KR20210118085A

KR20210118085A - 공통 경쇄를 갖는 ＦＩＸａｘＦＸ 이중특이적 항체

Info

Publication number: KR20210118085A
Application number: KR1020217022770A
Authority: KR
Inventors: 웨이 왕; 이-치앙 리; 존 케네스 블랙우드; 로베르토 매글리오찌
Original assignee: 키맵 리미티드
Priority date: 2018-12-21
Filing date: 2019-12-20
Publication date: 2021-09-29
Also published as: ES2901683T3; EP3723858A1; PT3723858T; CA3123177A1; WO2020128049A1; US11976135B2; BR112021012065A2; TW202039584A; EP3723858B1; PL3723858T3; SI3723858T1; US20220064327A1; TWI772724B; HRP20220088T1; LT3723858T; EP4015538A1; RS62848B1; DK3723858T3; CN113453757A; US20210101997A1

Abstract

혈액 응집 인자, 인자 IXa(FIXa) 및 인자 X(FX)에 결합하고, FX로부터 FXa로의 FIXa-촉매화된 활성화를 증강시키는 이중특이적 항원 결합 분자(예를 들어, 항체)가 제공된다. 혈우병 A 환자에서 결핍된 천연 보조인자 FVIIIa를 대체함으로써 출혈을 제어하기 위한 이중특이적 항원 결합 분자의 사용이 제공된다.

Description

공통 경쇄를 갖는 FIXaxFX 이중특이적 항체

본 발명은 혈액 응고 캐스케이드에서 인자 IXa 및 인자 X 응집 인자에 결합하는 이중특이적 항원-결합 분자(예를 들어, 항체)에 관한 것이다. 이러한 이중특이적 분자는 인자 X를 활성화시킴으로써 인자 VIII에 대해 기능적으로 치환하여, FVIII이 결핍된 환자, 즉, A형 혈우병을 갖는 환자에게 혈액 응집 능력을 복구시킨다.

혈우병은, 혈액이 많은 응집 인자 중 하나의 기능 소실(부분(partial) 또는 완전(total))로 인해 감소된 응집 능력을 갖는 유전적 병태이다. 혈우병 A는 혈액 응집 인자 VIII(FVIII) 결핍증(deficiency)이다. 질환은, 환자가 임의의 잔여 FVIII 기능을 보유하는 정도에 따라 그리고 혈액 응고 캐스케이드에서 다른 구성요소의 균형에 따라 경증(mild), 중등도(moderate) 및 중증(severe) 형태를 갖는다. 치료되지 않는다면, 혈우병 A는 비제어된 출혈을 유발하며, 이는 특히 혈관절증(haemarthrosis) 사건으로부터 관절에의 손상을 통해 중증 불구(disability)를 초래할 수 있다. 상기 질환은 종종 수명-제한적(life-limiting)이고 수명-위협적(life-threatening)일 수 있다. 혈우병 A의 세계적 발병률은 약 1:10,000인 것으로 여겨진다. 혈우병 B(상이한 혈액 응집 인자, 인자 IX의 결핍증)는 덜 보편적이며, 발병률은 약 1:50,000이다. 상기 질환 둘 다 X-연관이어서 통상 남성에서 발견되며, 따라서 출생 시 남성에서 혈우병 A의 발생률은 5,000명당 약 1명이다.

출혈 에피소드의 예방은 환자의 삶의 질을 향상시키고 치명적인 혈액 손실의 위험을 감소시킨다. 혈우병 A에 대해, 결측(missing) 보조-인자는 FVIII의 투여에 의해 대체될 수 있다. 환자에게 투여되기 위한 FVIII은 재조합적으로 발현될 수 있거나 상기 FVIII은 혈액 혈장으로부터 정제될 수 있다. 전형적으로, 이 치료에 있는 환자는 48시간마다 또는 주(week)당 3x FVIII을 자가-주사한다.

FVIII에 의한 치료가 완벽한 해결방안인 것은 아니다. 심각한 결함은 신체에서 동종-항체(allo-antibody)의 생성을 촉발할 수 있다. 이는 FVIII에 의한 치료를 무효로 만드는데, 동종-항체가 FVIII에 결합하고 이의 활성을 방지하므로, 출혈이 발생한다면 환자를 위험한 상황에 처하게 한다. 이러한 저해성 항체는 중증 혈우병에 대해 FVIII로 치료된 환자의 약 30%에서 발달한다.

재조합 형태보다는 혈장-유래 FVIII에 의한 치료는 환자에서 저해성 항체를 촉발하는 더 낮은 위험을 갖는 것으로 보고되었다. 이는 FVIII와 자연적으로 회합되어 발견되고 면역원성 에피토프를 가릴(mask) 수 있는 폰 빌레브란트 인자(VWF: Von Willebrand factor)를 보유하는 혈장-유래 형태로 인한 것일 수 있다. 그러나, 저해성 항체의 위험을 완전히 피하는 FVIII의 어떠한 형태도 생성되지 않았다.

재조합 FVIII은 가능하게는 더욱 면역원성이긴 하지만, 이것은 더욱 안정해서 보관 및 수송이 더 용이하고 더 저렴하기 때문에 혈장-유래 형태를 능가하는 일부 이점을 제공한다. 공여된 혈액 혈장으로부터의 생성물을 통한 감염을 전파시키는 위험은 현재, C형 간염 및 HIV와 같은 바이러스가 감염된 혈액 생성물의 수혜자에게 우연히 확산되었을 때인 1980년대와 비교하여 많이 감소되어 있지만, 당연하게도 엄격한 안전성 제어에 대한 필요성은 남아 있다.

FVIII의 새로운 재조합 형태, 예컨대 B-도메인 절단형(truncated) 폴리펩타이드 투록토코그 알파(turoctocog alfa)(NovoEight®)가 개발되었다. 그러나, 이러한 생성물은 FVIII에 대한 중화 항체를 발달시킨 환자에게 무효하다. 일부 환자는, 항-FVIII 항체가 발달하는 것을 방지하기 위해 면역 관용(immune tolerance) 유도를 성공적으로 겪는다. 그러나, 저해성 항체를 갖고 있거나 이를 발달시킬 위험에 있는 환자에서 사용하기 위한 FVIII에 대한 대안에 대한 실질적인 요구가 남아 있다.

하나의 이러한 대안은 활성화된 엡타코그 알파(eptacog alfa)(NovoSeven®)로 알려져 있는 재조합 인자 VIIa이다. 그러나, 이는 짧은 반감기를 가지며 수시간마다 주사되어야 한다. 이의 사용은 대체로, 장기간 보호적 치료를 위한 실현 가능한 옵션이라기 보다는, 저해성 항체를 갖는 혈우병 환자에서 구제 치료법(rescue therapy) 또는 수술 동안 지혈 커버(haemostatic cover)를 제공하는 것으로 제약된다.

또 다른 이용 가능한 생성물은 활성화된 프로트롬빈 복합체 농축물(aPCC: activated prothrombin complex concentrate)인 FEIBA(인자 8 저해제 바이패싱 활성: Factor Eight Inhibitor Bypassing Activity)이며, 이는 인자 VIII에 대한 저해제를 갖고 있는 혈우병 환자에서 수술적 개입 동안 출혈 에피소드를 제어하기 위해 그리고 출혈을 예방하기 위해 유사하게 사용될 수 있다.

여러 가지 다른 대안적인 치료법, 예컨대 유전자 치료법, siRNA를 사용한 항-트롬빈의 억제, 및 TFPI(조직 인자 경로 저해제)에 대한 항체, 콘시주맙(concizumab)이 현재 추구되고 있다.

하나의 접근법은 인자 IXa(FIXa)와 인자 X(FX) 둘 다 표적화하는 인간화(humanised) 이중특이적 IgG 항체이다. 이중특이적 항체는 하나의 아암으로 FIXa 및 다른 아암으로 FX에 결합하여, 이들 2개의 보조-인자를 함께 모아서 FVIII과 동일한 방식으로 FX의 FIXa-촉매화된 활성화를 촉진한다. 그러므로, 항체는 혈액 응고 캐스케이드에서 FVIII을 기능적으로 대체한다(도 1). 이의 구조가 FVIII과 완전히 상이하므로, 항체는 항-FVIII 항체에 의해 중화될 수 없으므로, 투여된 FVIII에 대해 동종-항체를 발달시켰거나 발달시킬 위험에 있는 환자에 적합하다.

2012년에, Kitazawa 등은, 92마리의 실험 동물을 인간 FIXa 또는 FX로 면역화시키고 항-FIXa 및 항-FX 항체 유전자를 발현을 위해 숙주 세포 내로 공동-형질주입함으로써 생성되었던 대략 40,000개의 항-FIXa/X 이중특이적 항체의 스크린으로부터, FX를 활성화시킬 수 있는 FIXa/X 이중특이적 항체의 단리를 보고하였다[1]. 선택된 항체를 정제하여, hBS23으로 지정된 인간화 항체를 발생시켰으며, 이 항체는 FVIII-결핍 혈장에서 응고 활성 및 영장류에서 생체내 지혈 활성을 보여주었다[1]. hBS910 [2]으로 지정된, 이 항체의 더욱 강력한 버전은 ACE910, INN 에미시주맙(emicizumab) [3]으로 명명된 시험(investigational) 약물 하에 임상 시험에 진입하였다. ACE910의 개발은 세계적으로 선두적인 항체 군 중 하나에서 발생하였다. 그렇지만, 분자를 적절한 생체내 효능 및 임상 규모 제조에 적합한 생화학적 및 생물물리학적 특성으로 조작하기 위해서는 7년 넘게 소요되었다.

ACE910을 1 mg/kg 이하의 용량에서 피하로 받는 48명의 건강한 남성의 I상 연구에서, 2명의 대상체는 항-ACE910 항체에 대해 양성인 것으로 시험되었다[4]. 상기 항체는 선형 약물동력학적 프로파일 및 약 4주 내지 5주의 반감기를 갖는 것으로 보고되었다[4]. 후속적으로, 에미시주맙은 중증 혈우병 A를 갖는 18명의 일본인 환자에게 3 mg/kg 이하의 매주 피하 용량으로 투여되었으며, 이들 환자에서 출혈을 제어하기 위해 응집 인자의 에피소드 사용을 감소시키는 것으로 보고되었다[5]. 2016년 12월에, 에미시주맙은 혈우병 A를 갖는 환자에서 출혈을 감소시키기 위해 III상 임상 시험에서 이의 1차 종점을 충족시킨 것으로 보고되었다("HAVEN 1" 연구). 출혈 수에서 통계학적으로 유의한 감소는 예방적 치료를 받지 않는 환자와 비교하여 에미시주맙 예방으로 치료된 환자에서 보고되었다. 상기 연구는 또한, 선행 바이패싱 제제 예방적 치료를 받았던 사람에서 환자-내(intra-patient) 비교에서 에미시주맙 예방적 치료에 의해 시간 경과에 따른 출혈의 수에서 통계학적으로 유의한 감소를 포함하여 모든 2차 종점을 충족시킨 것으로 보고되었다. 따라서, 에미시주맙에 대한 효능 데이터는 고무할 만하지만, 안전성 염려는 HAVEN 1 연구에서 환자의 사망에 의해 고조되었다. 승인된 약물은 에미시주맙과 병용하여 aPCC를 받는 환자에서 혈전성 미세혈관병증(thrombotic microangiopathy) 및 혈전색전증(thromboembolism)의 위험에 관한 박스형 경고문(boxed warning)을 갖고 있다. 상기 주지된 바와 같이, aPCC는 이중특이적 항체를 이용한 치료에 대한 주된 환자군인 FVIII에 대한 저해성 항체를 갖는 환자에서 출혈을 제어하는 데 사용된다.

혈우병의 관리는 진단 시점부터 시작하여 - 이는 보통 유아기에서임 - 환자의 수명 동안 지속적인 치료를 필요로 하고, 부작용 없이 관용적일 것이고 수십년 또는 심지어 백년에 걸쳐 효과적인 채로 남아 있을 치료법을 요구한다는 것을 주지하는 것이 중요하다. 따라서, 낮은 면역원성을 포함하여 장기간 안전성은, 더 짧은 기간, 예컨대 수주, 수개월 또는 심지어 수년의 기간에 걸쳐 투여되고자 하는 항체와 비교하여 항-혈우병 항체에 대해 더 큰 유의성을 갖는다.

WO2018/098363은 인간 항체 효모 라이브러리(아디맙(Adimab))로부터 단리된 FIX 및 FX에 결합하는 이중특이적 항체를 기재하였다. WO2018/098363은, 이중특이적 항체의 항-FIXa 아암의 친화도를 증가시키는 것이 FVIIIa 활성의 증가(검정에서 저하된 혈액 응집 시간으로 표시됨)를 초래함을 개시하였다. 이중특이적 항체 "BS-027125"는, 이의 FIXa-결합 아암의 친화도를 증가시킨, 초기에 선택된 "모(parent)" 항체의 친화도 성숙(affinity maturation)에 의해 발생되었다. BS-027125는 1-단계 응집 검정에서 대략 90%의 FVIIIa-유사 활성을 달성하는 것으로 보고되었다. 에미시주맙과 비교하여, BS-027125는 인자 FIX 자이모겐, FIXa 및 FX 자이모겐에 대해 훨씬 더 높은 친화도의 결합, 및 FXa에 대해 훨씬 더 낮은 결합(결합이 검출되지 않음)을 나타내는 것으로 보고되었다. FIX-결합 아암, "BIIB-9-1336"은 FIX 자이모겐(단백분해적 활성화 전 성숙 FIX)에 우선하여 FIXa(활성화된 FIX)에 대해 선택적인 결합을 반복적으로 보여주었고, FVIIIa에 의해 결합된 FIXa 에피토프와 중첩되는 에피토프에 결합하는 것으로 밝혀졌다. FX-결합 아암, "BIIB-12-917"은, (활성화된) FXa에 대해 검출 가능한 결합이 결여되었고 활성화 펩타이드(FXa가 아니라 FX 자이모겐에 존재함) 내에 놓인 FX의 에피토프에 결합된 FX 자이모겐에 대해 선택적인 결합을 반복적으로 보여주었다. 그 후에, 추가 돌연변이는 BIIB-9-1336을 포함하여 선택된 FIX-결합 항체 내로 도입되어, 라이브러리를 발생시켰으며, 상기 라이브러리로부터 FIXa에 대한 심지어 추가로 증가된 특이성 및/또는 친화도를 갖는 항체를 선택하였다.

WO2018/141863 및 WO2018/145125는 또한, 항-FIXaxFX 이중특이적 항체 및 출혈을 치료하거나 감소시키기 위한 응혈원(procoagulant)으로서의 이의 용도를 기재하였다.

본 발명은 혈액 응집 인자 FIXa 및 FX에 결합하는 향상된 이중특이적 항원-결합 분자에 관한 것이다. 본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자는 FX로부터 FXa로의 FIXa-촉매화된 활성화를 증강시키고, 혈우병 A를 갖는 환자에서 결측된 천연 인자 FVIIIa를 효과적으로 대체하여 환자의 혈액이 응집하는 능력을 복구시킬 수 있다. 도 2를 참조한다.

본원에 보고된 바와 같이, 본 발명자들은 FX 활성화를 증강시키는 데 있어서 매우 높은 약효를 포함하여 치료적 생성물로서 개발하기에 적합한 품질을 갖는 많은 이중특이적 항원-결합 분자를 발생시키는 데 성공하였다. 혈액 응집 캐스케이드에서 FVIIIa를 효과적으로 치환하는 데 사용될 수 있는, 항-FIXa 및 항-FX에 대한 신규 결합 부위를 갖는 이중특이적 항원-결합 분자가 기재된다. 특히, 상이한 항-FX 결합 부위 어레이와 조합되어 고도로 활성이어서 여러 가지 상이한 FIXa-FX 이중특이적 분자 내로 혼입되어, 추가의 요망되는 특징, 예컨대 제조 용이성을 갖는 이중특이적 항체의 선택을 위해 융통성(flexibility)을 제공할 수 있는 항-FIXa 결합 부위가 기재된다.

본 발명자들은, 강력한 FVIII 미메틱(mimetic) 활성(시험관내 검정에서 높은 성능에 의해 나타남)을 임상 규모 제조(발현, 이중특이적 분자 조립, 정제 및 제형 포함)에 적합한 강건한(robust) 생화학적 및 생물물리학적 특성을 조합하고 완전히 인간 기원이어서 인간 생체내 치료법에서 면역원성의 위험을 최소화하는 이중특이적 항체를 설계하였다.

본 발명의 양태는 첨부된 청구항에 제시되어 있고, 본 발명의 추가 구현예 및 바람직한 특질은 하기에 기재되어 있다.

제1 양태에서, 본 발명은 (i) FIXa 결합 부위를 포함하는 FIXa 결합 폴리펩타이드 아암, (ii) FX 결합 부위를 포함하는 FX 결합 폴리펩타이드 아암을 포함하는 이중특이적 항원-결합 분자에 관한 것이다. FIXa 및/또는 FX 결합 폴리펩타이드 아암은 FIXa 또는 FX 결합 부위를 각각 포함하는 항체 Fv 영역을 포함할 수 있다. 항체 Fv 영역은 항체 VH-VL 도메인 쌍이다. VH 도메인은 VH 도메인 프레임워크에 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, VL 도메인은 VL 도메인 프레임워크에 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다. 폴리펩타이드 아암은 항체 중쇄(선택적으로 IgG 불변 영역을 포함하는 것) 및/또는 항체 경쇄를 포함할 수 있다.

그러므로, 본 발명의 항원-결합 분자는

제1 및 제2 항체 Fv 영역으로서, 상기 제1 및 제2 항체 Fv 영역은 각각 FIXa 및 FX에 대한 결합 부위를 포함하는, 제1 및 제2 항체 Fv 영역, 및

생체내에서 분자의 반감기를 연장시키기 위한 반감기 연장(extending) 영역을 포함할 수 있다.

반감기 연장 영역은, 제1 항체 Fv 영역에 공유 연결된(예를 들어, 융합 단백질로서) 제1 폴리펩타이드 및 제2 항체 Fv 영역에 공유 연결된 제2 폴리펩타이드(예를 들어, 융합 단백질로서)를 포함하는 헤테로이량체화 영역일 수 있으며, 상기 2개의 폴리펩타이드는 서로 공유적으로 및/또는 비-공유적으로 쌍을 형성한다. 헤테로이량체화 영역의 제1 및 제2 폴리펩타이드는 동일한 또는 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 헤테로이량체화 영역은 하나 이상의 항체 불변 도메인을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 이는 항체 Fc 영역일 수 있다.

본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자는 FIXa 결합 폴리펩타이드 아암의 FIXa 결합 부위를 통해 FIXa에 결합하고 FX 결합 폴리펩타이드 아암의 FX 결합 부위를 통해 FX에 결합하여, FX로부터 FXa로의 FIXa-촉매화된 활성화를 증강시킬 수 있다. 이는 본원에 기재된 바와 같이 시험관내 FX 활성화 검정에서 결정될 수 있다.

FIXa 결합 부위는 FIXa 결합 폴리펩타이드 아암 내 상보성 결정 영역(CDR) 세트에 의해 제공될 수 있으며, 상기 CDR 세트는 HCDR1, HCDR2, HCDR3 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다. 선택적으로, HCDR1은 SEQ ID NO: 406이며, HCDR2는 SEQ ID NO: 407이고, HCDR3은 SEQ ID NO: 408이다. 선택적으로, LCDR1은 SEQ ID NO: 6이며, LCDR2는 SEQ ID NO: 7이고, LCDR3은 SEQ ID NO: 8이다.

FIXa 결합 폴리펩타이드 아암 내 HCDR 세트는 본원에 제시된 임의의 항-FIX VH 도메인, 예컨대 표 S-9A에 제시된 임의의 것, 표 N에서 식별된 임의의 것, 또는 도 20에 제시된 임의의 VH 도메인 N0128H, N0436H, N0511H, N1091H, N1172H, N1280H, N1314H, N1327H 또는 N1333H의 HCDR 세트일 수 있다. HCDR1은 SEQ ID NO: 441일 수 있다. HCDR2는 SEQ ID NO: 634 또는 SEQ ID NO: 436일 수 있다. HCDR3은 SEQ ID NO: 635 또는 SEQ ID NO: 433일 수 있다. CDR은 N1280 CDR일 수 있으며, 여기서, HCDR1은 SEQ ID NO: 441이며, HCDR2는 SEQ ID NO: 436이고, HCDR3은 SEQ ID NO: 533이다. 대안적으로, CDR은 N1333H CDR일 수 있다.

FIXa 결합 폴리펩타이드 아암 내 LCDR 세트는 본원에 제시된 임의의 항-FIX VL 도메인의 LCDR 세트일 수 있다. LCDR은 표 S-50에 제시된 바와 같은 0128L의 LCDR일 수 있다. LCDR1은 SEQ ID NO: 6일 수 있고, LCDR2는 SEQ ID NO: 7일 수 있고/있거나 LCDR3은 SEQ ID NO: 8일 수 있다.

선택적으로, CDR 세트에서 하나 이상의 아미노산은 이들 서열과 상이하도록 돌연변이화될 수 있다. 예를 들어, CDR 세트는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 변경을 포함할 수 있으며, 변경된 잔기 또는 잔기들은 중쇄 또는 경쇄 CDR 중 임의의 하나 이상에 존재한다. 예를 들어, CDR 세트는 1 또는 2개의 보존적 치환을 포함할 수 있다. 돌연변이, 예를 들어, 치환의 선택은 본원 실시예에 제공된 정보 및 분석에 의해 알려질 수 있다.

FIXa 결합 폴리펩타이드 아암은 HCDR HCDR1, HCDR2 및 HCDR3의 세트를 포함하는 항체 VH 도메인을 포함할 수 있다. HCDR1의 서열은, 선택적으로 1 또는 2개의 아미노산 변경(예를 들어, 치환)을 갖는, SEQ ID NO: 406일 수 있다. HCDR2의 서열은, 선택적으로 1 또는 2개의 아미노산 변경(예를 들어, 치환)을 갖는, SEQ ID NO: 407일 수 있다. HCDR3의 서열은, 선택적으로 1 또는 2개의 아미노산 변경(예를 들어, 치환)을 갖는, SEQ ID NO: 408일 수 있다.

FIXa 결합 폴리펩타이드 아암은 LCDR LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 세트를 포함하는 항체 VL 도메인을 포함할 수 있다. LCDR1의 서열은, 선택적으로 1 또는 2개의 아미노산 변경(예를 들어, 치환)을 갖는, SEQ ID NO: 6일 수 있다. LCDR2의 서열은, 선택적으로 1 또는 2개의 아미노산 변경(예를 들어, 치환)을 갖는, SEQ ID NO: 7일 수 있다. LCDR3의 서열은, 선택적으로 1 또는 2개의 아미노산 변경(예를 들어, 치환)을 갖는, SEQ ID NO: 8일 수 있다.

FIXa 결합 폴리펩타이드 아암의 항체 Fv 영역은 면역글로불린 중쇄 v, d 및 j 유전자 분절의 재조합을 통해 발생된 VH 도메인을 포함할 수 있으며, 상기 v 유전자 분절은 VH3-7(예를 들어, VH3-7*01)이며, j 유전자 분절은 JH6(예를 들어, JH6*02)이고, 선택적으로 d 유전자 분절은 DH1-26(예를 들어, DH1-26*01)이고/이거나, 상기 항체 Fv 영역은 면역글로불린 경쇄 v 및 j 유전자 분절의 재조합을 통해 발생된 VL 도메인을 포함할 수 있으며, 상기 v 유전자 분절은 VL3-21(예를 들어, VL3-21*d01)이고, j 유전자 분절은 JL2(예를 들어, JL2*01)이다. 또 다른 구현예에서, VL 도메인은 면역글로불린 경쇄 v 및 j 유전자 분절의 재조합을 통해 발생된 것일 수 있으며, 상기 v 유전자 분절은 VL3-21(예를 들어, VL3-21*d01)이고, j 유전자 분절은 JL3(예를 들어, JL3*02)이다.

FIXa 폴리펩타이드 결합 아암의 VH 도메인의 아미노산 서열은 도 20에 제시된 VH 도메인, 예를 들어, N1280H VH 도메인과 적어도 90% 서열 동일성을 공유할 수 있다. 서열 동일성은 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%일 수 있다. 선택적으로 VH 도메인은 본원에 제시된 임의의 항-FIX VH 도메인, 예컨대 표 S-9A에 제시된 임의의 것, 표 N에서 식별된 임의의 것, 또는 도 20에 제시된 임의의 VH 도메인 N0128H, N0436H, N0511H, N1091H, N1172H, N1280H, N1314H, N1327H 또는 N1333H 중 하나이다. 선택적으로 VH 도메인은 N1280H, N1333H, N1441, N1442 또는 N1454이다. 선택적으로 항-FIXa VH 도메인은 5개 이하의 아미노산 치환, 즉, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환을 갖는 임의의 상기 VH 도메인(예를 들어, N1280H)의 아미노산 서열을 포함한다. 치환은 선택적으로 하나 이상의 프레임워크 영역에 있을 수 있으며, 예를 들어, FR3, 선택적으로 IMGT 위치 84 및/또는 IMGT 위치 86에 1 또는 2개의 치환이 존재할 수 있다.

VL 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 10(0128L)과 적어도 90% 서열 동일성을 공유할 수 있다. 서열 동일성은 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%일 수 있다. 선택적으로 VL 도메인 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 10이다. VL 도메인 아미노산 서열은 대안적으로 SEQ ID NO: 416일 수 있다.

FX 결합 부위는 FX 결합 폴리펩타이드 아암에서 CDR 세트에 의해 제공될 수 있다. FX 결합 폴리펩타이드 아암은 항체 VH-VL 도메인 쌍(즉, 항체 Fv 영역)을 포함할 수 있으며, 상기 VH 도메인은 프레임워크에 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, VL 도메인은 프레임워크에 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다.

FX 결합 부위는 본원에 식별된 임의의 항-FX VH 도메인의 HCDR(예를 들어, 표 S10-C 및/또는 도 11에 제시된 VH 도메인의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3의 임의의 세트) 및 0128L LCDR에 의해 제공될 수 있다.

FX 결합 폴리펩타이드 아암은 표 S-10C 및/또는 도 11 중 임의의 것을 포함하여 본원에 개시된 VH 도메인 - 예를 들어, T0687H, T0736H 또는 T0999H VH 도메인과 적어도 90%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 VH 도메인을 포함할 수 있다. 서열 동일성은 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%일 수 있다. 선택적으로 VH 도메인은 5개 이하의 아미노산 치환, 즉, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환을 갖는 상기 VH 도메인의 아미노산 서열을 포함한다. 치환은 선택적으로 하나 이상의 프레임워크 영역에 있을 수 있다.

FX 결합 폴리펩타이드 아암은 T0201 VH 도메인(도 11에 도시됨)과 적어도 90%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 VH 도메인을 포함할 수 있다. 서열 동일성은 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%일 수 있다. 선택적으로 VH 도메인은 5개 이하의 아미노산 치환, 즉, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환을 갖는 상기 VH 도메인의 아미노산 서열을 포함한다. 치환은 선택적으로 하나 이상의 프레임워크 영역에 있을 수 있다.

FX 결합 폴리펩타이드 아암은 본원에 식별된 임의의 VH 도메인 아미노산 서열, 예컨대 표 S-10C에 제시된 임의의 것, 표 T에서 식별된 임의의 것 또는 도 11로부터의 임의의 것을 포함할 수 있다. 선택적으로 VH 도메인은 T0201H, T0687H, T0736H 또는 T0999H이다.

FX 결합 폴리펩타이드 아암은 0128L VL 도메인 SEQ ID NO: 10과 적어도 90%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 VL 도메인을 포함할 수 있다. 서열 동일성은 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%일 수 있다. 선택적으로 VL 도메인은 5개 이하의 아미노산 치환, 즉, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환을 갖는 0128L VL 도메인의 아미노산 서열을 포함한다. 선택적으로 VL 도메인 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 10이다. 대안적으로 VL 도메인 서열은 SEQ ID NO: 416이다.

FX 결합 폴리펩타이드 아암은

면역글로불린 중쇄 v, d 및 j 유전자 분절의 재조합을 통해 발생된 VH 도메인으로서, 상기 v 및 j 유전자 분절은 IGHV1-46(예를 들어, VH1-46*03) 및 IGHJ1(예를 들어, JH1*01)이고, 선택적으로 d 유전자 분절은 IGHD6-6(예를 들어, DH6-6*01)인, VH 도메인, 및

면역글로불린 경쇄 v 및 j 유전자 분절의 재조합을 통해 발생된 VL 도메인으로서, 상기 v 및 j 유전자 분절은 IGLV3-21(예를 들어, VL3-21*d01) 및 IGLJ2(예를 들어, JL2*01) 또는 IGLJ3(예를 들어, JL3*02)인, VL 도메인을 포함하는 항체 Fv 영역을 포함할 수 있다.

이에, 본 발명의 일 양태는 FIXa 및 FX에 결합하고 FX의 FIXa-매개 활성화를 촉매화하는 이중특이적 항체이며, 상기 항체는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍을 포함하며,

제1 중쇄-경쇄 쌍은 제1 VL 도메인과 쌍형성된(paired) 제1 VH 도메인을 포함하는 FIXa 결합 Fv 영역을 포함하고,

제2 중쇄-경쇄 쌍은 제2 VL 도메인과 쌍형성된 제2 VH 도메인을 포함하는 FX 결합 Fv 영역을 포함하며,

제1 VH 도메인은, HCDR1이 SEQ ID NO: 406이며 HCDR2가 SEQ ID NO: 407이고 HCDR3이 SEQ ID NO: 408인 것으로 정의된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 HCDR 세트를 포함하고/하거나 제1 VH 도메인은 아미노산 서열 수준에서 N1280H VH 도메인과 적어도 95% 동일하고;

제2 VH 도메인은 아미노산 서열 수준에서 T0201H VH 도메인과 적어도 95% 동일하며,

제1 VL 도메인 및 제2 VL 도메인은 각각, LCDR1이 SEQ ID NO: 6이며 LCDR2가 SEQ ID NO: 7이고 LCDR3이 SEQ ID NO: 8인 것으로 정의된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 LCDR 세트를 포함하고/하거나 제1 VL 도메인 및 제2 VL 도메인은 아미노산 서열 수준에서 0128L VL 도메인 SEQ ID NO: 10과 적어도 95% 동일하다.

본 발명의 또 다른 양태는 FIXa 및 FX에 결합하고 FX의 FIXa-매개 활성화를 촉매화하는 이중특이적 항체이며, 상기 항체는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍을 포함하며,

제1 중쇄-경쇄 쌍은 제1 VL 도메인과 쌍형성된 제1 VH 도메인을 포함하는 FIXa 결합 Fv 영역을 포함하고,

제1 VH 도메인은 인간 면역글로불린 중쇄 v, d 및 j 유전자 분절(segment)의 재조합 생성물이고, v 유전자 분절은 IGHV3-7(예를 들어, VH3-7*01)이며 j 유전자 분절은 IGHJ6(예를 들어, JH6*02)이고,

제2 VH 도메인은 인간 면역글로불린 중쇄 v, d 및 j 유전자 분절의 재조합 생성물이고, v 유전자 분절은 IGHV1-46(예를 들어, VH1-46*03)이며 j 유전자 분절은 IGHJ1(예를 들어, JH1*01)이고, 선택적으로 d 유전자 분절은 IGHD6-6(예를 들어, DH6-6*01)이며,

제1 VL 도메인과 제2 VL 도메인은 둘 다 인간 면역글로불린 경쇄 v 및 j 유전자 분절의 재조합 생성물이고, v 유전자 분절은 IGLV3-21(예를 들어, VL3-21*d01)이며 j 유전자 분절은 IGLJ2(예를 들어, JL2*01) 또는 IGLJ3(예를 들어, JL3*02)이다.

제1 VH 도메인은 N1280H VH 도메인과 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성을 갖고,

제2 VH 도메인은 T0201H VH 도메인과 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성을 가지며,

제1 VL 도메인 및 제2 VL 도메인은 각각 0128L VL 도메인과 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성을 갖는다.

제1 VH 도메인은, HCDR1이 SEQ ID NO: 406이며 HCDR2가 SEQ ID NO: 407이고 HCDR3이 SEQ ID NO: 408인 것으로 정의된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 HCDR 세트를 포함할 수 있다.

제1 VH 도메인은 N1280H와 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. 제1 VH 도메인은 N1280H HCDR1, N1280H HCDR2 및 N1280H HCDR3을 포함하는 N1280H HCDR 세트를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이는 N1280H VH 도메인일 수 있다. 대안적으로, VH 도메인은 N1441H, N1442H 또는 N1454H VH 도메인일 수 있다.

예시적인 VH 도메인 및 VH CDR 세트의 아미노산 서열은 도 20 및/또는 표 S-9A에 제시되어 있다. 이중특이적 항체의 제1 VH 도메인은 임의의 이들 VH 도메인과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성일 수 있거나 이를 가질 수 있다. 선택적으로 이는 상기 VH 도메인과 비교하여 5개 이하의 아미노산 치환, 즉, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환을 갖는 VH 도메인 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 치환은 선택적으로 프레임워크 영역에 있다.

제1 VH 도메인에서 보유되거나 도입될 수 있는 잔기 및 치환의 예는 하기(N1280H를 참조하여 정의되고, IMGT 숫자매김은 도 14에 도시된 바와 같음)를 포함한다:

FR3 내 Lys84에서 또 다른 잔기(예를 들어, Asp, Glu, His, Asn, Gln, Met, Thr, Gly, Ser, Ala, Ile, Leu, Val 또는 Tyr)의 치환, 예를 들어, Lys84Asp 또는 Lys84Glu; 및

FR3 내 Ser86에서 또 다른 잔기, 예를 들어, 음으로 하전된 잔기, 예컨대 Glu의 치환(Ser86Glu).

추가 예는

Gln3, Val5, Gly9, Gly11, Gly16, Gly17 및 Leu21 FR1 중 하나 이상에서 음으로 하전된 잔기(예를 들어, Asp 또는 Glu) 또는 His의 치환, 예컨대 임의의 Gln3Asp, Gln3Glu, Gln3His, Val5Glu, Gly9Glu, Gly11Asp, Gly11Glu, Gly11His, Gly16Glu, Gly17Asp, Gly17Glu 또는 Leu21Asp;

FR3 내 Val68 및/또는 Val71에서 음으로 하전된 잔기의 치환, 예를 들어, Val68Asp, Val68Glu 또는 Val71Glu;

FR3 내 Arg75에서 His, Gln 또는 Leu의 치환;

FR3 내 Arg80에서 Ser, Thr, Gly, Leu 또는 Lys의 치환; 및

FR3 내 Asn82에서 Asp 또는 His의 치환을 포함한다.

임의의 하나 이상의 상기 나열된 서열 특질이 포함될 수 있다.

제2 VH 도메인은 T0201H 또는 도 11 및/또는 표 S-10C에 제시된 임의의 다른 VH 도메인과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성일 수 있거나 이를 가질 수 있다. 선택적으로 이는 상기 VH 도메인과 비교하여 5개 이하의 아미노산 치환, 즉, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환을 갖는 VH 도메인 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 치환은 선택적으로 프레임워크 영역에 있다. 제2 VH 도메인은 T0201H HCDR1인 HCDR1, T0201H HCDR1인 HCDR2, 및/또는 T0201H HCDR3인 HCDR3을 포함할 수 있다. 이들 CDR의 아미노산 서열은 도 11, 도 12 및 표 S-10C에 나타나 있다. 추가의 예 CDR은 도 12 및 표 T에 나타나 있다. 예를 들어, 제2 VH 도메인은

T0201 HCDR1 또는 T0736 HCDR1인 HCDR1,

T0201 HCDR2인 HCDR2, 및/또는

T0201 HCDR3, T0687 HCDR3 또는 T0736 HCDR3인 HCDR3을 포함할 수 있다.

선택적으로, HCDR1은 SEQ ID NO: 636 또는 SEQ ID NO: 598이다. 선택적으로, HCDR2는 SEQ ID NO: 467이다. 선택적으로, HCDR3은 SEQ ID NO: 637, SEQ ID NO: 638, SEQ ID NO: 639 또는 SEQ ID NO: 565이다.

제2 VH 도메인에서 보유되거나 도입될 수 있는 잔기 및 치환의 예는 하기(T0201H를 참조하여 정의되고, IMGT 숫자매김은 도 13에 도시된 바와 같음)를 포함한다:

Cys114에서 또 다른 아미노산 잔기의 치환으로서, 예를 들어, 치환된 잔기는 Ile, Gln, Arg, Val 또는 Trp(바람직하게는 Ile, Val 또는 Leu)을 포함하는, 치환;

FR1 내 Gln3에 대한 또 다른 양으로 하전된 잔기의 치환, 예를 들어, Gln3Arg 또는 Gln3Lys;

프레임워크 영역에서 잔기의 생식계열화(germlining), 예를 들어, Ile5Val(FR1 내 잔기 5에서 이소류신에 대한 발린의 치환), 또는 프레임워크 영역에서 상이한 비-생식계열 잔기의 비-생식계열 잔기의 대체, 예를 들어, Ile5Arg(FR1 내 잔기 5에서 이소류신에 대한 아르기닌의 치환);

FR1 내 Glu11에서 또 다른 아미노산 잔기(예를 들어, Lys, Ala 또는 Gly)의 치환, 예를 들어, Glu11Lys;

FR1 내 Gly16에 대한 양으로 하전된 아미노산 잔기의 치환, 예를 들어, Gly16Arg;

FR2 내 위치 39에서 Met, 또는 대안적으로 이 위치에서 Leu의 존재;

CDR2 내 위치 62 및/또는 위치 64에서 Ser의 존재;

FR3 내 Phe71에서 Tyr의 치환;

FR3 내 Thr82에서 양으로 하전된 잔기의 치환, 예를 들어, Thr82Arg 또는 Thr82Lys; FR3 내 위치 85에서 Ser, 또는 대안적으로 이 위치에서 Thr의 존재;

FR3 내 Thr86에서 양으로 하전된 잔기의 치환, 예를 들어, Thr86Arg 또는 Thr86Lys.

FIXa 결합 폴리펩타이드 아암 및 FX 결합 폴리펩타이드 아암은 각각 항체 Fv를 포함할 수 있으며, 각각의 Fv의 VL 도메인은 동일한 아미노산 서열을 갖고, 즉, 이중특이적 항원-결합 분자는 공통 VL 도메인을 갖는다. 분자는 가변 영역 및 불변 영역, 선택적으로 인간 람다 불변 영역을 포함하는 공통 경쇄를 가질 수 있다.

이중특이적 항원-결합 분자는

FIXa 결합 Fv 영역을 포함하는 항체 중쇄 및 경쇄의 제1 쌍(중쇄-경쇄 쌍),

FX 결합 Fv 영역을 포함하는 제2 중쇄-경쇄 쌍을 포함하는 사량체성 면역글로불린일 수 있으며,

각각의 중쇄는 VH 도메인 및 불변 영역을 포함하며, 각각의 경쇄는 VL 도메인 및 불변 영역을 포함하고, 제1 중쇄-경쇄 쌍 및 제2 중쇄-경쇄 쌍은 이들의 중쇄 불변 영역의 헤테로이량체화를 통해 회합하여 면역글로불린 사량체를 형성한다.

주지된 바와 같이, 경쇄는 공통 경쇄일 수 있으며, 즉, 제1 중쇄-경쇄 쌍 및 제2 중쇄-경쇄 쌍의 경쇄는 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 각각의 중쇄-경쇄 쌍은 CH1 도메인과 쌍형성된 0128L CL 불변 도메인을 포함할 수 있다. 경쇄의 서열은 SEQ ID NO: 405일 수 있다. 대안적으로, 경쇄의 서열은 SEQ ID NO: 414일 수 있다. 예시적인 면역글로불린 이소타입은 인간 IgG, 예를 들어, 선택적으로 조작된 불변 도메인을 갖는 IgG4, 예컨대 IgG4 PE를 포함한다.

이중특이적 항체의 Fc 도메인은 호모이량체화(homodimerisation)보다는 헤테로이량체화를 촉진하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 제1 중쇄-경쇄 쌍의 중쇄 불변 영역은 제2 중쇄-경쇄 쌍의 중쇄 불변 영역으로부터의 상이한 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 상기 상이한 아미노산 서열은 중쇄 불변 영역의 헤테로이량체화를 촉진하도록 조작된다. 예는 납-인투-홀(knobs-into-hole) 돌연변이 또는 전하쌍 돌연변이를 포함한다. 대안적으로, 제1 중쇄-경쇄 쌍의 중쇄 불변 영역은 제2 중쇄-경쇄 쌍의 중쇄 불변 영역과 동일할 수 있으며, 이러한 경우, 호모이량체와 헤테로이량체 둘 다 조립될 것이고, 이들은 후속적으로, 항체 제조 과정 중 하나 이상의 정제 단계를 사용하여 분리되어, 하나의 항-FIXa 아암 및 하나의 항-FX 아암을 포함하는 요망되는 헤테로이량체를 단리할 것으로 예상된다.

본원에 예시된 이중특이적 항체의 유리한 특질은, 이들 항체가 키마우스(Kymouse) 플랫폼을 사용하여 인간 면역글로불린 유전자 분절로부터 발생되었다는 것이다. "인간화" 단계, 예컨대 인간 항체 가변 도메인 내로의 마우스 CDR의 그래프팅(grafting) 및 이들 변화로 인한 기능 손실을 경감시키기 위해 조작된 가변 도메인의 반복적(iterative) 개선을 필요로 할 수 있는 정상적인 실험 동물의 면역화로부터 발생된 항체와 달리, 본 발명의 항체는 완전 인간 항체 가변 도메인을 갖는 아웃세트(outset)로부터 발생 및 선택되었다. 완전 인간 항체의 사용은, 상기 주지된 바와 같이 낮은 면역원성이 가장 중요한 혈우병 치료의 맥락에서 특수한 관련성(relevance)을 갖는다. 본 발명의 이중특이적 항체의 낮은 면역원성은 이들 항체를, 다른 치료에 대한 저해성 항체, 예컨대 FVIII를 갖거나 갖지 않는 환자를 포함하여 혈우병 A 환자의 치료에 적합하게 만든다. 본 발명의 항원-결합 분자를 받는 환자는 치료법에 대한 면역원성 반응을 발달시킬 최소의 위험에 있어야 한다.

이중특이적 분자의 작용 모드(mode) 또한, 합병증, 예컨대 심부 정맥 혈전증(deep vein thrombosis) 및 폐색전(pulmonary embolism)의 낮은 위험성과 함께 안전성 프로파일과 관련이 있다. 이중특이적 분자의 활성은 천연 FVIII의 활성과 필적할 만하고, 기존의 혈액 응고 경로 내에 통합되는 작용 기전은 천연 응집 캐스케이드의 업스트림 촉발의 맥락에서만 활성화된다.

본 발명에 따른 이중특이적 항체는, 본원에 예시된 바와 같이 인자 Xase 검정, 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT) 검정 및 트롬빈 발생 검정(TGA)을 포함하여 FVIII 미메틱 활성에 대한 많은 기능적으로 관련된 검정에서 강한 활성을 보여주었다.

다른 바람직한 특질은 고농도에서 제형에 대한 분자의 장기간 반감기(투여의 필요한 빈도를 감소시킴) 및 순종성(amenability)(가정(home) 설정에서 피하 주사를 용이하게 함)을 포함한다.

환자 순응도(compliance)는 특히 10대 및 청년 환자 중에서 장기간의 자가-투여된 치료법에 대한 유의한 쟁점인 것으로 인식된다. 치료가 분야에서 성공을 거두기 위해서는, 이의 투여 스케쥴이 환자가 이해하고 최소의 불편함으로 따르도록 단순해야 한다. 투여되는 용량 사이에서 장기간 간격이 바람직하지만, 치료적 활성을 희생시키지 않으면서 용량 빈도를 감소시키는 것은 투약 기간의 종료로 향하여 "트로프(trough)" 농도에서 장기간의 생체내 반감기와 충분한 효능 둘 다를 갖는 생성물을 필요로 한다. 본 발명에 따른 항원-결합 분자는 바람직하게는 장기간의 생체내 반감기를 갖는다. 이는 생체내에서 FcRn을 통해 재순환을 받는 Fc 영역의 포함에 의해 용이하게 될 수 있다. 본 발명에 따른 항원-결합 분자는 또한 바람직하게는, 저농도에서 높은 기능적 활성을 유지한다. 본 발명자들은, 본 발명에 따른 이중특이적 항체가 에미시주맙과 유사한 혈전형성 활성(thrombogenic activity)을 갖지만, 더 낮은 농도에서 가장 두드러진 혈전형성 활성의 증가를 가짐을 밝혀내었다. 본원에 개시된 데이터는, 본 발명에 따른 이중특이적 항체가, 예를 들어, 항체 및 에미시주맙이 하기 농도에서 시험될 때, 적어도 1 내지 300 nM 범위의 농도에서 에미시주맙과 동일하거나 이를 능가하는 혈전형성 활성을 소유함을 나타낸다:

1 내지 30 nM, 예를 들어, 1 nM에서, 3 nM에서, 10 nM에서 및/또는 30 nM에서;

100 내지 300 nM, 예를 들어, 100 nM에서 및/또는 300 nM에서.

활성은 본원에 기재된 트롬빈 발생 검정에서 측정될 수 있다. 저농도에서의 효과적인 활성은, 출혈에 대한 보호가 투약 기간의 종료로 향할수록 유지되는 것을 보장하는 것을 도울 수 있다 - 항체의 생체내 농도는 다음 용량이 예정되기 전에 최종일에서 최저이다. 이는 또한, - 혈우병 환자에서 문제가 되는 출혈의 보편적인 부위인 관절을 포함하여 - 순환에 의해 상대적으로 불량하게 관류되는 신체 영역을 보호하는 데 일조할 수 있다.

본 발명의 추가 양태는 첨부된 청구항에 제시되고 본 개시내용에 기재된 바와 같이, 이중특이적 항원-결합 분자를 포함하는 약학적 조성물 및 혈우병 A의 치료를 포함하여 의약에서의 이의 사용에 관한 것이다.

단일특이적 항체는 또한, 본 발명의 양태로서 제공된다. 그러므로, 항-FIXa 항체는 본원에 정의된 바와 같은 제1 중쇄-경쇄 쌍의 2개 복사체(copy)를 포함할 수 있다. 항-FX 항체는 본원에 정의된 바와 같은 제2 중쇄-경쇄 쌍의 2개 복사체를 포함할 수 있다.

추가 양태는 본원에 기재된 항체의 서열을 인코딩하는 핵산 분자, 이러한 핵산을 함유하는 숙주 세포, 및 상기 숙주 세포를 배양하고 항체를 발현시키고 선택적으로 단리하거나 정제함으로써 항체를 생성하는 방법을 포함한다. 이로써, 발현된 항체가 수득된다. 본원에 기재된 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인은 유사하게 생성될 수 있고, 본 발명의 양태이다. 항체의 적합한 생성 방법은 생물반응기에서 연속식 또는 회분식(batch) 배양(예를 들어, 유가 회분식(fed batch) 배양)에 의해 숙주 세포로부터의 대규모 발현을 포함한다.

본 발명의 양태 및 구현예는 이제 도면을 참조로 하여 더욱 상세히 기재될 것이며, 도면에서,
도 1은 혈액 응고 캐스케이드[6]를 예시한다.
도 2는 (a) FIXa 및 FX와 상호작용하는 FVIIIa의 보조-인자 작용; (b) FIXa 및 FX와 상호작용하는 이중특이적 항체의 보조-인자 작용; 및 (c) 혈소판의 표면 상에서 FIXa(9a) 및 FX(10)와 상호작용하는 이중특이적 항체를 도시한다. 이 구현예에서 이중특이적 항체는, 각각이 (N으로부터 C까지) 도메인 VH1-CH1-CH2-CH3을 포함하는 2개의 이황화-연결된 중쇄 및 (N으로부터 C까지) 도메인 VL-CL을 포함하는 2개의 동일한 경쇄(공통 경쇄)를 포함하는 4-사슬 분자이다. 이러한 예시에서, VH1-VL을 포함하는 결합 부위는 FX에 결합하고, VH2-VL을 포함하는 결합 부위는 FXa에 결합한다.
도 3은 인자 IX의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 334)을 도시하며, 잔기는 성숙 단백질에 대해 숫자가 매겨져 있다. 신호 펩타이드(직선형의 밑줄 표시)는 분비 후 절단된다. 프로펩타이드(파형의 밑줄 표시)는 성숙 시 절단된다. 성숙 인자 IX는 경쇄(잔기 1-145) 및 중쇄(잔기 146-415)를 함유한다. 활성화 펩타이드(박스형)는 활성화 시 절단되어, Cys132와 Cys289 사이에서 이황화 브릿지에 의해 연결된 경쇄(잔기 1-145) 및 중쇄(잔기 181-415, 볼드체)를 함유하는 활성화된 인자 IXa를 발생시킨다.
도 4는 인자 X의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 335)을 도시하며, 잔기는 숫자가 매겨져 있다. 잔기 1-31은 신호 펩타이드(직선형의 밑줄 표시)이다. 잔기 32-40은 프로펩타이드(파형의 밑줄 표시)이다. FX 경쇄는 잔기 41 ― 179이다. FX 중쇄는 잔기 183 ― 488이다. FXa 중쇄는 잔기 235 ― 488(볼드체)이다.
도 5는 본 발명의 구현예: 공통 경쇄를 갖는 이중특이적 IgG를 도시한다.
도 6은 서로 기능적 조합하기 위한 그리고 N0128L 공통 VL 도메인과 쌍형성되기 위한 항-FIXa VH 도메인 서열 N0436H 및 항-FX VH 도메인 서열 T0200을 최적화하는 과정을 요약한다.
도 7은 (a) 이중특이적 분자의 FVIII 미메틱 활성에 대한 시험관내 검정(FXase 또는 테나제(tenase) 검정)의 원리; 및 (b) 음성 데이터와 비교하여 FIXa-FX 이중특이적 분자에 대한 양성 결과를 보여주는 검정으로부터의 실시예 데이터를 예시한다.
도 8은 FXase 검정(표준 반응 조건)에서 다양한 항-FX 아암을 갖는 이중특이적 항체를 스크리닝한 결과를 도시한다. 이중특이적 항체 패널은 각각이 N0128H 항-FIX VH 도메인과 조합되는 항-FX VH 시험 도메인 및 0128L 공통 VL 도메인의 범위를 포함한다.
도 9는 항-FX T0200H 도메인의 계통(lineage)에 대해 식별된 B 세포 클러스트를 예시한다.
도 10은 FXase 검정에서 최적화된 이중특이적 항체를 스크리닝한 결과를 도시한다. (a) N0128H, N1172H 또는 N1280H 항-FIX VH 도메인과 조합된 명명된 항-FX VH 도메인 및 0128L 공통 경쇄를 포함하는 IgG4 이중특이적 항체에 대한 FXase 활성이다. 405 nm에서 10분(600초)에서의 OD. (b) N1280H 항-FIX VH 도메인과 조합된 명명된 항-FX VH 도메인 및 N0128L 공통 경쇄를 포함하는 IgG4 이중특이적 항체에 대한 FXase 활성이다.
도 11은 T0200H B 세포 클러스터로부터 항-FX VH 도메인의 선택의 아미노산 서열 정렬이다. 생식계열 서열(SEQ ID NO: 518)은 비교를 위해 나타나 있다. CDR은 박스표시되어 있다.
도 12는 CDR3의 말단 4개 잔기가 다른 아미노산으로 개별적으로 돌연변이화된 T0201H VH 도메인의 돌연변이체를 식별한다. 예를 들어, T0590H VH 도메인은 T0201H VH 도메인의 Cys114Ala 돌연변이체이며, 즉, IMGT 위치 114에서의 시스테인은 알라닌에 의해 대체된다.
도 13은 (a) FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 도시하기 위해, 그리고 (b) IMGT 숫자매김을 도시하기 위해 주석이 달린(annotated) VH 도메인 T0201H의 아미노산 서열을 도시한다.
도 14는 N192H 및 N1280H에 대해 정렬되고 (a) FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 도시하기 위해, 그리고 (b) IMGT 숫자매김을 도시하기 위해 주석이 달린 VH 도메인 N0128H의 아미노산 서열을 도시한다.
도 15는 FXase 검정에서 (a) IXAX-1280.0201.0128 및 (b) 비교자 항체 AbE의 활성의 동역학(kinetics)을 도시한다. 항체는 단백질 A에 의해 정제되었고, 호모이량체/헤테로이량체 혼합물로 이루어진다.
도 16은 Xase 검정에서 이중특이적 항체의 결과를 도시한다. "E"는 항체 E 양성 대조군이다. FXase 활성은 12.5 μg/mL(10.4 nM) 최종 농도로 정규화된 시료에 대해 10분째에 OD405 nm로서 플롯화된다. 이중특이적 항체는 활성 순서로 순위가 매겨져 있다.
도 17은 FVIII 미메틱 활성(FXase)에 미치는 이중특이적 항체 최적화의 효과를 도시한다. 결과는 이중특이적 항체에 대해 도시되어 있으며, 각각은 항-FIXa 아암에서 명명된 VH 도메인 및 항-FX 아암에서 T0638H VH 도메인을 갖고, 둘 다 0128L 공통 경쇄 VL 도메인과 쌍형성되어 있다. FVIII 미메틱 활성(FXase)은 초(second)에서 시간의 함수(X-축)로서 405 nm에서 시험관내 색원체 인자 X 활성화 검정(Y-축)을 사용하여 측정되었다. 최적화된 이중특이적 항체는 개별적으로 표지된다. 인간 IgG4 이소타입 대조군은 어떠한 FVIII 미메틱 활성도 실증하지 않는다. 주된 점은 항체에서의 VH 도메인의 명칭을 이의 상응하는 그래프의 우측으로 최대 FXase 활성의 순서로, 즉, N1333H > N1280H > N1172H > N1091H > N0511H > N0436H > N0128H > 대조군으로 보여준다.
도 18은 N0128H, N1172H 또는 N1280H 항-FIX VH 도메인과 조합된 명명된 항-FX VH 도메인 및 0128L 공통 경쇄를 포함하는 IgG4 이중특이적 항체에 대한 aPTT 검정 결과를 도시한다.
도 19는 FVIII-결실된 인간 혈장을 사용하는 1-단계 활성화된 aPTT 응집 검정에서 IXAX-1280.0201.0128 이중특이적 항체(단백질 A 상에서 정제됨)에 대한 용량 반응을 도시한다.
도 20은 프레임워크 영역 및 CDR을 식별하기 위해 주석이 달린 N0128H, N0436H, N0511H, N1091H, N1172H, N1280H, N1314H, N1327H 및 N1333H의 VH 도메인 아미노산 서열을 도시한다.
도 21은 (a) 이소타입 대조군 항체 또는 (b) 단일특이적 항체의 센서그램과 비교하여, FIX 및 FX에의 동시적인 결합이 실증된, 항원에의 이중특이적 항체의 SPR 센서그램이다.
도 22는 T0681H의 선택된 CDR1 및 CDR2 서열 변이체에 대한 FXase 검정의 요약 결과를 제시한다. AbE 대조군에 대해 지시된 것을 제외하고는, 시료는 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제되었고, 이들의 최종 농도는 12.5 μg/mL(10.4 nM)로 정규화되었다. AbE 양성 대조군 항체의 3개 시료가 포함된다: (i) 정제된 단백질 A; 12.5 μg/mL; (ii) 정제된 단백질 A; 37.5 μg/mL; (iii) 정제된 단백질 A, 뒤이어 이온 교환 크로마토그래피에 의한 추가 정제; 37.5 μg/mL. 제시된 모든 데이터는 10분 시점에서 시료화되었다.
도 23은 시험관내에서 이중특이적 항체 FXase 활성에 미치는 T0201H CDR1, CDR2 및 CDR3 돌연변이생성의 효과를 요약한다. 이중특이적 항체 항-FX T0201H 변이체 VH 도메인은 HEK 세포에서 항-FIX N01280H 아암 및 N128_IgL 공통 경쇄와 함께 발현되며, 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제되고, 농축에 의해 0.15 mg/ml(125 nM 최종 농도)로 정규화되었다. 시험관내 FXase 검정은 5 μl의 정제된 물질을 사용하여 수행되었다. 데이터는 10분 시점에서 제시되어 있다. 점선은 T0201H의 FXase 활성을 나타낸다.
도 24는 이중특이적 항체 활성에 미치는 항-FX T0201H VH 도메인 내 서열 변동의 효과를 조사하는 aPTT 응집 검정의 요약 결과를 제시한다. 응집 시간(초)은 FVIII 결합 혈장을, 명명된 항-FX VH 아암, 항-FIX N01280H 아암 및 N128_IgL 공통 경쇄를 포함하는 이중특이적 항체로 스파이킹한 후 기록되었다. 이중특이적 항체는 HEK 세포에서 발현되었으며, 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제되었고, 3개의 상이한 농도 0.1 mg/ml, 0.3 mg/ml 및 0.5 mg/ml에서 분석되었다. 점선은 인간 IgG4 이소타입 대조군으로 스파이킹된 FVIII 결핍 혈장 또는 PBS로 스파이킹된 정상적인 풀링된 인간 혈장의 응집 시간을 나타낸다.
도 25는 돌연변이생성 과정 동안 FVIII 미메틱 활성에 대해 점진적으로 향상되었던 VH 도메인의 CDR을 식별한다. 검정색 음영은 동일한 서브-표의 것들보다 더 양호한 VH 도메인을 식별한다.
도 26은 트롬빈 발생 검정(TGA)에서 촉발제로서 인자 IXa를 사용하는 정상적인 풀링된 혈장의 트롬빈 발생 곡선을 도시한다. 트롬보그램은, 시간(분) 경과에 따라 응집 동안 발생된 트롬빈의 농도(nM)로서 플롯화된, 시료 혈장에서 시간 경과에 따른 트롬빈의 발생을 도시한다.
도 27은 AbE, 이소타입 대조군, 정상 혈장 및 에미시주맙 칼리브레이터(calibrator)와 비교하여, T0201H의 CDR1, CDR2 및 CDR3 단일 및 조합 변이체를 포함하는 133 nM의 최종 농도에서 이중특이적 항체로 스파이킹된 FVIII 결핍 혈장의 트롬빈 발생을 기재한다. 0.3 nM에서의 FIXa 촉발제. (A) 80분 트롬보그램. (B) 25분 트롬보그램.
도 28은 AbE, 이소타입 대조군, 정상 혈장 및 에미시주맙 칼리브레이터와 비교하여, T0201H의 CDR1, CDR2 및 CDR3 단일 및 조합 변이체를 포함하는 이중특이적 항체로 스파이킹된 FVIII 결핍 혈장 상에서 수행된 TGA로부터의 트롬빈 C_최대(nM) 및 T_최대(분)을 도시한다. 시험 항체는 단백질 A 크로마토그래피 단독에 의해 정제되었으며, 따라서, 헤테로이량체와 호모이량체의 혼합물을 나타낸다. (A) 항체 농도 133 nM. (B) 항체 농도 80 nM.
도 29는 (a) 이중특이적 항체 IXAX-1280.0999.0128 및 (b) 에미시주맙 칼리브레이터로 스파이킹된 FVIII 결핍 혈장 상에서 수행된 TGA로부터의 C_최대(nM) 및 T_최대(분) 용량 반응을 예시한다. 사용된 이소타입 대조군(+ 부호)은 인간 IgG4였고, FVIII 결핍 혈장 내로 스파이크(spike)되었다. 정상적인 풀링된 혈장(십자가 부호)은 PBS에 의해 스파이킹(spike)되었다.
도 30은 TGA에서 IXAX-1280.0999.0325 및 AbE의 C_최대에 대한 용량 반응 곡선을 도시한다. 수직 점선은 4.5 μg/ml(30 nM), 10 μg/ml(66.6 nM) 및 45 μg/ml(300 nM)에 상응하는 최종 항체 농도를 나타낸다. 수평선은 건강한 지원자로부터 수집된 정상적인 풀링된 혈장의 C_최대를 나타낸다.
도 31은 0.1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM 및 300 nM의 항체 농도에서 인간 FVIII-결실된 혈장에서 (a) IXAX-1280.0999.0325 "BiAb_1" 및 (b) AbE의 트롬보그램을 도시한다. 정상적인 인간 혈장 시료의 트롬보그램이 음영에 나타나 있다.
도 32는 TGA에서 IXAX-1280.0999.0325 및 AbE의 T_최대에 대한 용량 반응 곡선을 도시한다. 수직 점선은 4.5 μg/ml(30 nM), 10 μg/ml(66.6 nM) 및 45 μg/ml(300 nM)에 상응하는 항체 농도를 나타낸다. 수평선은 건강한 지원자로부터 수집된 정상적인 풀링된 혈장의 T_최대를 나타낸다.
도 33은 상업적으로 입수 가능한 인간 FVIII-결실 혈장에서 TGA 검정에서 상업적으로 입수 가능한 에미시주맙 칼리브레이터와 비교하여, BiAb_1(IXAX-1280.0999.0325), BiAb_2(IXAX-1454.0999.0325), BiAb_3(IXAX-1441.0999.0325) 및 BiAb_4(IXAX-1442.0736.0325)의 (a) C_최대 및 (b) T_최대의 측면에서 트롬빈 발생 능력을 도시한다.
도 34는 인간 FVIII-결실 혈장에서 TGA 검정에서 상업적으로 입수 가능한 에미시주맙 칼리브레이터와 비교하여, BiAb_1(IXAX-1280.0999.0325)의 (a) C_최대 및 (b) T_최대의 측면에서 트롬빈 발생 능력을 도시한다.
도 35는 안정하게 형질주입된 CHO 세포의 8개의 독립적인 미니풀(minipool)로부터 발현된 이중특이적 항체 IXAX-1172.0201.0128에 대한 정제 수율 및 헤테로이량체 %를 도시한다.
도 36은 8개의 독립적인 미니풀로부터 발현된 0.3 mg/ml로 정규화된 이중특이적 항체 IXAX-1172.0201.0128에 대한 FXase 검정에 의한 이중특이적 항체 활성(10분째의 활성)과 헤테로이량체 % 사이의 상관관계를 플롯화한다. 피어슨의 상관관계 계수는 0.9939로서 계산되었다.
도 37 (a)는 1 ml CaptoSP ImpRes 컬럼 상에서 이온 교환 크로마토그래피 및 20 nM 소듐 포스페이트, pH 6.0에서 500 nM 이하의 선형 NaCl 구배에 의한 IXAX-1280.0999.0128의 분리를 도시한다. 흡광도, mAU(밀리 흡광도 단위); 전도도, mS/cm(센티미터당 밀리 지멘스(milli Siemens)). 피크 1은 NINA-1280.0128 단일특이적 항-FIX 항체이다. 피크 2는 IXAX-1280.0999.0128 이중특이적 항체이다. 피크 3은 TINA-0999.0128 단일특이적 항-FX 항체이다. (b)는 계산식 용출과 함께 이온 교환 크로마토그래피에 의한 IXAX-0436.0202.0128의 분리를 도시한다. 피크 1은 NINA-0436.0128 단일특이적 항-FIX 항체이다. 피크 2는 IXAX-0436.0202.0128 이중특이적 항체이다. 피크 3은 TINA-0202.0128 단일특이적 항-FX 항체이다. (c)는 이온 교환 크로마토그래피에 의한 IXAX-1172.0201.0128의 분리를 도시한다. 피크 1은 NINA-1172.0128 항-FIX 단일특이적 항체이다. 피크 2는 IXAX-1172.0201.0128 이중특이적 항체이다.
도 38은 각각의 이중특이적 항체 (a) IXAX-1280.0999.0325 (b) IXAX-1454.0999.0325 (c) IXAX-1441.0999.0325 및 (d) IXAX-1442.0736.0325에 대한 정제된 FIX/FX 헤테로이량체의 양이온 교환 정제를 도시한다.
도 39는 IXAX-1280.0999.0325 및 AbE를 이용한 FXase 검정에서의 용량 반응을 도시한다. 점선은 4.5 μg/ml, 10 μg/ml 및 45 μg/ml에 상응하는 항체 농도를 나타낸다.
도 40은 IXAX-1280.0999.0325 및 AbE를 이용한 색원체(chromogenic) FVIII 미메틱 활성 Hyphen 검정에서의 용량 반응을 도시한다.
도 41은 IXAX-1280.0999.0325 및 AbE를 이용한 aPTT 검정에서의 용량 반응을 도시한다. 수직 점선은 66.6 nM(10 μg/ml) 및 300 nM(45 μg/ml) 최종 항체 농도를 나타내고; 수평선은 건강한 지원자로부터 수집된 정상적인 풀링된(pooled) 혈장의 aPTT 값을 나타낸다.
도 42는 저해제 혈장에서 이중특이적 항체 IXAX-1280.0999.0325(원형), IXAX-1441.0999.0325(다이아몬드형) 및 AbE(십자가형)의 효과를 조사하는 aPTT 응집 시간 검정의 결과를 제시한다. 용량 반응은, FVIII에 대한 특정한 저해제 수준의 70 BU를 실증하는, 혈우병 A를 갖는 환자로부터 수득된 혈장을 사용하는 1-단계 aPTT 응집 검정에서 이들 항체에 대해 나타나 있다. 수평 점선은 인간 IgG4 이소타입 대조군으로 스파이킹된 저해제 혈장의 응집 시간을 나타낸다.
도 43은 FVIII에 대한 특정한 저해제 수준의 70 BU를 실증하는, 혈우병 A를 갖는 환자로부터 수득된 혈장을 이용하는 트롬빈 발생 검정에서 IgG4 이중특이적 항체 IXAX-1280.0999.0325, IXAX-1441.0999.0325 및 AbE(모두 단백질 A 상에서 정제되고, 뒤이어 양이온 교환 크로마토그래피)에 대한 트롬빈 피크 높이(C_최대) 용량 반응을 도시한다. 이중특이적 항체 농도, nM은 각각의 희석에 대해 나타나 있다.
도 44는 FVIII에 대한 특정한 저해제 수준의 70 BU를 실증하는, 혈우병 A를 갖는 환자로부터 수득된 혈장을 이용하는 트롬빈 발생 검정에서 IgG4 이중특이적 항체 (a) IXAX-1280.0999.0325, (b) IXAX-1441.0999.0325 및 (c) AbE(모두 단백질 A 상에서 정제되고, 뒤이어 양이온 교환 크로마토그래피)에 대한 용량 반응을 도시한다. 분석된 이중특이적 항체 농도는 100, 33.3, 11.1, 3.7 및 1.23 nM이다. 회색 음영 영역은 정상적인 풀링된 혈장의 트롬빈 발생을 나타낸다. TGA 촉발제는 FIXa이다.

혈액 응고

혈액 응고 캐스케이드는 도 1에 다이어그램되어 있다. 응고 또는 응집은, 손상된 혈관으로부터의 혈액 손실을 중단시켜 혈관이 수선될 수 있게 하는 가장 중요한 생물학적 과정 중 하나이다. 응고 기전은 피브린의 침착 및 성숙과 더불어 혈소판의 활성화, 접착, 및 집합(aggregation)을 수반한다. 응고의 잘못된 조절(misregulation)은 과도한 출혈(혈우병) 또는 폐색성 응집(obstructive clotting)(혈전증)을 초래할 수 있다. 응고는 모든 포유류에서 고도로 보존된다. 응고는 응고 인자의 복잡한 네트워크에 의해 제어된다. 응고는 혈관의 내벽을 이루는(lining) 내피가 손상될 때 개시된다. 혈장 인자 VII(FVII)에의 내피하 조직 인자(TF)의 노출은 1차 지혈(외인성 경로)을 유발하며: 느슨한 전(plug)이 상처 부위에서 형성된다. 추가 응고 인자, 특히 인자 IX(FIX) 및 인자 VIII(FVIII)의 활성화는 2차 지혈(내인성 경로)을 유발하며: 피브린 가닥이 형성되어 전을 강화시킨다. 외인성 및 내인성 경로는 궁극적으로 공통점으로 수렴되며: 인자 Xa/Va 복합체의 형성으로서, 이는 칼슘과 함께 그리고 인지질 표면 상에 결합되어 프로트롬빈(인자 II)으로부터 트롬빈(인자 IIa)을 발생시킨다.

FVIII은 트롬빈 또는 인자 Xa(FXa)에 의해 절단되고, 생성된 인자 VIIIa(FVIIIa)는 A1 서브단위, A2 서브단위, 및 경쇄로 이루어진 헤테로삼량체성 구조를 제시한다. 활성화 시 그리고 칼슘 이온 및 인지질 표면(혈소판 상에서)의 존재 하에, FVIIIa는 이의 경쇄 및 A2 서브단위를 통해 FIXa에 결합하고 동시에 이의 A1 서브단위를 통해 FX에 결합하여, 활성 내인성 "테나제" 또는 "Xase" 복합체를 형성하며, 이 안에서 FVIIIa 보조인자는 FIXa 및 FX를 근접하게 배치시키고 또한 FIXa의 촉매 속도 상수를 알로스테릭하게(allosterically) 증강시킨다. 도 2a를 참조한다. 인자 X는 FIXa의 세린 프로테아제 활성에 의해 활성화되고, 응집 캐스케이드는 계속되어, 혈액 응집의 구조 중합체인 피브린의 침착으로 종료된다.

혈우병은 FVIII 보조인자 활성의 결여(혈우병 A) 또는 FIX 효소 활성의 결여(혈우병 B)로 인해 Xase 복합체에서의 결핍을 통해 발생한다.

인자 IX (FIX)

인자 IX는 인자 VIII을 보조인자로서 필요로 하는 세린 프로테아제이다. 이는 혈액에서 불활성 전구체로서 순환하며, 이는 상기 논의된 바와 같이 지혈 시도(challenge) 시 내인성 또는 외인성 경로를 통해 활성화된다.

문맥이 다르게 필요로 하지 않는 한, 본원에 지칭된 인자 IX는 인간 인자 IX이고, 인자 IXa는 인간 인자 IXa이다.

인간 인자 IX의 아미노산 서열은 도 3에 도시되어 있다. 인자 IX 유전자는 대략 34 kb 길이이고 8개 엑손을 함유한다. 전사체(transcript)는 짧은 5' 비번역 영역, 개방 리딩 프레임(open reading frame) + 정지 코돈 및 3' 비번역 영역을 포함한다. ORF는, 프리(pre)-서열(신호 펩타이드)이 분비를 위해 인자 IX를 지시하며 프로펩타이드(propeptide) 서열이, 인접 GLA 도메인에서 소정의 글루탐산 잔기를 카르복실화하는 비타민 K 의존적 카르복실라제에 대한 결합 도메인을 제공하는 461개 아미노산 프리-프로-단백질을 인코딩하며, 나머지는 인자 IX 자이모겐을 나타내고, 이는 프로-서열 및 프로-서열의 제거 후 순환 내로 진입한다. 성숙 415 잔기 FIX 단백질은 N 말단으로부터 C 말단까지, 12개 글루탐산 잔기가 번역-후 γ-카르복실화되는 GLA 도메인, 2개의 표피 성장 인자(EGF)-유사 도메인, 활성화 펩타이드 서열 및 촉매적 세린 프로테아제 도메인을 함유한다. FIX는 내인성 경로를 통해 발생된 활성화된 인자 XI에 의해, 또는 외인성 경로의 TF/FVIIa 복합체에 의해 활성화된다. 어느 방식으로든, 활성화는 R145 후 펩타이드 결합의 절단(α-절단) 및 R180 후 펩타이드 결합의 절단(β-절단)을 수반하여, 개입 서열에 상응하는 활성화 펩타이드를 방출시키므로 활성화된 FIXa 분자를 발생시키고, 이는 경쇄의 C132와 중쇄의 C289 사이에서 이황화 브릿지에 의해 연결되는 N 말단 경쇄(GLA-EGF-EGF) 및 C 말단 중쇄(촉매적 도메인)를 갖는다. 잔기 숫자매김은 성숙 FIX 폴리펩타이드 서열에서의 아미노산을 지칭한다. Xase 복합체가 형성되는 인지질 표면 상에서, 이는 인지질과 회합되는 FIXa의 GLA 도메인인 한편, 촉매적 도메인은 인지질 표면보다 높고(>70 Å) FVIIIa의 A2 도메인에 의해 조절된다[7, 8].

혈우병 B - FIXa 활성의 결핍 - 의 분자적 기초는 활성화 절단 부위에서의 여러 가지 점 돌연변이, 넌센스 돌연변이, mRNA 스플라이스 부위 돌연변이, 결실, 삽입, 또는 미스-센스 돌연변이를 포함하여 다양하다[9].

활성화된 FIX(FIXa)의 촉매적(프로테아제) 도메인은 FVIIIa에의 결합에 관여한다. 이 도메인에서 잔기 E245는 칼슘 이온에 결합하고, 이 위치에서의 돌연변이, 예를 들어, 치환 E245V는 FVIII에의 결합을 감소시키고 혈우병 B를 유발할 수 있다. 잔기 330-338에 의해 형성되는 FIX 나선 내에서의 돌연변이 또한, FVIII에의 감소된 결합, 결과적으로 혈우병 B와 연관되어 있다.

단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP) 및 길이 다형성을 포함하여 인자 IX에서의 비-병원성 돌연변이 또한 보고되었다 ―[9]에서 검토되었다. 이들은 엑손 6에서 MnII SNP를 포함하여, 잔기 148에서 T/A 치환을 초래하며(말뫼 다형성(Malmo polymorphism)), 이는 백인 및 흑인 미국인 집단 중에서 상대적으로 보편적이다[9].

인자 X(FX)

문맥이 다르게 필요로 하지 않는 한, 본원에 지칭된 인자 X는 인간 인자 X이고, 인자 Xa는 인간 인자 Xa이다. 인간 FX의 아미노산 서열은 도 4에 도시되어 있다.

FX는 또한, 스튜어트-프라워(Stuart-Prower) 인자로서 알려져 있다. 이는 세린 엔도펩티다제이다. FX는 가수분해에 의해 인자 IX(상기 기재된 바와 같이 이의 보조인자인 인자 FVIII와 함께) 또는 인자 VII(이의 보조인자인 조직 인자와 함께)에 의해 인자 Xa로 활성화될 수 있다. FX는 2개의 장소 - Arg-Thr 결합에서, 그리고 그 후에 Arg-Ile 결합에서 프로트롬빈을 절단함으로써 작용하여 활성 트롬빈을 산출한다.

항원-결합

이중특이적 항원-결합 분자의 바람직한 특질은, 이것이, 결합된 FIXa가 결합된 FX를 활성화시킬 수 있는 방식으로 FIXa 및 FX에 결합한다는 것이다.

FIXa 및 FX를 함께 모아서 FIXa에 의한 FX의 활성화를 촉진하기 위해, 이중특이적 항원-결합 분자는 이들 2개의 보조인자에 동시에 결합할 수 있다. 결합은 순차적으로 발생할 수 있으며, 예를 들어, 초기 2원(binary) 복합체가 제1 결합 아암과 이의 코그네이트(cognate) 항원 사이에서 형성하고, 뒤이어 제2 결합 아암을 이의 코그네이트 항원에 결합시킬 수 있다. 원칙적으로, 이들 2개의 결합 사건은 어떤 순서로든 발생할 수 있으며, 즉, FIXa와 뒤이어 FX, 또는 FX와 뒤이어 FIXa에서 발생할 수 있다. 분자적 안무(choreography)는 2개의 결합 부위가 이들의 각각의 항원에 대해 갖는 상대적 친화도에 의해 영향을 받는다. 이중특이적 항원-결합 분자, FIXa 및 FX 집단에서, 많은 상이한 복합체가 병행하여 존재하는 것으로 예상된다. 그러므로, 풀(pool)은 자유 항원-결합 분자, 자유 FIXa, 자유 FX, 항원-결합 분자와 복합체화된 FIXa, 항원-결합 분자와 복합체화된 FX, 및 FIX, FX 및 항원-결합 분자의 3원(tertiary) 복합체를 포함할 것이며, 이들 화학종은 각각 개별 상호작용의 상대적 온-레이트(on-rate) 및 오프-레이트(off-rate)에 따라 상이한 비율로 존재할 것이다.

이중특이적 항원-결합 분자가 FX에 대해서보다는 FIXa에 대해 더 높은 친화도를 갖는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 이중특이적 분자는 FIXa와 초기 복합체를 형성하는 것으로 고려될 것이며, 이는 다시 FX에 결합하여 이를 활성화시킬 것이다. FX에 대한 상대적으로 낮은 친화도는, 불완전한 항체-항원 복합체(즉, FIXa 없이)에서 결합된 FX의 비율을 감소시킨다. 이의 잠재적인 이점은, 더 큰 비율의 FX가, 환자의 혈액에 존재할 수 있는 임의의 FVIII와 연계되도록 자유롭게 남아 있을 수 있게 한다는 점이다. 혈우병 A는 기능적 FVIII의 약간의 결핍으로부터 완전 부재에 이르기까지 FVIII에서의 결핍의 범위를 포괄한다. 일부 기능적 FVIII를 보유하는 이들 환자에 대해, 이러한 천연 활성을 가능한 한 오래 보유하는 것이 바람직할 수 있다. 그러므로, FX 결합 아암이 FX에의 결합에 대해 FVIII와 경쟁하지 않는 이중특이적 항원-결합 분자를 제공하는 것이 바람직할 수 있다.

바람직하게는 FX 결합 아암은 FXa에 대해서보다는 FX에 대해 더 높은 친화도를 갖는다. FXa에 대한 낮은 친화도는 활성화된 생성물의 방출을 촉진하여, 응고 캐스케이드에서 FVIII-미메틱 분자의 역할을 완료하고 재사용을 위해 FX 결합 부위를 자유롭게 한다. 다양한 구현예에서, 본원에 기재된 이중특이적 분자(예를 들어, 항체 IXAX-1280.0999.0325 또는 항체 IXAX-1441.0999.0325), 이러한 이중특이적 분자의 FX 결합 아암(예를 들어, T0999H VH 도메인을 포함하는 아암), 또는 2개의 이러한 아암의 호모이량체를 포함하는 항-FX 단일특이적 항체는 예를 들어, ELISA에 의해 측정된 바와 같이, FXa에 대해서보다 FX에 대해 적어도 2-배 더 높은, 적어도 3-배 더 높은, 적어도 4-배 더 높은, 적어도 5-배 더 높은, 적어도 10-배 더 높은, 적어도 100-배 더 높은 친화도, 예를 들어, FXa에 대해서보다는 FX에 대해 적어도 1000-배 더 높은 친화도를 가지며, 선택적으로 FXa에의 유의한 결합을 보여주지 않는다. 예를 들어, 다양한 구현예에서, 이중특이적, FX 결합 아암 또는 항-FX 단일특이적 항체(예를 들어, TINA-0999.0325)는 ELISA에 의해 결정된 바와 같이 그리고 음성 대조군 IgG를 참조하여 인간 FXa에 결합하지 않는다. ELISA에 대한 대안으로서, 친화도는 SPR에 의해 측정될 수 있고, FX에 대한 친화도는 FXa에 대한 친화도와 비교될 수 있다.

- FIXa 결합

이중특이적 항원-결합 분자의 FIXa 결합 아암은 FIXa의 경쇄 및/또는 중쇄에 결합할 수 있다. 초기 연구는, 실시예에 기재된 N128 계통(lineage)의 FIXa 결합 아암이 단리에서 FIXa 경쇄에 결합하지 않음을 나타내었다.

그러므로, 본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자(또는 이의 FIXa 결합 폴리펩타이드 아암)는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 FIXa 분자에 결합하고 중쇄의 부재 하에 FIX 경쇄에 결합하지 않는 것일 수 있다. 선택적으로, FIXa 결합 아암은 FIXa 중쇄와 경쇄의 조합에 의해 형성되거나 이에 의해 안정화되는 에피토프를 인식한다. 이는 예를 들어, FIXa 분자 내 경쇄하고만 접촉하여, 상기 경쇄가 FIXa 분자 내 중쇄와 조합하여 존재할 때에만 노출되거나 안정화되는 에피토프에 결합할 수 있다. 대안적으로, 이는 경쇄와 중쇄 둘 다로부터 하나 이상의 잔기를 포함하거나 중쇄 단독의 잔기를 포함하는 에피토프와 접촉할 수 있다.

본 발명에 따른 항원-결합 분자, 또는 이의 FIXa-결합 폴리펩타이드 아암은 인간 FIXa의 EC 도메인에 10 mM 이하, 바람직하게는 5 mM 이하, 더욱 바람직하게는 1 mM 이하의 친화도(K_D로서 측정됨)로 결합할 수 있다. 예를 들어, K_D는 1 nM 내지 3 μM일 수 있다.

인간 FIXa를 결합하는 데 대한 K_D는 0.1 μM 내지 1 μM, 예를 들어, 0.15 내지 0.3 μM일 수 있다. K_D는 0.6 μM 이하, 0.5 μM 이하, 0.4 μM 이하, 0.3 μM 이하, 0.25 μM 이하, 또는 2 μM 이하일 수 있다. K_D는 적어도 0.1 μM, 예를 들어, 적어도 0.2 μM일 수 있다. 이는 0.1 μM 내지 0.5 μM일 수 있다.

K_D는 10 내지 100 nM, 예를 들어, 25 내지 75 nM일 수 있다.

K_D는 50 nM 이하, 10 nM 이하, 5 nM 이하, 2 nM 이하, 또는 1 nM 이하일 수 있다. K_D는 0.9 nM 이하, 0.8 nM 이하, 0.7 nM 이하, 0.6 nM 이하, 0.5 nM 이하, 0.4 nM 이하, 0.3 nM 이하, 0.2 nM 이하, 또는 0.1 nM 이하일 수 있다. K_D는 적어도 0.001 nM, 예를 들어, 적어도 0.01 nM 또는 적어도 0.1 nM일 수 있다. K_D는 0.1 내지 10 nM일 수 있다.

본 발명에 따른 항원-결합 분자, 또는 이의 FIXa-결합 폴리펩타이드 아암은 인간 FIX에 0.1 μM 내지 1 μM, 예를 들어, 0.15 내지 0.3 μM의 친화도(K_D로서 측정됨)로 결합할 수 있다. K_D는 0.6 μM 이하, 0.5 μM 이하, 0.4 μM 이하, 0.3 μM 이하, 0.25 μM 이하, 또는 2 μM 이하일 수 있다. K_D는 적어도 0.1 μM, 예를 들어, 적어도 0.2 μM일 수 있다.

FIX와의 상호작용의 K_D는 FIXa와의 상호작용의 K_D와 필적할 만할 수 있으며, 예를 들어, FIXa에 대한 친화도와 비교하여 FIX에 대한 FIXa-결합 아암의 친화도에서 25% 미만, 선택적으로 10% 미만의 차이가 존재할 수 있다. FIXa와 비교하여 FIX와의 상호작용의 K_D에서 어떠한 통계학적으로 유의한 차이도 존재하지 않을 수 있다.

본원 어디에서나 기재된 바와 같이, 친화도는 예를 들어, 25℃에서, 분석물로서 용액 중 항원과 함께, 선택적으로 이량체로서(예를 들어, 단일특이적 IgG로서) 고체 표면에 커플링된 결합 아암과 함께 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 사용하여 결정될 수 있다.

- FX 결합

본 발명에 따른 항원-결합 분자, 또는 이의 FX-결합 폴리펩타이드 아암은 인간 FX의 EC 도메인에 10 mM 이하, 바람직하게는 5 mM 이하, 더욱 바람직하게는 1 mM 이하의 K_D로 결합할 수 있다. 예를 들어, K_D는 5 μM 내지 1 nM, 예를 들어, 5 μM 내지 10 nM일 수 있다.

K_D는 0.1 μM 내지 2 μM, 예를 들어, 0.1 μM 내지 1 μM, 예를 들어, 0.15 내지 0.3 μM일 수 있다. K_D는 0.6 μM 이하, 0.5 μM 이하, 0.4 μM 이하, 0.3 μM 이하, 또는 0.25 μM 이하일 수 있다. K_D는 적어도 0.1 μM일 수 있다.

K_D는 50 nM 이하, 10 nM 이하, 5 nM 이하, 2 nM 이하, 또는 1 nM 이하일 수 있다. K_D는 0.9 nM 이하, 0.8 nM 이하, 0.7 nM 이하, 0.6 nM 이하, 0.5 nM 이하, 0.4 nM 이하, 0.3 nM 이하, 0.2 nM 이하, 또는 0.1 nM 이하일 수 있다. K_D는 적어도 0.001 nM, 예를 들어, 적어도 0.01 nM 또는 적어도 0.1 nM일 수 있다. 예를 들어, K_D는 1 내지 100 nM일 수 있다. K_D는 1 내지 10 nM일 수 있다.

- 항원-결합 친화도의 측정

FIX, FIXa, FX 및 FXa에 결합하기 위한 항원-결합 분자의 친화도는 평형 해리 상수 K_D, 회합의 비 Ka/Kd 또는 온-레이트(on-rate)(Ka) 및 해리 또는 결합 상호작용의 오프-레이트(off-rate)(kd)의 측면에서 정량화될 수 있다. 항원 결합에 대한 K_D, Ka 및 Kd는 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 사용하여 측정될 수 있다. 예시적인 SPR 절차 및 조건은 실시예 10에 나타나 있다.

친화도의 정량화는 1가 형태의 항원-결합 폴리펩타이드 아암, 예를 들어, 항원 결합 부위를 포함하는 항체 Fab 또는 Fv, 또는 문제의 항원에 대한 단일 항원-결합 아암을 갖는 헤테로이량체성 면역글로불린(예를 들어, IgG)과 함께 SPR을 사용하여 수행될 수 있다. 대안적으로, 2가(bivalent) 형태의 항원-결합 폴리펩타이드 아암, 예를 들어, 호모이량체성 항원-결합 아암을 포함하는 IgG에 대한 친화도를 결정하는 것이 편리할 수 있다. SPR은 항원-결합 폴리펩타이드 아암의 이량체를 바이오센서 칩 상에 (직접적으로 또는 간접적으로) 코팅시키는 단계, 상기 항원-결합 폴리펩타이드 아암을 농도 범위에서 완충 용액 중 항원에 노출시키는 단계, 결합을 검출하는 단계, 및 결합 상호작용에 대한 평형 해리 상수 K_D를 계산하는 단계를 포함할 수 있다. SPR은 25℃에서 수행될 수 있다. 적합한 완충 용액은 150 mM NaCl, 0.05% 세제(예를 들어, P20) 및 3 mM EDTA, pH 7.6이다. 2.5 mM CaCl₂와 함께 HBS-P 1X(10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% 폴리소르베이트 20 pH 7.6)는 예시적인 완충액이다. 결합 데이터는 사용되는 기기에 내재적일 수 있는 표준 알고리즘을 사용하여 1:1 모델로 적합화(fit)될 수 있다. 여러 가지 SPR 기기, 예컨대 Biacore^TM, ProteOn XPR36^TM(Bio-Rad®), 및 KinExA®(Sapidyne Instruments, Inc)가 알려져 있다.

- 교차-반응성

조절체(regulatory body)는, 후보 치료 분자가, 이것이 인간 임상 시험에 들어가기 전에 실험 동물에서 치료적 효능을 실증하는 것을 필요로 할 수 있다. 후천성 혈우병 A 동물 모델의 일례는, FVIII-중화 항체 또는 FVIII에 대한 저분자 저해제의 투여를 통해 혈액 응집이 결핍되게 하여, 인간 혈우병 A 환자의 표현형을 복제하는 시노몰구스 원숭이(cynomolgus monkey)이다. 동물 모델에서 이중특이적 항원-결합 분자의 시험을 가능하게 하기 위해, 각각의 아암의 결합 부위가 하나 이상의 비-인간 포유류로부터의 상응하는 항원과 교차-반응성인 것이 바람직하다. 그러므로, 항원-결합 분자의 FIXa 결합 부위는 뮤린(예를 들어, 마우스 또는 래트), 토끼 또는 비-인간 영장류(예를 들어, 시노몰구스 원숭이) FIXa, 뿐만 아니라 인간 FIXa에 결합할 수 있고, FX 결합 부위는 뮤린(예를 들어, 마우스 또는 래트), 토끼 또는 비-인간 영장류(예를 들어, 시노몰구스 원숭이) FXa, 뿐만 아니라 인간 FXa에 결합할 수 있다.

항원-결합 분자(또는 더욱 정확하게는 이의 항원 결합 부위)의 종 교차-반응성의 정도(extent)를 정량화하는 하나의 방식은 또 다른 종의 항원과 비교하여 항원 또는 하나의 종에 대한 이의 친화도의 배수-차이(fold-change), 예를 들어, 인간 항원 대 시노몰구스 항원에 대한 친화도의 배수 차이로서 존재한다. 친화도는, 항원-결합 분자에의 항원의 결합에 대한 평형 해리 상수를 지칭하는 K_D로서 정량화될 수 있다. K_D는 본원 어디에서나 기재된 바와 같이 SPR에 의해 결정될 수 있다.

종 교차-반응성 결합 분자는 인간 및 비-인간 항원에의 결합의 친화도의 배수-차이를 가질 수 있으며, 상기 배수-차이는 30-배 이하, 25-배 이하, 20-배 이하, 15-배 이하, 10-배 이하 또는 5-배 이하이다. 또 다른 방식으로, 인간 항원의 세포외 도메인에의 결합의 K_D는 비-인간 항원의 세포외 도메인에의 결합의 K_D의 30-배, 25-배, 20-배, 15-배, 10-배 또는 5-배 내에 있을 수 있다.

바람직하게는, 인간 및 비-인간 항원의 결합 친화도는 10-배 이하의 범위 내에, 더욱 바람직하게는 5-배 내에 또는 2-배 내에 있다. 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정된 바와 같이, 결합 비-인간 FIXa에 대한 K_D는, 결합 인간 FIXa에 대한 Kd보다 10-배 이하(바람직하게는 5-배 이하 또는 2-배 이하) 더 크거나 10-배 이하 더 낮을(바람직하게는 5-배 이하 또는 2-배 이하 더 낮을) 수 있다. 유사하게는, 예를 들어, SPR에 의해 결정된 바와 같이, 결합 비-인간 FX에 대한 K_D는, 결합 인간 FX에 대한 Kd보다 10-배 이하(바람직하게는 5-배 이하 또는 2-배 이하) 더 크거나 10-배 이하(바람직하게는 5-배 이하 또는 2-배 이하) 더 낮을 수 있다. 친화도의 결정 방법은 본원 어디에서나 기재되어 있다.

결합 분자는 또한, 종 둘 다의 결합 항원에 대한 K_D가 역치값을 충족시킨다면, 예를 들어, 결합 인간 항원의 K_D와 결합 비-인간 항원의 K_D 둘 다 10 mM 이하, 바람직하게는 5 mM 이하, 더욱 바람직하게는 1 mM 이하라면, 종 교차-반응성인 것으로 간주될 수 있다. K_D는 10 nM 이하, 5 nM 이하, 2 nM 이하, 또는 1 nM 이하일 수 있다. K_D는 0.9 nM 이하, 0.8 nM 이하, 0.7 nM 이하, 0.6 nM 이하, 0.5 nM 이하, 0.4 nM 이하, 0.3 nM 이하, 0.2 nM 이하, 또는 0.1 nM 이하일 수 있다.

상이한 종의 결합 항원에 대한 종 교차-반응성이 유리할 수 있는 한편, 이들 각각의 항원에 대한 FIXa 결합 아암 및 FX 결합 아암의 선택성은 원치 않는 부작용을 피하기 위해 바람직하다. 그러므로, 신체 내에서, FIX/FIXa 및 FX/FXa는 바람직하게는, 항원-결합 분자에 의해 결합된 유일한 항원이다.

FX의 FIXa-매개 활성화의 증강

FX로부터 FXa로의 FIXa-매개 활성화를 증강시키기 위해 이중특이적 항원-결합 분자의 능력은 시험관내 또는 생체내 검정에서 결정될 수 있다.

적합한 시험관내 검정은 실시예 3 및 실시예 7에서 예시되고 도 7에서 도시된 FX 활성화 검정이다. 검정은

(i) FXa의 형성에 적합한 조건 하에(예를 들어, 37℃에서 완충 용액 중 인지질의 존재 하에) 이중특이적 항원-결합 분자를 FIXa 및 FX와 접촉시키는 단계,

(ii) FXa에 의해 절단 가능한 기질을 첨가하여, 검출 가능한 생성물을 발생시키는 단계, 및

(iii) 상기 검출 가능한 생성물의 존재를 검출하고 선택적으로 정량화하는 단계를 포함한다.

상세한 프로토콜은 실시예 7에 나타나 있다.

생성물의 수준은, FIXa-FX 이중특이적 항원-결합 분자가 반응 혼합물로부터 부재하는 대조군 검정과 비교될 수 있다. 대조군과 비교된 이중특이적 분자를 이용하는 검정에서 생성물 수준의 유의한 차이는, 이중특이적 분자가 FX의 FIXa-매개 활성화를 증강시킬 수 있음을 나타낸다. FVIII은 양성 대조군으로서 포함될 수 있다.

생성물의 수준은, FIXa-FX 이중특이적 항원-결합 분자가 에미시주맙인 검정과 비교될 수 있다. 본 발명에 따른 이중특이적 분자는 에미시주맙과 동일하거나 유사한 정도까지(예를 들어, 10% 차이 내에서 또는 5% 차이 내에서), 또는 더 큰 정도까지(예를 들어, 검출 가능한 생성물의 수준에 의해 측정되는 바와 같이 에미시주맙으로 달성되는 것보다 10% 초과 더 큰, FX로부터 FXa로의 활성화) FX로부터 FXa로의 FIXa-매개 활성화를 증강시킬 수 있다. 바람직하게는 이중특이적 항체는 FX로부터 FXa로의 FIXa-매개 활성화를 에미시주맙과 적어도 동일한 규모까지 증강시킨다. 검정은 전형적으로 37℃의 생리학적 온도에서 수행된다. 검정에 사용되기 위한 이중특이적 분자의 적합한 농도는 본원 실시예에 나타나 있으며, 예를 들어, 12.5 μg/ml(10.4 nM) 또는 125 nM이다.

또 다른 적합한 검정은, FVIII-결핍 혈장에서 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT)을 측정하는 것이며, 이는 저해제의 존재 또는 부재 하에 수행될 수 있거나 이중특이적 분자의 활성을 재조합 인간 FVIII와 비교하는 데 사용될 수 있다. 이 검정은 실시예 8에 예시되어 있다. aPTT는, 혈액 응집 혈성의 전반적인 개요를 제공하고 검정이 판독됨에 따라 응고 시간을 제공하는 종점 검정이다. FVIII-결핍 혈장은 전형적으로, aPTT 검정에서 약 80초 내지 90초의 응고 시간을 가질 것이다. 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자는 aPTT 검정(음성 대조군과 비교됨)에서 응고 시간을 단축시키기에 효과적이다. 본 발명에 따른 이중특이적 항원 결합 분자를 이용한 aPTT 검정에서 인간 FVIII-결핍의 응고 시간은 예를 들어, 재조합 인간 FVIIIa를 이용한 응고 시간과 동일하거나 더 짧을 수 있다. 정상적인(FVIII+) 인간 혈장에 대한 생리학적 응집 시간은 전형적으로 < 40초, 예를 들어, 37초 내지 34초의 범위이다. 유사한 값은 활성화된 FVIIIa의 제공 시 FVIII-결핍 혈장으로 달성 가능하며, 이는 기준값에 대한 장치/측정의 보정을 통해 검정을 표준화하는 편리한 방식을 제공한다. 대안적으로, 정상적인(FVIII+) 인간 혈장의 응고 시간은 기준에 사용될 수 있으며, aPTT 검정은 칼슘의 첨가를 통한 응고의 유도에 의해 시작되었다. 검정은 전형적으로 37℃의 생리학적 온도에서 수행된다. 검정에 사용되기 위한 이중특이적 분자의 적합한 농도는 본원 실시예에 나타나 있으며, 0.1 mg/ml(44 nM), 0.3 mg/ml(133 nM) 및 0.5 mg/ml(222 nM)를 포함한다.

본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자는 aPTT 검정에서 FVIIIa의 10초 내의 응고 시간을 제공할 수 있다(즉, FVIIIa를 이용한 aPTT 검정의 응고 시간보다 10초 이하 더 길거나 10초 이하 더 짧음). 바람직하게는, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자를 이용한 aPTT 검정에서 응고 시간은 FVIIIa를 이용한 것보다 더 짧다. 이중특이적 항원-결합 분자는 응고 시간을 40초 미만, 35초 미만, 또는 30초 미만까지 단축시킬 수 있다. 응고 시간은 20초 내지 40초, 예를 들어, 20초 내지 30초일 수 있다. 바람직하게는 응고 시간은 22초 내지 28초, 예를 들어, 24초 내지 26초이다.

기능의 또 다른 척도(measure)는, 이중특이적 항원-결합 분자의 존재 하에 FVIII-결핍 혈액 혈장에서 트롬빈이 발생되는 속도이다. 이중특이적 항체의 활성은 트롬빈 발생 검정(TGA)[10]에서 측정될 수 있다. 많은 트롬빈 발생 검정이 최근에 검토된 바와 같이 기재되었다[11]. 본질적으로, TGA는 시험 분자(본원에서, 후보 이중특이적 항체)의 첨가 후 시간 경과에 따른 프로트롬빈으로부터 트롬빈으로의 전환(활성화)을 측정하는 단계를 포함하며, 트롬빈은 기질의 이의 절단을 통해 검출 가능한 생성물을 형성하여 검출된다.

도 1을 참조로 하여, 외인성 조직 인자(TF) 경로는 응고 캐스케이드를 개시하도록 존재하는 것으로 기억될 것이다. TF를 발현하는 세포는 통상 혈관구조의 외부에 체류하고, 조직 손상 시 이러한 TF-보유 세포는 순환중인 혈소판과 접촉하게 된다. TF는 인자 VIIa에 의해 소량의 인자 IX 및 X의 활성화를 용이하게 하기 위해 보조-인자로서 작용한다. 활성화된 인자 Xa 및 인자 V는 TF-보유 세포 상에서 프로트롬비나제 복합체를 형성하여, 제한된 양의 트롬빈을 발생시킨다. 새로 발생된 트롬빈은, 상처 부위에 누적되었던 혈소판 및 상기 혈소판 상에 존재하는 인자 XI을 활성화시킨다. 혈소판 결합된 FXIa는 FIXa의 추가 활성화를 보장하는 데 필요하다. TGA가 생체외 검정인 점을 고려하여, TF-보유 세포는 부재하고, 응고 촉발제가 공급되어 캐스케이드를 개시해야 한다. 상업적인 검정은 전형적으로, 응고를 개시하기 위해 재조합 TF/인지질 혼합물을 사용한다[11]. 본원(실시예 13 참조)에 예시된 TGA 방법은 인자 IXa/인지질 혼합물을 촉발제로서 사용하지만, 다른 업스트림 활성인자, 예컨대 FXIa가 사용될 수 있을 것이다.

TGA를 수행하기 위해, FVIII-결핍 혈장은 (i) 촉발제 시약, (ii) 트롬빈에 의해 검출 가능한 생성물로 전환될 수 있는 기질, 예를 들어, 트롬빈에 의해 절단 시 시각적으로 검출 가능한 생성물을 생성하는 형광원성 또는 발색원성 기질, 및 (iii) 시험 분자(예를 들어, 이중특이적 항체)와 접촉되어, FVIII-결핍 활성의 존재가 트롬빈 발생, 따라서 검출 가능한 생성물로부터 신호를 초래할 조건을 생성시킨다. 전형적으로, 혈장은 혈액 응집 캐스케이드에 필요한 칼슘과 같은 자유(free) 금속 이온이 결여될 것이다(도 1). Ca²⁺ 이온은 (예를 들어, 용액 중 CaCl₂로서) 공급되어 검정을 개시할 수 있으며, 예를 들어, 이는 기질 용액 내에 함유될 수 있다. 개시 후, 검출 가능한 생성물의 발생(트롬빈의 발생을 나타냄)은 시간 경과에 따라 예를 들어, 형광 또는 색상을 검출함으로써 모니터링된다(바람직하게는 연속적으로, 또는 빈번한 간격을 두고, 예를 들어, 약 20초마다). 플레이트 판독기는 예를 들어, 형광원성 기질로부터 형광단으로의 전환을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. TGA는 37℃의 생리학적 온도에서 수행된다.

형광은, 대조군 혈장에 첨가된 기지의 농도의 트롬빈에 대해 보정함으로써 트롬빈 농도로 전환될 수 있다. 그 후에, 트롬보그램이 생성될 수 있다(도 26, 도 27).

바람직하게는, 이중특이적 항체(또는 다른 시험 분자)는 적합하게는, TGA(예를 들어, 단백질 A 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해)에 사용되기 위해 정제되어, 예를 들어, 적어도 95% 이중특이적 헤테로이량체의 조성물에서 이중특이적 분자를 제공한다(즉, 5% 이하의 호모이량체성 또는 다른 항체 오염원이 존재해야 함). 바람직하게는 시험 분자는 가능한 한 100% 순도까지 근접하는 것으로서 제공된다. 이는 약 98, 99% 또는 100% 순수(pure) 이중특이적일 수 있다.

형광원성 TGA에서 건강한 개체로부터의 혈장에 적절한 기준 범위는 C_최대 200 내지 450 nM 및 T_최대 5분 내지 8분이다[11]. TGA에서의 활성은 또한, 건강한 개체, 중증 FVIII 결핍을 갖는 환자 및 FVIII 주입 후 중증 FVIII 결핍을 갖는 환자로부터의 혈장에 대해 공개된 대표적인 트롬빈 발생 곡선에 대해 비교될 수 있다[12]. 표준화를 위해, TGA에서의 성능은 또한, 기지의 농도에서 양성 대조군 분자를 나타내는 칼리브레이터에 대해 비교될 수 있다. 시험 이중특이적 분자의 희석 시리즈는 기지의 고정된 농도의 시리즈에서 칼리브레이터에 대해 비교될 수 있다. 적합한 칼리브레이터는 에미시주맙 칼리브레이터이다. 에미시주맙 칼리브레이터는 상업적으로 입수 가능하며, 100 μg/mL 에미시주맙(Hemlibra®)으로 스파이킹되고 완충액 및 안정화제를 추가로 포함하는 FVIII 면역결핍 시트레이트화된 인간 혈장으로부터 제조된다. 이는 동결건조된 형태로 공급되고, TGA에 사용되기 전에 물에서 재구성된다. 칼리브레이터 약병에서 에미시주맙의 정확한 농도는 알려져 있어서, 검정법에서 시험 이중특이적 분자의 활성은 농도에 대한 정규화 후 칼리브레이터의 활성에 대해 비교될 수 있다. 에미시주맙과 이중특이적 항체의 비교를 위한 대안적인 대조군으로서, TGA에서 시험 이중특이적 항체의 성능은 에미시주맙의 아미노산 서열을 갖는 대조군 이중특이적 항체의 성능과 비교될 수 있으며, 상기 시험 이중특이적 항체 및 에미시주맙의 아미노산 서열을 갖는 이중특이적 항체는 TGA에서 동일한 조건 하에 시험된다.

TGA는 트롬빈 발생의 6개 양태를 특징화하는 데 사용될 수 있다: 지체 시간(지체(lag)), 피크까지의 시간(T_최대), 최대 피크 높이(C_최대), 내인성 트롬빈 전위(ETP), 속도 지수(VI) 및 "테일 스타트(tail start)" 또는 기준선까지의 복귀(return). 지체 시간은 트롬빈 피크가 발생되기 시작하기 전 개시기(initiation phase)를 나타내며, 촉발제의 첨가는 응고 캐스케이드의 활성화를 초래한다. 일단 개시되면, 다량의 트롬빈은 전파기(propagation phase) 동안 신속하게 발생된다. 피크까지의 시간은 최대 트롬빈 피크 높이(C_최대)에 도달하는 데 소요되는 시간(T_최대)을 나타내며, ETP는 발생된 트롬빈의 총량을 나타내고, 속도 지수는 지체 시간과 피크까지의 시간 사이의 기울기를 특징화한다. 기준선까지의 복귀(테일 스타트)는 트롬빈 형성의 저해(활성화된 단백질 C에 의한 것임) 및 이미 형성된 트롬빈의 불활성화(항트롬빈에 의한 것임)를 반영한다. C_최대 및/또는 T_최대는 전형적으로, TGA에서 활성을 나타내는 데 사용되는 주된 척도이다. TGA에서의 기준값(예를 들어, C_최대, T_최대, 지체 시간 등)은 고정된 농도, 예를 들어, 1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM 또는 300 nM에서 이중특이적 분자에 대해 결정될 수 있다. 매개변수는 일련의 농도, 예를 들어, 1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM 및 300 nM 및/또는 완전 용량 반응 곡선을 수득하기 위한 다른 농도에서 측정되어, 그 후에 EC50 값이 결정될 수 있게 할 수 있다. 용량 반응 곡선은 비-선형 로그(항체) 대 반응 가변 기울기 모델(예를 들어, GraphPad Prism v8.0.0을 사용하여 수행될 수 있는 가변 기울기 4 매개변수 로지스틱 회귀 모델)을 사용하여 적합화될 수 있다. EC50은, 반수-최대(half-maximal) 효과가 도달되는 시험 분자(예를 들어, 항체)의 농도이다(측정되는 매개변수의 기준선 값과 최대값 사이의 절반). EC50은 용량 반응 곡선으로부터 결정될 수 있다. EC50 데이터를 이용하여 작업된 실시예는 본원의 실시예 14에 제시된다.

일 구현예에서, TGA는

(a) 자유 칼슘 이온이 결여된 FVIII-결핍 혈장을

(i) 인자 IXa/인지질 혼합물을 포함하는 촉발 시약,

(ii) 트롬빈에 의해 절단 시 시각적으로 검출 가능한 형광단을 생성하는 형광원성 기질(예를 들어, 2 nM ZGGR-AMC 형광원성 기질), 및 칼슘 이온(예를 들어, 100 mM CaCl2)(예를 들어, Stago로부터의 FluCa 시약)을 포함하는 용액,

(iii) 이중특이적 항체(예를 들어, 95% 내지 100%, 예를 들어, 99% 내지 100%의 순도에서)와 접촉시키는 단계,

(b) FVIII-미메틱 활성의 존재가 트롬빈 발생, 따라서 형광단으로부터의 신호를 초래할 조건 하에 37℃에서 혈장을 인큐베이션하는 단계,

(c) 시간 경과에 따른 형광을 검출하여, 형광원성 기질로부터 형광단으로의 전환을 모니터링하는 단계,

(d) 예정된 농도에서 트롬빈의 용액으로부터 형광에 대한 검출된 형광을 보정하는 단계, 및

(e) 트롬보그램의 하나 이상의 매개변수를 결정하는 단계로서, 상기 매개변수는

도달되는 최대 트롬빈 피크 높이(C_최대),

최대 트롬빈 피크 높이에 도달하는 데 소요된 시간(T_최대), 및/또는

트롬빈 피크가 발생되기 시작하기 전 개시기(initiation phase)의 길이(지체 시간(lag time))인, 단계를 포함한다.

상기 하나 이상의 매개변수는 반응의 기준선 및 상부(top) 고원부(plateau)(최대값)를 포함하여 완전 용량 반응 곡선을 수득하기 위해 이중특이적 항체의 일련의 농도에서 결정된다. 용량 반응 곡선은 비-선형 로그[항체] 대 반응 매개변수 가변 기울기 모델(예를 들어, 4 매개변수 로지스틱 회귀 모델)을 사용하여 데이터점(data point)으로 적합화될 수 있다. EC50은 상기 용량 반응 곡선으로부터 결정된다. 상기 하나 이상의 매개변수, 또는 상기 하나 이상의 매개변수에 대한 EC50은 시험 이중특이적 항체와 에미시주맙(예를 들어, Enzyme Research Laboratories로부터 입수 가능한 바와 같은 에미시주맙 칼리브레이터) 사이에서 비교될 수 있다.

본 발명에 따른 이중특이적 항체는 바람직하게는, 형광측정(fluorimetric) TGA에서 에미시주맙과 유사하거나 그보다 더 큰 약효를 나타낸다. 더 높은 약효는 상기 검정에서 하나 이상의 매개변수, 예를 들어, C_최대, T_최대 또는 지체 시간에 대해 더 낮은 EC50으로 표시될 수 있다. 본원 실시예에서 실증된 바와 같이, 본 발명의 구현예는 더 낮은 농도에서 에미시주맙보다 더 큰 약효를 일관되게 실증하였다. 예를 들어, 도 29, 도 30, 도 31, 도 33 및 도 34에 제시된 결과를 참조한다.

형광측정 TGA에서의 최대 반응(예를 들어, 최고 C_최대, 최저 T_최대, 최단 지체 시간 등)이 또한 주목할 만하다. 최대 반응은, 측정된 매개변수(예를 들어, C_최대)가 증가하는 항체 농도에 따라 고원부를 이루는 수준이고, 최대 달성 가능한 수준(예를 들어, 최대 C_최대)을 나타낸다. 과도한 최대 반응은, 응혈원 경로의 비정상적으로 증가된 활성화를 특징으로 하는 소모성 응고병증(consumption coagulopathy) 또는 파종성 혈관내 응고(DIC: disseminated intravascular coagulation)의 위험을 포함하여 이중특이적 분자의 과다투약의 증가된 위험과 관련이 있을 수 있다. 응고항진성(hypercoagulability)은 응고병증 사건, 예컨대 동맥/정맥 혈전증, 색전증 및 혈전성 미세혈관병증(thrombotic microangiopathy)을 통해 환자 안전성을 해칠 수 있고, 그러므로, 치료적 범위(therapeutic window), 즉, 허용 불가능한 부작용 또는 유해 사건의 위험 없이 유익한 효과가 달성되는 용량 또는 혈장 농도의 범위를 좁힐 것이다.

에미시주맙이 인간 임상 시험에서 허용 가능한 것으로 여겨진 안전성 프로파일에 기초하여 규제 승인을 받았기 때문에, TGA에서 에미시주맙의 최대 반응은 확립된 안전한 한계를 나타낸다. 선택적으로, 본 발명의 이중특이적 분자는 에미시주맙과 20% 이하(예를 들어, 15% 이하 또는 10% 이하) 상이한, TGA에서의 최대 C_최대 및/또는 최대 T_최대 반응을 갖는다. 이들 기준값은 에미시주맙 칼리브레이터 또는 에미시주맙의 서열 동일한 유사체를 사용하여 결정될 수 있다.

본 발명의 이중특이적 분자는 하기와 같이 TGA에서 최대 반응을 실증할 수 있다:

- TGA에서 500 nM을 초과하지 않는 C_최대. 선택적으로 C_최대에 대한 최대 반응은 450 nM을 초과하지 않으며, 예를 들어, 400 nM을 초과하지 않는다. C_최대에 대한 최대 반응은 200 내지 450 nM, 예를 들어, 250 내지 350 nM일 수 있고/있거나;

- TGA에서 1분의 최대 반응보다 더 낮지 않은 T_최대. 선택적으로 T_최대에 대한 최대 반응은 5분 이상, 4분 이상, 3분 이상, 또는 2분 이상이다. T_최대에 대한 최대 반응은 2분 내지 10분, 예를 들어, 2분 내지 8분, 또는 5분 내지 8분일 수 있다.

본 발명에 따른 이중특이적 항원-결합 분자는 예를 들어, 형광측정 TGA에 의해 결정된 바와 같이 100 내지 450 nM(예를 들어, 200 내지 450 nM) 범위의 C_최대를 가질 수 있으며, 상기 이중특이적 항체는 상기 검정에서 100 nM 또는 300 nM의 농도로 존재한다. C_최대는 바람직하게는 적어도 200 nM, 더욱 바람직하게는 적어도 250 nM 또는 적어도 300 nM이다. 이중특이적 분자의 C_최대는 에미시주맙의 C_최대와 동일하거나 유사할 수 있거나(예를 들어, C_최대로부터 10% 차이 이내), 에미시주맙의 C_최대보다 더 클 수 있다. 이중특이적 분자는 상기 검정에서 에미시주맙의 C_최대 EC50의 10% 이내이거나 그보다 더 낮은 C_최대 EC50을 가질 수 있다. EC50이 에미시주맙보다 더 낮은 경우, 본 발명의 이중특이적 분자와 에미시주맙 사이의 TGA에서 C_최대 EC50에서 적어도 2-배, 적어도 3-배, 적어도 4-배 또는 적어도 5-배 차이가 존재할 수 있다. 선택적으로, TGA에서 C_최대 EC50은 10-배 이하, 15-배 이하 또는 20-배 이하 상이할 수 있다. 형광측정 TGA에서 이중특이적 항원-결합 분자에 대한 C_최대의 EC50은 50 nM 미만, 예를 들어, 1 nM 내지 50 nM, 5 nM 내지 20 nM, 또는 5 nM 내지 10 nM일 수 있다.

본 발명에 따른 이중특이적 항원-결합 분자는 예를 들어, 형광측정 TGA에 의해 결정된 바와 같이 8분 이하, 예를 들어, 4분 내지 8분 범위의 T_최대를 가질 수 있으며, 상기 이중특이적 항체는 상기 검정에서 100 nM 또는 300 nM의 농도로 존재한다. 이중특이적 분자의 T_최대는 에미시주맙의 T_최대와 동일하거나 유사할 수 있거나(예를 들어, T_최대로부터 10% 차이 이내), 에미시주맙의 T_최대보다 더 작을 수 있다. 이중특이적 분자는 상기 검정에서 에미시주맙의 T_최대 EC50의 10% 이내이거나 그보다 더 낮은 T_최대 EC50을 가질 수 있다.

형광측정 TGA에서 이중특이적 항원-결합 분자에 대한 T_최대의 EC50은 5 nM 미만, 예를 들어 3 nM 미만 또는 2 nM 미만일 수 있다. 이는 1 nM 내지 5 nM, 예를 들어, 1 nM 내지 2 nM일 수 있다.

본 발명에 따른 이중특이적 항원-결합 분자는 예를 들어, 형광측정 TGA에 의해 결정된 바와 같이 2분 내지 6분의 지체 시간을 가질 수 있으며, 상기 이중특이적 항체는 상기 검정에서 100 nM 또는 300 nM의 농도로 존재한다. 이중특이적 분자의 지체 시간은 에미시주맙의 지체 시간과 동일하거나 유사할 수 있거나(예를 들어, 지체 시간으로부터 10% 차이 이내), 에미시주맙의 지체 시간보다 더 짧을 수 있다. 이중특이적 분자는 상기 검정에서 에미시주맙의 지체 시간 EC50의 10% 이내이거나 그보다 더 낮은 지체 시간 EC50을 가질 수 있다.

이중특이적 항원-결합 분자

이중특이적 항원-결합 분자는 FIXa 결합 폴리펩타이드 아암 및 FX 결합 폴리펩타이드 아암을 포함한다. 이는 다중-사슬 또는 단일-사슬 폴리펩타이드 분자일 수 있다. FIXa 결합 폴리펩타이드 아암 및 FX 결합 폴리펩타이드 아암이 이중특이적 분자의 상이한 모이어티를 나타내는 한편, 하나의 폴리펩타이드는 선택적으로, FIXa 결합 아암과 FX 결합 아암 둘 다의 모두 또는 파트를 형성할 수 있다.

폴리펩타이드 결합 아암은, 항원(FIXa 또는 FX) 중 하나에 대한 결합 부위를 포함하는 이중특이적 분자의 영역이다. 이중특이적 분자의 항원-결합 부위 중 하나 또는 둘 다, 폴리펩타이드 아암 내 상보성 결정 영역(또는 펩타이드 루프) 세트에 의해 제공될 수 있으며, 상기 폴리펩타이드 아암은 항체(예를 들어, 항체 Fv 영역) 또는 비-항체 분자의 것이든지 간에 임의의 적합한 스캐폴드 폴리펩타이드이다. 결합 아암은 하나 또는 하나 초과의(예를 들어, 2개의) 폴리펩타이드 또는 이의 파트(예를 들어, 도메인)를 포함할 수 있다.

본 발명은 본원에서 이중특이적 항체를 참조로 하여 상세히 기재되며, 항원 결합 폴리펩타이드 아암 중 적어도 하나는 항체 VH 및/또는 VL 도메인 내의 CDR 세트, 선택적으로 Fv 영역에 의해 제공된다.

항체는 면역글로불린, 또는 면역글로불린 도메인을 포함하는 분자이다. 항체는 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE 분자, 또는 이의 항원-특이적 항체 단편을 포함하는 분자일 수 있다. 용어 "항체"는 항체 항원-결합 부위를 포함하는 임의의 폴리펩타이드 또는 단백질을 망라한다. 항체 항원-결합 부위(파라토프(paratope))는, 이의 표적 항원의 에피토프에 결합하고 이에 상보적인 항체의 파트이다. 용어 "에피토프"는 항체에 의해 결합된 항원의 영역을 지칭한다. 에피토프는 구조적 또는 기능적인 것으로 정의될 수 있다. 기능적 에피토프는 일반적으로 구조적 에피토프의 서브세트이며, 상호작용의 친화도에 직접적으로 기여하는 잔기를 갖는다. 에피토프는 또한, 형태적(conformational)일 수 있으며, 즉, 비-선형 아미노산으로 이루어진다. 소정의 구현예에서, 에피토프는, 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹화(grouping)인 결정기(determinant), 예컨대 아미노산, 당(sugar) 측쇄, 포스포릴기, 또는 설포닐기를 포함할 수 있으며, 소정의 구현예에서, 특이적인 3-차원 구조적 특징, 및/또는 특이적인 전하 특징을 가질 수 있다.

항체 항원-결합 부위는 항체 VH 및/또는 VL 도메인 내의 상보성 결정 영역(CDR) 세트에 의해 제공되며, 항원과 결합할 수 있다. 일례에서, 항체 결합 부위는 단일 가변 도메인, 예를 들어, 중쇄 가변 도메인(VH 도메인) 또는 경쇄 가변 도메인(VL 도메인)에 의해 제공된다. 또 다른 예에서, 결합 부위는 VH/VL 쌍(Fv) 또는 2개 이상의 이러한 쌍에 의해 제공된다.

항체 가변 도메인은 상보성 결정 영역(CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3), 및 프레임워크 영역(FR)의 아미노산 서열을 포함하는 항체의 경쇄 및 중쇄의 부분이다. 그러므로, VH 도메인 및 VL 도메인 각각 내에 CDR 및 FR이 존재한다. VH 도메인은 HCDR 세트를 포함하고, VL 도메인은 LCDR 세트를 포함한다. VH는 중쇄의 가변 도메인을 지칭한다. VL은 경쇄의 가변 도메인을 지칭한다. 각각의 VH 및 VL은 전형적으로, 아미노-말단으로부터 카르복시-말단까지 하기 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어진다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. CDR 및 FR에 지정된 아미노산 위치는 IMGT 명명법에 따라 정의될 수 있다. 항체는 VH CDR1, CDR2 및 CDR3 및 프레임워크를 포함하는 항체 VH 도메인을 포함할 수 있다. 항체는 대안적으로 또는 또한, VL CDR1, CDR2 및 CDR3 및 프레임워크를 포함하는 항체 VL 도메인을 포함할 수 있다. 항체 VH 및 VL 도메인 및 CDR의 예시적인 서열은 본 개시내용의 파트를 형성한다. CDR은 IMGT 시스템[13]에 따라 정의된다. 본원에 개시된 모든 VH 및 VL 서열, CDR 서열, CDR 세트 및 HCDR 세트 및 LCDR 세트는 본 발명의 양태 및 구현예를 나타낸다. 본원에 기재된 바와 같이"CDR 세트"는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 그러므로, HCDR 세트는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 지칭하고, LCDR 세트는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 지칭한다. 달리 정의되지 않는 한, "CDR 세트"는 HCDR 및 LCDR을 포함한다.

항체는 항체 프레임워크 내에 하나 이상의 CDR, 예를 들어, CDR 세트를 포함할 수 있다. 프레임워크 영역은 인간 생식계열 유전자 분절 서열의 것일 수 있다. 그러므로, 항체는 인간 생식계열 프레임워크에 HCDR 세트를 포함하는 VH 도메인을 갖는 인간 항체일 수 있다. 통상, 항체는 또한 예를 들어, 인간 생식계열 프레임워크에 LCDR 세트를 포함하는 VL 도메인을 갖는다. 항체 "유전자 분절", 예를 들어, VH 유전자 분절, D 유전자 분절, 또는 JH 유전자 분절은, 항체의 부분이 유래되는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 지칭하며, 예를 들어, VH 유전자 분절은 FR1로부터 CDR3의 파트로의 폴리펩타이드 VH 도메인에 상응하는 핵산 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드이다. 인간 v, d 및 j 유전자 분절은 재조합되어 VH 도메인을 발생시키고, 인간 v 및 j 분절은 재조합되어 VL 도메인을 발생시킨다. D 도메인 또는 영역은 항체 사슬의 다양성(diversity) 도메인 또는 영역을 지칭한다. J 도메인 또는 영역은 항체 사슬의 연결(joining) 도메인 또는 영역을 지칭한다. 체세포 초돌연변이(somatic hypermutation)는, 상응하는 유전자 분절(segment)과 정확히 매칭되거나 정렬되지 않는 프레임워크 영역을 갖는 항체 VH 또는 VL 도메인을 초래할 수 있으나, 서열 정렬은 가장 근접한 유전자 분절을 식별하고 따라서 유전자 분절의 어떤 특정한 조합으로부터 특정 VH 또는 VL 도메인이 유래되는 지 식별하는 데 사용될 수 있다. 항체 서열을 유전자 분절과 정렬할 때, 항체 아미노산 서열은 유전자 분절에 의해 인코딩되는 아미노산 서열과 정렬될 수 있거나, 항체 뉴클레오타이드 서열은 유전자 분절의 뉴클레오타이드 서열과 직접적으로 정렬될 수 있다. 본원에 기재된 예시적인 항체의 프레임워크 영역에 상응하는 생식계열 유전자 분절은 표 S-12에 나타나 있다.

항체는 불변 영역을 포함하여 전체 면역글로불린일 수 있거나, 항체 단편일 수 있다. 항체 단편은 예를 들어, 무손상 항체의 항원 결합 및/또는 가변 영역을 포함하는 무손상(intact) 항체의 부분이다. 상기 항체 단편은 하나 이상의 불변 영역 도메인을 포함할 수 있다.

본 발명의 항체는 인간 항체 또는 인간 가변 영역 및 비-인간(예를 들어, 마우스) 불변 영역을 포함하는 키메라 항체일 수 있다. 본 발명의 항체는 예를 들어, 인간 가변 영역을 갖고, 선택적으로 또한 인간 불변 영역을 갖는다.

그러므로, 항체는 선택적으로, 불변 영역 또는 이의 파트, 예를 들어, 인간 항체 불변 영역 또는 이의 파트, 예컨대 인간 IgG4 불변 영역을 포함한다. 예를 들어, VL 도메인은 이의 C-말단 단부에서 항체 경쇄 카파 또는 람다 불변 도메인에 부착될 수 있다. 유사하게는, 항체 VH 도메인은 이의 C-말단 단부에서 임의의 항체 이소타입, 예를 들어, IgG, IgA, IgE 및 IgM 및 임의의 이소타입 서브-클래스, 예컨대 IgG1 또는 IgG4로부터 유래된 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 모두 또는 파트(예를 들어, CH1 도메인 또는 Fc 영역)에 부착될 수 있다.

효소 파파인에 의한 전체(2가) 면역글로불린의 분해는 "Fab" 단편으로 알려진 2개의 동일한(1가) 항원-결합 단편, 및 "Fc" 단편을 초래한다. Fc는 항원-결합 활성을 갖지 않지만 결정화하는 능력을 갖는다. "Fab"는 본원에서 사용될 때, 각각의 중쇄 및 경쇄의 1개의 불변 도메인 및 1개의 가변 도메인을 포함하는 항체의 단편을 지칭한다. 본원에서 용어 "Fc 영역"은 본연의(native)-서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함하여, 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는 데 사용된다. "Fc 단편"은 이황화에 의해 함께 보유된 H 사슬 둘 다의 카르복시-말단 부분을 지칭한다.

효소 펩신에 의한 항체의 분해는, 항체 분자의 2개 아암이 연결된 채 유지되는 2가 F(ab')2 단편을 초래한다. F(ab')2 단편은, 힌지 영역에서 이황화 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편이다. 단일-사슬 항체(예를 들어, scFv)는 또 다른 단편이다. 2개의 상이한 1가 단일특이적 항체 단편, 예컨대 scFv는 함께 연결되어, 2가 이중특이적 항체를 형성할 수 있다.

"Fv"는 본원에서 사용될 때, 항원-인식 부위와 항원-결합 부위 둘 다를 보유하는 항체의 최소 단편을 지칭한다. 이 영역은 밀착(tight), 비-공유 또는 공유 회합에서 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성된다. 이러한 입체배치에서 각각의 가변 도메인의 3개 CDR은 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상에서 항원-결합 부위를 정의한다. 종합적으로, 6개의 CDR은 항원-결합 특이성을 항체에 부여한다. 그러나, 심지어 단일 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 단지 3개의 CDR을 포함하는 Fv의 절반)은, 그렇지만 통상 전체 결합 부위보다 더 낮은 친화도에서, 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.

바람직하게는, 이중특이적 항체는 이중 결합 항체, 즉, 항원 결합 도메인 둘 다 VH/VL 쌍에 의해 형성되는 이중특이적 항체이다. 이중 결합 항체는 FIT-Ig(본원에 참조로서 포함된 WO2015/103072 참조), mAb-dAb, 독 앤드 락(dock and lock), Fab-아암 교환, SEEDbody, 트리오맙(Triomab), LUZ-Y, Fcab, κλ-바디(body), 직교(orthogonal) Fab, scDiabody-Fc, 디아바디(diabody)-Fc, 탠덤(tandem) scFv-Fc, Fab-scFv-Fc, Fab-scFv, 인트라바디(intrabody), BiTE, 디아바디, DART, TandAb, scDiabody, scDiabody-CH3, 디아바디(diabody)-CH3, 삼중 바디(Triple body), 미니항체, 미니바디(minibody), scFv-CH3 KIH, scFv-CH-CL-scFv, F(ab')2-scFv, scFv-KIH, Fab-scFv-Fc, 4가(tetravalent) HCab, ImmTAC, 납-인-홀(knobs-in-holes), 공통 경쇄를 갖는 납-인-홀, 공통 경쇄 및 전하쌍을 갖는 납-인-홀, 전하쌍, 공통 경쇄를 갖는 전하쌍, DT-IgG, DutaMab, IgG(H)-scFv, scFv-(H)IgG, IgG(L)-scFv, scFv-(L)IgG, IgG(L,H)-Fv, IgG(H)-V, V(H)-IgG, IgG(L)-V, V(L)-IgG, KIH IgG-scFab, 2scFv-IgG, IgG-2scFv 및 scFv4-Ig를 포함한다.

일 구현예에서, 이중특이적 항체는 FIXa-결합 폴리펩타이드 아암 및 FX-결합 폴리펩타이드 아암을 포함하는 이중특이적 IgG이며, 각각의 폴리펩타이드 아암은 중쇄 및 경쇄를 포함한다. IgG는

FX 결합 Fv 영역을 포함하는 제2 중쇄-경쇄 쌍을 포함하는 사량체성 면역글로불린이며,

선택적으로, 2개의 폴리펩타이드 아암은 공통 경쇄를 포함하므로, 제1 중쇄-경쇄 쌍 및 제2 중쇄-경쇄 쌍의 경쇄는 동일한 아미노산 서열을 갖는다(도 5). 대안적으로 2개의 폴리펩타이드 아암은 상이한 경쇄를 포함할 수 있다.

이중특이적 항체는 FIXa에 결합하기 위해 그리고 FX에 결합하기 위해 1가(monovalent)일 수 있다.

항체 불변 영역

상기 논의된 바와 같이, 항체는 다양한 이소타입에서 그리고 상이한 불변 영역과 함께 제공될 수 있다. 항체의 Fc 영역은 Fc 수용체에 의해 인식되고, 항체-의존적 세포-매개 세포독성(ADCC) 활성, 보체 의존적 세포독성(CDC) 활성 및 항체-의존적 세포 식세포작용(ADCP) 활성을 포함하여 세포성 이펙터 기능을 매개하는 항체의 능력을 결정한다. 이들 세포성 이펙터 기능은, Fc 수용체를 보유한 세포를 표적 세포의 부위로 모집(recruitment)하여, 항체-결합된 세포의 사멸화를 초래하는 것을 수반한다.

본 발명의 맥락에서, 세포성 이펙터 기능, 예컨대 ADCC, ADCP 및/또는 CDC를 피하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명에 따른 이중특이적 항원-결합 분자는 Fc 이펙터 기능이 결여되어 있을 수 있으며, 예를 들어, 상기 분자는 ADCC, ADCP 및/또는 CDC를 매개하지 않는 Fc 영역을 함유할 수 있거나, 상기 분자는 Fc 영역이 결여되거나 항체 불변 영역이 전적으로 결여되어 있을 수 있다. 항체는, 효과기 무효(null)인 불변 영역을 가질 수 있다.

항체는, 하나 이상의 유형의 Fc 수용체에 결합하지만 세포성 이펙터 기능을 유도하지 않는, 즉, ADCC, CDC 또는 ADCP 활성을 매개하지 않는 중쇄 불변 영역을 가질 수 있다. 이러한 불변 영역은 ADCC, CDC 또는 ADCP 활성의 촉발을 담당하는 특정 Fc 수용체(들)에 결합할 수 없을 수 있다.

항체는 Fcγ 수용체에 결합하지 않는 중쇄 불변 영역을 가질 수 있으며, 예를 들어, 불변 영역은 "E" 돌연변이, 예를 들어, IgG4-E로 지칭될 수 있는 Leu235Glu 돌연변이(즉, 야생형 류신 잔기가 글루탐산 잔기로 돌연변이화됨)를 포함할 수 있다. 중쇄 불변 영역에 대한 또 다른 선택적인 돌연변이는 Ser228Pro("P" 돌연변이)이며, 이는 Fab 아암 교환을 감소시킴으로써 안정성을 증가시킨다. 중쇄 불변 영역은 Leu235Glu 돌연변이와 Ser228Pro 돌연변이(EU 숫자매김) 둘 다 포함하는 IgG4일 수 있다. 이러한 "IgG4-PE" 중쇄 불변 영역은 이펙터 무효이다. 대안적인 효과기 무효 인간 불변 영역은 무능화된(disabled) IgG1이다.

항체 불변 영역은 생체내에서 연장된 반감기를 갖도록 조작될 수 있다. 예는 "YTE" 돌연변이 및 다른 반감기 연장 돌연변이를 포함한다(본원에 참조로서 포함된 문헌[Dall'Acqua, Kiener & Wu, JBC 281(33):23514-23524 2006] 및 WO02/060919). 삼중 돌연변이 YTE는 IgG CH2 도메인에서 3개 아미노산 치환이며, 이들 돌연변이는 카바트(Kabat)의 EU 인덱스에 따라 숫자매겨진 잔기 252에서 티로신, 잔기 254에서 트레오닌 및 잔기 256에서 글루탐산을 제공한다. 참조된 공개문헌에 기재된 바와 같이, YTE 돌연변이는 인간 CH2 야생형 도메인을 갖는 상응하는 항체의 반감기과 비교하여 항체의 반감기를 증가시킨다. 생체내 효능의 증가된 기간을 제공하기 위해, 본 발명의 항체는, 상응하는 야생형 인간 불변 영역(예를 들어, IgG, 예를 들어, IgG CH2 도메인)과 비교하여 항체의 반감기를 증가시키는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 항체 불변 영역(예를 들어, IgG 불변 영역, 예를 들어, IgG CH2 도메인)을 포함할 수 있다. 반감기는 표준 방법에 의해 결정될 수 있으며, 예컨대 WO02/060919에 기재되어 있다.

일부 구현예에서, 감마-카르복시글루탐산-풍부(Gla) 도메인 또는 다른 막-결합 도메인은 이중특이적 항체에(예를 들어, Fc의 C 말단에서) 포함되어, 혈소판 표면에서 인지질 막으로의 항체의 국소화를(Gla 도메인과 막 사이의 상호작용을 통해) 촉진함으로써, FIX 및 FX가 생체내에서 천연적으로 존재하는 이중특이적 항체의 국소 농도를 증가시킨다. WO2018/145125는 FIX/FX 이중특이적 항체 및 막 결합 도메인, 예를 들어, 혈소판 결합 도메인, 예컨대 C1, C2 도메인, PH 도메인, GLA 도메인 또는 혈소판 막 당단백질의 막 결합 도메인을 포함하는 FVIII 미메틱 단백질을 기재하였다. 본원에 기재된 바와 같이, 막-결합 도메인은 이중특이적 항체의 중쇄 불변 도메인 중 하나 또는 둘 다의 C-말단에 연결될 수 있다. 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자는 선택적으로 WO2018/145125에 기재된 특질 및 분자 포맷을 포함할 수 있다.

하기 논의된 바와 같이, 이중특이적 IgG 포맷 또는 상이한 항원 결합 아암이 불변 영역을 통해 헤테로이량체화되는 다른 항체 포맷에서, 상기 불변 영역은 호모이량체 형성보다 헤테로이량체 형성을 촉진하고/하거나 상이한 화학종의 혼합물로부터 헤테로이량체의 정제를 용이하게 하기 위해 조작될 수 있다.

항-FIXaxFX 이중특이적 항체 에미시주맙은 중쇄 불변 영역을 함유하며, 이는 이의 조립, 정제 및/또는 치료적 성능을 촉진하도록 설계된 특질을 포함한다. 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 이들 특질 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다. 그러므로, 상기 항체는 하기 변화(EU 숫자매김) 중 하나 이상을 포함하는 인간 IgG4(예를 들어, IgHG4*03) 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함할 수 있다:

CH1 내 Lys196Gln;

힌지 영역 내 Ser228Pro(P 돌연변이);

CH2의 DE 턴(turn) 내 Phe296Tyr;

CH3 내 Glu356Lys;

CH3 내 Lys439Glu;

CH3 내 Leu445Pro;

Gly446의 결실;

Lys447의 결실.

돌연변이 Glu356Lys 및 Lys439Glu 중 각각 하나는 헤테로이량체성 이중특이적 분자의 Fc 내의 2개의 반대로 쌍형성된 중쇄 불변 영역에 포함되며, 즉, 하나의 중쇄 불변 영역은 Glu356 및 Lys439Glu을 포함하고, 다른 중쇄 불변 영역은 Glu356Lys 및 Lys439(하기 변화 쌍형성에 대한 논의 참조)를 포함한다.

본 발명에 따른 이중특이적 항체는, 에미시주맙의 Fc 영역에 존재하는 특질 중 임의의 하나 이상을 갖는 Fc 영역을 포함할 수 있다. 이는 에미시주맙의 Fc 영역을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 에미시주맙 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열이다.

중쇄 불변 영역에 대한 예시적인 아미노산 서열은 표 S-100에 제시되어 있다.

헤테로이량체 형성 및/또는 정제를 용이하게 하기 위한 이중특이적 항체의 조작

임상에서 이중특이적 항체를 사용하는 어려움 중 하나는 역사적으로, 이들을 다량으로 그리고 약학적 등급의 순도로 생성하는 어려움이었다. "전형적인" 이중특이적 IgG 포맷은 중쇄 및 경쇄의 2개의 상이한 쌍, 따라서 4개의 상이한 폴리펩타이드 사슬을 포함하며, 이들은 함께 발현된다면 10개의 상이한 잠재적인 항체 분자로 조립될 수 있을 것이다. 화학종의 혼합물은, 경쇄 중 하나 또는 둘 다 H-L 쌍 사이에서 교환되는 분자인 호모이량체(호모이량체성 항-FIXa 결합 아암 및 호모이량체성 항-FX 결합 아암), 뿐만 아니라 "올바른" 이중특이적 헤테로이량체성 구조를 포함할 것이다.

이러한 잠재적인 쌍형성-오류(mis-pairing)를 피하는 대안적인 분자 포맷이 개발되어 왔으며, 몇몇 예는 본원에 제공된다. 이들은 예를 들어, 화학적 커플링 또는 류신 지퍼(fos:jun) 조립에 의해 제조되는 F(ab')2, 예를 들어, 디아바디, 및 scFv 헤테로이량체를 포함한다. 그렇지만, 이중특이적 IgG를 사용할 수 있으며 혈류에서 항체의 본연의 구조를 반영하고 투여된 치료 분자의 면역원성을 최소화하는 것이 여전히 바람직하다. 추가로, 전장 이중특이적 항체는 더 긴 혈청 반감기를 가질 수 있다.

이중특이적 항체의 제조를 위한 "납 인투 홀(Knobs into holes)" 기법은, [14] 및 US5,731,168에 기재되었으며, 둘 다 참조에 의해 본원에 포함한다. 그 원리는, 하나의 CH3 도메인이 "납"을 함유하고 다른 CH3 도메인이 입체적으로 반대의 위치에서 "홀"을 함유하도록 헤테로이량체성 중쇄의 쌍형성된 CH3 도메인을 조작하는 것이다. 납은 CH3 도메인 사이의 계면에서 작은 아미노산 측쇄를 대체함으로써 생성되는 한편, 홀은 큰 측쇄를 더 작은 측쇄로 대체함으로써 생성된다. 납은 홀 내로 삽입되어, 호모이량체 형성을 탈안정화시키는 한편 상이한 CH3 도메인의 헤테로이량체화를 선호하도록 설계된다. 이중특이적 항체를 형성하도록 조립되는 항체 중쇄와 경쇄의 혼합물에서, 쌍형성된 헤테로이량체성 중쇄를 갖는 IgG 분자의 비율은 증가되어, 활성 분자의 수율 및 회수를 상승시킨다.

돌연변이 Y349C 및/또는 T366W는 IgG CH3 도메인에서 "납(knob)"을 형성하기 위해 포함될 수 있다. 돌연변이 E356C, T366S, L368A 및/또는 Y407V는 IgG CH3 도메인에서 "홀(hole)"을 형성하기 위해 포함될 수 있다. 납 및 홀은 임의의 인간 IgG CH3 도메인, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 CH3 도메인 내로 도입될 수 있다. 바람직한 예는 IgG4이다. 주지된 바와 같이, IgG4는 추가 변형, 예컨대 "P" 및/또는 "E" 돌연변이를 포함할 수 있다. 예시적인 IgG4-PE 서열 및 납-인투-홀 돌연변이를 포함하는 다른 예시적인 불변 영역은 표 S-100에 제시되어 있다. IgG4 유형 a("ra") 서열은 치환 Y349C 및 T366W("납")를 함유하고, IgG4 유형 b("γb") 서열은 치환 E356C, T366S, L368A, 및 Y407V("홀")를 함유한다. ra와 γb 둘 다, 힌지 내 위치 228에서 "P" 치환(S228P)을 함유하여, 중쇄의 힌지 영역을 안정화시킨다. ra와 γb 둘 다, CH2 영역 내 위치 235에서 "E" 치환(L235S)을 함유하여, FcγR에의 결합을 무효화시킨다. 그러므로, IgG4-PE 중쇄의 관련 서열은 ppcp P cpapef E ggps(SEQ ID NO: 401)이다. 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자는 IgG4 PE 인간 중쇄 불변 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 143), 선택적으로 2개의 이러한 쌍형성된 불변 영역을 함유할 수 있으며, 선택적으로 하나는 "납" 돌연변이를 갖고 하나는 "홀" 돌연변이를 갖고, 예를 들어, 하나의 중쇄 불변 영역은 서열 SEQ ID NO: 144(납)를 갖고 하나의 중쇄 불변 영역은 서열 SEQ ID NO: 145(홀)를 갖는다.

이중특이적 IgG 조작에서 추가의 진전은 WO98/50431에 기재된 바와 같이 공통 경쇄를 사용하는 아이디어였다. 2개의 중쇄-경쇄 쌍을 포함하는 이중특이적 항체가 기재되었으며, 상기 2개의 중쇄-경쇄 쌍의 가변 경쇄는 공통 서열을 갖는다. WO98/50431은 헤테로이량체 형성을 촉진하고 호모이량체 형성을 방해하기 위해 중쇄 헤테로이량체화 계면에서 특정 상보적 상호작용(예컨대 납-인투-홀)을 공통 경쇄 접근법과 조합하는 것을 기재하였다. 조합에서, 이들 접근법은 요망되지 않는 헤테로이량체 및 호모이량체에 비해 요망되는 헤테로이량체의 형성을 증강시킨다.

납-인투-홀은 이중특이적 헤테로이량체 내 쌍형성된 CH3 도메인의 계면에서 상보적 분자 형상을 생성하도록 아미노산 측쇄를 조작하는 것을 수반하는 한편, 헤테로이량체 형성을 촉진하고 호모이량체 형성을 방해하는 또 다른 방식은 반대 전하를 갖도록 아미노산 측쇄를 조작하는 것이다. 중쇄 헤테로이량체에서 CH3의 회합은 반대로 하전된 잔기의 쌍형성에 의해 선호되는 한편, 쌍형성된 양전하 또는 쌍형성된 음전하는 호모이량체 형성을 에너지적으로 덜 선호되게 만들 것이다. WO2006/106905는 헤테로다량체 회합이 조절될 방식으로 하나 초과의 유형의 폴리펩타이드(예컨대 2개의 상이한 항체 중쇄의 헤테로이량체) 사이에서 계면을 형성하는 아미노산 잔기에 치환을 포함하는 상기 폴리펩타이드로 이루어진 헤테로다량체를 생성하는 방법을 기재하였으며, 상기 방법은

(a) 원래의 핵산으로부터의 폴리펩타이드 사이에 계면을 형성하는 아미노산 잔기를 인코딩하는 핵산을 변형시켜, 하나 이상의 다량체를 형성하는 폴리펩타이드 사이의 회합은 2개 이상의 유형의 다량체를 형성할 수 있는 헤테로다량체에서 저해될 것인, 단계;

(b) 상기 단계 (a)에 의해 변형된 핵산 서열이 발현되도록 숙주 세포를 배양하는 단계; 및

(c) 숙주 세포 배양물로부터 상기 헤테로다량체를 회수하는 단계를 포함하며,

단계 (a)의 변형은, 계면을 형성하는 돌연변이화된 잔기(들)를 포함하여 2개 이상의 아미노산 잔기가 동일한 유형의 양전하 또는 음전하를 운반할 방식으로 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환되도록 원래의 핵산을 변형시키는 것이다.

이의 일례는 하기를 포함하여 중쇄 호모이량체의 계면에서 정전기적 반발력을 도입함으로써, 예를 들어, CH3 도메인의 계면에서 서로 접촉하는 아미노산 잔기를 변형시킴으로써 중쇄 사이에서의 회합을 억제시키는 것이고:

위치 356 및 439

위치 357 및 370

위치 399 및 409,

잔기 숫자매김은 EU 숫자매김 시스템에 따른 것이다.

제1 중쇄의 CH3 도메인에서 유사한(like) 전하(양전하 또는 음전하 둘 다)를 갖도록 이들 잔기 쌍 중 하나 이상을 변형시킴으로써, 중쇄 호모이량체의 쌍형성은 정전기적 반발력에 의해 저해된다. 제1 중쇄 내의 상응하는 잔기와 비교하여 반대 전하를 갖도록 동일한 쌍 또는 제2(상이한) 중쇄의 CH3 도메인 내 잔기의 쌍을 조작함으로써, 제1 및 제2 중쇄의 헤테로이량체성 쌍형성은 정전기적 인력에 의해 촉진된다.

중쇄 불변 영역 CH3 계면에서의 아미노산은 전하쌍을 도입하도록 변형되었으며, 돌연변이는 WO2006/106905의 표 1에 나열되어 있다. 중쇄 위치 356, 357, 370, 399, 409 및 439에서 아미노산을 변형하여 CH3 계면에서 전하-유도 분자 반발력을 도입하는 것은 의도된 이중특이적 항체의 형성 효율을 증가시키는 효과를 가진 것으로 보고되었다. 예를 들어, 하나의 중쇄 불변 영역은 EU 숫자매김을 사용하여, 돌연변이 K439E(음으로 하전된 Glu에 의해 대체된 양으로 하전된 Lys)를 함유하는 IgG4 불변 영역일 수 있고, 다른 중쇄 불변 영역은 돌연변이 E356K(양으로 하전된 Lys에 의해 대체된 음으로 하전된 Glu)를 함유하는 IgG4 불변 영역일 수 있다. "전하쌍형성"은 이들 2개의 불변 영역의 헤테로이량체화로부터 조립된 Fc 영역 내 잔기 439 및 356의 공간적 근위부로부터 비롯된다.

2개의 상이한 중쇄 불변 영역이 사용되는 경우, 이들은 어느 한 배향에서 항체의 2개의 상이한 VH 도메인에 연결될 수 있다. 예를 들어,

제1 중쇄는 항-FIX VH 도메인 및 K439E를 포함하는 불변 영역을 포함할 수 있고, 제2 중쇄는 항-FX VH 도메인 및 E356K를 포함하는 불변 영역을 포함할 수 있거나,

제1 중쇄는 항-FIX VH 도메인 및 E356K를 포함하는 불변 영역을 포함할 수 있고, 제2 중쇄는 항-FX VH 도메인 및 K439E를 포함하는 불변 영역을 포함할 수 있다.

WO2006/106905는 IgG4의 CH3 도메인이 납-인투-홀 돌연변이로 돌연변이화된, FX 및 FIXa에 결합하는 이중특이적 IgG 항체를 예시하였다. 유형 a 유형 a(IgG4γa)는 Y349C 및 T366W에서 치환된 IgG4였으며, 유형 b(IgG4γb)는 E356C, T366S, L368A, 및 Y407V에서 치환된 IgG4였다.

또 다른 예에서, 항체 VH 및 VL 도메인에서 전하쌍의 도입은 "올바르지 않은" VH-VL 쌍의 형성(하나의 항체로부터의 VH와 다른 항체의 VL의 쌍형성)을 저해하는 데 사용되었다. 일례에서, VH 및 VL 내 Q 잔기는 K 또는 R(양성)로, 또는 E 또는 D(음성)로 변하여, Q 측쇄 사이에서 수소 결합을 저해하고 정전기적 반발력을 도입하였다.

전하쌍의 추가 예는 WO2013/157954에 개시되었으며, 이는 단일 세포로부터 헤테로이량체성 CH3 도메인-포함 분자를 생성하는 방법을 기재하였으며, 상기 분자는 계면을 형성할 수 있는 2개의 CH3 도메인을 포함하였다. 상기 방법은 세포에서

(a) 제1 CH3 도메인-포함 폴리펩타이드 사슬을 인코딩하는 제1 핵산 분자로서, 이러한 사슬은 EU 숫자매김 시스템에 따라 위치 366에서 K 잔기를 포함하는, 제1 핵산 분자, 및

(b) 제2 CH3 도메인-포함 폴리펩타이드 사슬을 인코딩하는 제2 핵산 분자로서, 이러한 사슬은 EU 숫자매김 시스템에 따라 위치 351에서 D 잔기를 포함하는, 제2 핵산 분자를 제공하는 단계를 포함하였으며,

상기 방법은 추가로, 숙주 세포를 배양하는 단계, 2개의 핵산 분자의 발현을 가능하게 하는 단계 및 헤테로이량체성 CH3 도메인-포함 분자를 배양물로부터 수합하는 단계를 포함한다.

호모이량체 형성보다 헤테로이량체 형성을 촉진하기 위해 폴리펩타이드 사슬 내에서 정전기적 반발력을 조작하는 추가 방법은 WO2011/143545에 기재되었다.

CH3-CH3 계면에서의 조작의 또 다른 예는 가닥-교환 조작된 도메인(SEED) CH3 헤테로이량체이다. CH3 도메인은 인간 IgA 및 IgG CH3 서열의 교대 분절로 이루어지며, 이들은 "SEED-바디"로 지칭되는 상보적인 SEED 헤테로이량체의 쌍을 형성한다[15]; WO2007/110205].

이중특이적 분자는 또한, 단백질 A와 같은 정제 시약에의 이의 결합 친화도를 변경시키기 위해 CH3 도메인에서 차별적으로 변형된 헤테로이량체화된 중쇄로 생성되었다. WO2010/151792는

N-말단으로부터 C-말단까지, 제1 에피토프에 선택적으로 결합하는 제1 에피토프-결합 영역, IgG1, IgG2, 및 IgG4로부터 선택되는 인간 IgG의 제1 CH3 영역을 포함하는 면역글로불린 불변 영역을 포함하는 제1 폴리펩타이드; 및

N-말단으로부터 C-말단까지, 제2 에피토프에 선택적으로 결합하는 제2 에피토프-결합 영역, IgG1, IgG2, 및 IgG4로부터 선택되는 인간 IgG의 제2 CH3 영역을 포함하는 면역글로불린 불변 영역을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하는 헤테로이량체성 이중특이적 항원-결합 단백질을 기재하였으며, 제2 CH3 영역은 단백질 A에의 제2 CH3 도메인의 결합을 감소시키거나 무효화시키는 변형을 포함한다.

그러므로, Fc 영역은 하나 이상의 돌연변이를 포함하여, 호모이량체 화학종으로부터 활성 헤테로이량체의 차별적인 정제를 촉진할 수 있다. 하나의 중쇄 불변 영역의 CH3는 돌연변이 His435Arg 및/또는 Tyr436Phe(EU 숫자매김)[16]을 포함할 수 있는 한편, 다른 중쇄 불변 영역의 CH3는 상기 돌연변이가 결여되어 있다. 에미시주맙은 예를 들어, 하나의 CH3가 His435를 포함하고 다른 CH3가 His435Arg을 포함하는 Fc 영역을 포함한다.

본 발명의 이중특이적 분자는 기재된 바와 같이 임의의 이들 기술 및 분자 포맷을 이용할 수 있다.

항체의 발생 및 변형

항체를 식별하고 제조하는 방법은 널리 알려져 있다. 본원에 기재된 항체 (또는 이의 중쇄-경쇄 쌍 또는 폴리펩타이드 결합 아암)를 인코딩하는 단리된(선택적으로 돌연변이화된) 핵산은 숙주 세포, 예를 들어, 논의된 바와 같은 CHO 세포 내로 도입될 수 있다. 그 후에, 숙주 세포는 항체(또는 항체 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인, 중쇄-경쇄 쌍, 또는 폴리펩타이드 결합 아암)의 발현을 위한 조건 하에 배양되어, 요망되는 항체 포맷을 생성한다. 일부 가능한 항체 포맷, 예를 들어, 전체 면역글로불린, 항원-결합 단편, 및 다른 설계는 본원에 기재되어 있다.

서열이 본원에 구체적으로 개시되어 있는 임의의 VH 및 VL 도메인 또는 CDR의 가변 도메인 아미노산 서열 변이체는 논의된 바와 같이 본 발명에 따라 이용될 수 있다.

항체 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 핵산에의 변경, 예컨대 본원에 기재된 바와 같이 잔기의 돌연변이 및 변이체의 발생이 수행될 수 있다. 대규모 제조를 위해 항체 서열을 최적화하거나, 정제를 용이하게 하거나, 안정성을 증강시키거나, 요망되는 약학적 제형에 포함시키기 위한 적합성을 향상시키는 것을 포함하는, 변이체를 생성하는 것이 바람직할 수 있는 많은 이유가 존재한다. 단백질 조작 작업, 예를 들어, 하나의 아미노산을 대안적인 아미노산으로 치환하고(선택적으로, Cys 및 Met을 가능하게는 제외하고는, 이 위치에서 모든 천연 발생 아미노산을 함유하는 변이체를 발생시키고), 기능 및 발현에 미치는 영향을 모니터링하여 최상의 치환을 결정하는 것이 항체 서열 내 하나 이상의 표적 잔기에서 수행될 수 있다. 일부 경우, 잔기를 Cys 또는 Met로 치환하거나 이들 잔기를 서열 내로 도입하는 것은 바람직하지 않는데, 이렇게 하는 것은 - 예를 들어, 새로운 분자내 또는 분자간 시스테인-시스테인 결합의 형성을 통해 제조에서 어려움을 발생시킬 수 있다. 주된 후보가 선택되었고 제조 및 임상 개발을 위해 최적화되고 있는 경우, 이의 항원-결합 특성을 가능한 한 적게 변화시키거나 적어도 모 분자의 친화도 및 약효를 보유하는 것이 일반적으로 바람직할 것이다. 그러나, 주요 항체 특징, 예컨대 친화도, 교차-반응성 또는 중화 약효를 조절하기 위해 변이체가 또한 발생될 수 있다.

하나 이상의 아미노산 돌연변이가 선택적으로, 본원에 개시된 항체 VH 또는 VL 도메인의 프레임워크 영역에서 이루어질 수 있다. 예를 들어, 상응하는 인간 생식계열 분절 서열과 상이한 하나 이상의 잔기는 생식계열로 복귀될 수 있다. 본원의 예시적인 항체의 VH 및 VL 도메인에 상응하는 인간 생식계열 유전자 분절 서열은 표 S-12에 나타나 있다.

이중특이적 항원 결합 분자에서, 항원-결합 부위는, H 및/또는 L CDR의 개시된 세트 내에 하나 이상의 아미노산 돌연변이와 함께 임의의 개시된 항-FIX 또는 항-FX 항체의 H 및/또는 L CDR 세트를 포함할 수 있다. 돌연변이는 아미노산 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 그러므로, 예를 들어, H 및/또는 L CDR의 개시된 세트 내에 하나 이상의 아미노산 치환이 존재할 수 있다. 예를 들어, H 및/또는 L CDR의 세트 내에 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2개 이하의 돌연변이, 예를 들어, 치환이 존재할 수 있다. 예를 들어, HCDR3에 6, 5, 4, 3 또는 2개 이하의 돌연변이, 예를 들어, 치환이 존재할 수 있고/있거나 LCDR3에 6, 5, 4, 3 또는 2개 이하의 돌연변이, 예를 들어, 치환이 존재할 수 있다.

항체는 표에 제시된 바와 같이 VH 도메인과 적어도 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 또는 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 VH 도메인을 포함하고/하거나 임의의 이들 항체의 VL 도메인과 적어도 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 또는 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 VL 도메인을 포함할 수 있다. 2개의 아미노산 서열의 동일성 %를 계산하는 데 사용될 수 있는 알고리즘은 예를 들어, 디폴트 매개변수를 이용하는 예를 들어, BLAST, FASTA 또는 스미스-워터맨 알고리즘(Smith-Waterman algorithm)을 포함한다. 특정 변이체는 하나 이상의 아미노산 서열 변경(아미노산 잔기의 첨가, 결실, 치환 및/또는 삽입)을 포함할 수 있다.

변경은 하나 이상의 프레임워크 영역 및/또는 하나 이상의 CDR에서 이루어질 수 있다. 변이체는 선택적으로 CDR 돌연변이생성에 의해 제공된다. 변경은 통상 기능 상실을 초래하지 않아서, 이렇게 변경된 아미노산 서열을 포함하는 항체는 이의 항원에 결합하는 능력을 보유할 수 있다. 이는 예를 들어, 본원에 기재된 검정에서 측정된 바와 같이, 변경이 이루어지지 않은 항체와 동일한 정량적 결합 능력을 보유할 수 있다. 이렇게 변경된 아미노산 서열을 포함하는 항체는 이의 항원에 결합하는 향상된 능력을 가질 수 있다.

변경은 하나 이상의 아미노산 잔기를 비-천연 발생 또는 비-표준 아미노산으로 대체하거나, 하나 이상의 아미노산 잔기를 비-천연 발생 또는 비-표준 형태로 변형시키거나, 하나 이상의 비-천연 발생 또는 비-표준 아미노산을 서열 내로 삽입하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 서열에서 변경의 수 및 위치의 예는 본원 어디에서나 기재되어 있다. 천연 발생 아미노산은 이의 표준 한글자(single-letter) 코드에 의해 G, A, V, L, I, M, P, F, W, S, T, N, Q, Y, C, K, R, H, D, E로 식별된 20개의 "표준" L-아미노산을 포함한다. 비-표준 아미노산은, 폴리펩타이드 백본 내로 혼입될 수 있는 임의의 다른 잔기를 포함하거나 기존의 아미노산 잔기의 변형으로 인한 것이다. 비-표준 아미노산은 천연 발생적 또는 비-천연 발생적일 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 "변이체"는 하나 이상의 아미노산 또는 핵산 결실, 치환 또는 첨가에 의해 모 폴리펩타이드 또는 핵산과 상이하게 되지만, 모 분자의 하나 이상의 특정 기능 또는 생물학적 활성을 보유하는 펩타이드 또는 핵산을 지칭한다. 아미노산 치환은, 아미노산이 상이한 천연-발생 아미노산 잔기로 대체되는 변경을 포함한다. 이러한 치환은, 폴리펩타이드에 함유된 아미노산 잔기가 극성, 측쇄 기능성 또는 크기와 관련하여 유사한 특징의 또 다른 천연 발생 아미노산으로 대체되는 경우 "보존적"으로 분류될 수 있다. 이러한 보존적 치환은 당업계에 널리 알려져 있다. 본 발명에 의해 포괄되는 치환은 또한, 펩타이드에 존재하는 아미노산 잔기가 상이한 특성을 갖는 아미노산, 예컨대 상이한 군으로부터의 천연-발생 아미노산으로 치환되거나(하전된 또는 소수성 아미노산을 알라닌으로 치환함), 대안적으로 천연-발생 아미노산이 비-보존적 아미노산으로 치환되는 경우, "비-보존적"일 수 있다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 보존적이다. 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 참조로 하여 사용될 때 용어 변이체 내에 포괄되는 것은, 기준 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드와 비교하여(예를 들어, 야생형 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드와 비교하여) 각각 1차, 2차 또는 3차 구조에서 다양할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 지칭한다.

일부 양태에서, 당업자는 당업계에 널리 알려진 방법을 사용하여 단리되거나 발생된 "합성 변이체", "재조합 변이체" 또는 "화학적으로 변형된" 폴리뉴클레오타이드 변이체 또는 폴리펩타이드 변이체를 사용할 수 있다. "변형된 변이체"는 하기 기재된 바와 같이 보존적 또는 비-보존적 아미노산 변화를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 변화는 기준 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드에서 아미노산 치환, 첨가, 결실, 융합 및 절단을 초래할 수 있다. 일부 양태는, 변이체에 기초하여 펩타이드 서열에서 통상 발생하지 않는 아미노산 및 다른 분자의 삽입 및 치환을 포함하지만 예를 들어 인간 단백질에서 통상 발생하지 않는 오르니틴의 삽입으로 제한되지 않는, 삽입 변이체, 결실 변이체, 또는 아미노산의 치환에 치환된 변이체를 포함한다. 용어 "보존적 치환"은 폴리펩타이드를 설명할 때, 폴리펩타이드의 활성을 실질적으로 변경시키지 않는, 폴리펩타이드의 아미노산 조성에서의 변화를 지칭한다. 예를 들어, 보존적 치환은 유사한 화학적 특성(예를 들어, 산성, 염기성, 양으로 또는 음으로 하전된, 극성 또는 비극성 등)을 갖는 아미노산 잔기 또는 상이한 아미노산 잔기를 치환하는 것을 지칭한다. 보존적 아미노산 치환은 류신을 이소류신 또는 발린으로 대체하는 것, 아스파르테이트를 글루타메이트로 대체하는 것, 또는 트레오닌을 세린으로 대체하는 것을 포함한다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당업계에 널리 알려져 있다. 예를 들어, 하기 6개 군은 서로에 대한 보존적 치환인 아미노산을 함유한다: 1) 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T); 2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E); 3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q); 4) 아르기닌(R), 라이신(K); 5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 및 6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W). (또한, 그 전체가 참조로서 포함된 문헌[Creighton, Proteins, W. H. Freeman and Company (1984)] 참조). 일부 구현예에서, 단일 아미노산 또는 작은 백분율의 아미노산을 변경시키거나 첨가하거나 결실시키는 개별적인 치환, 결실 또는 치환 또한, 변화가 펩타이드의 활성을 감소시키지 않는다면 "보존적 치환"인 것으로 여겨질 수 있다. 삽입 또는 결실은 전형적으로, 약 1 내지 5개 아미노산 범위에 있다. 보존적 아미노산의 선택은, 예를 들어, 아미노산이 펩타이드의 외부 상에 있고 용매에 노출되거나, 내부 상에 있고 용매에 노출되지 않는다면, 펩타이드에서 치환될 아미노산의 위치에 기초하여 선택될 수 있다.

당업자는, 아미노산을 용매에 노출시키는 것을 포함하여 기존의 아미노산의 위치에 기초하여 상기 기존의 아미노산을 치환할 아미노산을 선택할 수 있다(즉, 아미노산이 용매에 노출되거나, 용매에 노출되지 않는 내부적으로 국소화된 아미노산과 비교하여 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 외부 표면 상에 존재한다면). 이러한 보존적 아미노산 치환의 선택은 당업계에 널리 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Dordo 등, J. Mol Biol, 1999, 217, 721-739] 및 문헌[Taylor 등, J. Theor. Biol. 119(1986);205-218] 및 문헌[S. French 및 B. Robson, J. Mol. Evol. 19(1983)171]에 개시된 바와 같다. 이에, 당업자는 단백질 또는 펩타이드의 외부 상의 아미노산(즉, 용매에 노출된 아미노산)에 적합한 보존적 아미노산 치환을 선택할 수 있으며, 예를 들어, 그러나 제한되지 않으면서, 하기 치환이 사용될 수 있다: Y를 F로, T를 S 또는 K로, P를 A로, E를 D 또는 Q로, N을 D 또는 G로, R을 K로, G를 N 또는 A로, T를 S 또는 K로, D를 N 또는 E로, I를 L 또는 V로, F를 Y로, S를 T 또는 A로, R을 K로, G를 N 또는 A로, K를 R로, A를 S, K 또는 P로 치환.

대안적인 구현예에서, 당업자는 또한, 단백질 또는 펩타이드의 내부 상의 아미노산에 적합하게 포괄된 보존적 아미노산 치환을 선택할 수 있으며, 예를 들어, 당업자는 단백질 또는 펩타이드의 내부 상의 아미노산(즉, 아미노산은 용매에 노출되지 않음)에 대해 적합한 보존적 치환을 사용할 수 있으며, 예를 들어, 그러나 제한되지 않으면서, 당업자는 하기 보존적 치환을 사용할 수 있다: Y는 F, T는 A 또는 S로, I는 L 또는 V로, W는 Y로, M은 L로, N은 D로, G는 A로, T는 A 또는 S로, D는 N으로, I는 L 또는 V로, F는 Y 또는 L로, S는 A 또는 T로, 그리고 A는 S, G, T 또는 V로 치환된다. 일부 구현예에서, 비-보존적 아미노산 치환 또한, 변이체의 용어 내에 포괄된다.

본 발명은 본원의 표에 제시된 항체 VH 및/또는 VL 도메인의 VH 및/또는 VL 도메인 변이체를 함유하는 폴리펩타이드 결합 아암을 생성하는 방법을 포함한다. 변이체 VH 도메인을 포함하는 FIXa 결합 폴리펩타이드 아암은,

(i) 모 항체 VH 도메인의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산의 첨가, 결실, 치환 또는 삽입에 의해, 모 항체 VH 도메인의 아미노산 서열 변이체인 항체 VH 도메인을 제공하는 단계로서,

상기 모 항체 VH 도메인은 도 20에 도시된 VH 도메인, 예를 들어, N1280H이거나, 임의의 이들 VH 도메인의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 VH 도메인인, 단계,

(ii) 선택적으로, 이렇게 해서 제공된 VH 도메인을 VL 도메인과 조합하여, VH/VL 조합을 제공하는 단계, 및

(iii) 이렇게 해서 제공된 VH 도메인 또는 VH/VL 도메인 조합을 시험하여, 하나 이상의 요망되는 특징을 갖는 항체를 식별하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성될 수 있다.

VH 도메인은 이의 서열이 표 S-9A 또는 도 20에 제시되어 있는 임의의 VH 도메인, 또는 표 S-9A 또는 도 20에 제시된 VH 도메인의 HCDR 세트(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3)를 포함하는 임의의 VH 도메인일 수 있다.

FIXa-결합 폴리펩타이드 아암, 및 이를 포함하는 이중특이적 항-FIXa/FX 결합 분자의 요망되는 특징은 본원 어디에서나 상술되어 있다. 예를 들어, 상기 방법은 VH 도메인 또는 VH/VL 도메인 조합이 본원에 기재된 바와 같이 FIXa에 결합함을 확인하는 단계를 포함할 수 있다.

VL 도메인이 상기 방법에 포함될 때, VL 도메인은 N0128L VL 도메인일 수 있거나, N0128L VL 도메인의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산의 첨가, 결실, 치환 또는 삽입에 의해 제공되는 변이체일 수 있거나, N0128L VL 도메인의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 VL 도메인일 수 있다. VL 도메인은 0325L VL 도메인일 수 있다.

변이체 항체를 발생시키는 방법은 선택적으로, 항체 또는 VH/VL 도메인 조합의 복사체(copy)를 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 추가로, FIXa 결합 폴리펩타이드 아암을 포함하는 이중특이적 항체를, 예를 들어, 인코딩 핵산의 발현에 의해 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 숙주 세포에서의 재조합 발현을 포함하여 적합한 발현 방법은 본원에서 상세히 제시된다.

인코딩 핵산 및 발현 방법

본 발명에 따른 이중특이적 항원 결합 분자, 예를 들어, 이중특이적 항체를 인코딩하는 단리된 핵산이 제공될 수 있다. 핵산은 DNA 및/또는 RNA일 수 있다. 합성 기원의 게놈 DNA, cDNA, mRNA 또는 다른 RNA 또는 이들의 임의의 조합은 항체를 인코딩할 수 있다.

본 발명은 상기와 같은 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 플라스미드, 벡터, 전사 또는 발현 카세트 형태의 작제물을 제공한다. 예시적인 뉴클레오타이드 서열은 표에 포함된다. 본원에 제시된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열에 대한 지칭은 명시된 서열을 갖는 DNA 분자를 포괄하고, 문맥상 다르게 필요로 하지 않는 한, U가 T에 대해 치환되는 명시된 서열을 갖는 RNA 분자를 포괄한다.

본 발명은 또한, 항원 결합 분자를 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 인코딩된 분자를 생성하는 방법은 예를 들어, 핵산을 함유하는 재조합 숙주 세포를 배양함으로써 핵산으로부터의 발현을 포함할 수 있다. 그러므로, 이중특이적 분자는 수득될 수 있고, 임의의 적합한 기법을 사용하여 단리되고/되거나 정제된 다음, 적절하게 사용될 수 있다. 생성 방법은 생성물을, 적어도 하나의 추가 구성요소, 예컨대 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 조성물 내로 제형화하는 단계를 포함할 수 있다.

여러 가지 상이한 숙주 세포에서 폴리펩타이드의 클로닝 및 발현을 위한 시스템은 널리 알려져 있다. 적합한 숙주 세포는 박테리아, 포유류 세포, 식물 세포, 사상성 진균류(filamentous fungi), 효모 및 바큘로바이러스 시스템 및 유전자이식 식물과 동물을 포함한다.

원핵생물 세포에서 항체 및 항체 단편의 발현은 당업계에서 널리 확립되어 있다. 보편적인 박테리아 숙주는 이. 콜라이(E. coli)이다. 배양물 내 진핵생물 세포에서의 발현 또한, 생성을 위한 옵션으로서 당업자에게 이용 가능하다. 이종성 폴리펩타이드의 발현을 위해 당업계에서 입수 가능한 포유류 세포주는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, HeLa 세포, 새끼 햄스터 신장 세포, NSO 마우스 흑색종 세포, YB2/0 래트 골수종 세포, 인간 배야 신장 세포, 인간 배아 망막 세포 및 많은 다른 것들을 포함한다.

벡터는 적절하다면 프로모터 서열, 종결자 서열, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 마커 유전자 및 다른 서열을 포함하는 적절한 조절 서열을 함유할 수 있다. 항체를 인코딩하는 핵산은 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 핵산은 칼슘 포스페이트 형질주입, DEAE-덱스트란, 전기천공, 리포솜-매개 형질주입 및 레트로바이러스 또는 다른 바이러스, 예를 들어, 백시나, 또는 곤충 세포에 대해서는 바큘로바이러스를 사용하는 형질도입을 포함하여 다양한 방법에 의해 진핵생물 세포로 도입될 수 있다. 핵산을 숙주 세포, 특히 진핵생물 세포에 도입하는 것은 바이러스 또는 플라스미드 기초 시스템을 사용할 수 있다. 플라스미드 시스템은 에피솜적으로 유지될 수 있거나, 숙주 세포 내로 또는 인공 염색체 내로 혼입될 수 있다. 혼입은 단일 좌위(loci) 또는 다수의 좌위에서 하나 이상의 복사체의 무작위 또는 표적화된 통합에 의해 이루어질 수 있다. 박테리아 세포에 대해, 적합한 기법은 칼슘 클로라이드 형질전환, 전기천공 및 박테리오파지를 사용한 형질주입을 포함한다. 도입에 뒤이어, 예를 들어, 유전자의 발현을 위한 조건 하에 숙주 세포를 배양함으로써 핵산을 발현시킨 다음, 선택적으로 항체를 단리하거나 정제하는 것이 이어질 수 있다.

본 발명의 핵산은 숙주 세포의 게놈(예를 들어, 염색체) 내로 통합될 수 있다. 통합은, 표준 기법에 따라 게놈을 이용한 재조합을 촉진하는 서열의 포함에 의해 촉진될 수 있다. 이중특이적 분자를 인코딩하는 핵산은 숙주(예를 들어, CHO) 세포의 게놈 DNA 내로, 예를 들어, 염색체 DNA 내로 통합될 수 있으며, 생성된 재조합 세포는 이중특이적 분자를 발현하도록 배양될 수 있다. 세포주 개발 과정은 이중특이적 분자를 인코딩하는 핵산을 다수의 숙주 세포 내로 도입하는 단계, 및 요망되는 수준의 이중특이적 항체(예를 들어, 5% 이하의 호모이량체성 오염원과 함께 적어도 95% 헤테로이량체)를 요망되는 수율(예를 들어, 적어도 0.5 g/L 또는 적어도 1 g/L)로 발현하는 세포주를 선택하는 단계를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 세포주는 세포 배양물 내에서 많은 세대에 걸쳐 안정한 발현을 보유할 것이며, 따라서, 이는 이들 생성 수준을 예를 들어, 적어도 60 세대에 걸쳐 유지시킬 수 있다.

본 발명은 또한, 이중특이적 항원 결합 분자를 발현시키기 위해 발현 시스템에서 본원에 기재된 핵산을 사용하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 항원-결합 분자는 초기 발효 후 세포 상층액 내에서 적어도 0.5 g/L의 수율로, 바람직하게는 >2 g/L의 수율로 발현된다. 용해도는 분자의 유의한 응집 또는 분해 없이, >10 mg/ml, 바람직하게는 >50 mg/ml여야 한다.

전반적인 치료에 적합한 의약을 제공하기 위해, 항체는 대규모로, 예를 들어, 적어도 100 리터 또는 적어도 200 리터, 예를 들어, 100 내지 250 리터의 세포 배양 부피에서 생성될 수 있다. 회분식 배양, 특히 유가 배양은 현재, 임상 및 상업적 사용을 위한 생물치료제의 생성에 보편적으로 사용되며, 이러한 방법은 본 발명에서 항체를 발생시키고, 뒤이어 본원에 주지된 바와 같이 정제 및 제형 단계에 적합하게 사용될 수 있다. 생물반응기는 금속(예를 들어, 스테인리스강) 용기일 수 있거나 1회용 생물반응기일 수 있다.

제형 및 투여

본 발명에 따른 이중특이적 항원-결합 분자("이중특이적 분자"), 및 이의 인코딩 핵산 분자는 통상 단리된 형태로 제공될 것이다. 이중특이적 VH 및/또는 VL 도메인, 및 핵산은 이의 천연 환경 또는 이의 생성 환경으로부터 정제되어 제공될 수 있다. 단리된 항원-결합 분자 및 단리된 핵산은, 이것이 천연적으로 회합된 물질, 예컨대 이것이 생체내에서 발견되는 다른 폴리펩타이드 또는 핵산, 또는 이러한 제조가 시험관내에서 재조합 DNA 기법에 의한 것일 때 제조되는 환경(예를 들어, 세포 배양물)이 없거나 실질적으로 없을 것이다. 선택적으로 단리된 항원-결합 분자 또는 핵산은 (1) 이것이 통상 발견될 적어도 일부 다른 단백질이 없거나, (2) 동일한 공급원으로부터의, 예를 들어, 동일한 종으로부터의 다른 단백질이 본질적으로 없거나, (3) 상이한 종으로부터의 세포에 의해 발현되거나, (4) 이것이 천연적으로 회합된 적어도 약 50%의 폴리뉴클레오타이드, 지질, 탄수화물, 또는 다른 물질로부터 분리되었거나, (5) 이것이 천연적으로 회합되지 않은 폴리펩타이드와 작동적으로(공유 또는 비공유 상호작용에 의해) 회합되거나, (6) 천연적으로 발생하지 않는다.

이중특이적 항체는 단백질 A 크로마토그래피 및/또는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다(예를 들어, 세포 배양 상층액으로부터). 이중특이적 항체는,

인코딩 핵산을 포함하는 배양된 숙주 세포로부터 2개의 항체 중쇄 및 공통 경쇄를 발현시키는 단계,

항체 중쇄 및 공통 경쇄로부터 조립된 이중특이적 항체 및 단일특이적 항체를 포함하는 세포 배양물을 수득하는 단계,

이중특이적 항체 및 단일특이적 항체를 세포 배양물로부터 단리하는 단계(예를 들어, 단백질 A 크로마토그래피를 사용함), 및

이중특이적 항체를 단일특이적 항체로부터 정제하는 단계(예를 들어, 양이온 교환 크로마토그래피를 사용함)를 포함하는 방법에 의해 생성될 수 있다.

이중특이적 분자 또는 이를 인코딩하는 핵산은 희석제 또는 아쥬반트와 함께 제형화되고 또한 실용적인 목적을 위해 단리될 수 있으며 - 예를 들어, 이들은 면역검정에 사용되기 위해 마이크로역가 플레이트를 코팅시키는 데 사용된다면 담체와 혼합될 수 있고, 치료법에 사용될 때에는 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제와 혼합될 수 있다. 본원 어디에서나 기재된 바와 같이, 다른 활성 성분이 또한, 치료 조제물에 포함될 수 있다. 항원 결합 분자는 생체내에서 천연적으로 또는 이종성 진핵생물 세포, 예컨대 CHO 세포의 시스템에 의해 글리코실화될 수 있거나, 항원 결합 분자는(예를 들어, 원핵생물 세포에서 발현에 의해 생성된다면) 비글리코실화될 수 있다. 본 발명은 변형된 글리코실화 패턴을 갖는 항체를 포괄한다.

전형적으로, 단리된 생성물은 주어진 시료의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 25%, 또는 적어도 약 50%를 이룬다. 이중특이적 분자는, 이의 천연 또는 생성 환경에서 발견되고 이의 치료적, 진단적, 예방적, 연구 또는 다른 사용을 방해할 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 다른 오염원이 실질적으로 없을 수 있다.

본원 어디에서나 논의된 바와 같이, 이중특이적 항체에 대한 항체 중쇄 및 경쇄의 발현은 활성 헤테로이량체성 이중특이적 항체 외에도 원치 않는 호모이량체성 화학종(항-FIX 항체 및 항-FX 항체)을 발생시킬 수 있다. 바람직하게는 이중특이적 분자는, 헤테로이량체성 이중특이적 항체가 총 항체의 적어도 95% 나타내고 호모이량체성 항체 오염원이 5% 이하로 존재하는 조성물에 제공된다. 조성물은 적어도 98% 또는 적어도 99%의 헤테로이량체성 이중특이적 분자를 포함할 수 있으며, 이때 호모이량체성 오염원은 각각 0 내지 2% 또는 0 내지 1%를 나타낸다.

본 발명은 본원에 기재된 이중특이적 분자를 포함하는 치료적 조성물을 제공한다. 이러한 이중특이적 분자를 인코딩하는 핵산을 포함하는 치료적 조성물이 또한 제공된다. 인코딩 핵산은 본원 어디에서나 더욱 상세히 기재되고, DNA 및 RNA, 예를 들어, mRNA를 포함한다. 본원에 기재된 치료적 방법에서, 이중특이적 분자를 인코딩하는 핵산 및/또는 이러한 핵산을 함유하는 세포의 사용은 이중특이적 분자 자체를 포함하는 조성물에 대해 대안으로서(또는 그에 더하여) 사용될 수 있다. 그러므로, 이중특이적 분자를 인코딩하는 핵산을 함유하는 세포는 환자에서의 치료적 사용을 위한 약제를 나타내며, 상기 핵산은 게놈 내로 안정하게 통합된다. 이중특이적 분자를 인코딩하는 핵산은 의도된 환자로부터 유래되고 생체외에서 변형된 인간 세포 내로 도입될 수 있다. 환자에게 인코딩 핵산을 함유하는 세포의 투여는 이중특이적 분자를 발현할 수 있는 세포의 저장고를 제공하며, 이는 단리된 핵산 또는 단리된 이중특이적 분자의 투여와 비교하여 더 장기간에 걸쳐 치료적 이익을 제공할 수 있다. 이중특이적 분자를 인코딩하는 핵산은 유전자 치료법에 사용되기 위해 제공될 수 있으며, 상기 치료법은 인코딩 핵산을 생체내에서 환자의 세포 내로 도입하는 단계를 포함하며, 따라서 핵산은 환자의 세포에서 발현되고 치료적 효과, 예컨대 유전적 인자 VIII 결핍증에 대한 보상을 제공한다.

조성물은 향상된 이전, 전달, 내약성(tolerance)을 제공하기 위해 제형 내로 혼입되는 적합한 담체, 부형제 및 다른 제제를 함유할 수 있다. 다수의 적절한 제형은 모든 약학적 화학자에게 알려진 제형에서 발견될 수 있다: 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa]. 이들 제형은 예를 들어, 분말, 페이스트, 연고, 젤리, 왁스, 오일, 지질, 소낭을 함유하는 지질(양이온성 또는 음이온성)(예컨대 LIPOFECTINT™), DNA 접합체, 무수 흡수 페이스트, 수-중-유 및 유-중-수 에멀젼, 에멀젼 카르보왁스(다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반고체 젤, 및 카르보왁스를 함유하는 반고체 혼합물을 포함한다. 또한, 문헌[Powell 등 "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311]을 참조한다. 조성물은 의학적 주사 완충 용액과 조합된 항체 또는 핵산을 포함할 수 있다.

이중특이적 분자, 또는 이의 인코딩 핵산은 환자에게의 요망되는 투여 경로를 위해, 예를 들어, 주사용 액체(선택적으로 수용액) 내에서 제형화될 수 있다. 이중특이적 분자를 주사용으로 제형화하는 예시적인 완충액은 20 mM 소듐 아세테이트, 150 mM 아르기닌 하이드로클로라이드, 0.05% w/v 폴리소르베이트 80 pH 5.2의 수용액이다.

다양한 전달 시스템이 알려져 있고, 본 발명의 약학적 조성물을 투여하는 데 사용될 수 있다. 도입 방법은 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비내, 경막외 및 경구 경로를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는다. 조성물은 임의의 편리한 경로에 의해, 예를 들어, 주입 또는 볼루스(bolus) 주사에 의해, 상피 또는 점막피부 내벽(lining)(예를 들어, 경구 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있으며, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 또는 국소일 수 있다. 항원-결합 분자는 바람직하게는 피하 주사에 의해 투여된다.

약학적 조성물은 또한, 소낭, 특히 리포솜에서 전달될 수 있다(문헌[Langer (1990) Science 249:1527-1533]; 문헌[Treat 등 (1989) Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez Berestein 및 Fidler (eds.), Liss, New York에서, pp. 353-365]; 문헌[Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327] 참조; 일반적으로 동일 문헌 참조).

소정의 상황에서, 약학적 조성물은 제어 방출 시스템에서 전달될 수 있다. 일 구현예에서, 펌프가 사용될 수 있다(문헌[상기 Langer; Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201] 참조). 또 다른 구현예에서, 중합체성 물질이 사용될 수 있으며; 문헌[Medical Applications of Controlled Release, Langer 및 Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974)]를 참조한다. 더욱 다른 구현예에서, 제어 방출 시스템은 조성물의 표적 부근에 배치되므로, 전신 용량의 단지 한 분획을 필요로 할 수 있다(예를 들어, 문헌[Goodson, 상기 Medical Applications of Controlled Release, vol. 2에서, pp. 115-138, 1984] 참조).

주사 가능한 조제물은 정맥내, 피하, 피내 및 근육내 주사, 점적 주입(drip infusion) 등을 위한 투약 형태를 포함할 수 있다. 이들 주사 가능한 조제물은 공개적으로 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 주사 가능한 조제물은 예를 들어, 상기 기재된 항체 또는 이의 염을 주사용으로 편리하게 사용되는 멸균 수성 매질 또는 유성 매질에서 용해시키거나, 현탁시키거나 유화시킴으로써 제조될 수 있다. 주사용의 수성 매질로서, 예를 들어, 생리학적 식염수, 글루코스 및 다른 보조제를 함유하는 등장성 용액 등이 존재하며, 이는 적절한 가용화제, 예컨대 알코올(예를 들어, 에탄올), 폴리알코올(예를 들어, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜), 비이온성 계면활성제[예를 들어, 폴리소르베이트 80, HCO-50(수소화된 피마자유의 폴리옥시에틸렌(50 몰) 부가물)] 등과 조합되어 사용될 수 있다. 유성 매질로서, 예를 들어, 가용화제, 예컨대 벤질 벤조에이트, 벤질 알코올 등과 조합되어 사용될 수 있는 참기름, 대두유 등이 이용된다. 이렇게 해서 제조된 주사액은 적절한 앰플에 충전될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 표준 바늘 및 주사기를 이용하여 피하로 또는 정맥내로 전달될 수 있다. 치료는 병원에서 사용하는 것에 제약되지 않을 것으로 고려된다. 따라서, 무바늘(needle-free) 장치를 사용한 피하 주사가 또한 유리하다. 피하 전달에 관하여, 펜 전달 장치는 이미 본 발명의 약학적 조성물을 전달하는 데 있어서 적용을 갖는다. 이러한 펜 전달 장치는 재사용 가능하거나 폐기 가능할 수 있다. 재사용 가능한 펜 전달 장치는 일반적으로, 약학적 조성물을 함유하는 대체 가능한 카트리지를 이용한다. 일단 카트리지 내의 모든 약학적 조성물이 투여되었고 카트리지가 비워지면, 빈 카트리지는 쉽게 폐기되고, 약학적 조성물을 함유하는 새로운 카트리지로 대체될 수 있다. 그 후에, 펜 전달 장치가 재사용될 수 있다. 일회용 펜 전달 장치에는 대체 가능한 카트리지가 없다. 그보다는, 일회용 펜 전달 장치는 장치 내의 저장고에 보유된 약학적 조성물로 예비충전된다. 일단 저장고에서 약학적 조성물이 비워지면, 전체 장치가 폐기된다. 많은 재사용 가능한 펜 및 자동주사기 전달 장치는 본 발명의 약학적 조성물의 피하 전달에서 적용을 갖는다. 예는 몇몇 예를 들자면, AUTOPEN™(Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), DISETRONIC™ 펜(Disetronic Medical Systems, Burghdorf, Switzerland), HUMALOG MIX 75/25™ 펜, HUMALOG™ 펜, HUMALIN 70/30™ 펜(Eli Lilly and Co., Indianapolis, Ind.), NOVOPEN™I, II 및 III(Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), NOVOPEN JUNIOR™(Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), BD™ 펜(Becton Dickinson, Franklin Lakes, N.J.), OPTIPENT™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™, 및 OPTICLIKT™(Sanofi-Aventis, Frankfurt, Germany)를 포함하지만 확실히는 이로 제한되지 않는다. 본 발명의 약학적 조성물의 피하 전달에 적용을 갖는 일회용 펜 전달 장치의 예는 SOLOSTAR™ 펜(Sanofi-Aventis), FLEXPEN™(Novo Nordisk), 및 KWIKPEN™(Eli Lilly)을 포함하지만 확실히는 이로 제한되지 않는다.

유리하게는, 상기 기재된 경구 또는 비경구 사용을 위한 약학적 조성물은 활성 성분의 용량을 적합화시키도록 된 단위 용량에서 투약량 형태 내로 제조된다. 단위 용량 내의 이러한 투약 형태는 예를 들어, 정제, 알약, 캡슐, 주사액(앰플), 좌제 등을 포함한다. 함유된 상기 언급된 항체의 양은 일반적으로, 단위 용량, 특히 주사 형태 내 투약 형태당 약 5 내지 약 500 mg이며, 상기 언급된 항체는 다른 투약 형태에 대해 약 5 내지 약 100 mg, 및 약 10 내지 약 250 mg으로 함유될 수 있다.

이중특이적 분자, 핵산, 또는 이를 포함하는 조성물은 의학적 용기, 예컨대 약병, 주사기, IV 용기 또는 주사 장치에 함유될 수 있다. 일례에서, 이중특이적 핵산 또는 조성물은 시험관내에 있고, 멸균 용기에 있을 수 있다. 일례에서, 본원에 기재된 바와 같은 치료 방법에 사용하기 위한 이중특이적 분자, 포장재 및 설명서를 포함하는 키트가 제공된다.

본 발명의 일 양태는 본 발명의 이중특이적 분자 또는 핵산 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 조성물이며, 이의 예는 상기에 나열되어 있다. "약학적으로 허용 가능한"은, USA 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 승인 가능하거나 미국 약전 또는 인간을 포함하여 동물에 사용하기 위해 다른 일반적으로 인식된 약전에 나열되어 있음을 지칭한다. 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 또는 아쥬반트는 이중특이적 제제, 예를 들어, 본원에 기재된 임의의 항체 또는 폴리펩타이드 분자와 함께 환자에게 투여될 수 있으며, 치료적 양의 제제를 전달하기에 충분한 용량으로 투여될 때 이의 약리학적 활성을 파괴하지 않고 무독성이다.

일부 구현예에서, 이중특이적 분자는 본 발명에 따른 조성물에서 단독 활성 성분일 것이다. 그러므로, 조성물은 항체로 구성될 수 있거나, 조성물은 이중특이적 분자와 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제와 함께 구성될 수 있다. 그러나, 본 발명에 따른 조성물은 선택적으로, 하나 이상의 추가 활성 성분을 포함한다.

필요하다면(예를 들어, 급성 출혈의 관리를 위해), 이중특이적 분자는, 재조합 인자 VIII(예를 들어, 투록토코그 알파(turoctocog alfa)) 또는 재조합 인자 VIIa(예를 들어, 엡타코그 알파(eptacog alfa))를 포함하여 하나 이상의 다른 혈우병 치료와 조합될 수 있다. 본원에 기재된 이중특이적 분자의 기능적 특성 및 안전성 프로파일은 이러한 추가 치료제와의 이의 안전한 조합에 적합한 것으로 여겨진다. 이중특이적 분자는 US10407488에 기재된 바와 같이 재조합 인자 Va(FVa), 예를 들어, 활성화된 변이체 FVa와 조합될 수 있다.

본 발명에 따른 이중특이적 분자 또는 핵산과 함께 투여하는 것이 바람직할 수 있는 다른 치료제는 진통제(analgaesic agent)를 포함한다. 임의의 이러한 제제 또는 제제들의 조합은, 조합된 또는 별개의 조제물로서든지 간에, 본 발명에 따른 항체 또는 핵산과 조합되어 투여되거나, 이들과 함께 조성물에서 제공될 수 있다. 본 발명에 따른 이중특이적 분자 또는 핵산은 또 다른 치료제 또는 제제들, 예컨대 언급된 것들과 별개로 그리고 순차적으로, 또는 동시에 그리고 선택적으로는 조합된 조제물로서 투여될 수 있다.

다수의 조성물은 별개로 또는 동시에 투여될 수 있다. 별개의 투여는, 2개의 조성물이 상이한 시기에, 예를 들어, 적어도 10, 20, 30, 또는 10-60분 간격을 두거나, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12시간 간격을 두고 투여됨을 지칭한다. 당업자는 또한, 24시간 간격을 두고, 또는 심지어 더 장기간의 간격을 두고 조성물을 투여할 수 있다. 대안적으로, 2개 이상의 조성물은 동시에, 예를 들어, 10분 미만 또는 5분 미만의 간격을 두고 투여될 수 있다. 일부 양태에서, 동시에 투여되는 조성물은 각각의 구성요소에 대해 유사한 또는 상이한 시간 방출 기전으로 또는 기전 없이 혼합물로서 투여될 수 있다.

이중특이적 분자, 및 이의 인코딩 핵산은 치료제로서 사용될 수 있다. 본원에서 환자는 일반적으로 포유류, 전형적으로 인간이다. 이중특이적 분자 또는 핵산은 예를 들어, 본원에 언급된 임의의 투여 경로에 의해 포유류에게 투여될 수 있다.

투여는 통상 "치료적 유효량"으로 수행되며, 이 양은 이것이 투여되어 환자에게 이익을 보여주기에 충분한, 요망되는 효과를 발휘하는 양이다. 정확한 양은 치료 목적에 의존할 것이고, 기지의 기법을 사용하여 당업자에 의해 확인될 것이다(예를 들어, 문헌[Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding] 참조). 치료의 처방, 예를 들어, 투약에 대한 결정 등은 일반 의사 및 다른 의학 박사의 책임 내에 있으며, 치료되고 있는 질환의 증상의 중증도 및/또는 진행에 의존할 수 있다. 이중특이적 분자 또는 핵산의 치료적 유효량 또는 적합한 용량은 이의 시험관내 활성 및 동물 모델에서 생체내 활성을 비교함으로써 결정될 수 있다. 마우스 및 다른 시험 동물에서의 효과적인 투약을 인간에게 외삽하는 방법은 알려져 있다.

이중특이적 분자는 용량당 하기 범위 중 하나의 양으로 투여될 수 있다:

약 10 μg/kg 체중 내지 약 100 mg/kg 체중,

약 50 μg/kg 체중 내지 약 5 mg/kg 체중,

약 100 μg/kg 체중 내지 약 10 mg/kg 체중,

약 100 μg/kg 체중 내지 약 20 mg/kg 체중,

약 0.5 mg/kg 체중 내지 약 20 mg/kg 체중, 또는

약 5 mg/kg 체중 이하, 예를 들어 4 mg/kg 미만, 3 mg/kg 미만, 2 mg/kg 미만, 또는 1 mg/kg 미만의 항체.

투여되는 항원-결합 분자의 용량은 1 mg/kg까지일 수 있다. 이는 소아 집단에게는 더 낮은 강도, 예를 들어, 30 내지 150 mg/mL에서 제형화될 수 있다. 이중특이적 분자는 소아 집단에게는 더 적은 양으로 포장될 수 있으며, 예를 들어, 상기 분자는 약병에서 25 내지 75 mg, 예를 들어, 30 또는 60 mg으로 제공될 수 있다.

본원에 기재된 치료 방법에서, 하나 이상의 용량이 투여될 수 있다. 일부 경우, 단일 용량은 장기간 이익을 달성하기에 효과적일 수 있다. 그러므로, 상기 방법은 단일 용량의 이중특이적 분자, 이의 인코딩 핵산, 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 대안적으로, 다수의 용량은 순차적으로 그리고 통상 수일, 수주 또는 수개월의 기간에 의해 분리되어 투여될 수 있다. 선택적으로, 이중특이적 분자는 환자에게 1개월 1회, 또는 그보다 덜 빈번하게, 예를 들어, 2개월마다 또는 3개월마다 투여될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료하다", "치료", "치료하는" 또는 "개선"은 치료적 치료를 지칭하며, 목적은 질환 또는 장애와 관련된 병태의 진행 또는 중증도를 역전시키거나, 경감시키거나, 호전시키거나, 저해하거나, 서행시키거나 또는 중단시키는 것이다. 용어 "치료하는"은 병태, 질환 또는 장애의 적어도 하나의 부작용 또는 증상을 감소시키거나 경감시키는 것을 포함한다. 치료는 일반적으로, 하나 이상의 증상 또는 임상 마커가 감소된다면, "효과적"이다. 대안적으로, 치료는 질환의 진행이 감소되거나 중단된다면, "효과적"이다. 즉, "치료"는 증상 또는 마커의 향상을 포함할 뿐만 아니라, 치료의 부재 하에 예상될 것과 비교하여 증상의 진행 또는 악화의 중단, 또는 적어도 이의 서행을 포함한다. 유익한 또는 요망되는 임상 결과는, 검출 가능하거나 검출 불가능하든지 간에, 하나 이상의 증상(들)의 경감, 질환 정도의 약화, 질환의 안정화된(즉, 악화되지 않는) 상태, 질환 진행의 지연 또는 서행, 질환 상태의 호전 또는 완화, 관해(부분 또는 완전이든지 간에), 및/또는 저하된 사망률을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는다. 용어 질환의 "치료"는 또한, 상기 질환의 증상 또는 부작용으로부터의 경감(완화적 치료 포함)을 제공하는 것을 포함한다. 치료가 효과적이기 위한 완전 치유(complete cure)는 고려되지 않는다. 소정의 양태에서 상기 방법은 마찬가지로 치유를 포함할 수 있다. 발명의 맥락에서, 치료는 예방적 치료일 수 있다.

장기간 반감기는 본 발명의 이중특이적 분자에서의 바람직한 특질이다. 연장된 반감기는 덜 빈번한 투여로 번역되며, 더 적은 주사는 혈류에서 분자의 치료적 유효 농도를 유지시키는 데 필요하다. 인간에서 본 발명의 항원-결합 분자의 생체내 반감기는 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21일 이상일 수 있다. 비-인간 영장류, 예컨대 시노몰구스 원숭이에서 항원-결합 분자의 생체내 반감기는 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21일 이상일 수 있다.

정상적인 FVIII 활성의 1%의 유지는 혈우병에서 예방적 사용을 위한 최소인 것으로 여겨진다[1]. ACE910(에미시주맙)을 이용한 인간 임상 시험을 보고한 논문에서, 인 실리코(in silico) 집단 약물동력학적 모델링 및 시뮬레이션은, 1 mg/kg의 매주 용량이 적어도 약 300 nM(45 μg/ml)의 혈장 농도를 초래하여, 정상적인 FVIII 활성의 적어도 10%의 지속적인 지혈 효과를 발휘하였음을 시사하였다[4]. 이러한 용량은 또한, 환자에서 널리 관용되는 것으로 보고되었다.

해당 데이터에 기초하여, 대략 30 nM(약 4.5 μg/ml) 내지 300 nM(약 45 μg/ml)의 혈장 농도 범위는, 항체 농도 및 FVIII 활성 및 필적할 만한 항체 활성 사이에서 선형 관계를 추정하여 1 내지 10%의 유효 FVIII 활성에 상응할 것이다.

본 발명에 따른 이중특이적 분자는 30 nM(약 4.5 μg/ml) 내지 300 nM(약 45 μg/ml) 범위의 농도에서 이례적으로 높은 활성을 나타내어, 심지어 상대적으로 낮은 비용에서 강한 트롬빈 발생 활성을 유지시킨다. 이의 강한 약효에 의해 입증된 바와 같이(예를 들어, 실시예 14 참조), 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 에미시주맙보다 더 낮은 혈장 농도에서 치료적 효능을 나타낼 수 있다. 따라서, 상기 항체는 동등한 용량에서 더 큰 치료적 이익을 제공할 수 있고, 이는 에미시주맙과 비교하여 더 낮은 용량에서 동등한 치료적 이익을 제공할 수 있다. 그러므로, 환자는 더 작은 및/또는 덜 빈번한 주사로부터 이익을 얻을 수 있고, 헬스케어 제공자는 더 낮은 관련 비용으로부터 이익을 얻을 수 있다.

US FDA는 현재(2018년 10월에 발행된 지침에서), 에미시주맙이 처음 4주 동안 매주 1회 피하 주사에 의해 3 mg/kg의 로딩 용량, 및 뒤이어,

매주 1회 1.5 mg/kg, 또는

2주마다 1회 3 mg/kg, 또는

4주마다 1회 6 mg/kg의 유지 용량으로 투여되는 것을 권고한다.

본 발명에 따른 항원-결합 분자는 1주, 2주, 3주, 4주 또는 1개월 동안 정기적인 간격을 두고 투여되기 위해 제공될 수 있다.

바람직한 구현예에서, 이중특이적 분자는 피하 주사에 의해 투여된다.

치료적 사용

본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자는 치료법에 의한 인간 또는 동물 신체의 치료 방법에 사용될 수 있다. 분자에 대한 치료적 적응증은

혈우병 A를 치료하기 위한 사용,

유전적(hereditary) 인자 VIII 결핍증을 치료하기 위한 사용,

혈우병 A 환자에서 출혈 사건(bleeding incident)의 횟수를 유의하게 저하시키기 위한 사용,

인자 VIII 기능을 치환하기 위한 사용,

및/또는

혈액 응고를 촉진하기 위한 사용을 포함한다.

환자는 전형적으로 인간 환자이다. 환자는 혈우병 A 또는 유전적 인자 VIII 결핍증으로 진단된 인간, 또는 야생형과 비교하여 더 낮은(또는 부재하는) 인자 VIII 발현 또는 활성을 갖는 인간일 수 있다. 환자는 소아 환자(예를 들어, 2세 내지 18세 미만)일 수 있거나 성인일 수 있다. 환자는 인간 남성일 수 있다. 환자는 인자 VIII에 대한 저해제를 가질 수 있거나 가질 수 없다.

본 발명의 이중특이적 분자, 또는 이러한 이중특이적 분자 또는 이의 인코딩 핵산을 포함하는 조성물은 임의의 이러한 방법에 사용하기 위해 사용되거나 제공될 수 있다. 임의의 이러한 방법에 사용하기 위한 약제의 제조를 위한, 이중특이적 분자, 또는 이것 또는 이의 인코딩 핵산을 포함하는 조성물의 사용이 또한 고려된다. 상기 방법은 전형적으로, 항체 또는 조성물을 포유류, 예를 들어, 인간 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 적합한 제형 및 투여 방법은 본원 어디에서나 기재되어 있다.

FVIII에 대해 저해성 동종-항체를 발달시키는 혈우병 A 환자의 치료에 대해 현재 충족되지 않은 필요성이 존재한다. 본 발명의 항원-결합 분자는 이러한 환자에서 사용하기에 적합하다. 이에, 일부 양태에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항원 결합 분자로 치료되는 환자는 혈류 내 저해성 항체의 존재로 인해 FVIII에 의한 치료에 내성일 수 있다. 치료에 대한 내성은 치료법의 효능의 감소에서 나타날 수 있다. 이러한 내성은 환자로부터의 혈액 혈장 시료를 이용한 시험관내 검정(예를 들어, aPTT 검정)에서 검출될 수 있으며, 치료적 분자는 응고 시간을, 대조군 FVIII-결핍 혈장을 이용한 검정에서와 동일한 수준까지 단축시키지 않는다(후자는 치료적 분자에의 저해성 항체가 결여되어 있음).

혈우병에 대한 다른 치료, 예컨대 FIXa 및 FX에 대한 이중특이적 항체를 받는 환자는 또한, 이들 치료적 항체에 대한 저해성 항체를 발달시킬 수 있다. 주지된 바와 같이, 인간 항체, 예컨대 본 발명의 항체의 사용은 이의 위험을 최소화시켜야 하지만, 저해성 항체는 그럼에도 불구하고 본 발명의 항원 결합 분자 또는 FIXa 및 FX에의 다른 이중특이적 항원 결합 분자를 받는 일부 환자에서 발생될 수 있다. 본 발명에 따른 이중특이적 항원 결합 분자로 치료되는 환자는 혈류 내 저해성 항체의 존재로 인해 FIXa 및 FX에 대한 상이한 이중특이적 항원 결합 분자에 의한 치료에 내성일 수 있다. 환자는 에미시주맙에 의한 치료에 내성일 수 있다.

저해성 항체가 약물 생성물의 장기간 치료적 투여를 통해 발생될 수 있기 때문에, 환자가 저해성 항체를 발달시키는 위험을 감소시키기 위해서는 환자가 다수의 상이한 치료 사이에서 교대하거나 순환시키는 것이 유익할 수 있다. 그러므로, 본 발명에 따른 이중특이적 항원 결합 분자는, 상이한 FVIIIa-활성 대체 폴리펩타이드 약물, 예를 들어, FIXa 및 FX에 대한 이중특이적 항원 결합 분자, 선택적으로 에미시주맙에 의한 치료를 이전에 받았던 환자에게, 심지어 상기 환자가(아직) 저해성 항체를 발달시키지 않은 경우에도 투여될 수 있다. 유사하게는, 에미시주맙 또는 FIXa 및 FX에 대한 다른 이중특이적 항원 결합 분자, 및 다른 FVIIIa-활성 대체 폴리펩타이드 약물은 일반적으로, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자로 이전에 치료되었던 환자에게 투여될 수 있다. 치료 연대(regiment)는 제1 기간(예를 들어, 1개월 내지 6개월, 또는 6개월 내지 1년) 동안 제1 FVIII-활성 대체 폴리펩타이드 약물의 투여, 뒤이어 제2 기간(예를 들어, 1개월 내지 6개월, 또는 6개월 내지 1년) 동안 상이한 FVIII-활성 대체 폴리펩타이드 약물로의 전환(switching), 뒤이어 제1 약물로의 역전환 또는 더욱 또다른 FVIII-활성 대체 폴리펩타이드 약물로의 전환을 포함할 수 있다. 상이한 약물 치료의 상이한 아미노산 서열은, 하나의 약물에 대한 저해성 항체의 발달 위험에 있는 환자가 상이한 약물(예를 들어, 본 발명의 분자)로의 전환 후에는 더 이상 제1 약물(예를 들어, 에미시주맙)에 대한 저해성 항체의 위험에 있지 않음을 보장해야 한다. 순환 기간은 환자 및 의사의 편의성 및 선호도에 따라 다양해지거나 단축될 수 있다.

인코딩 핵산의 투여는 대안적인 치료법을 나타내고, 폴리펩타이드 약물을 직접적으로 투여하는 대신 수행될 수 있는 것으로 인식될 것이다.

주지된 바와 같이, 본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자는, 과민 반응, 동종-항체의 발달, 치료법의 중단을 유발하는 기관 독성 또는 다른 부작용의 발생이 없는 것(또는 미미함)과 관련하여 강한 안전성 프로파일을 갖는 것으로 여겨진다.

조항

하기 숫자매겨진 조항은 본 발명의 구현예를 나타내고, 설명의 일부이다.

1. FIXa 및 FX에 결합하고 FX의 FIXa-매개 활성화를 촉매화하는 이중특이적(bispecific) 항체로서, 상기 항체는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍(pair)을 포함하며,

제2 VH 도메인은 아미노산 서열 수준에서 T0201H VH 도메인 SEQ ID NO: 470과 적어도 95% 동일하며,

제1 VL 도메인 및 제2 VL 도메인은 각각, LCDR1이 SEQ ID NO: 6이며 LCDR2가 SEQ ID NO: 7이고 LCDR3이 SEQ ID NO: 8인 것으로 정의된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 LCDR 세트를 포함하고/하거나 제1 VL 도메인 및 제2 VL 도메인은 아미노산 서열 수준에서 0128L VL 도메인 SEQ ID NO: 10과 적어도 95% 동일한 것인, 이중특이적 항체.

2. FIXa 및 FX에 결합하고 FX의 FIXa-매개 활성화를 촉매화하는 이중특이적 항체로서, 상기 항체는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍을 포함하며,

제1 VL 도메인과 제2 VL 도메인은 둘 다 인간 면역글로불린 경쇄 v 및 j 유전자 분절의 재조합 생성물이고, v 유전자 분절은 IGLV3-21(예를 들어, VL3-21*d01)이며 j 유전자 분절은 IGLJ2(예를 들어, JL2*01) 또는 IGLJ3(예를 들어, JL3*02)인, 이중특이적 항체.

3. FIXa 및 FX에 결합하고 FX의 FIXa-매개 활성화를 촉매화하는 이중특이적 항체로서, 상기 항체는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍을 포함하며,

제1 VH 도메인은 N1280H VH 도메인 SEQ ID NO: 443과 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성을 갖고,

제2 VH 도메인은 T0201H VH 도메인 SEQ ID NO: 470과 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성을 가지며,

제1 VL 도메인 및 제2 VL 도메인은 각각 0128L VL 도메인 SEQ ID NO: 10과 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성을 갖는, 이중특이적 항체.

4. 조항 1 내지 3 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 제1 VH 도메인은, HCDR1이 SEQ ID NO: 406이며 HCDR2가 SEQ ID NO: 407이고 HCDR3이 SEQ ID NO: 408인 것으로 정의된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 HCDR 세트를 포함하는, 이중특이적 항체.

5. 조항 4에 있어서, 상기 제1 VH 도메인은 HCDR1 SEQ ID NO: 441을 포함하는, 이중특이적 항체.

6. 조항 4 또는 조항 5에 있어서, 상기 제1 VH 도메인은 HCDR2 SEQ ID NO: 634를 포함하는, 이중특이적 항체.

7. 조항 4 내지 6 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 제1 VH 도메인은 HCDR2 SEQ ID NO: 436을 포함하는, 이중특이적 항체.

8. 조항 4 내지 7 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 제1 VH 도메인은 HCDR3 SEQ ID NO: 635를 포함하는, 이중특이적 항체.

9. 조항 4 내지 8 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 제1 VH 도메인은 HCDR3 SEQ ID NO: 433을 포함하는, 이중특이적 항체.

10. 조항 1 내지 9 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 제1 VH 도메인은 N1280H와 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는, 이중특이적 항체.

11. 조항 1 내지 10 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 제1 VH 도메인은 N1280H HCDR1 SEQ ID NO: 441, N1280H HCDR2 SEQ ID NO: 436 및 N1280H HCDR3 SEQ ID NO: 433을 포함하는 N1280H HCDR 세트를 포함하는, 이중특이적 항체.

12. 조항 10 또는 조항 11에 있어서, 상기 제1 VH 도메인은 N1280H VH 도메인 SEQ ID NO: 443인, 이중특이적 항체.

13. 조항 1 내지 11 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 제1 VH 도메인은 N1454H VH 도메인 SEQ ID NO: 454인, 이중특이적 항체.

14. 조항 1 내지 11 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 제1 VH 도메인은 N1441H VH 도메인 SEQ ID NO: 456인, 이중특이적 항체.

15. 조항 1 내지 11 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 제1 VH 도메인은 N1442H VH 도메인 SEQ ID NO: 458인, 이중특이적 항체.

16. 조항 1 내지 3 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 제1 VH 도메인은 N1333H와 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는, 이중특이적 항체.

17. 조항 16에 있어서, 상기 제1 VH 도메인은 N1333H CDR1, N1333H CDR2 및 N1333H CDR3을 포함하는 N1333H CDR 세트를 포함하는, 이중특이적 항체.

18. 조항 16 또는 조항 17에 있어서, 상기 제1 VH 도메인은 N1333H VH 도메인인, 이중특이적 항체.

19. 조항 1 내지 3 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 제1 VH 도메인은 N1327H와 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는, 이중특이적 항체.

20. 조항 19에 있어서, 상기 제1 VH 도메인은 N1327H HCDR1, N1327H HCDR2 및 N1327H HCDR3을 포함하는 N1327H HCDR 세트를 포함하는, 이중특이적 항체.

21. 조항 19 또는 조항 20에 있어서, 상기 제1 VH 도메인은 N1327H VH 도메인인, 이중특이적 항체.

22. 조항 1 내지 3 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 제1 VH 도메인은 N1314H와 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는, 이중특이적 항체.

23. 조항 22에 있어서, 상기 제1 VH 도메인은 N1314H HCDR1, N1314H HCDR2 및 N1314H HCDR3을 포함하는 N1314H HCDR 세트를 포함하는, 이중특이적 항체.

24. 조항 22 또는 조항 23에 있어서, 상기 제1 VH 도메인은 N1314H VH 도메인인, 이중특이적 항체.

25. 조항 1 내지 3 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 제1 VH 도메인은 N1172H와 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는, 이중특이적 항체.

26. 조항 25에 있어서, 상기 제1 VH 도메인은 N1172H HCDR1, N1172H HCDR2 및 N1172H HCDR3을 포함하는 N1172H HCDR 세트를 포함하는, 이중특이적 항체.

27. 조항 25 또는 조항 26에 있어서, 상기 제1 VH 도메인은 N1172H VH 도메인인, 이중특이적 항체.

28. 조항 1 내지 3 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 제1 VH 도메인은 N1091H와 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는, 이중특이적 항체.

29. 조항 28에 있어서, 상기 제1 VH 도메인은 N1091H HCDR1, N1091H HCDR2 및 N1091H HCDR3을 포함하는 N1091H HCDR 세트를 포함하는, 이중특이적 항체.

30. 조항 28 또는 조항 29에 있어서, 상기 제1 VH 도메인은 N1091H VH 도메인인, 이중특이적 항체.

31. 조항 1 내지 3 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 제1 VH 도메인은 N0511H와 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는, 이중특이적 항체.

32. 조항 31에 있어서, 상기 제1 VH 도메인은 N0511H HCDR1, N0511H HCDR2 및 N0511H HCDR3을 포함하는 N0511H HCDR 세트를 포함하는, 이중특이적 항체.

33. 조항 31 또는 조항 32에 있어서, 상기 제1 VH 도메인은 N0511H VH 도메인인, 이중특이적 항체.

34. 조항 1 내지 3 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 제1 VH 도메인은 N0436H와 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는, 이중특이적 항체.

35. 조항 34에 있어서, 상기 제1 VH 도메인은 N0436H HCDR1, N0436H HCDR2 및 N0436H HCDR3을 포함하는 N0436H HCDR 세트를 포함하는, 이중특이적 항체.

36. 조항 34 또는 조항 35에 있어서, 상기 제1 VH 도메인은 N0436H VH 도메인인, 이중특이적 항체.

37. 조항 1 내지 36 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 제2 VH 도메인은 T0201H VH 도메인 SEQ ID NO: 470과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는, 이중특이적 항체.

38. 조항 37에 있어서, 상기 제2 VH 도메인은 T0201H HCDR1 SEQ ID NO: 462인 HCDR1, T0201H HCDR2 SEQ ID NO: 467인 HCDR2, 및/또는 T0201H HCDR3 SEQ ID NO: 468인 HCDR3을 포함하는, 이중특이적 항체.

39. 조항 1 내지 38 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 제2 VH 도메인은 HCDR1 SEQ ID NO: 636을 포함하는, 이중특이적 항체.

40. 조항 39에 있어서, 상기 제2 VH 도메인은 HCDR1 SEQ ID NO: 598을 포함하는, 이중특이적 항체.

41. 조항 1 내지 40 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 제2 VH 도메인은 HCDR2 SEQ ID NO: 467을 포함하는, 이중특이적 항체.

42. 조항 1 내지 41 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 제2 VH 도메인은 HCDR3 SEQ ID NO: 637을 포함하는, 이중특이적 항체.

43. 조항 42에 있어서, 상기 제2 VH 도메인은 HCDR3 SEQ ID NO: 638을 포함하는, 이중특이적 항체.

44. 조항 43에 있어서, 상기 제2 VH 도메인은 HCDR3 SEQ ID NO: 639를 포함하는, 이중특이적 항체.

45. 조항 44에 있어서, 상기 제2 VH 도메인은 HCDR3 SEQ ID NO: 565를 포함하는, 이중특이적 항체.

46. 조항 44에 있어서, 상기 제2 VH 도메인은 HCDR3 SEQ ID NO: 583을 포함하는, 이중특이적 항체.

47. 조항 37 내지 45 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 제2 VH 도메인은 SEQ ID NO: 632를 포함하는, 이중특이적 항체.

48. 조항 37 내지 45 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 제2 VH 도메인은 SEQ ID NO: 600을 포함하는, 이중특이적 항체.

49. 조항 37 내지 46 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 제2 VH 도메인은 SEQ ID NO: 585를 포함하는, 이중특이적 항체.

50. 조항 38에 있어서, 상기 제2 VH 도메인은 T0201H HCDR1, T0201H HCDR2 및 T0201H HCDR3을 포함하는 T0201H HCDR 세트를 포함하는, 이중특이적 항체.

51. 조항 37, 조항 38 또는 조항 50에 있어서, 상기 제2 VH 도메인은 선택적으로 Cys114에 치환을 갖는, T0201H VH 도메인인, 이중특이적 항체.

52. 조항 51에 있어서, Cys114에서의 치환은 Ile, Gln, Arg, Val 또는 Trp인, 이중특이적 항체.

53. 조항 1 내지 38 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 제2 VH 도메인은 T0638H HCDR1, T0638H HCDR2 및 T0638H HCDR3을 포함하는 T0638H HCDR 세트를 포함하는, 이중특이적 항체.

54. 조항 53에 있어서, 상기 제2 VH 도메인은 선택적으로 Cys114에 치환을 갖는, T0638 VH 도메인인, 이중특이적 항체.

55. 조항 54에 있어서, Cys114에서의 치환은 Ile, Gln, Arg, Val 또는 Trp인, 이중특이적 항체.

56. 조항 1 내지 55 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 제1 VL 도메인 및 제2 VL 도메인은 각각 0128L SEQ ID NO: 10과 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는, 이중특이적 항체.

57. 조항 1 내지 56 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 제1 VL 도메인 및 제2 VL 도메인은 각각 0128L LCDR1 SEQ ID NO: 6, 0128L LCDR2 SEQ ID NO: 7 및 0128L LCDR3 SEQ ID NO: 8을 포함하는 0128L CDR 세트를 포함하는, 이중특이적 항체.

58. 조항 1 내지 57 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 제1 VL 도메인 및 제2 VL 도메인은 아미노산 서열에서 동일한 것인, 이중특이적 항체.

59. 조항 58에 있어서, 상기 제1 VL 도메인 및 제2 VL 도메인은 0325L 아미노산 서열 SEQ ID NO: 416을 포함하는, 이중특이적 항체.

60. 조항 58 또는 조항 59에 있어서, 상기 제1 VL 도메인 및 제2 VL 도메인은 0128L 아미노산 서열 SEQ ID NO: 10을 포함하는, 이중특이적 항체.

61. 조항 1 내지 60 중 어느 한 조항에 있어서, 각각의 중쇄-경쇄 쌍은 CH1 도메인과 쌍형성된 CL 불변 도메인을 추가로 포함하는, 이중특이적 항체.

62. 조항 1 내지 61 중 어느 한 조항에 있어서, 중쇄-경쇄 쌍은 공통 경쇄를 포함하는, 이중특이적 항체.

63. 조항 62에 있어서, 상기 공통 경쇄는 0128L 경쇄의 CL 아미노산 서열 SEQ ID NO: 146을 포함하는, 이중특이적 항체.

64. 조항 63에 있어서, 상기 공통 경쇄는 0325L 경쇄 SEQ ID NO: 414인, 이중특이적 항체.

65. 조항 63에 있어서, 상기 공통 경쇄는 0128L 경쇄 SEQ ID NO: 405인, 이중특이적 항체.

66. 조항 1 내지 65 중 어느 한 조항에 있어서, 각각의 중쇄-경쇄의 중쇄는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제1 중쇄-경쇄 쌍 및 제2 중쇄-경쇄 쌍은 회합되어 중쇄 불변 영역의 이량체화를 통해 사량체성 면역글로불린을 형성하는, 이중특이적 항체.

67. 조항 66에 있어서, 상기 제1 중쇄-경쇄 쌍의 중쇄 불변 영역은 제2 중쇄-경쇄 쌍의 중쇄 불변 영역으로부터의 상이한 아미노산 서열을 포함하며, 상기 상이한 아미노산 서열은 중쇄 불변 영역의 헤테로이량체화를 촉진하도록 조작되는, 이중특이적 항체.

68. 조항 67에 있어서, 상기 중쇄 불변 영역은 납-인투-홀(knobs-into-holes) 돌연변이 또는 전하쌍 돌연변이를 포함하는, 이중특이적 항체.

69. 조항 67에 있어서, 하나의(예를 들어, 제1) 중쇄-경쇄 쌍의 중쇄 불변 영역은 치환 K439E를 포함하는 인간 IgG4 불변 영역이며, 다른(예를 들어, 제2) 중쇄-경쇄 쌍의 중쇄 불변 영역은 치환 E356K를 포함하는 IgG4 영역이고, 불변 영역 숫자매김은 EU 숫자매김 시스템에 따른 것인, 이중특이적 항체.

70. 조항 66 내지 69 중 어느 한 조항에 있어서, 하나 또는 둘 다의 중쇄-경쇄 쌍의 중쇄 불변 영역은 치환 S228P를 포함하는 인간 IgG4 불변 영역이고, 불변 영역 숫자매김은 EU 숫자매김 시스템에 따른 것인, 이중특이적 항체.

71. 조항 66 내지 70 중 어느 한 조항에 있어서, 하나의(예를 들어, 제1) 중쇄-경쇄 쌍의 중쇄 불변 영역은 SEQ ID NO: 409를 포함하고, 다른(예를 들어, 제2) 중쇄-경쇄 쌍의 중쇄 불변 영역은 SEQ ID NO: 410을 포함하는, 이중특이적 항체.

72. 조항 66 내지 71 중 어느 한 조항에 있어서,

제1 VH 도메인 아미노산 서열 SEQ ID NO: 443 또는 SEQ ID NO: 456를 포함하는 제1 중쇄,

제2 VH 도메인 아미노산 서열 SEQ ID NO: 632를 포함하는 제2 중쇄, 및

VL 도메인 아미노산 서열 SEQ ID NO: 416을 포함하는 공통 경쇄를 포함하는, 이중특이적 항체.

73. 조항 66 내지 72 중 어느 한 조항에 있어서,

아미노산 서열 SEQ ID NO: 419를 포함하는 제1 중쇄,

아미노산 서열 SEQ ID NO: 421을 포함하는 제2 중쇄, 및

아미노산 서열 SEQ ID NO: 414를 포함하는 공통 경쇄를 포함하는, 이중특이적 항체.

74. 조항 66 내지 71 중 어느 한 조항에 있어서,

아미노산 서열 SEQ ID NO: 424를 포함하는 제1 중쇄,

아미노산 서열 SEQ ID NO: 421을 포함하는 제2 중쇄, 및

75. 조항 66 내지 72 중 어느 한 조항에 있어서,

아미노산 서열 SEQ ID NO: 426을 포함하는 제1 중쇄,

아미노산 서열 SEQ ID NO: 421을 포함하는 제2 중쇄, 및

76. 조항 66 내지 71 중 어느 한 조항에 있어서,

아미노산 서열 SEQ ID NO: 428을 포함하는 제1 중쇄,

아미노산 서열 SEQ ID NO: 430을 포함하는 제2 중쇄, 및

77. 조항 66 내지 71 중 어느 한 조항에 있어서,

아미노산 서열 SEQ ID NO: 428을 포함하는 제1 중쇄,

아미노산 서열 SEQ ID NO: 432를 포함하는 제2 중쇄, 및

78. 조항 66에 있어서, 상기 제1 중쇄-경쇄 쌍의 중쇄 불변 영역은 상기 제2 중쇄-경쇄 쌍의 중쇄 불변 영역과 동일한 것인, 이중특이적 항체.

79. 조항 1 내지 68 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 항체는 인간 IgG인, 이중특이적 항체.

80. 조항 79에 있어서, 상기 항체는 인간 IgG4인, 이중특이적 항체.

81. 조항 79 또는 조항 80에 있어서, 상기 IgG는, 선택적으로 헤테로이량체화를 촉진하기 위해 하나 이상의 아미노산 치환으로 조작되는, IgG4-PE 중쇄 불변 영역 SEQ ID NO: 143을 포함하는, 이중특이적 항체.

82. 조항 79 또는 조항 80에 있어서, 상기 항체는 에미시주맙의 Fc 영역을 포함하는, 이중특이적 항체.

83. FIXa 및 FX에 결합하고 FX의 FIXa-매개 활성화를 촉매화하는 이중특이적 항체로서, 상기 항체는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍을 포함하며,

제1 중쇄-경쇄 쌍은 제1 VL 도메인과 쌍형성된 제1 VH 도메인을 포함하는 FIXa 결합 Fv 영역을 포함하고, 상기 제1 VH 도메인은 N1280H VH 도메인 SEQ ID NO: 443과 아미노산 서열에서 적어도 98% 동일하고,

제2 중쇄-경쇄 쌍은 제2 VL 도메인과 쌍형성된 제2 VH 도메인을 포함하는 FX 결합 Fv 영역을 포함하고, 상기 제2 VH 도메인은 T0999H VH 도메인 SEQ ID NO: 632와 아미노산 서열에서 적어도 98% 동일하고,

제1 중쇄-경쇄 쌍 및 제2 중쇄-경쇄 쌍은 각각 0325L 경쇄 아미노산 서열 SEQ ID NO: 414를 포함하는 공통 경쇄를 포함하는, 이중특이적 항체.

84. FIXa 및 FX에 결합하고 FX의 FIXa-매개 활성화를 촉매화하는 이중특이적 항체로서, 상기 항체는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍을 포함하며,

제1 중쇄-경쇄 쌍은 제1 VL 도메인과 쌍형성된 제1 VH 도메인을 포함하는 FIXa 결합 Fv 영역을 포함하고, 상기 제1 VH 도메인은 N1454H VH 도메인 SEQ ID NO: 454와 아미노산 서열에서 적어도 98% 동일하고,

85. FIXa 및 FX에 결합하고 FX의 FIXa-매개 활성화를 촉매화하는 이중특이적 항체로서, 상기 항체는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍을 포함하며,

제1 중쇄-경쇄 쌍은 제1 VL 도메인과 쌍형성된 제1 VH 도메인을 포함하는 FIXa 결합 Fv 영역을 포함하고, 상기 제1 VH 도메인은 N1441H VH 도메인 SEQ ID NO: 456과 아미노산 서열에서 적어도 98% 동일하고,

86. FIXa 및 FX에 결합하고 FX의 FIXa-매개 활성화를 촉매화하는 이중특이적 항체로서, 상기 항체는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍을 포함하며,

제1 중쇄-경쇄 쌍은 제1 VL 도메인과 쌍형성된 제1 VH 도메인을 포함하는 FIXa 결합 Fv 영역을 포함하고, 상기 제1 VH 도메인은 N1442H VH 도메인 SEQ ID NO: 458과 아미노산 서열에서 적어도 98% 동일하고,

제2 중쇄-경쇄 쌍은 제2 VL 도메인과 쌍형성된 제2 VH 도메인을 포함하는 FX 결합 Fv 영역을 포함하고, 상기 제2 VH 도메인은 T0736H VH 도메인 SEQ ID NO: 600과 아미노산 서열에서 적어도 98% 동일하고,

87. FIXa 및 FX에 결합하고 FX의 FIXa-매개 활성화를 촉매화하는 이중특이적 항체로서, 상기 항체는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍을 포함하며,

제2 중쇄-경쇄 쌍은 제2 VL 도메인과 쌍형성된 제2 VH 도메인을 포함하는 FX 결합 Fv 영역을 포함하고, 상기 제2 VH 도메인은 T0687H VH 도메인 SEQ ID NO: 585와 아미노산 서열에서 적어도 98% 동일하고,

88. FIXa 및 FX에 결합하고 FX의 FIXa-매개 활성화를 촉매화하는 이중특이적 항체로서, 상기 항체는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍을 포함하며,

제1 중쇄-경쇄 쌍은 제1 VL 도메인과 쌍형성된 제1 VH 도메인을 포함하는 FIXa 결합 Fv 영역을 포함하고, 상기 제1 VH 도메인은 N1333H VH 도메인과 아미노산 서열에서 적어도 98% 동일하고,

제2 중쇄-경쇄 쌍은 제2 VL 도메인과 쌍형성된 제2 VH 도메인을 포함하는 FX 결합 Fv 영역을 포함하고, 상기 제2 VH 도메인은 T0638H VH 도메인과 아미노산 서열에서 적어도 98% 동일하고,

제1 중쇄-경쇄 쌍 및 제2 중쇄-경쇄 쌍은 각각 0128L 경쇄 아미노산 서열 SEQ ID NO: 405를 포함하는 공통 경쇄를 포함하는, 이중특이적 항체.

89. 조항 1 내지 88 중 어느 한 조항에 있어서, FVIII-결핍 인간 혈액 혈장의 응고 시간을 aPTT 검정에서 40초 미만까지 감소시키는, 이중특이적 항체.

90. 조항 89에 있어서, FVIII-결핍 인간 혈액 혈장의 응고 시간을 aPTT 검정에서 30초 미만까지 감소시키는, 이중특이적 항체.

91. 조항 90에 있어서, FVIII-결핍 인간 혈액 혈장의 응고 시간을 aPTT 검정에서 22초 내지 28초까지 감소시키는, 이중특이적 항체.

92. 조항 91에 있어서, FVIII-결핍 인간 혈액 혈장의 응고 시간을 aPTT 검정에서 24초 내지 26초까지 감소시키는, 이중특이적 항체.

93. 조항 1 내지 92 중 어느 한 조항에 있어서, FX로부터 FXa로의 FIXa-매개 활성화를 FXase 검정에서 에미시주맙과 동일하거나 유사한 규모까지 증강시키는, 이중특이적 항체.

94. 조항 1 내지 93 중 어느 한 조항에 있어서, FX로부터 FXa로의 FIXa-매개 활성화를 에미시주맙과 적어도 동일한 규모까지 증강시키는, 이중특이적 항체.

95. 조항 89 내지 94 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 응고 시간 또는 FIXa-매개 활성화는 37℃에서 0.1 mg/ml, 0.3 mg/ml 또는 0.5 mg/ml의 항체 농도에서 결정된 바와 같은 것인, 이중특이적 항체.

96. 조항 1 내지 95 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 항체는 형광분석(fluorometric) 트롬빈 발생 검정(TGA: thrombin generation assay)에서 에미시주맙의 C_최대 EC50의 10% 이내에 있거나 C_최대 EC50보다 더 낮은, 상기 검정에서 C_최대에 대한 EC50을 갖고/갖거나 항체는 형광분석 TGA에서 200 내지 450 nM 트롬빈의 C_최대의 최대 반응을 발생시키는, 이중특이적 항체.

98. 조항 96에 있어서, 상기 항체는 형광분석 TGA에서 C_최대에 대해 50 nM 미만의 EC50을 갖는, 이중특이적 항체.

99. 조항 98에 있어서, 형광분석 TGA에서 C_최대에 대해 10 nM 미만의 EC50을 갖는, 이중특이적 항체.

100. 조항 1 내지 99 중 어느 한 조항에 있어서, C_최대에 대한 최대 반응은 250 nM 내지 400 nM인, 이중특이적 항체.

101. 조항 1 내지 100 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 항체는 형광분석 TGA에서 에미시주맙의 T_최대 EC50의 10% 이내에 있거나 T_최대 EC50보다 더 낮은, 상기 검정에서 T_최대에 대한 EC50을 갖고/갖거나 항체는 1분 내지 10분의 T_최대의 최대 반응을 발생시키는, 이중특이적 항체.

102. 조항 1 내지 101 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 항체는 형광분석 TGA에서 T_최대에 대해 5 nM 미만의 EC50을 갖는, 이중특이적 항체.

103. 조항 102에 있어서, T_최대에 대한 EC50은 2 nM 미만인, 이중특이적 항체.

104. 조항 1 내지 103 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 항체는 형광분석 TGA에서 2분 내지 8분의 T_최대의 최대 반응을 발생시키는, 이중특이적 항체.

105. 조항 1 내지 104 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 제1 중쇄-경쇄 쌍의 2개 복사체를 포함하는 항-FIXa 항체.

106. 조항 1 내지 104 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 제2 중쇄-경쇄 쌍의 2개 복사체를 포함하는 항-FX 항체.

107. 조항 1 내지 106 중 어느 한 조항에 따른 항체를 인코딩하는 단리된 핵산.

108. 시험관내 숙주 세포로서,

조항 1 내지 104 중 어느 한 조항에 정의된 바와 같은 제1 VH 도메인을 포함하는 항체 중쇄,

조항 1 내지 104 중 어느 한 조항에 정의된 바와 같은 제2 VH 도메인을 포함하는 항체 중쇄, 및/또는

조항 1 내지 104 중 어느 한 조항에 정의된 바와 같은 제1 또는 제2 VL 도메인을 포함하는 항체 경쇄를 인코딩하는 DNA를 포함하는, 숙주 세포.

109. 조항 108에 있어서,

아미노산 서열 SEQ ID NO: 419 또는 SEQ ID NO: 426을 포함하는 제1 중쇄,

아미노산 서열 SEQ ID NO: 421을 포함하는 제2 중쇄, 및

아미노산 서열 SEQ ID NO: 414를 포함하는 공통 경쇄를 인코딩하는 재조합 DNA를 포함하는, 숙주 세포.

110. 시험관내 숙주 세포 집단으로서, 각각의 숙주 세포는 조항 1 내지 104 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체를 인코딩하는 재조합 DNA를 포함하는, 숙주 세포 집단.

111. 조항 1 내지 104 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체의 생성을 위한 키트로서,

조항 1 내지 104 중 어느 한 조항에 정의된 바와 같은 제1 VH 도메인을 포함하는 항체 중쇄, 또는 상기 중쇄를 인코딩하는 핵산,

조항 1 내지 104 중 어느 한 조항에 정의된 바와 같은 제2 VH 도메인을 포함하는 항체 중쇄, 또는 상기 중쇄를 인코딩하는 핵산,

조항 1 내지 104 중 어느 한 조항에 정의된 바와 같은 제1 VL 도메인을 포함하는 항체 경쇄, 또는 상기 경쇄를 인코딩하는 핵산, 및

조항 1 내지 104 중 어느 한 조항에 정의된 바와 같은 제2 VL 도메인을 포함하는 항체 경쇄, 또는 상기 경쇄를 인코딩하는 핵산을 포함하는, 키트.

112. 조항 111에 있어서,

아미노산 서열 SEQ ID NO: 419 또는 SEQ ID NO: 426을 포함하는 제1 중쇄, 또는 상기 제1 중쇄를 인코딩하는 핵산,

아미노산 서열 SEQ ID NO: 421을 포함하는 제2 중쇄, 또는 상기 제2 중쇄를 인코딩하는 핵산, 및

아미노산 서열 SEQ ID NO: 414를 포함하는 공통 경쇄, 또는 상기 공통 경쇄를 인코딩하는 핵산을 포함하는, 키트.

113. 조항 111 또는 조항 112에 있어서, 상기 아미노산 서열 또는 상기 핵산은 세포에 제공되는, 키트.

114. 조항 111 또는 조항 112에 있어서, 상기 아미노산 서열 또는 상기 핵산은 무세포(cell-free) 완충 수성 배지에 제공되는, 키트.

115. 조항 111 내지 114 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 아미노산 서열 각각 또는 상기 핵산 각각은 별개의 약병에 제공되는, 키트.

116. 조항 1 내지 104 중 어느 한 조항에 따른 이중특이적 항체를 생성하는 방법으로서, 이중특이적 항체의 발현을 위한 조건 하에 조항 108 또는 조항 109에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 숙주 세포 배양물로부터 상기 이중특이적 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 방법.

117. 조항 116에 있어서, 적어도 100 리터의 부피를 포함하는 용기에서 상기 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.

118. 조항 117에 있어서, 상기 용기는 스테인리스강이거나 1회용 생물반응기인, 방법.

119. 조항 1 내지 104 중 어느 한 조항에 따른 이중특이적 항체 또는 조항 107에 따른 단리된 핵산을 약학적으로 허용 가능한 부형제와 함께 용액에서 포함하는 조성물.

120. 조항 119에 있어서, 상기 이중특이적 항체 또는 핵산은 멸균 수용액에 있는, 조성물.

121. 조항 119 또는 조항 120에 있어서, 조항 1 내지 104 중 어느 한 조항에 따른 이중특이적 항체를 포함하고, 상기 조성물이 5% 이하의 호모이량체성 항체 오염원을 포함하도록 상기 이중특이적 항체는 적어도 95% 순수한 것인, 조성물.

122. 조항 121에 있어서, 상기 조성물이 1% 이하의 호모이량체성 항체 오염원을 포함하도록 상기 이중특이적 항체는 적어도 99% 순수한 것인, 조성물.

123. 환자에서 출혈을 제어하는 방법으로서, 조항 119 또는 122 중 어느 한 조항에 따른 조성물을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.

124. 조항 119 내지 122 중 어느 한 조항에 있어서, 치료법에 의한 인체의 치료 방법에 사용하기 위한, 조성물.

125. 조항 119 내지 122 중 어느 한 조항에 있어서, 환자에서 출혈을 제어하는 방법에 사용하기 위한, 조성물.

125. 혈우병 A 환자에서 출혈을 제어하기 위한 약제의 제조에 있어서, 조항 1 내지 104 중 어느 한 조항에 따른 이중특이적 항체의 사용.

126. 조항 123 또는 조항 125에 있어서, 상기 환자는 혈우병 A 환자인, 방법, 사용하기 위한 조성물, 또는 사용.

127. 조항 126에 있어서, 상기 환자는 혈류 내 저해성 항체의 존재로 인해 FVIII에 의한 치료에 내성인, 방법 또는 사용하기 위한 조성물.

128. 조항 126 또는 조항 127에 있어서, 상기 환자는 혈류 내 저해성 항체의 존재로 인해 FIXa 및 FX에 대한 또 다른 이중특이적 항체에 의한 치료에 내성인, 방법 또는 사용하기 위한 조성물.

129. 조항 128에 있어서, 상기 환자는 에미시주맙에 의한 치료에 내성인, 방법 또는 사용하기 위한 조성물.

130. FVIIIa 활성을 대체하는 폴리펩타이드에 의한 치료를 받고 있는 혈우병 A 환자에서 저해성 항-약물 항체의 발달을 감소시키는 방법으로서,

제1 FVIIIa-활성 대체 폴리펩타이드 약물을 상기 환자에게 1 내지 12개월의 기간 동안 투여하는 단계,

제2의 상이한 FVIIIa-활성 대체 폴리펩타이드 약물을 상기 환자에게 1 내지 12개월의 기간 동안 스위칭(switch)하는 단계, 및

제1 항원-결합 분자 또는 제3의 상이한 FVIIIa-활성 대체 폴리펩타이드 약물을 상기 환자에게 1 내지 12개월의 기간 동안 스위칭하는 단계를 포함하고,

제1, 제2 또는 제3 FVIIIa-활성 대체 폴리펩타이드 약물은 조항 1 내지 104 중 어느 한 조항에 따른 이중특이적 항체이며,

각각의 경우, FVIIIa-활성 대체 폴리펩타이드 약물 또는 이의 인코딩 핵산은 환자에서 치료적 유효량으로 투여되어 FVIIIa를 기능적으로 대체하고, 임의의 FVIIIa-활성 대체 폴리펩타이드 약물에 대한 저해성 항-약물 항체를 발달시키는 환자의 위험성은 해당 FVIIIa-활성 대체 폴리펩타이드 약물에 의한 치료를 계속 받고 있는 환자와 비교하여 감소되는, 방법.

131. FVIIIa-활성 대체 폴리펩타이드 약물 또는 이의 인코딩 핵산을 포함하는, 저해성 항-약물 항체의 발달을 감소시키는 한편 혈우병 A 환자를 치료하는 방법에 사용하기 위한 조성물, 또는 저해성 항-약물 항체의 발달을 감소시키는 한편 혈우병 A 환자를 치료하는 방법에 사용하기 위한 약제의 제조를 위한 FVIIIa-활성 대체 폴리펩타이드 약물 또는 이의 인코딩 핵산의 사용으로서, 상기 방법은

제2의 상이한 FVIIIa-활성 대체 폴리펩타이드 약물을 상기 환자에게 1 내지 12개월의 기간 동안 스위칭하는 단계, 및

각각의 경우, FVIIIa-활성 대체 폴리펩타이드 약물 또는 이의 인코딩 핵산은 환자에서 치료적 유효량으로 투여되어 FVIIIa를 기능적으로 대체하고, 임의의 FVIIIa-활성 대체 폴리펩타이드 약물에 대한 저해성 항-약물 항체를 발달시키는 환자의 위험성은 해당 FVIIIa-활성 대체 폴리펩타이드 약물에 의한 치료를 계속 받고 있는 환자와 비교하여 감소되는, 사용하기 위한 조성물, 또는 사용.

132. 조항 130 또는 조항 131에 있어서, 상기 제1, 제2 및 제3 FVIIIa-활성 대체 폴리펩타이드 약물은 임의의 순서의 재조합 또는 혈장-유래 FVIII, 에미시주맙, 및 조항 1 내지 104 중 어느 한 조항에 따른 이중특이적 항체인, 방법, 사용하기 위한 조성물, 또는 사용.

133. 조항 123 내지 132 중 어느 한 조항에 있어서, 상기 치료는 상기 환자에게의 상기 조성물의 피하 투여를 포함하는, 방법, 사용하기 위한 조성물, 또는 사용.

등가물: 당업자는 일상적인 실험 이상을 사용하지 않으면서 본원에 기재된 본 발명의 구체적인 구현예에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 첨부된 청구항의 보호 범위 내에 있고자 한다.

실시예

인간 FIXa 및 인간 FX에 대한 Fv 결합 부위를 포함하는 이중특이적 IgG 항체를, 2018년 6월 22일에 출원된 발명의 명칭이 "Bispecific antibodies for factor IX and factor X"인 PCT/EP2018/066836(WO2018/234575)에 기재된 바와 같이 발생시켰다. 본원에 기재된 바와 같이, 면역화 및 스크리닝의 광범위한 캠페인은 항-FIXa 항체 NINA-0128의 식별을 유발하였으며, 이는 상이한 항-FX 결합 Fv의 임의의 선택과 IgG 포맷에서 쌍형성될 때, 테나제 검정 및 aPTT 검정을 포함하여 기능적 스크린에서 두드러진 활성을 보여주었다. NINA-0128은 VH 도메인 N0128H 및 VL 도메인 0128L을 포함한다. 다수의 N0128H VH 도메인의 변이체가 발생되고 시험되었으며, 예를 들어, N0436H VH 도메인을 포함하여 이중특이적 포맷에서 기능의 추가 향상을 초래하였다.

해당 작업 상에서 구축되어, 이중특이적 IgG는 공통 경쇄로서 NINA-0128의 VL 도메인과 함께 설계되었다. 항-FX 항체 패널을, 인간 면역글로불린 유전자를 포함하는 유전자이식 마우스에서 생체내에서 발생시켰다. 이들은 인간 불변 영역을 포함하는 공통 경쇄에서 0128L VL 도메인을 사용하여, 항-FIX 결합 아암으로서 NINA-0128과 함께 공동-발현되었다. 하나의 VH 도메인, T0200은 이중특이적 포맷에서 두드러진 활성을 보여주었으며, 추가 개발을 위해 선택되었다. T0200H 클론과 동일한 면역화된 동물로부터 수득된 구조적으로 관련된 항체는, 항-FIX VH 도메인 및 0128L 공통 경쇄를 갖는 이중특이적 IgG4에서 T0200H VH 도메인보다 심지어 더 양호하게 수행한 항-FX VH 도메인을 추가로 포함하였다.

한편, 공통 0128L VL 도메인을 보유하면서도 VH 도메인에 돌연변이를 도입하는 추가의 항-FIXa 항체 변이체를 발생시켰다. CDR1, CDR2 및 CDR3 내 각각의 위치에서 모든 가능한 아미노산을 치환하며, 공통 경쇄를 포함하는 이중특이적 항체의 맥락에서 생성된 VH 도메인 변이체를 발현시키고, 광범위한 기능적 검정에서 변이체 이중특이적 항체를 평가하며, 증가된 기능적 활성과 관련된 돌연변이를 식별하고, 증가된 기능적 활성과 관련된 돌연변이의 조합을 포함하는 추가 변이체를 발생시킴으로써, 항-FIXa N0436H VH 도메인 서열을 최적화하였다.

향상된 T0200H VH 도메인 변이체를 향상된 N0436H VH 도메인 변이체와 조합하였으며, 각각은 N0128L 공통 경쇄와 쌍형성되었고, 최적화, 스크리닝 및 선택의 반복된 라운드(round)를 수행하였다.

도 6은 스크리닝 프로그램의 단순화된 개요를 도시한다.

매우 강한 FVIII 미메틱 활성은 최적화된 서열을 포함하는 공통 경쇄 이중특이적 항체로 달성되었다. 하기 이중특이적 항체는 다양한 질환-관련 검정에서 기능적 특징화에 의해 나타난 바와 같이, 강한 수행인자의 예이다. 공통 경쇄를 갖는 이중특이적 항체의 명명법은 IXAX-nnnn.tttt.llll이며, nnnn은 항-FIX VH 도메인의 4 디지트 숫자 식별자(digit numerical identifier)이고, tttt는 항-FX VH 도메인의 4 디지트 숫자 식별자이며, llll 은 공통 VL 도메인의 4 디지트 숫자 식별자이다:

IXAX-0128.0201.0128 (항-FIXa VH 도메인 N0128H; 항-FX VH 도메인 T0201H; 0128L 공통 경쇄)

IXAX-0436.0201.0128

IXAX-0511.0201.0128

IXAX-1091.0201.0128

IXAX-1172.0201.0128

IXAX-1280.0201.0128

IXAX-1341.0201.0128

IXAX-1327.0201.0128

IXAX-1333.0201.0128

이중특이적 항체에서 상기 및 다른 항-FIX VH 도메인과 널리 조합되는 다른 고성능 항-FX VH 도메인은 T0201H 계통 및 이의 변이체, 예컨대 도 11에 나열된 것 및 다른 관련된 서열이었다. 특히 양호한 결과는 하기로부터 선택되는 항-FIX VH 도메인, 항-FX VH 도메인 및 공통 경쇄를 포함하는 이중특이적 항체로 수득되었다:

예를 들어,

IXAX-1280.0999.0325

IXAX-1454.0999.0325

IXAX-1441.0999.0325

IXAX-1441.0736.0325

IXAX-1442.0687.0325

본원에 기재된 이중특이적 항체는 본원에 기재된 바와 같은 치료적 사용을 위한 후보 약학적 약물 분자를 나타낸다. 이들은, 특히 기존의 치료가 항-약물 항체의 존재로 인해 더 이상 효과적이지 않은 환자에서 이러한 기존의 치료, 예컨대 에미시주맙에 대한 대안을 제공함으로써 환자에게 중요한 헬스케어 옵션을 제공할 수 있다.

이들 실시예에서, 기준 항체 AbE 또는 항체 E는 에미시주맙의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 갖는 이중특이적 항체이다[3].

실시예 1. 공통 경쇄를 갖는 항-FX 항체 패널의 생성

0128L VL 도메인을 공통 경쇄를 발현하는 유전자이식 마우스를 인간 인자 X로 면역화하였다. 항원 특이적 B 세포를 유세포분석에 의해 단일 세포 분류하고, VH 및 VL 서열을 차세대 시퀀싱(NGS)에 의해 검색하였다. 200개의 항-FX 중쇄를 단일 세포 분류된 림프구의 NGS 분석에 의해 식별하였다. 추가의 벌크 NGS 분석을 동일한 이식유전자 동물로부터 수합된 골수 및 림프절 조직 상에서 수행하였다.

실시예 2. 공통 경쇄를 갖는 항-FIXaxFIX 이중특이적 항체의 생성

각각의 항-FX 중쇄를, HEK293 세포에서 항-FIX N0128H 중쇄 및 0128L 공통 경쇄를 포함하는 이중특이적 항체로서 발현시켰다. 이중특이적 항체를, 본원에 참조로서 포함된 2018년 6월 22일에 출원된 발명의 명칭이 "Bispecific antibodies for factor IX and factor X"인 PCT/EP2018/066836에 실질적으로 기재된 바와 같은 단백질 A에 의해 정제하였다.

실시예 3. 활성화 응고 인자 VIII(FVIIIa)-유사 활성 검정(FXase 또는 테나제 검정)을 사용한 항-FX 아암의 초기 스크리닝

각각이 N0128H 항-FIX 중쇄 및 0128L 공통 VL 도메인과 조합된 광범위한 상이한 항-FX 중쇄를 포함하는 200개의 이중특이적 항체를 인자 Xa 세대 검정을 사용하여 스크리닝하였다. 이러한 기능적 스크리닝은 FVIIIa-미메틱 활성, 즉, 시험관내에서 효소적 "FXase"에 의해 FX로부터 FXa로의 FIXa-매개 활성화를 증강(촉매)시키는 능력을 검출한다. 이 검정에서, 시험 이중특이적 항체를, FXa의 형성에 적합한 조건 하에 인지질의 존재 하에, FIXa 및 FX와 접촉시킨다. FXa에 의해 절단될 때 검출 가능한 생성물을 발생시키는 FXa에 대한 기질을 첨가한다. 시험 이중특이적 항체의 존재 하에 이러한 생성물의 검출을, 시험 항체가 존재하지 않는 음성 대조군(대조군 항체가 포함될 수 있음)과 비교한다. 검출된 신호를, 반응 용액의 흡광도를 405 nm에서 기록함으로써 정량화한다. 흡광도를 검정에서 광범위한 항체 농도에 걸쳐 측정하고, EC50 값을 이 검정에서 이중특이적 항체 약효의 척도로서 계산한다. 시험 항체와 대조군 사이의 EC50의 유의한 차이는, 상기 시험 항체가 FX의 FIXa-매개 활성화를 증강시킬 수 있음을 나타낸다. 도 7.

결과

검정된 모든 이중특이적 항체 중에서, 단일 항체는 두드러진 FXase 활성을 보여주었으며: 0128L 공통 VL 도메인과 쌍형성된 N0128H 항-FIX 중쇄 및 T0200H 항-FX 중쇄는 패널 내의 모든 다른 것들보다 뚜렷하게 더 높은 FXase 활성을 가졌다. 도 8.

재료 & 방법 - 표준 FXase 반응 조건.

재조합 항체를 생성하는 Expi293 세포로부터의 5 μL 상층액 및 7.5 μL FIX(3.75 μg/mL)(실시예 8)를 검정 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 2.5 μL FXIa(10 ng/mL), 5 μL FX(50 ng/mL), 0.05 μL 인지질(10 mg/mL) 및 5 μL TBSB-S 완충액의 혼합물을 각각의 웰에 첨가하여, 효소 반응(FX의 FIXa 절단으로 FXa를 발생시킴)을 개시하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 60분째에, 5 μL의 0.5 M EDTA를 첨가함으로써 반응을 종결시켰다. 10 μL S2765 기질 용액을 각각의 웰에 첨가한 후, 405 nm(기준 파장 655 nm)에서의 흡광도를 30분 동안 측정하였다(10분당 1회 판독). 모든 반응을 달리 정의되지 않는 한, 37℃에서 수행하였다.

TBSB:

0.1% 소 혈청 알부민을 함유하는 Tris 완충 식염수

7.5 mL TBSB를 만들기 위해:

0.1 mL 7.5% BSA 용액(Sigma)

7.4 mL 1X TBS 용액(20X TBS 용액 ThermoFisher로부터 희석됨)

TBSB-S:

5 mM CaCl2 및 1 mM MgCl2를 함유하는 TBSB

100 mL TBSB-S를 만들기 위해:

99.4 mL TBSB

0.5 mL 1 M CaCl2 (Sigma)

0.1 mL 1 M MgCl2 (Sigma)

FXIa 스탁 용액(10 μg/mL):

10 mL TBSB-S를 0.1 mg FXIa(Enzyme Research Laboratories)에 첨가하여 10 μg/mL 스탁 용액을 만든다.

사용 전에 10 ng/mL(1:1,000) 작업 용액으로 희석시킨다.

F.IXa 스탁 용액(5 μg/mL)

100 mL TBSB-S를 0.5 mg FIXa(HFIXa 1080)(Enzyme Research Laboratories)에 첨가하여 5 μg/mL 스탁 용액을 만든다.

사용 전에 1.0 μg/mL(1:5) 작업 용액으로 희석시킨다.

FIX 스탁 용액(37.5 μg/mL):

13.3 mL TBSB-S를 0.5 mg FIX(Enzyme Research Laboratories)에 첨가하여 37.5 μg/mL 스탁 용액을 만든다.

사용 전에 3.75 μg/mL(1:10) 작업 용액으로 희석시킨다.

FX 작업 용액(50 μg/mL):

16 mL TBSB-S를 0.8 mg FX(Enzyme Research Laboratories)에 첨가하여 50 μg/mL 작업 용액을 만든다.

사용 전에 추가 희석이 필요하지 않다.

S2765 스탁 용액:

25 mg S2765(Chromogenix) 색원체 기질(0.035 mmol)

2 mM 스탁 용액을 만들기 위해:

17.493 mL 물을 바이얼에 첨가하고 진탕(shaking)으로 용해시킨다.

폴리브렌 용액:

0.6 g/L 헥사디메트린 브로마이드 스탁 용액을 만들기 위해:

0.15 g 헥사디메트린 브로마이드(Sigma)를 250 mL 물에 첨가한다.

사용 전에 0.6 mg/L(1:1,000) 작업 용액으로 희석시킨다.

S2765 기질 작업 용액

2 mM S-2765 스탁 용액과 0.6 mg/L 폴리브렌 용액의 1:1 혼합물.

실시예 4. 항-FX T0200H VH 도메인의 식별

N0128H 항-FIX VH 도메인, T0200H 항-FX VH 도메인 및 0128L 공통 경쇄를 포함하는 IXAX.0128.0200.0128로 지정된 이중특이적 항체는 다른 이중특이적 항체와 비교하여 높은 FXase 활성을 실증하였다. T0200H VH 도메인을 추가 개발을 위해 선택하여, 더욱 추가의 향상된 이중특이적 항체의 생성을 시도하였다.

실시예 5. 항-FX T0200H VH 도메인의 최적화

계통발생(phylogenetic) 분석

벌크 NGS(실시예 1) 및 계통발생 분석으로부터, 113개의 항-FX 중쇄는 항-FX 중쇄 T0200H와 동일한 림프구 클러스터에 속하는 것으로 식별되었다. 클러스터는, 공통 진화 계통을 공유하는 것으로 보이는 B 세포를 나타낸다. 클러스터 내의 항-FX 중쇄는 아미노산 수준에서 T0200H와 대략 95%의 서열 동일성을 공유하였다. 도 9.

113개의 항-FX 중쇄는, 상이한 항-FIX 중쇄 및 0128L 공통 경쇄의 패널을 갖는 이중특이적 항체에서 발현되고, FXase 검정에 의해 스크리닝되었다.

본 발명자들은, 이중특이적 항체로서 검정될 때 T0200H VH 도메인과 비교하여 증가된 FXase 활성을 보여준 몇몇 항-FX-중쇄를 식별하였다. 도 10은 Xase 검정으로부터의 실시예 데이터를 도시한다.

가장 활성인 FX 아암 서열의 선택은 도 11에 도시되어 있다. 이들 VH 도메인을 각각 T0201H 내지 T0217H로 지정하였다. 이중특이적 포맷에서 가장 강한 활성을 갖는 것은 T0204, T0207, T0205 및 T0201(도 10b)이었다.

아미노산 서열 비교를 사용하고, 기능적 데이터에 의해 뒷받침되어, 본 발명자들은, 가장 활성인 VH 도메인에서 상이하고 T0200H와 비교하여 증강된 생물학적 활성에 기여할 수 있는 항-FX 중쇄의 프레임워크 및 CDR 영역에서 몇몇 아미노산 잔기를 식별하였다. 예를 들어, VH 도메인의 하기 아미노산 특질 중 하나 이상은 VH 도메인을 함유하는 이중특이적 항체의 FVIII-미메틱 활성을 증가시킬 수 있다(IMGT 잔기 숫자매김):

FR1 내 위치 5에서 이소류신(I)에 의한 발린(V)의 대체;

FR1 내 위치 13에서 글루타민(Q)에 의한 라이신(K)의 대체;

FR2 내 위치 39에서 메티오닌(M)에 의한 류신(L)의 대체;

CDR2 내 위치 62에서 세린(S)에 의한 트레오닌(T)의 대체;

CDR2 내 위치 64에서 세린(S)에 의한 아스파르테이트(D)의 대체;

FR3 내 위치 85에서 세린(S)에 의한 트레오닌(T)의 대체;

CDR3 내 위치 112에서 세린(S)에 의한 알라닌(A)의 대체.

그렇지만, 활성은 심지어 이들 아미노산 치환이 없어도 높은 것이 분명한데, 왜냐하면 T0200H 자체가 이중특이적 항체에서 강한 활성을 보여주기 때문이고, 이들 치환 중 어느 것도 상위 VH 도메인 모두에 일관적으로 존재하지 않았다(도 11).

기능적 최적화를 위한 표적화된 돌연변이생성

VH 도메인 T0201H의 CDR3은 VH 도메인의 라이브러리를 제공하기 위해 체계적으로 돌연변이화되었으며, 각각의 위치에서의 잔기는 또 다른 아미노산에 의해 개별적으로 대체되었다. 생성된 VH 도메인은 T0XXXH로 명명되었으며, XXX 숫자는 IMGT 위치 114(Cys), 115(Leu), 116(Gln) 및 117(Leu)의 돌연변이체에 대해 도 12에 도시되어 있다. IMGT 숫자매김에 대해서는 도 13을 참조한다.

잠재적인 개발 부담의 제거

CDR3에 존재하는 쌍형성되지 않은 시스테인(C) 잔기는 고위험 서열 모티프로서 식별되었다. 벌크 NGS 분석으로부터 식별된 T0200H의 CDR3 및 모든 113개의 추가 항-FX VH 도메인 내의 위치 114에 존재하는 이러한 쌍형성되지 않은 시스테인은 이중특이적 항체의 개발에 대한 책임(liability)을 나타낸다. 본 발명자들은 T0201H 내의 이 위치에서 시스테인에 대한 모든 다른 아미노산의 치환을 함유하는 VH 도메인을 스크리닝하였다. 이들 새로운 변이체를 IgG4 이중특이적 항체로서 N1280H(실시예 6 참조) 및 0128L 공통 경쇄와 함께 발현시키며, 단백질 A에 의해 정제하고, FXase 검정에 의해 FVIII 미메틱 활성에 대해 스크리닝하였다. 위치 114에서 이소류신(I), 글루타민(Q), 아르기닌(R), 발린(V) 또는 트립토판(W)에 의한 시스테인의 대체는 T0201H 또는 T0202H VH 도메인을 갖는 이중특이적 항체와 유사한 FVIII 미메틱 활성을 갖는 이중특이적 항체를 초래하였다. 본 발명자들은, C114가 여러 가지 다른 아미노산으로 대체되고 FVIII 미메틱 활성을 여전히 유지할 수 있다고 결론내린다.

실시예 6. 항-FIX VH의 체계적인 서열 최적화

CDR1, CDR2 and CDR3 내의 각각의 아미노산 잔기를 개별적으로 돌연변이화하여, 항-FIX N0128H 중쇄의 단일 위치 돌연변이체를 발생시켰다. 이렇게 해서 발생된 항-FIX 중쇄 변이체를, HEK293에서 항-FX 중쇄 T0201H 및 N0128L 공통 VL 도메인과 쌍형성된 이중특이적 포맷에서 발현시켰다.

단백질 A 정제된 이중특이적 항체를 FXase(실시예 7) 및 aPTT에 의해 생물학적 활성에 대해 검정하여, 이중특이적 항체의 FVIII-미메틱 활성을 향상시킨 아미노산 변화를 알아내었다. 그 후에, 향상된 변이체를 조합하여, CDR1, CDR2 및 CDR3 영역에서 이중 또는 삼중 돌연변이체를 발생시켰다.

표 N은 CDR의 하나 이상의 잔기가 다른 아미노산으로 돌연변이화된 N0128H VH 도메인의 돌연변이체를 식별한다. 예를 들어, N0436H VH 도메인은 N0128H VH 도메인의 Ser->Ile 돌연변이체이며, 즉, CDR3 내 IMGT 위치 111A에서의 세린은 이소류신에 의해 대체된다. 추가의 잔기 돌연변이를 초기 단일 돌연변이의 상부 상에 도입하였다. 예를 들어, N0511H VH 도메인은 N0436H VH 도메인의 Ser112ALys 돌연변이체이며, 즉, CDR3 내 IMGT 위치 112A에서의 세린은 라이신에 의해 대체된다. N1172H는 N0511H VH 도메인의 Glu64Arg 돌연변이체이며, 즉, CDR2 내 IMGT 위치 64에서의 글루타메이트는 아르기닌에 의해 대체된다. N1280H는 N1172H VH 도메인의 Thr29Arg 돌연변이체이며, 즉, CDR1 내 IMGT 위치 29에서의 Thr은 아르기닌에 의해 대체된다. 다른 명명된 VH 도메인은 표 N으로부터 동일한 방식으로 식별될 수 있다.

IMGT 숫자매김에 대해서는 도 14를 참조한다.

실시예 7. FXase 검정에서 향상된 이중특이적 항체의 스크리닝

실시예 5에 기재된 바와 같이 발생된 VH 도메인 변이체를 포함하는 항-FX 아암을, 실시예 6에 기재된 바와 같이 발생된 VH 도메인 변이체를 포함하는 항-FIX 아암과 조합하여, FIXAxFX 이중특이적 항체를 발생시키고, 테나제 검정에서 기능적 활성에 대해 스크리닝하였으며, 상기 VH 도메인은 0128L 공통 VL 경쇄와 쌍형성되었다.

결과

실시예 데이터는 도시되어 있다:

도 10.

도 15.

도 16.

고도로 활성인 이중특이적 항체를 항-FIX VH 도메인과 항-FX VH 도메인의 몇몇 조합에 대해 식별하였으며, 각각은 0128L 공통 VL 도메인과 쌍형성되었다. 항-FIX VH 도메인과 항-FX VH 도메인 조합의 예는 도 16에 도시되어 있다.

항-FX VH 도메인의 정체성은 이들 이중특이적 아암 조합에 대해 항-FIX VH 도메인의 동일성보다 더 강한 영향을 갖는 것으로 나타났으며, T0638H, T0616H, T0596H 및 T0663H가 그 중에서도 최고-수행 항-FX VH 도메인이다. 이들 항-FX 도메인은 도 16에 도시된 것과 같은 N1280H의 변이체를 포함하여 여러 가지 항-FIX 아암과 널리 조합되어 수행되었다. 항-FIX VH 도메인 서열은 첨부된 표 N을 참조로 하여 식별된다. 항-FX VH 도메인 서열은 도 12를 참조로 하여 식별된다.

임의의 3개의 CDR 내 아미노산 잔기를 변형시킴으로써 N128 이중특이적 항체의 FVIII-미메틱 활성을 순차적으로 최적화하였다. 몇몇 아미노산 잔기는 CDR에 걸쳐 FVIII 미메틱 활성을 증가시키는 것으로 식별되었고, 이들 돌연변이를 조합하여 활성을 최대화하였다. N0128H VH 도메인을 갖는 항체의 FVIII 미메틱 활성은 하기 순서에서 추가의 VH 도메인에 의해 점진적으로 향상되었다: N0128H -> N0436H -> N0511H -> N1091H -> N01172H -> N1280H -> N1333H. 도 17.

재료 & 방법 - 변형된 FXase 반응 조건.

이중특이적 항체 FVIII 미메틱 활성에 대한 초기 스크리닝을 실시예 3에서 상기 제시된 표준 FXase 반응 조건을 사용하여 평가하였다. 이중특이적 항체의 FVIII 미메틱 활성이 증가함에 따라, 표준 FXase 반응 조건은 FXase 활성에서의 향상을 검출하기에 더 이상 충분하지 않았다. 따라서, 더욱 민감한 변형된 FXase 반응 조건을 확립하였다.

이러한 변형된 검정은 하기 방식에서 표준 FXase 반응 조건과 상이하다: FXIa를 사용하지 않으며, 활성화된 형태의 인자 IX(FIXa)를 사용하고, 인큐베이션 단계는 존재하지 않는다. 모든 FXase 시약을 이중특이적 항체와 혼합하고, 37℃로 설정된 Envision 플레이트 판독기를 사용하여 405 nm에서 30초마다 40 내지 50회 반응 용액의 흡광도를 기록함으로써 FXa 세대를 검출한다.

18.45 μl TBSB-S 완충액을 0.05 μl 인지질(10 mg/ml)과 혼합하고, 피펫팅에 의해 격렬히 혼합하여, 인지질을 분산시켰다. 이 혼합물에 1.5 μl FIXa(1 μg/ml) 및 5 μl의 FX(50 μg/ml)를 5 μl의 폴리브렌(0.6 mg/L) 및 5 μl S2765(4 mM)와 조합하였으며, 모두 37℃까지 예열시켰다. 마지막으로, FXase 활성에 대해 조사중에 있는 5 ul의 이중특이적 항체를 첨가하였다. 405 nm(기준 파장 655 nm)에서의 흡광도를 30초마다 40회 내지 50회 기록하였다.

실시예 8. 혈장 응고 검정에서 향상된 이중특이적 항체의 스크리닝

실시예 5에 기재된 바와 같이 발생된 VH 도메인 변이체를 포함하는 항-FX 아암을, 실시예 6에 기재된 바와 같이 발생된 VH 도메인 변이체를 포함하는 항-FIX 아암과 조합하여, FIXaxFX 이중특이적 항체를 발생시켰으며, 상기 VH 도메인은 0128L 공통 VL 경쇄와 쌍형성되었다. 본 발명의 이중특이적 항체가 혈우병 A 환자의 혈액 응고 능력을 교정하는 능력을 결정하기 위해, FVIII 결핍 혈장을 사용하여 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT)에 미치는 이들 항체의 효과를 검사하였다.

여러 가지 농도를 갖는 5 μL의 이중특이적 항체 용액, 20 μL의 FVIII 결핍 혈장(Helena Biosciences), 및 25 μL의 aPTT 시약(APTT Si L Minus, Helena Biosciences)의 혼합물을 37℃에서 3분 동안 가온시켰다. 25 μL의 25 mM CaCl₂(Helena Biosciences)를 혼합물에 첨가함으로써 응고 반응을 개시하였다. 응고까지의 기간을 측정하였다. 이에 사용된 장비는 C-4 4 채널 응고 분석기(Helena Biosciences)였다.

결과의 시료를 도 18에 도시한다.

후속적으로, 최고 응고 시간-단축 효과를 나타낸 이중특이적 항체에 대해 농도 의존성을 결정하였다.

예를 들어, IXAX-1280.0201.0128 IgG4 항체는 기준 항체 AbE(양성 대조군)와 필적할 만한, aPTT에서의 용량 의존적 저하를 실증하였다. 도 19. aPTT에서 어떠한 감소도 이소타입 대조군 항체에 대해서는 관찰되지 않았다. 이 검정에 사용된 항체 조제물이, 단백질 A 상에서 1-단계 정제의 결과였고, 요망되는 이중특이적 분획 외에도 잔여 항-FIX 단일특이적 항체 및 잔여 항-FX 단일특이적 항체를 함유하였음을 주목한다.

실시예 9. 이중특이적 항체에서 항-FIX VH 도메인의 분석

실시예 7 및 실시예 8에 기재된 것을 포함하여 여러 가지 기능적 검정으로부터의 데이터를 고려하여, 항-FX VH 도메인 T0201 및 이의 서열 변이체가 공통 경쇄를 갖는 이중특이적 항체에서 여러 가지 항-FIX VH 도메인과 조합되어 양호하게 수행되었음을 주지하였다. 예를 들어, 항-FIX VH 도메인 N0128H, N0436H, N0511H, N1091H, N1172H, N1280H, N1314H, N1327H 및 N1333H는 모두 이중특이적 항체에서 양호한 기능적 활성을 제공하였다. 이들 항-FIX VH 도메인은 밀접한 구조적 관계를 공유한다. 도 20. 이의 성능은, 치환(표 N)을 통한 잔기의 미세한 조정 및 향상된 활성과 관련된 치환의 조합에 의해 추가로 증강될 수 있었다.

실시예 10. 항원-결합에 대한 친화도

항체-항원 상호작용의 결합 친화도 및 동역학을 SPR을 사용하여 결정하였다. 정제된 시험 항체(모든 IgG4PE)의 친화도 및 동역학을, 양성 대조군으로서 비교자 항-FIX 항체 AbN 또는 비교자 항-FX 항체 AbT 및 음성 대조군으로서 이소타입 대조군(ISTC)과 비교하였다.

FIX에 대한 결합 친화도

분석된 항-FIX 항체는 대략 0.18 μM 내지 0.3 μM의 친화도 범위에서 FIX에의 결합 및 FIX에 대한 신속한 회합(k_on) 및 해리(_koff) 속도를 보여주었다. 분석된 항-FIX 항체는 비교자 항체 AbN과 비교하여 FIX에의 약간 더 높은 결합 친화도 및 더 높은 회합 속도를 보여주었다. FIX에 대한 어떠한 결합도 ISTC로는 관찰되지 않았다. 표 E-10-1.

FX에 대한 결합 친화도

분석된 항-FX 항체는 대략 0.1 μM 내지 1.4 μM의 친화도 범위에서 FX에의 결합 및 FX에 대한 신속한 회합(k_on) 및 해리(_koff) 속도를 보여주었다. FX에 대한 어떠한 결합도 ISTC로는 관찰되지 않았다.

항-FX 항체는, 벤치마크 항체 AbT와 비교하여 FX에 대해 유사한 결합 친화도를 분석하였다.

재료 & 방법

SPR을 사용하여, FIX 또는 FX 각각에 대한 결합 친화도(K_D), 동역학 상수 온-레이트(k_on) 및 오프-레이트(k_off)를 결정하였다. Biacore 8K(GE Healthcare) 시스템을 사용하여 분석을 수행하였다.

항-인간 IgG Fc 항체를 CM4 칩(GE Healthcare) 상에 제조업체의 설명서에 따라 고정시켰다. 칩 표면을 아민 커플링에 의해 활성화시키고, 1 M 에탄올아민으로 차단시켰다. 25℃에서 HBS-EP를 고정화 전개 완충액으로서 사용하여 고정화를 수행하였다.

단백질 A 상에서 정제되었던 단일특이적 항체(리간드로서 지칭됨)를 대략 2 μg/ml에서 항-인간 IgG Fc CM4 표면 상으로 포착하였다. 리간드를 모든 8개의 유동 채널 중 모든 활성 채널에서 10 μl/분에서 60초 동안 주사하였다. 25℃에서 중성 pH HBS-P 1X + CaCl₂ 2.5 mM을 전개 완충액으로서 사용하여 전개를 수행하였다.

인간 FIX(MW ~55 KDa) 또는 인간 FX(분석물)(MW ~58 KDa)를 전개 완충액에서 1 mg/ml로 재구성하고, 분석물로서 사용하였다. 분석물을 활성 채널과 기준 채널 둘 다에서, 다수 사이클 동역학(MCK) 모드에서 3개 농도(1.5 μM, 500 nM 및 166.7 nM)에서 120초의 회합기 및 200초(FIX의 경우) 또는 300초(FX의 경우) 해리기로, 30 μl/초의 유속에서 주사하였다. 10 μl/분에서 60초 동안 10 mM 글리신 pH 1.5의 3개 주사를 재생기에 사용하였다.

항-FIX 분석에 대해, ISTC 항체 hIgG4PE를 1 μg/ml에서 60초 동안 기준 채널에서 10 μl/분에서 포착하였다. hIgG4PE ISTC 및 hIgG1 ISTC는 또한, 활성 채널에서 음성 대조군으로서 포착되었다. 단일특이적 항체 AbN을 양성 대조군으로서 사용하였다.

항-FX 분석을 위해, hIgG4PE ISTC는 또한, 활성 채널에서 음성 대조군으로서 포착되었다. 단일특이적 항체 AbT를 양성 대조군으로서 사용하였다.

회합 속도 상수(kon), 해리 속도 상수(koff) 및 해리 상수(KD)에 대한 값을, BIAevaluation 소프트웨어에 의해 결합 데이터로부터 계산하였다. 데이터를 기준으로 하며 완충액을 차감하고 1 단계 생물분자 반응(랭뮤어 1:1) 모델로 적합화시켰다. 해리의 처음 30초를 모델에서 평가하였다.

실시예 11. FX 및 FIX에의 이중특이적 항체의 동시 결합

FIXxFX 이중특이적 항체 IXAX-0436.0202.0128이 FIX 및 FX에 동시에 결합하는 능력을, SPR을 사용하여 실증하였다. 정제된 이중특이적 항체의 결합 동역학을 이소타입 대조군(ISTC)과 비교하였다. 결합에 대한 센서그램은, FIX 및 FX에의 결합이 ISTC로 관찰되지 않은 한편, 이중특이적 항체가 FIX 및 FX에 동시에 결합하였음을 나타내었다. 도 21a.

FIX는 제1 분석물과의 결합을 허용하기 위해 이중특이적 항체로 포착된 표면에 걸쳐 유동하였다(flown). 이중특이적 항체 사이의 상호작용은 센서그램 도 21에 도시된 바와 같이 기준선 반응을 발생시켰다. 제2 분석물, FX의 뒤이은 주사는, FX가 이미 FIX와 복합체를 이룬 이중특이적 항체에 결합함을 나타내는 신호의 추가 증가를 발생시켰다.

대조적으로, FIX 및 FX가, 이소타입 대조군이 포착된 표면에 걸쳐 유동되었을 때 FIX 또는 FX에의 어떠한 결합도 관찰되지 않았으며, 이는 이중특이적 항체에 대한 FI과 FX 사이의 상호작용의 특이성을 실증하였다. 도 21a.

이중특이적 항체에 대한 센서그램을 또한, 단일특이적 항체에 대한 센서그램과 비교할 수 있다. 포착된 항체가 항-FX 단일특이적 분자일 때, 동일한 시리즈의 주사는 FIX가 유동될 때 임의의 유의한 반응을 제공하지 않으며 대신에 제2 주사가 수행될 때(1:1 혼합물) 대략 50 반응 단위(RU)가 관찰되며 한편 이중특이적 분자에 의해서는 반응이 25 RU 더 높다. 도 21b.

FVII-미메틱 이중특이적 항체의 주요 특질은, FIX 및 FX에 동시에 결합하여, FIXa에 의한 FX로부터 FXa로의 전환을 촉진하는 능력이다. 관찰된 결합은, 본원에 기재된 이중특이적 항체가 인자 IX 및 인자 IX와 동시에 상호작용할 수 있다는 생물물리학적 확인을 나타내며, 이는 첨부된 실시예에 기재된 기능적 데이터와 일치한다.

재료 & 방법

Biacore 8K(GE Healthcare) 시스템을 사용하여 SPR 분석을 수행하였다.

단백질 A 포착에 의해, 뒤이어 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제되었던 이중특이적 항체(리간드)를 대략 2 μg/ml에서 항-인간 IgG Fc CM4 표면 상으로 포착하였다. 리간드를 하나의 활성 채널에서 10 μl/분에서 60초 동안 10 μg/ml로 주사하였다. 25℃에서 중성 pH HBS-P 1X + CaCl₂ 2.5 mM을 전개 완충액으로서 사용하여 전개를 수행하였다.

인간 FIX 및 인간 FX(분석물)를 전개 완충액에서 1.15 mg/ml로 재구성하고, 분석물로서 사용하였다. 분석물을 180초 동안 10 μM에서 단독으로 주사하거나 10 μl/분에서 1:1(10 μM 10 μM) 혼합하여 주사하였다.

이소타입 대조군 hIgG4PE 항체를 10 μg/ml에서 60초 동안 음성 대조군으로서 기준 채널에서 10 μl/분에서 포착하였다. 완충액의 블랭크 주사를, 이중 기준 과정에 사용될 모든 시료에 대해 수행하였다. 30 μl/분에서 30초 동안 10 mM 글리신 pH 1.5의 3개 주사를 재생기에 사용하였다. 데이터를 기준으로 하며 완충액을 차감하고 랭뮤어 1:1 모델로 적합화시켰다.

실시예 12. 항-FX VH의 추가 최적화

이중특이적 항체의 항-FIX 결합 아암을, N1280H의 CDR을 포함하는 VH 도메인 및 0128L의 CDR을 포함하는 VL 도메인으로서 "고정"한 한편, 추가 개선을 항-FX VH 도메인에 수행하여 성능을 향상시켰다. 0128L을 공통 경쇄로서 사용하였다.

표 T는 CDR의 하나 이상의 잔기가 다른 아미노산으로 돌연변이화된 T0201H VH 도메인의 돌연변이체를 식별한다. 상기 표는 식별된 돌연변이를 갖는 각각의 변이체 VH 도메인에 주어진 명칭을 보여준다. 각각의 경우, 지시된 것 이외의 잔기는 변하지 않은 채 있다. 예를 들어, T0616H VH 도메인은 T0201H VH 도메인의 Leu115Ile 돌연변이체이며, 즉, CDR3 내 IMGT 위치 115에서의 류신(L)은 이소류신(I)에 의해 대체된다. T0201H VH 도메인에 단일 돌연변이를 함유하는 변이체에 추가 잔기 변화를 도입하여, T0201H VH 도메인에서 상이한 돌연변이의 조합을 나타내는 추가 변이체를 초래하였다. 예를 들어, T0687H VH 도메인은 T0201H VH 도메인의 Ser111APhe, Cys114Val, Leu115Ile 돌연변이체이며, 즉, CDR3 내 IMGT 위치 111A에서 세린은 페닐알라닌에 의해 대체되며(T0537H 돌연변이), CDR3 내 IMGT 위치 114에서 시스테인은 발린에 의해 대체되고(T0606H 돌연변이), IMGT 위치 115에서 류신은 이소류신에 의해 대체된다(T0616H 돌연변이). 다른 명명된 항-FX VH 도메인의 서열은 표 T로부터 동일한 방식으로 식별될 수 있다. IMGT 숫자매김에 대해서는 도 13을 참조한다.

단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제된 이중특이적 항체를, T0201H VH 도메인을 포함하는 모 이중특이적 분자를 능가하는 향상에 대해 확인하기 위해 기능적 활성에 대해 시험하였다.

향상된 항체는 FXase 검정(실시예 7에 상술된 바와 같은 변형된 FXase 반응 조건을 사용함) 및 aPTT 검정(실시예 8에 상술된 바와 같은 방법)에서 식별되었다.

HCDR3의 돌연변이생성은 FVIII 미메틱 활성에서 향상을 발휘하였다. 향상된 활성을 실증하는 VH 도메인의 HCDR은 도 25에 나타나 있다. 예를 들어, T0201H VH 도메인 CDR3에서 각각의 하기 치환 및 치환들의 조합은 FVIII 미메틱 활성을 향상시키는 것으로 밝혀졌다(괄호 안에 표시된 것은 생성된 VH 도메인의 명칭임)(비-배제적 목록):

CDR3 내 Gln116Met (T0638H VH);

CDR3 내 Leu115Ile (T0616H VH);

CDR3 내 Ser111APhe (T0537H VH);

Cys114Ile Leu115Ile (T0666H VH);

Ser111APhe Cys114Ile Leu115Ile (T0678H VH);

Ser111APhe Cys114Leu Leu115Ile (T0681H VH);

Ser111APhe Cys114Val Leu115Ile (T0687H).

T0201H의 HCDR3 돌연변이생성을 결론내리자면, VH 도메인 T0687H, T0678H 및 T0681H는 이중특이적 항체에서 가장 강한 활성을 실증하였다.

이중특이적 항체의 기능적 활성을, 항-FX 아암에서 HCDR1 및 HCDR2의 돌연변이생성을 통해 더욱 추가로 향상시켰다. T0681H로 출발하여, CDR1 및 CDR2의 각각의 아미노산 잔기를 모든 다른 가능한 아미노산에 의해 체계적으로 대체하여, 표 T에서 식별된 T0690H 내지 T0993H로 숫자매겨진 VH 도메인을 발생시켰다.

aPTT 및 TGA 분석을 또한 수행하여, HCDR1 변이체의 기능적 평가를 뒷받침하였다. VH 도메인 T0736(S29K 돌연변이), T0713, T0734, T0742, T0774 및 T0785는 T0681H와 비교하여 향상된 활성을 보여주었다. T0681H의 HCDR1 변이체의 기능적 분석에 기초하여, VH 도메인 T0736H를 상위 수행자로서 선택하였다. T0201H와 비교하여, T0736H는 CDR1에서의 Ser29Lys 치환을 CDR3에서의 Ser111APhe Cys114Val 및 Leu115Ile 치환과 조합한다.

FXase, aPTT 및 TGA 분석을 또한 수행하여, HCDR2 변이체의 기능적 평가를 뒷받침하였다. T0681H의 HCDR2 변이체의 기능적 분석에 기초하여, 하기 VH 도메인은 T0681H와 비교하여 향상된 활성을 갖는 것으로 식별되었다: T0926H(S62K), T850H(I56L), T0925H(S62L), T0951H(G63S), T0958H(S64D), T0989(T65R) 및 T0990H(T65S).

그 후에, 선택된 CDR1 및 CDR2 변이체를 선택된 CDR3과 조합하여, 추가 VH 도메인 변이체를 발생시켜 활성에서 가능한 추가 향상을 조사하였다.

고성능 항체에 대한 FXase 검정 데이터는 도 22 및 도 23에 요약되어 있다. aPTT 검정 데이터를 도 24에 요약한다.

도 22 및 23에 도시된 VH 도메인을 포함하는 이중특이적 항체는, T0201H를 포함하는 이중특이적 항체와 비교하여 향상된 또는 유사한 응집 시간을 실증하였으며, T0999H는 aPTT 검정에서 최단 응집 시간을 실증하였다.

FXase 활성 및 응집 시간은 비교자 이중특이적 항체 AbE와 필적할 만하였다.

도 25는 돌연변이생성 과정 동안 FVIII 미메틱 활성에 대해 점진적으로 향상되었던 VH 도메인의 CDR을 식별한다.

실시예 13. 트롬빈 발생 검정에서 이중특이적 항체의 강한 활성

트롬빈 발생 검정(TGA)은 혈액 혈장에서 프로트롬빈으로부터 트롬빈으로의 활성화를 검출한다. 트롬빈이 발생됨에 따라, 이는 형광원성 기질을 형광단으로 전환시키며, 이러한 형광단은 플레이트 판독기에 의해 계속해서 모니터링된다. TGA는 FVIII-결핍 혈장에서의 응고 캐스케이드에서 FVIII에 대해 치환하는 이중특이적 항체의 능력의 강력한 척도를 제공하며, TGA에서 트롬빈 발생의 동역학은 FVIII-미메틱 약물의 생체내 치료적 성능의 지표로서 고도로 신뢰할 만한 것으로 여겨진다.

결과

TGA 촉발제로서 인자 IXa에 대한 적합한 농도를 확립하기 위해, 본 발명자들은 초기에 고정된 농도의 이중특이적 항체를 이용하여 TGA를 수행하였으며, 한편, 촉발제 시약에 존재하는 FIXa의 농도는 다양하게 하였다. 본 발명자들은, 222 nM FIXa를 함유하는 1 ml MP 시약의 스탁 용액이 정상적인 풀링된 인간 혈장(최종 농도, 0.33 nM FIXa)에 대해 트롬빈 발생을 418.11 nM 트롬빈의 C_최대, 7.67분의 T_최대, 및 5.83분의 지체 시간으로 촉발하기에 충분하다고 결정하였다. 도 26. 이들 값은 건강한 성인(예를 들어, 참조 [11]의 표 3 참조)에서 기준 범위와 필적할 만하고, TGA 촉발제로서의 FIXa의 사용을 입증한다.

이중특이적 항체 VH 도메인 T0201H 및 T0201H의 CDR1, CDR2 및 CDR3 조합적 변이체는 HEK 세포에서 FIX N1280H 아암 및 N0128 공통 경쇄와 함께 발현되며, 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제되고, 133 nM 및 80 nM의 최종 농도에서 분석되었다. VH 도메인 변이체는 T0201H와 비교하여 지체 시간의 단축, C_최대의 증가 및 피크까지의 더 짧은 시간을 나타내었으며, T0999는 분석된 농도 둘 다에서 최대 트롬빈 피크 높이 및 피크까지의 최단 시간을 실증하였다. 적어도 IXAX-1280.0999.0128의 성능은 AbE 및 에미시주맙 칼리브레이터의 성능과 필적할 만하였다. AbE는 각각 2.5분, 291.8 nM 및 6.0분의 지체 시간, 피크 높이 및 피크까지의 시간을 실증하였으며, IXAX-1280.0999.0128은 2.0분, 317.2 nM 및 5분의 지체 시간, 피크 높이 및 피크까지의 시간을 실증하였다. 도 27. 도 28. 도 27에 예시된 바와 같이 그리고 T_최대를 증가시키기 위해, 본 발명자들은 T0999, T0687, T0736, T0678, T0681, T0666, T0201 및 T0596을 각각 포함하는 이중특이적 항체에 대해 5, 6.83, 6.83, 7, 7.67, 13.17, 15 및 15.67분의 T최대를 관찰하였다.

용량 반응 TGA에 대해, 이중특이적 항체 IXAX-1280.0999.0128은 HEK 세포에서 발현되며, 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제되고, 이중특이적 헤테로이량체는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 0.3 nM FIXa 촉발제를 사용하여, TGA에서 C_최대(nM) 및 T_최대(분) 용량 반응은 이중특이적 항체 IXAX-1280.0999.0128로 스파이킹된 FVIII 결핍 혈장 상에서 수행하고 에미시주맙 칼리브레이터에 대해 비교하였다. 이중특이적 항체 둘 다, 증가하는 항체 농도에 따라 C_최대에서 선형 저하를 실증하였다. IXAX-1280.0999.0128은 칼리브레이터 항체보다 더 큰 C_최대를 달성하였으며, 이러한 증가는 더 낮은 이중특이적 항체 농도에서 더욱 두드러졌다. 도 29를 참조한다.

재료 & 방법

TGA 촉발제로서 적합한 농도의 인자 IXa를 확립하기 위한 초기 실험 작업에 대해, 건강한 개체(Helena Biosciences)로부터 취한 80 μl 정상적인 풀링된 혈장을 Immulon 2HB 투명 U-바닥 96웰 플레이트(ThermoFisher # 3665)에서 20 μl의 촉발제 시약(다양한 양의 FIXa만 함유하는 인지질로 이루어진 마이크로입자(MP) 시약)과 혼합하였다. 모든 시약을 제조업체의 설명서에 따라 수조에서 37℃로 예열시켜 사용하였다.

일단 0.33 nM FIXa의 최종 농도가 정상 혈장에 대해 트롬빈 발생을 촉발하기에 충분한 것으로 결정되면, 0.3 nM FIXa를 포함하는 동일한 검정 조건을 보정 자동화된 트롬보그램 검정에서 FVIII-결핍 혈장과 함께 적용하였다.

FVIII 면역결핍 혈장(Helena Biosciences)을 Immulon 2HB 투명 U-바닥 96웰 플레이트에서 20 μl의 촉발제 시약(222 nM FIXa만 함유하는 인지질로 이루어진 마이크로입자(MP) 시약, 최종 농도 0.33 nM)과 혼합하였다. 모든 시약을 제조업체의 설명서에 따라 수조에서 37℃로 예열시켜 사용하였다. TGA 용량 반응을, 5회 지점에 걸쳐 3 중 1 희석 시리즈로 300 nM의 시험 이중특이적 항체 또는 에미시주맙 칼리브레이터(FVIII 결핍 혈장으로 스파이킹된 에미시주맙(Enzyme Research Laboratories))에서 출발하여 수행하였다. 인간 IgG4 이소타입 대조군 항체를 음성 대조군으로서 사용하고, PBS로 스파이킹된 정상(FVIII+ve) 풀링된 혈장을 양성 대조군으로서 사용하였다.

시료를 2벌로 측정하였으며, 동일한 혈장에서 트롬빈 칼리브레이터(예정된 양의 트롬빈을 함유함)를 함유하는 2벌 칼리브레이터 웰이 동반되었다. 96웰 플레이트를 Fluoroskan Ascent 플레이트 판독기(Thermo)에서 10분 동안 37℃까지 가온시켰다. 트롬빈 발생은 20 μl FluCa 시약(형광원성 기질, ZGGR-AMC(2.5 mM), 100 mM CaCl₂를 함유하는 완충액 중)의 첨가 시 시작되었다. TGA 시약을 Stago로부터 수득하였다. 시간 경과에 따른 형광의 증가를 플레이트 판독기에 의해 모니터링하였다.

트롬빈 칼리브레이터 곡선을 조사중인 각각의 시료와 함께 전개시켰다. 기지의 농도의 트롬빈과 함께 칼리브레이터를 사용하여, 조사 하의 시료에서 발생된 트롬빈의 양을, 소프트웨어 ThrombinoscopeBV를 사용하여 수득된 형광 신호로부터 계산할 수 있다. 시험 웰로부터의 형광을 트롬빈 칼리브레이터 웰로부터의 형광에 대해 보정하여, 시험 웰에서 발생된 등가 트롬빈을 결정하였다.

Stago 분석 소프트웨어를 사용하여 전개 데이터를 분석하였다. 기지의 활성을 갖는 트롬빈 칼리브레이터 곡선을 사용하여, 발생된 트롬빈의 양을 결정하였다. 트롬보그램의 하기 양태를 결정하였다: 지체 시간(분), 내인성 트롬빈 잠재력(ETP; 트롬보그램 아래 면적, nM 트롬빈/분), 피크 높이(C_최대; nM 트롬빈), 피크까지의 시간(T_최대/분), 속도 지수(VI; nM/분, 지체 시간과 피크까지의 시간 사이의 기울기) 및 테일 시작(분; 트롬빈 발생이 종료되었을 때의 시간).

실시예 14. 트롬빈 발생 검정에서 용량 반응 및 약효

이중특이적 항체 IXAX-1280.0999.0325의 최대 트롬빈 피크 높이(C_최대, nM 트롬빈) 및 피크까지의 시간(T_최대, 분)을 평가하기 위해, 본 발명자들은 실시예 13에 제시된 방법에 따라 완전 항체 농도 용량 반응을 사용하여 인간 FVIII-결핍 혈장에서 트롬빈 발생 검정(TGA)을 수행하였다. 용량 반응 곡선으로부터 발생된 데이터는 비-선형 로그[항체] 대 반응 매개변수 가변 기울기 모델(예를 들어, 4 매개변수 로지스틱 회귀 모델)을 사용하여 적합화되었다. AbE를 비교를 위해 포함시켰다. 이 검정에 사용된 IXAX-1280.0999.0325 및 AbE는 질량 분광법에 의해 100% 헤테로이량체에 근접한 것으로 결정되었으며, 호모이량체성 오염원은 검출되지 않았다.

45 내지 4.5 μg/ml와 동등한 300 내지 30 nM을 스패닝하는 전향적 치료 창에 걸쳐, 본 발명자들은 분석된 모든 농도에서 AbE와 비교하여 IXAX-1280.0999.0325에 대해 동등한(10% 이내) 또는 더 큰 C_최대(nM 트롬빈) 값을 관찰하였다(도 30). IXAX-1280.0999.0325의 C_최대는, 이중특이적 항체의 농도가 100 내지 300 nM였을 때 정상 혈장 대조군의 C_최대에 근접하였다(도 30 및 도 31). 대조적으로, AbE의 C_최대만 IgG 농도가 300 nM일 때 정상 수준에 도달하였다. 이 연구에서, IXAX-1280.0999.0325(8.0 nM)의 EC50은 AbE의 EC50(54.4 nM)의 대략 15%였다.

C_최대 곡선을 사용하여, IXAX-1280.0999.0325는 이의 농도가 8 μg/mL 이상일 때 45 μg/mL의 에미시주맙과 동일한 활성을 달성할 수 있는 것으로 예측될 수 있으며, 이는 에미시주맙과 비교하여 IXAX-1280.0999.0325가 갖는 잠재적인 효능 이점을 시사한다.

T_최대에 관한 것인 점을 제외하고는 동일한 용량 반응의 분석에서, 본 발명자들은 분석된 모든 농도에서 AbE와 비교하여 IXAX-1280.0999.0325에 대해 동등한(10% 이내) 또는 더 짧은(또는 단축된) T_최대 값을 관찰하였다(도 32). 수득된 T_최대 값에 기초하여 계산된 EC50 값은, AbE(정사각형)에 대한 2.8 nM과 비교하여 IXAX-1280.0999.0325(원형)에 대해 1.65 nM이다.

도 30 및 도 32에 나타낸 치료 범위에 관하여, 본 발명자들은 각각 AbE와 비교하여 더 크고 더 짧은 IXAX-1280.0999.0325 C_최대 및 T_최대 용량 반응 곡선을 관찰하였다.

3개의 추가의 이중특이적 항체(BiAb 2, 3 및 4)의 활성을 또한 TGA에서 평가하고, 상업적으로 입수 가능한 인간 FVIII-결핍 혈장(Helena Biosciences)에서 상업적으로 입수 가능한 에미시주맙 칼리브레이터(Enzyme Research Laboratories) 및 IXAX-1280.0999.0325(BiAb 1)의 성능에 대해 비교하였다. BiAb는 하기와 같았으며, 각각은 2개의 중쇄에 대해 각각 중쇄 불변 영역 SEQ ID NO: 409 및 SEQ ID NO: 410, 및 공통 경쇄에 람다 경쇄 불변 영역 SEQ ID NO: 146을 포함한다:

1. IXAX-1280.0999.0325. 항-FIX 중쇄 SEQ ID NO: 419, 항-FX 중쇄 SEQ ID NO: 421, 공통 경쇄 SEQ ID NO: 414.

2. IXAX-1454.0999.0325. 항-FIX 중쇄 SEQ ID NO: 424, 항-FX 중쇄 SEQ ID NO: 421, 공통 경쇄 SEQ ID NO: 414.

3. IXAX-1441.0999.0325. 항-FIX 중쇄 SEQ ID NO: 426, 항-FX 중쇄 SEQ ID NO: 421, 공통 경쇄 SEQ ID NO: 414.

4. IXAX-1442.0736.0325. 항-FIX 중쇄 SEQ ID NO: 428, 항-FX 중쇄 SEQ ID NO: 430, 공통 경쇄 SEQ ID NO: 414.

BiAb_1, 2, 3 및 4는 트롬빈 피크 높이(C_최대)를 용량-의존적으로 증가시켰고, 피크까지의 시간(T_최대)을 에미시주맙과 동일한 방식으로 용량-의존적으로 저하시켰다. BiAb_1에 대한 C_최대 곡선의 상한은 에미시주맙(334.8 nM)보다 더 높아서 약 368 nM에서 측정되었다. BiAb_1, 2, 3, 및 4의 EC50(C_최대)은 서로 유사하였으며, 각각 6.45 nM, 5.87 nM, 5.2 nM 및 4.81 nM의 계산된 EC50을 가졌고, 이는 에미시주맙의 EC50(18.33 nM)의 26% 내지 35%의 EC50을 나타낸다. 도 33a. 계BiAb_1 내지 BiAb_4에 대해 계산된 EC50(T_최대) 값은 에미시주맙에 대한 2.53 nM과 비교하여 각각 0.56 nM, 0.65 nM, 1.08 nM 및 0.93 nM이었다. 도 33b.

제3 연구에서, BiAb_1(IXAX-1280.0999.0325)을, 인간 FVIII-결실 혈장에서 TGA 검정을 사용함으로써 상업적으로 입수 가능한 에미시주맙 칼리브레이터와 다시 비교하였다. BiAb_1은 트롬빈 피크 높이(C_최대)를 용량-의존적으로 증가시켰고, 피크까지의 시간(T_최대)을 용량-의존적으로 저하시켰다. 도 34. BiAb_1에 대한 C_최대 곡선의 상한은 에미시주맙(286.3 nM)보다 더 높아서 약 396.5 nM이었다. EC50 of BiAb_1은 에미시주맙의 EC50(25.9 nM)의 대략 30%인 7.7 nM이었다.

검정 대 검정 변동은 도 34, 도 33 및 도 30에서 도시된 바와 같이 TGA 사이에서 관찰되며, BiAb_1은 각각 대략 400 nM, 375 nM 및 375 nM의 C_최대를 나타내었고, 에미시주맙은 275 nM, 300 nM 및 350 nM의 C_최대를 나타내었다. 절대 판독에서의 변동에도 불구하고, 관찰된 트렌드는 TGA의 각각의 경우에 동일하였다.

요약하자면, 상업적으로 입수 가능한 에미시주맙 칼리브레이터 또는 발생된 기준 항체 AbE를 이용한 TGA 데이터는 에미시주맙과 비교하여 BiAb_1(IXAX-1280.0999.0325)에 대해 효능 이점을 일관되게 나타내었다. 이점은 또한, 시험된 다른 항체(BiAb_2, BiAb_3 및 BiAb_4)로도 관찰되었다.

에미시주맙의 FDA 약제학 검토에 따르면, 0의 연간 출혈률(ABR: annualized bleeding rate) 중앙값은 ≥ 45 μg/mL의 에미시주맙 정상 상태 트로프 혈장 농도애서 달성될 것이다[17]. 상기 기재된 TGA로부터의 C_최대 곡선을 사용하여, BiAb_1은 이의 농도가 2 내지 4 μg/mL 이상일 때 45 μg/mL의 에미시주맙과 동일한 활성을 달성할 수 있는 것으로 예측될 수 있다. 이러한 관찰은, 에미시주맙과 관련하여 잠재적인 효능 및/또는 투약 이점을 시사한다. 활성 차이는 잠재적으로, 이중특이적 항체가 에미시주맙보다 더 낮은 용량 및/또는 덜 빈번하게 투여될 때 동일한 치료 효과를 달성할 수 있음을 의미하며, 이는 임상 이점을 나타낸다. 더 높은 C_최대가 더욱 강력한 응혈원 능력에 대한 잠재성을 나타내긴 하지만, 이러한 증가의 규모는 안전성 염려와 관련이 있을 것 같지는 않다.

실시예 15. 최적화된 항체 아암의 친화도

정제된 항-FIX 항체 및 항-FX 항체가 이의 각각의 항원에 결합하기 위한 친화도 및 동역학을 상기 실시예 10에 기재된 바와 같이 SPR에 의해 결정하였다.

항-FIX 항체는 대략 0.05 μM 내지 0.3 μM(50 내지 300 nM)의 친화도 범위로 FIX에의 결합을, 이중특이적 항체에서의 더 큰 활성과 상관관계가 있는 증가하는 친화도(더 낮은 K_D) 및 더 빠른 오프-레이트의 일반적인 경향과 함께 보여주었다.

표 E15-1.

실시예 16. 초기 생물물리학적 평가

이중특이적 항체의 발현을 평가하기 위해, IXAX-1172.0201.0128을 미니풀 분석을 위한 대표적인 항체로서 선택하였다. 미니풀 분석은, 다량(적어도 1 g/l)의 헤테로이량체성 이중특이적 항체를 발현하는 CHO 안정하게 형질주입된 세포의 스크리닝을 가능하게 하고, 안정한 이중특이적 항체 발현을 평가하는 수단을 나타낸다.

안정하게 형질주입된 CHO-K1 세포에 대한 표준 Lonza 유가식 과다성장 프로토콜을 사용하여, 이중특이적 항체를 발현시켰다. 형질주입 후, 5000개의 생존 가능한 세포를 웰당 분취하여, 다수의 미니풀을 발생시켰다. 8개를 옥텟(Octet)에 의해 측정된 바와 같이 항체 역가에 기초하여 포워드하였다.

세포를 수집하며, 여과하고, 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제하여, 항체를 상층액으로부터 단리하였다. 항체 농도(mg)를 OD280에 의해 정량화하며, 항체의 총량(mg)을 시료의 부피 및 세포 배양 부피에 따라 지정된 정제 수율(mg/L)에 기초하여 그에 맞게 계산하였다. 이미지화된 모세관 등전 집중(icIEF: imaged capillary isoelectic focusing)Protein Simple, Maurice)을 사용하여, 각각의 8개 미니풀 시료에서 헤테로이량체 및 호모이량체의 상대 백분율을 결정하였다. FIX 및 FX에 대해 일시적으로 발현된 기준 호모이량체 아암을 사용하여, 호모이량체 및 헤테로이량체 피크를 지정하였다.

본 발명자들은 대략 95% 이하의 헤테로이량체(예를 들어, MP_1 및 MP_7에 대해 도시된 바와 같음, 도 35)로 대략 1 g/L 이중특이적 항체를 발현하는 안정하게 형질주입된 세포를 단리할 수 있었다.

FXase 검정에서 이중특이적 항체 활성은 0.99의 피어슨 상관 계수로 헤테로이량체 %와 상관관계가 있었다(도 36).

실시예 17. 이중특이적 항체의 정제

이중특이적 항체의 2개의 중쇄 및 1개의 공통 경쇄의 공동-발현은 이중특이적 항체 + 단일특이적 항체 부산물을 포함하는 조성물을 발생시킨다. 이들은 단일특이적 호모이량체와 비교하여 이중특이적 헤테로이량체의 등전점의 차이를 활용하는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다.

이중특이적 항체 IXAX-1280.0999.0128은 항-FIX 중쇄 SEQ ID NO: 419, 항-FX 중쇄 SEQ ID NO: 421, 및 공통 경쇄 SEQ ID NO: 405를 포함한다. 이중특이적 항체를 HEK 세포에서 이들 폴리펩타이드의 공동-발현 후 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 정제하여, 항체를 세포 상층액으로부터 단리하고, 뒤이어 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 헤테로이량체를 단리하였다.

이중특이적 항체 IXAX-0436.0201.0128은 VH 도메인 SEQ ID NO: 324 및 IgG4 인간 중쇄 불변 영역을 P(힌지) 돌연변이 및 K439E와 함께 포함하는 항-FIX 중쇄, VH 도메인 SEQ ID NO: 470 및 IgG4 인간 중쇄 불변 영역을 P(힌지) 돌연변이 및 E356K와 함께 포함하는 항-FX 중쇄, 및 공통 경쇄 SEQ ID NO: 405를 포함한다.

이중특이적 항체 IXAX-0436.0202.0128은 VH 도메인 SEQ ID NO: 324 및 IgG4 인간 중쇄 불변 영역을 P(힌지) 돌연변이 및 K439E와 함께 포함하는 항-FIX 중쇄, VH 도메인 SEQ ID NO: 472 및 IgG4 인간 중쇄 불변 영역을 P(힌지) 돌연변이 및 E356K와 함께 포함하는 항-FX 중쇄, 및 공통 경쇄 SEQ ID NO: 405를 포함한다.

이중특이적 항체 IXAX-1172.0201.0128은 VH 도메인 SEQ ID NO: 440 및 IgG4 인간 중쇄 불변 영역을 P(힌지) 돌연변이 및 K439E와 함께 포함하는 항-FIX 중쇄, VH 도메인 SEQ ID NO: 470 및 IgG4 인간 중쇄 불변 영역을 P(힌지) 돌연변이 및 E356K와 함께 포함하는 항-FX 중쇄, 및 공통 경쇄 SEQ ID NO: 405를 포함한다.

이온 교환 크로마토그래피는 각각의 항체 조성물을 이의 구성요소 파트로 명료하게 분리시켰다. 기준선 분리가 관찰되었다. 항-FIXxFX 헤테로이량체성 이중특이적 항체를 호모이량체성 오염원 항-FIX 및/또는 항-FX 단일특이적 항체로부터 분리한다.

도 37a는 항-FIX 호모이량체 NINA-1280.0128 및 항-FX 호모이량체 TINA-0999.0128과 혼합된 이중특이적 항체를 포함하는 조성물로부터 IXAX-1280.0999.0128의 성공적인 정제를 도시한다.

도 37b는 항-FIX 호모이량체 NINA-0436.0128 및 항-FX 호모이량체 TINA-0202.0128과 혼합된 이중특이적 항체를 포함하는 조성물로부터 IXAX-0436.0202.0128의 성공적인 정제를 도시한다. 크로마토그램은 소듐 아세테이트 pH 5에서 500 nM 이하까지 증가하는 농도의 NaCl을 사용하는 일련의 계산식 용출을 사용하여 호모이량체 오염원으로부터 N436 이중특이적 항체의 양이온 교환 정제를 나타낸다. 피크 1은 항-FIX 호모이량체 항체를 나타내며; 피크 2는 항-FIX/FX 이중특이적 항체를 나타내고, 피크 3은 항-FX 호모이량체 항체를 나타낸다. 피크 1, 2 및 3은 각각 18%, 79% 및 3%의 총 피크 면적을 이룬다.

도 37c는 이중특이적 항체 및 항-FIX 호모이량체 NINA-1172.0128을 포함하는 조성물로부터 IXAX-1172.0201.0128의 성공적인 정제를 도시한다. 본원에서 컬럼 정제는 31.5% 항-FIX 호모이량체 및 68.5% 이중특이적 헤테로이량체를 산출하였다. 크로마토그램은 약하게 결합된 피크 1(항-FIX 호모이량체)을 제거하기 위한 초기 계단식 용출, 뒤이어 항-FIX/FX 이중특이적 분자를 용출하기 위해 증가하는 농도의 NaCl을 사용하는 구배 용출을 사용하여 항-FIX 호모이량체 오염원으로부터 N1172 이중특이적 항체의 양이온 교환 정제를 나타낸다. 항-FX 호모이량체의 존재는 검출되지 않았다.

재료 & 방법

IXAX-1280.0999.0128 정제를 위해, 이중특이적 항체를 Expi293F HEK 세포에서 일시적으로 발현시켰다. 세포 배양 상층액을 수합하며, 여과하고, 1x 포스페이트 완충 식염수(PBS)로 평형화된 5 ml HiTrap MabSelect Sure(MSS) 컬럼(GE Healthcare) 상에 로딩하였다. 컬럼을 5 컬럼 부피의 PBS로 세척하고, 결합된 항체를 IgG 용출물(ThermoFisher)을 사용하여 용출시켰다. 용출된 이중특이적 항체를 4℃에서 1x PBS 내로 밤새 투석시키며, 10 kDa 분자량 컷오프와 함께 원심분리 필터 유닛을 사용하여 농축시켰다.

크로마토그래피를 실온에서 수행하였다. 1 ml HiTrap Capto SP 컬럼(GE Healthcare)을 20 mM 소듐 포스페이트, pH 6.0으로 평형화시키고, 평형 완충액(20 mM 소듐 포스페이트, pH 6.0)에서 1:20 희석된 0.5 mg의 단백질 A 정제된 물질을 컬럼 상으로 로딩하였다. 컬럼을 후속적으로 10 컬럼 부피의 평형 완충액으로 세척하고, 뒤이어 선형 구배(500 mM NaCl까지 90 컬럼 부피에 걸쳐 100% B)에 의해 이중특이적 항체 및 단일특이적 오염원을 용출시켰다. 이 과정에서, 완충액은 1 ml 컬럼에 대해 1 ml/분의 유속에서 90 cv에 걸쳐 A(20 mM 소듐 포스페이트, pH 6.0, 염 없음)로부터 B(500 mM NaCl을 첨가하는 완충액 A)로 점진적으로 변한다.

IXAX-0436.0202.0128 정제를 위해, 3개의 상이한 이온 강도에서의 세척을 포함하는 계산식 구배를, 다양화된 비율의 완충액 A(50 mM 소듐 아세테이트, pH 5) 및 완충액 B(50 nM 소듐 아세테이트 및 500 mM 소듐 클로라이드)를 사용하여 적용하였다.

IXAX-1172.0201.0128 정제를 위해, 초기 계단식 용출을 사용하여 약하게 결합된 피크 1(항-FIX 호모이량체)을 제거하고, 뒤이어 증가하는 농도의 NaCl을 사용하는 구배 용출에 의해 항-FIX/FX 이중특이적 분자를 용출하였다.

후속적으로, 하기 이중특이적 항체를 CHO 세포에서 발현시켰다:

5. IXAX-1280.0999.0325. 항-FIX 중쇄 SEQ ID NO: 419, 항-FX 중쇄 SEQ ID NO: 421, 공통 경쇄 SEQ ID NO: 414.

6. IXAX-1454.0999.0325. 항-FIX 중쇄 SEQ ID NO: 424, 항-FX 중쇄 SEQ ID NO: 421, 공통 경쇄 SEQ ID NO: 414.

7. IXAX-1441.0999.0325. 항-FIX 중쇄 SEQ ID NO: 426, 항-FX 중쇄 SEQ ID NO: 421, 공통 경쇄 SEQ ID NO: 414.

8. IXAX-1442.0736.0325. 항-FIX 중쇄 SEQ ID NO: 428, 항-FX 중쇄 SEQ ID NO: 430, 공통 경쇄 SEQ ID NO: 414.

9. IXAX-1442.0687.0325. 항-FIX 중쇄 SEQ ID NO: 428, 항-FX 중쇄 SEQ ID NO: 421, 공통 경쇄 SEQ ID NO: 414.

각각의 이들 이중특이적 항체는 2개의 중쇄에 대해 각각 중쇄 불변 영역 SEQ ID NO: 409 및 SEQ ID NO: 410, 및 공통 경쇄에 람다 경쇄 불변 영역 SEQ ID NO: 146을 포함한다.

CHO 세포에서 각각의 상기 항체 1 내지 5의 일시적인 발현으로부터 관찰된 역가는 단일특이적 이소타입 대조군 항체에 대한 역가와 필적할 만하였다. 안정한 풀 및 미니풀(형질주입 후 접종된 4,000개 이하의 세포)을 또한, 발생시켰다. 안정한 풀이 낮은 백분율(11% 내지 19%)의 헤테로이량체성 항체를 생성하긴 하였지만, 4.9 g/l 이하의 역가 및 82% 이하의 헤테로이량체의 백분율을 갖는 미니풀을 제한된 수의 스크리닝된 미니풀로부터 확립하였다.

단백질 A 정제 후, 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 호모이량체성 부산물을 제거하여, 기능적 검정에 사용하기에 그리고 개발성 스크리닝에 적합한 고순도 물질을 발생시켰다.

구배 양이온 교환 방법을 사용하여, 항체 1 내지 4를 호모이량체성 부산물로부터 분리하여, 용출된 물질에서 91% 내지 96% 헤테로이량체를 제공하였다. 그러므로, 심지어 이러한 예비 정제 방법을 이용하여, 본 발명자들은 91% 내지 96%의 순수한 헤테로이량체를 수득할 수 있었다. 도 38. 필적할 만한 호모이량체/헤테로이량체 분리는 이러한 기법을 사용하여 항체 5에 대해 관찰되지 않았다.

실시예 18. 질량 분광법에 의한 품질 평가

치료적 단일클론 항체의 구조적 온전성은, 생성물 불균질을 초래하는 다수의 유형의 번역후 변형에 의해 손상될 수 있다. 질량 분광법(MS)을 사용하여, 양이온 교환 정제 후 이중특이적 항체의 품질을 특징화하고 평가하였다.

실시예 17에 기재된 바와 같은 양이온 교환 분리 후, BiAb_1 IXAX-1280.0999.0325의 용출된 조성물 내 3개의 상이한 화학종(각각 항-FIX/항-FX 헤테로이량체, 항-FIX 호모이량체 및 항-FX 호모이량체)을 MS에 의해 분석하였다. MS에 의해 결정된 3개 분자의 분자량(MW)은 BiAb_1의 아미노산 서열에 의해 예측된 이론적 MW와 매칭하였다. 그러므로, MS 결과는, 양이온 교환 정제 후 FIX/FX 헤테로이량체의 정체성(identity) 및 순도를 확인시켜 주었다.

실시예 19. 안정성 평가

실시예 17에 기재된 바와 같은 정제 후, BiAb_1, 2, 3 및 4를 완충액 1(소듐 아세테이트, pH 5.5) 또는 완충액 2(시트레이트/포스페이트, pH 6.0)로 완충액 교환하거나, 4℃에서 2주 동안, 25℃에서 4주 동안 보관하거나, 1X 냉동/해동 주기를 수행하였다. IgG의 농도를 치료 전과 후에 측정하여, 치료로 인한 항체의 손실을 계산하였다. SEC-HPLC를 또한, 치료 전과 후에 수행하여, 이중특이적 항체 분해 및 응집에 대해 모니터링하였다. BiAb_1, 2, 3 또는 4의 명백한 손실 또는 분해 중 어느 것도 관찰되지 않았다. 그러므로, 이들 4개의 이중특이적 항체는 완충액 1과 완충액 2 둘 다에서 모두 안정하였다.

실시예 20. FXase 검정에서 용량 반응 및 약효

FXase 동역학 검정을 수행하여, 용량 반응에서 IXAX-1280.0999.0325 및 AbE의 인자 VIII 미메틱 활성을 측정하여, 이의 EC50 값을 실시예 7에 따라 결정하였다. 용량 반응 곡선으로부터 발생된 데이터는 비-선형 로그[항체] 대 반응 매개변수 가변 기울기 모델(예를 들어, 4 매개변수 로지스틱 회귀 모델)을 사용하여 적합화되었다. 도 39. y-축에 600초 검정 시점에서 OD405 nm 값이 플롯화된다. IXAX-1280.0999.0325와 AbE 둘 다에 대한 EC50 값을 데이터의 비-선형 회귀 곡선으로부터 계산하여, IXAX-1280.0999.0325에 대해 3.99 nM의 EC50 및 AbE에 대해 261.2 nM의 EC50을 제공하였다. 용량 반응 곡선이 불완전했기 때문에 이들은 근사치이다. 이런 점에도 불구하고, IXAX-1280.0999.0325가 AbE보다 유의하게 더 낮은 EC50을 갖는다는 것이 명백하다. IXAX-1280.0999.0325 및 AbE의 활성은 용량 의존적이다. IXAX-1280.0999.0325는 AbE와 비교하여 특히 더 낮은 농도에서 더 높은 FVIII 미메틱 활성을 실증하였다.

실시예 21. 하이픈 검정 용량 반응

인간 혈장에서 인자 Xa 생성을 분석하는 색원체 검정(HYPHEN BioMed)을 사용하여, IXAX-1280.0999.0325 및 AbE의 인자 VIII 미메틱 활성을 측정하였다. 이 검정에서, FXa 발생은 색원체 기질 첨가 후 측정된 OD405와 비례한다. 항체 농도 용량 반응 곡선을 발생시키고, 비-선형 로그[항체] 대 반응 매개변수 가변 기울기 모델(예를 들어, 4 매개변수 로지스틱 회귀 모델)을 사용하여 적합화하였다. 용량 반응에 기초한 EC50 값을 계산하였다. AbE에 대한 15.43 nM과 비교하여 5.92 nM의 EC50 값이 IXAX-1280.0999.0325에 대해 계산되었다.

IXAX-1280.0999.0325는 대체로 모든 농도에 걸쳐 AbE보다 더 큰 FVIII 미메틱 능력을 일관되게 달성하였다. 60 nM에서 A405 nm는 두 분자 모두에 대해 4.988에서 포화되었었다. IXAX-1280.0999.0325는 20 nM에서 이 포화를 보유한 한편, AbE는 3.457의 저하된 A405 nm로 제시되었다. 0.028 nM의 최저 농도에서, IXAX-1280.0999.0325는 AbE보다 4-배 넘게 더 큰 흡광도를 나타내었다. 계산된 EC50 값은, IXAX-1280.0999.0325가 용량 반응 검정에 걸쳐 AbE와 비교할 때 우수한 약효를 보여줌을 확인시켜 준다. 도 40.

재료 & 방법

BIOPHEN FVIII:C(Ref. 221402) 키트를 제조업체의 검정 프로토콜에 따라 사용하였다. 간략하게는, FVIII 결핍 혈장(Helena Biosciences Europe)을 Tris-BSA 완충액(R4)에서 1:40으로 희석시키고, 45 μl를 투명 바닥 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 5 μl의 이중특이적 항체를 희석된 혈장에 첨가하였다. 37℃까지 예비-인큐베이션된 50 μl의 각각의 시약 R1(FX) 및 R2(FIXa)를 각각의 웰에 첨가하고, 37℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 후속적으로, 50 μl의 시약 R3(SXa-11, 색원체 시약)을 첨가하며, 혼합하고, 정확히 추가 5분 동안 인큐베이션하였다. 50 μl 20% 아세트산의 첨가는 반응을 종결시켰다. 인자 Xa가 특이적 인자 Xa 기질(SXa-11)을 절단하는 능력을 통해 인자 Xa의 발생을 모니터링하였다. 이 기질의 절단은 착색된 생성물, pNA를 방출시키며, 이는 405 nM에서 분광광도계를 사용하여 모니터링되고 블랭크 시료와 비교될 수 있다.

이 검정에 사용된 IXAX-1280.0999.0325 및 AbE는 질량 분광법에 의해 100% 헤테로이량체에 근접한 것으로 결정되었으며, 호모이량체성 오염원은 검출되지 않았다(또는 낮은 수준으로 검출되었음).

IXAX-1280.0999.0325 및 AbE 시료를, PBS를 희석제로서 이용하는 1:3 희석 시리즈를 사용하여 희석시켰다. 5 μL 부피를 45 μL 인자 VIII 결핍 혈장에 첨가하였다. 희석 시리즈(검정될 때)에서 각각의 시료의 최종 농도(nM)는 60.0, 20.0, 6.67, 2.22, 0.741, 0.247, 0.082, 및 0.028이었다. 농도를 log(M)으로 전환시키고 플롯화하였다. 비-선형 회귀를 그래프 상에서 플롯화하여, EC50 계산을 가능하게 하였다.

실시예 22. 혈장 응고 검정에서 용량 반응 및 약효

본 발명자들은, 완전 항체 농도 용량 반응(실시예 8에 따른 방법)을 사용하여 IXAX-1280.0999.0325에 대한 이중특이적 항체 AbE의 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT)을 평가하였다. 용량 반응 곡선으로부터 발생된 데이터는 비-선형 로그[항체] 대 반응 매개변수 가변 기울기 모델(예를 들어, 4 매개변수 로지스틱 회귀 모델)을 사용하여 적합화되었다.

분석된 농도값에 걸쳐, 본 발명자들은 분석된 모든 농도에서 AbE와 비교하여 IXAX-1280.0999.0325에 대해 동등한 aPTT 값(10% 이내)을 관찰하였다(도 41). 용량 반응 곡선을, 지혈 효능을 실증하지 않은 인간 IgG4 단일클론 항체 이소형 대조군과 비교하였다. 수득된 aPTT 값에 기초하여 계산된 EC50 값은, AbE(정사각형)에 대한 2.0 nM과 비교하여 IXAX-1280.0999.0325(원형)에 대해 2.1 nM였다.

30 내지 300 nM의 전향적 치료 범위에 관하여, 본 발명자들은 IXAX-1280.0999.0325를 이용하여 AbE와 동등한 aPTT 용량 반응 곡선을 관찰하였다.

이 검정에 사용된 IXAX-1280.0999.0325 및 AbE는 질량 분광법에 의해 100% 헤테로이량체인 것으로 결정되었으며, 호모이량체성 오염원은 검출되지 않았다.

실시예 23. 항-FVIII 저해 항체의 존재 하에서의 활성

인자 VIII 대체 치료법은, 환자가 외인성적으로 투여된 FVIII에 대한 동종항체를 발달시킨다면 혈우병 A 환자를 치료하는 데 효과가 없어질 수 있다. 저해성 항-FVIII 동종항체는 FIX, 인지질 및 폰빌레브란트 인자가 FVIII에 결합하는 것을 차단하여 이를 불활성화시킬 수 있다.

유리하게는, 치료적 이중특이적 항체는 환자의 혈액에서 FVIII 동종항체의 존재에 무감각하므로, 동종항체는 FVIII에 대해 특이성을 갖는다. 이는, 저해제 환자로부터 취한 혈장에서 지혈을 기능적으로 복구시키는 이중특이적 항체의 능력에 의해 확인된다. 이 실시예에서, 본 발명자들은, 저해성 동종항체를 갖는 혈우병 A 환자로부터의 혈장("저해제 혈장"으로 지칭됨)을 사용하는 2개의 지혈 검정: 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT) 및 트롬빈 발생 검정(TGA)을 사용하여 실증한다. 응집 시간의 복귀는, 분석된 이중특이적 항체가 FVIII 저해성 동종항체의 존재 하에 기능적임을 나타내었다. 그러므로, 본원에 제시된 데이터는, IXAX-1280.0999.0325 및 IXAX-1441.0999.0325가 FVIII에 대한 저해성 동종항체를 갖는 환자에서 응고 시간을 기능적으로 복귀시킬 수 있을 것임을 나타낸다.

베데스다(Bethesda) 검정 또는 니메겐-변형 베데스다(Nijmegen-Modified Bethesda) 검정을 사용하여, FVIII에 대한 동종항체의 역가를 측정한다. 이들 검정에서, 환자의 혈장의 상이한 희석물을 동일 부피의 '정상' 혈장과 혼합하며, 소정의 시간 동안 인큐베이션하고, FVIII의 수준을 측정한다. 잔여 FVIII의 저하가 관찰될 때 저해제의 존재가 나타난다. 이들 검정에서의 측정 단위는 베데스다 단위(BU)로 알려져 있으며 - 더 높은 BU는 더 큰 저해 또는 더 낮은 잔여 FVIII 활성을 나타낸다. 본원에 기재된 실험은 70 BU의 특이적인 저해제 수준을 갖는 환자 혈장을 사용하였다.

aPTT

IgG4 이중특이적 항체 IXAX-1280.0999.0325, IXAX-1441.0999.0325 및 AbE를 CHO 세포에서 발현시킨 다음, 단백질 A 크로마토그래피, 뒤이어 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하여, 활성 헤테로이량체를 오염성 호모이량체로부터 분리하고, 6개의 상이한 농도 300, 100, 33.3, 11.1, 3.7 및 1.23 nM에서 aPTT에 의해 분석하였다. aPTT를 실시예 8에 따라 수행하였다. 용량 반응 곡선으로부터 발생된 데이터는 비-선형 로그[항체] 대 반응 매개변수 가변 기울기 모델(예를 들어, 4 매개변수 로지스틱 회귀 모델)을 사용하여 적합화되었다. IXAX-1280.0999.0325 IgG4 항체와 IXAX-1441.0999.0325 IgG4 항체 둘 다, AbE와 유사한 방식으로 저해제 환자 시료에서 응집 결함을 구제할 수 있었다. 도 42.

트롬빈 발생 검정

저해제 혈장에서의 트롬빈 발생(70 BU)을, 단백질 A 상에서의 정제, 뒤이어 양이온 교환 크로마토그래피 후 IXAX-1280.0999.0325, IXAX-1441.0999.0325 및 AbE IgG4 이중특이적 항체를 사용하여 결정하였다. 트롬빈 발생 검정을 실시예 13에 따라 사용하였다. 트롬빈 피크를 모든 이중특이적 항체에 대해 관찰하였으며, 이는 IXAX-1280.0999.0325와 IXAX-1441.0999.0325 둘 다, AbE와 유사한 방식으로 FVIII에 대한 저해성 동종항체를 함유하는 혈장에서 지혈을 기능적으로 복귀시킬 수 있음을 나타낸다.

각각의 이중특이적 항체에 대한 용량 반응을 수행하고, 피크 트롬빈 높이(C_최대)를 결정하였다. 도 43. 분석된 농도 범위에서, IXAX-1280.0999.0325 및 IXAX-1441.0999.0325에 대한 C_최대 용량 반응은 AbE의 C_최대보다 더 컸으며, 이는 더 큰 트롬빈 버스트(burst)를 나타내고, IXAX-1280.0999.0325 및 IXAX-1441.0999.0325에 대한 T_최대 용량 반응은 AbE에 대한 T_최대보다 더 낮았으며, 이는 더 신속한 트롬빈 버스트를 나타낸다. 도 44.

<110> Kymab Limited <120> FIXaxFX Bispecific Antibody with Common Light Chain <130> K00058-1 WO <150> GB1820977.5 <151> 2018-12-21 <150> GB1906816.2 <151> 2019-05-15 <150> GB1908190.0 <151> 2019-06-07 <160> 639 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr Trp 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ile Asn Gln Asp Gly Ser Glu Lys 1 5 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ala Arg Glu Gly Tyr Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 4 <211> 367 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tttgtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag tctctggatt cacctttaat agctattgga tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaac ataaaccaag atggaagtga gaaattctat 180 gtggcctctg tgaagggccg attcaccatg tccagagaca acgccaagaa atcagtgtat 240 gtacaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagagggg 300 tatagtagtt cgtcctatta tggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctcag 367 <210> 5 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Ile Asn Gln Asp Gly Ser Glu Lys Phe Tyr Val Ala Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Val Tyr 65 70 75 80 Val Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Tyr Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Asn Ile Gly Arg Lys Ser 1 5 <210> 7 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Tyr Asp Ser 1 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Gln Val Trp Asp Gly Ser Ser Asp His Trp Val 1 5 10 <210> 9 <211> 325 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 tcctatgtgc tgactcagcc accctcagtg tcagtggccc caggagagac ggccaggatt 60 acctgtgggg gagacaacat tggaaggaaa agtgtgtact ggtaccagca gaagtcaggc 120 caggcccctg tgctggtcat ctattatgat agcgaccggc cctcagggat ccctgagcga 180 ttctctgggt ccaactctgg gaacacggcg accctgacca tcagcagggt cgaagccggg 240 gatgaggccg actattactg tcaggtgtgg gatggaagta gtgatcattg ggtgttcggc 300 ggagggacca agttgaccgt cctag 325 <210> 10 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Arg Lys Ser Val 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Gly Ser Ser Asp His 85 90 95 Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Trp 1 5 <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys 1 5 <210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Ala Arg Glu Gly Tyr Ser Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 14 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agctattgga tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaac ataaagcaag atggaagtga gaaatactat 180 gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagagggg 300 tatagcagtt actactacta cggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 15 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Tyr Ser Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 16 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agctattgga tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaac ataaaccaag atggaagtga gaaatactat 180 gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctacaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagagggg 300 tatagtagtt cgtcctatta tggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 17 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Ile Asn Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Tyr Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 18 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr Trp 1 5 <210> 19 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgtag cctctggatt catctttagt agctattgga tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaat ataaatcaag atggaagtga gaaatactat 180 gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagagggg 300 tatagcagtt cgtcctatta tggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 20 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Ile Asn Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Tyr Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 21 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag tctctggatt cacctttaat agctattgga tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaac ataaaccaag atggaagtga gaaattctat 180 gtggcctctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcagtgtat 240 ctacaaatga acagcctgag agccgaggac 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sapiens <400> 25 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag tctctggatt cacctttaat aactattgga tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaac ataaaccaag atggaagtga gaaattctat 180 gtggcctctg tgaagggccg attcatcatc tccagagaca acgccaaaaa ttcagtgtat 240 ctacaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagagggg 300 tataccgatt cgtcctatta tggaatggac gtctggggcc aagggaccac ggtctccgtc 360 tcctca 366 <210> 26 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Ile Asn Gln Asp Gly Ser Glu Lys Phe Tyr Val Ala Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Tyr Thr Asp Ser Ser Tyr Tyr Gly Met 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agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagagggg 300 tatagtagtt cgtcctatta tggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 56 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Ile Asn Gln Asp Gly Ser Glu Lys Phe Tyr Val Ala Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Val Tyr 65 70 75 80 Val Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Tyr Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 57 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Ala 1 5 <210> 58 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Ile Asn Ala Gly Asn Gly Phe Thr 1 5 <210> 59 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Ala Arg 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agcggccctc agaggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcgcc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg agactgatta ttactgtgca acatgggatg acagcctgag tgcttatgtc 300 ttcggagctg ggaccaaagt caccgtccta g 331 <210> 85 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 85 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Glu Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Ala Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Thr Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Ser Ala Tyr Val Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 110 <210> 86 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 86 Glu Phe Thr Phe Ser Thr Ala Gly 1 5 <210> 87 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 87 Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys 1 5 <210> 88 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens 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Ala Val Tyr Tyr Cys 35 <210> 160 <211> 38 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 160 Phe Tyr Val Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Asp Asn 1 5 10 15 Ala Lys Lys Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 20 25 30 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 35 <210> 161 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 161 Ala Arg Glu Gly Tyr Ala Ser Ser Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 162 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 162 Ala Arg Glu Gly Tyr Ser Ala Ser Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 163 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 163 Ala Arg Glu Gly Tyr Ser Ser Ala Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 164 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 164 Ala Arg Glu Gly Tyr Ser Ser Ser Ala Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 165 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 165 Ala Arg Glu Gly Tyr Ser Ser Cys Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 166 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 166 Ala Arg Glu Gly Tyr Ser Ser Asp Ser Tyr Tyr Gly 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Val 1 5 10 15 <210> 206 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 206 Ala Arg Glu Gly Tyr His Ser Ser Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 207 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 207 Ala Arg Glu Gly Tyr Ile Ser Ser Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 208 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 208 Ala Arg Glu Gly Tyr Lys Ser Ser Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 209 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 209 Ala Arg Glu Gly Tyr Leu Ser Ser Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 210 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 210 Ala Arg Glu Gly Tyr Met Ser Ser Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 211 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 211 Ala Arg Glu Gly Tyr Asn Ser Ser Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 212 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 212 Ala Arg Glu Gly Tyr Pro Ser Ser Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 213 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 213 Ala Arg Glu Gly Tyr Gln Ser Ser 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Glu Gly Tyr Ser Glu Ser Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 222 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 222 Thr Val Phe Leu Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu Asn Arg Pro 1 5 10 15 Lys Arg <210> 223 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 223 Ala Arg Glu Gly Tyr Ser Phe Ser Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 224 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 224 Ala Arg Glu Gly Tyr Ser Gly Ser Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 225 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 225 Ala Arg Glu Gly Tyr Ser His Ser Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 226 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 226 Ala Arg Glu Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 227 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 227 Ala Arg Glu Gly Tyr Ser Lys Ser Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 228 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 228 Ala Arg Glu Gly Tyr Ser Leu Ser Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 229 <211> 15 <212> PRT 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attactgtgc gagagagggg 300 tatagtgcct cgtcctatta tggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctcag 367 <210> 240 <211> 367 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 240 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tttgtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag tctctggatt cacctttaat agctattgga tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaac ataaaccaag atggaagtga gaaattctat 180 gtggcctctg tgaagggccg attcaccatg tccagagaca acgccaagaa atcagtgtat 240 gtacaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagagggg 300 tatagtagtg cctcctatta tggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctcag 367 <210> 241 <211> 367 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 241 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tttgtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag tctctggatt cacctttaat agctattgga tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaac ataaaccaag atggaagtga gaaattctat 180 gtggcctctg tgaagggccg attcaccatg tccagagaca acgccaagaa atcagtgtat 240 gtacaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc 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tatagtagtg actcctatta tggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctcag 367 <210> 244 <211> 367 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 244 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tttgtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag tctctggatt cacctttaat agctattgga tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaac ataaaccaag atggaagtga gaaattctat 180 gtggcctctg tgaagggccg attcaccatg tccagagaca acgccaagaa atcagtgtat 240 gtacaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagagggg 300 tatagtagtg agtcctatta tggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctcag 367 <210> 245 <211> 367 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 245 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tttgtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag tctctggatt cacctttaat agctattgga tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaac ataaaccaag atggaagtga gaaattctat 180 gtggcctctg tgaagggccg attcaccatg tccagagaca acgccaagaa atcagtgtat 240 gtacaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagagggg 300 tatagtagtt 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tcctgtgcag tctctggatt cacctttaat agctattgga tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaac ataaaccaag atggaagtga gaaattctat 180 gtggcctctg tgaagggccg attcaccatg tccagagaca acgccaagaa atcagtgtat 240 gtacaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagagggg 300 tatagtagtt cgtggtatta tggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctcag 367 <210> 277 <211> 367 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 277 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tttgtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag tctctggatt cacctttaat agctattgga tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaac ataaaccaag atggaagtga gaaattctat 180 gtggcctctg tgaagggccg attcaccatg tccagagaca acgccaagaa atcagtgtat 240 gtacaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagagggg 300 tatagtagtt cgtactatta tggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctcag 367 <210> 278 <211> 367 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 278 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tttgtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag 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tccagagaca acgccaagaa atcagtgtat 240 gtacaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagagggg 300 tatagtaact cgtcctatta tggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctcag 367 <210> 307 <211> 367 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 307 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tttgtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag tctctggatt cacctttaat agctattgga tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaac ataaaccaag atggaagtga gaaattctat 180 gtggcctctg tgaagggccg attcaccatg tccagagaca acgccaagaa atcagtgtat 240 gtacaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagagggg 300 tatagtccct cgtcctatta tggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctcag 367 <210> 308 <211> 367 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 308 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tttgtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag tctctggatt cacctttaat agctattgga tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaac ataaaccaag atggaagtga gaaattctat 180 gtggcctctg tgaagggccg attcaccatg tccagagaca 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gtacaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagagggg 300 tatagttggt cgtcctatta tggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctcag 367 <210> 313 <211> 367 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 313 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tttgtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag tctctggatt cacctttaat agctattgga tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaac ataaaccaag atggaagtga gaaattctat 180 gtggcctctg tgaagggccg attcaccatg tccagagaca acgccaagaa atcagtgtat 240 gtacaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagagggg 300 tatagttact cgtcctatta tggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctcag 367 <210> 314 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 314 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Ile Asn Gln Asp Gly Ser Glu Lys Phe Tyr Val Ala Ser Val 50 55 60 Lys 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tgggggaggc tttgtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag tctctggatt cacctttaat agctattgga tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaac ataaaccaag atggaagtag aaaattctat 180 gtggcctctg tgaagggccg attcaccatg tccagagaca acgccaagaa atcagtgtat 240 gtacaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagagggg 300 tatagtagta tcaagtatta tggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 440 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 440 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Ile Asn Gln Asp Gly Ser Arg Lys Phe Tyr Val Ala Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Val Tyr 65 70 75 80 Val Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Tyr Ser Ser Ile Lys Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr 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agctgtgccg tgtccggctt ccggttcaac agctactgga tgtcctgggt ccgacaggcc 120 cctggcaaag gacttgagtg ggtcgccaac atcaaccagg acggcagccg gaagttttac 180 gtggcctctg tgaagggcag attcaccatg agccgggaca acgccaagaa agaggtgtac 240 gtgcagatga acagcctgag agccgaggac accgccgtgt actattgtgc cagagagggc 300 tacagcagca tcaagtacta cggcatggac gtgtggggcc agggcacaac agtgacagtc 360 tcttct 366 <210> 454 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 454 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Arg Phe Asn Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Ile Asn Gln Asp Gly Ser Arg Lys Phe Tyr Val Ala Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Glu Val Tyr 65 70 75 80 Val Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Tyr Ser Ser Ile Lys Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 455 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atcaacccta aaagtggtag tacaagttac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240 atggagctga tcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatggg 300 tatggcagct cgtcccggtg cctccagctc tggggccagg gcaccctggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 474 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 474 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Arg Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Lys Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ile Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Tyr Gly Ser Ser Ser Arg Cys Leu Gln Leu Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 475 <211> 363 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 475 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgcagaaga ctggggcctc agtgaaggtt 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attactgtgc gagagatggg 300 tatggcagct tctcccggct gatccagctc tggggccagg gcaccctggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 600 <211> 121 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 600 Gln Val Gln Leu Ile Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Arg Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Lys Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Tyr Gly Ser Phe Ser Arg Leu Ile Gln Leu Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 601 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 601 Arg Tyr Arg Phe Thr Ser Tyr Tyr 1 5 <210> 602 <211> 363 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 602 caggtgcagt tgatacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg catctagata cagattcacc agctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaata atcaacccta aaagtggtag tacaagttac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatggg 300 tatggcagct tctcccggct gatccagctc tggggccagg gcaccctggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 603 <211> 121 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 603 Gln Val Gln Leu Ile Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Arg Tyr Arg Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Lys Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Tyr Gly Ser Phe Ser Arg Leu Ile Gln Leu Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 604 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 604 Arg Tyr Ser Phe Lys Ser Tyr Tyr 1 5 <210> 605 <211> 363 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 605 caggtgcagt tgatacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg catctagata cagcttcaag agctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaata atcaacccta aaagtggtag tacaagttac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatggg 300 tatggcagct tctcccggct gatccagctc tggggccagg gcaccctggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 606 <211> 121 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 606 Gln Val Gln Leu Ile Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Arg Tyr Ser Phe Lys Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Lys Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Tyr Gly Ser Phe Ser Arg Leu Ile Gln Leu Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 607 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 607 Arg Tyr Ser Phe Thr Ala Tyr Tyr 1 5 <210> 608 <211> 363 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 608 caggtgcagt tgatacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg catctagata cagcttcacc gcctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaata atcaacccta aaagtggtag tacaagttac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatggg 300 tatggcagct tctcccggct gatccagctc tggggccagg gcaccctggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 609 <211> 121 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 609 Gln Val Gln Leu Ile Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Arg Tyr Ser Phe Thr Ala Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Lys Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Tyr Gly Ser Phe Ser Arg Leu Ile Gln Leu Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 610 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 610 Leu Asn Pro Lys Ser Gly Ser Thr 1 5 <210> 611 <211> 363 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 611 caggtgcagt tgatacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg catctagata cagcttcacc agctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaata ctgaacccta aaagtggtag tacaagttac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatggg 300 tatggcagct tctcccggct gatccagctc tggggccagg gcaccctggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 612 <211> 121 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 612 Gln Val Gln Leu Ile Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Arg Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Leu Asn Pro Lys Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Tyr Gly Ser Phe Ser Arg Leu Ile Gln Leu Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 613 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 613 Ile Asn Pro Lys Ile Gly Ser Thr 1 5 <210> 614 <211> 363 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 614 caggtgcagt tgatacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg catctagata cagcttcacc agctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaata atcaacccta aaatcggtag tacaagttac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatggg 300 tatggcagct tctcccggct gatccagctc tggggccagg gcaccctggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 615 <211> 121 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 615 Gln Val Gln Leu Ile Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Arg Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Lys Ile Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Tyr Gly Ser Phe Ser Arg Leu Ile Gln Leu Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 616 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 616 Ile Asn Pro Lys Lys Gly Ser Thr 1 5 <210> 617 <211> 363 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 617 caggtgcagt tgatacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg catctagata cagcttcacc agctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaata atcaacccta aaaagggtag tacaagttac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatggg 300 tatggcagct tctcccggct gatccagctc tggggccagg gcaccctggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 618 <211> 121 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 618 Gln Val Gln Leu Ile Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Arg Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Lys Lys Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Tyr Gly Ser Phe Ser Arg Leu Ile Gln Leu Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 619 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 619 Ile Asn Pro Lys Ser Ser Ser Thr 1 5 <210> 620 <211> 363 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 620 caggtgcagt tgatacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg catctagata cagcttcacc agctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaata atcaacccta aaagtagcag tacaagttac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatggg 300 tatggcagct tctcccggct gatccagctc tggggccagg gcaccctggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 621 <211> 121 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 621 Gln Val Gln Leu Ile Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Arg Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Lys Ser Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Tyr Gly Ser Phe Ser Arg Leu Ile Gln Leu Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 622 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 622 Ile Asn Pro Lys Ser Gly Asp Thr 1 5 <210> 623 <211> 363 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 623 caggtgcagt tgatacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg catctagata cagcttcacc agctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaata atcaacccta aaagtggtga cacaagttac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatggg 300 tatggcagct tctcccggct gatccagctc tggggccagg gcaccctggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 624 <211> 121 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 624 Gln Val Gln Leu Ile Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Arg Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Lys Ser Gly Asp Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Tyr Gly Ser Phe Ser Arg Leu Ile Gln Leu Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 625 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 625 Ile Asn Pro Lys Ser Gly Ser Arg 1 5 <210> 626 <211> 363 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 626 caggtgcagt tgatacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg catctagata cagcttcacc agctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaata atcaacccta aaagtggtag tagaagttac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatggg 300 tatggcagct tctcccggct gatccagctc tggggccagg gcaccctggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 627 <211> 121 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 627 Gln Val Gln Leu Ile Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Arg Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Lys Ser Gly Ser Arg Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Tyr Gly Ser Phe Ser Arg Leu Ile Gln Leu Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 628 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 628 Ile Asn Pro Lys Ser Gly Ser Ser 1 5 <210> 629 <211> 363 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 629 caggtgcagt tgatacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg catctagata cagcttcacc agctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaata atcaacccta aaagtggtag tagcagttac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatggg 300 tatggcagct tctcccggct gatccagctc tggggccagg gcaccctggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 630 <211> 121 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 630 Gln Val Gln Leu Ile Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Arg Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Lys Ser Gly Ser Ser Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Tyr Gly Ser Phe Ser Arg Leu Ile Gln Leu Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 631 <211> 363 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 631 caggttcagc tgattcagtc cggcgccaaa gtgaagaaac ctggcgcctc tgtgaaggtg 60 tcctgcaagg cctctcggta caagttcacc tcctactaca tgcactgggt ccgacaggcc 120 cctggacaag gattggagtg gatgggcatc atcaacccca agtccggctc cacctcttac 180 gcccagaaat tccagggcag agtgaccatg accagagaca cctctacctc caccgtgtac 240 atggaactgt ccagcctgag atccgaggac accgccgtgt actactgtgc cagagatggc 300 tacggcagct tctccagact gatccagttg tggggccagg gcacactggt cacagtgtcc 360 tct 363 <210> 632 <211> 121 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 632 Gln Val Gln Leu Ile Gln Ser Gly Ala Lys Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Arg Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Lys Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Tyr Gly Ser Phe Ser Arg Leu Ile Gln Leu Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 633 <211> 318 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 633 ggacaaccta aggccgctcc ttctgtgacc ctgtttcctc catcctccga ggaactgcag 60 gccaacaagg ctaccctcgt gtgcctgatc tccgactttt accctggcgc tgtgaccgtg 120 gcctggaagg ctgatagttc tcctgtgaag gccggcgtgg aaaccaccac accttccaag 180 cagtccaaca acaaatacgc cgcctcctcc tacctgtctc tgacccctga acagtggaag 240 tcccacaagt cctactcttg ccaagtgacc cacgagggct ccaccgtgga aaagacagtg 300 gctcctaccg agtgctcc 318 <210> 634 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7) <223> Xaa is Arg or Glu <400> 634 Ile Asn Gln Asp Gly Ser Xaa Lys 1 5 <210> 635 <211> 15 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9) <223> Xaa is Lys or Ser <400> 635 Ala Arg Glu Gly Tyr Ser Ser Ile Xaa Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 636 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3) <223> Xaa is Lys or Ser <400> 636 Arg Tyr Xaa Phe Thr Ser Tyr Tyr 1 5 <210> 637 <211> 14 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> Xaa is Phe or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12) <223> Xaa is Ile or Leu <400> 637 Ala Arg Asp Gly Tyr Gly Ser Xaa Ser Arg Xaa Xaa Gln Leu 1 5 10 <210> 638 <211> 14 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> Xaa is Phe or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11) <223> Xaa is Leu or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12) <223> Xaa is Ile or Leu <400> 638 Ala Arg Asp Gly Tyr Gly Ser Xaa Ser Arg Xaa Xaa Gln Leu 1 5 10 <210> 639 <211> 14 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11) <223> Xaa is Leu or Val <400> 639 Ala Arg Asp Gly Tyr Gly Ser Phe Ser Arg Xaa Ile Gln Leu 1 5 10

Claims

FIXa 및 FX에 결합하고 FX의 FIXa-매개 활성화를 촉매화하는 이중특이적(bispecific) 항체로서, 상기 항체는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍(pair)을 포함하며,
제1 중쇄-경쇄 쌍은 제1 VL 도메인과 쌍형성된(paired) 제1 VH 도메인을 포함하는 FIXa 결합 Fv 영역을 포함하고,
제2 중쇄-경쇄 쌍은 제2 VL 도메인과 쌍형성된 제2 VH 도메인을 포함하는 FX 결합 Fv 영역을 포함하며,
제1 VH 도메인은, HCDR1이 SEQ ID NO: 406이며 HCDR2가 SEQ ID NO: 407이고 HCDR3이 SEQ ID NO: 408인 것으로 정의된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 HCDR 세트를 포함하고/하거나 제1 VH 도메인은 아미노산 서열 수준에서 N1280H VH 도메인과 적어도 95% 동일하고;
제2 VH 도메인은 아미노산 서열 수준에서 T0201H VH 도메인 SEQ ID NO: 470과 적어도 95% 동일하며,
제1 VL 도메인 및 제2 VL 도메인은 각각, LCDR1이 SEQ ID NO: 6이며 LCDR2가 SEQ ID NO: 7이고 LCDR3이 SEQ ID NO: 8인 것으로 정의된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 LCDR 세트를 포함하고/하거나 제1 VL 도메인 및 제2 VL 도메인은 아미노산 서열 수준에서 0128L VL 도메인 SEQ ID NO: 10과 적어도 95% 동일한 것인, 이중특이적 항체.
FIXa 및 FX에 결합하고 FX의 FIXa-매개 활성화를 촉매화하는 이중특이적 항체로서, 상기 항체는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍을 포함하며,
제1 중쇄-경쇄 쌍은 제1 VL 도메인과 쌍형성된 제1 VH 도메인을 포함하는 FIXa 결합 Fv 영역을 포함하고,
제2 중쇄-경쇄 쌍은 제2 VL 도메인과 쌍형성된 제2 VH 도메인을 포함하는 FX 결합 Fv 영역을 포함하며,
제1 VH 도메인은 인간 면역글로불린 중쇄 v, d 및 j 유전자 분절(segment)의 재조합 생성물이고, v 유전자 분절은 IGHV3-7(예를 들어, VH3-7*01)이며 j 유전자 분절은 IGHJ6(예를 들어, JH6*02)이고,
제2 VH 도메인은 인간 면역글로불린 중쇄 v, d 및 j 유전자 분절의 재조합 생성물이고, v 유전자 분절은 IGHV1-46(예를 들어, VH1-46*03)이며 j 유전자 분절은 IGHJ1(예를 들어, JH1*01)이고, 선택적으로 d 유전자 분절은 IGHD6-6(예를 들어, DH6-6*01)이며,
제1 VL 도메인과 제2 VL 도메인은 둘 다 인간 면역글로불린 경쇄 v 및 j 유전자 분절의 재조합 생성물이고, v 유전자 분절은 IGLV3-21(예를 들어, VL3-21*d01)이며 j 유전자 분절은 IGLJ2(예를 들어, JL2*01) 또는 IGLJ3(예를 들어, JL3*02)인, 이중특이적 항체.
FIXa 및 FX에 결합하고 FX의 FIXa-매개 활성화를 촉매화하는 이중특이적 항체로서, 상기 항체는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍을 포함하며,
제1 중쇄-경쇄 쌍은 제1 VL 도메인과 쌍형성된 제1 VH 도메인을 포함하는 FIXa 결합 Fv 영역을 포함하고,
제2 중쇄-경쇄 쌍은 제2 VL 도메인과 쌍형성된 제2 VH 도메인을 포함하는 FX 결합 Fv 영역을 포함하며,
제1 VH 도메인은 N1280H VH 도메인 SEQ ID NO: 443과 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성을 갖고,
제2 VH 도메인은 T0201H VH 도메인 SEQ ID NO: 470과 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성을 가지며,
제1 VL 도메인 및 제2 VL 도메인은 각각 0128L VL 도메인 SEQ ID NO: 10과 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성을 갖는, 이중특이적 항체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 VH 도메인은, HCDR1이 SEQ ID NO: 406이며 HCDR2가 SEQ ID NO: 407이고 HCDR3이 SEQ ID NO: 408인 것으로 정의된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 HCDR 세트를 포함하는, 이중특이적 항체.
제4항에 있어서, 상기 제1 VH 도메인은 HCDR1 SEQ ID NO: 441을 포함하는, 이중특이적 항체.
제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 제1 VH 도메인은 HCDR2 SEQ ID NO: 634를 포함하는, 이중특이적 항체.
제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 VH 도메인은 HCDR2 SEQ ID NO: 436을 포함하는, 이중특이적 항체.
제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 VH 도메인은 HCDR3 SEQ ID NO: 635를 포함하는, 이중특이적 항체.
제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 VH 도메인은 HCDR3 SEQ ID NO: 433을 포함하는, 이중특이적 항체.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 VH 도메인은 N1280H와 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는, 이중특이적 항체.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 VH 도메인은 N1280H HCDR1 SEQ ID NO: 441, N1280H HCDR2 SEQ ID NO: 436 및 N1280H HCDR3 SEQ ID NO: 433을 포함하는 N1280H HCDR 세트를 포함하는, 이중특이적 항체.
제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 제1 VH 도메인은 N1280H VH 도메인 SEQ ID NO: 443인, 이중특이적 항체.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 VH 도메인은 N1441H VH 도메인 SEQ ID NO: 456인, 이중특이적 항체.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 VH 도메인은 T0201H HCDR1 SEQ ID NO: 462인 HCDR1, T0201H HCDR2 SEQ ID NO: 467인 HCDR2, 및/또는 T0201H HCDR3 SEQ ID NO: 468인 HCDR3을 포함하는, 이중특이적 항체.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 VH 도메인은 HCDR1 SEQ ID NO: 636 또는 SEQ ID NO: 598을 포함하고/하거나; 제2 VH 도메인은 HCDR2 SEQ ID NO: 467을 포함하고/하거나; 제2 VH 도메인은 HCDR3 SEQ ID NO: 637, SEQ ID NO: 638, SEQ ID NO: 639 또는 SEQ ID NO: 565를 포함하는, 이중특이적 항체.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 VH 도메인은 SEQ ID NO: 632를 포함하는, 이중특이적 항체.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 VL 도메인 및 제2 VL 도메인은 각각 0128L SEQ ID NO: 10과 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는, 이중특이적 항체.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 VL 도메인 및 제2 VL 도메인은 각각 0128L LCDR1 SEQ ID NO: 6, 0128L LCDR2 SEQ ID NO: 7 및 0128L LCDR3 SEQ ID NO: 8을 포함하는 0128L CDR 세트를 포함하는, 이중특이적 항체.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 VL 도메인 및 제2 VL 도메인은 아미노산 서열에서 동일한 것인, 이중특이적 항체.
제19항에 있어서, 상기 제1 VL 도메인 및 제2 VL 도메인은 0325L 아미노산 서열 SEQ ID NO: 416을 포함하는, 이중특이적 항체.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 중쇄-경쇄 쌍은 CH1 도메인과 쌍형성된 CL 불변 도메인을 추가로 포함하는, 이중특이적 항체.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄-경쇄 쌍은 공통 경쇄를 포함하는, 이중특이적 항체.
제22항에 있어서, 상기 공통 경쇄는 0128L 경쇄의 CL 아미노산 서열 SEQ ID NO: 146을 포함하는, 이중특이적 항체.
제23항에 있어서, 상기 공통 경쇄는 0325L 경쇄 SEQ ID NO: 414인, 이중특이적 항체.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 중쇄-경쇄의 중쇄는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제1 중쇄-경쇄 쌍 및 제2 중쇄-경쇄 쌍은 회합되어 중쇄 불변 영역의 이량체화를 통해 사량체성 면역글로불린을 형성하는, 이중특이적 항체.
제25항에 있어서, 상기 제1 중쇄-경쇄 쌍의 중쇄 불변 영역은 제2 중쇄-경쇄 쌍의 중쇄 불변 영역으로부터의 상이한 아미노산 서열을 포함하며, 상기 상이한 아미노산 서열은 중쇄 불변 영역의 헤테로이량체화를 촉진하도록 조작되는, 이중특이적 항체.
제26항에 있어서, 상기 중쇄 불변 영역은 납-인투-홀(knobs-into-holes) 돌연변이 또는 전하쌍 돌연변이를 포함하는, 이중특이적 항체.
제26항에 있어서, 하나의(예를 들어, 제1) 중쇄-경쇄 쌍의 중쇄 불변 영역은 치환 K439E를 포함하는 인간 IgG4 불변 영역이며, 다른(예를 들어, 제2) 중쇄-경쇄 쌍의 중쇄 불변 영역은 치환 E356K를 포함하는 IgG4 영역이고, 불변 영역 숫자매김은 EU 숫자매김 시스템에 따른 것인, 이중특이적 항체.
제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 또는 둘 다의 중쇄-경쇄 쌍의 중쇄 불변 영역은 치환 S228P를 포함하는 인간 IgG4 불변 영역이고, 불변 영역 숫자매김은 EU 숫자매김 시스템에 따른 것인, 이중특이적 항체.
제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 하나의(예를 들어, 제1) 중쇄-경쇄 쌍의 중쇄 불변 영역은 SEQ ID NO: 409를 포함하고, 다른(예를 들어, 제2) 중쇄-경쇄 쌍의 중쇄 불변 영역은 SEQ ID NO: 410을 포함하는, 이중특이적 항체.
제25항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 VH 도메인 아미노산 서열 SEQ ID NO: 443 또는 SEQ ID NO: 456를 포함하는 제1 중쇄,
제2 VH 도메인 아미노산 서열 SEQ ID NO: 632를 포함하는 제2 중쇄, 및
VL 도메인 아미노산 서열 SEQ ID NO: 416을 포함하는 공통 경쇄를 포함하는, 이중특이적 항체.
제25항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
아미노산 서열 SEQ ID NO: 419를 포함하는 제1 중쇄,
아미노산 서열 SEQ ID NO: 421을 포함하는 제2 중쇄, 및
아미노산 서열 SEQ ID NO: 414를 포함하는 공통 경쇄를 포함하는, 이중특이적 항체.
제25항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
아미노산 서열 SEQ ID NO: 426을 포함하는 제1 중쇄,
아미노산 서열 SEQ ID NO: 421을 포함하는 제2 중쇄, 및
아미노산 서열 SEQ ID NO: 414를 포함하는 공통 경쇄를 포함하는, 이중특이적 항체.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 인간 IgG인, 이중특이적 항체.
제34항에 있어서, 상기 항체는 인간 IgG4인, 이중특이적 항체.
FIXa 및 FX에 결합하고 FX의 FIXa-매개 활성화를 촉매화하는 이중특이적 항체로서, 상기 항체는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍을 포함하며,
제1 중쇄-경쇄 쌍은 제1 VL 도메인과 쌍형성된 제1 VH 도메인을 포함하는 FIXa 결합 Fv 영역을 포함하고, 상기 제1 VH 도메인은 N1280H VH 도메인 SEQ ID NO: 443과 아미노산 서열에서 적어도 98% 동일하고,
제2 중쇄-경쇄 쌍은 제2 VL 도메인과 쌍형성된 제2 VH 도메인을 포함하는 FX 결합 Fv 영역을 포함하고, 상기 제2 VH 도메인은 T0999H VH 도메인 SEQ ID NO: 632와 아미노산 서열에서 적어도 98% 동일하고,
제1 중쇄-경쇄 쌍 및 제2 중쇄-경쇄 쌍은 각각 0325L 경쇄 아미노산 서열 SEQ ID NO: 414를 포함하는 공통 경쇄를 포함하는, 이중특이적 항체.
FIXa 및 FX에 결합하고 FX의 FIXa-매개 활성화를 촉매화하는 이중특이적 항체로서, 상기 항체는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍을 포함하며,
제1 중쇄-경쇄 쌍은 제1 VL 도메인과 쌍형성된 제1 VH 도메인을 포함하는 FIXa 결합 Fv 영역을 포함하고, 상기 제1 VH 도메인은 N1441H VH 도메인 SEQ ID NO: 456과 아미노산 서열에서 적어도 98% 동일하고,
제2 중쇄-경쇄 쌍은 제2 VL 도메인과 쌍형성된 제2 VH 도메인을 포함하는 FX 결합 Fv 영역을 포함하고, 상기 제2 VH 도메인은 T0999H VH 도메인 SEQ ID NO: 632와 아미노산 서열에서 적어도 98% 동일하고,
제1 중쇄-경쇄 쌍 및 제2 중쇄-경쇄 쌍은 각각 0325L 경쇄 아미노산 서열 SEQ ID NO: 414를 포함하는 공통 경쇄를 포함하는, 이중특이적 항체.
제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, FVIII-결핍 인간 혈액 혈장의 응고 시간을 aPTT 검정에서 22초 내지 28초까지 감소시키는, 이중특이적 항체.
제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, FX로부터 FXa로의 FIXa-매개 활성화를 에미시주맙과 적어도 동일한 규모까지 증강시키는, 이중특이적 항체.
제38항에 있어서, 상기 응고 시간 또는 FIXa-매개 활성화는 37℃에서 0.1 mg/ml, 0.3 mg/ml 또는 0.5 mg/ml의 항체 농도에서 결정된 바와 같은 것인, 이중특이적 항체.
제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 형광분석(fluorometric) 트롬빈 발생 검정(TGA: thrombin generation assay)에서 에미시주맙의 C_최대 EC50의 10% 이내에 있거나 C_최대 EC50보다 더 낮은, 상기 검정에서 C_최대에 대한 EC50을 갖고/갖거나 항체는 형광분석 TGA에서 200 내지 450 nM 트롬빈의 C_최대의 최대 반응을 발생시키는, 이중특이적 항체.
제41항에 있어서, 상기 항체는 형광분석 TGA에서 C_최대에 대해 50 nM 미만의 EC50을 갖는, 이중특이적 항체.
제42항에 있어서, 형광분석 TGA에서 C_최대에 대해 10 nM 미만의 EC50을 갖는, 이중특이적 항체.
제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, C_최대에 대한 최대 반응은 250 nM 내지 400 nM인, 이중특이적 항체.
제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 제1 중쇄-경쇄 쌍의 2개 복사체를 포함하는 항-FIXa 항체.
제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 제2 중쇄-경쇄 쌍의 2개 복사체를 포함하는 항-FX 항체.
제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 따른 항체를 인코딩하는 단리된 핵산.
시험관내 숙주 세포로서,
제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 제1 VH 도메인을 포함하는 항체 중쇄,
제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 제2 VH 도메인을 포함하는 항체 중쇄, 및/또는
제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 제1 또는 제2 VL 도메인을 포함하는 항체 경쇄를 인코딩하는 DNA를 포함하는, 숙주 세포.
제48항에 있어서,
아미노산 서열 SEQ ID NO: 419 또는 SEQ ID NO: 426을 포함하는 제1 중쇄,
아미노산 서열 SEQ ID NO: 421을 포함하는 제2 중쇄, 및
아미노산 서열 SEQ ID NO: 414를 포함하는 공통 경쇄를 인코딩하는 재조합 DNA를 포함하는, 숙주 세포.
시험관내 숙주 세포 집단으로서, 각각의 숙주 세포는 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체를 인코딩하는 재조합 DNA를 포함하는, 숙주 세포 집단.
제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체의 생성을 위한 키트로서,
제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 제1 VH 도메인을 포함하는 항체 중쇄, 또는 상기 중쇄를 인코딩하는 핵산,
제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 제2 VH 도메인을 포함하는 항체 중쇄, 또는 상기 중쇄를 인코딩하는 핵산,
제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 제1 VL 도메인을 포함하는 항체 경쇄, 또는 상기 경쇄를 인코딩하는 핵산, 및
제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 제2 VL 도메인을 포함하는 항체 경쇄, 또는 상기 경쇄를 인코딩하는 핵산을 포함하는, 키트.
제51항에 있어서,
아미노산 서열 SEQ ID NO: 419 또는 SEQ ID NO: 426을 포함하는 제1 중쇄, 또는 상기 제1 중쇄를 인코딩하는 핵산,
아미노산 서열 SEQ ID NO: 421을 포함하는 제2 중쇄, 또는 상기 제2 중쇄를 인코딩하는 핵산, 및
아미노산 서열 SEQ ID NO: 414를 포함하는 공통 경쇄, 또는 상기 공통 경쇄를 인코딩하는 핵산을 포함하는, 키트.
제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체를 생성하는 방법으로서, 이중특이적 항체의 발현을 위한 조건 하에 제48항 또는 제49항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 숙주 세포 배양물로부터 상기 이중특이적 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체 또는 제47항에 따른 단리된 핵산을 약학적으로 허용 가능한 부형제와 함께 용액에서 포함하는 조성물.
혈우병 A 환자에서 출혈을 제어하는 방법으로서, 제54항에 따른 조성물을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
제54항에 있어서, 치료법에 의한 인체의 치료 방법에 사용하기 위한, 조성물.
제54항에 있어서, 혈우병 A 환자에서 출혈을 제어하는 방법에 사용하기 위한, 조성물.
혈우병 A 환자에서 출혈을 제어하기 위한 약제의 제조에 있어서, 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체의 사용.
제55항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 혈류 내 저해성 항체의 존재로 인해 FVIII에 의한 치료에 내성인, 방법, 사용하기 위한 조성물, 또는 사용.
제55항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 혈류 내 저해성 항체의 존재로 인해 FIXa 및 FX에 대한 또 다른 이중특이적 항체에 의한 치료에 내성인, 방법, 사용하기 위한 조성물, 또는 사용.
제60항에 있어서, 상기 환자는 에미시주맙(emicizumab)에 의한 치료에 내성인, 방법, 사용하기 위한 조성물, 또는 사용.
FVIIIa 활성을 대체하는 폴리펩타이드에 의한 치료를 받고 있는 혈우병 A 환자에서 저해성 항-약물 항체의 발달을 감소시키는 방법으로서,
제1 FVIIIa-활성 대체 폴리펩타이드 약물을 상기 환자에게 1 내지 12개월의 기간 동안 투여하는 단계,
제2의 상이한 FVIIIa-활성 대체 폴리펩타이드 약물을 상기 환자에게 1 내지 12개월의 기간 동안 스위칭(switch)하는 단계, 및
제1 항원-결합 분자 또는 제3의 상이한 FVIIIa-활성 대체 폴리펩타이드 약물을 상기 환자에게 1 내지 12개월의 기간 동안 스위칭하는 단계를 포함하고,
제1, 제2 또는 제3 FVIIIa-활성 대체 폴리펩타이드 약물은 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체이며,
각각의 경우, FVIIIa-활성 대체 폴리펩타이드 약물 또는 이의 인코딩 핵산은 환자에서 치료적 유효량으로 투여되어 FVIIIa를 기능적으로 대체하고, 임의의 FVIIIa-활성 대체 폴리펩타이드 약물에 대한 저해성 항-약물 항체를 발달시키는 환자의 위험성은 해당 FVIIIa-활성 대체 폴리펩타이드 약물에 의한 치료를 계속 받고 있는 환자와 비교하여 감소되는, 방법.
FVIIIa-활성 대체 폴리펩타이드 약물 또는 이의 인코딩 핵산을 포함하는, 저해성 항-약물 항체의 발달을 감소시키는 한편 혈우병 A 환자를 치료하는 방법에 사용하기 위한 조성물, 또는 저해성 항-약물 항체의 발달을 감소시키는 한편 혈우병 A 환자를 치료하는 방법에 사용하기 위한 약제의 제조를 위한 FVIIIa-활성 대체 폴리펩타이드 약물 또는 이의 인코딩 핵산의 사용으로서,
상기 방법은
제1 FVIIIa-활성 대체 폴리펩타이드 약물을 상기 환자에게 1 내지 12개월의 기간 동안 투여하는 단계,
제2의 상이한 FVIIIa-활성 대체 폴리펩타이드 약물을 상기 환자에게 1 내지 12개월의 기간 동안 스위칭하는 단계, 및
제1 항원-결합 분자 또는 제3의 상이한 FVIIIa-활성 대체 폴리펩타이드 약물을 상기 환자에게 1 내지 12개월의 기간 동안 스위칭하는 단계를 포함하고,
제1, 제2 또는 제3 FVIIIa-활성 대체 폴리펩타이드 약물은 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체이며,
각각의 경우, FVIIIa-활성 대체 폴리펩타이드 약물 또는 이의 인코딩 핵산은 환자에서 치료적 유효량으로 투여되어 FVIIIa를 기능적으로 대체하고, 임의의 FVIIIa-활성 대체 폴리펩타이드 약물에 대한 저해성 항-약물 항체를 발달시키는 환자의 위험성은 해당 FVIIIa-활성 대체 폴리펩타이드 약물에 의한 치료를 계속 받고 있는 환자와 비교하여 감소되는, 사용하기 위한 조성물, 또는 사용.
제62항 또는 제63항에 있어서, 상기 제1, 제2 및 제3 FVIIIa-활성 대체 폴리펩타이드 약물은 임의의 순서의 재조합 또는 혈장-유래 FVIII, 에미시주맙, 및 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체인, 방법, 사용하기 위한 조성물, 또는 사용.
제55항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료는 상기 환자에게의 상기 조성물의 피하 투여를 포함하는, 방법, 사용하기 위한 조성물, 또는 사용.