional, se pueden desarrollar compuestos con una actividad análoga a FVIII (es decir un activador de FIXa) que se pueden administrar oralmente y ser también activos en presencia de inhibidores de FVIII. Los compuestos de este tipo se pueden utilizar ventajosamente en el tratamiento de la hemofilia A, ya que evitan muchos inconvenientes asociados a los tratamientos actuales, tales como la inyección intravenosa, vía molesta especialmente para los niños pequeños.

Los ligandos o las composiciones farmacéuticas pueden estar presentes en forma liofilizada para su almacenamiento y posteriormente ser suspendidas en un disolvente adecuado antes de su administración a un paciente. En general este método ha demostrado ser ventajoso para las inmunoglobulinas convencionales y, en este caso, se pueden aplicar métodos conocidos de liofilización y reconstitución.

Algunas de las composiciones proporcionadas se encuentran en una forma soluble en agua, estando presentes como sales farmacéuticamente aceptables, lo que significa la inclusión de sales de adición tanto de ácidos como de bases. El término "sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sales que conservan la eficacia biológica de las bases libres y que no se forman biológicamente o de otro modo no deseable con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y similares, y ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido maleico, ácido malónico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido p-toluensulfónico, ácido salicílico y similares. Las "sales de adición de base farmacéuticamente aceptables" incluyen aquellas que proceden de bases inorgánicas tales como sales de sodio, potasio, litio, amonio, calcio, magnesio, hierro, zinc, cobre, manganeso, aluminio y similares. Ciertas composiciones incluyen sales de amonio, potasio, sodio, calcio y magnesio. Las sales procedentes de bases no tóxicas orgánicas farmacéuticamente aceptables incluyen sales de aminas primarias, secundarias y terciarias, aminas sustituidas que incluyen aminas sustituidas de origen natural, aminas cíclicas y resinas básicas de intercambio iónico, tales como isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina y etanolamina.

Las composiciones farmacéuticas pueden incluir también uno o más de los siguientes: proteínas de soporte tales como seroalbúmina; tampones; cargas tales como celulosa microcristalina, lactosa, maíz y otros almidones; agentes de unión; dulcificantes y otros agentes aromatizantes; agentes colorantes; y polietilenglicol.

Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar en una variedad de formas de dosificación unitaria dependiendo del método de administración. Por ejemplo, las formas de dosificación unitaria adecuadas para la administración oral incluyen, pero no se limitan a, polvo, tabletas, píldoras, cápsulas y pastillas. Se reconoce que los ligandos proteicos (por ejemplo, anticuerpos) cuando se administran oralmente deben ser protegidos contra la digestión. Esto se consigue típicamente mediante la complexión de las moléculas con una composición para convertirlas en resistentes a la hidrólisis ácida y enzimática, o preservando las moléculas en un soporte adecuadamente resistente, tal como un liposoma o una barrera de protección. Son bien conocidos en la técnica los medios para proteger los agentes contra la digestión.

Las composiciones para la administración pueden incluir un ligando (por ejemplo un anticuerpo) disuelto en un soporte farmacéuticamente aceptable, preferentemente un soporte acuoso. Se pueden utilizar diversos soportes acuosos, por ejemplo soluciones salinas tamponadas y similares. Estas soluciones son estériles y generalmente están libres de materias no deseadas. Estas composiciones pueden ser esterilizadas mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según sea necesario para acercarse a las condiciones fisiológicas, tales como ajuste del pH y agentes tampón, agentes de ajuste de la toxicidad y similares, por ejemplo acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio y similares. La concentración de agente activo en estas formulaciones puede variar ampliamente y se seleccionará esencialmente en base a los volúmenes de los fluidos, viscosidades, peso corporal y similares de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado y las necesidades del paciente (por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science (15ª ed., 1980) y Goodman & Gillman, The Pharmacological Basis of Therapeutics (Hardman y col., eds., 1996)).

Los componentes utilizados para formular las composiciones farmacéuticas son preferentemente de gran pureza y están sustancialmente libres de contaminantes potencialmente nocivos (por ejemplo, al menos el grado de National Food (NF), en general al menos el grado analítico, y de forma más típica al menos el grado farmacéutico). Además, las composiciones destinadas al uso in vivo son habitualmente estériles. Hasta el punto que determinado compuesto deba ser sintetizado antes de su uso, el producto resultante típicamente está sustancialmente libre de todo agente potencialmente tóxico, particularmente de endotoxinas, que pueden estar presentes durante el proceso de síntesis o purificación. Las composiciones para la administración parental son también estériles, sustancialmente isotónicas y elaboradas bajo condiciones GMP.

Las composiciones que contienen los ligandos proporcionados se pueden administrar para el tratamiento terapéutico o profiláctico. En las aplicaciones terapéuticas, las composiciones se administran a un paciente que padece de una enfermedad de la coagulación sanguínea en una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente la enfermedad y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para cumplir con este objetivo se define como "dosis terapéuticamente eficaz". Las cantidades eficaces para este uso dependerán de la severidad de la enfermedad y del estado de salud general del paciente. Se pueden aplicar administraciones únicas o múltiples de las composiciones, dependiendo de la dosificación y con una frecuencia según se requiera y tolere el paciente. En cualquier caso, la composición debe proporcionar una cantidad suficiente de los agentes de esta invención para tratar eficazmente al paciente. Una cantidad de modulador capaz de prevenir o ralentizar el desarrollo de un trastorno sanguíneo en un paciente se denomina "dosis profilácticamente eficaz". La dosis particular necesaria para un tratamiento profiláctico dependerá de la condición médica e historial del paciente, así como de otros factores tales como la edad, el peso, el género, la vía de administración, eficacia, etc.

La dosis apropiada puede ser determinada por un especialista en la técnica por medio de técnicas conocidas (véase, por ejemplo, Ansel y col., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery; Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vol. 1-3, 1992), Dekker, ISBN 0824770846, 082476918X, 0824712692, 0824716981; Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); y Pickar, Dosage Calculations (1999)).

Ciertos métodos generalmente comprenden la administración a un paciente de una cantidad farmacéuticamente eficaz de uno o más de los ligandos definidos anteriormente. La cantidad farmacéuticamente eficaz del ligando oscila típicamente entre 0,005 y 50 mg por kg de peso corporal. Los trastornos de la coagulación sanguínea que pueden ser tratados incluyen, pero no se limitan a, la hemofilia A y la diátesis hemorrágica. El grupo de pacientes a tratar puede incluir o limitarse a los pacientes con inhibidor de hemofilia.

B. Utilidades No Terapéuticas

Además de las aplicaciones anteriores, los ligandos se pueden utilizar para aplicaciones industriales, por ejemplo para la purificación del Factor IX/Factor IXa por cromatografía de afinidad, o como componente de los métodos de detección (por ejemplo ensayos ELISA) o como agente para la identificación de una interacción con los dominios funcionales de una proteína diana.

Cuando se utilizan los ligandos en métodos de identificación, los ligandos se ligan típicamente a una etiqueta. Se conocen diversos métodos para conjugar un ligando proteico (por ejemplo un anticuerpo) a una etiqueta (véase, por ejemplo, Hunter y col., Nature, 144:945 (1962); David y col., Biochemistry, 13:1014 (1974); Pain y col., J. Immunol. Meth., 40:219 (1981); y Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982)). La duración de las composiciones con péptidos radioetiquetados o anticuerpos radioetiquetados puede prolongarse mediante la adición de sustancias que estabilizan el péptido o el anticuerpo radioetiquetado y lo protegen contra la degradación. Se puede utilizar cualquier sustancia o combinación de sustancias que estabilice el péptido o el anticuerpo radioetiquetado, incluyendo aquellas sustancias reveladas en la patente de Estados Unidos Nº 5.961.955.

Se proporcionan los siguientes ejemplos para ilustrar ciertos aspectos de los ligandos, composiciones y métodos proporcionados. Sin embargo, no se debe interpretar que estos ejemplos limitan el alcance de la invención reivindicada.

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Ejemplo 1

Generación de líneas celulares de hibridomas

Ratones Balb/c fueron inmunizados cuatro veces con FIXa humano a intervalos de una semana. Se inyectaron 100 \mug de antígeno por inmunización utilizando Al(OH)_{3} como adyuvante. Se obtuvieron células del bazo tres días después de la última inmunización y se establecieron líneas celulares de hibridomas de acuerdo con procedimientos estándar (Köhler y Milstein, Nature 256:495 (1975)). Se cultivaron, por ratón, 880 líneas celulares de hibridomas en placas de 96 pocillos, en primer lugar en un medio de selección HAT y luego en un medio de cultivo normal (RPMI-1640). Después de cuatro a cinco semanas, se cribaron los sobrenadantes en busca de una actividad análoga a la FVIII en un ensayo de selección (véase a continuación). Las líneas celulares que expresan los anticuerpos identificadas como presentando actividad análoga a la de FVIII fueron subclonadas cuatro a seis veces para asegurarse que la línea celular era monoclonal y estable.

Aislamiento de los anticuerpos específicos de FIXa que muestran una actividad análoga a la de FVIII

Se aisló una serie de anticuerpos específicos del FIXa humano que mostraban una actividad análoga a la de FVIIIa utilizando el siguiente procedimiento de selección: se inmunizaron ratones Balb/c con FIXa y, después de la inmortalización de las células del bazo, se obtuvieron líneas celulares de hibridomas.

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Ejemplo 2

Ensayo de selección

Se utilizó el kit de ensayo comercial para la actividad de FVIII COATEST VIII:C/4® (Chromogenix) para cribar los sobrenadantes de hibridomas en busca de anticuerpos que presentaban una actividad análoga a la de FVIII. El ensayo se llevó a cabo esencialmente tal como lo describe el fabricante, excepto que se redujeron los volúmenes de la muestra y del reactivo a un formato de 96 pocillos y que no se interrumpieron las reacciones a los 5 minutos, sino que se dejó que continuaran durante tres horas. Además, se añadieron 20 ng de FIXa humano en cada pocillo para aumentar la sensibilidad del ensayo. El COATEST VIII:C/4® era un ensayo todo en uno y la segmentación de FX en FXa por FIXa, así como la segmentación del sustrato cromogénico específico de FXa Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA (S-2222) tuvo lugar en el mismo pocillo de reacción. La estimulación de la actividad catalítica de FIXa por un anticuerpo específico que funcionaba como cofactor de FIXa resultó en la generación de FXa y, por tanto, en la segmentación del sustrato cromogénico. Se midió la p-nitroanilina liberada a 405 nm en un lector de microplacas de 96 pocillos (iEMS-Reader, Labsystems, Finlandia).

Se cribaron los sobrenadantes individuales de las células hibridomas en busca de la actividad análoga a la de FVIII. Brevemente, la mezcla de la enzima FIXa, el sustrato FX, fosfolípidos y Ca^{2+} se incubaron con sobrenadantes de hibridomas. Los anticuerpos agonísticos, es decir los anticuerpos de unión a FIXa que eran capaces de aumentar la actividad de la FIXa-proteasa, aceleraron la formación de FXa mediada por FIXa. La generación de FXa, indicativa de la presencia de anticuerpos agonísticos, se controló con un sustrato específico de FXa y se comprobó la liberación de p-nitroanilina. Como controles negativos se utilizaron sobrenadantes de las líneas celulares de hibridomas que expresan el IgG de ratón no específico. En paralelo, se sometieron a ensayo mediante ELISA los sobrenadantes de hibridomas en busca de anticuerpos de unión a FIXa. Este procedimiento de selección permitió el descubrimiento de 88 anticuerpos que mostraban distintos grados de actividad agonística de FIXa de entre los 5.280 sobrenadantes de hibridomas totales sometidos a ensayo, mientras que aproximadamente un 60% de las líneas celulares de hibridomas produjeron anticuerpos de unión a FIXa.

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Ejemplo 3

Producción y purificación de anticuerpos procoagulantes

Se cultivaron líneas celulares de hibridomas monoclonales en un medio de cultivo estándar (por ejemplo, RPMI-1640) durante dos a tres semanas. El IgG se purificó sobre Proteína G-Sepharose 4 Fast Flow (Amersham Biosciences) de acuerdo con procedimientos estándar (véase, por ejemplo, Jungbauer, A. y col., (1989) J. Cromatogr. 476:257-268).

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Ejemplo 4

Función de los anticuerpos procoagulantes

Todos los anticuerpos monoclonales que mostraban la actividad análoga a FVIII se purificaron y se caracterizaron luego por medio de ensayos de generación de FXa. Se identificó que dos anticuerpos monoclonales, calificados 198B1 y 224F3, mostraban la actividad más pronunciada de FVIII. Después, se describió la caracterización en profundidad de estos dos anticuerpos. Se descubrió que el anticuerpo 198B1 era estrictamente específico de FIX y FIXa humanos, ya que el ELISA y el análisis Western Blot no mostraron ninguna unión a FIX bovino o murino. Además, la incubación con FIXa bovino no resultó en la generación de FXa. Sin embargo, el anticuerpo 224F3 se unió a FIX y FIXa humanos y bovinos, pero no murinos. El ELISA de competición reveló que los dos anticuerpos interactuaban con el mismo lugar de unión en FIX. Por otra parte, los anticuerpos no competían con FVIIIa para unirse a FIXa.

Detección de la formación de Factor Xa que induce la actividad de ciertos anticuerpos

La conversión proteolítica de FX en su forma enzimáticamente activa, FXa, se logró poniendo en contacto FX con el complejo activador intrínseco del Factor X. Este complejo se componía de la proteasa FIXa unida a su cofactor FVIIIa sobre una superficie fosfolipídica cargada negativamente en presencia de iones Ca^{2+} (van Dieijen, G. y col., (1985) Thromb. Haemost. 53:396-400; y Rosing y col., (1985) Blood 65:319-332). Para determinar cuantitativamente la capacidad de los anticuerpos procoagulantes para convertir FX en FXa, se realizaron los siguientes ensayos:

Se llevaron a cabo reacciones en tubos PPN (Micronic, Holanda) en un baño de agua a 37ºC como sigue: 220 \mul de tampón HNaBSA5 (25 mM Hepes, 175 mM NaCl, 5 mg/ml BSA, pH 7,35) conteniendo 12,8 \muM de fosfolípidos y 5,9 mM de Ca^{2+} se precalentaron a 37ºC. Se añadieron 20 \mul FX, 20 \mul FIXa y 40 \mul del cofactor respectivo (anticuerpo o como control rFVIII activado por trombina) obteniéndose una mezcla de reacción que contenía 10 \muM de fosfolípido, 5 mM CaCl_{2} y 0,5 mg/ml BSA. Las concentraciones finales de FIXa, rFVIII, FX y anticuerpo dependían del tipo de análisis. Después de variar los intervalos de tiempo, partes alícuotas (20 \mul) tomadas de esta mezcla de reacción se trasladaron a 500 \mul de tampón EDTA enfriado en hielo (50 mM Tris, pH 8,3, 9 mM EDTA, 428 mM NaCl) para interrumpir la formación de FXa. La cantidad de FXa generado se determinó mezclando 210 \mul de la parte alícuota diluida con 40 \mul de una mezcla sustrato-\alphaNAPAP (5 mM Pefachrome FXa (Pefa-5523) + 6 \muM \alphaNAPAP; Pentapharm) en una microplaca de 96 pocillos y se midió la velocidad de segmentación del sustrato cromogénico (\DeltaOD/min) a 405 nm. a 37ºC, en un lector de microplacas. La concentración de FXa se calculó para cada momento a partir de una curva de calibración estándar con cantidades conocidas de FXa.

En un primer conjunto de experimentos, se incubaron 11 nM FIXa, 150 nM FX y 10 \muM de vesículas de fosfolípidos con diversas cantidades de anticuerpo (5-200 nM) en una mezcla de reacción que contenía 5 mM de iones Ca^{2+} y se siguió la generación de FXa con un sustrato cromogénico específico de FXa. El 224F3 produjo resultados más notables que el anticuerpo 198B1. Las curvas de generación de FXa obtenidas con el anticuerpo 224F3 se muestran en la Figura 2a. El incremento mediado por el anticuerpo de la velocidad de formación de FXa (nM FXa/min) dependía de la concentración y, comparado con el control tampón, se observó un aumento de la velocidad multiplicado por 10 a la concentración óptima del anticuerpo. Como control negativo, se aplicó el tampón o anticuerpos policlonales no específicos de ratón y ambos controles negativos produjeron una activación de fondo idéntica. Para su comparación, se realizaron ensayos de generación de FXa en presencia de 17,5 pM del cofactor natural FVIIIa. La curva obtenida con FVIIIa era lineal durante aproximadamente cinco minutos; a continuación, se interrumpió la generación de FXa, probablemente debido a la inactivación de FVIIIa por la disociación de su dominio A2. La generación de FXa con anticuerpos era lineal durante al menos 30 minutos. Las evaluaciones del anticuerpo revelaron además un efecto dependiente de la dosis sobre la velocidad de formación de FXa (Fig. 2b). Se obtuvo a 11 nM FIXa una respuesta lineal a la dosis hasta una concentración de mAb de aproximadamente 5 nM (es decir, hasta la presencia de un sitio de unión por cada molécula de FIXa). Entre concentraciones del anticuerpo de 10 nM y 30 nM, la velocidad de activación de FX alcanzó un máximo y bajó a concentraciones más altas de anticuerpo (Fig. 2b). En el caso de 50 nM FIXa, se obtuvo una linealidad hasta 25 nM de anticuerpo (datos no mostrados). Así, se pudo observar una respuesta lineal a la dosis hasta que FIXa se saturó con el anticuerpo.

Se formaron cantidades no detectables de FXa cuando se omitieron de la mezcla de reacción FIXa, FX, fosfolípidos o iones Ca^{2+}. Para descartar la posibilidad de que el sustrato FX fuera segmentado por trazas de FXa por activación autocatalítica, se llevaron a cabo ensayos de generación de FXa en presencia de 60 \muM de Pefablock Xa^{TM} (Pentapharm). Pefablock es un inhibidor competitivo de FXa que inhibe totalmente la actividad de FXa a esta concentración. Después del submuestreo en tampón EDTA, se diluyó el Pefablock a 2 \muM, concentración que permitió la cuantificación de FXa. Se obtuvieron las mismas velocidades de generación de FXa en ausencia y presencia de Pefablock Xa^{TM}. Estos resultados indicaban que la formación de FXa tuvo lugar cuando FXa, que estaba presente o generado en la mezcla de reacción, fue inhibido y se descartó la posibilidad de que la autocatálisis contribuyera a la generación de FXa mediada por el anticuerpo. Para resumir, los experimentos descritos en este apartado mostraron que los anticuerpos no se catalizaron o indujeron una reacción de derivación, sino que, en su lugar, funcionaban como cofactor específico para la activación proteolítica de FX por FIXa.

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Ejemplo 5

Mediciones de SPR

La interacción de FIXa con los anticuerpos fue investigada mediante tecnología de Resonancia de Plasmón de Superficie (SPR) utilizando un Instrumento BIACORE 300 (Biacore AG, Uppsala, Suecia). Se inmovilizaron anticuerpos Fc anti-ratón policlonales sobre un chip sensor CM5 y se saturaron con el anticuerpo monoclonal respectivo. Como referencia, se utilizó un IgG de ratón no específico. Se aplicaron distintas concentraciones de FIXa al chip, se apartaron y se calcularon las constantes de afinidad a partir del análisis en estado estable utilizando el programa integrante BIACORE. Las constantes de velocidad de disociación (Kd), calculadas a partir de la unión en estado estable, eran conformes con las curvas cinéticas, es decir, 4,77 x 10^{-10} M para 224F3 y 3,55 x 10^{-9} M para 198B1. El anticuerpo 224F3 tuvo la mayor afinidad con FIXa y, en todos los casos, la unión fue más fuerte en presencia de 5 mM CaCl_{2}.

La Fig. 1 muestra la unión de 5,56 nM FIXa a los dos anticuerpos monoclonales diferentes capturados por Fc\gamma anti-ratón (RAMFc) en presencia de 5 mM CaCl_{2}. FIXa mostró una afinidad más baja con los anticuerpos en presencia de 3 mM EDTA y no se unió al IgG de ratón no específico.

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Ejemplo 6

Generación de Trombina

El plasma depletado de FVIII o plasma con inhibidor de FVIII fue desfibrinado con 1 U/ml de Ancrod, eliminándose la fibrina con una varilla de agitación de plástico. Se mezclaron en tubos micrónicos 200 \mul de plasma desfibrinado y 10 \mul de anticuerpo prediluido (véanse las Fig. 4 y 5). Como control, se utilizó rFVIII en lugar de plasma depletado de FVIII y FEIBA® en lugar de plasma con inhibidor. Las concentraciones de mAb, rFVIII y FEIBA® se describen en la sección "Breve Descripción de los Dibujos". La mezcla se precalentó a 37ºC durante 5 minutos y una parte alícuota de 10 \mul se trasladó a 740 \mul de tampón Cuvet enfriado en hielo (50 mM Tris, 175 mM NaCl, 0,5 mg/ml ovoalbúmina, 20 mM EDTA, pH 7,9) para determinar el punto cero. Después, se añadieron 87,5 \mul de Pathromtin SL (Dade Behring; precalentado a 37ºC) y 25 \mul de HNBSA5 que contenía 162,5 mM de CaCl_{2} (precalentado a 37ºC) para iniciar la formación de trombina mediante la vía intrínseca de la coagulación. Después de distintos intervalos de tiempo, partes alícuotas (10 \mul) procedentes de la mezcla de reacción se trasladaron a 740 \mul de tampón Cuvet enfriado en hielo para interrumpir la formación de trombina. La cantidad de trombina presente en las partes alícuotas diluidas se determinó en un lector de microplacas con el sustrato cromogénico específico de la trombina S2238 (Chromogenix). La concentración de trombina se calculó para cada momento a partir de una curva de calibración estándar elaborada con cantidades conocidas de trombina.

Los reactivos de los experimentos descritos en la descripción fueron los siguientes. Se compraron los factores de coagulación humanos FIX, FIXa, FX, FXa y \alpha-trombina a Enzyme Research Laboratories (USA). El Factor VIII (rFVIII) de coagulación humana recombinante fue preparado por Baxter BioSciences (USA) (RECOMBINATE^{TM}). Se compró el BSA a Calbiochem (USA). El plasma humano depletado de FVIII fue preparado por Baxter BioSciences (Austria) por inmunodepleción y el plasma humano con inhibidor de FVIII fue preparado a partir de plasma de paciente por Technoclon (Austria). Se compró el IgG policlonal no específico de ratón a Sigma (USA). Las vesículas de fosfolípidos (DOPC:POPS 60:40) fueron preparadas por Baxter BioSciences (Austria) a partir de fosfolípidos sintéticos (Avanti Polar Lipids, Inc., USA). Se compró Pathromtin SL a Dade Behring (USA) y Ancrod a NIBSC (RU). Se obtuvieron FEIBA® y DAPPTIN de Baxter BioSciences (Austria).

La interacción entre el FVIII y la serina proteasa FIXa era un ejemplo destacado de la función de un efector. La unión del cofactor FVIIIa a FIXa convirtió la enzima desde una forma de actividad baja en una proteasa muy activa mediante, entre otras cosas, la inducción de un cambio conformacional en el FXIa que condujo a un incremento de la actividad de segmentación del FX. Con el fin de seleccionar los anticuerpos específicos que inducían un cambio conformacional similar en la proteasa FIXa, se adaptó un ensayo fotométrico comercial del Factor VIII, el cual se utilizó mucho para medir la actividad de FVIII en plasma. Aunque el 60% de las líneas celulares seleccionadas expresaban un anticuerpo de unión a FIX, sólo el 1,6% de los sobrenadantes de hibridomas mostró una actividad análoga a la FVIII en nuestro ensayo de selección. Esto estaba de acuerdo con nuestra hipótesis de que la activación de FIXa era un extraño descubrimiento. Los experimentos cinéticos demostraron que los anticuerpos aumentaban la actividad catalítica (k_{cat}) de FIXa en aproximadamente 10 veces, mientras que la Km de FX para FIXa se vio afectada duramente. El FVIII aumentó esencialmente la k_{cat} de FIXa y, como con el complejo anticuerpo-FIXa, el efecto de FVIII sobre FIXa dependía estrictamente de la presencia de iones Ca^{2+} y fosfolípidos. Así, se pudo concluir que el cambio conformacional provocado por el FVIII y nuestros anticuerpos era similar. Los anticuerpos procoagulantes analizados no compitieron con FVIII para la unión de FIXa, sino que compitieron uno con otro. Esto indicaba que algunos "puntos calientes" eran responsable de un cambio conformacional adecuado.

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La función efectora de los anticuerpos se confirmó en los ensayos de plasma. Por contraste a los ensayos de generación de FXa, los ensayos de plasma utilizando sistemas modelo que contenían proteínas purificadas investigaron toda la vía intrínseca de coagulación, desde FXIIa hasta la formación de trombina, así como la inactivación de los factores de coagulación activados por la antitrombina y a_{2}-macroglobulina. Los anticuerpos fueron eficaces en los ensayos de plasma de una forma dependiente de la dosis hasta que el FIX se saturaba con el anticuerpo. La eficacia era más baja que en el caso del FVIII, lo que estaba de acuerdo con los datos cinéticos obtenidos en los sistemas modelo. El anticuerpo no afectó a las otras reacciones procoagulantes, ni tampoco a la inactivación de los factores de coagulación activados por los inhibidores de proteasa en plasma. Esta conclusión se basaba en la observación de que las curvas de generación de trombina mostraban una explosión idéntica y una inactivación de la trombina con ambos anticuerpos y FVIII. Se detectó también una actividad análoga a la de FVIII en plasma depletado de FVIII y con inhibidor de FVIII, poniendo en evidencia que los anticuerpos inhibidores dirigidos contra FVIII no afectaban a la actividad de los anticuerpos procoagulantes.

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Ejemplo 7

Pruebas de la actividad procoagulante del anticuerpo 224F3 en un modelo de ratón in vivo Materiales

Se utilizaron ratones macho y hembra noqueados en Factor IX, con un peso corporal por encima de 25 g. Se compró el FIX humano a Enzyme Research Laboratories (USA). Se preparó el anticuerpo monoclonal 224F3 (subclón 224 AE3) tal como se describe en los Ejemplos 1, 2 y 3. Se compró el IgG policlonal no específico de ratón a Sigma (USA). FIX, el anticuerpo 224F3 y un IgG no específico de ratón se diluyeron hasta la concentración deseada en un tampón de aplicación (68 mM NaCl, 100 mM Glicina, 20 mM L-Histidina, pH 7,2 + 0,1% BSA). El plasma con inhibidor de FVIII se desarrolló en cabra por múltiples inyecciones de FVIII humano, se cosechó por plasmaféresis y se inactivó con calor a 56ºC durante 2 horas. El plasma con inhibidor mostró más de 2.000 BU. Se cosechó plasma de cabra normal de una cabra no inmunizada y se trató como plasma con inhibidor.

Método

Se trataron 20 ratones noqueados en FIX con plasma con inhibidor de FVIII (desarrollado en cabra, 20 ml/kg) para obtener una inmunodepleción adicional de FVIII. Después de una hora, se inyectó FIX humano en los ratones (300 U/kg = 1.500 \mug/kg), para superar la depleción de FIX. Así, los ratones se correspondían con pacientes con inhibidor de FVIII. A los 10 minutos, se trataron los ratones con el anticuerpo 224F3 (2.000 \mug/kg). Después de 10 minutos más, se realizó un clip de la cola (a 1 cm de la extremidad) y se determinaron las características del sangrado tal como se describe en Turecek y col., Thrombosis and Haemostasis 77 (3), 591-599 (1997).

Se trataron 20 ratones con plasma de cabra normal (20 ml/kg). Después de una hora, se inyectó en los ratones FIX humano (300 U/kg = 1.500 \mug/kg). A los 10 minutos se trataron los ratones con un tampón sin anticuerpos (10 ml/kg). Después de 10 minutos más, se realizó un clip de la cola (a 1 cm de la extremidad) y se determinaron las características de sangrado. Estos ratones sirvieron como grupo de control positivo, ya que mostraban la actividad de FIX y la actividad de FVIII y que, por tanto, tenían características normales de sangrado.

Se trataron 20 ratones noqueados por FIX con plasma con inhibidor de FVIII (desarrollado en cabra, 20 ml/kg) para obtener una inmunodepleción adicional de FVIII. Después de una hora, se inyectó FIX humano en los ratones (300 U/kg = 1.500 \mug/kg), para superar la depleción de FIX. Por tanto, los ratones se correspondían con pacientes con inhibidor de FVIII. A los 10 minutos, se trataron los ratones con IgG de ratón no específico (2.000 \mug/kg). Después de 10 minutos más, se realizó un clip de la cola (a 1 cm de la extremidad) y se determinaron las características de sangrado. Estos ratones se correspondían con pacientes con inhibidor de FVIII y se trataron con anticuerpos no activos y sirvieron así como grupo control negativo.

Resultados

La pérdida de sangre se determinó en cada ratón por separado cada dos minutos. Se calculó el promedio de los resultados de los 20 ratones de cada grupo, se muestran en la Figura 9. La Figura 9 muestra la pérdida de sangre que se observó durante los primeros 16 minutos en cada intervalo de tiempo. En el grupo control que conservaba toda la actividad de FVIII (sin inmunodepleción de FVIII), la pérdida de sangre fue aproximadamente de 60 \mul en los primeros dos minutos después del clip de la cola. En este grupo control, la pérdida de sangre disminuyó continuamente hasta aproximadamente 15 \mul en un intervalo de tiempo de 14-16 minutos después del clip de la cola. Después de la inmunodepleción de FVIII y el tratamiento con el anticuerpo 224F3, la pérdida de sangre mostró una característica similar: 50 \mul de pérdida de sangre en los primeros dos minutos y disminución de la pérdida de sangre hasta aproximadamente 20 \mul por intervalo de tiempo (dos minutos). Esto indicaba que había tenido lugar la coagulación de la sangre, ralentizando por tanto la pérdida de sangre. En el caso del segundo grupo control, se mostró la característica de pérdida de sangre de los ratones, totalmente desprovista de actividad de FVIII. De nuevo, se determinó la pérdida inicial de sangre en 50 \mul, pero la disminución en la pérdida de sangre no era tan notable y aumentó a los ocho
minutos.

La Figura 10 muestra los mismos datos; sin embargo, se indica la pérdida total de sangre. La pérdida de sangre del grupo que se trató con IgG de ratón no específico era más alta que en los otros dos grupos, alcanzando una pérdida total de sangre de 350 \mul a los 16 minutos. Los ratones tratados con el anticuerpo 224F3 o no inmunodepletados de FVIII mostraron una característica similar de pérdida de sangre durante los primeros 16 minutos, con una pérdida total de sangre de aproximadamente 220 \mul durante los primeros 16 minutos. Las velocidades de pérdida de sangre en los primeros 16 minutos de los 20 ratones tratados con 224F3 y de los 20 ratones tratados con IgG de ratón no específico (grupo control negativo) se compararon aplicando una prueba-t de Student. Se descubrió que la diferencia entre ambos grupos era estadistícamente notable (p < 0,02).

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Ejemplo 8

Desarrollo de Derivados del Anticuerpo 224F3 Principio

Han podido desarrollarse derivados del anticuerpo procoagulante 224F3 con actividad procoagulante potencialmente aumentada, por ejemplo mediante la introducción de mutaciones en el VL y/o en la secuencia codificadora de VH. Preferentemente, estas mutaciones se llevaron a cabo utilizando técnicas de clonación de punta y un vector de expresión bacteriano que contenía los genes VH y VL en el formato scFv (véanse, por ejemplo, los métodos relacionados en la sección II, parte C). Lo siguiente es una lista de mutaciones típicas que pudieron introducirse: (i) mutaciones específicas en VH y/o VL, (ii) mutaciones aleatorias distribuidas por toda la secuencia de VH y/o VL (por ejemplo, por PCR propenso a error (error-prone PCR) o (iii) mutaciones aleatorias dentro de una CDR específica. Estos derivados mutados pudieron ser seleccionados mediante una tecnología de visualización de fagos, enriqueciendo así las variantes scFv que pudieron unirse al FIXa humano. Las variantes pudieron expresarse en el sobrenadante utilizando técnicas de expresión estándar y se pudieron cribar en busca de la actividad análoga a la de FVIII por medio, por ejemplo, del siguiente ensayo:

Ensayo de fluorescencia para la determinación del potencial de activación de FIXa de fragmentos de anticuerpo que contienen una etiqueta de hexahistidina Materiales Tampones

\bullet

TBS: 25 mM Tris; 150 mM NaCl, pH 7,5.

\bullet

TBS/2% BSA: 2 g BSA/100 ml TBS.

\bullet

HNa: 25 mM HEPES, 175 mM NaCl, pH 7,35.

\bullet

HNaBSA5: 5 mg BSA/ml de tampón HNa.

Reactivos

\bullet

Penta-HIS anticuerpo, exento de BSA (Qiagen).

\bullet

hFIXa\beta (ERL).

\bullet

hFX (ERL).

\bullet

Fosfolípidos:

\bullet

sustrato fluorogénico Pefafluor FXa: CH_{3}SO_{2}-D-CHA-Gly-Arg-AMC.AcOH (Pentapharm LTD).

\bullet

mezcla de PL/Ca^{++}/hFX/sustrato fluorogénico: concentración final: 4,3 mM CaCl_{2}; 9,4 \muM PL; 29,3 nM hFX; 167 \muM sustrato fluorogénico.

Método

Se recubrieron los pocillos de una placa de microtitulación con 2 \mug/ml de Penta-HIS anticuerpo y se bloquearon después con TBS/2% BSA. Se diluyó el sobrenadante bacteriano que contenía las variantes expresadas de 224F3 (por ejemplo, formato scFv) en TBS/2% BSA y se incubó en los pocillos. Se lavó la placa y se incubó con FIXa humano (1 \mug/ml, diluido en HNaBSA5). Después del lavado, se aplicó la mezcla de PL/Ca^{++}/hFX/sustrato fluorogénico. Se midió la generación de la señal de fluorescencia en un lector de fluorescencia. Cuando se inmovilizó un scFv con una actividad análoga a la de FVIII en el pocillo, se pudo observar un aumento de generación de FXa y una generación acelerada de la señal de fluorescencia.

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Ejemplos de derivados del anticuerpo 224F3

Mediante la aplicación del método descrito anteriormente se construyeron varias versiones mutadas de 224F3 y se analizaron en cuanto a la unión a FIXa\beta por un ELISA y en cuanto a la actividad análoga a la de FVIII por el ensayo de fluorescencia. La Tabla 2 muestra las mutaciones puntuales que se construyeron y si la mutación influyó en la unión y/o en el potencial de activación de FIXa del anticuerpo. En particular, esta tabla muestra las mutaciones específicas introducidas en 224F3-scFv y los resultados de las pruebas posteriores en cuanto a la unión a FIXa\beta (ELISA) y al potencial de activación de FIXa (ensayo de fluorescencia). La actividad análoga al scFv de tipo salvaje se indica con un (+); la actividad notablemente inferior a la actividad de tipo salvaje se indica con un (-). Con respecto a la nomenclatura, S31l, por ejemplo, significa que el aminoácido No. 31 (serina, S) de la cadena pesada (en el bucle H1) se sustituyó por una I (isoleucina).

TABLA 2

2

Claims (11)

1. Anticuerpo que comprende un dominio V_{H} que tiene una CDR1 incluyendo la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:6, una CDR2 incluyendo la secuencia según se muestra en la SEQ ID NO:7 y una CDR3 incluyendo la secuencia mencionada en la SEQ ID NO:8, así como un dominio V_{L} que tiene una CDR1 que comprende la secuencia tal como se enuncia en la SEQ ID NO:3, una CDR2 que comprende la secuencia según se expone en la SEQ ID NO:4 y una CDR3 que comprende la secuencia mencionada en la SEQ ID NO:5, que pueden unirse al Factor IX/Factor IXa humano y bovino y aumentar la actividad de procoagulación del Factor IXa.

2. Anticuerpo según la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo comprende las dos secuencias de aminoácidos relacionadas en las SEQ ID NOs: 1-2.

3. Anticuerpo según la reivindicación 1, que se selecciona de entre el grupo consistente en un anticuerpo IgG, un anticuerpo monoclonal, un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo recombinante de cadena única, un anticuerpo humanizado y un anticuerpo etiquetado.

4. Célula que expresa un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Ácido nucleico que codifica el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

6. Método para producir un anticuerpo que puede unirse al Factor IX/IXa que comprende el cultivo de una célula según la reivindicación 4.

7. Método para producir un anticuerpo que puede unirse al Factor IX/IXa que comprende la expresión del ácido nucleico según la reivindicación 5 en una célula.

8. Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un soporte y/o diluyente farmacéuticamente aceptable.

9. Composición farmacéutica según la reivindicación 8, que comprende además Factor IX, Factor IXa\alpha, Factor IXa\beta y/o Factor IX\alpha.

10. Utilización de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en la fabricación de un medicamento para tratar un trastorno de la coagulación sanguínea.

11. Utilización según la reivindicación 10, caracterizada porque el trastorno de la coagulación sanguínea es hemofilia A o diátesis hemorrágica.