ES2901683T3

ES2901683T3 - Anticuerpo biespecífico FIXAXFX con cadena ligera común

Info

Publication number: ES2901683T3
Application number: ES19836806T
Authority: ES
Inventors: Wei Wang; E-Chiang Lee; John Blackwood; Roberto Magliozzi
Original assignee: Kymab Ltd
Current assignee: Kymab Ltd
Priority date: 2018-12-21
Filing date: 2019-12-20
Publication date: 2022-03-23
Anticipated expiration: 2039-12-20
Also published as: US20210101997A1; US11976135B2; US10815308B2; EP4015538A1; PT3723858T; SI3723858T1; TWI772724B; CN113453757B; TW202039584A; RS62848B1; PL3723858T3; BR112021012065A2; JP7530362B2; LT3723858T; CA3123177A1; DK3723858T3; EP3723858B1; HRP20220088T1; CN113453757A; EP3723858A1

Abstract

Anticuerpo biespecífico que se une a FIXa y FX y cataliza la activación de FX mediada por FIXa, en el que el anticuerpo comprende dos pares de cadenas pesadas-ligeras de inmunoglobulina, en el que un primer par de cadenaS pesadas-ligeras comprende una región Fv de unión a FIXa que comprende un primer dominio VH emparejado con un primer dominio VL, y un segundo par de cadenas pesadas- ligeras comprende una región Fv de unión a FX que comprende un segundo dominio VH emparejado con un segundo dominio VL, en el que el primer dominio VH comprende un conjunto de HCDRs que comprende HCDR1, HCDR2 y HCDR3 con secuencias de aminoácidos definidas en las que HCDR1 es SEQ ID NO: 441, HCDR2 es SEQ ID NO: 436 y HCDR3 es SEQ ID NO: 433, y en el que el primer dominio VH es al menos un 95 % idéntico al dominio VH N1280H SEQ ID NO: 443 a nivel de secuencia de aminoácidos; el segundo dominio VH comprende un conjunto de HCDRs que comprende HCDR1, HCDR2 y HCDR3 con secuencias de aminoácidos definidas en las que HCDR1 es SEQ ID NO: 598, HCDR2 es SEQ ID NO: 467 y HCDR3 es SEQ ID NO: 565, y en el que el segundo dominio VH es al menos un 95 % idéntico al dominio VH T0999H SEQ ID NO: 632 a nivel de secuencia de aminoácidos, y el primer dominio VL y el segundo dominio VL comprenden cada uno un conjunto de LCDRs que comprenden LCDR1, LCDR2 y LCDR3 con secuencias de aminoácidos definidas donde LCDR1 es SEQ ID NO: 6, LCDR2 es SEQ ID NO: 7 y LCDR3 es SEQ ID NO: 8, y en el que el primer dominio VL y el segundo dominio VL son al menos un 95 % idénticos al dominio VL 0128L SEQ ID NO: 10 a nivel de la secuencia de aminoácidos.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpo biespecífico FIXAXFX con cadena ligera común

Campo de la invención

Esta invención se refiere a moléculas biespecíficas de unión a antígenos (por ejemplo, anticuerpos) que se unen a los factores de coagulación factor IXa y factor X en la cascada de coagulación de la sangre. Estos biespecíficos sustituyen funcionalmente al factor VIII mediante la activación del factor X, lo que restablece la capacidad de coagulación de la sangre en los pacientes con deficiencia de FVIII, es decir, los pacientes con hemofilia de tipo A.

Antecedentes

La hemofilia es una enfermedad hereditaria en la que la sangre tiene una capacidad reducida de coagulación, debido a la pérdida de la función (parcial o total) de uno de los muchos factores de coagulación. La hemofilia A es una deficiencia del factor VIII de coagulación de la sangre (FVIII). La enfermedad tiene formas leves, moderadas y graves, dependiendo del grado en que el paciente conserve alguna función residual de FVIII y del equilibrio de otros componentes de la cascada de coagulación sanguínea. Si no se trata, la hemofilia A conduce a una hemorragia incontrolada, que puede provocar una discapacidad grave, especialmente por daños en las articulaciones a causa de eventos de hemartrosis. La enfermedad es a menudo mortal y puede poner en peligro la vida. Se cree que la incidencia mundial de la hemofilia A es de aproximadamente 1:10.000. La hemofilia B (deficiencia de otro factor de coagulación de la sangre, el factor IX) es menos común, con una incidencia de alrededor de 1:50.000. Ambas enfermedades están ligadas al cromosoma X, por lo que suelen afectar a los varones, de modo que la incidencia de la hemofilia A en los nacimientos masculinos se sitúa en torno a 1 de cada 5.000.

La prevención de los episodios de hemorragia es esencial para mejorar la calidad de vida de los pacientes y reducir el riesgo de pérdida de sangre mortal. En el caso de la hemofilia A, el cofactor que falta puede sustituirse mediante la administración de FVIII. El FVIII que se administra a un paciente puede expresarse de forma recombinante o puede purificarse a partir del plasma sanguíneo. Normalmente, los pacientes que siguen este tratamiento se autoinyectan FVIII cada 48 horas o 3 veces por semana.

El tratamiento con FVIII no es una solución perfecta. Un grave inconveniente es que puede desencadenar la producción de aloanticuerpos en el cuerpo. Esto hace que el tratamiento con FVIII sea ineficaz, ya que los aloanticuerpos se unen al FVIII e impiden su actividad, poniendo al paciente en una situación peligrosa si se produce una hemorragia. Dichos anticuerpos inhibidores se desarrollan en aproximadamente el 30 % de los pacientes tratados con FVIII para la hemofilia grave.

Se ha informado que el tratamiento con FVIII derivado del plasma, en lugar de la forma recombinante, tiene un menor riesgo de desencadenar anticuerpos inhibidores en los pacientes. Esto puede deberse a la forma derivada del plasma que retiene el factor de Von Willebrand (VWF), que se encuentra naturalmente en asociación con el FVIII y puede enmascarar epítopos inmunogénicos. Sin embargo, todavía no se ha producido ninguna forma de FVIII que evite completamente el riesgo de anticuerpos inhibidores.

A pesar de ser posiblemente más inmunogénico, el FVIII recombinante ofrece algunas ventajas sobre la forma derivada del plasma, ya que al ser más estable es más fácil y barato de almacenar y transportar. El riesgo de transmisión de infecciones a través de productos procedentes de donaciones de plasma sanguíneo es ahora mucho menor que en los años 80, cuando virus como la hepatitis C y el VIH se contagiaban inadvertidamente a los receptores de productos sanguíneos infectados, pero, por supuesto, sigue siendo necesario realizar estrictos controles de seguridad.

Se han desarrollado nuevas formas recombinantes de FVIII, como el polipéptido truncado de dominio B turoctocog alfa (NovoFight®). Sin embargo, estos productos son ineficaces para los pacientes que desarrollan anticuerpos neutralizantes contra el FVIII. Algunos pacientes se someten con éxito a la inducción de la tolerancia inmunitaria para evitar el desarrollo de anticuerpos anti-FVIII. Sin embargo, sigue existiendo una importante demanda de alternativas al FVIII para su uso en pacientes que tienen, o corren el riesgo de desarrollar, anticuerpos inhibidores.

Una de estas alternativas es el factor VIIa recombinante, conocido como eptacog alfa activado (NovoSeven®). Sin embargo, tiene una semivida corta y debe inyectarse cada pocas horas. Su uso se limita en gran medida a la terapia de rescate o a proporcionar cobertura hemostática durante la cirugía en hemofílicos que tienen anticuerpos inhibidores, en lugar de ser una opción viable para el tratamiento protector a largo plazo.

Otro producto disponible es el FEIBA (Actividad de Omisión del Inhibidor del Factor Ocho), un concentrado de complejo de protrombina activado (aPCC), que también puede utilizarse para controlar los episodios de hemorragia y para prevenir las hemorragias durante las intervenciones quirúrgicas en pacientes hemofílicos que tienen inhibidores del factor VIII.

En la actualidad se están llevando a cabo otras terapias alternativas, como la terapia génica, la supresión de la antitrombina mediante ARNip y un anticuerpo contra el TFPI (inhibidor de la vía del factor tisular), el concizumab.

Un enfoque es un anticuerpo IgG biespecífico humanizado dirigido tanto al factor IXa (FlXa) como al factor X (FX). El anticuerpo biespecífico se une al FIXa con un brazo y al FX con el otro brazo, reuniendo estos dos cofactores y promoviendo así la activación del FX catalizada por el FIXa del mismo modo que lo hace el FVIII. Así, el anticuerpo sustituye funcionalmente al FVIII en la cascada de la coagulación sanguínea (Figura 1). Como su estructura es completamente diferente a la del FVIII, el anticuerpo no puede ser neutralizado por los anticuerpos anti-FVIII, por lo que es adecuado para los pacientes que han desarrollado, o corren el riesgo de desarrollar, aloanticuerpos contra el FVIII administrado.

En 2012, Kitazawa et al informaron del aislamiento de un anticuerpo biespecífico FIXa/X que era capaz de activar el FX, a partir de un cribado de aproximadamente 40.000 anticuerpos biespecíficos anti-FIXa/X que habían sido producidos mediante la inmunización de 92 animales de laboratorio con FIXa o FX humano y la cotransfección de los genes de los anticuerpos anti-FIXa y anti-FX en células huésped para su expresión [1]. El anticuerpo seleccionado se refinó para generar un anticuerpo humanizado designado hBS23, que mostró actividad de coagulación en plasma deficiente de FVIII y actividad hemostática in vivo en primates [1]. Una versión más potente de este anticuerpo, denominada hBS910 [2], entró en los ensayos clínicos con el nombre de fármaco en investigación ACE910, INN emicizumab [3]. El desarrollo del ACE910 tuvo lugar en uno de los principales grupos de anticuerpos a nivel mundial. Sin embargo, se necesitaron más de 7 años para diseñar una molécula con la eficacia in vivo apropiada y con propiedades bioquímicas y biofísicas adecuadas para la fabricación a escala clínica.

En un estudio de fase I de 48 sujetos masculinos sanos que recibieron ACE910 por vía subcutánea a dosis de hasta 1 mg/kg, 2 sujetos dieron positivo a anticuerpos anti-ACE910 [4]. Se informó de que el anticuerpo tenía un perfil farmacocinético lineal y una semivida de unas 4-5 semanas [4]. Posteriormente, se administró emicizumab a 18 pacientes japoneses con hemofilia A grave, en dosis subcutáneas semanales de hasta 3 mg/kg, y se informó de que reducía el uso episódico de factores de coagulación para controlar las hemorragias en estos pacientes [5]. En diciembre de 2016, se informó de que emicizumab había cumplido su criterio de valoración principal en un ensayo clínico de fase III para reducir las hemorragias en pacientes con hemofilia A (el estudio "HAVEN 1"). Se notificó una reducción estadísticamente significativa del número de hemorragias en los pacientes tratados con profilaxis con emicizumab en comparación con los que no recibieron tratamiento profiláctico. También se informó de que el estudio había cumplido todos los criterios de valoración secundarios, incluida una reducción estadísticamente significativa del número de hemorragias a lo largo del tiempo con el tratamiento de profilaxis con emicizumab en una comparación intrapaciente en personas que habían recibido un tratamiento previo de profilaxis con agentes de derivación. Los datos de eficacia de emicizumab son, por tanto, alentadores, aunque la preocupación por la seguridad se vio incrementada por la muerte de un paciente en el estudio HAVEN 1. El fármaco aprobado lleva una advertencia en caja sobre el riesgo de microangiopatía trombótica y tromboembolismo en pacientes que reciben aPCC en combinación con emicizumab. Como se ha señalado anteriormente, el aPCC se utiliza para controlar las hemorragias en pacientes que tienen anticuerpos inhibidores del FVIII, un grupo de pacientes clave para el tratamiento con el anticuerpo biespecífico.

Es importante señalar que el manejo de la hemofilia requiere un tratamiento continuo durante toda la vida del paciente, comenzando en el momento del diagnóstico -que suele ser en la infancia- y exige una terapia que se tolere sin efectos adversos y que siga siendo eficaz durante varias décadas o incluso un siglo. Por lo tanto, la seguridad a largo plazo, incluida la baja inmunogenicidad, es de mayor importancia para un anticuerpo contra la hemofilia en comparación con los anticuerpos destinados a ser administrados durante un período más corto, como un período de semanas, meses o incluso algunos años.

El documento WO2018/098363 describe anticuerpos biespecíficos que se unen a FIXy FX, aislados de una biblioteca de anticuerpos humanos de levadura (Adimab). El documento WO2018/098363 divulgó que el aumento de la afinidad del brazo anti-FIXa de un anticuerpo biespecífico da lugar a un aumento de la actividad de FVllla (representada por la disminución del tiempo de coagulación de la sangre en un ensayo). Se generó un anticuerpo biespecífico "BS-027125" mediante la maduración por afinidad de un anticuerpo "padre" inicialmente seleccionado, que aumentó la afinidad de su brazo de unión a FIXa. Se informó de que el BS-027125 alcanzaba aproximadamente un 90 % de actividad similar a la del FVIIIa en un ensayo de coagulación de una etapa. En comparación con el emicizumab, se informó de que el BS-027125 presentaba una unión de afinidad mucho mayor con el zimógeno del factor FIX, el FIXa y el zimógeno del FX, y una unión mucho menor (no se detectó ninguna unión) con el FXa. El brazo de unión a FIX, "BIIB-9-1336", supuestamente mostró una unión selectiva a FIXa (FIX activado) con preferencia al zimógeno de FIX (FIX maduro antes de la activación proteolítica), y se descubrió que se unía a un epítopo que se solapaba con el epítopo de FIXa unido a FVIIIa. El brazo de unión al FX, "BIIB-12-917", mostró, según se informa, una unión selectiva al zimógeno del FX, careció de una unión detectable al FXa (activado) y se unió a un epítopo del FX que se encuentra dentro del péptido de activación (que está presente en el zimógeno del FX pero no en el FXa). A continuación, se introdujeron más mutaciones en anticuerpos de unión a FIX seleccionados, incluido el BIIB-9-1336, para generar bibliotecas a partir de las cuales seleccionar anticuerpos con una especificidad y/o afinidad aún mayor por FIXa.

Los documentos WO2018/141863 y WO2018/145125 también describen anticuerpos biespecíficos anti-FIXaxFX y su uso como procoagulantes para tratar o reducir las hemorragias.

El documento US 2016/222129 también describió anticuerpos biespecíficos anti-FIXaxFX que funcionan como sustitutos del FVIII, promoviendo la coagulación, y composiciones farmacéuticas que comprenden dichas moléculas.

CA 3027018 A1 describió anticuerpos biespecíficos anti-FIXaxFX que tienen una mayor actividad sustitutiva del FVIII, superior a la del ACE910 (emicizumab).

El documento US 2005/058640 describe ligandos (incluyendo anticuerpos) que pueden unirse a FIX/FIXa y activar la actividad procoagulante de FIXa.

Paz-Priel et al, en un seguimiento del estudio "HAVEN 1", que incluye HAVEN 2, 3 y 4, informaron de una baja tasa observada de formación de anticuerpos antifármaco (ADA) y de riesgo de consecuencias clínicas en pacientes tratados con emicizumab [Paz-Priel et al, Blood 132(supplement 1):633].

Hoad y Gaczy describieron el descubrimiento y la selección de anticuerpos monoclonales contra el FX y el FXa [Hoad, R & Geczy, C, Journal of Immunological Methods 136:269-278 1991].

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a moléculas biespecíficas de unión a antígenos mejoradas que se unen a los factores de coagulación de la sangre FIXa y FX. Las moléculas biespecíficas de unión a antígenos de la presente invención mejoran la activación de FX a FXa catalizada por FIXa, y pueden sustituir eficazmente el cofactor natural FVIIIa que falta en los pacientes con hemofilia A, para restaurar la capacidad de coagulación de la sangre de los pacientes. Véase la figura 2.

Como se informa aquí, los inventores lograron generar una serie de moléculas biespecíficas de unión a antígenos que tienen cualidades adecuadas para su desarrollo como productos terapéuticos, incluyendo una potencia muy alta en la mejora de la activación del FX. Se describen moléculas biespecíficas de unión a antígenos que tienen nuevos sitios de unión para el anti-FIXa y el anti-FX, que pueden utilizarse para sustituir eficazmente al FVIIIa en la cascada de coagulación de la sangre. En particular, se describe un sitio de unión anti-FIXa que es altamente activo en combinación con un conjunto de diferentes sitios de unión anti-FX y que, por lo tanto, puede incorporarse a una variedad de diferentes biespecíficos FIXa-FX, proporcionando flexibilidad para la selección de anticuerpos biespecíficos con otras características deseadas, como la facilidad de fabricación.

Los inventores han diseñado anticuerpos biespecíficos que combinan una potente actividad mimética del FVIII (según lo indicado por el alto rendimiento en los ensayos in vitro) con sólidas propiedades bioquímicas y biofísicas adecuadas para la fabricación a escala clínica (incluyendo la expresión, el ensamblaje molecular biespecífico, la purificación y la formulación), y que son de origen totalmente humano, minimizando así el riesgo de inmunogenicidad en la terapia humana in vivo.

Los aspectos de la invención se exponen en las reivindicaciones adjuntas, y a continuación se describen otras realizaciones y características preferidas de la invención.

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a moléculas biespecíficas de unión a antígenos que comprenden (i) un brazo polipeptídico de unión a FIXa que comprende un sitio de unión a FIXa, y (ii) un brazo polipeptídico de unión a FX que comprende un sitio de unión a FX. El brazo polipeptídico de unión a FIXa y/o FX puede comprender una región Fv del anticuerpo que comprende el sitio de unión a FIXa o FX respectivamente. La región Fv de un anticuerpo es un par de dominios VH-VL del anticuerpo. El dominio VH comprende HCDR1, HCDR2 y HCDR3 en un marco de dominio VH, y el dominio VL comprende LCDR1, LCDR2 y LCDR3 en un marco de dominio VL. El brazo polipeptídico puede comprender una cadena pesada de anticuerpo (opcionalmente una que comprenda una región constante de IgG) y/o una cadena ligera de anticuerpo.

Las moléculas de unión a antígeno de la presente invención pueden, por tanto, comprender

primera y segunda regiones Fv de anticuerpos, las primeras y segundas regiones Fv de anticuerpos que comprenden sitios de unión para FIXa y para FX respectivamente, y

una región de extensión de la semivida para prolongar la semivida de la molécula in vivo.

La región de extensión de la semivida puede ser una región de heterodimerización, que comprende un primer polipéptido unido covalentemente (por ejemplo, como una proteína de fusión) a la primera región Fv del anticuerpo y un segundo polipéptido unido covalentemente (por ejemplo, como una proteína de fusión) a la segunda región Fv del anticuerpo, en la que los dos polipéptidos se emparejan covalentemente y/o no covalentemente entre sí. El primer y segundo polipéptidos de la región de heterodimerización pueden tener secuencias de aminoácidos idénticas o diferentes. La región de heterodimerización puede comprender uno o más dominios constantes del anticuerpo, por ejemplo, puede ser una región Fc del anticuerpo.

Las moléculas biespecíficas de unión a antígenos de la presente invención son capaces de unirse a FIXa a través del sitio de unión a FIXa del brazo del polipéptido de unión a FIXa y de unirse a FX a través del sitio de unión a FX del brazo del polipéptido de unión a FX, y de este modo potenciar la activación catalizada por FIXa de FX a FXa. Esto puede determinarse en un ensayo de activación de FX in vitro como se describe en el presente documento.

El sitio de unión a FlXa puede ser proporcionado por un conjunto de regiones determinantes de complementariedad (CDRs) en el brazo polipeptídico de unión a FlXa, el conjunto de CDRs comprende HCDR1, HCDR2, h Cd R3 y LCDR1, LCDR2 y LCDR3.

El conjunto de HCDRs en el brazo del polipéptido de unión a FIXa son los CDRs N1280, donde HCDR1 es SEQ ID NO: 441, HCDR2 es SEQ ID NO: 436 y HCDR3 es SEQ ID NO: 433.

El conjunto de LCDRs en el brazo del polipéptido de unión a FIXa son los LCDRs de 0128L como se muestra en la Tabla S-50. LCDR1 es SEQ ID NO: 6, LCDR2 es SEQ ID NO: 7 y LCDR3 es SEQ ID NO: 8.

La región Fv del anticuerpo del brazo polipeptídico de unión a FIXa puede comprender un dominio VH generado a través de la recombinación de los segmentos génicos v, d y j de la cadena pesada de la inmunoglobulina, en el que el segmento génico v es VH3-7 (por ejemplo, VH3-7*01), en el que el segmento génico j es JH6 (por ejemplo, JH6*02), y opcionalmente en el que el segmento génico d es DH1-26 (por ejemplo, DH1-26*01), y/o puede comprender un dominio VL generado a través de la recombinación de los segmentos génicos v y j de la cadena ligera de inmunoglobulina, en el que el segmento génico v es VL3-21 (por ejemplo, VL3-21*d01) y el segmento génico j es JL2 (por ejemplo, JL2*01).

La secuencia de aminoácidos del dominio VH de un brazo de unión del polipéptido FIXa puede compartir al menos un 95 % de identidad de secuencia con un dominio VH mostrado en la Figura 20, por ejemplo, el dominio VH N1280H. La identidad de la secuencia puede ser de al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %. Opcionalmente, el dominio VH es uno de los dominios VH anti-FIX mostrados en el presente documento, como cualquiera de los mostrados en la Tabla S-9A, cualquiera de los identificados en la Tabla N, o cualquiera de los dominios VH N0128H, N0436H, N0511H, N1091H, N1172H, N1280H, N1314H, N1327H o N1333H mostrados en la Figura 20. Opcionalmente el dominio VH es N1280H, N1333H, N1441, N1442 o N1454. Opcionalmente, el dominio VH anti-FIXa comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de dichos dominios VH (por ejemplo, N1280H) con hasta 5 sustituciones de aminoácidos, es decir, 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones. Las sustituciones pueden estar opcionalmente en una o más regiones marco, por ejemplo, puede haber 1 o 2 sustituciones en FR3, opcionalmente en la posición 84 y/o 86 de IMGT.

La secuencia de aminoácidos del dominio VL puede compartir al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 10 (0128L). La identidad de la secuencia puede ser de al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %. Opcionalmente, la secuencia de aminoácidos del dominio VL es la SEQ ID NO: 10. La secuencia de aminoácidos del dominio VL puede ser alternativamente SEQ ID NO: 416.

El sitio de unión a FX puede ser proporcionado por un conjunto de CDRs en el brazo polipeptídico de unión a FX. El brazo polipeptídico de unión a FX puede comprender un par de dominios VH-VL de anticuerpos (es decir, una región Fv de anticuerpos), el dominio VH que comprende HCDR1, HCDR2 y HCDR3 en un marco, y el dominio VL que comprende LCDR1, LCDR2 y LCDr 3 en un marco.

El sitio de unión a FX puede ser proporcionado por los HCDR del dominio VH T0999H mostrado en la Tabla S10-C y los LCDR 0128L.

El brazo polipeptídico de unión a FX puede comprender un dominio VH que tenga al menos un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con el dominio VH T0999H. La identidad de la secuencia puede ser de al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %. Opcionalmente, el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de dicho dominio VH con hasta 5 sustituciones de aminoácidos, es decir, 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones. Las sustituciones pueden ser opcionalmente en una o más regiones del marco.

El brazo polipeptídico de unión a FX puede comprender la secuencia de aminoácidos del dominio VH de T0201H, T0687H, T0736H o T0999H.

El brazo polipeptídico de unión a FX puede comprender un dominio VL que tenga al menos un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con el dominio VL 0128L SEQ ID NO: 10. La identidad de la secuencia puede ser de al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %. Opcionalmente, el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos del dominio VL 0128L con hasta 5 sustituciones de aminoácidos, es decir, 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones. Opcionalmente, la secuencia de aminoácidos del dominio VL es la SEQ ID NO: 10. Alternativamente, la secuencia del dominio VL es SEQ ID NO: 416.

El brazo polipeptídico de unión a FX puede comprender una región Fv del anticuerpo que comprende

un dominio VH generado a través de la recombinación de los segmentos génicos v, d y j de la cadena pesada de la inmunoglobulina, donde los segmentos génicos v y j son IGHV1-46 (por ejemplo, VH1-46*03) e IGHJ1 (por ejemplo, JH1*01), y opcionalmente donde el segmento génico d es IGHD6-6 (por ejemplo, DH6-6*01), y

un dominio VL generado a través de la recombinación de los segmentos génicos v y j de la cadena ligera de inmunoglobulina, en el que los segmentos génicos v y j son IGLV3-21 (por ejemplo, VL3-21*d01) e IGLJ2 (por ejemplo, JL2*01).

También se describe un anticuerpo biespecífico que se une a FlXa y FX y cataliza la activación de FX mediada por FlXa, en el que el anticuerpo comprende dos pares de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, en el que

un primer par de cadena pesada-ligera comprende una región Fv de unión a FIXa que comprende un primer dominio VH emparejado con un primer dominio VL, y

un segundo par de cadenas pesadas y ligeras comprende una región Fv de unión a FX que comprende un segundo dominio VH emparejado con un segundo dominio VL, en el que

el primer dominio VH es un producto de la recombinación de los segmentos genéticos v, d y j de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana, donde el segmento génico v es IGHV3-7 (por ejemplo, VH3-7*01) y el segmento génico j es IGHJ6 (por ejemplo, JH6*02),

el segundo dominio VH es un producto de la recombinación de los segmentos génicos v, d y j de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana, donde el segmento génico v es IGHV1-46 (por ejemplo, VH1-46*03) y el segmento génico j es IGHJ1 (por ejemplo, JH1*01), y opcionalmente donde el segmento génico d es IGHD6-6 (por ejemplo, DH6-6*01), y

el primer dominio VL y el segundo dominio VL son ambos productos de la recombinación de los segmentos génicos v y j de la cadena ligera de inmunoglobulina humana, en los que el segmento génico v es IGLV3-21 (por ejemplo, VL3-21*d01) y el segmento génicoj es IGLJ2 (por ejemplo, JL2*01).

Las secuencias de aminoácidos de ejemplos de dominios VH y conjuntos de CDR VH se muestran en la Figura 20 y/o en la Tabla S-9A. El primer dominio VH del anticuerpo biespecífico puede ser, o puede tener al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con cualquiera de estos dominios VH. Opcionalmente puede comprender una secuencia de aminoácidos del dominio VH que tenga hasta 5 sustituciones de aminoácidos, es decir, 1,2, 3, 4 o 5 sustituciones con respecto a dicho dominio VH. Las sustituciones son opcionales en las regiones marco.

Entre los ejemplos de residuos y sustituciones que pueden conservarse o introducirse en el primer dominio VH se incluyen los siguientes (definidos con referencia a N1280H, con numeración IMGT como se muestra en la Figura 14):

Sustitución de otro residuo (por ejemplo, Asp, Glu, His, Asn, Gin, Met, Thr, Gly, Ser, Ala, Ile, Leu, Val o Tyr) en el Lys84 del FR3, por ejemplo, Lys84Asp o Lys84Glu; y

Sustitución de otro residuo en Ser86 en FR3, por ejemplo, un residuo cargado negativamente como Glu (Ser86Glu).

Otros ejemplos incluyen:

Sustitución de un residuo cargado negativamente (por ejemplo, Asp o Glu) o His en uno o más de los FR1 Gln3, Val5, Gly9, Gly11, Gly16, Gly17 y Leu21, como cualquiera de Gln3Asp, Gln3Glu, Gln3His, Val5Glu, Gly9Glu, Gly11Asp, Gly11Glu, Gly11His, Gly16Glu, Gly17Asp, Gly17Glu o Leu21Asp;

Sustitución de un residuo cargado negativamente en Val68 y/o Val71 en FR3, por ejemplo, Val68Asp, Val68Glu o Val71Glu;

Sustitución de His, Gln o Leu en Arg75 en FR3;

Sustitución de Ser, Thr, Gly, Leu o Lys en Arg80 en FR3; y

Sustitución de Asp o His en Asn82 en FR3.

Pueden incluirse una o varias de las características de la secuencia antes mencionada.

El segundo dominio VH puede ser, o puede tener al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con el dominio VH T0999H mostrado en la Tabla S-10C. Opcionalmente puede comprender una secuencia de aminoácidos del dominio VH que tenga hasta 5 sustituciones de aminoácidos, es decir, 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones con respecto a dicho dominio VH. Las sustituciones son opcionales en las regiones marco.

Ejemplos de residuos y sustituciones que pueden conservarse o introducirse en el segundo dominio VH incluyen los siguientes (definidos con referencia a T0201H, con numeración IMGT como se muestra en la Figura 13):

Sustitución de otro residuo de aminoácido en Cys114, por ejemplo, donde el residuo sustituido es Ile, Gin, Arg, Val o Trp, (preferentemente Ile, Val o Leu);

Sustitución de Gln3 por otro residuo con carga positiva en el FR1, por ejemplo, Gln3Arg o Gln3Lys; La determinación de línea germinal de residuos en regiones marco, por ejemplo, Ile5Val (sustitución de valina por isoleucina en el residuo 5 de FR1), o sustitución de un residuo que no son de línea germinal en una región marco por un residuo que no es de línea germinal diferente, por ejemplo, Ile5Arg (sustitución de arginina por isoleucina en el residuo 5 de FR1);

Sustitución de otro residuo de aminoácido (por ejemplo, Lys, Ala o Gly) en Glu11 en FR1, por ejemplo, Glu11Lys;

Sustitución de un residuo de aminoácido cargado positivamente porGly16 en FR1, por ejemplo, Gly16Arg;

Presencia de Met en la posición 39 en FR2, o alternativamente Leu en esta posición;

Presencia de Ser en la posición 62 y/o en la posición 64 en la CDR2;

Sustitución de Tyr en Phe71 en FR3;

Sustitución de un residuo cargado positivamente en Thr82 en FR3, por ejemplo, Thr82Arg o Thr82Lys; Presencia de Ser en la posición 85 en FR3, o alternativamente Thr en esta posición;

Sustitución de un residuo cargado positivamente en Thr86 en FR3, por ejemplo, Thr86Arg o Thr86Lys.

El brazo del polipéptido de unión a FIXa y el brazo del polipéptido de unión a FX pueden comprender cada uno un anticuerpo Fv, en el que el dominio VL de cada Fv tiene una secuencia de aminoácidos idéntica, es decir, la moléculas biespecífica de unión a antígenos tiene un dominio VL común. La molécula puede tener una cadena ligera común que comprende una región variable y una región constante, opcionalmente una región constante lambda humana.

La moléculas biespecífica de unión a antígenos puede ser una inmunoglobulina tetramérica que comprende

un primer par de cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo (par de cadenas pesadas y ligeras) que comprende una región Fv de unión a FIXa,

un segundo par de cadena pesada-ligera que comprende una región Fv de unión a FX,

en la que cada cadena pesada comprende un dominio VH y una región constante, y cada cadena ligera comprende un dominio VL y una región constante, y en la que el primer y el segundo par de cadenas pesadas y ligeras se asocian mediante la heterodimerización de sus regiones constantes de cadena pesada para formar el tetrámero de inmunoglobulina.

Como se ha señalado, la cadena ligera puede ser una cadena ligera común, es decir, la cadena ligera del primer y segundo par de cadenas pesadas y ligeras tiene una secuencia de aminoácidos idéntica. Cada par de cadena pesadaligera puede comprender el dominio constante 0128L CL emparejado con un dominio CH1. La secuencia de la cadena ligera puede ser SEQ ID NO: 405. Alternativamente, la secuencia de la cadena ligera puede ser SEQ ID NO: 414. Los isotipos de inmunoglobulina ejemplares incluyen la IgG humana, por ejemplo, la IgG4, opcionalmente con dominios constantes de ingeniería como la IgG4 PE.

El dominio Fc de un anticuerpo biespecífico puede ser diseñado para promover la heterodimerización sobre la homodimerización. Por ejemplo, la región constante de la cadena pesada del primer par cadena pesada-ligera puede comprender una secuencia de aminoácidos diferente de la región constante de la cadena pesada del segundo par cadena pesada-ligera, en la que las diferentes secuencias de aminoácidos están diseñadas para promover la heterodimerización de las regiones constantes de la cadena pesada. Algunos ejemplos son las mutaciones de botón en ojal o las mutaciones de pares de carga. Alternativamente, la región constante de la cadena pesada del primer par de cadena pesada-ligera puede ser idéntica a la región constante de la cadena pesada del segundo par de cadena pesada-ligera, en cuyo caso se espera que se ensamblen tanto homodímeros como heterodímeros, y éstos se separarán posteriormente utilizando uno o más pasos de purificación en el proceso de fabricación de anticuerpos para aislar el heterodímero deseado que comprende un brazo anti-FIXa y un brazo anti-FX.

Una característica ventajosa de los anticuerpos biespecíficos aquí ejemplificados es que han sido generados a partir de segmentos genéticos de inmunoglobulina humana, utilizando la plataforma Kymouse. A diferencia de los anticuerpos generados a partir de la inmunización de animales normales de laboratorio, que pueden requerir pasos de "humanización" como el injerto de CDR de ratón en dominios variables de anticuerpos humanos y el refinamiento iterativo de los dominios variables diseñados para mitigar una pérdida de función resultante de estos cambios, los anticuerpos de la presente invención se generaron y seleccionaron desde el principio con dominios variables de anticuerpos totalmente humanos. El uso de un anticuerpo totalmente humano es de especial relevancia en el contexto del tratamiento de la hemofilia, donde la baja inmunogenicidad es primordial, como se ha señalado anteriormente. La baja inmunogenicidad de los anticuerpos biespecíficos de la presente invención los hace adecuados para el tratamiento de pacientes con hemofilia A, incluidos aquellos con o sin anticuerpos inhibidores de otros tratamientos como el FVIII. Los pacientes que reciban las moléculas de unión a antígeno de la presente invención deberían tener un riesgo mínimo de desarrollar una respuesta inmunogénica a la terapia.

El modo de acción de las moléculas biespecíficas también se asocia con un buen perfil de seguridad, con bajo riesgo de complicaciones como la trombosis venosa profunda y la embolia pulmonar. La actividad de las moléculas biespecíficas es comparable a la del FVIII natural y su mecanismo de acción se integra en la vía de coagulación sanguínea existente, activándose únicamente en el contexto del desencadenamiento previo de la cascada de coagulación natural.

Los anticuerpos biespecíficos según la presente invención han mostrado una fuerte actividad en una serie de ensayos funcionalmente relevantes para la actividad mimética del FVIII, incluyendo el ensayo de factor Xasa, el ensayo de tiempo de tromboplastina parcial activado (aPTT) y el ensayo de generación de trombina (TGA), como se ejemplifica en el presente documento.

Otras características deseables son la larga semivida (que reduce la frecuencia de administración necesaria) y la posibilidad de formular las moléculas a alta concentración (que facilita la inyección subcutánea en el hogar).

Se reconoce que el cumplimiento del paciente es un problema importante para la terapia autoadministrada a largo plazo, especialmente entre los pacientes adolescentes y adultos jóvenes. Para que un tratamiento tenga éxito sobre el terreno, su programa de administración debe ser sencillo para que el paciente lo entienda y lo siga con las mínimas molestias. Los intervalos largos entre las dosis administradas son deseables, pero la reducción de la frecuencia de las dosis sin sacrificar la actividad terapéutica requiere un producto con una larga semivida in vivo y una eficacia suficiente en las concentraciones "mínimas" hacia el final de un período de dosificación. Las moléculas de unión a antígeno según la presente invención tienen deseablemente una larga semivida in vivo . Esto puede facilitarse mediante la inclusión de una región Fc que se recicla in vivo a través del FcRn. Las moléculas de unión a antígeno según la presente invención también mantienen preferentemente una elevada actividad funcional a baja concentración. Encontramos que los anticuerpos biespecíficos según la presente invención tienen una actividad trombogénica similar a la del emicizumab, pero con un aumento de la actividad trombogénica que es más pronunciado a concentraciones más bajas. Los datos divulgados en el presente documento indican que los anticuerpos biespecíficos según la presente invención poseen una actividad trombogénica que es igual o supera la de emicizumab a concentraciones en al menos el intervalo de 1 a 300 nM, por ejemplo cuando el anticuerpo y el emicizumab se prueban a las siguientes concentraciones:

1 - 30 nM, por ejemplo, a 1 nM, a 3 nM, a 10 nM y/o a 30 nM;

100 - 300 nM, por ejemplo, a 100 nM y/o a 300 nM.

La actividad puede medirse en el ensayo de generación de trombina aquí descrito. La actividad efectiva a bajas concentraciones puede ayudar a garantizar que la protección contra las hemorragias se mantenga hacia el final de un período de dosificación, ya que la concentración in vivo del anticuerpo es más baja en los últimos días antes de la siguiente dosis. También puede ayudar a proteger zonas del cuerpo que están relativamente mal perfundidas por la circulación, incluidas las articulaciones, que son un lugar habitual de hemorragias problemáticas en los pacientes hemofílicos.

Otros aspectos de la invención se refieren a las composiciones farmacéuticas que comprenden las moléculas biespecíficas de unión a antígenos y su uso en medicina, incluyendo para el tratamiento de la hemofilia A, como se establece en las reivindicaciones adjuntas y se describe en la presente divulgación.

También se proporcionan anticuerpos monoespecíficos como aspectos de la presente invención. Así, un anticuerpo anti-FIXa puede comprender dos copias de un primer par cadena pesada-ligera como se define en el presente documento. Un anticuerpo anti-FX puede comprender dos copias de un segundo par cadena pesada-ligera como se define en el presente documento.

Otros aspectos incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican secuencias de los anticuerpos descritos en el presente documento, células huésped que contienen dichos ácidos nucleicos y procedimientos de producción de los anticuerpos mediante el cultivo de las células huésped y la expresión y opcionalmente el aislamiento o la purificación de los anticuerpos. De este modo se obtiene el anticuerpo expresado. Los dominios VH y VL de los anticuerpos descritos en el presente documento pueden producirse de forma similar y son aspectos de la presente invención. Los procedimientos adecuados de producción de anticuerpos incluyen la expresión a gran escala a partir de células huésped (por ejemplo, células de mamífero) en un biorreactor mediante cultivo continuo o por lotes (por ejemplo, cultivo por lotes alimentado).

Breve descripción de los dibujos

Aspectos y realizaciones de la invención se describirán ahora con más detalle, con referencia a los dibujos, en los que:

La figura 1 ilustra la cascada de coagulación de la sangre [6].

La figura 2 muestra (A) la acción cofactora del FVIIIa interactuando con el FlXa y el FX; (B) la acción cofactora del anticuerpo biespecífico interactuando con el FIXa y el FX; y (C) el anticuerpo biespecífico interactuando con el FIXa (9a) y el FX (10) en la superficie de una plaqueta. El anticuerpo biespecífico en esta realización es una molécula de cuatro cadenas que tiene dos cadenas pesadas ligadas por disulfuro, cada una de las cuales comprende dominios (N a C) VH1-CH1-CH2-CH3 y dos cadenas ligeras idénticas (cadena ligera común) que comprenden dominios (N a C) VL-CL. En esta ilustración, el sitio de unión que comprende VH1-VL se une a FX y el sitio de unión que comprende VH2-VL se une a FXa.

La figura 3 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 334) del factor IX, con numeración de residuos para la proteína madura. El péptido señal (subrayado recto) se escinde después de la secreción. El propéptido (subrayado en onda) se escinde en la maduración. El factor IX maduro contiene una cadena ligera (residuos 1-145) y una cadena pesada (residuos 146-415). El péptido de activación (en recuadro) se escinde en la activación, generando el factor IXa activado que contiene una cadena ligera (residuos 1-145) y una cadena pesada (residuos 181-415, en negrita) unidas por un puente disulfuro entre Cys132 y Cys289.

La figura 4 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 335) del factorX, con numeración de residuos. Los residuos 1-31 son un péptido señal (subrayado recto). Los residuos 32-40 son un propéptido (subrayado en onda). La cadena ligera Fx tiene los residuos 41 - 179. La cadena pesada del FX son los residuos 183 -488. La cadena pesada del FXa son los residuos 235 - 488 (en negrita).

La figura 5 muestra una realización de la invención: IgG biespecífica con cadena ligera común.

La Figura 6 resume el proceso de optimización de la secuencia del dominio VH anti-FIXa N0436H y de la secuencia del dominio Vh anti-FX T0200 para su combinación funcional entre sí y para su emparejamiento con el dominio VL común N0128L.

La figura 7 ilustra (A) los principios del ensayo in vitro para la actividad mimética del FVIII de una molécula biespecífica (ensayo de FXasa o tenasa); y (B) datos de ejemplo del ensayo que muestran un resultado positivo para la molécula biespecífica FIXa-Fx en comparación con el control negativo.

La figura 8 muestra los resultados del cribado de anticuerpos biespecíficos con varios brazos anti-FX en el ensayo de FXasa (condiciones de reacción estándar). El panel de anticuerpos biespecíficos comprende una gama de dominios de prueba VH anti-FX, cada uno en combinación con el dominio VH anti-FIX N0128H y el dominio VL común 0128L.

La figura 9 ilustra el grupo de células B identificado para el linaje del dominio anti-FX T0200H.

La figura 10 muestra los resultados del cribado de los anticuerpos biespecíficos optimizados en el ensayo FXasa. (A) Actividad FXasa para los anticuerpos biespecíficos IgG4 que comprenden el dominio Vh denominado anti-FX combinado con el dominio Vh anti-FIX N0128H, N1172H o N1280H y la cadena ligera común 0128L. OD a 405 nm a los 10 minutos (600s). (B) Actividad FXasa para los anticuerpos biespecíficos IgG4 que comprenden el dominio VH denominado anti-FX combinado con el dominio VH anti-FIX N1280H y la cadena ligera común N0128L.

La Figura 11 es una alineación de la secuencia de aminoácidos de una selección de dominios VH anti-FX del grupo de células B T0200H. Secuencia de la línea germinal (SEQ ID NO: 518) se muestra a modo de comparación. Los CDR están en caja.

La Figura 12 identifica los mutantes del dominio VH T0201H en los que los cuatro residuos terminales de la CDR3 fueron mutados individualmente a otros aminoácidos. Por ejemplo, el dominio VH T0590H es un mutante Cys114Ala del dominio VH T0201H, es decir, en el que la cisteína en la posición 114 del IMGT se sustituye por alanina.

La figura 13 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VH T0201H, anotada en (A) para mostrar FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4, y en (B) para mostrar la numeración IMGT.

La figura 14 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VH N0128H, alineada con N192H y N1280H y anotada en (A) para mostrar FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4, y en (B) para mostrar la numeración IMGT.

La figura 15 muestra la cinética de actividad de (A) IXAX-1280.0201.0128 y de (B) el anticuerpo comparador AbE en el ensayo de FXasa. El anticuerpo se purificó mediante proteína A y está compuesto por una mezcla de homodímero/heterodímero.

La figura 16 muestra los resultados de los anticuerpos biespecíficos en el ensayo de la Xasa. "E" es el control positivo del anticuerpo E. Las actividades de la FXasa se representan como OD405nm a los 10 minutos para las muestras normalizadas a una concentración final de 12,5 pg/ml (10,4 nM). Los anticuerpos biespecíficos se clasifican por orden de actividad.

La figura 17 muestra el efecto de la optimización del anticuerpo biespecífico sobre la actividad mimética del FVIII (FXasa). Se muestran los resultados de los anticuerpos biespecíficos, cada uno de los cuales tiene el denominado dominio VH en el brazo anti-FIXa y el dominio VH T0638H en el brazo anti-FX, ambos emparejados con el dominio VL de la cadena ligera común 0128L. La actividad mimética del FVIII (FXasa) se midió mediante un ensayo cromogénico de activación del Factor X in vitro a 405 nm (eje Y) en función del tiempo en segundos (eje X). Los anticuerpos biespecíficos optimizados están marcados individualmente. Un control de isotipo IgG4 humano no demuestra actividad mimética del FVIII. La clave muestra el nombre del dominio VH en el anticuerpo a la derecha de su gráfico correspondiente en orden de máxima actividad FXasa, es decir, N1333H > N1280H > N1172H > N1091H > N0511H > N0436H > N0128H > control.

La Figura 18 muestra los resultados del ensayo aPTT para los anticuerpos biespecíficos IgG4 que comprenden el dominio VH denominado anti-FX combinado con el dominio VH anti-FIX N0128H, N1172H o N1280H y la cadena ligera común 0128L.

La figura 19 muestra una respuesta a la dosis del anticuerpo biespecífico IXAX-1280.0201.0128 (purificado en proteína A) en un ensayo de coagulación del aPTT activado en una etapa utilizando plasma humano empobrecido en FVIII.

La Figura 20 muestra las secuencias de aminoácidos del dominio VH de N0128H, N0436H, N0511 H, N1091H, N1172H, N1280H, N1314H, N1327H y N1333H, anotadas para identificar sus regiones marco y CDR.

La Figura 21 es un sensorgrama SPR de la unión del anticuerpo biespecífico al antígeno, donde se demuestra la unión simultánea a FIXy FX, comparado con el sensorgrama de (A) el anticuerpo de control del isotipo o (B) el anticuerpo monoespecífico.

La Figura 22 presenta los resultados resumidos de los ensayos de FXasa para las variantes de secuencia CDR1 y CDR2 seleccionadas de T0681H. Excepto cuando se indica para los controles de AbE, las muestras se purificaron mediante cromatografía de proteína A y sus concentraciones finales se normalizaron a 12,5 |jg/ml (10,4 nM). Se incluyen 3 muestras de anticuerpo de control positivo AbE: (i) proteína A purificada; 12,5 |jg/ml; (ii) proteína A purificada; 37,5 jg/ml; (iii) proteína A purificada seguida de una nueva purificación por cromatografía de intercambio iónico; 37,5 jg/ml. Todos los datos mostrados fueron muestreados en el punto de tiempo de 10 minutos.

La figura 23 resume el efecto de la mutagénesis de las CDR1, CDR2 y CDR3 de T0201H sobre la actividad de la FXasa del anticuerpo biespecífico in vitro. Los anticuerpos biespecíficos anti-FX T0201H variante de dominios VH se expresaron con el brazo anti-FIX N01280H y la cadena ligera común N128_IgL en células HEK, se purificaron mediante cromatografía de proteína A y se normalizaron por concentración a 0,15 mg/ml (concentración final de 125 nM). El ensayo de FXasa in vitro se realizó utilizando 5 j l de material purificado. Los datos mostrados son en el punto de tiempo de 10 minutos. La línea de puntos representa la actividad FXasa de T0201H.

La Figura 24 presenta un resumen de los resultados de los ensayos de coagulación aPTT que investigan el efecto de la variación de la secuencia en el dominio VH del anti-FX T0201H sobre la actividad del anticuerpo biespecífico. El tiempo de coagulación (segundos) se registró después de añadir plasma deficiente en FVIII con anticuerpos biespecíficos que incluían el brazo anti-FX VH, el brazo anti-FIX N01280H y la cadena ligera común N128_IgL. Los anticuerpos biespecíficos se expresaron en células HEK, se purificaron mediante cromatografía de proteína A y se analizaron a tres concentraciones diferentes 0,1 mg/ml, 0,3 mg/ml y 0,5 mg/ml. Las líneas punteadas indican los tiempos de coagulación del plasma deficiente en FVIII sembrado con un control de isotipo IgG4 humano o o plasma humano agrupado normal sembrado con PBS.

La Figura 25 identifica las CDR de los dominios VH que fueron mejoradas progresivamente para la actividad mimética del FVIII durante el proceso de mutagénesis. El sombreado negro identifica los dominios VH mejor que los de la misma sub-tabla.

La figura 26 muestra la curva de generación de trombina del plasma normal agrupado utilizando el factor IXa como activador en un ensayo de generación de trombina (TGA). El trombograma representa la generación de trombina a lo largo del tiempo en el plasma de la muestra, trazado como la concentración (nM) de trombina generada durante la coagulación a lo largo del tiempo (minutos).

La Figura 27 describe la generación de trombina del plasma deficiente en FVIII al que se le siembran anticuerpos biespecíficos a una concentración final de 133 nM que comprenden variantes simples y combinadas de CDR1, CDR2 y CDR3 de T0201H, en comparación con AbE, el control de isotipo, el plasma normal y el calibrador de emicizumab. Disparo de FIXa a 0,3 nM. (A) Trombograma de 80 minutos. (B) Trombograma de 25 minutos.

La Figura 28 muestra la Cmáx de la trombina (nM) y la Tmáx (min) del TGA llevada a cabo en plasma con deficiencia de FVIII al que se le añadieron anticuerpos biespecíficos que comprenden mutantes simples y combinados de CDR1, CDR2 y CDR3 de T0201H, en comparación con AbE, control de isotipo, plasma normal y calibrador de emicizumab. Los anticuerpos de prueba se purificaron únicamente mediante cromatografía de proteína A y, por tanto, representan una mezcla de heterodímero y homodímero. (A) Concentración de anticuerpos 133 nM. (B) Concentración de anticuerpos 80 nM.

La Figura 29 ilustra las respuestas de dosis Cmáx (nM) y Tmáx (min) del TGA realizada en plasma deficiente de FVIII sembrado con (A) anticuerpo biespecífico IXAX-1280.0999.0128 y (B) calibrador de emicizumab. El control de isotipo (signo positivo) utilizado fue una IgG4 humana y se sembró en plasma deficiente de FVIII. El plasma normal agrupado (signo de la cruz) se sembró con PBS.

La figura 30 muestra las curvas dosis-respuesta para la Cmáx de IXAX-1280.0999.0325 y AbE en TGA. Las líneas de puntos verticales indican la concentración final de anticuerpos correspondiente a 4,5 pg/ml (30 nM), 10 pg/ml (66,6 nM) y 45 pg/ml (300 nM). Las líneas horizontales representan la Cmáx del plasma normal agrupado recogido de voluntarios sanos.

La figura 31 muestra los trombogramas de (A) IXAX-1280.0999.0325 "BiAb_1" y (B) AbE, en plasma humano empobrecido en FVIII, a concentraciones de anticuerpos de 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM y 300 nM. El trombograma de una muestra de plasma humano normal se muestra en la sombra.

La figura 32 muestra las curvas dosis-respuesta para Tmáx de IXAX-1280.0999.0325 y AbE en TGA. Las líneas de puntos verticales indican la concentración de anticuerpos correspondiente a 4,5 pg/ml (30 nM), 10 pg/ml (66,6 nM) y 45 pg/ml (300 nM). Las líneas horizontales representan la Tmáx del plasma normal agrupado recogido de voluntarios sanos.

La figura 33 muestra las capacidades de generación de trombina en términos de (A) Cmáx y (B) Tmáx de BiAb_1 (IXAX-1280.0999.0325), BiAb_2 (IXAX-1454.0999.0325), BiAb_3 (IXAX-1441.0999.0325) y BiAb_4 (IXAX-1442.0736.0325) en comparación con el calibrador de emicizumab disponible en el mercado en un ensayo TGA en plasma humano comercialmente disponible empobrecido en FVIII.

La Figura 34 muestra las capacidades de generación de trombina en términos de (A) Cmáx y (B) Tmáx de BiAb_1 (IXAX-1280.0999.0325) en comparación con el calibrador de emicizumab disponible en el mercado en un ensayo TGA en plasma humano empobrecido en FVIII.

La Figura 35 muestra el rendimiento de la purificación y el % de heterodímeros para el anticuerpo biespecífico IXAX-1172.0201.0128 expresado a partir de 8 miniagrupaciones independientes de células CHO transfectadas de forma estable.

La figura 36 representa la correlación entre la actividad de los anticuerpos biespecíficos mediante el ensayo FXasa (actividad a los 10 minutos) y el % de heterodímeros para el anticuerpo biespecífico IXAX-1172.0201.0128 normalizado a 0,3 mg/ml expresado a partir de 8 miniproductos independientes. El coeficiente de correlación de Pearson se calculó en 0,9939.

La figura 37 (A) muestra la separación de IXAX-1280.0999.0128 mediante cromatografía de intercambio iónico en una columna CaptoSp ImpRes de 1 ml y un gradiente lineal de NaCl hasta 500 nM en 20 nM de fosfato sódico, pH 6,0. Absorbancia, mAU (mili unidad de absorbancia); conductividad, mS/cm (mili Siemens por centímetro). El pico 1 es el anticuerpo monoespecífico anti-FIX NINA-1280.0128. El pico 2 es el anticuerpo biespecífico IXAX-1280.0999.0128. El pico 3 es el anticuerpo monoespecífico anti-FX TINA-0999.0128. (B) muestra la separación de IXAX-0436.0202.0128 por cromatografía de intercambio iónico con elución escalonada. El pico 1 es el anticuerpo monoespecífico anti-FIX NINA-0436.0128. El pico 2 es el anticuerpo biespecífico IXAX-0436.0202.0128. El pico 3 es el anticuerpo anti-FX mooespecífico TINA-0202.0128. (C) muestra la separación de IXAX-1172.0201.0128 por cromatografía de intercambio iónico. El pico 1 es el anticuerpo monoespecífico NINA-1172.0128 anti-FIX. El pico 2 es el anticuerpo biespecífico IXAX-1172.0201.0128.

La Figura 38 muestra la purificación por intercambio catiónico de los heterodímeros FIX/FX purificados para cada uno de los anticuerpos biespecíficos (A) IXAX-1280.0999.0325 (B) IXAX-1454.0999.0325 (C) IXAX-1441.0999.0325 y (D) IXAX-1442.0736.0325.

La figura 39 muestra la respuesta a la dosis en el ensayo de FXasa con IXAX-1280.0999.0325 y AbE. Las líneas de puntos indican la concentración de anticuerpos correspondiente a 4,5 pg/ml, 10 pg/ml y 45 pg/ml.

La Figura 40 muestra la respuesta a la dosis en un ensayo cromogénico de actividad mimética del FVIII con IXAX-1280.0999.0325 y AbE.

La figura 41 muestra la respuesta a la dosis en el ensayo de aPTT con IXAX-1280.0999.0325 y AbE. Las líneas de puntos verticales representan las concentraciones finales de anticuerpos de 66,6 nM (10 pg/ml) y 300 nM (45 pg/ml); las líneas horizontales representan el valor de aPTT del plasma normal agrupado recogido de voluntarios sanos.

La figura 42 presenta los resultados de los ensayos de tiempo de coagulación aPTT que investigan el efecto de los anticuerpos biespecíficos IXAX-1280.0999.0325 (círculo), IXAX-1441.0999.0325 (diamante) y AbE (cruz) en el plasma inhibidor. Se muestran las respuestas a la dosis de estos anticuerpos en un ensayo de coagulación aPTT de una etapa utilizando plasma obtenido de un paciente con hemofilia A que demuestra un nivel de inhibidor específico de 70 BU al FVIII. La línea horizontal punteada indica el tiempo de coagulación del plasma inhibidor sembrado con un control de isotipo de IgG4 humana.

La figura 43 muestra una respuesta a la dosis de la altura del pico de trombina (Cmáx) para los anticuerpos biespecíficos IgG4 IXAX-1280.0999.0325, IXAX-1441.0999.0325 y AbE (todos ellos purificados en proteína A, seguida de cromatografía de intercambio catiónico) en un ensayo de generación de trombina con plasma obtenido de un paciente con hemofilia A que demuestra un nivel de inhibidor específico de 70 BU al FVIII. Se indican las concentraciones de anticuerpos biespecíficos en nM para cada dilución.

La figura 44 muestra una respuesta a la dosis para los anticuerpos biespecíficos IgG4 (A) IXAX-1280.0999.0325, (B) IXAX-1441.0999.0325 y (C) AbE (todos purificados en proteína A, seguida de cromatografía de intercambio catiónico) en un ensayo de generación de trombina con plasma obtenido de un paciente con hemofilia A que demuestra un nivel de inhibidor específico de 70 BU al FVIII. Las concentraciones de anticuerpos biespecíficos analizadas son 100, 33,3, 11,1, 3,7 y 1,23 nM. La zona sombreada en gris indica la generación de trombina del plasma normal agrupado. La activación del TGA es FIXa.

Descripción detallada

Coagulación de la sangre

La cascada de la coagulación de la sangre está diagramada en la Figura 1. La coagulación es uno de los procesos biológicos más importantes que detiene la pérdida de sangre de un vaso dañado para permitir su reparación. El mecanismo de la coagulación implica la activación, adhesión y agregación de las plaquetas junto con la deposición y maduración de la fibrina. Una mala regulación de la coagulación puede provocar una hemorragia excesiva (hemofilia) o una coagulación obstructiva (trombosis). La coagulación está muy conservada en todos los mamíferos. Está controlado por una compleja red de factores de coagulación. La coagulación se inicia cuando se daña el endotelio que recubre el vaso sanguíneo. La exposición del factortisular subendotelial (FT) al factor VII plasmático (FVII) conduce a la hemostasia primaria (vía extrínseca): se forma un tapón suelto en el lugar de la lesión. La activación de otros factores de coagulación, especialmente el factor IX (FIX) y el factor VIII (FVIII), conduce a la hemostasia secundaria (vía intrínseca): se forman cordones de fibrina para reforzar el tapón. Las vías extrínseca e intrínseca convergen finalmente en un punto común: la formación del complejo factor Xa/Va que, junto con el calcio y unido a una superficie fosfolipídica, genera trombina (factor Ila) a partir de protrombina (factor II).

El FVIII es escindido por la trombina o el factor Xa (FXa), y el factor VIIIa resultante (FVIIIa) presenta una estructura heterotrimérica compuesta por la subunidad A1, la subunidad A2 y la cadena ligera. En el momento de la activación y en presencia de iones de calcio y de una superficie fosfolipídica (en las plaquetas), el FVIIIa se une a través de su cadena ligera y de su subunidad A2 al FIXa y, simultáneamente, se une a través de su subunidad A1 al FX, formando un complejo intrínseco activo de "tenasa" o "Xasa" en el que el cofactor del FVIIIa pone en proximidad al FIXa y al FX y, además, aumenta alostéricamente la constante de velocidad catalítica del FIXa. Véase la figura 2a. El factor X es activado por la actividad de la serina proteasa del FIXa, y la cascada de coagulación continúa, culminando en la deposición de fibrina, el polímero estructural del coágulo sanguíneo.

La hemofilia surge por una deficiencia del complejo Xasa, debido a una falta de actividad del cofactor FVIII (hemofilia A) o a una falta de actividad de la enzima FIX (hemofilia B).

Factor IX (FIX)

El factor IX es una serina proteasa que requiere el factor VIII como cofactor. Circula en la sangre como un precursor inactivo, que se activa a través de la vía intrínseca o extrínseca en el momento de la exposición hemostática, como se ha comentado anteriormente.

A menos que el contexto requiera otra cosa, el factor IX al que se hace referencia aquí es el factor IX humano, y el factor IXa es el factor IXa humano.

La secuencia de aminoácidos del factor IX humano se muestra en la Figura 3. El gen del factor IX tiene una longitud de aproximadamente 34 kb y contiene 8 exones. El transcrito comprende una corta región no traducida 5', un marco de lectura abierto más un codón de parada y una región no traducida 3'. El ORF codifica una preproteína de 461 aminoácidos en la que la presecuencia (péptido señal) dirige el factor IX para su secreción, la secuencia del propéptido proporciona un dominio de unión para una carboxilasa dependiente de la vitamina K, que carboxila ciertos residuos de ácido glutámico en el dominio GLA adyacente, y el resto representa el zimógeno del factor IX, que entra en circulación tras la eliminación de las presecuencias y las pro-secuencias. La proteína FIX madura, de 415 residuos, contiene, desde el extremo N al C: un dominio GLA en el que 12 residuos de ácido glutámico están Y-carboxilados postraduccionalmente, dos dominios similares al factor de crecimiento epidérmico (EGF), una secuencia peptídica de activación y un dominio catalítico de serina proteasa. El FIX es activado por el factor XI activado generado a través de la vía intrínseca, o por el complejo TF/FVIIa de la vía extrínseca. En cualquier caso, la activación implica la escisión del enlace peptídico que sigue a R145 (escisión a) y del enlace peptídico que sigue a R180 (escisión p), liberando un péptido de activación correspondiente a la secuencia intermedia, y generando así la molécula de FlXa activada, que tiene una cadena ligera terminal N (GLA-EGF-EGF) y una cadena pesada terminal C (dominio catalítico) unidas por un puente disulfuro entre C132 de la cadena ligera y C289 de la cadena pesada. La numeración de los residuos se refiere a los aminoácidos de la secuencia madura del polipéptido FIX. En la superficie del fosfolípido donde se forma el complejo de la Xasa, es el dominio GLA del FlXa el que se asocia con el fosfolípido, mientras que el dominio catalítico se encuentra a gran altura (> 70 A) por encima de la superficie del fosfolípido y es modulado por el dominio A2 del FVIIIa [7, 8].

La base molecular de la hemofilia B -deficiencia en la actividad de FlXa- es diversa, incluyendo una variedad de mutaciones puntuales, mutaciones sin sentido, mutaciones en el sitio de empalme del ARNm, deleciones, inserciones o mutaciones sin sentido en los sitios de escisión de activación [9].

El dominio catalítico (proteasa) del FIX activado (FlXa) está involucrado en la unión al FVIIIa. El residuo E245 de este dominio se une a los iones de calcio, y las mutaciones en esta posición pueden reducir la unión al FVIII y dar lugar a la hemofilia B, por ejemplo la sustitución E245V. Las mutaciones dentro de la hélice del FIX formada por los residuos 330-338 también están relacionadas con una unión reducida al FVIII y, por consiguiente, con la hemofilia B.

También se han notificado mutaciones no patógenas en el factor IX, incluyendo polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) y polimorfismos de longitud - revisados en [9]. Entre ellos se encuentra el SNP Mnll en el exón 6, que da lugar a una sustitución T/A en el residuo 148 (polimorfismo de Malmo), que es relativamente común entre las poblaciones blancas y negras estadounidenses [9].

Factor X (FX)

A menos que el contexto requiera otra cosa, el factor X al que se hace referencia aquí es el factor X humano, y el factor Xa es el factor Xa humano. La secuencia de aminoácidos del FX humano se muestra en la Figura 4.

El FX también se conoce como factor Stuart-Prower. Es una endopeptidasa de serina. El FX puede ser activado, por hidrólisis, en factor Xa por el factor IX (junto con su cofactor, el factor FVIII, como se ha descrito anteriormente) o por el factor VII (con su cofactor, el factor tisular). El FX actúa escindiendo la protrombina en dos puntos: en un enlace Arg-Thr y luego en un enlace Arg-Ile, para producir la trombina activa.

Unión a antígenos

Una característica deseable de la moléculas biespecífica de unión a antígenos es que se une a FIXa y FX de manera que permite que el FIXa unido active el FX unido.

Para unir el FIXa y el FX y así promover la activación del FX por el FIXa, la moléculas biespecífica de unión a antígenos puede unir estos dos cofactores simultáneamente. La unión puede producirse secuencialmente, por ejemplo, puede formarse un complejo binario inicial entre un primer brazo de unión y su antígeno afín, seguido de la unión del segundo brazo de unión a su antígeno afín. En principio, estos dos eventos de unión pueden ocurrir en cualquier secuencia, es decir, FIXa seguido de FX, o FX seguido de FIXa. La coreografía molecular está influenciada por las afinidades relativas de los dos sitios de unión a sus respectivos antígenos. En una población de moléculas biespecíficas de unión a antígenos, FIXa y FX, se espera que existan varios complejos diferentes en paralelo. Así, la agrupación comprenderá molécula de unión a antígeno libre, FIXa libre, FIXa complejado con molécula de unión a antígeno, FX complejado con molécula de unión a antígeno, y un complejo terciario de FIX, FX y molécula de unión a antígeno, estando cada una de estas especies presente en diferentes proporciones según las tasas relativas de activación y desactivación de las interacciones individuales.

Puede ser preferible que una moléculas biespecífica de unión a antígenos tenga una mayor afinidad por FIXa que por FX. Esta molécula biespecífica debería formar un complejo inicial con el FIXa, que a su vez se uniría y activaría el Fx . La afinidad relativamente baja por el FX reduce la proporción de FX que se une en complejos anticuerpo-antígeno incompletos (es decir, sin FIXa). Una ventaja potencial de esto es que permite que una mayor proporción de FX permanezca libre para comprometerse con cualquier FVIII que pueda estar presente en la sangre del paciente. La hemofilia A abarca una serie de deficiencias de FVIII, que van desde una deficiencia leve hasta la ausencia total de FVIII funcional. Para aquellos pacientes que conservan algo de FVIII funcional, puede ser deseable conservar esta actividad natural en la medida de lo posible. Por lo tanto, puede ser deseable proporcionar una moléculas biespecífica de unión a antígenos en la que el brazo de unión al FX no compita con el FVIII para unirse al FX.

Preferentemente, el brazo de unión a FX tiene una mayor afinidad por FX que por FXa. Una baja afinidad por el FXa promueve la liberación del producto activado, completando el papel de la molécula mimética del FVIII en la cascada de coagulación y liberando el sitio de unión del Fx para su reutilización. En varias realizaciones, un biespecífico descrito en el presente documento (por ejemplo, el anticuerpo IXAX-1280.0999.0325 o el anticuerpo IXAX-1441.0999.0325), el brazo de unión a FXde dicho biespecífico (por ejemplo brazo de unión que comprende el dominio VH T0999H), o un anticuerpo monoespecífico anti-FXque comprende un homodímero de dos de dichos brazos, tiene una afinidad al menos 2 veces mayor, al menos 3 veces mayor, al menos 4 veces mayor, al menos 5 veces mayor, al menos 10 veces mayor, al menos 100 veces mayor por el FX que por el FXa, por ejemplo, al menos 1.000 veces mayor por el FX que por el FXa, y opcionalmente no muestra una unión significativa al FXa, por ejemplo, medida por ELISA. Por ejemplo, en varias realizaciones el anticuerpo biespecífico, el brazo de unión a FX o el anticuerpo monoespecífico anti-FX (por ejemplo, TINA-0999.0325) no se une a FXa humano según se determina por ELISA y con referencia a una IgG de control negativo. Como alternativa a ELISA, la afinidad puede medirse por SPR y la afinidad por FX compararse con la afinidad por FXa.

- Unión a FlXa

El brazo de unión a FIXa de una moléculas biespecífica de unión a antígenos puede unir la cadena ligera y/o la cadena pesada de FIXa. Los estudios iniciales indicaron que los brazos de unión a FIXa del linaje N128 descrito en los Ejemplos no se unen a la cadena ligera de FIXa de forma aislada (en ausencia de la cadena pesada).

Una moléculas biespecífica de unión a antígenos de la presente invención (o brazo polipeptídico de unión a FIXa de la misma) puede, por tanto, ser una que se une a una molécula de FIXa que comprende una cadena pesada y una cadena ligera, y que no se une a la cadena ligera de FIX en ausencia de la cadena pesada. Opcionalmente, el brazo de unión de FIXa reconoce un epítopo formado por, o estabilizado por, la combinación de las cadenas pesadas y ligeras de FIXa. Por ejemplo, puede hacer contacto sólo con la cadena ligera de la molécula de FIXa, uniendo un epítopo que está expuesto o estabilizado sólo cuando la cadena ligera está presente en combinación con la cadena pesada de la molécula de FIXa. Alternativamente, puede contactar con un epítopo que comprenda uno o más residuos tanto de la cadena ligera como de la cadena pesada, o que comprenda residuos de la cadena pesada únicamente.

Una molécula de unión a antígeno según la presente invención, o un brazo polipeptídico de unión a FIXa de la misma, puede unirse al dominio EC de FIXa humano con una afinidad (medida como Kd) de 10 mM o menos, preferentemente 5 mM o menos, más preferentemente 1 mM o menos. Por ejemplo, la Kd puede estar entre 1 nM y 3 pM.

La Kd para la unión de FIXa humano puede estar entre 0,1 pM y 1 pM, por ejemplo, entre 0,15 y 0,3 pM. La Kd puede ser 0,6 pM o menos, 0,5 pM o menos, 0,4 pM o menos, 0,3 pM o menos, 0,25 pM o menos, o 2 pM o menos. La Kd puede ser de al menos 0,1 pM, por ejemplo de al menos 0,2 pM. Puede ser de 0,1 pM - 0,5 pM.

La Kd puede estar entre 10 y 100 nM, por ejemplo, entre 25 y 75 nM.

La K^Dpuede ser 50 nM o menos, 10 nM o menos, 5 nM o menos, 2 nM o menos, o 1 nM o menos. La K^Dpuede ser de 0,9 nM o menos, de 0,8 nM o menos, de 0,7 nM o menos, de 0,6 nM o menos, de 0,5 nM o menos, de 0,4 nM o menos, de 0,3 nM o menos o de 0,1 nM o menos. La Kd puede ser de al menos 0,001 nM, por ejemplo de al menos 0,01 nM o de al menos 0,1 nM. La Kd puede estar entre 0,1 -10 nM.

Una molécula de unión a antígeno según la presente invención, o un brazo polipeptídico de unión a FIXa de la misma, puede unirse a FIX humano con una afinidad (medida como Kd) entre 0,1 pM y 1 pM, por ejemplo, entre 0,15 y 0,3 pM. La K^Dpuede ser de 0,6 pM o menos, 0,5 pM o menos, 0,4 pM o menos, 0,3 pM o menos, 0,25 pM o menos, o 2 pM o menos. La Kd puede ser de al menos 0,1 pM, por ejemplo de al menos 0,2 pM.

La Kd de interacción con FIX puede ser comparable a la Kd de interacción con FIXa, por ejemplo, puede haber una diferencia de menos del 25 %, opcionalmente menos del 10 %, en la afinidad del brazo de unión a FIXa por FIX en comparación con la afinidad por FIXa. Es posible que no haya una diferencia estadísticamente significativa en la Kd de la interacción con FIX en comparación con FIXa.

Como se describe en otra parte del presente documento, la afinidad puede determinarse utilizando la resonancia de plasmón superficial (SPR), por ejemplo, con el brazo de unión acoplado a una superficie sólida, opcionalmente como un dímero (por ejemplo, como IgG monoespecífica), con el antígeno en solución como analito, a 25 °C.

- Unión a F X

Una molécula de unión a antígeno según la presente invención, o un brazo polipeptídico de unión a FX de la misma, puede unirse al dominio EC de FX humano con una Kd de 10 mM o menos, preferentemente 5 mM o menos, más preferentemente 1 mM o menos. Por ejemplo, la Kd puede estar entre 5 pM y 1 nM, por ejemplo, entre 5 pM y 10 nM.

La Kd puede estar entre 0,1 pM y 2 pM, por ejemplo, entre 0,1 pM y 1 pM, por ejemplo, entre 0,15 y 0,3 pM.La Kd puede ser de 0,6 pM o menos, 0,5 pM o menos, 0,4 pM o menos, 0,3 pM o menos, o 0,25 pM o menos. La K^Dpuede ser de al menos 0,1 pM.

La K^Dpuede ser 50 nM o menos, 10 nM o menos, 5 nM o menos, 2 nM o menos, o 1 nM o menos. La K^Dpuede ser de 0,9 nM o menos, de 0,8 nM o menos, de 0,7 nM o menos, de 0,6 nM o menos, de 0,5 nM o menos, de 0,4 nM o menos, de 0,3 nM o menos o de 0,1 nM o menos. La Kd puede ser de al menos 0,001 nM, por ejemplo de al menos 0,01 nM o de al menos 0,1 nM. Por ejemplo, la Kd puede estar entre 1 -100 nM. La Kd puede estar entre 1 -10 nM.

- M edición de la afin idad de unión a l antígeno

La afinidad de una molécula de unión a antígeno para la unión de FIX, FIXa, FX y FXa puede ser cuantificada en términos de la constante de disociación de equilibrio Kd, la relación Ka/Kd de la asociación o tasa de activación (Ka) y la disociación o tasa de desactivación (kd) de la interacción de unión. Los valores Kd, Ka y Kd para la unión del antígeno pueden medirse utilizando la resonancia de plasmón de superficie (SPR). El procedimiento y las condiciones del SPR se exponen en el Ejemplo 10.

La cuantificación de la afinidad puede realizarse mediante SPR con el brazo polipeptídico de unión al antígeno en forma monovalente, por ejemplo, el anticuerpo Fab o Fv que comprende el sitio de unión al antígeno, o la inmunoglobulina heterodimérica (por ejemplo, IgG) que tiene un solo brazo de unión al antígeno en cuestión. Alternativamente, puede ser conveniente determinar la afinidad por el brazo polipeptídico de unión al antígeno en forma bivalente, por ejemplo la IgG que comprende brazos homodiméricos de unión al antígeno. La SPR puede comprender el recubrimiento de dímeros del brazo polipeptídico de unión al antígeno en un chip biosensor (directa o indirectamente), la exposición de los brazos polipeptídicos de unión al antígeno en una solución tamponada en un intervalo de concentraciones, la detección de la unión y el cálculo de la constante de disociación de equilibrio Kd para la interacción de unión. La SPR puede realizarse a 25°C. Una solución tampón adecuada es 150 mM de NaCl, 0,05 % de detergente (por ejemplo, P20)y 3 mM de EDTA, pH 7,6. HBS-P 1X(10mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,05 % polisorbato 20 pH 7,6) con 2,5 mM CaCh. es un tampón de ejemplo. Los datos de enlace pueden ajustarse a un modelo 1:1 utilizando algoritmos estándar, que pueden ser inherentes al instrumento utilizado. Se conoce una variedad de instrumentos SPR, como Biacore™, ProteOn XPR36™ (Bio-Rad®) y KinExA® (Sapidyne Instruments, Inc).

- R eactiv idad cruzada

Los cuerpos reguladores pueden exigir que las moléculas terapéuticas candidatas hayan demostrado su eficacia terapéutica en animales de laboratorio antes de pasar a los ensayos clínicos en humanos. Un ejemplo de modelo animal de hemofilia A adquirida es un mono cynomolgus al que se le provoca una deficiencia en la coagulación de la sangre mediante la administración de un anticuerpo neutralizador del FVIII o un inhibidor de molécula pequeña contra el FVIII, replicando así el fenotipo de un paciente humano con hemofilia A. Para poder probar las moléculas biespecíficas de unión a antígenos en modelos animales, es deseable que el sitio de unión de cada brazo sea de reacción cruzada con el antígeno correspondiente de uno o más mamíferos no humanos. Así, el sitio de unión a FIXa de la molécula de unión a antígeno puede unir FIXa murino (por ejemplo, de ratón o rata), de conejo o de primate no humano (por ejemplo, de mono cynomolgus) así como FIXa humano, y el sitio de unión a FX puede unir FXa murino (por ejemplo, de ratón o rata), de conejo o de primate no humano (por ejemplo, de mono cynomolgus) así como FXa humano.

Una forma de cuantificar el grado de reactividad cruzada entre especies de una molécula de unión a antígeno (o, más precisamente, de su sitio de unión a antígeno) es como la diferencia de pliegues en su afinidad por el antígeno de una especie en comparación con el antígeno de otra especie, por ejemplo, la diferencia de pliegues en la afinidad por el antígeno humano frente al antígeno de cynomolgus. La afinidad puede cuantificarse como Kd, refiriéndose a la constante de disociación de equilibrio de la unión del antígeno a la molécula de unión al antígeno. La Kd puede determinarse mediante SPR como se describe en este documento.

Una molécula de unión con reactividad cruzada entre especies puede tener una diferencia de veces en la afinidad para la unión de antígenos humanos y no humanos que es 30 veces o menos, 25 veces o menos, 20 veces o menos, 15 veces o menos, 10 veces o menos o 5 veces o menos. Dicho de otro modo, la Kd de unión al dominio extracelular del antígeno humano puede estar dentro de 30 veces, 25 veces, 20 veces, 15 veces, 10 veces o 5 veces de la Kd de unión al dominio extracelular del antígeno no humano.

Preferentemente, las afinidades de unión del antígeno humano y no humano están dentro de un intervalo de 10 veces o menos, más preferentemente dentro de 5 veces o dentro de 2 veces. La Kd para la unión de FIXa no humano, por ejemplo, determinada por resonancia de plasmón de superficie, puede ser hasta 10 veces (preferentemente hasta 5 veces o hasta 2 veces) mayor o hasta 10 veces menor (preferentemente hasta 5 veces o hasta 2 veces menor) que la Kd para la unión de FIXa humano. Del mismo modo, la Kd para la unión de FX no humanos, por ejemplo, determinada por SPR, puede ser hasta 10 veces (preferentemente hasta 5 veces o hasta 2 veces) mayor o hasta 10 veces (preferentemente hasta 5 veces o hasta 2 veces) menor que la Kd para la unión de FX humanos. Los procedimientos para determinar la afinidad se describen en otra parte del presente documento.

Las moléculas de unión también pueden considerarse de reactividad cruzada entre especies si la Kd de unión al antígeno de ambas especies cumple un valor umbral, por ejemplo, si la Kd de unión al antígeno humano y la Kd de unión al antígeno no humano son ambas de 10 mM o menos, preferentemente de 5 mM o menos, más preferentemente de 1 mM o menos. La Kd puede ser de 10 nM o menos, 5 nM o menos, 2 nM o menos, o 1 nM o menos. La Kd puede ser de 0,9 nM o menos, de 0,8 nM o menos, de 0,7 nM o menos, de 0,6 nM o menos, de 0,5 nM o menos, de 0,4 nM o menos, de 0,3 nM o menos o de 0,1 nM o menos.

Aunque la reactividad cruzada de especies para la unión de antígenos de diferentes especies puede ser ventajosa, la selectividad del brazo de unión de FIXa y del brazo de unión de FX para sus respectivos antígenos es, sin embargo, deseable para evitar efectos secundarios no deseados. Así, dentro del cuerpo, el FIX/FIXa y el FX/FXa son preferentemente los únicos antígenos unidos por la molécula de unión al antígeno.

Potenciación de la activación de FX mediada por FIXa

La capacidad de una moléculas biespecífica de unión a antígenos para potenciar la activación de FX a FXa mediada por FIXa puede determinarse en ensayos in vitro o in vivo.

Un ensayo in vitro adecuado es el ensayo de activación de FX ejemplificado en el Ejemplo 3 y el Ejemplo 7 e ilustrado en la Figura 7. El ensayo comprende

(i) contacto de la moléculas biespecífica de unión a antígenos con FIXa y FX en condiciones adecuadas para la formación de FXa (por ejemplo, en presencia de fosfolípidos, en solución tamponada a 37°C)

(ii) ladición de un sustrato escindible por el FXa para generar un producto detectable, y

(iii) detectar, y opcionalmente cuantificar, la presencia del producto detectable.

En el ejemplo 7 se expone un protocolo detallado.

El nivel de producto puede compararse con un ensayo de control en el que la moléculas biespecífica de unión a antígenos FIXa-FX está ausente de la mezcla de reacción. La diferencia significativa en el nivel de producto en el ensayo con el biespecífico comparado con el control indica que el biespecífico es capaz de mejorar la activación de FX mediada por FIXa. El FVIII puede incluirse como control positivo.

El nivel de producto puede compararse con un ensayo en el que la moléculas biespecífica de unión a antígenos FIXa-FX es emicizumab. Un biespecífico según la presente invención puede potenciar la activación de FX a FXa mediada por FIXa en la misma medida o en una medida similar (por ejemplo, dentro de una diferencia del 10 % o dentro de una diferencia del 5 %) que el emicizumab, o en una medida mayor (por ejemplo, más de un 10 % de activación de FX a FXa que la que se consigue con emicizumab, medida por el nivel de producto detectable). Preferentemente, el anticuerpo biespecífico potencia la activación de FX a FXa mediada por FIXa al menos en la misma medida que el emicizumab. El ensayo se realiza típicamente a temperatura fisiológica de 37 grados C. Las concentraciones adecuadas de biespecíficos para su uso en el ensayo se indican en los Ejemplos del presente documento, por ejemplo, 12,5 pg/ml (10,4 nM) o 125 nM.

Otro ensayo adecuado es la medición del tiempo de tromboplastina parcial activado (aPTT) en plasma deficiente de FVIII, que puede realizarse en presencia o ausencia de inhibidores y puede utilizarse para comparar la actividad de las moléculas biespecíficas con el FVIII humano recombinante. Este ensayo se ejemplifica en el Ejemplo 8. El aPTT es un ensayo de punto final que proporciona una visión global de la formación de coágulos de sangre y proporciona el tiempo de coagulación como lectura del ensayo. El plasma deficiente en FVIII suele tener un tiempo de coagulación de aproximadamente 80-90 segundos en el ensayo de aPTT. Las moléculas biespecíficas de unión a antígenos de la presente invención son eficaces para reducir el tiempo de coagulación en un ensayo de aPTT (en comparación con un control negativo). El tiempo de coagulación del FVIII humano deficiente en un ensayo de aPTT con una moléculas biespecífica de unión a antígenos según la presente invención puede, por ejemplo, ser igual o menor que el del tiempo de coagulación con FVIIIa humano recombinante. El tiempo de coagulación fisiológico para el plasma humano normal (FVIII+) es típicamente

< 40 segundos, por ejemplo, en el intervalo de 37 - 34 s. Se pueden alcanzar valores similares con plasma deficiente en FVIII si se suministra FVIIIa activado, lo que proporciona una forma conveniente de estandarizar el ensayo a través de la calibración del aparato/medición contra los valores de referencia. Alternativamente, se puede utilizar como referencia el tiempo de coagulación del plasma humano normal (FVIII+), iniciándose el ensayo de aPTT mediante la inducción de la coagulación a través de la adición de calcio. El ensayo se realiza típicamente a temperatura fisiológica de 37 grados C. Las concentraciones adecuadas de biespecíficos para su uso en el ensayo se indican en los Ejemplos del presente documento, e incluyen 0,1 mg/ml (44 nM), 0,3 mg/ml (133 nM) y 0,5 mg/ml (222 nM).

Una moléculas biespecífica de unión a antígenos de la presente invención puede dar un tiempo de coagulación en el ensayo de aPTT de dentro de 10 segundos del de FVIIIa (es decir, hasta 10 segundos más o hasta 10 segundos menos que el tiempo de coagulación del ensayo de aPTT con FVIIIa). Preferentemente, el tiempo de coagulación en el ensayo de aPTT con una moléculas biespecífica de unión a antígenos de la invención es menor que con el FVIIIa. La moléculas biespecífica de unión a antígenos puede reducir el tiempo de coagulación a menos de 40 segundos, menos de 35 segundos o menos de 30 segundos. El tiempo de coagulación puede estar entre 20 y 40 segundos, por ejemplo, entre 20 y 30 segundos. Preferentemente, el tiempo de coagulación es de 22 - 28 segundos, por ejemplo, 24 - 26 segundos.

Otra medida de la función es la tasa a la que se genera la trombina en el plasma sanguíneo deficiente en FVIII en presencia de la moléculas biespecífica de unión a antígenos. La actividad de un anticuerpo biespecífico puede medirse en un ensayo de generación de trombina (TGA) [10]. Se han descrito varios ensayos de generación de trombina, como se ha revisado recientemente [11]. Esencialmente, un TGA comprende la medición de la conversión (activación) de la protrombina en trombina a lo largo del tiempo tras la adición de una molécula de prueba (en este caso, el anticuerpo biespecífico candidato), donde la trombina se detecta a través de su escisión de un sustrato para formar un producto detectable.

Con referencia a la Figura 1, se recordará que existe la vía extrínseca del factor tisular (TF) para iniciar la cascada de coagulación. Las células que expresan el FT normalmente residen fuera de la vasculatura y, cuando se produce un daño tisular, dichas células portadoras de FT entran en contacto con las plaquetas circulantes. El FT actúa como cofactor para facilitar la activación de pequeñas cantidades de factores IX y X por el factor VIIa. El factor Xa activado y el factor V forman un complejo de protrombinasa en las células portadoras de FT, generando una cantidad limitada de trombina. La trombina recién generada activa las plaquetas que se han acumulado en el lugar de la lesión y el factor XI que está presente en las plaquetas. El FXIa ligado a las plaquetas es necesario para asegurar una mayor activación del FIXa. Dado que el t Ga es un ensayo ex vivo, las células portadoras de TF están ausentes y se debe suministrar un desencadenante de la coagulación para iniciar la cascada. Los ensayos comerciales suelen utilizar una mezcla de TF recombinante/fosfolípido para iniciar la coagulación [11]. El procedimiento de TGA aquí ejemplificado (véase el Ejemplo 13) utiliza una mezcla de factor IXa/fosfolípido como activador, aunque podrían utilizarse otros activadores previos como el FXIa.

Para realizar el TGA, el plasma deficiente en FVIII se pone en contacto con (i) el reactivo desencadenante, (ii) un sustrato convertible por la trombina en un producto detectable, por ejemplo, un sustrato fluorogénico o cromogénico que produce un producto visualmente detectable al ser escindido por la trombina, y (iii) la molécula de prueba (por ejemplo, anticuerpo biespecífico), para crear las condiciones en las que la presencia de la actividad mimética del FVIII daría lugar a la generación de trombina y, por tanto, a una señal del producto detectable. Normalmente, el plasma carecerá de iones metálicos libres, como el calcio, que son necesarios en la cascada de coagulación de la sangre (Figura 1). Se pueden suministrar iones Ca2+ (por ejemplo, como CaCh en solución) para iniciar el ensayo, por ejemplo, puede estar contenido en la solución de sustrato. Tras la iniciación, la generación del producto detectable (que representa la generación de trombina) se monitoriza (preferentemente de forma continua, o a intervalos frecuentes, por ejemplo, cada 20 segundos aproximadamente) a lo largo del tiempo, por ejemplo, detectando la fluorescencia o el color. Se puede utilizar un lector de placas, por ejemplo, para controlar la conversión de un sustrato fluorogénico en un fluoróforo. El TGA se realiza a una temperatura fisiológica de 37 grados C.

La fluorescencia puede convertirse en concentración de trombina calibrándola con concentraciones conocidas de trombina añadidas al plasma de control. A continuación, se puede generar un trombograma (Figura 26, Figura 27).

Preferentemente, los anticuerpos biespecíficos (u otras moléculas de prueba) se purifican adecuadamente para su uso en el TGA (por ejemplo, mediante cromatografía de proteína A y cromatografía de intercambio iónico o cromatografía de interacción hidrófoba), por ejemplo, para proporcionar el biespecífico en una composición de al menos un 95 % de heterodímero biespecífico (es decir, no debe haber más de un 5 % de homodiméricos u otros contaminantes de anticuerpos). Preferentemente, la molécula de ensayo se proporciona con una pureza lo más cercana posible al 100 %. Puede ser de aproximadamente 98, 99 o 100 % de pureza biespecífica.

Los intervalos de referencia aproximados para el plasma de individuos sanos en un TGA fluorogénico son Cmáx 200 a 450 nM y Tmáx 5 a 8 minutos [11]. La actividad en un TGA también puede compararse con las curvas representativas de generación de trombina publicadas para el plasma de individuos sanos, pacientes con deficiencia grave de FVIII y pacientes con deficiencia grave de FVIII después de la infusión de FVIII [12]. Para la normalización, el rendimiento en el TGA también puede compararse con un calibrador que representa una molécula de control positivo a una concentración conocida. Una serie de diluciones del biespecífico de prueba puede compararse con el calibrador en una serie de concentraciones fijas conocidas. Un calibrador adecuado es un calibrador de emicizumab. El calibrador de emicizumab está disponible comercialmente, preparado a partir de plasma humano citratado inmunodeplejado sembrado con 100 pg/ml de emicizumab (Hemlibra®) y compuesto además por tampón y estabilizadores. Se suministra en forma liofilizada y se reconstituye en agua antes de su uso en el TGA. La concentración exacta de emicizumab en la ampolla calibradora es conocida, por lo que la actividad de una molécula biespecífica de prueba en el ensayo puede compararse con la actividad del calibrador tras normalizar la concentración. Como control alternativo para la comparación de un anticuerpo biespecífico con emicizumab, el rendimiento del anticuerpo biespecífico de prueba en el TGA puede compararse con el rendimiento de un anticuerpo biespecífico de control que tenga la secuencia de aminoácidos de emicizumab, en el que el anticuerpo biespecífico de prueba y el anticuerpo biespecífico que tenga la secuencia de aminoácidos de emicizumab se ensayan en condiciones idénticas en el TGA.

El TGA puede utilizarse para caracterizar seis aspectos de la generación de trombina: el tiempo de retardo (lag), el tiempo hasta el pico (Tmáx), la altura máxima del pico (Cmáx), el potencial de trombina endógena (ETP), el índice de velocidad (VI) y el "inicio de la cola" o el retorno a la línea de base. El tiempo de retardo representa la fase de iniciación antes de que comience a generarse el pico de trombina, donde la adición de un desencadenante da lugar a la activación de la cascada de coagulación. Una vez iniciada, se generan rápidamente grandes cantidades de trombina durante la fase de propagación. El tiempo hasta el pico representa el tiempo que se tarda (Tmáx) en alcanzar la altura máxima de la trombina (Cmáx), el ETP representa la cantidad total de trombina generada y el índice de velocidad caracteriza la pendiente entre el tiempo de retraso y el tiempo hasta el pico.El retorno a la línea de base (inicio de la cola) refleja la inhibición (por la proteína C activada) de la formación de trombina y la inactivación (por la antitrombina) de la trombina ya formada. La Cmáx y/o la Tmáx suelen ser las medidas clave utilizadas para representar la actividad en el TGA. Los valores de referencia en el TGA (por ejemplo, Cmáx, Tmáx, tiempo de retardo, etc.) pueden determinarse para el biespecífico a una concentración fija, por ejemplo, 1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM o 300 nM. Los parámetros pueden medirse en una serie de concentraciones, por ejemplo, a 1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM y 300 nM y/u otras concentraciones para obtener una curva completa de respuesta a la dosis, lo que permite determinar los valores de EC50. La curva de respuesta a la dosis puede ajustarse utilizando un modelo no lineal de log(anticuerpo) frente a la pendiente de la variable de respuesta (por ejemplo, un modelo de regresión logística de 4 parámetros de pendiente variable, que puede realizarse utilizando GraphPad Prism v8.0.0). La EC50 es la concentración de la molécula de prueba (por ejemplo, el anticuerpo) a la que se alcanza el efecto medio máximo (la mitad del camino entre el valor de referencia y el valor máximo del parámetro medido). La EC50 puede determinarse a partir de la curva de respuesta a la dosis. En el ejemplo 14 se presentan ejemplos de trabajo con datos de EC50.

En una realización, el TGA comprende:

(a) Poner en contacto el plasma deficiente en FVIII que carece de iones de calcio libres con

(i) un reactivo desencadenante que comprende una mezcla de factor IXa/fosfolípido,

(ii) una solución que comprende un sustrato fluorogénico (por ejemplo, 2 nM de sustrato fluorogénico ZGGR-AMC) que produce un fluoróforo visualmente detectable al ser escindido por la trombina, e iones de calcio (por ejemplo, 100 mM de CaCh), (por ejemplo, el reactivo FluCa de Stago), y

(iii) el anticuerpo biespecífico (por ejemplo, con una pureza del 95 % al 100 %, por ejemplo, del 99 % al 100 %),

(b) incubar el plasma a 37 grados C en condiciones en las que la presencia de actividad mimética del FVIII daría lugar a la generación de trombina y, por tanto, a una señal del fluoróforo,

(c) detectar la fluorescencia a lo largo del tiempo para controlar la conversión del sustrato fluorogénico en fluoróforo,

(d) calibrar la fluorescencia detectada frente a la fluorescencia de soluciones de trombina a concentraciones predeterminadas, y

(e) determinar uno o más parámetros de un trombograma, en el que dichos parámetros son:

altura máxima del pico de trombina (Cmáx) que se alcanza,

el tiempo que se tarda (Tmáx) en alcanzar el pico máximo de trombina, y/o

duración de la fase de iniciación antes de que se genere el pico de trombina (tiempo de retardo).

Dichos uno o más parámetros se determinan a una serie de concentraciones del anticuerpo biespecífico para obtener una curva completa de respuesta a la dosis que incluya la línea de base y la meseta superior (valor máximo) de la respuesta. Las curvas dosis-respuesta pueden ajustarse a los puntos de datos utilizando un modelo no lineal de log[anticuerpo] frente a la pendiente de la variable del parámetro de respuesta (modelo de regresión logística de 4 parámetros). La EC50 se determina a partir de dicha curva de respuesta a la dosis. Dicho uno o más parámetros, o la EC50 para dicho uno o más parámetros, puede compararse entre el anticuerpo biespecífico de prueba y el emicizumab (por ejemplo, el calibrador de emicizumab, disponible en Enzyme Research Laboratories).

Un anticuerpo biespecífico según la presente invención exhibe preferentemente una potencia que es similar o mayor que la de emicizumab en un TGA fluorimétrico. Una mayor potencia puede estar representada por una menor EC50 para uno o más parámetros de dicho ensayo, por ejemplo, Cmáx, Tmáx o tiempo de retardo. Como se demuestra en los Ejemplos del presente documento, las realizaciones de la presente invención demostraron sistemáticamente una mayor potencia que el emicizumab a concentraciones más bajas. Véanse, por ejemplo, los resultados presentados en las figuras 29, 30, 31, 33 y 34.

La respuesta máxima (por ejemplo, la Cmáx más alta, la Tmáx más baja, el tiempo de retardo más corto, etc.) en el TGA fluorimétrico también es digna de mención. La respuesta máxima es el nivel en el que el parámetro medido (por ejemplo, Cmáx) se estabiliza con el aumento de la concentración de anticuerpos, y representa el nivel máximo alcanzable (por ejemplo, la Cmáx máxima). Una respuesta máxima excesiva puede asociarse a un mayor riesgo de sobredosificación de la molécula biespecífica, incluido el riesgo de coagulopatía por consumo o coagulación intravascular diseminada (CID), que se caracteriza por una activación anormalmente mayor de las vías procoagulantes. La hipercoagulabilidad puede comprometer la seguridad del paciente a través de eventos de coagulopatía como la trombosis arterial/venosa, la embolia y la microangiopatía trombótica, y por tanto reduciría la ventana terapéutica, es decir, el intervalo de dosis o concentración plasmática en el que se consigue un efecto beneficioso sin efectos secundarios inaceptables o riesgo de eventos adversos.

Dado que el emicizumab ha recibido la aprobación reglamentaria sobre la base de un perfil de seguridad considerado aceptable en los ensayos clínicos en humanos, la respuesta máxima del emicizumab en el TGA representa límites seguros establecidos. Opcionalmente, los biespecíficos de la presente invención tienen una respuesta Cmáx y/o Tmáx máxima en el TGA que no es más del 20 % (por ejemplo, no más del 15 % o no más del 10 %) diferente de la del emicizumab. Estos valores de referencia pueden determinarse utilizando un calibrador de emicizumab o un análogo de emicizumab de secuencia idéntica.

Los biespecíficos de la presente invención pueden demostrar respuestas máximas en el TGA como sigue:

Cmáx en el TGA no superior a 500 nM. Opcionalmente, la respuesta máxima para la Cmáx no supera los 450 nM, por ejemplo, no supera los 400 nM. La respuesta máxima para la Cmáx puede estar entre 200 y 450 nM, por ejemplo, entre 250 y 350 nM; y/o

Tmáx en el TGA no inferiora una respuesta máxima de 1 minuto. Opcionalmente, la respuesta máxima para Tmáx no es inferior a 5 minutos, no inferior a 4 minutos, no inferior a 3 minutos o no inferior a 2 minutos. La respuesta máxima para Tmáx puede estar entre 2 y 10 minutos, por ejemplo, entre 2 y 8 minutos o entre 5 y 8 minutos.

Una moléculas biespecífica de unión a antígenos según la presente invención puede tener una Cmáx en el intervalo de 100 a 450 nM (por ejemplo, 200 a 450 nM) según se determina mediante TGA fluorimétrico, por ejemplo, cuando el anticuerpo biespecífico está a una concentración de 100 nM o 300 nM en dicho ensayo. La Cmáx es preferentemente de al menos 200 nM, más preferentemente de al menos 250 nM o de al menos 300 nM. La Cmáx del biespecífico puede ser igual o similar (por ejemplo, con una diferencia del 10 %) a la Cmáx del emicizumab, o puede ser mayor que la del emicizumab. El biespecífico puede tener una Cmáx EC50 en dicho ensayo que esté dentro del 10 % de la Cmáx EC50 del emicizumab, o que sea inferior. Cuando la EC50 es inferior a la del emicizumab, puede haber una diferencia de al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces o al menos 5 veces en la Cmáx EC50 en el TGA entre el biespecífico de la presente invención y el emicizumab. Opcionalmente, la Cmáx EC50 en el TGA puede ser hasta 10 veces, hasta 15 veces o hasta 20 veces diferente. La EC50 de la Cmáx para la moléculas biespecífica de unión a antígenos en el TGA fluorimétrico puede ser inferior a 50 nM, por ejemplo, entre 1 nM y 50 nM, entre 5 nM y 20 nM, o entre 5 nM y 10 nM.

Una moléculas biespecífica de unión a antígenos según la presente invención puede tener una Tmáx de 8 minutos o menos, por ejemplo, en el intervalo de 4 a 8 minutos, según se determina mediante TGA fluorimétrico, por ejemplo, en el que el anticuerpo biespecífico está a una concentración de 100 nM o 300 nM en dicho ensayo. La Tmáx del biespecífico puede ser igual o similar (por ejemplo, con una diferencia del 10 %) a la Tmáx del emicizumab, o puede ser menor que la del emicizumab. El biespecífico puede tener una Tmáx EC50 en dicho ensayo que esté dentro del 10 % de la Tmáx EC50 del emicizumab, o que sea inferior.

La EC50 de la Tmáx para la moléculas biespecífica de unión a antígenos en el TGA fluorimétrica puede ser inferior a 5 nM, por ejemplo, inferior a 3 nM o inferior a 2 nM. Puede estar entre 1 nM y 5 nM, por ejemplo, entre 1 nM y 2 nM.

Una moléculas biespecífica de unión a antígenos de acuerdo con la presente invención puede tener un tiempo de retardo de 2 - 6 minutos, tal como se determina mediante TGA fluorométrico, por ejemplo, cuando el anticuerpo biespecífico está a una concentración de 100 nM o 300 nM en dicho ensayo. El tiempo de retardo del biespecífico puede ser igual o similar (por ejemplo, con una diferencia del 10 %) al tiempo de retardo del emicizumab, o puede ser inferior al del emicizumab. El biespecífico puede tener una EC50 de tiempo de retardo en dicho ensayo que esté dentro del 10 % de la EC50 de tiempo de retardo del emicizumab, o que sea inferior.

Moléculas biespecíficas de unión a antígenos

La moléculas biespecífica de unión a antígenos comprende un brazo polipeptídico de unión a FIXa y un brazo polipeptídico de unión a FX. Puede ser una molécula polipeptídica de una o varias cadenas. Mientras que el brazo del polipéptido de unión a FIXa y el brazo del polipéptido de unión a FX representan diferentes partes de la molécula biespecífica, un polipéptido puede formar opcionalmente todo o parte del brazo de unión a FIXa y del brazo de unión a FX.

Un brazo de unión al polipéptido es la región de la molécula biespecífica que comprende el sitio de unión para uno de los antígenos (FIXa o FX). Uno o ambos sitios de unión al antígeno de una molécula biespecífica pueden ser proporcionados por un conjunto de regiones determinantes de la complementariedad (o bucles peptídicos) en un brazo polipeptídico, en el que el brazo polipeptídico es cualquier polipéptido de andamiaje adecuado, ya sea el de un anticuerpo (por ejemplo, una región Fv de anticuerpo) o el de una molécula que no es de anticuerpo. Un brazo de unión puede comprender uno o más de uno (por ejemplo, dos) polipéptidos o partes (por ejemplo, dominios) de los mismos.

La invención se describe en detalle en el presente documento con referencia a los anticuerpos biespecíficos, en los que al menos uno de los brazos polipeptídicos de unión al antígeno está proporcionado por un conjunto de CDR en un dominio VH y/o VL del anticuerpo, opcionalmente una región Fv.

Los anticuerpos son inmunoglobulinas o moléculas que comprenden dominios de inmunoglobulina. Los anticuerpos pueden ser moléculas IgG, IgM, IgA, IgD o IgE o moléculas que incluyen fragmentos de anticuerpos específicos de antígenos. El término "anticuerpo" abarca cualquier polipéptido o proteína que comprenda un sitio de unión al antígeno del anticuerpo. Un sitio de unión al antígeno de un anticuerpo (paratopo) es la parte de un anticuerpo que se une y es complementaria al epítopo de su antígeno diana. El término "epítopo" se refiere a una región de un antígeno que se une a un anticuerpo. Los epítopos pueden definirse como estructurales o funcionales. Los epítopos funcionales son generalmente un subconjunto de los epítopos estructurales y tienen aquellos residuos que contribuyen directamente a la afinidad de la interacción. Los epítopos también pueden ser conformacionales, es decir, compuestos por aminoácidos no lineales. En ciertas realizaciones, los epítopos pueden incluir determinantes que son agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, grupos fosforilo o grupos sulfonilo y, en ciertas realizaciones, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas.

Un sitio de unión al antígeno de un anticuerpo es proporcionado por un conjunto de regiones determinantes de la complementariedad (CDR) en un dominio VH y/o VL del anticuerpo, y es capaz de unirse al antígeno. En un ejemplo, el sitio de unión del anticuerpo lo proporciona un único dominio variable, por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada (dominio VH) o un dominio variable de cadena ligera (dominio VL). En otro ejemplo, el sitio de unión lo proporciona un par VH/VL (un Fv) o dos o más pares de este tipo.

Los dominios variables de los anticuerpos son las porciones de las cadenas ligeras y pesadas de los anticuerpos que incluyen las secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs; es decir, CDR1, CDR2 y CDR3) y las regiones marco (FRs). Así, dentro de cada uno de los dominios VH y VL hay CDRs y FRs. Un dominio VH comprende un conjunto de HCDRs, y un dominio VL comprende un conjunto de LCDRs. VH se refiere al dominio variable de la cadena pesada. VL se refiere al dominio variable de la cadena ligera. Cada VH y VL se compone normalmente de tres CDRs y cuatro FRs, dispuestos desde el amino-terminal al carboxi-terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las posiciones de aminoácidos asignadas a las CDR y FR pueden definirse según la nomenclatura IMGT. Un anticuerpo puede comprender un dominio VH de anticuerpo que comprende una VH CDR1, CDR2 y CDR3 y un marco. Puede comprender, alternativamente o también, un dominio Vl de anticuerpo que comprenda una VL CDR1, CDR2 y CDR3 y un marco. Ejemplos de secuencias de dominios VH y VL de anticuerpos y CDRs forman parte de la presente divulgación. Los CDR se definen según el sistema IMGT [13]. Todas las secuencias VH y VL, las secuencias CDR, los conjuntos de CDR y los conjuntos de HCDR y los conjuntos de LCDR divulgados en el presente documento representan aspectos y realizaciones de la invención. Como se describe en el presente documento, un "conjunto de CDR" comprende CDR1, CDR2 y CDR3. Así, un conjunto de HCDRs se refiere a HCDR1, HCDR2 y HCDR3, y un conjunto de LCDRs se refiere a LCDR1, LCDR2 y LCDR3. Salvo que se indique lo contrario, un "conjunto de CDR" incluye los HCDR y los LCDR.

Un anticuerpo puede comprender uno o más CDRs, por ejemplo un conjunto de CDRs, dentro de una estructura de anticuerpo. Las regiones marco pueden ser de secuencias de segmentos genéticos de la línea germinal humana. Así, el anticuerpo puede ser un anticuerpo humano que tenga un dominio VH que comprenda un conjunto de HCDR en un marco de línea germinal humana. Normalmente, el anticuerpo también tiene un dominio VL que comprende un conjunto de LCDR, por ejemplo, en un marco de línea germinal humana. Un "segmento génico" de un anticuerpo, por ejemplo, un segmento génico VH, un segmento génico D o un segmento génico JH se refiere a un oligonucleótido que tiene una secuencia de ácido nucleico de la que se deriva esa porción de un anticuerpo, por ejemplo, un segmento génico VH es un oligonucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que corresponde a un dominio VH polipeptídico desde FR1 hasta parte de c DR3. Los segmentos genéticos humanos v, d y j se recombinan para generar el dominio VH, y los segmentos humanos v y j se recombinan para generar el dominio VL. El dominio o región D se refiere al dominio o región de diversidad de una cadena de anticuerpos. El dominio o región J se refiere al dominio o región de unión de una cadena de anticuerpos. La hipermutación somática puede dar lugar a que el dominio VH o VL de un anticuerpo tenga regiones marco que no coincidan o se alineen exactamente con los segmentos genéticos correspondientes, pero la alineación de la secuencia puede utilizarse para identificar los segmentos genéticos más cercanos y, por lo tanto, identificar de qué combinación particular de segmentos genéticos se deriva un dominio VH o VL concreto. Cuando se alinean secuencias de anticuerpos con segmentos de genes, la secuencia de aminoácidos del anticuerpo puede alinearse con la secuencia de aminoácidos codificada por el segmento de genes, o la secuencia de nucleótidos del anticuerpo puede alinearse directamente con la secuencia de nucleótidos del segmento de genes. Los segmentos genéticos de la línea germinal correspondientes a las regiones marco de los anticuerpos de ejemplo descritos en el presente documento se indican en la Tabla S-12.

Un anticuerpo puede ser una inmunoglobulina completa, incluyendo regiones constantes, o puede ser un fragmento de anticuerpo. Un fragmento de anticuerpo es una porción de un anticuerpo intacto, que comprende, por ejemplo, la región de unión al antígeno y/o la región variable del anticuerpo intacto. El fragmento de anticuerpo puede incluir uno o más dominios de región constante.

Un anticuerpo de la invención puede ser un anticuerpo humano o un anticuerpo quimérico que comprende regiones variables humanas y regiones constantes no humanas (por ejemplo, de ratón). El anticuerpo de la invención, por ejemplo, tiene regiones variables humanas, y opcionalmente también tiene regiones constantes humanas.

Así, los anticuerpos incluyen opcionalmente regiones constantes o partes de las mismas, por ejemplo, regiones constantes de anticuerpos humanos o partes de las mismas, como una región constante de IgG4 humana. Por ejemplo, un dominio VL puede estar unido en su extremo C-terminal a los dominios constantes kappa o lambda de la cadena ligera del anticuerpo. Del mismo modo, un dominio VH de anticuerpo puede estar unido en su extremo C-terminal a todo o parte (por ejemplo, un dominio CH1 o una región Fc) de una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina derivada de cualquier isotipo de anticuerpo, por ejemplo, IgG, IgA, IgE e IgM y cualquiera de las subclases de isotipo, como IgG1 o IgG4.

La digestión de inmunoglobulinas enteras (bivalentes) con la enzima papaína da lugar a dos fragmentos idénticos (monovalentes) de unión al antígeno conocidos como fragmentos "Fab" y un fragmento "Fc". El Fc no tiene actividad de unión al antígeno, pero tiene la capacidad de cristalizar. "Fab", cuando se utiliza aquí, se refiere a un fragmento de un anticuerpo que incluye un dominio constante y uno variable de cada una de las cadenas pesadas y ligeras. El término "región Fc" se utiliza aquí para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina, incluyendo regiones Fc de secuencia nativa y regiones Fc variantes. El "fragmento Fc" se refiere a las porciones carboxi-terminales de ambas cadenas H unidas por disulfuros.

La digestión de los anticuerpos con la enzima pepsina da lugar a un fragmento F(ab')2 bivalente en el que los dos brazos de la molécula de anticuerpo permanecen unidos. El fragmento F(ab')2 es un fragmento bivalente que incluye dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra. Los anticuerpos de cadena única (por ejemplo, scFv) son otro fragmento. Dos fragmentos diferentes de anticuerpos monoespecíficos monovalentes, como el scFv, pueden unirse para formar un anticuerpo bivalente biespecífico.

"Fv", cuando se utiliza aquí, se refiere al fragmento mínimo de un anticuerpo que retiene tanto los sitios de reconocimiento del antígeno como los de unión al antígeno. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable de cadena pesada y otro de cadena ligera en asociación estrecha, no covalente o covalente. Es en esta configuración donde los tres CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión al antígeno en la superficie del dímero VH-VL. En conjunto, las seis CDR confieren al anticuerpo una especificidad de unión al antígeno. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende sólo tres CDRs específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque normalmente con una afinidad menor que el sitio de unión completo.

Preferentemente, el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo de doble unión, es decir, un anticuerpo biespecífico en el que ambos dominios de unión al antígeno están formados por un par VH/VL. Los anticuerpos de doble unión incluyen FIT-Ig (véase WO2015/103072 incorporados aquí por referencia), mAb-dAb, acoplamiento y bloqueo, intercambio de brazos Fab, cuerpo SEED, Triomab, LUZ-Y, Fcab, KÁ-cuerrpo, Fab ortogonal, scDiacuerrpo-Fc, diacuerrpo-Fc, scFv-Fc en tándem, Fab-scFv-Fc, Fab-scFv, intracuerrpo, BiTE, diacuerrpo, DART, TandAb, scDiacuerrpo, scDiacuerrpo-CH3, Diacuerrpo-CH3, Triple cuerrpo, Minianticuerrpo, minicuerrpo, scFv-CH3 KIH, scFv-CH-CL-scFv, F(ab')2-scFv, scFv-KIH, Fab-scFv-Fc, HCab tetravalente, ImmTAC, botón en o ja l, botón en ojal con cadena ligera común, botón en ojal con cadena ligera común y pares de carga, pares de carga, pares de carga con cadena ligera común, DT-IgG, DutaMab, IgG(H)-scFv, scFv-(H)IgG, IgG(L)-scFv, scFv-(L)IgG, IgG(L,H)-Fv, IgG(H)-V, V(H)-IgG, IgG(L)-V, V(L)-IgG, KIH IgG-scFab, 2scFv-IgG, IgG-2scFv y scFv4-Ig.

En una realización, el anticuerpo biespecífico es una IgG biespecífica que comprende un brazo polipeptídico de unión a FlXa y un brazo polipeptídico de unión a FX, cada brazo polipeptídico comprende una cadena pesada y una cadena ligera. La IgG es una inmunoglobulina tetramérica que comprende

Opcionalmente, los dos brazos polipeptídicos comprenden una cadena ligera común, de modo que la cadena ligera del primer y segundo par de cadenas pesadas-ligeras tiene una secuencia de aminoácidos idéntica (Figura 5). Alternativamente, los dos brazos polipeptídicos pueden comprender diferentes cadenas ligeras.

El anticuerpo biespecífico puede ser monovalente para la unión de FIXa y para la unión de FX.

Regiones constantes de anticuerpos

Como se ha comentado anteriormente, los anticuerpos pueden proporcionarse en varios isotipos y con diferentes regiones constantes. La región Fc de los anticuerpos es reconocida por los receptores Fc y determina la capacidad del anticuerpo para mediar en las funciones efectoras celulares, incluida la actividad de citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC), la actividad de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y la actividad de fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP). Estas funciones efectoras celulares implican el reclutamiento de células portadoras de receptores Fc en el lugar de las células diana, lo que provoca la muerte de la célula unida al anticuerpo.

En el contexto de la presente invención es deseable evitar las funciones efectoras celulares como ADCC, ADCP y/o CDC. Por lo tanto, las moléculas biespecíficas de unión a antígenos según la presente invención pueden carecer de la función efectora Fc, por ejemplo, pueden contener regiones Fc que no medien la ADCC, ADCP y/o CDC, o pueden carecer de regiones Fc o carecer de regiones constantes de anticuerpos por completo. Un anticuerpo puede tener una región constante que es nula en cuanto a los efectores.

Un anticuerpo puede tener una región constante de cadena pesada que se une a uno o más tipos de receptores Fc pero no induce funciones efectoras celulares, es decir, no media la actividad ADCC, CDC o ADCP. Dicha región constante puede ser incapaz de unirse al receptor o receptores Fc concretos responsables de desencadenar la actividad ADCC, CDC o a Dc P.

Un anticuerpo puede tener una región constante de cadena pesada que no se une a los receptores Fcy, por ejemplo, la región constante puede comprender una mutación Leu235Glu (es decir, donde el residuo de leucina de tipo salvaje está mutado a un residuo de ácido glutámico), que puede denominarse mutación "E", por ejemplo, IgG4-E. Otra mutación opcional para una región constante de la cadena pesada es Ser228Pro (mutación "P"), que aumenta la estabilidad al reducir el intercambio del brazo Fab. Una región constante de la cadena pesada puede ser una IgG4 que comprenda tanto la mutación Leu235Glu como la mutación Ser228Pro (numeración EU). Esta región constante de la cadena pesada "IgG4-PE" es nula en cuanto a los efectores. Un efector alternativo nulo de la región constante humana es una IgG1 inhabilitada.

Las regiones constantes de los anticuerpos pueden ser diseñadas para tener una semivida extendida in vivo. Algunos ejemplos son las mutaciones "YTE" y otras mutaciones que prolongan la semivida (Dall'Acqua, Kiener & Wu, JBC 281(33):23514-235242006 y WO02/060919 incorporado por referencia en el presente documento). La triple mutación YTE es una sustitución de 3 aminoácidos en el dominio CH2 de la IgG, estas mutaciones proporcionan tirosina en el residuo 252, treonina en el residuo 254 y ácido glutámico en el residuo 256, numerados según el índice UE de Kabat. Como se describe en las publicaciones citadas, la modificación YTE aumenta la semivida del anticuerpo en comparación con la semivida de un anticuerpo correspondiente que tenga un dominio CH2 humano de tipo salvaje. Para proporcionar una mayor duración de la eficacia in vivo, los anticuerpos de la presente invención pueden incluir regiones constantes del anticuerpo (por ejemplo, regiones constantes de IgG, por ejemplo, dominios CH2 de IgG) que tienen una o más mutaciones que aumentan la semivida del anticuerpo en comparación con la correspondiente región constante humana de tipo salvaje (por ejemplo, IgG, por ejemplo, dominio CH2 de IgG). La semivida puede determinarse mediante procedimientos estándar, como los descritos en WO02/060919.

En algunas realizaciones, se incluye en el anticuerpo biespecífico un dominio rico en ácido gamma-carboxiglutámico (Gla) u otro dominio de unión a la membrana (por ejemplo, en el extremo C del Fc), para promover la localización del anticuerpo en la membrana fosfolipídica de la superficie de las plaquetas (mediante la interacción entre el dominio Gla y la membrana), aumentando así la concentración local del anticuerpo biespecífico donde FIX y FX están naturalmente presentes in vivo. El documento WO2018/145125 describió una proteína mimética del FVIII que comprende un anticuerpo biespecífico FIX/FX y un dominio de unión a la membrana, por ejemplo, un dominio de unión a las plaquetas como un dominio C1, C2, un dominio PH, un dominio GLA o un dominio de unión a la membrana de una glicoproteína de la membrana de las plaquetas. Como se describe en el mismo, el dominio de unión a membrana puede estar unido al terminal C de uno o ambos dominios constantes de cadena pesada del anticuerpo biespecífico. Las moléculas biespecíficas de unión a antígenos de la presente invención pueden incluir opcionalmente las características y formatos moleculares descritos en el documento WO2018/145125.

Como se discute más adelante, en los formatos de IgG biespecíficos u otros formatos de anticuerpos en los que los diferentes brazos de unión al antígeno se heterodimerizan a través de regiones constantes, las regiones constantes pueden diseñarse para promover la formación de heterodímeros sobre la formación de homodímeros y/o para facilitar la purificación de heterodímeros a partir de una mezcla de especies diferentes.

El anticuerpo biespecífico anti-FIXaxFX emicizumab contiene una región constante de cadena pesada que incluye características diseñadas para promover su ensamblaje, purificación y/o rendimiento terapéutico. Un anticuerpo biespecífico según la presente invención puede comprender una o más de estas características. Por lo tanto, puede comprender una secuencia de aminoácidos de la región constante de la cadena pesada de la IgG4 humana (por ejemplo, IgHG4*03) que comprenda uno o más de los siguientes cambios (numeración EU):

Lys196Gln en CH1;

Ser228Pro en la región bisagra (mutación P);

Phe296Tyr en el giro DE de CH2;

Glu356Lys en CH3;

Lys439Glu en CH3;

Leu445Pro en CH3;

Deleción de Gly446;

Deleción de Lys447.

Una de cada una de las mutaciones Glu356Lys y Lys439Glu se incluyen en las dos regiones constantes de la cadena pesada emparejadas de forma opuesta dentro del Fc del biespecífico heterodimérico, es decir, una región constante de la cadena pesada comprende Glu356 y Lys439Glu y la otra región constante de la cadena pesada comprende Glu356Lys y Lys439 (véase la discusión sobre el emparejamiento de cargas más adelante).

Un anticuerpo biespecífico según la presente invención puede comprender una región Fc que tiene una o más de las características que están presentes en la región Fc de emicizumab. Puede comprender la región Fc de emicizumab. En una realización, las secuencias de aminoácidos de las regiones constantes de la cadena pesada son las secuencias de aminoácidos de las regiones constantes de la cadena pesada del emicizumab.

En la Tabla S-100 se muestran ejemplos de secuencias de aminoácidos para las regiones constantes de la cadena pesada.

Ingeniería de anticuerpos biespecíficos para facilitar la formación y/o purificación de heterodímeros

Una de las dificultades con el uso de anticuerpos biespecíficos en la clínica ha sido históricamente la dificultad de producirlos en grandes cantidades y con una pureza de grado farmacéutico. El formato "tradicional" de las IgG biespecíficas comprende dos pares diferentes de cadenas pesadas y ligeras, es decir, 4 cadenas polipeptídicas diferentes, que si se expresan juntas podrían formar 10 moléculas de anticuerpos diferentes. La mezcla de especies incluirá homodímeros (brazos de unión anti-FIXa homodiméricos y brazos de unión anti-FX homodiméricos), moléculas en las que una o ambas cadenas ligeras se intercambian entre los pares H-L, así como la estructura heterodimérica biespecífica "correcta".

Se han desarrollado formatos moleculares alternativos que evitan este posible emparejamiento erróneo, y en el presente documento se proporcionan varios ejemplos. Entre ellos se encuentran los F(ab')2, por ejemplo, preparados por acoplamiento químico o ensamblaje de cremalleras de leucina (fos:jun), diacuerpos y heterodímeros de scFv. Sin embargo, sigue siendo deseable poder utilizar IgG biespecíficas, para reflejar la estructura nativa de los anticuerpos en el torrente sanguíneo y minimizar la inmunogenicidad de la molécula terapéutica administrada. Además, un anticuerpo biespecífico de longitud completa puede tener una semivida sérica más larga.

La tecnología de "botón en o ja l" para fabricar anticuerpos biespecíficos se describió en [14] y en US5,731,168 ambos incorporados aquí por referencia. El principio consiste en diseñar dominios CH3 emparejados de cadenas pesadas heterodiméricas de manera que un dominio CH3 contenga un "botón" y el otro dominio CH3 contenga un "ojal" en una posición estéricamente opuesta. Los botoene se crean sustituyendo las pequeñas cadenas laterales de aminoácidos en la interfaz entre los dominios CH3, mientras que los ojales se crean sustituyendo las grandes cadenas laterales por otras más pequeñas. El botón está diseñado para insertarse en el ojal, para favorecer la heterodimerización de los diferentes dominios CH3 mientras se desestabiliza la formación del homodímero. En una mezcla de cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos que se ensamblan para formar un anticuerpo biespecífico, la proporción de moléculas de IgG que tienen cadenas pesadas heterodiméricas emparejadas se incrementa, aumentando el rendimiento y la recuperación de la molécula activa

Las mutaciones Y349C y/o T366W pueden incluirse para formar "botones" en un dominio IgG CH3. Las mutaciones E356C, T366S, L368A y/o Y407V pueden incluirse para formar "ojales" en un dominio IgG CH3. Los botones y ojales pueden introducirse en cualquier dominio CH3 de IgG humana, por ejemplo, un dominio CH3 de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. Un ejemplo preferido es la IgG4. Como se ha señalado, la IgG4 puede incluir otras modificaciones como las mutaciones "P" y/o "E". En la Tabla S-100 se muestra un ejemplo de secuencia de IgG4-PE y otros ejemplos de regiones constantes que incluyen mutaciones de "botón en ojal ". La secuencia IgG4 tipo a ("ra") contiene las sustituciones Y349C y T366W ("botones"), y la secuencia IgG4 tipo b ("Yb") contiene las sustituciones E356C, T366S, L368A e Y407V ("ojales"). Tanto ra como Yb contienen también la sustitución "P" en la posición 228 de la bisagra (S228P), para estabilizar la región de la bisagra de la cadena pesada. Tanto ra como yb también contienen la sustitución "E" en la región CH2 en la posición 235 (L235S), para abolir la unión a FcyR. Así, la secuencia relevante de la cadena pesada de la IgG4-PE es ppcpPcpapefEggps (SEQ ID NO: 401). Una moléculas biespecífica de unión a antígenos de la presente invención puede contener una región constante de cadena pesada humana IgG4 PE (por ejemplo, SEQ ID NO: 143), opcionalmente dos de estas regiones constantes emparejadas, opcionalmente en las que una tiene mutaciones "botones" y otra tiene mutaciones "ojales", por ejemplo, en las que una región constante de la cadena pesada tiene una secuencia SEQ ID NO: 144 (botones) y una región constante de la cadena pesada tiene una secuencia SEQ ID NO: 145 (ojales).

Otro avance en la ingeniería de las IgG biespecíficas fue la idea de utilizar una cadena ligera común, como se describe en WO98/50431. Se describieron anticuerpos biespecíficos que comprendían dos pares de cadenas pesadas-ligeras, en los que las cadenas ligeras variables de ambos pares de cadenas pesadas-ligeras tenían una secuencia común. El documento WO98/50431 describió la combinación del enfoque común de la cadena ligera con interacciones complementarias específicas en la interfaz de heterodimerización de la cadena pesada (como pomos en ojales) para promover la formación de heterodímeros y dificultar la formación de homodímeros. En combinación, estos enfoques mejoran la formación del heterodímero deseado en relación con los heterodímeros y homodímeros no deseados.

Mientras que la tecnología de botón en ojal implica la ingeniería de las cadenas laterales de aminoácidos para crear formas moleculares complementarias en la interfaz de los dominios CH3 emparejados en el heterodímero biespecífico, otra forma de promover la formación del heterodímero y dificultar la formación del homodímero es diseñar las cadenas laterales de aminoácidos para que tengan cargas opuestas. La asociación de los dominios CH3 en los heterodímeros de la cadena pesada se ve favorecida por el emparejamiento de residuos con cargas opuestas, mientras que las cargas positivas emparejadas o las cargas negativas emparejadas harían que la formación del homodímero fuera menos favorable energéticamente. El documento WO2006/106905 describe un procedimiento para producir un heteromultimero compuesto por más de un tipo de polipéptido (tal como un heterodímero de dos cadenas pesadas de anticuerpos diferentes) que comprende una sustitución en un residuo de aminoácido que forma una interfaz entre dichos polipéptidos de manera que se regule la asociación del heteromultimero, comprendiendo el procedimiento

(a) modificar un ácido nucleico que codifica un residuo de aminoácido que forma la interfaz entre los polipéptidos del ácido nucleico original, de manera que la asociación entre los polipéptidos que forman uno o más multímeros se inhiba en un heteromultímeros que pueden formar dos o más tipos de multímeros;

(b) cultivar células huésped de forma que se exprese una secuencia de ácido nucleico modificada por la etapa a); y

(c) recuperar dicho heteromultimero del cultivo de células huésped,

en la que la modificación de la etapa (a) consiste en modificar el ácido nucleico original de manera que uno o más residuos de aminoácidos sean sustituidos en la interfase de manera que dos o más residuos de aminoácidos, incluyendo el residuo o residuos mutados, que forman la interfase lleven el mismo tipo de carga positiva o negativa.

Un ejemplo de esto es suprimir la asociación entre cadenas pesadas introduciendo repulsión electrostática en la interfaz de los homodímeros de cadena pesada, por ejemplo modificando los residuos de aminoácidos que entran en contacto en la interfaz de los dominios CH3, incluyendo:

posiciones 356 y 439

posiciones 357 y 370

posiciones 399 y 409,

la numeración de los residuos se ajusta al sistema de numeración EU.

Modificando uno o más de estos pares de residuos para que tengan cargas similares (ambas positivas o ambas negativas) en el dominio CH3 de una primera cadena pesada, se inhibe el emparejamiento de homodímeros de cadena pesada por repulsión electrostática. Mediante la ingeniería de los mismos pares o pares de residuos en el dominio CH3 de una segunda cadena pesada (diferente) para tener una carga opuesta en comparación con los residuos correspondientes en la primera cadena pesada, el emparejamiento heterodimérico de la primera y segunda cadenas pesadas se promueve por la atracción electrostática.

Los aminoácidos de la interfaz CH3 de la región constante de la cadena pesada se modificaron para introducir pares de carga, las mutaciones se enumeran en la Tabla 1 del documento WO2006/106905. Se informó de que la modificación de los aminoácidos en las posiciones 356, 357, 370, 399, 409 y 439 de la cadena pesada para introducir la repulsión molecular inducida por la carga en la interfaz CH3 tenía el efecto de aumentar la eficacia de la formación del anticuerpo biespecífico previsto. Por ejemplo, una región constante de la cadena pesada puede ser una región constante de IgG4 que contenga la mutación K439E (Lys con carga positiva sustituida por Glu con carga negativa) y la otra región constante de la cadena pesada puede ser una región constante de IgG4 que contenga la mutación E356K (Glu con carga negativa sustituida por Lys con carga positiva), utilizando la numeración EU. El "emparejamiento de cargas" resulta de la proximidad espacial de los residuos 439 y 356 en una región Fc ensamblada a partir de la heterodimerización de estas dos regiones constantes.

Cuando se utilizan dos regiones constantes de cadena pesada diferentes, éstas pueden conectarse a los dos dominios VH diferentes del anticuerpo en cualquier orientación. Por ejemplo,

una primera cadena pesada puede comprender un dominio VH anti-FIX y una región constante que comprende K439E, y una segunda cadena pesada puede comprender un dominio VH anti-FXy una región constante que comprende E356K, o

una primera cadena pesada puede comprender un dominio VH anti-FIX y una región constante que comprende E356K, y una segunda cadena pesada puede comprender un dominio VH anti-FX y una región constante que comprende K439E.

El documento WO2006/106905 también ejemplificó anticuerpos IgG biespecíficos que unen FXy FIXa en los que los dominios CH3 de IgG4 fueron diseñados con mutaciones de botón en ojal. El tipo a (IgG4Ya) era una IgG4 sustituida en Y349C y T366W, y el tipo b (IgG4Yb) era una IgG4 sustituida en E356C, T366S, L368A e Y407V.

En otro ejemplo, se utilizó la introducción de pares de carga en los dominios VH y VL del anticuerpo para inhibir la formación de pares VH-VL "incorrectos" (emparejamiento de VH de un anticuerpo con VL del otro anticuerpo). En un ejemplo, los residuos Q en la VH y VL se cambiaron a K o R (positivo), o a E o D (negativo), para inhibir el enlace de hidrógeno entre las cadenas laterales Q e introducir la repulsión electrostática.

Otros ejemplos de pares de carga fueron divulgados en el documento WO2013/157954 que describía un procedimiento para producir una molécula heterodimérica que comprende dominios CH3 a partir de una sola célula, la molécula que comprende dos dominios CH3 capaces de formar una interfaz. El procedimiento comprende proporcionar en la célula (a) una primera molécula de ácido nucleico que codifica una primera cadena polipeptídica que comprende el dominio CH3, esta cadena comprende un residuo K en la posición 366 según el sistema de numeración EU y (b) una segunda molécula de ácido nucleico que codifica una segunda cadena polipeptídica que comprende el dominio CH3, esta cadena comprende un residuo D en la posición 351 según el sistema de numeración EU, comprendiendo el procedimiento además la etapa de cultivar la célula huésped, permitiendo la expresión de las dos moléculas de ácido nucleico y cosechando la molécula heterodimérica que comprende el dominio CH3 del cultivo. Otros procedimientos de ingeniería de las interacciones electrostáticas en las cadenas polipeptídicas para promover la formación de heterodímeros sobre la formación de homodímeros se describieron en el documento WO2011/143545. Otro ejemplo de ingeniería en la interfaz CH3-CH3 son los heterodímeros CH3 de dominio de intercambio de hebras (SEED). Los dominios CH3 están compuestos por segmentos alternos de secuencias CH3 de IgA e IgG humanas, que forman pares de heterodímeros SEED complementarios denominados "cuerpos SEED" [15 WO2007/110205]. También se han producido biespecíficos con cadenas pesadas heterodimerizadas que se modifican diferencialmente en el dominio c H3 para alterar su afinidad de unión a un reactivo de purificación como la proteína A. El documento WO2010/151792 describe una proteína biespecífica de unión a antígeno heterodimérica que comprende

un primer polipéptido que comprende, de N-terminal a C-terminal, una primera región de unión a un epítopo que se une selectivamente a un primer epítopo, una región constante de inmunoglobulina que comprende una primera región CH3 de una IgG humana seleccionada entre IgG1, IgG2 e IgG4; y

un segundo polipéptido que comprende, de N-terminal a C-terminal, una segunda región de unión a epítopo que se une selectivamente a un segundo epítopo, una región constante de inmunoglobulina que comprende una segunda región CH3 de una IgG humana seleccionada entre IgG1, IgG2 e IgG4, en la que la segunda región CH3 comprende una modificación que reduce o elimina la unión del segundo dominio c H3 a la proteína A.

La región Fc puede así comprender una o más mutaciones para promover la purificación diferencial del heterodímero activo de las especies de homodímero. El CH3 de una región constante de la cadena pesada puede incluir la mutación His435Arg y/o Tyr436Phe (numeración EU) [16] mientras que el CH3 de la otra región constante de la cadena pesada carece de dichas mutaciones. El emicizumab, por ejemplo, comprende una región Fc en la que un CH3 comprende His435 y el otro CH3 comprende His435Arg.

Los biespecíficos de la presente invención pueden emplear cualquiera de estas técnicas y formatos moleculares según se desee.

Generación y modificación de anticuerpos

Los procedimientos para identificar y preparar anticuerpos son bien conocidos. El ácido nucleico aislado (opcionalmente mutado) que codifica los anticuerpos (o los pares de cadenas pesadas y ligeras o los brazos de unión polipeptídica de los mismos) descritos en el presente documento puede introducirse en células huésped, por ejemplo, células CHO, como se ha comentado. A continuación, las células huésped se cultivan en condiciones de expresión del anticuerpo (o del dominio variable de la cadena pesada y/o ligera del anticuerpo, del par de cadenas pesadas y ligeras, o del brazo de unión del polipéptido) para producir el formato de anticuerpo deseado. En el presente documento se describen algunos formatos posibles de anticuerpos, por ejemplo, inmunoglobulinas enteras, fragmentos de unión a antígenos y otros diseños.

Variantes de la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cualquiera de los dominios VH y VL o CDRs cuyas secuencias se divulgan específicamente en el presente documento y pueden emplearse de acuerdo con la presente invención, como se discute.

Pueden realizarse alteraciones del ácido nucleico que codifica el dominio variable de la cadena pesada y/o ligera del anticuerpo, como la mutación de residuos y la generación de variantes, como se describe en el presente documento. Hay muchas razones por las que puede ser deseable crear variantes, que incluyen la optimización de la secuencia del anticuerpo para la fabricación a gran escala, facilitar la purificación, mejorar la estabilidad o mejorar la idoneidad para la inclusión en una formulación farmacéutica deseada. El trabajo de ingeniería de proteínas puede realizarse en uno o más residuos objetivo de la secuencia del anticuerpo, por ejemplo, para sustituir un aminoácido por un aminoácido alternativo (opcionalmente, generando variantes que contengan todos los aminoácidos naturales en esta posición, con la posible excepción de Cys y Met), y monitorizando el impacto en la función y la expresión para determinar la mejor sustitución. En algunos casos no es deseable sustituir un residuo por Cys o Met, o introducir estos residuos en una secuencia, ya que hacerlo puede generar dificultades en la fabricación, por ejemplo, por la formación de nuevos enlaces intramoleculares o intermoleculares de cisteína-cisteína. Cuando se ha seleccionado un candidato principal y se está optimizando para su fabricación y desarrollo clínico, generalmente será deseable cambiar lo menos posible sus propiedades de unión al antígeno, o al menos mantener la afinidad y la potencia de la molécula madre. Sin embargo, también se pueden generar variantes para modular características clave de los anticuerpos, como la afinidad, la reactividad cruzada o la potencia neutralizadora.

Una o más mutaciones de aminoácidos pueden realizarse opcionalmente en regiones marco de un dominio VH o VL de anticuerpos divulgado en el presente documento. Por ejemplo, uno o más residuos que difieren de la correspondiente secuencia del segmento de la línea germinal humana pueden ser revertidos a la línea germinal. Las secuencias de segmentos genéticos de la línea germinal humana correspondientes a los dominios VH y VL de los anticuerpos de ejemplo aquí indicados se indican en la Tabla S-12.

En una moléculas biespecífica de unión a antígenos, un sitio de unión a antígeno puede comprender un conjunto de CDR H y/o L de cualquiera de los anticuerpos anti-FIX o anti-FX divulgados con una o más mutaciones de aminoácidos dentro del conjunto de CDR H y/o L divulgado. La mutación puede ser una sustitución, deleción o inserción de aminoácidos. Así, por ejemplo, puede haber una o más sustituciones de aminoácidos dentro del conjunto divulgado de CDRs H y/o L. Por ejemplo, puede haber hasta 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 mutaciones, por ejemplo, sustituciones, dentro del conjunto de H y/o L CDR. Por ejemplo, puede haber hasta 6, 5, 4, 3 o 2 mutaciones, por ejemplo, sustituciones, en HCDR3 y/o puede haber hasta 6, 5, 4, 3 o 2 mutaciones, por ejemplo, sustituciones, en LCDR3.

Un anticuerpo puede comprender un dominio VH que tenga al menos un 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio VH como se muestra en las Tablas, y/o que comprenda un dominio VL que tenga al menos un 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio Vl de cualquiera de esos anticuerpos. Los algoritmos que pueden utilizarse para calcular el % de identidad de dos secuencias de aminoácidos incluyen, por ejemplo, BLAST, FASTA o el algoritmo de Smith-Waterman, empleando, por ejemplo, parámetros por defecto. Las variantes particulares pueden incluir una o más alteraciones de la secuencia de aminoácidos (adición, deleción, sustitución y/o inserción de un residuo de aminoácido).

Las alteraciones pueden realizarse en una o más regiones marco y/o en una o más CDRs. Las variantes se obtienen opcionalmente por mutagénesis de CDR. Las alteraciones normalmente no provocan una pérdida de función, por lo que un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos así alterada puede conservar la capacidad de unirse a su antígeno. Puede conservar la misma capacidad de unión cuantitativa que un anticuerpo en el que no se ha producido la alteración, por ejemplo, según se mide en un ensayo descrito en el presente documento. El anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos así alterada puede tener una capacidad mejorada para unirse a su antígeno.

La alteración puede comprender la sustitución de uno o más residuos de aminoácidos por un aminoácido no natural o no estándar, la modificación de uno o más residuos de aminoácidos a una forma no natural o no estándar, o la inserción de uno o más aminoácidos no naturales o no estándar en la secuencia. Los ejemplos de números y ubicaciones de las alteraciones en las secuencias de la invención se describen en otra parte del presente documento. Los aminoácidos naturales incluyen los 20 aminoácidos L "estándar" identificados como G, A, V, L, I, M, P, F, W, S, T, N, Q, Y, C, K, R, H, D, E por sus códigos estándar de una sola letra. Los aminoácidos no estándar incluyen cualquier otro residuo que pueda incorporarse a un esqueleto polipeptídico o que resulte de la modificación de un residuo de aminoácido existente. Los aminoácidos no estándar pueden ser de origen natural o no natural.

El término "variante", tal y como se utiliza en este documento, se refiere a un péptido o ácido nucleico que difiere de un polipéptido o ácido nucleico original por una o más deleciones, sustituciones o adiciones de aminoácidos o ácidos nucleicos, pero que conserva una o más funciones específicas o actividades biológicas de la molécula original. Las sustituciones de aminoácidos incluyen alteraciones en las que un aminoácido se sustituye por un residuo de aminoácido diferente que se produce de forma natural. Estas sustituciones pueden clasificarse como "conservadoras", en cuyo caso un residuo de aminoácido contenido en un polipéptido se sustituye por otro aminoácido natural de carácter similar, ya sea en relación con la polaridad, la funcionalidad de la cadena lateral o el tamaño. Estas sustituciones conservadoras son bien conocidas en la técnica. Las sustituciones abarcadas por la presente invención también pueden ser "no conservadoras", en las que un residuo de aminoácido presente en un péptido se sustituye por un aminoácido con propiedades diferentes, como un aminoácido natural de un grupo diferente (por ejemplo, sustituyendo un aminoácido cargado o hidrófobo por alanina), o alternativamente, en las que un aminoácido natural se sustituye por un aminoácido no convencional. En algunas realizaciones las sustituciones de aminoácidos son conservadoras. También se engloba dentro del término variante cuando se utiliza con referencia a un polinucleótido o polipéptido, se refiere a un polinucleótido o polipéptido que puede variar en su estructura primaria, secundaria o terciaria, en comparación con un polinucleótido o polipéptido de referencia, respectivamente (por ejemplo, en comparación con un polinucleótido o polipéptido de tipo salvaje).

En algunos aspectos, se pueden utilizar "variantes sintéticas", "variantes recombinantes", o variantes polinucleotídicas "químicamente modificadas" o variantes polipeptídicas aisladas o generadas mediante procedimientos bien conocidos en el arte. Las "variantes modificadas" pueden incluir cambios de aminoácidos conservadores o no conservadores, como se describe a continuación. Los cambios polinucleotídicos pueden dar lugar a sustituciones de aminoácidos, adiciones, deleciones, fusiones y truncamientos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia. Algunos aspectos incluyen variantes de inserción, variantes de deleción o variantes sustituidas con sustituciones de aminoácidos, incluyendo inserciones y sustituciones de aminoácidos y otras moléculas) que no se dan normalmente en la secuencia peptídica que es la base de la variante, por ejemplo, pero sin limitarse a la inserción de ornitina que no se da normalmente en las proteínas humanas. El término "sustitución conservadora", al describir un polipéptido, se refiere a un cambio en la composición de aminoácidos del polipéptido que no altera sustancialmente la actividad del mismo. Por ejemplo, una sustitución conservadora se refiere a la sustitución de un residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido diferente que tiene propiedades químicas similares (por ejemplo, ácido, básico, cargado positiva o negativamente, polar o no polar, etc.). Las sustituciones de aminoácidos conservadoras incluyen la sustitución de una leucina por una isoleucina o una valina, un aspartato por un glutamato o una treonina por una serina. Las tablas de sustitución conservadoras que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, los siguientes seis grupos contienen aminoácidos que son sustituciones conservadoras entre sí: 1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); y 6) Fenilalanina (f ), Tirosina (Y), Triptófano (W). (Véase también Creighton, Proteins, W. H. Freeman and Company (1984), incorporado por referencia en su totalidad) En algunas realizaciones, las sustituciones, deleciones o adiciones individuales que alteran, añaden o eliminan un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos también pueden considerarse "sustituciones conservadoras" si el cambio no reduce la actividad del péptido. Las inserciones o deleciones suelen ser del orden de 1 a 5 aminoácidos. La elección de los aminoácidos conservadores puede seleccionarse en función de la ubicación del aminoácido a sustituir en el péptido, por ejemplo si el aminoácido está en el exterior del péptido y expuesto a los disolventes, o en el interior y no expuesto a los disolventes.

Uno puede seleccionar el aminoácido que sustituirá a un aminoácido existente basándose en la localización del aminoácido existente, incluyendo su exposición a los disolventes (es decir, si el aminoácido está expuesto a los disolventes o está presente en la superficie exterior del péptido o polipéptido en comparación con los aminoácidos localizados internamente y no expuestos a los disolventes). La selección de tales sustituciones conservadoras de aminoácidos es bien conocida en la técnica, por ejemplo, como se indica en Dordo et al, J. Mol Biol, 1999, 217, 721 739 y Taylor et al, J. Theor. Biol. 119(1986);205-218 y S. French y B. Robson, J. Mol. Evol. 19(1983)171. En consecuencia, se pueden seleccionar sustituciones conservadoras de aminoácidos adecuadas para los aminoácidos del exterior de una proteína o péptido (es decir aminoácidos expuestos a un disolvente), por ejemplo, pero sin limitarse a ello, pueden utilizarse las siguientes sustituciones: sustitución de Y por F, T por S o K, P por A, E por D o Q, N por D o G, R por K, G por N o A, T por S o K, D por N o E, I por L o V, F por Y, S por T o A, R por K, G por N o A, K por R, A por S, K o P.

En realizaciones alternativas, uno puede también seleccionar sustituciones conservadoras de aminoácidos englobadas adecuadas para aminoácidos en el interior de una proteína o péptido, por ejemplo uno puede utilizar sustituciones conservadoras adecuadas para aminoácidos está en el interior de una proteína o péptido (es decir los aminoácidos no están expuestos a un disolvente), por ejemplo, pero sin limitarse a ello, se pueden utilizar las siguientes sustituciones conservadoras: donde Y se sustituye por F, T por A o S, I por L o V, W por Y, M por L, N por D, G por A, T por A o S, D por N, I por L o V, F por Y o L, S por A o T y A por S, G, T o V. En algunas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos no conservadoras también se engloban dentro del término de variantes.

La invención incluye procedimientos de producción de brazos de unión de polipéptidos que contienen variantes de dominio VH y/o VL de los dominios VH y/o VL de anticuerpos mostrados en las Tablas del presente documento. Los brazos polipeptídicos de unión a FIXa que comprenden dominios VH variantes pueden producirse mediante un procedimiento que comprende

(i) proporcionar, mediante adición, deleción, sustitución o inserción de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de un dominio VH del anticuerpo parental, un dominio VH del anticuerpo que es una variante de la secuencia de aminoácidos del dominio VH del anticuerpo parental, donde el dominio VH del anticuerpo parental es un dominio VH mostrado en la Figura 20, por ejemplo, N1280H, o es un dominio VH que comprende las regiones determinantes de la complementariedad de la cadena pesada de cualquiera de esos dominios VH,

(ii) combinar opcionalmente el dominio VH así proporcionado con un dominio VL, para proporcionar una combinación v H/VL, y

(iii) probar el dominio VH o la combinación de dominios VH/VL así proporcionada para identificar un anticuerpo con una o más características deseadas.

El dominio VH puede ser cualquier dominio VH cuya secuencia se muestra en la Tabla S-9A o la Figura 20, o cualquier dominio VH que comprenda un conjunto de HCDRs (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) de un dominio VH mostrado en la Tabla S-9A o la Figura 20.

Las características deseadas de los brazos polipeptídicos de unión a FIXa, y de las moléculas de unión a FIXa/FX biespecíficas que los comprenden, se detallan en otra parte del presente documento. Por ejemplo, el procedimiento puede comprender la confirmación de que el dominio VH o la combinación de dominios VH/VL se une a FIXa como se describe en el presente documento.

Cuando se incluyen dominios VL en el procedimiento, el dominio VL puede ser el dominio VL N0128L o puede ser una variante proporcionada mediante adición, deleción, sustitución o inserción de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos del dominio VL N0128L, o puede ser un dominio VL que comprenda las regiones determinantes de complementariedad de la cadena ligera del dominio VL N0128L. El dominio VL puede ser el dominio VL 0325L.

Los procedimientos de generación de anticuerpos variantes pueden comprender opcionalmente la producción de copias del anticuerpo o de la combinación de dominios VH/v L. Los procedimientos pueden comprender además la producción de un anticuerpo biespecífico que comprenda el brazo polipeptídico de unión a FIXa, por ejemplo mediante la expresión del ácido nucleico codificador. Los procedimientos adecuados de expresión, incluida la expresión recombinante en células huésped, se exponen en detalle en el presente documento.

Ácidos nucleicos que codificas y procedimientos de expresión

Se puede proporcionar ácido nucleico aislado que codifica moléculas biespecíficas de unión a antígenos, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, según la presente invención. El ácido nucleico puede ser ADN y/o ARN. El ADN genómico, el ADNc, el ARNm u otro ARN, de origen sintético, o cualquier combinación de ellos puede codificar un anticuerpo.

La presente invención proporciona constructos en forma de plásmidos, vectores, casetes de transcripción o de expresión que comprenden al menos un polinucleótido como el anterior. En las tablas se incluyen ejemplos de secuencias de nucleótidos. La referencia a una secuencia de nucleótidos, tal y como se establece en el presente documento, abarca una molécula de ADN con la secuencia especificada, y abarca una molécula de ARN con la secuencia especificada en la que la U se sustituye por la T, a menos que el contexto requiera otra cosa.

La presente invención también proporciona una célula huésped recombinante que comprende uno o más ácidos nucleicos que codifican la molécula de unión a antígeno. Los procedimientos de producción de la molécula codificada pueden comprender la expresión del ácido nucleico, por ejemplo, mediante el cultivo de células huésped recombinantes que contengan el ácido nucleico. La molécula biespecífica puede obtenerse así, y puede aislarse y/o purificarse utilizando cualquier técnica adecuada, para luego utilizarla según convenga. Un procedimiento de producción puede comprender la formulación del producto en una composición que incluya al menos un componente adicional, como un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Los sistemas de clonación y expresión de un polipéptido en una variedad de células huésped diferentes son bien conocidos. Las células huésped adecuadas incluyen bacterias, células de mamíferos, células vegetales, hongos filamentosos, levaduras y sistemas de baculovirus y plantas y animales transgénicos.

La expresión de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos en células procariotas está bien establecida en el arte. Un huésped bacteriano común es E. coli. La expresión en células eucariotas en cultivo también está disponible para los expertos en la materia como una opción para la producción. Las líneas celulares de mamíferos disponibles en la técnica para la expresión de un polipéptido heterólogo incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de hámster bebé, células de melanoma de ratón NSO, células de mieloma de rata YB2/0, células de riñón embrionario humano, células de retina embrionaria humana y muchas otras.

Los vectores pueden contener secuencias reguladoras apropiadas, incluyendo secuencias promotoras, secuencias terminadoras, secuencias de poliadenilación, secuencias potenciadoras, genes marcadores y otras secuencias según corresponda. El ácido nucleico que codifica un anticuerpo puede introducirse en una célula huésped. El ácido nucleico puede introducirse en las células eucariotas por diversos procedimientos, como la transfección con fosfato de calcio, DEAE-Dextran, la electroporación, la transfección mediada por liposomas y la transducción mediante retrovirus u otros virus, por ejemplo, vaccinia o, para las células de insectos, baculovirus. La introducción del ácido nucleico en la célula huésped, en particular una célula eucariota, puede utilizar un sistema viral o basado en un plásmido. El sistema de plásmidos puede mantenerse de forma episomal o puede incorporarse a la célula huésped o a un cromosoma artificial.

La incorporación puede ser por integración aleatoria o dirigida de una o más copias en uno o varios loci. Para las células bacterianas, las técnicas adecuadas incluyen la transformación con cloruro de calcio, la electroporación y la transfección mediante bacteriófagos. La introducción puede ir seguida de la expresión del ácido nucleico, por ejemplo, mediante el cultivo de células huésped en condiciones para la expresión del gen, y después, opcionalmente, el aislamiento o la purificación del anticuerpo.

El ácido nucleico de la invención puede integrarse en el genoma (por ejemplo, en el cromosoma) de la célula huésped. La integración puede promoverse mediante la inclusión de secuencias que promuevan la recombinación con el genoma, de acuerdo con las técnicas estándar. El ácido nucleico que codifica un biespecífico puede integrarse en el ADN genómico de una célula huésped (por ejemplo, CHO), por ejemplo, en el ADN cromosómico, y la célula recombinante resultante puede cultivarse para expresar el biespecífico. Un proceso de desarrollo de líneas celulares puede comprender la introducción del ácido nucleico que codifica el biespecífico en múltiples células huésped, y la selección de una línea celular que exprese un nivel deseado de anticuerpo biespecífico (por ejemplo, al menos un 95 % de heterodímero, con no más de un 5 % de contaminantes homodiméricos) en el rendimiento deseado (por ejemplo, al menos 0,5 g/l o al menos 1 g/l). Preferentemente, la línea celular mantendrá una expresión estable a lo largo de un número de generaciones en cultivo celular, por lo que puede mantener estos niveles de producción durante al menos 60 generaciones, por ejemplo.

La presente invención también proporciona un procedimiento que comprende utilizar el ácido nucleico descrito en el presente documento en un sistema de expresión para expresar la moléculas biespecífica de unión a antígenos. De manera deseable, las moléculas de unión a antígeno se expresan en un rendimiento de al menos 0,5 g/l en el sobrenadante celular tras la fermentación inicial, preferentemente en un rendimiento de > 2 g/l. La solubilidad debe ser > 10 mg/ml, preferentemente > 50 mg/ml, sin que se produzca una agregación o degradación significativa de las moléculas.

Para proporcionar medicamentos adecuados para el tratamiento global, los anticuerpos pueden producirse a gran escala, por ejemplo en volúmenes de cultivo celular de al menos 100 litros o al menos 200 litros, por ejemplo, entre 100-250 litros. El cultivo por lotes, en particular el cultivo por lotes alimentados, se utiliza ahora comúnmente para la producción de bioterapéuticos para uso clínico y comercial, y tales procedimientos pueden utilizarse adecuadamente en la presente invención para generar los anticuerpos, seguidos de pasos de purificación y formulación como se indica en el presente documento. Los biorreactores pueden ser recipientes metálicos (por ejemplo, de acero inoxidable) o pueden ser biorreactores de un solo uso.

Formulación y administración

Las moléculas biespecíficas de unión a antígenos ("biespecíficas") según la presente invención, y sus moléculas de ácido nucleico que codificas, se proporcionarán normalmente en forma aislada. Los dominios VH y/o VL biespecíficos y los ácidos nucleicos pueden suministrarse purificados de su entorno natural o de su entorno de producción. Las moléculas de unión a antígeno aisladas y el ácido nucleico aislado estarán libres o sustancialmente libres de material con el que se asocian de forma natural, como otros polipéptidos o ácidos nucleicos con los que se encuentran in vivo, o el entorno en el que se preparan (por ejemplo, el cultivo celular) cuando dicha preparación es por tecnología de ADN recombinante in vitro. Opcionalmente, una molécula de unión a antígeno o un ácido nucleico aislado (1) está libre de al menos algunas otras proteínas con las que se encontraría normalmente, (2) está esencialmente libre de otras proteínas de la misma fuente, por ejemplo de la misma especie, (3) es expresada por una célula de una especie diferente, (4) ha sido separada de al menos un 50 por ciento de polinucleótidos, lípidos, carbohidratos u otros materiales con los que está asociada en la naturaleza, (5) está asociada de forma operativa (por interacción covalente o no covalente) con un polipéptido con el que no está asociada en la naturaleza, o (6) no se encuentra en la naturaleza.

El anticuerpo biespecífico puede purificarse (por ejemplo, a partir del sobrenadante de cultivo celular) mediante cromatografía de proteína A y/o cromatografía de intercambio iónico. El anticuerpo biespecífico puede producirse mediante un procedimiento que comprende

expresar dos cadenas pesadas de anticuerpos y una cadena ligera común a partir de células huésped cultivadas que comprenden ácidos nucleicos que codificas,

obtener un cultivo celular que comprenda el anticuerpo biespecífico y los anticuerpos monoespecíficos ensamblados a partir de las cadenas pesadas del anticuerpo y la cadena ligera común,

aislar el anticuerpo biespecífico y los anticuerpos monoespecíficos del cultivo celular (por ejemplo, utilizando cromatografía de proteína A), y

purificar el anticuerpo biespecífico a partir de los anticuerpos monoespecíficos (por ejemplo, utilizando cromatografía de intercambio catiónico).

Los biespecíficos o sus ácidos nucleicos que codificas pueden ser formulados con diluyentes o adyuvantes y aún así, a efectos prácticos, estar aislados - por ejemplo, pueden mezclarse con portadores si se utilizan para recubrir placas de microtitulación para su uso en inmunoensayos, y pueden mezclarse con portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables cuando se utilizan en terapia. Como se describe en este documento, también pueden incluirse otros ingredientes activos en los preparados terapéuticos. Las moléculas de unión al antígeno pueden estar glicosiladas, ya sea de forma natural in vivo o mediante sistemas de células eucariotas heterólogas, como las células CHO, o pueden estar (por ejemplo, si se producen por expresión en una célula procariota) sin glicosilar. La invención abarca los anticuerpos que tienen un patrón de glicosilación modificado.

Típicamente, un producto aislado constituye al menos un 5 %, al menos un 10 %, al menos un 25 % o al menos un 50 % de una muestra dada. Un biespecífico puede estar sustancialmente libre de proteínas o polipéptidos u otros contaminantes que se encuentran en su entorno natural o de producción que podrían interferir con su uso terapéutico, diagnóstico, profiláctico, de investigación o de otro tipo.

Como se discute en este documento, la expresión de cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos para un anticuerpo biespecífico puede generar especies homodiméricas no deseadas (anticuerpos anti-FIX y anti-FX) además del anticuerpo biespecífico heterodimérico activo. Preferentemente, se proporciona un biespecífico en una composición en la que el anticuerpo biespecífico heterodimérico representa al menos el 95 % del anticuerpo total, estando los contaminantes del anticuerpo homodimérico presentes en un 5 % o menos. La composición puede comprender al menos un 98 % o al menos un 99 % de biespecíficos heterodiméricos, representando los contaminantes homodiméricos un 0 - 2 % o un 0 - 1 % respectivamente.

La invención proporciona composiciones terapéuticas que comprenden los biespecíficos aquí descritos. También se proporcionan composiciones terapéuticas que comprenden ácido nucleico que codifica dichos biespecíficos. Los ácidos nucleicos que codificas se describen con más detalle en el presente documento e incluyen ADN y ARN, por ejemplo, ARNm. En los procedimientos terapéuticos descritos en el presente documento, el uso del ácido nucleico que codifica el biespecífico, y/o de las células que contienen dicho ácido nucleico, puede utilizarse como alternativa (o además) a las composiciones que comprenden la propia molécula biespecífica. Las células que contienen el ácido nucleico que codifica el biespecífico, opcionalmente en las que el ácido nucleico está integrado de forma estable en el genoma, representan así medicamentos para su uso terapéutico en un paciente. El ácido nucleico que codifica el biespecífico puede introducirse en células humanas derivadas del paciente previsto y modificarse ex vivo. La administración de células que contienen el ácido nucleico codificador al paciente proporciona un reservorio de células capaces de expresar el biespecífico, lo que puede proporcionar un beneficio terapéutico a más largo plazo en comparación con la administración del ácido nucleico aislado o de la molécula biespecífica aislada. El ácido nucleico que codifica el biespecífico puede proporcionarse para su uso en terapia génica, que comprende la introducción del ácido nucleico que codifica en las células del paciente in vivo, de modo que el ácido nucleico se exprese en las células del paciente y proporcione un efecto terapéutico como la compensación de la deficiencia hereditaria del factor VIII.

Las composiciones pueden contener portadores adecuados, excipientes y otros agentes que se incorporan a las formulaciones para proporcionar una mejor transferencia, suministro, tolerancia y similares. En el formulario conocido por todos los químicos farmacéuticos se pueden encontrar multitud de formulaciones adecuadas: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, ungüentos, jaleas, ceras, aceites, lípidos, lípidos (catiónicos o aniónicos) que contienen vesículas (como LIPOFECTINT™), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidra, emulsiones de aceite en agua y agua en aceite, emulsiones carbowax (polietilenglicoles de varios pesos moleculares), geles semisólidos y mezclas semisólidas que contienen carbowax. Véase también Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311. Las composiciones pueden comprender el anticuerpo o el ácido nucleico en combinación con un tampón de inyección médico.

Los biespecíficos, o sus ácidos nucleicos que codificas, pueden formularse para la vía de administración deseada a un paciente, por ejemplo, en líquido (opcionalmente solución acuosa) para inyección. Un ejemplo de tampón en el que formular el biespecífico para inyección es una solución acuosa de acetato de sodio 20 mM, clorhidrato de arginina 150 mM, polisorbato 80 al 0,05 % p/v pH 5,2.

Se conocen varios sistemas de suministro que pueden utilizarse para administrar la composición farmacéutica de la invención. Los procedimientos de introducción incluyen, pero no se limitan a, las vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epiduraly oral. La composición puede administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo por infusión o inyección en bolo, por absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, rectal e intestinal, etc.) y puede administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local. Las moléculas de unión al antígeno se administran preferentemente por inyección subcutánea.

La composición farmacéutica también puede suministrarse en una vesícula, en particular un liposoma (véase Langer (1990) Science 249:1527-1533 Treat et al. (1989) en Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 López-Berestein, ibíd., pp. 317-327; véase en general ibíd.).

En ciertas situaciones, la composición farmacéutica puede suministrarse en un sistema de liberación controlada. En una realización, se puede utilizar una bomba (véase Langer, supra; Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). En otra realización, se pueden utilizar materiales poliméricos; véase, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974). En otra realización, un sistema de liberación controlada puede colocarse en la proximidad del objetivo de la composición, requiriendo así sólo una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138, 1984).

Las preparaciones inyectables pueden incluir formas de dosificación para inyecciones intravenosas, subcutáneas, intracutáneas e intramusculares, infusiones por goteo, etc. Estas preparaciones inyectables pueden ser preparadas por procedimientos públicamente conocidos. Por ejemplo, las preparaciones inyectables pueden prepararse, por ejemplo, disolviendo, suspendiendo o emulsionando el anticuerpo o su sal descrita anteriormente en un medio acuoso estéril o en un medio aceitoso utilizado convencionalmente para inyecciones. Como medio acuoso para las inyecciones existen, por ejemplo, la solución salina fisiológica, una solución isotónica que contiene glucosa y otros agentes auxiliares, etc., que pueden utilizarse en combinación con un agente solubilizante apropiado, como un alcohol (por ejemplo, etanol), un polialcohol (por ejemplo, propilenglicol, polietilenglicol), un tensioactivo no iónico [por ejemplo, polisorbato 80, HCO-50 (aducto polioxietileno (50 mol) de aceite de ricino hidrogenado)], etc. Como medio oleoso, se emplean, por ejemplo, aceite de sésamo, aceite de soja, etc., que pueden utilizarse en combinación con un agente solubilizante como benzoato de bencilo, alcohol bencílico, etc. La inyección así preparada puede llenarse en una ampolla apropiada. Una composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse por vía subcutánea o intravenosa con una aguja y jeringa estándar. Está previsto que el tratamiento no se limite al uso en la clínica. Por lo tanto, también es ventajosa la inyección subcutánea mediante un dispositivo sin agujas. Con respecto a la administración subcutánea, un dispositivo de suministro de pluma tiene fácilmente aplicaciones en el suministro de una composición farmacéutica de la presente invención. Dicho dispositivo de suministro de plumas puede ser reutilizable o desechable. Un dispositivo de suministro de pluma reutilizable generalmente utiliza un cartucho reemplazable que contiene una composición farmacéutica. Una vez que se ha administrado toda la composición farmacéutica dentro del cartucho y éste está vacío, el cartucho vacío puede desecharse fácilmente y sustituirse por un nuevo cartucho que contenga la composición farmacéutica. El dispositivo de suministro de la pluma puede entonces reutilizarse. En un dispositivo de suministro de pluma desechable, no hay un cartucho reemplazable. Más bien, el dispositivo de suministro de pluma desechable viene precargado con la composición farmacéutica mantenida en un depósito dentro del dispositivo. Una vez que el depósito se vacía de la composición farmacéutica, se desecha todo el dispositivo. Numerosos dispositivos reutilizables de administración de plumas y autoinyectores tienen aplicaciones en la administración subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención. Los ejemplos incluyen, pero ciertamente no se limitan a AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, Reino Unido), pluma DISETRONIC™ (Disetronic Medical Systems, Burghdorf, Suiza), pluma HUMALOG MIX 75/25™, pluma HUMALOG™, pluma HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly and Co, Indianapolis, Ind ), NOVOPEN™I, II y III (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), pluma Bd ™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, N.J.), OPTIPENT™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ y OPTICLIKT™ (Sanofi-Aventis, Frankfurt, Alemania), por nombrar sólo algunos. Los ejemplos de dispositivos de administración de pluma desechable que tienen aplicaciones en la administración subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención incluyen, pero ciertamente no se limitan a la pluma SOLOSTAR™ (Sanofi-Aventis), el FLEXPEN™ (Novo Nordisk) y el KWIKPEN™ (Eli Lilly).

Ventajosamente, las composiciones farmacéuticas para uso oral o parenteral descritas anteriormente se preparan en formas de dosificación en una dosis unitaria adecuada a una dosis de los ingredientes activos. Tales formas de dosificación en una dosis unitaria incluyen, por ejemplo, comprimidos, píldoras, cápsulas, inyecciones (ampollas), supositorios, etc. La cantidad de dicho anticuerpo contenida es generalmente de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 mg por forma de dosificación en una dosis unitaria; especialmente en la forma de inyección, dicho anticuerpo puede estar contenido en aproximadamente 5 a aproximadamente 100 mg y en aproximadamente 10 a aproximadamente 250 mg para las otras formas de dosificación.

El ácido nucleico biespecífico, o la composición que lo comprende, puede estar contenido en un recipiente médico como una ampolla, una jeringa, un recipiente intravenoso o un dispositivo de inyección. En un ejemplo, el ácido nucleico biespecífico o la composición es in vitro, y puede estar en un recipiente estéril. En un ejemplo, se proporciona un kit que comprende el biespecífico, el envase y las instrucciones para su uso en un procedimiento terapéutico como el descrito en el presente documento.

Un aspecto de la invención es una composición que comprende un biespecífico o ácido nucleico de la invención y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, cuyos ejemplos se enumeran más arriba. "Farmacéuticamente aceptable" se refiere a lo aprobado o aprobable por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal de EE.UU. o a lo que figura en la Farmacopea de EE.UU. u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales, incluidos los humanos. Un portador, excipiente o adyuvante farmacéuticamente aceptable puede administrarse a un paciente, junto con un agente biespecífico, por ejemplo, cualquier anticuerpo o molécula polipeptídica descrita en el presente documento, y no destruye la actividad farmacológica del mismo y no es tóxico cuando se administra en dosis suficientes para administrar una cantidad terapéutica del agente.

En algunas realizaciones, el biespecífico será el único ingrediente activo en una composición según la presente invención. Así, una composición puede consistir en el anticuerpo o puede consistir en el biespecífico con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Sin embargo, las composiciones según la presente invención incluyen opcionalmente uno o más ingredientes activos adicionales.

Cuando sea necesario (por ejemplo, para el manejo de hemorragias agudas), el biespecífico puede combinarse con uno o más tratamientos para la hemofilia, incluyendo el factor VIII recombinante (por ejemplo, turoctocog alfa) o el factor VIIa recombinante (por ejemplo, eptacog alfa). Las propiedades funcionales y el perfil de seguridad de los biespecíficos aquí descritos se consideran adecuados para su combinación segura con dichos agentes terapéuticos adicionales. El biespecífico puede combinarse con el factor Va recombinante (FVa), por ejemplo una variante activada del FVa como se describe en el documento US10407488.

Otros agentes terapéuticos que puede ser deseable administrar con los ácidos biespecíficos o nucleicos según la presente invención incluyen agentes analgésicos. Cualquier agente o combinación de agentes de este tipo puede administrarse en combinación con, o proporcionarse en composiciones con anticuerpos o ácidos nucleicos según la presente invención, ya sea como preparación combinada o separada. El ácido biespecífico o nucleico según la presente invención puede administrarse por separado y de forma secuencial, o de forma concurrente y opcionalmente como preparación combinada, con otro agente o agentes terapéuticos como los mencionados.

Las composiciones múltiples pueden administrarse por separado o simultáneamente. La administración separada se refiere a que las dos composiciones se administran en momentos diferentes, por ejemplo, con un intervalo de al menos 10, 20, 30 o 10-60 minutos, o con un intervalo de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12 horas. También se pueden administrar composiciones con 24 horas de diferencia, o incluso con más tiempo. Alternativamente, dos o más composiciones pueden ser administradas simultáneamente, por ejemplo, con menos de 10 o menos de 5 minutos de diferencia. Las composiciones administradas simultáneamente pueden, en algunos aspectos, administrarse como una mezcla, con o sin mecanismo de liberación temporal similar o diferente para cada uno de los componentes.

Los biespecíficos, y sus ácidos nucleicos que codificas, pueden utilizarse como agentes terapéuticos. Los pacientes aquí son generalmente mamíferos, típicamente humanos. Un ácido biespecífico o nucleico puede administrarse a un mamífero, por ejemplo, por cualquier vía de administración mencionada en el presente documento.

La administración se realiza normalmente en una "cantidad terapéuticamente eficaz", siendo ésta una cantidad que produce el efecto deseado para el que se administra, suficiente para mostrar beneficio a un paciente. La cantidad exacta dependerá de la finalidad del tratamiento y podrá ser determinada por un experto en la materia mediante técnicas conocidas (véase, por ejemplo, Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding). La prescripción del tratamiento, por ejemplo, las decisiones sobre la dosis, etc., es responsabilidad de los médicos de cabecera y de otros facultativos, y puede depender de la gravedad de los síntomas y/o de la progresión de la enfermedad que se esté tratando. Una cantidad terapéuticamente eficaz o una dosis adecuada de ácido biespecífico o nucleico puede determinarse comparando su actividad in vitro y su actividad in vivo en un modelo animal. Se conocen procedimientos de extrapolación de las dosis efectivas en ratones y otros animales de experimentación a los seres humanos.

Los biespecíficos pueden administrarse en una cantidad en uno de los siguientes intervalos por dosis:

de aproximadamente 10 pg/kg de peso corporal a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal,

de aproximadamente 50 pg/kg de peso corporal a aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal,

de aproximadamente 100 pg/kg de peso corporal a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal,

de aproximadamente 100 pg/kg de peso corporal a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal,

de aproximadamente 0,5 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, o

aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal o menos, por ejemplo menos de 4, menos de 3, menos de 2 o menos de 1 mg/kg del anticuerpo.

La dosis de molécula de unión a antígeno administrada puede ser de hasta 1 mg/kg. Puede formularse a una concentración menor para poblaciones pediátricas, por ejemplo 30 - 150 mg/ml. La molécula biespecífica puede envasarse en cantidades más pequeñas para una población pediátrica, por ejemplo, puede suministrarse en ampollas de 25-75 mg, por ejemplo, 30 o 60 mg.

En los procedimientos de tratamiento aquí descritos, pueden administrarse una o más dosis. En algunos casos, una sola dosis puede ser eficaz para lograr un beneficio a largo plazo. Así, el procedimiento puede comprender la administración de una dosis única del biespecífico, su ácido nucleico que codifica o la composición. Alternativamente, se pueden administrar múltiples dosis, normalmente de forma secuencial y separadas por un periodo de días, semanas o meses. Opcionalmente, el biespecífico puede administrarse a un paciente una vez al mes, o con menos frecuencia, por ejemplo, cada dos meses o cada tres meses.

Tal y como se utiliza en el presente documento, los términos "trato", "tratamiento" "tratar" o "mejora" se refieren a tratamientos terapéuticos, en los que el objetivo es revertir, aliviar, mejorar, inhibir, ralentizar o detener la progresión o la gravedad de una condición asociada a una enfermedad o trastorno. El término "tratar" incluye reducir o aliviar al menos un efecto adverso o síntoma de una afección, enfermedad o trastorno. El tratamiento suele ser "eficaz" si se reducen uno o más síntomas o marcadores clínicos. Por otra parte, el tratamiento es "eficaz" si se reduce o detiene la progresión de una enfermedad. Es decir, el "tratamiento" incluye no sólo la mejora de los síntomas o los marcadores, sino también el cese, o al menos la ralentización, del progreso o el empeoramiento de los síntomas en comparación con lo que cabría esperaren ausencia de tratamiento. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, el alivio de uno o más síntomas, la disminución de la extensión de la enfermedad, la estabilización (es decir, el no empeoramiento) del estado de la enfermedad, el retraso o la ralentización de la progresión de la enfermedad, la mejora o paliación del estado de la enfermedad, la remisión (ya sea parcial o total), y/o la disminución de la mortalidad, ya sea detectable o indetectable. El término "tratamiento" de una enfermedad también incluye el alivio de los síntomas o efectos secundarios de la enfermedad (incluido el tratamiento paliativo). Para que el tratamiento sea eficaz no se contempla la curación completa. El procedimiento puede, en ciertos aspectos, incluir también la curación. En el contexto de la invención, el tratamiento puede ser preventivo.

La larga semivida es una característica deseable en los biespecíficos de la presente invención. La prolongación de la semivida se traduce en una administración menos frecuente, siendo necesarias menos inyecciones para mantener una concentración terapéuticamente eficaz de la molécula en el torrente sanguíneo. La semivida in vivo de las moléculas de unión a antígeno de la presente invención en humanos puede ser de 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 días, o más. La semivida in v ivo de las moléculas de unión al antígeno en primates no humanos, como los monos cynomolgus, puede ser de 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 días, o más.

El mantenimiento del 1 % de la actividad normal del FVIII se considera un mínimo para el uso profiláctico en la hemofilia [1]. En un artículo en el que se informa de un ensayo clínico en humanos con ACE910 (emicizumab), la modelización farmacocinética poblacional in silico y las simulaciones sugirieron que una dosis semanal de 1 mg/kg daba lugar a una concentración plasmática de al menos aproximadamente 300 nM (45 pg/ml), produciendo un efecto hemostático continuo de al menos el 10 % de la actividad normal del FVIII [4]. También se informó de que esta dosis era bien tolerada por los pacientes.

En base a estos datos, un intervalo de concentración plasmática de aproximadamente 30 nM (~4,5 pg/ml) a 300 nM (~45 pg/ml) correspondería a una actividad efectiva del FVIII del 1 - 10 %, asumiendo una relación lineal entre la concentración de anticuerpos y la actividad del FVIII y una actividad comparable de los anticuerpos.

Los biespecíficos según la presente invención exhiben una actividad excepcionalmente alta a concentraciones en el intervalo de 30 nM (~4,5 pg/ml) a 300 nM (~45 pg/ml), manteniendo una fuerte actividad de generación de trombina incluso a dosis relativamente bajas. Como se evidencia por su alta potencia (véase, por ejemplo, el Ejemplo 14), un anticuerpo biespecífico según la presente invención puede mostrar eficacia terapéutica a una concentración plasmática más baja que el emicizumab. Por lo tanto, puede proporcionar un mayor beneficio terapéutico a una dosis equivalente, y puede proporcionar un beneficio terapéutico equivalente a una dosis más baja, en comparación con emicizumab. Así, los pacientes pueden beneficiarse de inyecciones más pequeñas y/o menos frecuentes, y los proveedores de servicios sanitarios pueden beneficiarse de la reducción de los costes asociados.

Actualmente, la FDA estadounidense (en una guía publicada en octubre de 2018) recomienda que el emicizumab se administre a una dosis de carga de 3 mg/kg mediante inyección subcutánea una vez por semana durante las primeras 4 semanas, seguida de una dosis de mantenimiento de:

1,5 mg/kg una vez por semana, o

3 mg/kg una vez cada 2 semanas, o

6 mg/kg una vez cada 4 semanas.

Las moléculas de unión a antígeno según la presente invención pueden proporcionarse para su administración a intervalos regulares de una semana, dos semanas, tres semanas, cuatro semanas o un mes.

En una realización preferida, el biespecífico se administra por inyección subcutánea.

Uso terapéutico

Las moléculas biespecíficas de unión a antígenos de la presente invención pueden utilizarse en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia. Las indicaciones terapéuticas de las moléculas incluyen:

utilizar para tratar la hemofilia A,

utilizar para tratar la deficiencia hereditaria del factor VIII,

utilizar para disminuir significativamente el número de incidentes hemorrágicos en pacientes con hemofilia A, utilizar para sustituir la función del factor VIII,

y/o

utilizar para promover la coagulación de la sangre.

Los pacientes son típicamente humanos. El paciente puede ser un humano diagnosticado con hemofilia A o deficiencia hereditaria de factor VIII, o un humano que tiene una expresión o actividad del factor VIII inferior (o ausente) en comparación con el tipo salvaje. El paciente puede ser un paciente pediátrico (por ejemplo, de 2 a menos de 18 años) o puede ser un adulto. El paciente puede ser un hombre humano. El paciente puede tener o no inhibidores del factor VIII.

Una molécula biespecífica de la presente invención, o una composición que comprenda dicha molécula biespecífica o su ácido nucleico codificador, puede utilizarse o proporcionarse para su uso en cualquier procedimiento de este tipo. También se contempla el uso de la molécula biespecífica, o de una composición que la comprenda o su ácido nucleico codificador, para la fabricación de un medicamento que se utilice en cualquiera de estos procedimientos. El procedimiento comprende típicamente la administración del anticuerpo o la composición a un mamífero, por ejemplo, un paciente humano. En el presente documento se describen formulaciones y procedimientos de administración adecuados.

Actualmente existe una necesidad insatisfecha de tratamiento para los pacientes con hemofilia A que desarrollan aloanticuerpos inhibidores del FVIII. Las moléculas de unión a antígeno de la presente invención son adecuadas para su uso en dichos pacientes. Por consiguiente, en algunos aspectos, un paciente tratado con una moléculas biespecífica de unión a antígenos según la presente invención puede ser resistente al tratamiento con FVIII debido a la presencia de anticuerpos inhibidores en el torrente sanguíneo. La resistencia al tratamiento puede manifestarse en una reducción de la eficacia de la terapia. Dicha resistencia puede detectarse en ensayos in vitro (por ejemplo, el ensayo aPTT) con una muestra de plasma sanguíneo del paciente, en la que la molécula terapéutica no reduce el tiempo de coagulación al mismo nivel que en un ensayo con plasma de control deficiente en FVIII (este último carece de anticuerpos inhibidores de la molécula terapéutica).

Los pacientes que reciben otros tratamientos para la hemofilia, como los anticuerpos biespecíficos contra el FIXa y el FX, también pueden desarrollar anticuerpos inhibidores contra esos anticuerpos terapéuticos. Como se ha señalado, el uso de anticuerpos humanos como los de la presente invención debería minimizar el riesgo de que esto ocurra, pero pueden generarse anticuerpos inhibidores en algunos pacientes que reciben moléculas de unión a antígeno de la presente invención u otras moléculas biespecíficas de unión a antígenos a FIXa y FX. Un paciente tratado con una moléculas biespecífica de unión a antígenos según la presente invención puede ser resistente al tratamiento con una moléculas biespecífica de unión a antígenos diferente para FIXa y FX debido a la presencia de anticuerpos inhibidores en el torrente sanguíneo. El paciente puede ser resistente al tratamiento con emicizumab.

Dado que los anticuerpos inhibidores pueden generarse a través de la administración terapéutica a largo plazo de un producto farmacéutico, puede ser beneficioso para los pacientes alternar o hacer ciclos entre múltiples tratamientos diferentes, para reducir el riesgo de que desarrollen anticuerpos inhibidores. Así, una moléculas biespecífica de unión a antígenos de la presente invención puede administrarse a un paciente que haya recibido previamente un tratamiento con un fármaco polipeptídico diferente que sustituya la actividad del FVIIIa, por ejemplo, una moléculas biespecífica de unión a antígenos para FIXa y FX, opcionalmente emicizumab, incluso cuando el paciente no haya desarrollado (todavía) anticuerpos inhibidores. Del mismo modo, emicizumab u otras moléculas biespecíficas de unión a antígeno para FIXa y FX, y otros fármacos polipeptídicos que sustituyen la actividad del FVIIIa en general, pueden administrarse a pacientes que fueron tratados previamente con una molécula biespecífica de unión a antígeno de la presente invención. Los regímenes de tratamiento pueden comprender la administración de un primer fármaco polipeptídico sustitutivo de la actividad del FVIII durante un primer periodo (por ejemplo, entre uno y seis meses, o entre seis meses y un año), seguido de un cambio a otro fármaco polipeptídico sustitutivo de la actividad del FVIII durante un segundo periodo (por ejemplo, entre uno y seis meses, o entre seis meses y un año), seguido de un cambio al primer fármaco o a otro fármaco polipeptídico sustitutivo de la actividad del FVIII. Las diferentes secuencias de aminoácidos de los distintos tratamientos farmacológicos deben garantizar que un paciente con riesgo de desarrollar anticuerpos inhibitorios contra un fármaco ya no corra el riesgo de desarrollar anticuerpos inhibitorios contra el primer fármaco (por ejemplo, emicizumab) tras cambiar a un fármaco diferente (por ejemplo, una molécula de la presente invención). El periodo de ciclos puede variar o acortarse, según la conveniencia y las preferencias del paciente y del médico.

Se reconocerá que la administración del ácido nucleico que codifica representa una terapia alternativa, y puede realizarse en lugar de administrar el fármaco polipeptídico directamente.

Como se ha señalado, se cree que las moléculas de unión a antígenos biespecíficas de la presente invención tienen un perfil de seguridad sólido, asociado a la ausencia (o al mínimo) de incidentes de reacciones de hipersensibilidad, desarrollo de aloanticuerpos, toxicidad de órganos u otros acontecimientos adversos que conduzcan a la interrupción de la terapia.

Equivalentes: Los expertos en la materia reconocerán, o serán capaces de determinar utilizando únicamente la experimentación rutinaria, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de la invención descritas en el presente documento.

Ejemplos

Los anticuerpos IgG biespecíficos que comprenden sitios de unión Fv para FIXa y FX humanos se generaron como se describe en el documento PCT/EP2018/066836 presentado el 22 de junio de 2018 titulado "Anticuerpos biespecíficos para el factor IX y el factor X" (WO2018/234575). Como se describe en el mismo, una amplia campaña de inmunización y cribado condujo a la identificación de un anticuerpo anti-FIXa NINA-0128 que, cuando se empareja en formato IgG con cualquiera de una selección de diferentes Fvs de unión anti-FX, mostró una actividad sobresaliente en los cribados funcionales, incluyendo un ensayo de tenasa y un ensayo aPTT. NINA-0128 comprende el dominio VH N0128H y el dominio VL 0128l . Se generaron y probaron varias variantes del dominio VH N0128H, que dieron lugar a nuevas mejoras en la función en un formato biespecífico, incluyendo por ejemplo el dominio VH N0436H.

Sobre la base de ese trabajo, se diseñaron IgG biespecíficas con el dominio VL del NINA-0128 como cadena ligera común. Se generó un panel de anticuerpos anti-FX in vivo en un ratón transgénico con genes de inmunoglobulina humana. Estos fueron coexpresados con NINA-0128 como brazo de unión anti-FIX, utilizando el dominio VL 0128L en una cadena ligera común que incluye una región constante humana. Un dominio VH, el T0200, mostró una actividad extraordinaria en el formato biespecífico y fue seleccionado para su desarrollo posterior. Los anticuerpos estructuralmente relacionados obtenidos del mismo animal inmunizado que el clon T0200H, incluían otros dominios VH anti-FX que funcionaban incluso mejor que el dominio VH T0200H en la IgG4 biespecífica con un dominio VH anti-FIX y la cadena ligera común 0128L.

Mientras tanto, se generaron otras variantes de anticuerpos anti-FIXa, introduciendo mutaciones en el dominio VH mientras se conservaba el dominio VL común 0128L. La secuencia del dominio VH del anti-FIXa N0436H se optimizó sustituyendo todos los aminoácidos posibles en cada posición de la CDR1, la CDR2 y la CDR3, expresando las variantes del dominio VH resultantes en el contexto de anticuerpos biespecíficos que comprenden la cadena ligera común, evaluando los anticuerpos biespecíficos variantes en una serie de ensayos funcionales, identificando las mutaciones asociadas con una mayor actividad funcional y generando otras variantes que incluyen combinaciones de mutaciones asociadas con una mayor actividad funcional.

Las variantes mejoradas del dominio VH T0200H se combinaron con las variantes mejoradas del dominio VH N0436H, cada una de ellas emparejada con la cadena ligera común N0128L, y se realizaron rondas repetidas de optimización, cribado y selección.

La figura 6 muestra una visión general simplificada del programa de cribado.

Se logró una actividad mimética del FVIII muy fuerte con anticuerpos biespecíficos de cadena ligera comunes que incluían las secuencias optimizadas. Los siguientes anticuerpos biespecíficos son ejemplos de gran rendimiento, como indica la caracterización funcional en una serie de ensayos relevantes para la enfermedad. La nomenclatura de los anticuerpos biespecíficos que tienen una cadena ligera común es IXAX-nnnn.tttt.llll, donde nnnn es un identificador numérico de 4 dígitos del dominio VH anti-FIX, tttt es un identificador de 4 dígitos del dominio VH anti-FX, y llll es un identificador numérico de 4 dígitos del dominio VL común:

IXAX-0128.0201.0128 (dominio VH anti-FIXa N0128H; dominio VH anti-FX T0201H; cadena ligera común 0128L) IXAX-0436.0201.0128

IXAX-0511.0201.0128

IXAX-1091.0201.0128

IXAX-1172.0201.0128

IXAX-1280.0201.0128

IXAX-1341.0201.0128

IXAX-1327.0201.0128

IXAX-1333.0201.0128

Otros dominios VH anti-FX de alto rendimiento que se combinan bien con los anteriores y con otros dominios VH anti-FIX en anticuerpos biespecíficos fueron los de la línea T0201H y sus variantes, como los enumerados en la Figura 11 y otras secuencias relacionadas. Se obtuvieron resultados particularmente buenos con anticuerpos biespecíficos que incluían un dominio VH anti-FIX, un dominio VH anti-FX y una cadena ligera común seleccionada entre las siguientes:

dominio VH anti-FIX: dominio VH anti-FX: dominio común VL

N0436H T0201H 0128L

N0511H T0596H 0325L

N1091H T0616H

N1172H T0638H

N1280H T0666H

N1327H T0678H

N1333H T0681H

N1341H T0687H

N1441H T0736H

N1442H T0999H

N1454H

Por ejemplo,

IXAX-1280.0999.0325

IXAX-1454.0999.0325

IXAX-1441.0999.0325

IXAX-1441.0736.0325

IXAX-1442.0687.0325

Los anticuerpos biespecíficos descritos aquí representan moléculas farmacéuticas candidatas para uso terapéutico como se describe aquí. Pueden ofrecer una opción sanitaria vital para los pacientes al proporcionar una alternativa a los tratamientos existentes, como el emicizumab, especialmente en los pacientes para los que dichos tratamientos existentes ya no son eficaces debido a la presencia de anticuerpos antifármaco.

En estos Ejemplos, el anticuerpo de referencia AbE o anticuerpo E es un anticuerpo biespecífico que tiene las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera de emicizumab [3].

Ejemplo 1. Creación de un panel de anticuerpos anti-FX con cadena ligera común

Los ratones transgénicos que expresan una cadena ligera común que comprende el dominio de VL 0128L fueron inmunizados con factor X humano. Las células B específicas de antígeno fueron clasificadas por citometría de flujo y las secuencias VH y VL fueron recuperadas por secuenciación de próxima generación (NGS). Se identificaron 200 cadenas pesadas anti-FX mediante el análisis NGS de los linfocitos clasificados como células individuales. Se realizaron más análisis de NGS a gran escala en tejidos de médula ósea y ganglios linfáticos recogidos de los mismos animales transgénicos.

Ejemplo 2. Creación de anticuerpos biespecíficos anti-FIXaxFIX con cadena ligera común

Cada cadena pesada anti-FX se expresó en células HEK293 como anticuerpo biespecífico que comprendía la cadena pesada anti-FIX N0128H y la cadena ligera común 0128L. Los anticuerpos biespecíficos se purificaron mediante proteína A sustancialmente como se describe en PCT/EP2018/066836 presentado el 22 de junio de 2018 titulado "Anticuerpos biespecíficos para el factor IX y el factor X", que se incorpora por referencia al presente documento.

Ejemplo 3. Cribado inicial de los brazos anti-FX mediante el ensayo de actividad similar al factor VIII de coagulación (FVIIIa) (ensayo FXasa o tenasa)

200 anticuerpos biespecíficos que comprenden una gama de diferentes cadenas pesadas anti-FX, cada uno en combinación con la cadena pesada anti-FIX N0128H y el dominio VL común 0128L, fueron cribados utilizando un ensayo de generación de factor Xa. Este cribado funcional detecta la actividad mimética del FVIIIa, es decir, la capacidad de potenciar (catalizar) la activación de FX a FXa mediada por el FIXa, in vitro, mediante un ensayo enzimático de "FXasa". En este ensayo, la molécula biespecífica de prueba se pone en contacto con FIXa y FX en presencia de fosfolípidos, en condiciones adecuadas para la formación de FXa. Se añade un sustrato para el FXa que, al ser escindido por el FXa, genera un producto detectable. La detección de este producto en presencia del anticuerpo biespecífico de prueba se compara con un control negativo en el que no está presente el anticuerpo de prueba (puede incluirse un anticuerpo de control). La señal detectada se cuantifica registrando la absorbancia de la solución de reacción a 405 nm. La absorbencia se mide en un intervalo de concentraciones de anticuerpos en el ensayo y se calcula un valor EC50 como medida de la potencia del anticuerpo biespecífico en este ensayo. La diferencia significativa de la EC50 entre el anticuerpo de prueba y el control indica que el anticuerpo de prueba es capaz de potenciar la activación de FX mediada por FIXa. Figura 7.

Resultados

Entre todos los anticuerpos biespecíficos ensayados, uno solo mostró una actividad FXasa sobresaliente: la cadena pesada N0128H anti-FIX y la cadena pesada T0200H anti-FX, emparejadas con el dominio VL común 0128L, tuvieron una actividad FXasa notablemente mayor que todas las demás del panel. Figura 8.

M ateriales y procedim ientos - Condiciones de reacción estándar de la FXasa

Se añadieron 7,5 pl de FIX (3,75 pg/ml) y 5 pl de sobrenadante de las células Expi293 que producen los anticuerpos recombinantes (Ejemplo 8) a cada pocillo de una placa de ensayo y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Se añadió una mezcla de 2,5 pl de FXIa (10 ng/ml), 5 pl de FX (50 ng/ml), 0,05 pl de fosfolípido (10 mg/ml) y 5 pl de tampón TBSB-S a cada pocillo para iniciar la reacción enzimática (escisión de FIXa de FX para generar FXa), y se incubó a 37 °C durante 1 hora. Después de 60 minutos, la reacción se terminó añadiendo 5 pl de EDTA 0,5 M. Tras añadir 10 pl de solución de sustrato S2765 a cada pocillo, se midió la absorbancia a 405 nm (longitud de onda de referencia 655 nm) durante 30 minutos (una lectura cada 10 minutos). Todas las reacciones se llevaron a cabo a 37°C a menos que se indique lo contrario.

TBSB:

Solución salina tamponada con Tris que contiene 0,1 % de albúmina de suero bovino

Para hacer 7,5 ml de TBSB:

0,1 ml de solución de BSA al 7,5 % (Sigma)

7.4 ml de solución TBS 1X (diluida a partir de la solución TBS 20X de ThermoFisher)

TBSB-S:

TBSB que contiene 5 mM CaCh y 1 mM MgCl2

Para hacer 100 ml de TBSB-S:

99.4 ml TBSB

0,5 ml de CaCh 1M (Sigma)

0,1 ml de MgCl2 1M (Sigma)

Solución madre de FXIa (10 pg/ml):

Añadir 10 ml de TBSB-S a 0,1 mg de FXIa (Enzyme Research Laboratories) para hacer una solución madre de 10 pg/ml.

Diluir a 10 ng/ml (1:1.000) la solución de trabajo antes de usarla.

Solución madre de F.IXa (5 pg/ml)

Añadir 100 ml de TBSB-S a 0,5 mg de FlXa (HFIXa 1080) (Enzyme Research Laboratories) para hacer una solución madre de 5 pg/ml.

Diluir a 1,0 pg/ml (1:5) la solución de trabajo antes de usarla.

Solución madre de FIX (37,5 pg/ml):

Añadir 13,3 ml de TBSB-S a 0,5 mg de FIX (Enzyme Research Laboratories) para hacer una solución madre de 37,5 pg/ml.

Diluir a 3,75 pg/ml (1:10) la solución de trabajo antes de usarla.

Solución de trabajo FX (50 pg/ml):

Añadir 16 ml de TBSB-S a 0,8 mg de FX (Enzyme Research Laboratories) para hacer una solución de trabajo de 50 pg/ml.

No es necesario diluirlo más antes de utilizarlo.

Solución madre S2765:

25 mg de sustrato cromogénico S2765 (Chromogenix) (0,035 mmol)

Para hacer una solución madre de 2 mM:

Añadir 17,493 ml de agua al vial y disolver con agitación.

Solución de polibreno:

Para hacer una solución madre de bromuro de hexadimetrina de 0,6 g/l:

Añadir 0,15 g de bromuro de hexadimetrina (Sigma) a 250 ml de agua.

Diluir a 0,6 mg/l (1:1.000) la solución de trabajo antes de usarla.

Solución de trabajo de sustrato S2765

Una mezcla 1:1 de solución madre de S-27652mM y solución de polibreno 0,6 mg/l.

Ejemplo 4. Identificación del dominio VH anti-FX T0200H

El anticuerpo biespecífico designado IXAX.0128.0200.0128, que comprende el dominio VH anti-FIX N0128H, el dominio VH anti-FX T0200H y la cadena ligera común 0128L, demostró una elevada actividad FXasa en comparación con los otros anticuerpos biespecíficos. Se eligió el dominio VH T0200H para su desarrollo posterior, con el fin de intentar la producción de anticuerpos biespecíficos aún mejorados.

Ejemplo 5. Optimización del dominio VH anti-FX T0200H

A nális is filogenético

A partir de la NGS masiva (Ejemplo 1) y del análisis filogenético, se identificaron 113 cadenas pesadas anti-FX que pertenecían al mismo grupo de linfocitos que la cadena pesada anti-FX T0200H. El grupo representa a las células B que parecen compartir un linaje evolutivo común. Las cadenas pesadas anti-FX del grupo compartían aproximadamente un 95 % de identidad de secuencia con T0200H a nivel de aminoácidos. Figura 9.

Las 113 cadenas pesadas anti-FX se expresaron en anticuerpos biespecíficos con un panel de diferentes cadenas pesadas anti-FIX y la cadena ligera común 0128L, y se cribaron mediante el ensayo de FXasa.

Se identificaron varias cadenas pesadas anti-FX que mostraron una mayor actividad FXasa en comparación con el dominio VH T0200H cuando se ensayaron como anticuerpos biespecíficos. La figura 10 muestra datos de ejemplo del ensayo de la Xasa.

En la figura 11 se muestra una selección de las secuencias de brazos FX más activas. Estos dominios VH fueron designados T0201H a T0217H respectivamente. Los que presentaron la mayor actividad en formato biespecífico fueron T0204, T0207, T0205 y T0201 (Figura 10b).

Utilizando comparaciones de secuencias de aminoácidos, y con el apoyo de los datos funcionales, se identificaron varios residuos de aminoácidos en los marcos y regiones CDR de las cadenas pesadas anti-FX que difieren en los dominios VH más activos y pueden contribuir a la actividad biológica mejorada en comparación con T0200H. Por ejemplo, una o más de las siguientes características de aminoácidos del dominio VH pueden aumentar la actividad mimética del FVIII de los anticuerpos biespecíficos que contienen el dominio VH (numeración de residuos IMGT):

Sustitución de la valina (V) por la isoleucina (I) en la posición 5 del FR1;

Sustitución de la lisina (K) por la glutamina (Q) en la posición 13 del FR1;

Sustitución de leucina (L) por metionina (M) en la posición 39 en el FR2;

Sustitución de treonina (T) por serina (S) en la posición 62 de la CDR2;

Sustitución de aspartato (D) por serina (S) en la posición 64 de la CDR2;

Sustitución de treonina (T) por serina (S) en la posición 85 de FR3;

Sustitución de alanina (A) por serina (S) en la posición 112 de la CDR3.

Sin embargo, está claro que la actividad es alta incluso sin estas sustituciones de aminoácidos, ya que el propio T0200H muestra una fuerte actividad en un anticuerpo biespecífico, y ninguna de estas sustituciones estaba presente de forma consistente en todos los dominios VH superiores (Figura 11).

M utagénesis dirig ida p ara la optim ización funcional

La CDR3 del dominio VH T0201H se mutó sistemáticamente para proporcionar una biblioteca de dominios VH en la que el residuo de cada posición se sustituyó individualmente por otro aminoácido. Los dominios VH resultantes se denominaron T0XXXH, donde los números XXX se muestran en la Figura 12 para los mutantes de las posiciones 114 (Cys), 115 (Leu), 116 (Gln) y 117 (Leu) del IMGT. Consulte la figura 13 para ver la numeración del Im Gt .

Elim inación de la posib le responsabilidad de desarrollo

Un residuo de cisteína (C) no apareado presente en la CDR3 fue identificado como un motivo de secuencia de alto riesgo. Esta cisteína no apareada, presente en la posición 114 de la CDR3 de T0200H y de los otros 113 dominios VH anti-FX identificados a partir del análisis NGS masivo, representa un inconveniente para el desarrollo del anticuerpo biespecífico. Se cribaron los dominios VH que contenían sustituciones de todos los demás aminoácidos para la cisteína en esta posición en T0201H. Estas nuevas variantes se expresaron con la cadena ligera común N1280H (véase el ejemplo 6) y 0128L como anticuerpos biespecíficos IgG4, se purificaron mediante proteína A y se cribaron para determinar la actividad mimética del FVIII mediante el ensayo de FXasa. La sustitución de la cisteína en la posición 114 por isoleucina (I), glutamina (Q), arginina (R), valina (V) o triptófano (W) dio lugar a anticuerpos biespecíficos con una actividad mimética del FVIII similar a la de los anticuerpos biespecíficos con los dominios VH T0201H o T0202H. Concluimos que el C114 puede ser sustituido por una variedad de otros aminoácidos y seguir manteniendo la actividad mimética del FVIII.

Ejemplo 6. Optimización sistemática de la secuencia del anti-FIX VH

Cada residuo de aminoácido en CDR1, CDR2 y CDR3 fue mutado individualmente para generar mutantes de posición única de la cadena pesada anti-FIX N0128H. Las variantes de la cadena pesada anti-FIX así generadas se expresaron en formato biespecífico, emparejadas con el dominio VL común de la cadena pesada anti-FX T0201H y N0128L en HEK293.

Los anticuerpos biespecíficos purificados de la proteína A fueron ensayados para la actividad biológica por FXasa (Ejemplo 7) y aPTT para buscar cambios de aminoácidos que mejoraron la actividad mimética del FVIII del anticuerpo biespecífico. Las variantes mejoradas se combinaron para generar mutantes dobles o triples en las regiones CDR1, CDR2 y CDR3.

La Tabla N identifica mutantes del dominio VH N0128H en los que uno o más residuos de las CDRs están mutados a otros aminoácidos. Por ejemplo, el dominio VH N0436H es un mutante Ser-> Ile del dominio VH N0128H, es decir, en el que la serina en la posición 111A del IMGT en la CDR3 se sustituye por isoleucina. Se introdujeron más mutaciones de residuos además de las mutaciones individuales iniciales. Por ejemplo, el dominio VH N0511H es un mutante Ser112ALys del dominio VH N0436H, es decir, en el que la serina en la posición 112A del IMGT en la CDR3 se sustituye por lisina. N1172H es un mutante Glu64Arg del dominio VH N0511H, es decir, en el que el glutamato en la posición 64 del IMGT en la CDR2 se sustituye por arginina. N1280H es un mutante Thr29Arg del dominio VH N1172H, es decir, en el que la Thr en la posición 29 del IMGT en la CDR1 se sustituye por arginina. Los otros dominios VH nombrados pueden identificarse en la Tabla N de la misma manera.

Consulte la figura 14 para ver la numeración IMGT.

Ejemplo 7. Cribado de anticuerpos biespecíficos mejorados en el ensayo de la FXasa

Los brazos anti-FX que comprenden las variantes del dominio VH generadas como se describe en el Ejemplo 5 se combinaron con los brazos anti-FIX que comprenden las variantes del dominio VH generadas como se describe en el Ejemplo 6, cada uno emparejado con el dominio VL común 0128L, para generar anticuerpos biespecíficos FIXAxFX, y se examinó la actividad funcional en el ensayo de tenasa.

Resultados

Se muestran datos de ejemplo:

Figura 10.

Figura 15.

Figura 16.

Se identificaron anticuerpos biespecíficos altamente activos para varias combinaciones de dominios VH anti-FIX y VH anti-FX, cada uno emparejado con el dominio VL común 0128L. En la Figura 16 se muestran ejemplos de combinaciones de dominios VH anti-FIX y VH anti-FX.

La identidad del dominio VH anti-FX parecía tener una mayor influencia que la identidad del dominio VH anti-FIX para estas combinaciones de brazos biespecíficos, siendo T0638H, T0616H, T0596H y T0663H los dominios VH anti-FX de mayor rendimiento. Estos dominios anti-FX funcionaron bien en combinación con una variedad de brazos anti-FIX, incluyendo variantes de N1280H como las indicadas en la Figura 16. Las secuencias de dominio VH anti-FIX se identifican por referencia a la Tabla N adjunta. Las secuencias de dominio VH anti-FX se identifican por referencia a la Figura 12.

La actividad mimética del FVIII del anticuerpo biespecífico N128 se optimizó secuencialmente modificando residuos de aminoácidos en cualquiera de las tres CDR. Se identificaron varios residuos de aminoácidos que aumentan la actividad mimética del FVIII en las CDR y se combinaron estas mutaciones para maximizar la actividad. La actividad mimética del FVIII de los anticuerpos con el dominio VH N0128H se mejoró progresivamente con otros dominios VH en el siguiente orden: N0128H -> N0436H -> N0511H -> N1091H -> N01172H -> N1280H -> N1333H. Figura 17.

M ateriales y procedim ientos - Condiciones de reacción de la FXasa m odificada.

El cribado inicial de la actividad mimética del anticuerpo biespecífico FVIII se evaluó utilizando las condiciones de reacción estándar de la FXasa establecidas anteriormente en el Ejemplo 3. A medida que la actividad mimética del FVIII del anticuerpo biespecífico aumentaba, las condiciones de reacción de la FXasa estándar ya no eran suficientes para detectar mejoras en la actividad de la FXasa. Por lo tanto, se establecieron condiciones de reacción de la FXasa modificada más sensibles.

Este ensayo modificado difiere de las Condiciones de Reacción Estándar de la FXasa de las siguientes maneras: No se utiliza el FXIa, se utiliza la forma activada del Factor IX (FIXa) y no hay paso de incubación. Todos los reactivos de FXasa se mezclan con un anticuerpo biespecífico y la generación de FXa se detecta registrando la absorbancia de la solución de reacción 40 a 50 veces cada 30 segundos a 405 nm utilizando un lector de placas Envision ajustado a 37 °C.

Se mezclaron 18,45 pl de tampón TBSB-S con 0,05 pl de fosfolípido (10 mg/ml) y se mezclaron vigorosamente mediante pipeteo para dispersar el fosfolípido. A esta mezcla se añadieron 1,5 pl de FIXa (1 pg/ml) y 5 pl de FX (50 pg/ml), con 5 pl de polibreno (0,6 mg/l) y 5 pl de S2765 (4 mM), todo ello precalentado a 37 °C. Por último, se añadieron 5 ul de anticuerpo biespecífico que se estaba investigando para la actividad de la FXasa. La absorbencia a 405 nm (longitud de onda de referencia 655 nm) se registró de 40 a 50 veces cada 30 segundos.

Ejemplo 8. Cribado de anticuerpos biespecíficos mejorados en el ensayo de coagulación en plasma

Los brazos anti-FX que comprenden las variantes del dominio VH generadas como se describe en el Ejemplo 5 se combinaron con brazos anti-FIX que comprenden las variantes del dominio VH generadas como se describe en el Ejemplo 6, cada uno emparejado con el dominio VL común 0128L, para generar anticuerpos biespecíficos FIXaxFX. Para determinar la capacidad de los anticuerpos biespecíficos de la presente invención para corregir la capacidad de coagulación de la sangre de los pacientes con hemofilia A, se examinó el efecto de estos anticuerpos en el tiempo de tromboplastina parcial activado (aPTT) utilizando plasma deficiente en FVIII.

Una mezcla de 5 pl de solución de anticuerpos biespecíficos con una variedad de concentraciones, 20 pl de plasma deficiente de FVIII (Helena Biosciences), y 25 pl de reactivo aPTT (APTT Si L Minus, Helena Biosciences) se calentó a 37°C durante 3 minutos. La reacción de coagulación se inició añadiendo a la mezcla 25 |jl de CaCh 25 mM (Helena Biosciences). Se midió el período de tiempo hasta la coagulación. El aparato utilizado fue el analizador de coagulación C-4 de 4 canales (Helena Biosciences).

Una muestra de los resultados se muestra en la Figura 18.

La dependencia de la concentración se determinó posteriormente para los anticuerpos biespecíficos que mostraron el mayor efecto de reducción del tiempo de coagulación.

Por ejemplo, el anticuerpo IXAX-1280.0201.0128 IgG4 demostró una disminución dependiente de la dosis en el aPTT, comparable al anticuerpo de referencia AbE (control positivo). Figura 19. No se observó ninguna reducción del aPTT con un anticuerpo de control del isotipo. Obsérvese que la preparación de anticuerpos utilizada para este ensayo fue el resultado de una purificación en un solo paso sobre proteína A y, como tal, contenía anticuerpos monoespecíficos anti-FIX residuales y anticuerpos monoespecíficos anti-FX residuales, además de la fracción biespecífica deseada.

Ejemplo 9. Análisis de los dominios VH anti-FIX en anticuerpos biespecíficos

Considerando los datos de una variedad de ensayos funcionales, incluyendo los descritos en el Ejemplo 7 y el Ejemplo 8, se observó que el dominio VH anti-FX T0201 y sus variantes de secuencia se desempeñaron bien en combinación con una variedad de dominios VH anti-FIX en anticuerpos biespecíficos con la cadena ligera común. Por ejemplo, los dominios VH anti-FIX N0128H, N0436H, N0511H, N1091H, N1172H, N1280H, N1314H, N1327H y N1333H dieron una buena actividad funcional en los anticuerpos biespecíficos. Estos dominios VH anti-FIX comparten una estrecha relación estructural. Figura 20. Su rendimiento podría mejorarse aún más mediante el ajuste fino de los residuos a través de la sustitución (Tabla N) y la combinación de sustituciones asociadas con una mejor actividad.

Ejemplo 10. Afinidad de unión al antígeno

La afinidad de unión y la cinética de la interacción anticuerpo-antígeno se determinaron mediante SPR. La afinidad y la cinética de los anticuerpos de prueba purificados (todos ellos IgG4PE) se compararon con el anticuerpo anti-FIX de comparación AbN o el anticuerpo anti-FX de comparación AbT como control positivo y con un control de isotipo (ISTC) como control negativo.

A fin id ad de unión para F IX

Los anticuerpos anti-FIX analizados mostraron una unión a FIX en el intervalo de afinidad de aproximadamente 0,18 jM a 0,3 jM y tasas de asociación (kon) y disociación (koff) rápidas para FIX. Los anticuerpos anti-FIX analizados mostraron una afinidad de unión a FIX ligeramente superior y una tasa de asociación más alta en comparación con el anticuerpo comparador AbN. No se observó ninguna unión a FIX con ISTC. Tabla E-10-1.

Tabla E-10-1. Afinidad de unión y constantes cinéticas en la tasa de activación (kon) y en la tasa de inactivación (koff) de los anticuerpos anti-FIX. Nomenclatura de anticuerpos monoespecíficos anti-FIXa: NINA-hhhh.llll, donde hhhh es el identificador numérico del dominio VH (por ejemplo, N0436H) y llll es el identificador numérico del dominio VL (por ejemplo, 0128L).

A fin id ad de unión para F X

Los anticuerpos anti-FX analizados mostraron una unión a FX en el intervalo de afinidad de aproximadamente 0,1 jM a 1,4 jM y una tasa de asociación (k^on) y disociación(k^off) rápida para FX. No se observó ninguna unión a FX con ISTC.

Los anticuerpos anti-FX analizados mostraron una afinidad de unión a FX similar a la del anticuerpo de referencia AbT. Tabla E-10-2. Afinidad de unión y constantes cinéticas de tasa de activación (kon) y de desactivación (koff) de los anticuerpos anti-FX. Nomenclatura de anticuerpos monoespecíficos anti-FX: TINA-hhhh.llll, donde hhhh es el identificador numérico del dominio VH (por ejemplo, N0201H) y llll es el identificador numérico del dominio VL (por ejemplo, 0128L).

M ateriales y procedim ientos

La SPR se utilizó para determinar la afinidad de unión (K ^d ) a FIX o FX respectivamente, las constantes cinéticas en la tasa de activación (kon) y en la tasa de desactivación (koff). Los análisis se realizaron con un sistema Biacore 8K (GE Healthcare).

El anticuerpo IgG Fc antihumano se inmovilizó en el chip CM4 (GE Healthcare) según las instrucciones del fabricante. La superficie del chip se activó mediante el acoplamiento de aminas y posteriormente se bloqueó con etanolamina 1M. La ejecución de inmovilización se realizó a 25°C utilizando HBS-EP como tampón de ejecución inmovilización. Los anticuerpos monoespecíficos (denominados ligando) que habían sido purificados en la proteína A fueron capturados en la superficie de la IgG Fc CM4 antihumana a aproximadamente 2 pg/ml. Los ligandos se inyectaron durante 60 segundos a 10 pl/min en todos los canales activos de los 8 canales de flujo. La ejecución se realizó a 25°C utilizando HBS-P 1X de pH neutro CaCh 2,5 mM como tampón de ejecución.

FIX humano (MW ~55 KDa) o FX humano (MW ~58 KDa) se reconstituyó a 1 mg/ml en el tampón de ejecución y se utilizó como analito. El analito se inyectó en modo de cinética de ciclos múltiples (MCK) a 3 concentraciones (1,5 pM, 500 nM y 166,7 nM) con 120 segundos de fase de asociación y 200 segundos (para FIX) o 300 segundos (para FX) de fase de disociación, a un caudal de 30 pl/seg en ambos canales, el activo y el de referencia. Para la fase de regeneración se utilizaron tres inyecciones de Glicina 10 mM pH 1,5 durante 60 segundos a 10 pl/min.

Para el análisis anti-FIX, el anticuerpo ISTC hlgG4PE fue capturado a 1 pg/ml durante 60 segundos a 10 pl/min en el canal de referencia. hlgG4PE ISTC y hlgG1 ISTC también fueron capturados en el canal activo como control negativo. El anticuerpo monoespecífico AbN se utilizó como control positivo.

Para el análisis anti-FX, el ISTC hlgG4PE también fue capturado en el canal activo como control negativo. El anticuerpo monoespecífico AbT se utilizó como control positivo.

Los valores de la constante de la tasa de asociación (k^on), la constante de la tasa de disociación (k^off) y la constante de disociación (Kd) se calcularon a partir de los datos de unión mediante el software BIAevaluation. Los datos se sustrajeron de la referencia y del tampón y se ajustaron al modelo de reacción biomolecular de un paso (Langmuir 1:1). En el modelo se evaluaron los primeros 30 segundos de disociación.

Ejemplo 11. Unión simultánea de anticuerpos biespecíficos a FX y FIX

La capacidad del anticuerpo biespecífico FIXxFX IXAX-0436.0202.0128 de unirse simultáneamente a FIX y FX se demostró utilizando SPR. La cinética de unión del anticuerpo biespecífico purificado se comparó con un control de isotipo (ISTC). Los sensorgramas de la unión indicaron que el anticuerpo biespecífico se unió simultáneamente a FIX y FX mientras que no se observó ninguna unión a FIX y FX con ISTC. Figura 21A.

FIX fue pasaado sobre la superficie capturada con el anticuerpo biespecífico para permitir la unión con el primer analito. La interacción entre el anticuerpo biespecífico generó una respuesta de base como se indica en el sensograma de la Figura 21. La siguiente inyección del segundo analito, FX, generó un nuevo aumento de la señal que indica que FX se une al anticuerpo biespecífico ya en complejo con FIX.

Por el contrario, no se observó ninguna unión a FIX o FX cuando FIX y FX fueron pasados sobre la superficie donde un control de isotipo fue capturado, demostrando la especificidad de la interacción entre FI y FX al anticuerpo biespecífico. Figura 21A.

El sensorgrama para el anticuerpo biespecífico también puede ser comparado con el sensorgrama para el anticuerpo monoespecífico. Cuando el anticuerpo capturado es un monoespecífico anti-FX la misma serie de inyección no da ninguna respuesta significativa cuando es pasado el FIX en cambio cuando se realiza la segunda inyección (mezcla 1:1) se observan aproximadamente 50 unidades de respuesta (RU) mientras que con el biespecífico la respuesta es 25 RU mayor. Figura 21B.

Una característica clave del anticuerpo biespecífico mimético del FVII es la capacidad de unirse simultáneamente a FIX y FX, para promover la conversión de FX en FXa por FIXa. La unión observada representa una confirmación biofísica de que los anticuerpos biespecíficos aquí descritos pueden interactuar simultáneamente con el Factor IX y el Factor IX, lo que está de acuerdo con los datos funcionales descritos en los Ejemplos adjuntos.

M ateriales y procedim ientos

El análisis SPR se realizó con un sistema Biacore 8K (GE Healthcare).

Se inmovilizó un anticuerpo IgG Fc antihumano en el chip CM4 (GE Healthcare) según las instrucciones del fabricante. La superficie del chip se activó mediante el acoplamiento de aminas y posteriormente se bloqueó con etanolamina 1M. El proceso de inmovilización se realizó a 25°C utilizando HBS-EP como tampón de inmovilización.

El anticuerpo biespecífico (ligando), que había sido purificado por captura de proteína A seguida de cromatografía de intercambio iónico, fue capturado en la superficie de IgG Fc c M4 antihumana a aproximadamente 2 pg/ml. El ligando se inyectó a 10 pg/ml durante 60 segundos a 10 pl/min en un canal activo. La ejecución se realizó a 25°C utilizando HBS-P 1X de pH neutro CaCh 2,5 mM como tampón de ejecución.

El FIX humano y el FX humano (analitos) se reconstituyeron a 1,15 mg/ml en el tampón de ejecución y se utilizaron como analitos. Los analitos se inyectaron a 10 pM solos o mezclados 1:1 (10 pM 10 pM) a 10 pl/min durante 180 segundos.

Se capturó un anticuerpo de control de isotipo hlgG4PE a 10 pg/ml durante 60 segundos a 10 pl/min en el canal de referencia como control negativo. Se realizó una inyección en blanco de tampón para todas las muestras que se iban a utilizar en el proceso de doble referencia. Para la fase de regeneración se utilizaron tres inyecciones de 10 mM de glicina con pH 1,5 durante 30 segundos a 30 pl/min. Los datos fueron referenciados y sustraídos del tampón y ajustados en el modelo Langmuir 1:1.

Ejemplo 12. Optimización adicional del VH anti-FX

El brazo de unión anti-FIX del anticuerpo biespecífico se "fijó" como un dominio VH que comprendía las CDRs de N1280H y un dominio VL que comprendía las CDRs de 0128L, mientras que se realizaron otros refinamientos en el dominio Vh anti-FX para mejorar el rendimiento. 0128L se utilizó como cadena ligera común.

La Tabla T identifica los mutantes del dominio VH T0201H en los que uno o más residuos de las CDRs están mutados a otros aminoácidos. La tabla muestra el nombre dado a cada variante del dominio VH que tiene la mutación identificada. En cada caso, los residuos distintos de los indicados se dejan sin modificar. Por ejemplo, el dominio VH T0616H es un mutante Leu115lle del dominio VH T0201H, es decir, en el que la leucina (L) en la posición IMGT 115 de la CDR3 se sustituye por isoleucina (I). Se introdujeron más cambios de residuos en las variantes que contenían las mutaciones simples en el dominio VH T0201H, dando lugar a otras variantes que representaban combinaciones de diferentes mutaciones en el dominio VH T0201H. Por ejemplo, el dominio VH T0687H es un mutante Ser111APhe, Cys114Val, Leu115lle del dominio VH T0201H, es decir en el que la serina en la posición 111A del IMGT en la CDR3 se sustituye por fenilalanina (mutación T0537H), la cisteína en la posición 114 del IMGT en la CDR3 se sustituye por valina (mutación T0606H), y la leucina en la posición 115 del IMGT se sustituye por isoleucina (mutación T0616H). Las secuencias de otros dominios VH anti-FX nombrados pueden identificarse en la Tabla T de la misma manera. Consulte la figura 13 para ver la numeración del IMGT.

Los anticuerpos biespecíficos, purificados por cromatografía de proteína A, se sometieron a pruebas de actividad funcional para buscar una mejora con respecto al biespecífico parental que comprende el dominio VH T0201H. Se identificaron anticuerpos mejorados en el ensayo de FXasa (utilizando condiciones de reacción de FXasa modificadas como se detalla en el Ejemplo 7) y en el ensayo de aPTT (procedimiento como se detalla en el Ejemplo 8).

La mutagénesis de HCDR3 produjo mejoras en la actividad mimética del FVIII. Los HCDR de los dominios VH que demuestran una actividad mejorada se indican en la Figura 25. Por ejemplo, se descubrió que cada una de las siguientes sustituciones y combinaciones de sustituciones en la CDR3 del dominio VH T0201H mejoraba la actividad mimética del FVIII (el nombre del dominio VH resultante se indica entre paréntesis) (lista no exhaustiva):

Gln116Met en CDR3 (T0638H VH);

Leu115lle en CDR3 (T0616H VH);

Ser111APhe en CDR3 (T0537H VH);

Cys114lle Leu115lle (T0666H VH);

Ser111APhe Cys114lle Leu115lle (T0678H VH);

Ser111APhe Cys114Leu Leu115lle (T0681H VH);

Ser111APhe Cys114Val Leu115lle (T0687H).

Concluyendo la mutagénesis HCDR3 de T0201H, los dominios VH T0687H, T0678H y T0681H demostraron la mayor actividad en los anticuerpos biespecíficos.

La actividad funcional de los anticuerpos biespecíficos se mejoró aún más mediante la mutagénesis de HCDR1 y HCDR2 en el brazo anti-FX. Empezando por T0681H, cada residuo de aminoácido de CDR1 y CDR2 fue sustituido sistemáticamente por todos los demás aminoácidos posibles, generando los dominios VH numerados T0690H a T0993H identificados en la Tabla T.

También se realizaron análisis de aPTT y TGA para apoyar la evaluación funcional de las variantes de HCDR1. Los dominios VH T0736 (mutación S29K), T0713, T0734, T0742, T0774 y T0785 mostraron una mejor actividad en comparación con T0681H. Basándose en los análisis funcionales de las variantes de HCDR1 de T0681H, se seleccionó el dominio VH T0736H como el de mayor rendimiento. En comparación con T0201H, T0736H combina una sustitución Ser29Lys en CDR1 con las sustituciones Ser111APhe Cys114Val y Leu115lle en CDR3.

También se realizaron análisis de FXasa, aPTT y TGA para apoyar la evaluación funcional de las variantes de HCDR2. Basándose en los análisis funcionales de las variantes de HCDR2 de T0681H, se identificaron los siguientes dominios VH que tienen una actividad mejorada en comparación con T0681 H: T0926H (S62K), T850H (I56L), T0925H (S62L), T0951H (G63S), T0958H (S64D), T0989 (T65R) y T0990H (T65S).

Las variantes CDR1 y CDR2 seleccionadas se combinaron entonces con las CDR3 seleccionadas, generando otras variantes del dominio VH para investigar posibles mejoras adicionales en la actividad.

Los datos del ensayo FXasa para anticuerpos de alto rendimiento se resumen en la Figura 22 y la Figura 23. Los datos del ensayo de aPTT se resumen en la Figura 24.

Los anticuerpos biespecíficos que comprenden los dominios VH mostrados en las Figuras 22 y 23 demostraron tiempos de coagulación mejorados o similares en comparación con los anticuerpos biespecíficos que comprenden T0201H, con T0999H demostrando el tiempo de coagulación más corto en el ensayo aPTT.

La actividad de la FXasa y los tiempos de coagulación fueron comparables con el anticuerpo biespecífico de comparación AbE.

La Figura 25 identifica las CDR de los dominios VH que se mejoraron progresivamente para la actividad mimética del FVIII durante el proceso de mutagénesis.

Ejemplo 13. Fuerte actividad de los anticuerpos biespecíficos en un ensayo de generación de trombina El ensayo de generación de trombina (TGA) detecta la activación de la protrombina a trombina en el plasma sanguíneo. A medida que se genera la trombina, ésta convierte un sustrato fluorogénico en un fluoróforo, que se monitoriza continuamente mediante un lector de placas. El TGA proporciona una medida sólida de la capacidad de los anticuerpos biespecíficos para sustituir al FVIII en la cascada de coagulación en el plasma deficiente de FVIII, y se cree que la cinética de generación de trombina en el TGA es muy fiable como indicador del rendimiento terapéutico in vivo de los fármacos miméticos del FVIII.

Resultados

Para establecer una concentración adecuada para el factor IXa como desencadenante del TGA, inicialmente se realizaron TGAs con una concentración fija de anticuerpo biespecífico mientras se variaba la concentración de FIXa presente en el reactivo desencadenante. Se determinó que una solución madre de 1 ml de reactivo MP que contiene 222 nM de FIXa es suficiente para desencadenar la generación de trombina para el plasma humano normal agrupado (concentración final, 0,33 nM de FIXa) con una Cmáx de 418,11 nM de trombina, un Tmáx de 7,67 minutos y un tiempo de retardo de 5,83 minutos. Figura 26. Estos valores son comparables con el intervalo de referencia en adultos sanos (véase, por ejemplo, la Tabla 3 de la ref [11]) y validar el uso de FIXa como activador del TGA.

El dominio VH T0201H de anticuerpo biespecífico y las variantes combinatorias CDR1, CDR2 y CDR3 de T0201H se expresaron con el brazo FIX N1280H y la cadena ligera común N0128 en células HEK, se purificaron mediante cromatografía de proteína A y se analizaron a una concentración final de 133 nM y 80 nM. Las variantes del dominio VH mostraron un tiempo de retardo más corto, un aumento de la Cmáx y un tiempo más corto hasta el pico en comparación con la T0201H, siendo la T0999 la que mostró la mayor altura del pico de trombina y el menor tiempo hasta el pico en ambas concentraciones analizadas. El rendimiento de al menos IXAX-1280.0999.0128 fue comparable al de AbE y al del calibrador de emicizumab. AbE demostró un tiempo de retardo, una altura de pico y un tiempo hasta el pico de 2,5 minutos, 291,8 nM y 6,0 minutos respectivamente, y IXAX-1280.0999.0128 demostró un tiempo de retardo, una altura de pico y un tiempo hasta el pico de 2,0 minutos, 317,2 nM y 5 minutos. Figura 27. Figura 28. Como se ilustra en la Figura 27 y en orden de aumento de la Tmáx, se observó una Tmáx de 5, 6,83, 6,83, 7, 7,67, 13,17, 15 y 15,67 minutos para los anticuerpos biespecíficos que comprenden T0999, T0687, T0736, T0678, T0681, T0666, T0201 y T0596 respectivamente.

Tabla E13-2. Parámetros registrados del TGA realizado con (i) calibrador de emicizumab y (ii) plasma normal agrupado sembrado con PBS. El calibrador de emicizumab es originalmente 100 ug/ml = 0,1 mg/ml = 666,666 nM. La dilución 125/80 = 1,5625 (80 plasma, 20 Calibrador/MP, 20 FluCa, 5 PBS spike) proporciona una concentración final de emicizumab de 426,6 nM para el calibrador. Consulte la figura 27.

Para un TGA de respuesta a la dosis, se expresó el anticuerpo biespecífico IXAX-1280,0999,0128 en células HEK, se purificó por cromatografía de proteína A y se purificó el heterodímero biespecífico por cromatografía de intercambio iónico. Utilizando un disparador de FIXa de 0,3 nM, se llevó a cabo la respuesta a la dosis de Cmáx (nM) y Tmáx (min) en el TGA en plasma con deficiencia de FVIII al que se le añadió el anticuerpo biespecífico IXAX-1280.0999.0128 y se comparó con el calibrador de emicizumab. Ambos anticuerpos biespecíficos demostraron una disminución lineal de la Cmáx con el aumento de la concentración del anticuerpo. IXAX-1280.0999.0128 alcanzó una Cmáx mayor que la del anticuerpo calibrador, siendo este aumento más pronunciado a bajas concentraciones de anticuerpos biespecíficos. Véase la figura 29.

Tabla E13-3. Parámetros registrados del TGA llevado a cabo en plasma deficiente en FVIII, sembrado con mutantes CDR1, CDR2 y CDR3 simples y combinados de T0201H en el anticuerpo biespecífico IXAX-1280.0201.0128. Consulte la figura 29.

Tabla E13-4. Parámetros registrados del TGA realizado con el calibrador de emicizumab. Consulte la figura 29.

M ateriales y procedim ientos

Para el trabajo experimental inicial con el fin de establecer una concentración adecuada de factor IXa como activador del TGA, se mezclaron 80 j l de plasma normal agrupado, tomado de individuos sanos (Helena Biosciences), con 20 |jl de reactivo activador (reactivo de micropartículas (MP) que se compone únicamente de fosfolípidos que contienen cantidades variables de FlXa) en placas de 96 pocillos de fondo U transparentes Immulon 2HB (ThermoFisher# 3665). Todos los reactivos se utilizaron según las instrucciones del fabricante, precalentados a 37°C en un baño de agua.

Una vez que se determinó que una concentración final de 0,33 nM de FlXa era suficiente para desencadenar la generación de trombina para el plasma normal, se aplicaron las mismas condiciones de ensayo incluyendo 0,3 nM de FlXa con plasma empobrecido en FVIII en ensayos de trombograma automatizados calibrados.

El plasma inmunodepletado de FVIII (Helena Biosciences) se mezcló con 20 j l de reactivo de activación (reactivo de micropartículas (MP) que está compuesto únicamente por fosfolípidos que contienen 222 nM de FlXa, concentración final de 0,33 nM) en placas de 96 pocillos Immulon 2HB transparentes de fondo en U. Todos los reactivos se utilizaron según las instrucciones del fabricante, precalentados a 37°C en un baño de agua. Se llevó a cabo una respuesta a la dosis de TGA comenzando con 300 nM de anticuerpo biespecífico de prueba o de calibrador de emicizumab (emicizumab sembrado con plasma deficiente de FVIII (Enzyme Research Laboratories)) con una serie de dilución de 1 en 3 en cinco puntos. Se utilizó un anticuerpo de control de isotipo IgG4 humano como control negativo, y plasma normal agrupado (FVIII+ve) sembrado con PBS como control positivo.

Las muestras se midieron por duplicado, acompañadas de pocillos calibradores duplicados que contenían un calibrador de trombina (que contenía una cantidad predeterminada de trombina) en el mismo plasma. La placa de 96 pocillos se calentó a 37 °C en un lector de placas Fluoroskan Ascent (Thermo) durante 10 minutos. La generación de trombina comenzó tras la adición de 20 j l de reactivo FluCa (sustrato fluorogénico, ZGGR-AMC (2,5 mM), en tampón que contiene 100 mM de CaCh). Los reactivos TGA se obtuvieron de Stago. El aumento de la fluorescencia a lo largo del tiempo se controló con el lector de placas.

Se realizó una curva de calibrador de trombina junto a cada muestra investigada. Utilizando un calibrador, con una concentración conocida de trombina, se puede calcular la cantidad de trombina generada en una muestra investigada a partir de la señal fluorescente obtenida mediante el software ThrombinoscopeBV. La fluorescencia de los pocillos de prueba se calibró con la fluorescencia de los pocillos calibradores de trombina, para determinar la trombina equivalente generada en los pocillos de prueba.

Los datos de la ejecución se analizaron con el software de análisis Stago. La cantidad de trombina generada se determinó utilizando la curva del calibrador de trombina con actividad conocida. Se determinaron los siguientes aspectos del trombograma: tiempo de retardo (minutos), potencial de trombina endógena (PTE; área bajo el trombograma, nM de trombina/minuto), altura del pico (Cmáx; nM de trombina), tiempo hasta el pico (Tmáx/minuto), índice de velocidad (VI; nM/minuto, pendiente entre el tiempo de retardo y el tiempo hasta el pico) y comienzo de la cola (minutos; tiempo en el que la generación de trombina ha llegado a su fin).

Ejemplo 14. Respuesta a la dosis y potencia en el ensayo de generación de trombina

Para evaluar la altura máxima del pico de trombina (Cmáx, nM de trombina) y el tiempo hasta el pico (Tmáx, minutos) del anticuerpo biespecífico IXAX-1280.0999.0325 se realizaron ensayos de generación de trombina (TGA) en plasma humano empobrecido en FVIII utilizando una respuesta a la dosis de concentración completa del anticuerpo según el procedimiento establecido en el Ejemplo 13. Los datos generados a partir de las curvas dosis-respuesta se ajustaron mediante un modelo no lineal de log[anticuerpo] frente a la pendiente de la variable del parámetro de respuesta (modelo de regresión logística de 4 parámetros). Se incluyó el AbE a modo de comparación. Se determinó por espectrometría de masas que el IXAX-1280.0999.0325 y el AbE utilizados en este ensayo eran casi 100 % heterodímeros, sin que se detectaran contaminantes homodiméricos.

En una ventana terapéutica prospectiva que abarca de 300 a 30 nM, equivalente a 45 a 4,5 jg/ml, se observaron valores de Cmáx (nM de trombina) equivalentes (dentro del 10 %) o mayores para IXAX-1280.0999.0325 en comparación con AbE en todas las concentraciones analizadas (Figura 30). La Cmáx de IXAX-1280.0999.0325 se aproximó a la de un control plasmático normal cuando las concentraciones del anticuerpo biespecífico estaban entre 100 y 300 nM (Figura 30 y Figura 31). En cambio, la Cmáx del AbE sólo alcanzó el nivel nominal cuando la concentración de IgG es de 300 nM. En este estudio, la EC50 de IXAX-1280.0999.0325 (8,0 nM) fue aproximadamente el 15 % de la EC50 de AbE (54,4 nM).

Utilizando la curva de Cmáx, puede predecirse que IXAX-1280.0999.0325 puede alcanzar la misma actividad que 45 jg/m l de emicizumab cuando su concentración es igual o superior a 8 jg/ml, lo que sugiere una ventaja potencial de eficacia con IXAX-1280.0999.0325 en comparación con emicizumab.

Al analizar la misma respuesta a la dosis pero con respecto a la Tmáx, se observaron valores de Tmáx equivalentes (dentro del 10 %) o menores (o reducidos) para IXAX-1280.0999.0325 en comparación con AbE en todas las concentraciones analizadas (Figura 32). Los valores EC50 calculados a partir de los valores Tmáx obtenidos son de 1,65 nM para IXAX-1280.0999.0325 (círculo) frente a 2,8 nM para AbE (cuadrado).

Con respecto a los intervalos terapéuticos indicados en las Figuras 30 y 32, se observaron con IXAX-1280.0999.0325 curvas Cmáx y Tmáx de respuesta a la dosis que son mayores y menores en comparación con AbE, respectivamente.

Tabla E14-1. Ajuste no lineal de la Cmáx. Valores de mejor ajuste para el logaritmo de la concentración de anticuerpos frente a la Cmáx. Pendiente variable (4 parámetros).

Tabla E14-2. Ajuste no lineal de Tmáx. Valores de mejor ajuste para el logaritmo de la concentración de anticuerpos frente a la Cmáx. Pendiente variable (4 parámetros).

Las actividades de otros tres anticuerpos biespecíficos (BiAb 2, 3 y 4) también se evaluaron en el TGAy se compararon con el rendimiento de IXAX-1280.0999.0325 (BiAb 1) y el calibrador de emicizumab disponible comercialmente (Enzyme Research Laboratories) en plasma humano empobrecido en FVIII disponible comercialmente (Helena Biosciences). Los BiAbs eran los siguientes, cada uno de los cuales incluía las regiones constantes de la cadena pesada SEQ ID NO: 409 y SEQ ID NO: 410 respectivamente en las dos cadenas pesadas, y la región constante de la cadena ligera lambda SEQ ID NO: 146 en la cadena ligera común:

1. IXAX-1280.0999.0325. Anti-FIX cadena pesada SEQ ID NO: 419, anti-FX cadena pesada SEQ ID NO: 421, cadena ligera común SEQ ID NO: 414.

2. IXAX-1454.0999.0325. Anti-FIX cadena pesada SEQ ID NO: 424, anti-FX cadena pesada SEQ ID NO: 421, cadena ligera común SEQ ID NO: 414.

3. IXAX-1441.0999.0325. Anti-FIX cadena pesada SEQ ID NO: 426, anti-FX cadena pesada SEQ ID NO: 421, cadena ligera común SEQ ID NO: 414.

4. IXAX-1442.0736.0325. Anti-FIX cadena pesada SEQ ID NO: 428, anti-FX cadena pesada SEQ ID NO: 430, cadena ligera común SEQ ID NO: 414.

Los BiAb_1, 2, 3 y 4 aumentaron de forma dependiente de la dosis la altura del pico de trombina (Cmáx), y disminuyeron de forma dependiente de la dosis el tiempo hasta el pico (Tmáx) de la misma forma que el emicizumab. El tope de la curva de Cmáx de BiAb_1 se midió a aproximadamente 368 nM, más alto que el de emicizumab (334,8 nM). Las EC50 (Cmáx) de BiAb_1, 2, 3 y 4 fueron similares entre sí y tuvieron unas EC50 calculadas de 6,45 nM, 5,87 nM, 5,2 nM y 4,81 nM respectivamente, lo que representa unas EC50 entre el 26 % y el 35 % de la EC50 de emicizumab (18,33 nM). Figura 33A. Los valores de EC50 (Tmáx) calculados para BiAb_1 a BiAb_4 fueron de 0,56 nM, 0,65 nM, 1,08 nM y 0,93 nM respectivamente, en comparación con 2,53 nM para emicizumab. Figura 33B.

En un tercer estudio, BiAb_1 (IXAX-1280.0999.0325) se comparó de nuevo con el calibrador de emicizumab disponible en el mercado utilizando el ensayo TGA en plasma humano empobrecido en FVIII. BiAb_1 aumentó de forma dependiente de la dosis la altura del pico de trombina (Cmáx), y disminuyó de forma dependiente de la dosis el tiempo hasta el pico (Tmáx). Figura 34. El tope de la curva de Cmáx para BiAb_1 fue de aproximadamente 396,5 nM, superior al de emicizumab (286,3 nM). La EC50 de BiAb_1 fue de 7,7 nM, aproximadamente el 30 % de la EC50 de emicizumab (25,9 nM).

Se observa una variación de ensayo a ensayo entre el TGA como se muestra en la Figura 34, la Figura 33 y la Figura 30, en las que BiAb_1 exhibió Cmáx de aproximadamente 400 nM, 375 nM y 375 nM respectivamente y en las que emicizumab exhibió Cmáx de 275 nM, 300 nM y 350 nM. A pesar de la variación en las lecturas absolutas, las tendencias observadas fueron las mismas en cada caso del TGA.

En resumen, los datos de TGA con el calibrador de emicizumab disponible en el mercado o con el anticuerpo de referencia generado AbE indicaron consistentemente una ventaja de eficacia para BiAb_1 (IXAX-1280.0999.0325) en comparación con emicizumab. También se observó una ventaja con los otros anticuerpos probados (BiAb_2, BiAb_3 y BiAb_4).

Según una revisión multidisciplinar de la FDA sobre el emicizumab, se alcanzaría una mediana de la tasa de hemorragia anualizada (ABR) de 0 con una concentración plasmática mínima de emicizumab > 45 |jg/ml[17]. Utilizando las curvas de Cmáx del TGA descritas anteriormente, se predice que BiAb_1 puede alcanzar la misma actividad que 45 jg/m l de emicizumab cuando su concentración es igual o superior a aproximadamente 2 -4 jg/ml. Esta observación sugiere una posible ventaja de eficacia y/o dosificación con respecto a emicizumab. Las diferencias de actividad significan potencialmente que el anticuerpo biespecífico puede lograr el mismo efecto terapéutico cuando se administra a una dosis menor y/o con menos frecuencia que el emicizumab, lo que representa una ventaja clínica. Aunque la mayor Cmáx indica la posibilidad de una capacidad procoagulante más potente, es poco probable que la magnitud de este aumento se asocie a problemas de seguridad.

Ejemplo 15. Afinidades de los brazos de anticuerpos optimizados

La afinidad y cinética de los anticuerpos purificados anti-FIX y anti-FX para la unión a sus respectivos antígenos se determinó por SPR como se describe en el Ejemplo 10 anterior.

Los anticuerpos anti-FIX mostraron unión a FIX con un intervalo de afinidad de aproximadamente 0,05 jM - 0,3 jM (50 - 300 nM), con una tendencia general de afinidad creciente (menor Kd) y una tasa de desactivación más rápida correlacionada con una mayor actividad en el anticuerpo biespecífico. Tabla El5-1.

Tabla E15-1.

Los anticuerpos anti-FX mostraron unión a FX con un intervalo de afinidad de aproximadamente 0,3 - 3 jM . Tabla E15-2. Se incluyó el anticuerpo anti-FX MONA como anticuerpo de control de baja afinidad con dominios VH y VL de un clon de IgM obtenido de la clasificación de células individuales (Ejemplo 1).

Tabla E15-2.

Ejemplo 16. Evaluación biofísica inicial

Para evaluar la expresión de los anticuerpos biespecíficos, se eligió IXAX-1172.0201.0128 como anticuerpo representativo para el análisis de la nminiagrupación. El análisis de Miniagrupación permite el cribado de células c Ho transfectadas de forma estable que expresan grandes cantidades (al menos 1 g/l) de anticuerpos biespecíficos heterodiméricos y representa un medio para evaluar la expresión estable de anticuerpos biespecíficos.

Utilizando los protocolos estándar de Lonza de sobrecrecimiento de lotes alimentados para células CHO-K1 transfectadas de forma estable, se expresaron anticuerpos biespecíficos. Tras la transfección, se tomaron alícuotas 5,000 células viables por pocillo para generar múltiples miniagrupaciones. 8 fueron llevados adelante en base a los títulos de anticuerpos medidos por Octet.

Las células fueron cosechadas, filtradas y purificadas por cromatografía de proteína A para aislar los anticuerpos del sobrenadante. La concentración de anticuerpos (mg) se cuantificó mediante la DO280, la cantidad total de anticuerpos (mg) se calculó en función del volumen de la muestra y se asignó un rendimiento de purificación (mg/l) según el volumen del cultivo celular. Los porcentajes relativos de heterodímeros y homodímeros en cada una de las 8 muestras de la miniagrupación se determinaron mediante el enfoque isoeléctrico capilar por imágenes (icIEF) (Protein Simple, Maurice). Los picos de homodímeros y heterodímeros se asignaron utilizando brazos de homodímeros de referencia expresados transitoriamente para FIX y FX.

Se pudieron aislar células transfectadas de forma estable que expresaban aproximadamente 1 g/l de anticuerpo biespecífico con hasta aproximadamente el 95 % de heterodímero (por ejemplo, como se muestra para MP_1 y MP_7, Figura 35).

La actividad del anticuerpo biespecífico en el ensayo de FXasa se correlacionó con el % de heterodímero con un coeficiente de correlación de Pearson de 0,99 (Figura 36).

Ejemplo 17. Purificación del anticuerpo biespecífico

La coexpresión de las dos cadenas pesadas y una cadena ligera común de un anticuerpo biespecífico genera una composición que comprende el anticuerpo biespecífico más subproductos de anticuerpos monoespecíficos. Estos pueden separarse mediante cromatografía de intercambio iónico, aprovechando las diferencias en el punto isoeléctrico del heterodímero biespecífico en comparación con los homodímeros monoespecíficos.

El anticuerpo biespecífico IXAX-1280.0999.0128 comprende la cadena pesada anti-FIX SEQ ID NO: 419, la cadena pesada anti-FX s Eq ID NO: 421 y la cadena ligera común SEQ ID NO: 405. El anticuerpo biespecífico se purificó tras la coexpresión de estos polipéptidos en células HEK, utilizando la cromatografía de proteína A para aislar los anticuerpos del sobrenadante celular, seguida de cromatografía de intercambio iónico para aislar el heterodímero.

El anticuerpo biespecífico IXAX-0436.0201.0128 comprende la cadena pesada anti-FIX que comprende el dominio VH SEQ ID NO: 324 y una región constante de la cadena pesada humana IgG4 con la mutación P (bisagra) y K439E, cadena pesada anti-FIX que comprende el dominio VH SEQ ID NO: 470 y la región constante de la cadena pesada humana IgG4 con la mutación P (bisagra) y E356K, y la cadena ligera común SEQ ID NO: 405.

El anticuerpo biespecífico IXAX-0436.0202.0128 comprende la cadena pesada anti-FIX que comprende el dominio VH SEQ ID NO: 324 y una región constante de la cadena pesada humana IgG4 con la mutación P (bisagra) y K439E, cadena pesada anti-FIX que comprende el dominio VH SEQ ID NO: 472 y la región constante de la cadena pesada humana IgG4 con la mutación P (bisagra) y E356K, y la cadena ligera común SEQ ID NO: 405.

El anticuerpo biespecífico IXAX-1172.0201.0128 comprende la cadena pesada anti-FIX que comprende el dominio VH SEQ ID NO: 440 y una región constante de la cadena pesada humana IgG4 con la mutación P (bisagra) y K439E, cadena pesada anti-FIX que comprende el dominio VH SEQ ID NO: 470 y una región constante de la cadena pesada humana IgG4 con mutación P (bisagra) y E356K, y la cadena ligera común SEQ ID NO: 405.

La cromatografía de intercambio iónico separó limpiamente cada composición de anticuerpos en sus partes componentes. Se observó la separación de la línea de base. El anticuerpo biespecífico heterodimérico anti-FIXxFX se separa de los anticuerpos contaminantes homodiméricos anti-FIX y/o monoespecíficos anti-FX.

La Figura 37a muestra la purificación exitosa de IXAX-1280.0999.0128 a partir de una composición que comprende el anticuerpo biespecífico mezclado con el homodímero anti-FIX NINA-1280.0128 y el homodímero anti-FX TINA-0999.0128.

La figura 37b muestra la purificación exitosa de IXAX-0436.0202.0128 a partir de una composición que comprende el anticuerpo biespecífico mezclado con el homodímero anti-FIX NINA-0436.0128 y el homodímero anti-FX TINA-0202.0128. El cromatograma representa la purificación por intercambio iónico de cationes del anticuerpo biespecífico N436 a partir de los contaminantes del homodímero utilizando una serie de eluciones escalonadas con concentraciones crecientes de NaCl hasta 500 nM en acetato de sodio de pH 5. El pico 1 representa el anticuerpo homodímero anti-FIX; el pico 2, el anticuerpo biespecífico anti-FIX/FXy el pico 3 representa el anticuerpo homodímero anti-FX. Los picos 1, 2 y 3 constituyen el 18 %, el 79 % y el 3 % del área total del pico, respectivamente.

La Figura 37c muestra la purificación exitosa de IXAX-1172.0201.0128 a partir de una composición que comprende el anticuerpo biespecífico y el homodímero anti-FIX NINA-1172.0128. La purificación en columna produjo un 31,5 % de homodímero anti-FIX y un 68,5 % de heterodímero biespecífico. El cromatograma representa la purificación por intercambio iónico de cationes del anticuerpo biespecífico N1172 a partir de los contaminantes del homodímero anti-FIX, utilizando una elución inicial escalonada para eliminar el pico 1 débilmente unido (homodímero anti-FIX), seguida de una elución en gradiente utilizando concentraciones crecientes de NaCl para eluir el biespecífico anti-FIX/FX. No se detectó la presencia del homodímero anti-FX.

M ateriales y procedim ientos

Para la purificación de IXAX-1280.0999.0128, el anticuerpo biespecífico se expresó transitoriamente en células HEK Expi293F. El sobrenadante del cultivo celular se recolectó, se filtró y se cargó en una columna HiTrap MabSelect Sure (MSS) de 5 ml (GE Healthcare) equilibrada con 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS). La columna se lavó con 5 volúmenes de PBS y el anticuerpo unido se eluyó utilizando IgG elute (ThermoFisher). El anticuerpo biespecífico eluido se dializó en 1x p Bs durante la noche a 4 °C y se concentró utilizando una unidad de filtro centrífugo con un corte de peso molecular de 10 kDa.

La cromatografía se realizó a temperatura ambiente. Se equilibró una columna HiTrap Capto SP (GE Healthcare) de 1 ml con fosfato sódico 20 mM, pH 6,0 y se cargaron en la columna 0,5 mg de material purificado de proteína A, diluido 1:20 en tampón de equilibrio (fosfato sódico 20 mM, pH 6,0). A continuación, la columna se lavó con 10 volúmenes de tampón de equilibrio, seguidos de un gradiente lineal (100 % B en 90 volúmenes de columna hasta 500 mM de NaCl) para eluir el anticuerpo biespecífico y los contaminantes monoespecíficos. En este proceso, el tampón se cambia progresivamente de A (fosfato sódico 20 mM, pH 6,0, sin sal) a B (tampón A con la adición de 500 mM de NaCl) a lo largo de 90 cv a un caudal de 1 ml/min para la columna de 1 ml.

Para la purificación de IXAX-0436.0202.0128, se aplicó un gradiente escalonado que incluía lavados a tres concentraciones iónicas diferentes utilizando proporciones variadas de Tampón A (acetato de sodio 50 mM, pH 5) y Tampón B (acetato de sodio 50 nM y cloruro de sodio 500 mM).

Para la purificación de IXAX-1172.0201.0128, se utilizó una elución escalonada inicial para eliminar el pico 1 débilmente unido (homodímero anti-FIX), seguida de una elución en gradiente utilizando concentraciones crecientes de NaCl para eluir el biespecífico anti-FIX/FX.

Posteriormente, se expresaron los siguientes anticuerpos biespecíficos en células CHO:

5. IXAX-1280.0999.0325. Anti-FIX cadena pesada SEQ ID NO: 419, anti-FX cadena pesada SEQ ID NO: 421, cadena ligera común SEQ ID NO: 414.

6. IXAX-1454.0999.0325. Anti-FIX cadena pesada SEQ ID NO: 424, anti-FX cadena pesada SEQ ID NO: 421, cadena ligera común SEQ ID NO: 414.

7. IXAX-1441.0999.0325. Anti-FIX cadena pesada SEQ ID NO: 426, anti-FX cadena pesada SEQ ID NO: 421, cadena ligera común SEQ ID NO: 414.

8. IXAX-1442.0736.0325. Anti-FIX cadena pesada SEQ ID NO: 428, anti-FX cadena pesada SEQ ID NO: 430, cadena ligera común SEQ ID NO: 414.

9. IXAX-1442.0687.0325. Anti-FIX cadena pesada SEQ ID NO: 428, anti-FX cadena pesada SEQ ID NO: 421, cadena ligera común SEQ ID NO: 414.

Cada uno de estos anticuerpos biespecíficos incluye regiones constantes de cadena pesada SEQ ID NO: 409 y SEQ ID NO: 410 respectivamente para las dos cadenas pesadas, y la región constante de la cadena ligera lambda SEQ ID NO: 146 en la cadena ligera común.

Los títulos observados a partir de la expresión transitoria de cada uno de los anticuerpos 1 a 5 anteriores en células CHO fueron comparables a los títulos de un anticuerpo de control de isotipo monoespecífico. También se generaron agrupaciones y miniagrupaciones estables (hasta 4,000 células sembradas después de la transfección). Aunque las agrupaciones estables produjeron porcentajes bajos (11 - 19 %) de anticuerpos heterodiméricos, se establecieron miniagrupaciones con títulos de hasta 4,9 g/l y porcentajes de heterodímeros de hasta el 82 % a partir de un número limitado de miniagrupaciones examinadas.

Tras la purificación de la proteína A, se utilizó la cromatografía de intercambio catiónico para eliminar los subproductos homodiméricos y generar materiales de alta pureza adecuados para su uso en ensayos funcionales y para el cribado de desarrollabilidad.

Utilizando un procedimiento de intercambio catiónico en gradiente, los anticuerpos 1 a 4 se separaron de los subproductos homodiméricos, proporcionando un 91 - 96 % de heterodímero en el material eluido. Por lo tanto, incluso con este procedimiento de purificación preliminar se pudo ontene un heterodímero con una pureza del 91 - 96 %. Figura 38. No se observó una separación comparable entre homodímeros y heterodímeros para el anticuerpo 5 utilizando esta técnica.

Ejemplo 18. Evaluación de la calidad por espectrometría de masas

La integridad estructural de los anticuerpos monoclonales terapéuticos puede verse comprometida por múltiples tipos de modificaciones postraduccionales que dan lugar a la heterogeneidad del producto. Se utilizó la espectrometría de masas (EM) para caracterizar y evaluar la calidad de los anticuerpos biespecíficos tras la purificación por intercambio catiónico.

Después de la separación por intercambio catiónico como se describe en el Ejemplo 17, las tres especies diferentes (heterodímero anti-FIX/anti-FX, homodímero anti-FIX y homodímero anti-FX respectivamente) en la composición eluida de BiAb_1 IXAX-1280.0999.0325 se analizaron por MS. Los pesos moleculares (MW) de las tres moléculas determinadas por EM coincidían con los MW teóricos predichos por las secuencias de aminoácidos de BiAb_1. Los resultados de la EM confirmaron así la identidad y la pureza del heterodímero FIX/FX tras la purificación por intercambio catiónico.

Ejemplo 19. Evaluación de la estabilidad

Después de la purificación como se describe en el Ejemplo 17, los BiAb_1, 2, 3 y 4, respectivamente, se cambiaron de tampón al tampón 1 (acetato de sodio, pH 5,5) o al tampón 2 (citrato/fosfato, pH 6,0), se almacenaron durante 2 semanas a 4°C, durante 4 semanas a 25°C, o se sometieron a un ciclo de congelación/descongelación de 1X. Se midió la concentración de IgG antes y después del tratamiento para calcular la pérdida de anticuerpos debida al tratamiento. También se realizó una SEC-HPLC antes y después del tratamiento para controlar la degradación y agregación del anticuerpo biespecífico. No se observó ninguna pérdida o degradación evidente de BiAb_1, 2, 3 o 4. Así, estos cuatro anticuerpos biespecíficos eran estables tanto en el tampón 1 como en el 2.

Ejemplo 20. Respuesta a la dosis y potencia en el ensayo FXasa

Se llevó a cabo un ensayo cinético de FXasa para medir la actividad mimética del factor VIII de IXAX-1280.0999.0325 y AbE en una respuesta a la dosis para determinar sus valores EC50 según el Ejemplo 7. Los datos generados a partir de las curvas dosis-respuesta se ajustaron mediante un modelo no lineal de log[anticuerpo] frente a la pendiente de la variable del parámetro de respuesta (modelo de regresión logística de 4 parámetros). Figura 39. En el eje Y se representan los valores de DO405 nm en un punto de tiempo de ensayo de 600 segundos. Los valores de EC50 tanto para IXAX-1280.0999.0325 como para AbE se calcularon a partir de una curva de regresión no lineal de los datos, dando una EC50 de 3,99 nM para IXAX-1280.0999.0325 y una EC50 de 261,2 nM para AbE. Se trata de aproximaciones, ya que la curva de respuesta a la dosis era incompleta. A pesar de ello, es evidente que IXAX-1280.0999.0325 tiene una EC50 significativamente menor que AbE. La actividad de IXAX-1280.0999.0325 y AbE depende de la dosis. IXAX-1280.0999.0325 demostró una mayor actividad mimética del FVIII, en particular a bajas concentraciones, en comparación con el AbE.

Tabla E20-1. Valores de mejor ajuste de la cinética FXasa para el logaritmo de la concentración de anticuerpos frente a la respuesta. Pendiente variable (4 parámetros).

Ejemplo 21. Respuesta a la dosis del ensayo del guión

Se utilizó un ensayo cromogénico (HYPHEN BioMed), que analiza la producción de factor Xa en plasma humano, para medir la actividad mimética del factor VIII de IXAX-1280.0999.0325 y AbE. En este ensayo, la generación de FXa es proporcional a la DO405 medida tras la adición del sustrato cromogénico. Se generaron curvas dosis-respuesta de la concentración de anticuerpos y se ajustaron utilizando un modelo no lineal de log[anticuerpo] frente a la pendiente de la variable del parámetro de respuesta (modelo de regresión logística de 4 parámetros). Se calcularon los valores EC50 basados en las respuestas a las dosis. Se calculó un valor EC50 de 5,92 nM para IXAX-1280.0999.0325 en comparación con 15,43 nM para AbE.

IXAX-1280.0999.0325 logró consistentemente una mayor capacidad mimética del FVIII que el AbE en casi todas las concentraciones. A 60 nM el A405nm se había saturado a 4,988 para ambas moléculas. IXAX-1280.0999.0325 conservó esta saturación a 20 nM mientras que AbE se presentó con una disminución de A405nm de 3,457. A la concentración más baja de 0,028 nM, IXAX-1280.0999.0325 mostró una absorbencia más de 4 veces superior a la de AbE. Los valores EC50 calculados confirman que IXAX-1280.0999.0325 muestra una potencia superior en comparación con AbE a través de un ensayo de respuesta a la dosis. Figura 40.

Tabla E21-1. EC50 de la FXasa. Valores de mejor ajuste para el logaritmo de la concentración de anticuerpos frente a la respuesta. Pendiente variable (4 parámetros).

M ateriales y procedim ientos

Se utilizó el kit BIOPHEN FVIiiiC (Ref. 221402) siguiendo el protocolo de ensayo del fabricante. En resumen, el plasma deficiente en FVIII (Helena Biosciences Europe) se diluyó 1:40 utilizando el tampón Tris-BSA (R4) y se añadieron 45 |jl a una placa de 96 pocillos de fondo transparente. Se añadieron 5 j l de anticuerpo biespecífico al plasma diluido. Se añadieron 50 j l de cada reactivo R1 (FX) y R2 (FIXa), preincubados a 37 °C, a cada pocillo y se incubaron a 37 °C durante cinco minutos. Posteriormente, se añadieron 50 j l del reactivo R3 (SXa-11, reactivo cromogénico), se mezclaron y se incubaron durante cinco minutos más, exactamente. La adición de 50 j l de ácido acético al 20 % terminó la reacción. La generación del factor Xa se monitorizó a través de la capacidad del factor Xa para escindir un sustrato específico del factor Xa (SXa-11). La escisión de este sustrato libera el producto coloreado, el pNA, que puede ser monitorizado utilizando un espectrofotómetro a 405 nM y comparado con una muestra en blanco.

Se determinó por espectrometría de masas que IXAX-1280.0999.0325 y AbE utilizados en este ensayo eran casi 100 % heterodímeros, sin que se detectaran contaminantes homodiméricos (o con niveles bajos).

Las muestras IXAX-1280.0999.0325 y AbE se diluyeron utilizando una serie de dilución 1:3 con PBS como diluyente. Se añadió un volumen de 5 j l a 45 j l de plasma deficiente en factor VIII. Las concentraciones finales (nM) de cada muestra en la serie de dilución (cuando se ensayó) fueron: 60,0, 20,0, 6,67, 2,22, 0,741, 0,247, 0,082 y 0,028. Las concentraciones se convirtieron en log(M) y se representaron gráficamente. Se trazó una regresión no lineal en el gráfico para poder calcular la EC50.

Ejemplo 22. Respuesta a la dosis y potencia en el ensayo de coagulación en plasma

Se evaluó el tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT) del anticuerpo biespecífico AbE contra IXAX-1280,0999.0325 utilizando una respuesta de dosis de concentración de anticuerpo completa (procedimiento según el Ejemplo 8). Los datos generados a partir de las curvas dosis-respuesta se ajustaron mediante un modelo no lineal de log[anticuerpo] frente a la pendiente de la variable del parámetro de respuesta (modelo de regresión logística de 4 parámetros).

Sobre los valores de concentración analizados, se observaron valores de aPTT equivalentes (dentro del 10 %) para IXAX-1280.0999.0325 en comparación con AbE en todas las concentraciones analizadas (Figura 41). Las curvas de respuesta a la dosis se compararon con un control de isotipo de anticuerpo monoclonal IgG4 humano, que no demostró eficacia hemostática. Los valores EC50 calculados a partir de los valores de aPTT obtenidos fueron de 2,1 nM para IXAX-1280.0999.0325 (círculo) en comparación con 2,0 nM para AbE (cuadrado).

Con respecto a un intervalo terapéutico prospectivo de 30 - 300 nM, se observaron con IXAX-1280.0999.0325 una curva de respuesta a la dosis de aPTT equivalente a la de AbE.

Se determinó por espectrometría de masas que IXAX-1280.0999.0325 y AbE utilizados en este ensayo eran 100 % heterodímeros, sin que se detectaran contaminantes homodiméricos.

Ejemplo 23. Actividad en presencia de anticuerpos inhibidores del FVIII

La terapia de sustitución del factor VIII puede resultar ineficaz para el tratamiento de pacientes con hemofilia A si el paciente desarrolla aloanticuerpos contra el FVIII administrado exógenamente. Los aloanticuerpos inhibidores anti-FVIII pueden bloquear la unión del FIX, el fosfolípido y el factor von Willebrand al FVIII, haciéndolo inactivo.

Ventajosamente, los anticuerpos terapéuticos biespecíficos son insensibles a la presencia de aloanticuerpos del FVIII en la sangre de un paciente, ya que los aloanticuerpos tienen especificidad para el FVIII. Esto se confirma por la capacidad de un anticuerpo biespecífico de restaurar funcionalmente la hemostasia en el plasma tomado de un paciente con inhibidores. En este ejemplo, se demostró utilizando dos ensayos hemostáticos: el tiempo de tromboplastina parcial activado (aPTT) y el ensayo de generación de trombina (TGA) utilizando plasma de un paciente con hemofilia A que tiene aloanticuerpos inhibidores (denominado "plasma inhibidor"). El restablecimiento del tiempo de coagulación indicó que los anticuerpos biespecíficos analizados son funcionales en presencia de un aloanticuerpo inhibidor del FVIII. Así, los datos presentados aquí indican que IXAX-1280.0999.0325 e IXAX-1441.0999.0325 podrán rescatar funcionalmente el tiempo de coagulación en pacientes que tienen aloanticuerpos inhibidores contra el FVIII.

El ensayo Bethesda o el ensayo Bethesda modificado de Nijmegen se utiliza para medir el título de aloanticuerpos contra el FVIII. En estos ensayos, se mezclan diferentes diluciones del plasma del paciente con un volumen igual de plasma "normal" y se dejan incubar durante un periodo de tiempo y se mide el nivel de FVIII. La presencia de un inhibidor se indica cuando se observa una disminución del FVIII residual. La unidad de medida en estos ensayos se conoce como unidades Bethesda (BU): una BU más alta indica una mayor inhibición y una menor actividad residual del FVIII. Los experimentos descritos aquí utilizaron plasma de pacientes con un nivel de inhibidor específico de 70 BU.

a P T T

Los anticuerpos biespecíficos IgG4 IXAX-1280.0999.0325, IXAX-1441.0999.0325 y AbE se expresaron en células CHO y luego se purificaron mediante cromatografía de proteína A seguida de cromatografía de intercambio de cationes para separar el heterodímero activo de los homodímeros contaminantes y se analizaron a seis concentraciones diferentes 300, 100, 33,3, 11,1, 3,7 y 1,23 nM mediante aPTT. aPTT se llevó a cabo según el Ejemplo 8. Los datos generados a partir de las curvas dosis-respuesta se ajustaron mediante un modelo no lineal de log[anticuerpo] frente a la pendiente de la variable del parámetro de respuesta (modelo de regresión logística de 4 parámetros). Tanto el IXAX-1280.0999.0325 como el iXa X-1441.0999.0325 anticuerpos IgG4 fueron capaces de rescatar el defecto de coagulación en la muestra de pacientes con inhibidores de forma similar al AbE. Figura 42.

Ensayo de generación de trom bina

La generación de trombina en el plasma del inhibidor (70 BU) se determinó utilizando para IXAX-1280.0999.0325, IXAX-1441.0999.0325 y los anticuerpos biespecíficos AbE IgG4 tras la purificación en proteína A seguida de cromatografía de intercambio catiónico. Se utilizó un ensayo de generación de trombina según el ejemplo 13. Se observó un pico de trombina para todos los anticuerpos biespecíficos, lo que indica que tanto IXAX-1280.0999.0325 como IXAX-1441.0999.0325 pueden restablecer funcionalmente la hemostasia en el plasma que contiene aloanticuerpos inhibidores del FVIII, de forma similar al AbE.

Se realizó una respuesta a la dosis para cada anticuerpo biespecífico y se determinó la altura del pico de trombina (Cmáx). Figura 43. En el intervalo de concentración analizado, las respuestas de dosis Cmáx para IXAX-1280.0999.0325 e IXAX-1441.0999.0325 fueron mayores que la Cmáx de AbE, indicando una mayor explosión de trombina, y las respuestas de dosis Tmáx para IXAX-1280.0999.0325 e IXAX-1441.0999.0325 fueron menores que la Tmáx de AbE, indicando una explosión de trombina más rápida. Figura 44.

Referencias

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3 WHO Drug Information, Recommended INN List 75, Vol 30 No 12016

4 Uchida et al., Afirst-in-human phase 1 study of ACE910, a novel factor VlII-mimetic bispecific antibody, in healthy subjects, Blood 127(13):1633-1641 2015

5 Shima et al., Factor Vlll-Mimetic Function of Humanized Bispecific Antibody in Hemophilia A,N Engl J Med 374:2044-20532016

6 Diagram by Dr Graham Beards, based on information in Pallister CJ and Watson MS (2010) Haematology, UK: Scion Publishing, pp. 336-347 ISBN: 1-904842-39-9

7 Fay, Activation of factor VIII and mechanisms of cofactor action, Blood Reviews, 18:1-152004

8 Brandstetter et al., X-ray structure of clotting factor IXa Active site and module structure related to Xase activity and hemophilia B, PNAS 92:9796-9800 1995

9 Bowen, Haemophilia A and haemophilia B: molecular insights, Mol. Pathol. 55:1-182002

10 Tripodi, A.Thrombin Generation Assay and Its Application in the Clinical Laboratory, Clinical Chemistry 62(5):699-7072016

11 Kintigh, Monagle & Ignjatovic, A review of commercially available thrombin generation assays, Res Pract Thromb Haemost 2:42-482018.

12 Young, et al., Thrombin generation and whole blood viscoelastic assays in the management of hemophilia: current state of art and future perspectives, Blood 121(11):1944-19502013

13 Lefranc MP, IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains, Dev Comp Immunol. 27(1):55-772003

14 Ridgway et al., Protein Eng. 9:617-621 1996

15 Davis JH et al., PEDS 23:195-202

16 Smith, et al., A novel, native-format bispecific antibody triggering T-cell killing of B-cells is robustly active in mouse tumor models and cynomolgus monkeys, Scientific Reports 5:179432015

17 FDA multidisciplinary review of emicizumab, Center for Drug Evaluation and Research, application number 761083Orig1s000 (BlA 761083, Hemlibra®, emicizumab-kxwh), currently available at https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/nda/2017/761083Orig1s000MultidisciplineR.pdf FIXa binding arm VH domain polypeptide sequences

Secuencias polipeptídicas del dominio VH del brazo de unión FX

Segmentos genéticos de la línea germinal humana

Tabla S-12: Segmentos de genes v e i de la línea germinal correspondientes para los dominios de anticuerpos VH y VL

Expresión recombinante del anticuerpo biespecífico utilizando la cadena ligera común N0128L con su secuencia líder nativa de IgA humana (péptido líder v3-21 MAWTALLLGLLSHCTGSVT SEQ ID NO: 519) dio como resultado el recorte de la Ser terminal N para producir un anticuerpo en el que el dominio VL era idéntico a la secuencia mostrada aquí para el dominio VL del N0325. Para su uso con secuencias líderes alternativas en las que el polipéptido de cadena ligera maduro se produce por escisión después de la Ser, se generó la cadena ligera 0325 para conseguir el mismo producto maduro. 0325 omite el residuo Serterminal N de 0128L.

Regiones constantes

[mutación de bisagra]

Tabla N

Tabla N (continuación)

T ab la T (continuación)

Claims

REIVINDICACIONES

1. Anticuerpo biespecífico que se une a FlXa y FX y cataliza la activación de FX mediada por FlXa, en el que el anticuerpo comprende dos pares de cadenas pesadas-ligeras de inmunoglobulina, en el que

un primer par de cadenaS pesadas-ligeras comprende una región Fv de unión a FIXa que comprende un primer dominio VH emparejado con un primer dominio Vl , y

un segundo par de cadenas pesadas- ligeras comprende una región Fv de unión a FX que comprende un segundo dominio VH emparejado con un segundo dominio VL, en el que

el primer dominio VH comprende un conjunto de HCDRs que comprende HCDR1, HCDR2 y HCDR3 con secuencias de aminoácidos definidas en las que HCDR1 es SeQ ID NO: 441, HCDR2 es SEQ ID NO: 436 y HCDR3 es SEQ ID NO: 433, y en el que el primer dominio VH es al menos un 95 % idéntico al dominio VH N1280H SEQ ID NO: 443 a nivel de secuencia de aminoácidos;

el segundo dominio VH comprende un conjunto de HCDRs que comprende HCDR1, HCDR2 y HCDR3 con secuencias de aminoácidos definidas en las que HCDR1 es SEQ ID No : 598, HCDR2 es SEQ ID NO: 467 y HCDR3 es SEQ ID NO: 565, y en el que el segundo dominio VH es al menos un 95 % idéntico al dominio VH T0999H SEQ ID NO: 632 a nivel de secuencia de aminoácidos, y

el primer dominio VL y el segundo dominio VL comprenden cada uno un conjunto de LCDRs que comprenden LCDR1, LCDR2 y Lc Dr 3 con secuencias de aminoácidos definidas donde LCDR1 es SEQ ID NO: 6, LCDR2 es SEQ ID NO: 7 y LCDR3 es SEQ ID NO: 8, y en el que el primer dominio VL y el segundo dominio VL son al menos un 95 % idénticos al dominio VL 0128L SEQ ID NO: 10 a nivel de la secuencia de aminoácidos.

2. Anticuerpo biespecífico según cualquier reivindicación anterior, en el que el primer dominio VH tiene al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con el dominio VH N1280H SEQ ID NO: 443.

3. Anticuerpo biespecífico según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el primer dominio VH es el dominio VH N1441H SEQ ID NO: 456.

4. Anticuerpo biespecífico según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el primer dominio VH es el dominio VH N1280H SEQ ID NO: 443.

5. Anticuerpo biespecífico según cualquier reivindicación anterior, en el que el segundo dominio VH comprende la SEQ ID NO: 632.

6. Anticuerpo biespecífico según cualquier reivindicación anterior, en el que el primer dominio VL y el segundo dominio VL tienen cada uno al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con 0128L SEQ ID NO: 10.

7. Anticuerpo biespecífico según cualquier reivindicación anterior, en el que el primer dominio VL y el segundo dominio VL son idénticos en la secuencia de aminoácidos.

8. Anticuerpo biespecífico según la reivindicación 7, en el que el primer dominio VL y el segundo dominio VL comprenden la secuencia de aminoácidos 0325L SEQ ID NO: 416.

9. Anticuerpo biespecífico según cualquier reivindicación anterior, en el que cada par de cadenas pesada-ligera comprende además un dominio constante CL emparejado con un dominio CH1.

10. Anticuerpo biespecífico según cualquier reivindicación anterior, en el que los pares de cadenas pesada-ligera comprenden una cadena ligera común.

11. Anticuerpo biespecífico según la reivindicación 10, en el que la cadena ligera común comprende la secuencia de aminoácidos CL SEQ ID NO: 146 de la cadena ligera 0128L.

12. Anticuerpo biespecífico según la reivindicación 11, en el que la cadena ligera común es la cadena ligera 0325L SEQ ID NO: 414.

13. Anticuerpo biespecífico según cualquier reivindicación anterior, en el que la cadena pesada de cada cadena pesada-ligera comprende una región constante de cadena pesada y en el que los pares de cadenas pesadas-ligeras primera y segunda se asocian para formar una inmunoglobulina tetramérica mediante la dimerización de las regiones constantes de cadena pesada.

14. Anticuerpo biespecífico según la reivindicación 13, en el que la región constante de la cadena pesada del primer par de cadenas pesada-ligera comprende una secuencia de aminoácidos diferente de la región constante de la cadena pesada del segundo par de cadenas pesada-ligera, en el que las diferentes secuencias de aminoácidos están diseñadas para promover la heterodimerización de las regiones constantes de la cadena pesada.

15. Anticuerpo biespecífico según la reivindicación 14, en el que las regiones constantes de la cadena pesada comprenden mutaciones de botón en ojal o mutaciones de pares de carga.

16. Anticuerpo biespecífico según la reivindicación 14, en el que la región constante de la cadena pesada de uno (por ejemplo, el primer) par de cadenas pesada-ligera es una región constante IgG4 humana que comprende la sustitución K439E y en el que la región constante de la cadena pesada del otro (por ejemplo, el segundo) par de cadenas pesadaligera es una región IgG4 que comprende la sustitución E356K, en el que la numeración de la región constante es según el sistema de numeración EU.

17. Anticuerpo biespecífico según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en el que la región constante de la cadena pesada de uno o ambos pares de cadena pesada-ligera es una región constante de IgG4 humana que comprende la sustitución S228P, en la que la numeración de la región constante es según el sistema de numeración EU.

18. Anticuerpo biespecífico según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, en el que la región constante de la cadena pesada de uno (por ejemplo, el primer) par de cadenas pesada-ligera comprende la SEQ ID NO: 409 y la región constante de la cadena pesada del otro (por ejemplo, el segundo) par de cadenas pesada-ligera comprende laSEQ ID NO: 410.

19. Anticuerpo biespecífico según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18, que comprende una primera cadena pesada que comprende una primera secuencia de aminoácidos del dominio VH SEQ ID NO: 456 o s Eq ID NO: 443,

una segunda cadena pesada que comprende una segunda secuencia de aminoácidos del dominio VH SEQ ID NO: 632, y

una cadena ligera común que comprende una secuencia de aminoácidos del dominio VL SEQ ID NO: 416.

20. Anticuerpo biespecífico según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 19, que comprende

una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 426

una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 421, y

una cadena ligera común que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 414.

21. Anticuerpo biespecífico según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 19, que comprende

una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 419,

22. Anticuerpo biespecífico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en el que el anticuerpo es IgG humano.

23. Anticuerpo biespecífico según la reivindicación 22, en el que el anticuerpo es IgG4 humano.

24. Ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo según cualquier reivindicación anterior.

25. Una célula huésped in v itro que comprende ADN recombinante que codifica

una cadena pesada de anticuerpo que comprende un primer dominio VH como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23,

una cadena pesada de anticuerpo que comprende un segundo dominio VH como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, y

una cadena ligera de anticuerpo que comprende un primer o segundo dominio VL como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23.

26. Una célula huésped según la reivindicación 25 que comprende ADN recombinante que codifica

una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 426 o SEQ ID NO: 419, una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 421, y

27. Un kit para la producción de un anticuerpo biespecífico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, que comprende

una cadena pesada de anticuerpo que comprende un primer dominio VH como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, o ácido nucleico que codifica dicha cadena pesada,

una cadena pesada de anticuerpo que comprende un segundo dominio VH como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, o ácido nucleico que codifica dicha cadena pesada,

una cadena ligera de anticuerpo que comprende un primer dominio VL como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, o ácido nucleico que codifica dicha cadena ligera, y

una cadena ligera de anticuerpo que comprende un segundo dominio VL como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, o ácido nucleico que codifica dicha cadena ligera.

28. Un kit según la reivindicación 27, que comprende

una primera cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 426 o SEQ ID NO: 419, o ácido nucleico que codifica dicha primera cadena pesada,

una segunda cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 421, o ácido nucleico que codifica dicha segunda cadena pesada, y

una cadena ligera común que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 414, o ácido nucleico que codifica dicha cadena ligera común.

29. Un procedimiento de producción de un anticuerpo biespecífico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, que comprende el cultivo de células huésped según la reivindicación 25 o la reivindicación 26 en condiciones de expresión del anticuerpo biespecífico, y la recuperación del anticuerpo biespecífico a partir del cultivo de células huésped.

30. Una composición que comprende un anticuerpo biespecífico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, o un ácido nucleico aislado según la reivindicación 24, en solución con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

31. Una composición según la reivindicación 30 para su uso en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano mediante terapia.