JP2022515770A - 共通の軽鎖を有するFIXa×FX二重特異性抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
第1および第2の抗体Fv領域であって、第1および第2の抗体Fv領域は、それぞれFIXaおよびFXについての結合部位を含む、第1および第2の抗体Fv領域と、
インビボで分子の半減期を延長するための半減期延長領域と、を含み得る。
免疫グロブリン重鎖v、d、およびj遺伝子セグメントの組換えを通して生成されたVHドメインであって、vおよびj遺伝子セグメントが、IGHV1-46(例えば、VH1-46*03)およびIGHJ1(例えば、JH1*01)であり、任意選択で、d遺伝子セグメントが、IGHD6-6(例えば、DH6-6*01)である、VHドメインと、
免疫グロブリン軽鎖vおよびj遺伝子セグメントの組換えを通して生成されたVLドメインであって、vおよびj遺伝子セグメントが、IGLV3-21(例えば、VL3-21*d01)およびIGLJ2(例えば、JL2*01)またはIGLJ3(例えば、JL3*02)である、VLドメインと、を含む抗体Fv領域を含んでもよい。
第1の重鎖-軽鎖対は、第1のVLドメインと対になった第1のVHドメインを含むFIXa結合性Fv領域を含み、
第2の重鎖-軽鎖対は、第2のVLドメインと対になった第2のVHドメインを含むFX結合性Fv領域を含み、
第1のVHドメインは、HCDR1は配列番号406であり、HCDR2は配列番号407であり、HCDR3は配列番号408であると定義されたアミノ酸配列を有するHCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含むHCDRのセットを含み、および/または第1のVHドメインは、アミノ酸配列レベルでN1280H VHドメインと少なくとも95%同一であり、
第2のVHドメインは、アミノ酸配列レベルでT0201H VHドメインと少なくとも95%同一であり、
第1のVLドメインおよび第2のVLドメインが、各々、LCDR1は配列番号6であり、LCDR2は配列番号7であり、LCDR3は配列番号8であると定義されたアミノ酸配列を有するLCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含むLCDRのセットを含み、および/または第1のVLドメインおよび第2のVLドメインが、アミノ酸配列レベルで配列番号10の0128L VLドメインと少なくとも95%同一である。
第1の重鎖-軽鎖対は、第1のVLドメインと対になった第1のVHドメインを含むFIXa結合性Fv領域を含み、
第2の重鎖-軽鎖対は、第2のVLドメインと対になった第2のVHドメインを含むFX結合性Fv領域を含み、
第1のVHドメインは、免疫グロブリン重鎖v、d、およびj遺伝子セグメントの組換え産物であり、v遺伝子セグメントは、IGHV3-7(例えば、VH3-7*01)であり、j遺伝子セグメントは、IGHJ6(例えば、JH6*02)であり、
第2のVHドメインは、免疫グロブリン重鎖v、d、およびj遺伝子セグメントの組換え産物であり、v遺伝子セグメントは、IGHV1-46(例えば、VH1-46*03)であり、j遺伝子セグメントは、IGHJ1(例えば、JH1*01)であり、任意選択で、d遺伝子セグメントは、IGHD6-6(例えば、DH6-6*01)であり、
第1のVLドメインおよび第2のVLドメインは、共に、ヒト免疫グロブリン軽鎖vおよびj遺伝子セグメントの組換え産物であり、v遺伝子セグメントは、IGLV3-21(例えば、VL3-21*d01)であり、j遺伝子セグメントは、IGLJ2(例えば、JL2*01)またはIGLJ3(例えば、JL3*02)である。
第1の重鎖-軽鎖対は、第1のVLドメインと対になった第1のVHドメインを含むFIXa結合性Fv領域を含み、
第2の重鎖-軽鎖対は、第2のVLドメインと対になった第2のVHドメインを含むFX結合性Fv領域を含み、
第1のVHドメインは、N1280H VHドメインと少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有し、
第2のVHドメインは、T0201H VHドメインと少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有し、
第1のVLドメインおよび第2のVLドメインは各々、0128L VLドメインと少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有する。
FR3のLys84での別の残基(例えば、Asp、Glu、His、Asn、Gln、Met、Thr、Gly、Ser、Ala、Ile、Leu、ValまたはTyr)の置換、例えば、Lys84AspまたはLys84Glu、および
FR3のSer86での別の残基、例えば、Glu(Ser86Glu)などの負に帯電した残基の置換。
Gln3、Val5、Gly9、Gly11、Gly16、Gly17、およびLeu21 FR1のうちの1つ以上での負に帯電した残基(例えば、AspもしくはGlu)またはHisの置換、例えば、Gln3Asp、Gln3Glu、Gln3His、Val5Glu、Gly9Glu、Gly11Asp、Gly11Glu、Gly11His、Gly16Glu、Gly17Asp、Gly17Glu、またはLeu21Aspのうちのいずれか、
FR3のVal68および/またはVal71での負に帯電した残基の置換、例えば、Val68Asp、Val68Glu、またはVal71Glu、
FR3のArg75でのHis、Gln、またはLeuの置換、
FR3のArg80でのSer、Thr、Gly、Leu、またはLysの置換、ならびに
FR3のAsn82でのAspまたはHisの置換。
T0201 HCDR1もしくはT0736 HCDR1であるHCDR1、
T0201 HCDR2であるHCDR2、および/または
T0201 HCDR3、T0687 HCDR3、もしくはT0736 HCDR3であるHCDR3。
Cys114での別のアミノ酸残基の置換、例えば、置換された残基がIle、Gln、Arg、ValまたはTrp(好ましくはIle、ValまたはLeu)である、
FR1のGln3について別の正に帯電した残基の置換、例えば、Gln3ArgまたはGln3Lys、
フレームワーク領域の残基の生殖細胞系列、例えば、Ile5Val(FR1の残基5でのイソロイシンについてバリンの置換)、またはフレームワーク領域の非生殖細胞系列残基の、異なる非生殖細胞系列残基による置換、例えば、Ile5Arg(FR1の残基5のイソロイシンについてアルギニンの置換)、
FR1のGlu11での別のアミノ酸残基(例えば、Lys、AlaまたはGly)の置換、例えば、Glu11Lys、
FR1のGly16についての正に帯電したアミノ酸残基の置換、例えば、Gly16Arg、
FR2の39位にMetが存在するか、代替的には、この位置にLeuが存在する、
CDR2の62位および/または64位にSerが存在する、
FR3のPhe71でのTyrの置換、
FR3のThr82での正に帯電した残基の置換、例えば、Thr82ArgまたはThr82Lys、FR3の85位でのSerの存在、または代替的にはこの位置でのThrの存在、
FR3のThr86での正に帯電した残基の置換、例えば、Thr86ArgまたはThr86Lys。
FIXa結合性Fv領域を含む抗体重鎖および軽鎖の第1の対(重鎖-軽鎖対)と、
FX結合性Fv領域を含む第2の重鎖-軽鎖対と、を含む、四量体免疫グロブリンであってもよく、
各重鎖は、VHドメインおよび定常領域を含み、各軽鎖は、VLドメインおよび定常領域を含み、第1および第2の重鎖-軽鎖対は、それらの重鎖定常領域のヘテロ二量体化を通して会合して、免疫グロブリン四量体を形成する。
1~30nM、例えば、1nM、3nM、10nM、および/または30nM、
100~300nM、例えば、100nMおよび/または300nM。
血液凝固カスケードが、図1に示される。凝固(Coagulation)または凝固(clotting)は、損傷した血管からの失血を止めて、血管が修復されることを可能にする、最も重要な生物学的プロセスのうちの1つである。凝固の機構には、フィブリンの沈着および成熟とともに、血小板の活性化、接着、および凝集を伴う。凝固の誤調節は、過度の出血(血友病)または閉塞性凝固(血栓症)を引き起こす可能性がある。凝固は、すべての哺乳動物において高度に保存されている。それは、凝固因子の複雑なネットワークによって制御される。血管の内側を覆う内皮が損傷すると、凝固が開始する。内皮下組織因子(TF)の血漿第VII因子(FVII)への曝露は、一次止血(外因性経路)をもたらし、損傷部位に緩い栓が形成される。追加の凝固因子、特に第IX因子(FIX)および第VIII因子(FVIII)の活性化は、二次止血(内因性経路)をもたらし、フィブリン鎖が形成されて栓を強化する。外因性および内因性経路は、最終的に共通点に集中し、カルシウムと一緒に、かつリン脂質表面上に結合した第Xa/Va因子複合体の形成が、プロトロンビン(第II因子)からトロンビン(第IIa因子)を生成する。
第IX因子は、補因子として第VIII因子を必要とするセリンプロテアーゼである。それは、不活性な前駆体として血液中を循環し、上述のように、止血チャレンジ時に内因性または外因性経路を通して活性化される。
文脈が他の意味を必要としない限り、本明細書で言及される第X因子は、ヒト第X因子であり、第Xa因子は、ヒト第Xa因子である。ヒトFXのアミノ酸配列が、図4に示される。
二重特異性抗原結合分子の望ましい特徴は、結合したFIXaが結合したFXを活性化することを可能にする方法で、FIXaおよびFXを結合することである。
二重特異性抗原結合分子のFIXa結合アームは、FIXaの軽鎖および/または重鎖に結合し得る。初期の研究は、実施例に記載のN128系統のFIXa結合アームが、単独で(重鎖の非存在下で)FIXa軽鎖に結合しないことを示した。
本発明による抗原結合分子、またはそのFX結合ポリペプチドアームは、10mM以下、好ましくは5mM以下、より好ましくは1mM以下のKDでヒトFXのECドメインに結合し得る。例えば、KDは、5μM~1nM、例えば、5μM~10nMであってもよい。
FIX、FIXa、FX、およびFXaに結合するための抗原結合分子の親和性は、平衡解離定数KD、会合のKa/Kd比またはオンレート(Ka)、および解離または結合相互作用のオフレート(kd)の観点から定量化され得る。KD、抗原結合のためのKaおよびKdは、表面プラズモン共鳴(SPR)を使用して測定され得る。SPRの手順および条件の例を実施例10に示す。
規制機関は、候補治療分子がヒトの臨床試験に進む前に実験動物における治療効果を実証していることを要求し得る。後天性血友病A動物モデルの一例は、FVIII中和抗体またはFVIIIに対する小分子阻害剤の投与を通して血液凝固が欠乏した状態にされ、それによりヒト血友病A患者の表現型を再現した、カニクイザルである。動物モデルにおける二重特異性抗原結合分子の試験を可能にするために、各アームの結合部位は、1つ以上の非ヒト哺乳動物からの対応する抗原と交差反応することが望ましい。したがって、抗原結合分子のFIXa結合部位は、ネズミ科(例えば、マウスもしくはラット)、ウサギ、または非ヒト霊長類(例えば、カニクイザル)FIXaならびにヒトFIXaに結合し得、FX結合部位は、ネズミ科(例えば、マウスもしくはラット)、ウサギ、または非ヒト霊長類(例えば、カニクイザル)FXaおよびヒトFXaに結合し得る。
FIXaを介したFXからFXaへの活性化を増強する二重特異性抗原結合分子の能力は、インビトロまたはインビボアッセイで決定され得る。
(i)FXaの形成に適した条件下(例えば、リン脂質の存在下、37℃の緩衝液中)で、二重特異性抗原結合分子をFIXaおよびFXと接触させることと、
(ii)FXaによって開裂可能である基質を添加して、検出可能な生成物を生成することと、
(iii)検出可能な生成物の存在を検出し、任意選択で定量化することと、を含む。
(a)遊離カルシウムイオンを欠くFVIII欠乏血漿を
(i)第IXa因子/リン脂質混合物を含むトリガー試薬、
(ii)トロンビンによる切断時に視覚的に検出可能なフルオロフォアを生成する蛍光発生基質(例えば、2nMのZGGR-AMC蛍光発生基質)、およびカルシウムイオン(例えば、100mMのCaCl2)を含む溶液(例えば、StagoからのFluCa試薬)、および
(iii)二重特異性抗体(例えば、純度95%~100%、例えば、99%~100%)と接触させること、
(b)FVIII模倣活性の存在がトロンビン生成をもたらし、したがってフルオロフォアからのシグナルをもたらす条件下で、血漿を37℃でインキュベートすること、
(c)蛍光を経時的に検出して、蛍光発生基質からフルオロフォアへの変換を監視すること、
(d)所定の濃度のトロンビンの溶液からの蛍光に対して検出された蛍光を較正すること、ならびに
(e)トロンボグラムの1つ以上のパラメーターを決定することであって、ここで、パラメーターは、
到達する最大トロンビンピーク高さ(Cmax)、
最大トロンビンピーク高さ到達するのにかかる時間(Tmax)、および/または
トロンビンピークが生成され始める前の開始段階の長さ(ラグタイム)である、決定すること、を含む。
-TGAのCmaxが500nMを超えないこと。任意選択で、Cmaxの最大応答は450nMを超えない、例えば、400nMを超えない。Cmaxの最大応答は、200~450nM、例えば250~350nMである。および/または
-TGAのTmaxは、最大応答1分以上である。任意選択で、Tmaxの最大応答は5分以上、4分以上、3分以上、または2分以上である。Tmaxの最大応答は、2~10分、例えば2~8分、または5~8分であり得る。
二重特異性抗原結合分子は、FIXa結合ポリペプチドアームおよびFX結合ポリペプチドアームを含む。それは、多鎖または単鎖ポリペプチド分子であってもよい。FIXa結合ポリペプチドアームおよびFX結合ポリペプチドアームは、二重特異性分子の異なる部分を表すが、1つのポリペプチドが任意選択で、FIXa結合アームおよびFX結合アームの両方の全部または一部を形成することができる。
FIXa結合性Fv領域を含む抗体重鎖および軽鎖の第1の対(重鎖-軽鎖対)と、
FX結合性Fv領域を含む第2の重鎖-軽鎖対と、を含む、四量体免疫グロブリンであり、
各重鎖は、VHドメインおよび定常領域を含み、各軽鎖は、VLドメインおよび定常領域を含み、第1および第2の重鎖-軽鎖対は、それらの重鎖定常領域のヘテロ二量体化を通して会合して、免疫グロブリン四量体を形成する。
上述のように、抗体は、様々なアイソタイプで、かつ異なる定常領域とともに提供され得る。抗体のFc領域は、Fc受容体によって認識され、抗体依存性細胞介在性細胞傷害(ADCC)活性、補体依存性細胞傷害(CDC)活性、および抗体依存性細胞食作用(ADCP)活性を含む、細胞性エフェクター機能を仲介する抗体の能力を決定する。これらの細胞性エフェクター機能は、Fc受容体を有する細胞の標的細胞の部位への動員を伴い、抗体結合細胞の死滅をもたらす。
CH1のLys196Gln、
ヒンジ領域のSer228Pro(P変異)、
CH2のDEターンのPhe296Tyr、
CH3のGlu356Lys、
CH3のLys439Glu、
CH3のLeu445Pro、
Gly446の欠失、
Lys447の欠失。
診療所で二重特異性抗体を使用することの難しさの1つは、歴史的に、大量かつ医薬品グレードの純度でそれらを産生することの難しさであった。「従来の」二重特異性IgG形式は、重鎖および軽鎖の2つの異なる対、したがって4つの異なるポリペプチド鎖を含み、これは、一緒に発現すると、アセンブルして10個の異なる潜在的な抗体分子になり得る。種の混合物は、ホモ二量体(ホモ二量体抗FIXa結合アームおよびホモ二量体抗FX結合アーム)、一方または両方の軽鎖がH-L対間で交換される分子、ならびに「正しい」二重特異性ヘテロ二量体構造を含む。
(a)1つ以上の多量体を形成するポリペプチド間の会合が2種以上の多量体を形成し得るヘテロ多量体において阻害されるように、元の核酸からのポリペプチド間の界面を形成するアミノ酸残基をコードする核酸を修飾することと、
(b)ステップ(a)によって修飾された核酸配列が発現されるように、宿主細胞を培養することと、
(c)宿主細胞培養物から該ヘテロ多量体を回収することと、
を含み、ステップ(a)の修飾は、界面を形成する変異残基を含む2つ以上のアミノ酸残基が同じ種類の正または負の電荷を保持するように、1つ以上のアミノ酸残基が置換されるように元の核酸を修飾する。
位置356および439
位置357および370
位置399および409
EU番号付けシステムに従っている残基番号付け、を含む。
第1の重鎖は、抗FIX VHドメインと、K439Eを含む定常領域とを含み得、第2の重鎖は、抗FX VHドメインと、E356Kを含む定常領域とを含み得るか、または
第1の重鎖は、抗FIX VHドメインと、E356Kを含む定常領域とを含み得、第2の重鎖は、抗FX VHドメインと、K439Eを含む定常領域とを含み得る。
(a)第1のCH3ドメインを含むポリペプチド鎖をコードする第1の核酸分子であって、この鎖は、EU番号付けシステムに従って366位にK残基を含む、第1の核酸分子と、
(b)第2のCH3ドメインを含むポリペプチド鎖をコードする第2の核酸分子であって、この鎖は、EU番号付けシステムに従って351位にD残基を含む、第2の核酸分子とを提供することを含み、
この方法は、宿主細胞を培養し、2つの核酸分子の発現を可能にし、培養物からヘテロ二量体のCH3ドメインを含む分子を採取するステップをさらに含む。
N末端からC末端まで、第1のエピトープに選択的に結合する第1のエピトープ結合領域、IgG1、IgG2、およびIgG4から選択されるヒトIgGの第1のCH3領域を含む免疫グロブリン定常領域を含む第1のポリペプチドと、
N末端からC末端まで、第2のエピトープに選択的に結合する第2のエピトープ結合領域、IgG1、IgG2、およびIgG4から選択されるヒトIgGの第2のCH3領域を含む免疫グロブリン定常領域を含む第2のポリペプチドと、を含み、ここで、第2のCH3領域は、プロテインAへの第2のCH3ドメインの結合を低減または排除する修飾を含む、ヘテロ二量体二重特異性抗原結合タンパク質を記載した。
抗体を同定および調製するための方法は、よく知られている。本明細書に記載の単離された(任意選択で変異された)核酸コード抗体(またはその重鎖-軽鎖対もしくはポリペプチド結合アーム)は、宿主細胞、例えば、議論されるようにCHO細胞に導入され得る。次いで、宿主細胞は、任意の所望の抗体形式を産生するために、抗体の(または抗体重鎖および/もしくは軽鎖可変ドメイン、重鎖-軽鎖対、またはポリペプチド結合アームの)発現のための条件下で培養される。いくつかの可能な抗体形式、例えば、免疫グロブリン全体、抗原結合断片、および他の設計が本明細書に記載されている。
(i)親抗体VHドメインのアミノ酸配列中の1つ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換、または挿入によって、親抗体VHドメインのアミノ酸配列バリアントである抗体VHドメインを提供することであって、
ここで、親抗体VHドメインは、図20に示されるVHドメイン、例えば、N1280Hであるか、またはこれらのVHドメインのいずれかの重鎖相補性決定領域を含むVHドメインである、提供することと、
(ii)任意選択で、そのように提供されたVHドメインをVLドメインと組み合わせて、VH/VLの組み合わせを提供することと、
(iii)VHドメインまたはそのように提供されたVH/VLドメインの組み合わせを試験して、1つ以上の所望の特性を有する抗体を同定することと、を含む方法によって産生され得る。
本発明に従って、二重特異性抗原結合分子、例えば、二重特異性抗体をコードする単離された核酸が提供され得る。核酸は、DNAおよび/またはRNAであってもよい。合成起源のゲノムDNA、cDNA、mRNA、もしくは他のRNA、またはそれらの任意の組み合わせは、抗体をコードすることができる。
本発明による二重特異性抗原結合分子(「二重特異性抗体(bispecifics)」)、およびそれらをコードする核酸分子は、通常、単離された形態で提供される。二重特異性抗体VHおよび/またはVLドメイン、ならびに核酸は、それらの自然環境または産生環境から精製されて提供されてもよい。単離された抗原結合分子および単離された核酸は、それらがインビボで見られる他のポリペプチドもしくは核酸、またはそれらが調製され(例えば、細胞培養)、そのような調製がインビトロでの組換えDNA技術によるものである環境など、それらが自然に会合される材料を含まないか、または実質的に含まない。任意選択で、単離された抗原結合分子または核酸は、(1)それが通常見られる少なくともいくつかの他のタンパク質を含まないか、(2)同じ源からの、例えば、同じ種からの他のタンパク質を本質的に含まないか、(3)異なる種の細胞によって発現されるか、(4)ポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、または自然界でそれが会合される他の材料の少なくとも約50%から単離されているか、(5)それが自然界で会合されていないポリペプチドと作動可能に会合されているか(共有結合もしくは非共有結合相互作用によって)、または(6)自然界で生じない。
コード核酸を含む培養宿主細胞からの2つの抗体重鎖および共通の軽鎖を発現させることと、
抗体重鎖および共通の軽鎖からアセンブルされた二重特異性抗体および単一特異性抗体を含む細胞培養物を取得することと、
(例えば、プロテインAクロマトグラフィーを使用して)細胞培養物から二重特異性抗体および単一特異性抗体を単離することと、
(例えば、陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して)単一特異性抗体から二重特異性抗体を精製することと、を含む方法により生成することができる。
約10μg/kg体重~約100mg/kg体重、
約50μg/kg体重~約5mg/kg体重、
約100μg/kg体重~約10mg/kg体重、
約100μg/kg体重~約20mg/kg体重、
約0.5mg/kg体重~約20mg/kg体重、または
約5mg/kg体重以下、例えば、4未満、3未満、2未満、または1mg/kg未満の抗体。
週に1回、1.5mg/kg、または
2週間に1回、3mg/kg、または
4週間に1回、6mg/kgの維持用量を続けることを推奨している。
本発明の二重特異性抗原結合分子は、療法によるヒトまたは動物の身体の治療方法で使用され得る。分子の治療指標は、以下を含む。
血友病Aの治療に使用する、
遺伝性第VIII因子欠乏症の治療に使用する、
血友病A患者における出血インシデントの数の大幅な減少のために使用する、
第VIII因子機能の代わりになるために使用する、
および/または
血液凝固の促進のために使用する。
以下の番号付きの項は、本発明の実施形態を表し、本記載の一部である。
第1の重鎖-軽鎖対は、第1のVLドメインと対になった第1のVHドメインを含むFIXa結合性Fv領域を含み、
第2の重鎖-軽鎖対は、第2のVLドメインと対になった第2のVHドメインを含むFX結合性Fv領域を含み、
第1のVHドメインが、HCDR1は配列番号406であり、HCDR2は配列番号407であり、HCDR3は配列番号408であると定義されたアミノ酸配列を有するHCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含むHCDRのセットを含み、および/または第1のVHドメインが、アミノ酸配列レベルでN1280H VHドメインと少なくとも95%同一であり、
第2のVHドメインが、アミノ酸配列レベルでT0201H VHドメイン、配列番号470と少なくとも95%同一であり、
第1のVLドメインおよび第2のVLドメインが、各々、LCDR1は配列番号6であり、LCDR2は配列番号7であり、LCDR3は配列番号8であると定義されたアミノ酸配列を有するLCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含むLCDRのセットを含み、および/または第1のVLドメインおよび第2のVLドメインが、アミノ酸配列レベルで配列番号10の0128L VLドメインと少なくとも95%同一である、二重特異性抗体。
第1の重鎖-軽鎖対は、第1のVLドメインと対になった第1のVHドメインを含むFIXa結合性Fv領域を含み、
第2の重鎖-軽鎖対は、第2のVLドメインと対になった第2のVHドメインを含むFX結合性Fv領域を含み、
第1のVHドメインが、免疫グロブリン重鎖v、d、およびj遺伝子セグメントの組換え産物であり、v遺伝子セグメントが、IGHV3-7(例えば、VH3-7*01)であり、j遺伝子セグメントが、IGHJ6(例えば、JH6*02)であり、
第2のVHドメインが、免疫グロブリン重鎖v、d、およびj遺伝子セグメントの組換え産物であり、v遺伝子セグメントが、IGHV1-46(例えば、VH1-46*03)であり、j遺伝子セグメントが、IGHJ1(例えば、JH1*01)であり、任意選択で、d遺伝子セグメントが、IGHD6-6(例えば、DH6-6*01)であり、
第1のVLドメインおよび第2のVLドメインが、共に、ヒト免疫グロブリン軽鎖vおよびj遺伝子セグメントの組換え産物であり、v遺伝子セグメントが、IGLV3-21(例えば、VL3-21*d01)であり、j遺伝子セグメントが、IGLJ2(例えば、JL2*01)またはIGLJ3(例えば、JL3*02)である、二重特異性抗体。
第1の重鎖-軽鎖対は、第1のVLドメインと対になった第1のVHドメインを含むFIXa結合性Fv領域を含み、
第2の重鎖-軽鎖対は、第2のVLドメインと対になった第2のVHドメインを含むFX結合性Fv領域を含み、
第1のVHドメインが、配列番号443のN1280H VHドメインと少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有し、
第2のVHドメインが、配列番号470のT0201H VHドメインと少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有し、
第1のVLドメインおよび第2のVLドメインが各々、配列番号10の0128L VLドメインと少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有する、二重特異性抗体。
第1のVHドメインの配列番号443または配列番号456のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、
第2のVHドメインの配列番号632のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、
VLドメインの配列番号416のアミノ酸配列を含む共通の軽鎖と、を含む、第66~71項のいずれかに記載の二重特異性抗体。
配列番号419のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、
配列番号421のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、
配列番号414のアミノ酸配列を含む共通の軽鎖と、を含む、第66~72項のいずれかに記載の二重特異性抗体。
配列番号424のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と
配列番号421のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、
配列番号414のアミノ酸配列を含む共通の軽鎖と、を含む、第66~71項のいずれかに記載の二重特異性抗体。
配列番号426のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と
配列番号421のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、
配列番号414のアミノ酸配列を含む共通の軽鎖と、を含む、第66~72項のいずれかに記載の二重特異性抗体。
配列番号428のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と
配列番号430のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、
配列番号414のアミノ酸配列を含む共通の軽鎖と、を含む、第66~71項のいずれかに記載の二重特異性抗体。
配列番号428のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と
配列番号432のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、
配列番号414のアミノ酸配列を含む共通の軽鎖と、を含む、第66~71項のいずれかに記載の二重特異性抗体。
第1の重鎖-軽鎖対が、第1のVLドメインと対になった第1のVHドメインを含むFIXa結合性Fv領域を含み、第1のVHドメインが、アミノ酸配列において、配列番号443のN1280H VHドメインと少なくとも98%同一であり、
第2の重鎖-軽鎖対が、第2のVLドメインと対になった第2のVHドメインを含むFX結合性Fv領域を含み、第2のVHドメインが、アミノ酸配列において、配列番号632のT0999H VHドメインと少なくとも98%同一であり、
第1および第2の重鎖-軽鎖対が各々、配列番号414の0325L軽鎖アミノ酸配列を含む共通の軽鎖を含む、二重特異性抗体。
第1の重鎖-軽鎖対が、第1のVLドメインと対になった第1のVHドメインを含むFIXa結合性Fv領域を含み、第1のVHドメインが、アミノ酸配列において、配列番号454のN1454H VHドメインと少なくとも98%同一であり、
第2の重鎖-軽鎖対が、第2のVLドメインと対になった第2のVHドメインを含むFX結合性Fv領域を含み、第2のVHドメインが、アミノ酸配列において、配列番号632のT0999H VHドメインと少なくとも98%同一であり、
第1および第2の重鎖-軽鎖対が各々、配列番号414の0325L軽鎖アミノ酸配列を含む共通の軽鎖を含む、二重特異性抗体。
第1の重鎖-軽鎖対が、第1のVLドメインと対になった第1のVHドメインを含むFIXa結合性Fv領域を含み、第1のVHドメインが、アミノ酸配列において、配列番号456のN1441H VHドメインと少なくとも98%同一であり、
第2の重鎖-軽鎖対が、第2のVLドメインと対になった第2のVHドメインを含むFX結合性Fv領域を含み、第2のVHドメインが、アミノ酸配列において、配列番号632のT0999H VHドメインと少なくとも98%同一であり、
第1および第2の重鎖-軽鎖対が各々、配列番号414の0325L軽鎖アミノ酸配列を含む共通の軽鎖を含む、二重特異性抗体。
第1の重鎖-軽鎖対が、第1のVLドメインと対になった第1のVHドメインを含むFIXa結合性Fv領域を含み、第1のVHドメインが、アミノ酸配列において、配列番号458のN1442H VHドメインと少なくとも98%同一であり、
第2の重鎖-軽鎖対が、第2のVLドメインと対になった第2のVHドメインを含むFX結合性Fv領域を含み、第2のVHドメインが、アミノ酸配列において、配列番号600のT0736H VHドメインと少なくとも98%同一であり、
第1および第2の重鎖-軽鎖対が各々、配列番号414の0325L軽鎖アミノ酸配列を含む共通の軽鎖を含む、二重特異性抗体。
第1の重鎖-軽鎖対が、第1のVLドメインと対になった第1のVHドメインを含むFIXa結合性Fv領域を含み、第1のVHドメインが、アミノ酸配列において、配列番号458のN1442H VHドメインと少なくとも98%同一であり、
第2の重鎖-軽鎖対が、第2のVLドメインと対になった第2のVHドメインを含むFX結合性Fv領域を含み、第2のVHドメインが、アミノ酸配列において、配列番号585のT0687H VHドメインと少なくとも98%同一であり、
第1および第2の重鎖-軽鎖対が各々、配列番号414の0325L軽鎖アミノ酸配列を含む共通の軽鎖を含む、二重特異性抗体。
第1の重鎖-軽鎖対が、第1のVLドメインと対になった第1のVHドメインを含むFIXa結合性Fv領域を含み、第1のVHドメインが、アミノ酸配列において、N1333H VHドメインと少なくとも98%同一であり、
第2の重鎖-軽鎖対が、第2のVLドメインと対になった第2のVHドメインを含むFX結合性Fv領域を含み、第2のVHドメインが、アミノ酸配列において、T0638H VHドメインと少なくとも98%同一であり、
第1および第2の重鎖-軽鎖対が各々、配列番号405の0128L軽鎖アミノ酸配列を含む共通の軽鎖を含む、二重特異性抗体。
第1~104項のいずれかに記載の第1のVHドメインを含む抗体重鎖、
第1~104項のいずれかに記載の第2のVHドメインを含む抗体重鎖、および/または
第1~104のいずれかに記載の第1または第2のVLドメインを含む抗体軽鎖、をコードする組換えDNAを含むインビトロでの宿主細胞。
配列番号419または配列番号426のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、
配列番号421のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、
配列番号414のアミノ酸配列を含む共通の軽鎖と、をコードする組換えDNAを含む、第108項に記載の宿主細胞。
第1~104項のいずれかに記載の第1のVHドメインを含む抗体重鎖、または該重鎖をコードする核酸、
第1~104項のいずれかに記載の第2のVHドメインを含む抗体重鎖、または該重鎖をコードする核酸、
第1~104項のいずれかに記載の第1のVLドメインを含む抗体軽鎖、または該軽鎖をコードする核酸、および
第1~104項のいずれかに記載の第2のVLドメインを含む抗体軽鎖、または該軽鎖をコードする核酸を含む、キット。
配列番号419または配列番号426のアミノ酸配列を含む第1の重鎖、または該第1の重鎖をコードする核酸、
配列番号421のアミノ酸配列を含む第2の重鎖、または該第2の重鎖をコードする核酸、および
配列番号414のアミノ酸配列を含む共通の軽鎖、または該共通の軽鎖をコードする核酸、を含む、第111項に記載のキット。
第1のFVIIIa活性に取って代わるポリペプチド薬物を、1~12か月間の期間にわたって患者に投与することと、
患者を、1~12か月間の期間にわたって、第2の異なるFVIIIa活性に取って代わるポリペプチド薬物に切り替えることと、
患者を、1~12か月間の期間にわたって、第1の抗原結合分子、または第3の異なるFVIIIa活性に取って代わるポリペプチド薬物のいずれかに切り替えることと、を含み、
第1、第2または第3のFVIIIa活性に取って代わるポリペプチド薬物は、第1~104項のいずれかに記載の二重特異性抗体であり、
各場合において、FVIIIa活性に取って代わるポリペプチド薬物またはそのコード核酸が、患者においてFVIIIaに機能的に取って代わる治療有効量で投与され、患者が、FVIIIa活性に取って代わるポリペプチド薬物のうちのいずれかに対して阻害抗薬物抗体を発生させるリスクが、そのFVIIIa活性に取って代わるポリペプチド薬物での治療を受け続けている患者と比較して低減される、方法。
第1のFVIIIa活性に取って代わるポリペプチド薬物を、1~12か月間の期間にわたって患者に投与することと、
患者を、1~12か月間の期間にわたって、第2の異なるFVIIIa活性に取って代わるポリペプチド薬物に切り替えることと、
患者を、1~12か月間の期間にわたって、第1の抗原結合分子、または第3の異なるFVIIIa活性に取って代わるポリペプチド薬物のいずれかに切り替えることと、を含み、
第1、第2または第3のFVIIIa活性に取って代わるポリペプチド薬物は、第1~104項のいずれかに記載の二重特異性抗体であり、
各場合において、FVIIIa活性に取って代わるポリペプチド薬物またはそのコード核酸が、患者においてFVIIIaに機能的に取って代わる治療有効量で投与され、患者が、FVIIIa活性に取って代わるポリペプチド薬物のうちのいずれかに対して阻害抗薬物抗体を発生させるリスクが、そのFVIIIa活性に取って代わるポリペプチド薬物での治療を受け続けている患者と比較して低減される、組成物または使用。
IXAX-0128.0201.0128(抗FIXa VHドメインN0128H;抗FX VHドメインT0201H;0128L共通軽鎖)
IXAX-0436.0201.0128
IXAX-0511.0201.0128
IXAX-1091.0201.0128
IXAX-1172.0201.0128
IXAX-1280.0201.0128
IXAX-1341.0201.0128
IXAX-1327.0201.0128
IXAX-1333.0201.0128
0128L VLドメインを含む共通の軽鎖を発現するトランスジェニックマウスをヒト第X因子で免疫化した。抗原特異的B細胞をフローサイトメトリーによって単一細胞選別し、VHおよびVL配列を次世代シーケンシング(NGS)で回収した。200個の抗FX重鎖が、単一細胞で選別されたリンパ球のNGS分析によって同定された。同じトランスジェニック動物から採取した骨髄およびリンパ節組織について、さらにバルクNGS分析を実施した。
各抗FX重鎖は、抗FIX N0128H重鎖および0128L共通軽鎖を含む二重特異性抗体としてHEK293細胞で発現された。二重特異性抗体は、参照により本明細書に組み込まれる2018年6月22日に提出された「Bispecific antibodies for factor IX and factor X」と題されたPCT/EP2018/066836に実質的に記載されるようにプロテインAによって精製された。
各々がN0128H抗FIX重鎖および0128L共通VLドメインと組み合わされた一連の異なる抗FX重鎖を含む200個の二重特異性抗体を、第Xa因子生成アッセイを使用してスクリーニングした。この機能的スクリーニングは、FVIIIa模倣活性、すなわち、酵素的「FXase」アッセイによってインビトロで、FIXaを介したFXのFXaへの活性化を増強(触媒)する能力を検出する。このアッセイでは、FXaの形成に適した条件下で、リン脂質の存在下において、試験二重特異性分子をFIXaおよびFXと接触させる。FXaの基質を添加し、これは、FXaによって開裂されると、検出可能な生成物を生成する。試験二重特異性抗体の存在下でのこの生成物の検出を、試験抗体が存在しない(対照抗体が含まれる場合がある)陰性対照と比較する。検出されたシグナルを、405nmでの反応溶液の吸光度を記録することによって定量化する。吸光度を、アッセイにおける広範囲の抗体濃度にわたって測定し、EC50値を、このアッセイにおける二重特異性抗体の効力の尺度として計算する。試験抗体と対照との間のEC50の有意差は、試験抗体がFIXaを介したFXの活性化を増強することが可能であることを示す。図7。
アッセイされたすべての二重特異性抗体の中で、単一の抗体が卓越したFXase活性を示した。0128L共通VLドメインと対になったN0128H抗FIX重鎖およびT0200H抗FX重鎖は、パネル内の他のすべての抗体よりも著しく高いFXase活性を示した。図8。
7.5μLのFIX(3.75μg/mL)、および組換え抗体を産生するExpi293細胞(実施例8)からの5μLの上清をアッセイプレートの各ウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。2.5μLのFXIa(10ng/mL)、5μLのFX(50ng/mL)、0.05μLのリン脂質(10mg/mL)、および5μLのTBSB-S緩衝液の混合物を各ウェルに添加して、酵素反応(FXaを生成するためのFXのFIXa開裂)を開始し、37℃で1時間インキュベートした。60分後、5μLの0.5M EDTAを添加することによって反応を終了した。10μLのS2765基質溶液を各ウェルに添加した後、405nm(参照波長655nm)での吸光度を30分間測定した(10分毎に1回読み取り)。特に明記しない限り、すべての反応を37℃で実施した。
TBSB:
0.1%ウシ血清アルブミンを含むトリス緩衝生理食塩水
7.5mLのTBSBを作製するには:
0.1mLの7.5% BSA溶液(Sigma)
7.4mLの1X TBS溶液(20X TBS溶液ThermoFisherから希釈)
TBSB-S:
5mMのCaCl2および1mMのMgCl2を含むTBSB
100mLのTBSB-Sを作製するには:
99.4mLのTBSB
0.5mLの1M CaCl2(Sigma)
0.1mLの1M MgCl2(Sigma)
FXIa原液(10μg/mL):
10mLのTBSB-Sを0.1mgのFXIa(Enzyme Research Laboratories)に添加して、10μg/mLの原液を作製する。
使用前に10ng/mL(1:1,000)の希釈標準溶液に希釈する。
F.IXa原液(5μg/mL)
100mLのTBSB-Sを0.5mg FIXa(HFIXa 1080)(Enzyme Research Laboratories)に添加して、5μg/mLの原液を作製する。
使用前に1.0μg/mL(1:5)の希釈標準溶液に希釈する。
FIX原液(37.5μg/mL):
13.3mLのTBSB-Sを0.5mgのFIX(Enzyme Research Laboratories)に添加して、37.5μg/mLの原液を作製する。
使用前に3.75μg/mL(1:10)の希釈標準溶液に希釈する。
FX希釈標準溶液(50μg/mL):
16mLのTBSB-Sを0.8mgのFX(Enzyme Research Laboratories)に添加して、50μg/mLの希釈標準溶液を作製する。
使用前にさらなる希釈は必要ない。
S2765原液:
25mgのS2765(Chromogenix)発色基質(0.035mmol)
2mMの原液を作製するには:
17.493mLの水をバイアルに添加し、振盪しながら溶解する。
ポリブレン溶液:
0.6g/Lの臭化ヘキサジメトリン原液を作製するには:
0.15gの臭化ヘキサジメトリン(Sigma)を250mLの水に添加する。
使用前に0.6mg/L(1:1,000)の希釈標準溶液に希釈する。
S2765基質希釈標準溶液
2mMのS-2765原液および0.6mg/Lのポリブレン溶液の1:1混合物。
N0128H抗FIX VHドメイン、T0200H抗FX VHドメイン、および0128L共通軽鎖を含むIXAX.0128.0200.0128と指定された二重特異性抗体は、他の二重特異性抗体と比較して高いFXase活性を示した。T0200H VHドメインは、なおさらに改善された二重特異性抗体の産生を試みるためのさらなる開発のために選択された。
系統発生分析
バルクNGS(実施例1)および系統発生分析から、113個の抗FX重鎖が、抗FX重鎖T0200Hと同じリンパ球クラスターに属するものとして同定された。このクラスターは、共通の進化系統を共有しているように見えるB細胞を表している。クラスター内の抗FX重鎖は、アミノ酸レベルでT0200Hと約95%の配列同一性を共有していた。図9。
FR1の5位でのバリン(V)のイソロイシン(I)による置換。
FR1の13位でのリジン(K)のグルタミン(Q)による置換。
FR2の39位でのロイシン(L)のメチオニン(M)による置換。
CDR2の62位でのスレオニン(T)のセリン(S)による置換。
CDR2の64位でのアスパラギン酸(D)のセリン(S)による置換。
FR3の85位でのスレオニン(T)のセリン(S)による置換。
CDR3の112位でのアラニン(A)のセリン(S)による置換。
VHドメインT0201HのCDR3を体系的に変異させて、各位置の残基が個別に別のアミノ酸に置き換えられたVHドメインのライブラリを提供した。得られたVHドメインはT0XXXHと名付けられ、ここで、IMGT位置114(Cys)、115(Leu)、116(Gln)、および117(Leu)の変異体のXXX番号が図12に示されている。IMGTの番号付けについては、図13を参照されたい。
CDR3に存在する対になっていないシステイン(C)残基は、高リスクの配列モチーフとして同定された。T0200HのCDR3の114位に存在するこの対になっていないシステインと、バルクNGS分析から同定された113個のさらなる抗FX VHドメインすべてが、二重特異性抗体の開発について開発責任を負っている。本発明者らは、T0201Hのこの位置にあるシステインを他のすべてのアミノ酸で置換したVHドメインをスクリーニングした。これらの新しいバリアントは、IgG4二重特異性抗体としてN1280H(実施例6を参照されたい)および0128L共通軽鎖で発現され、プロテインAによって精製され、FXaseアッセイによってFVIII模倣活性についてスクリーニングされた。114位のシステインをイソロイシン(I)、グルタミン(Q)、アルギニン(R)、バリン(V)、またはトリプトファン(W)で置き換えると、T0201HまたはT0202H VHドメインを有する二重特異性抗体と同様のFVIII模倣活性を有する二重特異性抗体が得られた。本発明者らは、C114は他の様々なアミノ酸に置き換えることができ、引き続きFVIII模倣活性を維持できると結論付けている。
CDR1、CDR2、およびCDR3の各アミノ酸残基を個別に変異させて、抗FIX N0128H重鎖の単一位置変異体を生成した。このように生成された抗FIX重鎖バリアントは、HEK293の抗FX重鎖T0201HおよびN0128L共通VLドメインと対になって二重特異性形式で発現された。
各々が0128L共通VLドメインと対になった、実施例5に記載のように生成されたVHドメインバリアントを含む抗FXアームを、実施例6に記載のように生成されたVHドメインバリアントを含む抗FIXアームと組み合わせ、FIXAxFX二重特異性抗体を生成し、テナーゼアッセイにおける機能的活性についてスクリーニングした。
実施例データを示す。
図10。
図15。
図16。
二重特異性抗体FVIII模倣活性の初期スクリーニングは、上記の実施例3に記載された標準FXase反応条件を使用して評価された。二重特異性抗体のFVIII模倣活性が増加するにつれて、標準FXase反応条件はFXase活性の改善を検出するのにもはや十分ではなかった。したがって、より感度の高い修飾されたFXase反応条件が確立された。
各々が0128L共通VLドメインと対になった、実施例5に記載のように生成されたVHドメインバリアントを含む抗FXアームを、実施例6に記載のように生成されたVHドメインバリアントを含む抗FIXアームと組み合わせ、FIXaxFX二重特異性抗体を生成した。血友病A患者の血液の凝固能力を修正する本発明の二重特異性抗体の能力を決定するために、FVIII欠乏血漿を使用した活性化部分トロンボプラスチン時間(aPTT)に対するこれらの抗体の効果を検査した。
実施例7および実施例8に記載されたものを含む様々な機能アッセイからのデータを考慮すると、抗FX VHドメインT0201およびその配列バリアントは、共通の軽鎖を有する二重特異性抗体において様々な抗FIX VHドメインと組み合わせて良好に機能することが注目された。例えば、抗FIX VHドメインN0128H、N0436H、N0511H、N1091H、N1172H、N1280H、N1314H、N1327H、およびN1333Hはすべて、二重特異性抗体で良好な機能的活性を示した。これらの抗FIX VHドメインは、密接な構造的関係を共有している。図20。それらの性能は、置換による残基の微調整(表N)および改善された活性に関連する置換の組み合わせによってさらに増強する可能性がある。
結合親和性および抗体-抗原相互作用の動力学は、SPRを使用して決定された。精製された試験抗体(すべてIgG4PE)の親和性および動態を、陽性対照としてのコンパレーター抗FIX抗体AbNまたはコンパレーター抗FX抗体AbT、および陰性対照としてのアイソタイプ対照(ISTC)と比較した。
分析した抗FIX抗体は、約0.18μM~0.3μMの親和性範囲でのFIXへの結合、ならびにFIXの高速会合(kオン)および解離(kオフ)速度を示した。分析された抗FIX抗体は、コンパレーター抗体AbNと比較して、FIXへのわずかに高い結合親和性およびより高い会合速度を示した。ISTCではFIXへの結合は観察されなかった。表E-10-1。
分析した抗FX抗体は、約0.1μM~1.4μMの親和性範囲でのFXへの結合、ならびにFXの高速会合(kオン)および解離(kオフ)速度を示した。ISTCではFXへの結合は観察されなかった。
SPRを使用して、FIXまたはFXそれぞれに対する結合親和性(KD)、反応速度定数オンレート(kオン)およびオフレート(kオフ)を決定した。Biacore 8K(GE Healthcare)システムを使用して分析を実施した。
FIXxFX二重特異性抗体IXAX-0436.0202.0128がFIXおよびFXに同時に結合する能力は、SPRを使用して実証された。精製された二重特異性抗体の結合動態をアイソタイプ対照(ISTC)と比較した。結合のセンサーグラムは、二重特異性抗体がFIXおよびFXに同時に結合する一方で、ISTCではFIXおよびFXへの結合が観察されなかったことを示した。図21A。
Biacore 8K(GE Healthcare)システムを使用してSPR分析を実施した。
二重特異性抗体の抗FIX結合アームは、N1280HのCDRを含むVHドメインおよび0128LのCDRを含むVLドメインとして「固定」され、性能を改善させるために抗FX VHドメインがさらに改良された。0128Lは共通の軽鎖として使用された。
CDR3(T0638H VH)のGln116Met;
CDR3(T0616H VH)のLeu115Ile;
CDR3(T0537H VH)のSer111APhe;
Cys114Ile Leu115Ile(T0666H VH);
Ser111APhe Cys114Ile Leu115Ile(T0678H VH);
Ser111APhe Cys114Leu Leu115Ile(T0681H VH);
Ser111APhe Cys114Val Leu115Ile(T0687H)。
トロンビン生成アッセイ(TGA)は、血漿中のトロンビンへのプロトロンビンの活性化を検出する。トロンビンが生成されると、蛍光発生基質がフルオロフォアに変換され、それが、プレートリーダーによって継続的に監視される。TGAは、FVIII欠乏血漿の凝固カスケードでFVIIIを置換する二重特異性抗体の能力の強力な尺度を提供し、TGAでのトロンビン生成の動態は、FVIII模倣薬のインビボ治療性能の指標として非常に信頼できると考えられている。
TGAトリガーとしての第IXa因子の適切な濃度を確立するために、本発明者らは、トリガー試薬に存在するFIXaの濃度を変化させながら、最初に固定濃度の二重特異性抗体を使用してTGAを実施した。本発明者らは、222nMのFIXaを含む1mlのMP試薬の原液は、Cmaxが418.11nMのトロンビン、Tmaxが7.67分、ラグタイムが5.83分の正常なプールされたヒト血漿(最終濃度、0.33nMのFIXa)のトロンビン生成を誘発するのに十分であると判断した。図26。これらの値は、健康な成人の基準範囲と同等であり(例えば、参考文献[11]の表3を参照)、TGAトリガーとしてのFIXaの使用を確証するものである。
TGAトリガーとして第IXa因子の適切な濃度を確立するための最初の実験作業では、健康な個人から採取した80μlの正常なプール血漿(Helena Biosciences)を、Immulon 2HB透明U底96ウェルプレート(ThermoFisher#3665)にて、20μlのトリガー試薬(様々な量のFIXaのみを含有するリン脂質から構成される微粒子(MP)試薬)と混合した。すべての試薬は製造元の指示に従って使用し、水浴で37℃に予熱した。
二重特異性抗体IXAX-1280.0999.0325の最大トロンビンピーク高さ(Cmax、nMのトロンビン)およびピークまでの時間(Tmax、分)を評価するために、本発明者らは、実施例13に記載された方法に従って、完全な抗体濃度用量を使用して、ヒトFVIII枯渇血漿でトロンビン生成アッセイ(TGA)を実施した。用量反応曲線から生成したデータは、非線形対数[抗体]対反応パラメーター可変勾配モデル(4パラメーターロジスティック回帰モデル)を使用して適合させた。比較のためにAbEを含めた。このアッセイで使用されたIXAX-1280.0999.0325およびAbEは、質量分析によって100%のヘテロ二量体に近く、ホモ二量体汚染物質は検出されなかったと判断された。
1.IXAX-1280.0999.0325.配列番号419の抗FIX重鎖、配列番号421の抗FX重鎖、配列番号414の共通の軽鎖。
2.IXAX-1454.0999.0325.配列番号424の抗FIX重鎖、配列番号421の抗FX重鎖、配列番号414の共通の軽鎖。
3.IXAX-1441.0999.0325.配列番号426の抗FIX重鎖、配列番号421の抗FX重鎖、配列番号414の共通の軽鎖。
4.IXAX-1442.0736.0325.配列番号428の抗FIX重鎖、配列番号430の抗FX重鎖、配列番号414の共通の軽鎖。
それぞれの抗原に結合するための精製された抗FIXおよび抗FX抗体の親和性および動態は、上記の実施例10に記載されるようにSPRによって決定された。
二重特異性抗体の発現を評価するために、IXAX-1172.0201.0128をミニプール分析の代表的な抗体として選択した。ミニプール分析は、大量(少なくとも1g/l)のヘテロ二量体二重特異性抗体を発現するCHO安定トランスフェクト細胞のスクリーニングを可能にし、安定した二重特異性抗体発現を評価する手段を表す。
二重特異性抗体の2つの重鎖および1つの共通の軽鎖の共発現は、二重特異性抗体および単一特異性抗体副産物を含む組成物を生成する。これらは、単一特異性ホモ二量体と比較した二重特異性ヘテロ二量体の等電点の違いを利用して、イオン交換クロマトグラフィーによって分離することができる。
IXAX-1280.0999.0128精製では、二重特異性抗体はExpi293F HEK細胞で一過性に発現した。細胞培養上清を回収し、濾過し、1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で平衡化した5mlのHiTrap MabSelect Sure(MSS)カラム(GE Healthcare)にロードした。カラムを5カラム容量のPBSで洗浄し、結合した抗体をIgG溶出液(ThermoFisher)を使用して溶出した。溶出した二重特異性抗体を4℃で一晩1xPBSに透析し、分子量10kDaのカットオフを有する遠心フィルターユニットを使用して濃縮した。
5.IXAX-1280.0999.0325.配列番号419の抗FIX重鎖、配列番号421の抗FX重鎖、配列番号414の共通の軽鎖。
6.IXAX-1454.0999.0325.配列番号424の抗FIX重鎖、配列番号421の抗FX重鎖、配列番号414の共通の軽鎖。
7.IXAX-1441.0999.0325.配列番号426の抗FIX重鎖、配列番号421の抗FX重鎖、配列番号414の共通の軽鎖。
8.IXAX-1442.0736.0325.配列番号428の抗FIX重鎖、配列番号430の抗FX重鎖、配列番号414の共通の軽鎖。
9.IXAX-1442.0687.0325.配列番号428の抗FIX重鎖、配列番号421の抗FX重鎖、配列番号414の共通の軽鎖。
治療用モノクローナル抗体の構造的完全性は、製品の不均一性をもたらす複数のタイプの翻訳後修飾によって損なわれる可能性がある。質量分析(MS)を使用して、陽イオン交換精製後の二重特異性抗体の品質を特徴付け、評価した。
実施例17に記載の精製の後、BiAb_1、2、3および4をそれぞれ、緩衝液1(酢酸ナトリウム、pH5.5)または緩衝液2(クエン酸/リン酸、pH6.0)のいずれかに緩衝液交換し、4℃で2週間保存するか、25℃で4週間保存するか、または1回の凍結/解凍サイクルに付した。処理による抗体の損失を計算するために、処理の前後にIgGの濃度を測定した。SEC-HPLCも、二重特異性抗体の分解および凝集を監視するために、処理の前後に実施された。BiAb_1、2、3、または4の明らかな損失または分解は観察されなかった。したがって、これらの4つの二重特異性抗体は、緩衝液1および緩衝液2の両方ですべて安定だった。
FXase動態アッセイを実行して、用量反応におけるIXAX-1280.0999.0325およびAbEの第VIII因子模倣活性を測定し、実施例7に従ってそれらのEC50値を決定した。用量反応曲線から生成したデータは、非線形対数[抗体]対反応パラメーター可変勾配モデル(4パラメーターロジスティック回帰モデル)を使用して適合させた。図39。y軸は、600秒のアッセイ時点でのOD405nm値をプロットしている。IXAX-1280.0999.0325およびAbEの両方のEC50値は、データの非線形回帰曲線から計算され、IXAX-1280.0999.0325のEC50は3.99nM、AbEのEC50は261.2nMだった。用量反応曲線が不完全だったため、これらは概算である。これにもかかわらず、IXAX-1280.0999.0325のEC50はAbEよりも有意に低いことは明らかである。IXAX-1280.0999.0325およびAbEの活性は用量依存的である。IXAX-1280.0999.0325は、AbEと比較して、特に低濃度で、より高いFVIII模倣活性を示した。
ヒト血漿中の第Xa因子産生を分析する発色アッセイ(HYPHEN BioMed)を使用して、IXAX-1280.0999.0325およびAbEの第VIII因子模倣活性を測定した。このアッセイでは、FXaの生成は、発色基質の添加後に測定されたOD405に比例する。抗体濃度用量反応曲線を生成し、非線形対数[抗体]対反応パラメーター可変勾配モデル(4パラメーターロジスティック回帰モデル)を使用して適合させた。用量反応に基づくEC50値を計算した。AbEの15.43nMと比較して、IXAX-1280.0999.0325のEC50値は5.92nMと計算された。
BIOPHEN FVIII:C(Ref.221402)キットは、製造元のアッセイプロトコルに従って使用された。簡単に説明すると、FVIII欠乏血漿(Helena Biosciences Europe)をトリス-BSA緩衝液(R4)を使用して1:40に希釈し、透明な底の96ウェルプレートに45μlを加えた。5μlの二重特異性抗体を希釈した血漿に加えた。37℃にプレインキュベートした試薬R1(FX)およびR2(FIXa)を各々50μlずつ各ウェルに添加し、37℃で5分間インキュベートした。続いて、50μlの試薬R3(SXa-11、発色試薬)を添加し、混合し、さらに5分間正確にインキュベートした。50μlの20%酢酸の添加により反応を停止させた。第Xa因子の生成は、特定の第Xa因子基質(SXa-11)を切断する第Xa因子の能力によって監視された。この基質が切断されると、着色生成物pNAが放出される。これは、分光光度計を使用して405nMで監視され、ブランク試料と比較することができる。
本発明者らは、完全抗体濃度用量反応(実施例8による方法)を使用して、IXAX-1280.0999.0325に対する二重特異性抗体AbEの活性化部分トロンボプラスチン時間(aPTT)を評価した。用量反応曲線から生成したデータは、非線形対数[抗体]対反応パラメーター可変勾配モデル(4パラメーターロジスティック回帰モデル)を使用して適合させた。
患者が外因的に投与されたFVIIIに対して同種抗体を産生した場合、第VIII因子補充療法は、血友病Aの患者の治療に効果がなくなる可能性がある。阻害性抗FVIII同種抗体は、FIX、リン脂質、およびヴォン・ヴィレブランド因子のFVIIIへの結合を遮断し、FVIIIを不活性にし得る。
IgG4二重特異性抗体IXAX-1280.0999.0325、IXAX-1441.0999.0325、およびAbEをCHO細胞で発現させた後、プロテインAクロマトグラフィー、続いて陽イオン交換クロマトグラフィーで精製し、活性ヘテロ二量体を汚染ホモ二量体から分離し、aPTTにより、6つの異なる濃度、300、100、33.3、11.1、3.7および1.23nMで分析した。aPTTは、実施例8に従って実行された。用量反応曲線から生成したデータは、非線形対数[抗体]対反応パラメーター可変勾配モデル(4パラメーターロジスティック回帰モデル)を使用して適合させた。IXAX-1280.0999.0325とIXAX-1441.0999.0325IgG4抗体はどちらも、AbEと同様の方法で、阻害性患者試料の凝固障害を救済することができた。図42。
阻害性血漿(70BU)でのトロンビン生成は、IXAX-1280.0999.0325、IXAX-1441.0999.0325、AbE IgG4二重特異性抗体について、以下のプロテインA、その後の陽イオン交換クロマトグラフィーでの精製を用いて、決定された。実施例13に従って、トロンビン生成アッセイを使用した。トロンビンピークがすべての二重特異性抗体で観察され、これは、IXAX-1280.0999.0325およびIXAX-1441.0999.0325の両方が、AbEと同様に、FVIIIに対する阻害性同種抗体を含有する血漿中の止血を機能的に回復できることを示している。
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Claims (65)
- FIXa及びFXに結合し、FXのFIXa媒介活性化を触媒する二重特異性抗体であって、前記抗体は2つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対を含み、
第1の重鎖-軽鎖対は、第1のVLドメインと対合した第1のVHドメインを含むFIXa結合性Fv領域を含み、
第2の重鎖-軽鎖対は、第2のVLドメインと対合した第2のVHドメインを含むFX結合性Fv領域を含み、
前記第1のVHドメインは、HCDR1が配列番号406であり、HCDR2が配列番号407であり、HCDR3が配列番号408であると定義されたアミノ酸配列を有するHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含むHCDRセットを含み、及び/又は前記第1のVHドメインはアミノ酸配列レベルでN1280H VHドメインと少なくとも95%同一であり、
前記第2のVHドメインはアミノ酸配列レベルで配列番号470のT0201H VHドメインと少なくとも95%同一であり、
前記第1のVLドメイン及び前記第2のVLドメインは、各々、LCDR1が配列番号6であり、LCDR2が配列番号7であり、LCDR3が配列番号8であると定義されたアミノ酸配列を有するLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含むLCDRセットを含み、及び/又は前記第1のVLドメイン及び前記第2のVLドメインはアミノ酸配列レベルで配列番号10の0128L VLドメインと少なくとも95%同一である、二重特異性抗体。 - FIXa及びFXに結合し、FXのFIXa媒介活性化を触媒する二重特異性抗体であって、前記抗体は2つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対を含み、
第1の重鎖-軽鎖対は、第1のVLドメインと対合した第1のVHドメインを含むFIXa結合性Fv領域を含み、
第2の重鎖-軽鎖対は、第2のVLドメインと対合した第2のVHドメインを含むFX結合性Fv領域を含み、
前記第1のVHドメインは、ヒト免疫グロブリン重鎖v、d及びj遺伝子セグメントの組換え産物であり、前記v遺伝子セグメントはIGHV3-7(例えば、VH3-7*01)であり、前記j遺伝子セグメントはIGHJ6(例えば、JH6*02)であり、
前記第2のVHドメインは、ヒト免疫グロブリン重鎖v、d及びj遺伝子セグメントの組換え産物であり、前記v遺伝子セグメントはIGHV1-46(例えば、VH1-46*03)であり、前記j遺伝子セグメントはIGHJ1(例えば、JH1*01)であり、任意に、前記d遺伝子セグメントはIGHD6-6(例えば、DH6-6*01)であってもよく、
前記第1のVLドメイン及び前記第2のVLドメインは、共に、ヒト免疫グロブリン軽鎖v及びj遺伝子セグメントの組換え産物であり、前記v遺伝子セグメントはIGLV3-21(例えば、VL3-21*d01)であり、前記j遺伝子セグメントはIGLJ2(例えば、JL2*01)又はIGLJ3(例えば、JL3*02)である、二重特異性抗体。 - FIXa及びFXに結合し、FXのFIXa媒介活性化を触媒する二重特異性抗体であって、前記抗体は2つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対を含み、
第1の重鎖-軽鎖対は、第1のVLドメインと対合した第1のVHドメインを含むFIXa結合性Fv領域を含み、
第2の重鎖-軽鎖対は、第2のVLドメインと対合した第2のVHドメインを含むFX結合性Fv領域を含み、
前記第1のVHドメインは、配列番号443のN1280H VHドメインと少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有し、
前記第2のVHドメインは、配列番号470のT0201H VHドメインと少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有し、
前記第1のVLドメイン及び前記第2のVLドメインは、各々、配列番号10の0128L VLドメインと少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有する、二重特異性抗体。 - 前記第1のVHドメインは、HCDR1が配列番号406であり、HCDR2が配列番号407であり、HCDR3が配列番号408であると定義されたアミノ酸配列を有するHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含むHCDRセットを含む、請求項1~3のいずれか1項に記載の二重特異性抗体。
- 前記第1のVHドメインが配列番号441のHCDR1を含む、請求項4に記載の二重特異性抗体。
- 前記第1のVHドメインが配列番号634のHCDR2を含む、請求項4又は5に記載の二重特異性抗体。
- 前記第1のVHドメインが配列番号436のHCDR2を含む、請求項4~6のいずれか1項に記載の二重特異性抗体。
- 前記第1のVHドメインが配列番号635のHCDR3を含む、請求項4~7のいずれか1項に記載の二重特異性抗体。
- 前記第1のVHドメインが配列番号433のHCDR3を含む、請求項4~8のいずれか1項に記載の二重特異性抗体。
- 前記第1のVHドメインが、N1280Hと少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有する、請求項1~9のいずれか1項に記載の二重特異性抗体。
- 前記前記第1のVHドメインが、配列番号441のN1280H HCDR1、配列番号436のN1280H HCDR2及び配列番号433のN1280H HCDR3を含むN1280H HCDRセットを含む、請求項1~10のいずれか1項に記載の二重特異性抗体。
- 前記第1のVHドメインが配列番号443のN1280H VHドメインである、請求項10又は11に記載の二重特異性抗体。
- 前記第1のVHドメインが配列番号456のN1441H VHドメインである、請求項1~11のいずれか1項に記載の二重特異性抗体。
- 前記第2のVHドメインが、配列番号462のT0201H HCDR1であるHCDR1、配列番号467のT0201H HCDR2であるHCDR2及び/又は配列番号468のT0201H HCDR3であるHCDR3を含む、請求項1~13のいずれか1項に記載の二重特異性抗体。
- 前記第2のVHドメインが配列番号636又は配列番号598のHCDR1を含み、前記第2のVHドメインが配列番号467のHCDR2を含み、及び/又は前記第2のVHドメインが配列番号637、配列番号638、配列番号639又は配列番号565のHCDR3を含む、請求項1~14のいずれか1項に記載の二重特異性抗体。
- 前記第2のVHドメインが配列番号632を含む、請求項1~15のいずれか1項に記載の二重特異性抗体。
- 前記第1のVLドメイン及び前記第2のVLドメインが、各々、配列番号10の0128Lと少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有する、請求項1~16のいずれか1項に記載の二重特異性抗体。
- 前記第1のVLドメイン及び前記第2のVLドメインが、各々、配列番号6の0128L LCDR1、配列番号7の0128L LCDR2及び配列番号8の0128L LCDR3を含む0128L CDRセットを含む、請求項1~17のいずれか1項に記載の二重特異性抗体。
- 前記第1のVLドメイン及び前記第2のVLドメインがアミノ酸配列において同一である、請求項1~18のいずれか1項に記載の二重特異性抗体。
- 前記第1のVLドメイン及び前記第2のVLドメインが配列番号416の0325Lアミノ酸配列を含む、請求項19に記載の二重特異性抗体。
- 各重鎖-軽鎖対が、CH1ドメインと対合したCL定常ドメインを更に含む、請求項1~20のいずれか1項に記載の二重特異性抗体。
- 前記重鎖-軽鎖対が共通の軽鎖を含む、請求項1~21のいずれか1項に記載の二重特異性抗体。
- 前記共通の軽鎖が0128L軽鎖の配列番号146のCLアミノ酸配列を含む、請求項22に記載の二重特異性抗体。
- 前記共通の軽鎖が配列番号414の0325L軽鎖である、請求項23に記載の二重特異性抗体。
- 各重鎖-軽鎖の重鎖が重鎖定常領域を含み、前記第1及び第2の重鎖-軽鎖対が会合して、前記重鎖定常領域の二量体化による四量体免疫グロブリンを形成している、請求項1~24のいずれか1項に記載の二重特異性抗体。
- 前記第1の重鎖-軽鎖対の前記重鎖定常領域が、前記第2の重鎖-軽鎖対の前記重鎖定常領域とは異なるアミノ酸配列を含み、前記互いに異なる2つのアミノ酸配列が、前記重鎖定常領域のヘテロ二量体化を促進するように操作されている、請求項25に記載の二重特異性抗体。
- 前記重鎖定常領域が、ノブ・イントゥ・ホール変異又は電荷対変異を含む、請求項26に記載の二重特異性抗体。
- 一方(例えば、第1)の重鎖-軽鎖対の前記重鎖定常領域が、置換K439Eを含むヒトIgG4定常領域であり、他方(例えば、第2)の重鎖-軽鎖対の前記重鎖定常領域が、置換E356Kを含むIgG4領域であり、定常領域の番号付けがEU番号付けシステムに従うものである、請求項26に記載の二重特異性抗体。
- 一方又は両方の重鎖-軽鎖対の前記重鎖定常領域が、置換S228Pを含むヒトIgG4定常領域であり、定常領域の番号付けが前記EU番号付けシステムに従うものである、請求項25~28のいずれか1項に記載の二重特異性抗体。
- 一方(例えば、第1)の重鎖-軽鎖対の前記重鎖定常領域が配列番号409を含み、他方(例えば、第2)の重鎖-軽鎖対の前記重鎖定常領域が配列番号410を含む、請求項25~29のいずれか1項に記載の二重特異性抗体。
- 配列番号443又は配列番号456の第1のVHドメインアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、
配列番号632の第2のVHドメインアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、
配列番号416のVLドメインアミノ酸配列を含む共通の軽鎖と
を含む請求項25~30のいずれか1項に記載の二重特異性抗体。 - 配列番号419のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、
配列番号421のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、
配列番号414のアミノ酸配列を含む共通の軽鎖と
を含む請求項25~31のいずれか1項に記載の二重特異性抗体。 - 配列番号426のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と
配列番号421のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、
配列番号414のアミノ酸配列を含む共通の軽鎖と
を含む請求項25~32のいずれか1項に記載の二重特異性抗体。 - ヒトIgGである請求項1~27のいずれか1項に記載の二重特異性抗体。
- ヒトIgG4である請求項34に記載の二重特異性抗体。
- FIXa及びFXに結合し、FXのFIXa媒介活性化を触媒する二重特異性抗体であって、前記抗体は2つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対を含み、
第1の重鎖-軽鎖対は、第1のVLドメインと対合した第1のVHドメインを含むFIXa結合性Fv領域を含み、前記第1のVHドメインは、アミノ酸配列において、配列番号443のN1280H VHドメインと少なくとも98%同一であり、
第2の重鎖-軽鎖対は、第2のVLドメインと対合した第2のVHドメインを含むFX結合性Fv領域を含み、前記第2のVHドメインは、アミノ酸配列において、配列番号632のT0999H VHドメインと少なくとも98%同一であり、
前記第1及び第2の重鎖-軽鎖対は、各々、配列番号414の0325L軽鎖アミノ酸配列を含む共通の軽鎖を含む、二重特異性抗体。 - FIXa及びFXに結合し、FXのFIXa媒介活性化を触媒する二重特異性抗体であって、前記抗体は2つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対を含み、
第1の重鎖-軽鎖対は、第1のVLドメインと対合した第1のVHドメインを含むFIXa結合性Fv領域を含み、前記第1のVHドメインは、アミノ酸配列において、配列番号456のN1441H VHドメインと少なくとも98%同一であり、
第2の重鎖-軽鎖対は、第2のVLドメインと対合した第2のVHドメインを含むFX結合性Fv領域を含み、前記第2のVHドメインは、アミノ酸配列において、配列番号632のT0999H VHドメインと少なくとも98%同一であり、
前記第1及び第2の重鎖-軽鎖対は、各々、配列番号414の0325L軽鎖アミノ酸配列を含む共通の軽鎖を含む、二重特異性抗体。 - aPTTアッセイにおいて、FVIII欠乏ヒト血漿の凝固時間を22~28秒に短縮する、請求項1~37のいずれか1項に記載の二重特異性抗体。
- 前記FXからFXaへのFIXa媒介活性化を少なくともエミシズマブと同程度に増強する、請求項1~38のいずれか1項に記載の二重特異性抗体。
- 前記凝固時間又はFIXa媒介活性化が、37℃で0.1mg/ml、0.3mg/ml又は0.5mg/mlの抗体濃度で決定される、請求項38に記載の二重特異性抗体。
- 蛍光測定トロンビン生成アッセイ(TGA)におけるエミシズマブのCmax EC50の10%以内であるか若しくは該EC50より低い、蛍光測定TGAにおけるCmaxに関するEC50を有し、及び/又は蛍光測定TGAにおいて200~450nM トロンビンのCmaxの最大応答を生じる請求項1~40のいずれか1項に記載の二重特異性抗体。
- 蛍光測定TGAにおけるCmaxに関するEC50が50nM未満である請求項41に記載の二重特異性抗体。
- 蛍光測定TGAにおけるCmaxに関するEC50が10nM未満である請求項42に記載の二重特異性抗体。
- 前記Cmaxの最大応答が250nM~400nMである、請求項1~43のいずれか1項に記載の二重特異性抗体。
- 請求項1~44のいずれか1項に記載の第1の重鎖-軽鎖対の2つのコピーを含む抗FIXa抗体。
- 請求項1~44のいずれか1項に記載の第2の重鎖-軽鎖対の2つのコピーを含む抗FX抗体。
- 請求項1~46のいずれか1項に記載の抗体をコードする単離された核酸。
- 請求項1~44のいずれか1項に記載の第1のVHドメインを含む抗体重鎖、
請求項1~44のいずれか1項に記載の第2のVHドメインを含む抗体重鎖、及び/又は
請求項1~44のいずれか1項に記載の第1若しくは第2のVLドメインを含む抗体軽鎖
をコードする組換えDNAを含むインビトロの宿主細胞。 - 配列番号419又は配列番号426のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、
配列番号421のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、
配列番号414のアミノ酸配列を含む共通の軽鎖と
をコードする組換えDNAを含む、請求項48に記載の宿主細胞。 - 各宿主細胞が、請求項1~44のいずれか1項に記載の二重特異性抗体をコードする組換えDNAを含むインビトロの宿主細胞の集団。
- 請求項1~44のいずれか1項に記載の二重特異性抗体を製造するキットであって、
請求項1~44のいずれか1項に記載の第1のVHドメインを含む抗体重鎖又は該重鎖をコードする核酸と、
請求項1~44のいずれか1項に記載の第2のVHドメインを含む抗体重鎖又は該重鎖をコードする核酸と、
請求項1~44のいずれか1項に記載の第1のVLドメインを含む抗体軽鎖又は該軽鎖をコードする核酸と、
請求項1~44のいずれか1項に記載の第2のVLドメインを含む抗体軽鎖又は該軽鎖をコードする核酸と
を含むキット。 - 配列番号419若しくは配列番号426のアミノ酸配列を含む第1の重鎖又は該第1の重鎖をコードする核酸と、
配列番号421のアミノ酸配列を含む第2の重鎖又は該第2の重鎖をコードする核酸と、
配列番号414のアミノ酸配列を含む共通の軽鎖又は該共通の軽鎖をコードする核酸と
を含む請求項51に記載のキット。 - 請求項1~44のいずれか1項に記載の二重特異性抗体を製造する方法であって、
請求項48又は49に記載の宿主細胞を、前記二重特異性抗体の発現のための条件下で培養すること、及び
前記宿主細胞の培養物から前記二重特異性抗体を回収すること
を含む方法。 - 請求項1~44のいずれか1項に記載の二重特異性抗体又は請求項47に記載の単離された核酸を、溶液中に、薬学的に許容される賦形剤と共に含む組成物。
- 血友病A患者における出血を制御する方法であって、請求項54に記載の組成物を前記患者に投与することを含む、方法。
- ヒト身体の治療方法における使用のための請求項54に記載の組成物。
- 血友病A患者の出血を制御する方法における使用のための請求項54に記載の組成物。
- 血友病A患者の出血を制御するための薬剤の製造のための請求項1~44のいずれか1項に記載の二重特異性抗体の使用。
- 前記患者が、血流中の阻害性抗体の存在に起因して、FVIIIを用いる治療に耐性である、請求項55~58のいずれか1項に記載の方法、使用のための組成物、又は使用。
- 前記患者が、血流中の阻害性抗体の存在に起因して、FIXa及びFXに対する別の二重特異性抗体を用いる治療に耐性である、請求項55~59のいずれか1項に記載の方法、使用のための組成物、又は使用。
- 前記患者がエミシズマブを用いる治療に耐性である、請求項60に記載の方法、使用のための組成物、又は使用。
- FVIIIa活性を補充するポリペプチドを用いる治療を受けている血友病A患者における、阻害性抗薬物抗体の発生を低減させる方法であって、
FVIIIa活性を補充する第1のポリペプチド薬物を、1~12か月の期間にわたって前記患者に投与することと、
FVIIIa活性を補充する第2の異なるポリペプチド薬物に切り替えて、1~12か月の期間にわたって前記患者に投与することと、
前記第1の抗原結合分子又はFVIIIa活性を補充する第3の異なるポリペプチド薬物のいずれかに切り替えて、1~12か月の期間にわたって前記患者に投与することと
を含み、
前記FVIIIa活性を補充する第1、第2又は第3のポリペプチド薬物は請求項1~44のいずれか1項に記載の二重特異性抗体であり、
各場合において、前記FVIIIa活性を補充するポリペプチド薬物又はそのコード核酸は、前記患者においてFVIIIaを機能的に補充する治療有効量で投与され、前記患者が、前記FVIIIa活性を補充するポリペプチド薬物のいずれかに対する阻害性抗薬物抗体を発生させるリスクが、該FVIIIa活性を補充するポリペプチド薬物による治療を受け続ける患者と比較して低減される、方法。 - 阻害抗薬物抗体の発生を低減させつつ血友病A患者を治療する方法で使用するための、FVIIIa活性を補充するポリペプチド薬物若しくはそのコード核酸を含む組成物、又は阻害抗薬物抗体の発生を低減させつつ血友病A患者を治療する方法で使用するための薬剤の製造のための、FVIIIa活性を補充するポリペプチド薬物若しくはそのコード核酸の使用であって、
前記治療方法が、
FVIIIa活性を補充する第1のポリペプチド薬物を、1~12か月の期間にわたって前記患者に投与することと、
FVIIIa活性を補充する第2の異なるポリペプチド薬物に切り替えて、1~12か月の期間にわたって前記患者に投与することと、
前記第1の抗原結合分子又はFVIIIa活性を補充する第3の異なるポリペプチド薬物のいずれかに切り替えて、1~12か月の期間にわたって前記患者に投与することと
を含み、
前記FVIIIa活性を補充する第1、第2又は第3のポリペプチド薬物は請求項1~44のいずれか1項に記載の二重特異性抗体であり、
各場合において、前記FVIIIa活性を補充するポリペプチド薬物又はそのコード核酸は、前記患者においてFVIIIaを機能的に補充する治療有効量で投与され、前記患者が、前記FVIIIa活性を補充するポリペプチド薬物のいずれかに対する阻害性抗薬物抗体を発生させるリスクが、該FVIIIa活性を補充するポリペプチド薬物による治療を受け続ける患者と比較して低減される、組成物又は使用。 - 前記FVIIIa活性を補充する第1、第2及び第3のポリペプチド薬物が、任意の順序で、組換えの又は血漿由来のFVIII、エミシズマブ及び請求項1~44のいずれか1項に記載の二重特異性抗体である、請求項62に記載の方法又は請求項63に記載の使用のための組成物若しくは使用。
- 前記治療が、前記患者への前記組成物の皮下投与を含む、請求項55~64のいずれか1項に記載の方法、使用のための組成物又は使用。
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