ES2119165T5

ES2119165T5 - Nueva actividad de cofactor anticoagulante.

Info

Publication number: ES2119165T5
Application number: ES94905908T
Authority: ES
Inventors: Bjorn Dahlback
Original assignee: TAC Thrombosis and Coagulation AB
Current assignee: TAC Thrombosis and Coagulation AB
Priority date: 1993-01-29
Filing date: 1994-01-28
Publication date: 2004-07-01
Anticipated expiration: 2014-01-28
Also published as: ES2119165T3; CZ184995A3; CA2154080A1; HU9502190D0; DE69411898T3; EP0690991B1; US20070212743A1; PL181102B1; FI953565A; EP0690991A1; HUT72191A; WO1994017415A1; EP0690991B2; CA2154080C; ATE168781T1; FI953565A0; BR9406223A; US7169572B1; DK0690991T4; NZ261190A

Abstract

UNA ACTIVIDAD ANTICOAGULANTE SANGUINEA NOVEDOSA, LLAMADA ACTIVIDAD 2 DE COFACTOR-APC, ES DECIR LA SEGUNDA ACTIVIDAD DE COFACTOR A LA PROTEINA C ( = APC) ACTIVADA. LA ACTIVIDAD DE COFACTOR ES PROBABLE QUE SEA ASOCIADA CON EL FACTOR V, POR QUE SE COMPORTA COMO UNA PROTEINA QUE PUEDE SER ENRIQUECIDA DESDE EL PLASMA CON METODOS QUE SON SIMILARES A AQUELLOS PARA EL FACTOR V. EN EL PAGE-SDS, LA FRACCION ENRIQUECIDA DA ORIGEN A TRES BANDAS MOLECULARES EN 175-250 KD. Y 100-180 KD. Y 330 KD. RESPECTICAMENTE. SE DESCRIBEN LOS DIFERENTES ASPECTOS, TALES COMO LAS PREPARACIONES ENRIQUECIDAS O DEFICIENTES EN LA ACTIVIDAD DE COFACTOR; LAS PREPARACIONES DE ANTICUERPOS ESPECIFICAS PARA LAS LOCALIZACIONES DE FACTOR V, ASOCIADAS CON LA ACTIVIDAD 2 DE COFACTOR APC; LOS USOS DE DIAGNOSTICO Y TERAPEUTICOS EN CONEXION CON EL TRATAMIENTO DE DESORDENES RELACIONADOS A DEFICIENCIAS EN LA ACTIVIDAD 2 DE COFACTOR APC, PROTEINA C Y/O PROTEINA S ADEMAS DE LOS DISTINTOS USOS DE PREPARACIONES ENRIQUECIDAS EN LA ACTIVIDAD 2DE COFACTOR APC (FACTOR V NORMAL), PROTEINA C/APC Y /O PROTEINA S. LA ACTIVIDAD 2 DE COFACTOR APC TAMBIEN PUEDE SER UTILIZADA TERAPEUTICAMENTE EN CONEXION CON OTRAS ENFERMEDADES, EN LAS CUALES LA ADMINISTRACION DEL COFACTOR ES BENEFICIOSA PARA EL PACIENTE.

Description

Nueva actividad de cofactor anticoagulante.

La presente invención se refiere, en general, a una nueva actividad de cofactor anticoagulante implicada en el sistema de coagulación de la sangre humana e implicada también, posiblemente, en el sistema de coagulación de la sangre de algunas otras especies de mamíferos.

La coagulación de la sangre es un sistema complejo en el que están involucradas muchas proteínas que actúan de común acuerdo con las plaquetas para producir hemostasis. El sistema de coagulación está estrictamente regulado por una serie de proteínas anticoagulantes presentes en el plasma y sobre la superficie de células sanguíneas endoteliales (Esmon, J. Biol. Chem. 264, 4743-4746 (1989); Bauer, Sem. Hematol. 28, 10-18 (1991); y Rapaport, Blood 73, 359-65 (1989)). En condiciones fisiológicas, los mecanismos pro- y anticoagulantes se equilibran delicadamente proporcionando hemostasis y coagulación. Las alteraciones de este equilibrio dan como resultado o bien hemorragia o bien trastornos tromboembólicos.

La presente invención se refiere a una nueva actividad implicada en un sistema anticoagulante fisio1ógicamente importantes, asociado con Proteína C y Proteína S, que ha sido aclarado en los últimos años y que se indica seguidamente como parte de las interacciones de la coagulación de la sangre, ilustrado en el Esquema 1 que figura a continuación:

Esquema 1

20

El documento EP-0434377 se refiere a métodos de determinación de niveles de factores de coagulación extrínsecos e intrínsecos y proteína C.

En el documento WO 91/02812 se describe un método y un kit de ensayo para analizar indirectamente la Proteína C.

Br. J. Haematol, 70 (4), 435-440, diciembre 1988 se refiere al uso de concentrados de Proteína C y S humanas en el tratamiento de deficiencias de Proteína C.

En Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 78 (1), 162-166, Enero, 1981, se describe el aislamiento de Factor V funcional usando una anticuerpo de hibridoma.

Comp. Biochem. Physiol, 83B (2), 379-401, 1986, se refiere a la purificación de Factor V (procedente de rata) y a la producción de antisuero monoespecífico contra Factor V de rata purificado.

Ninguna de las referencias bibliográficas anteriores se refiere a la nueva actividad, que se describe en la presente solicitud de patente y está asociada con el sistema anticoagulante de Proteína C.

En el sistema anticoagulante antes citado, la Proteína C, una proteína plasmática dependiente de la vitamina K, es un componente clave que después de activación a Proteína C activada (Activated Protein C) (APC) sobre células endoteliales mediante el complejo trombina/trombomodulina degrada selectivamente los Factores de coagulación V_{a} y VIII_{a} es decir, las formas activadas de los Factores de coagulación V y VIII, respectivamente (Esmon, loc. cit.; Stenflo, en Protein C and related proteins, ed. Bertina (Churchill Livingstone Longham Group, GB) 21-54 (1988); Mann et al., Ann. Rev. Biochem. 57, 915-956 (1988); y Kane et al., Blood, 71, 539-55 (1988).

La actividad de la APC está influida por otra proteína plasmática dependiente de la vitamina K, denominada Proteína S, que actúa como cofactor de la APC en la degradación de los Factores V_{a} y VIII_{a}. Esmon, loc. cit; Stenflo, loc. cit.; y Dahlbäck, Thromb. Haemostas. 66, 49-61 (1991).

Los Factores V_{a} y VIII_{a} antes citados son cofactores unidos a fosfolípidos implicados en la activación del Factor X y la protrombina, respectivamente y están, por tanto, involucrados directamente en la conversión del fibrinógeno en fibrina, es decir, en la formación de los coágulos. Por consiguiente, la velocidad de la reacción de coagulación depende de los Factores VIII y V y la degradación de sus formas activadas, siendo los Factores VIII y V sin activar malos sustratos para la APC.

Alteraciones en el sistema de la coagulación de la sangre se manifiestan frecuentemente como estados graves y con frecuencia amenazantes de la vida, y su conocimiento acerca de las causas subyacentes de las alteraciones es con frecuencia crucial con objeto de permitir establecer un diagnóstico y/o poner en práctica con éxito el tratamiento terapéutico de una enfermedad manifestada o la exploración de individuos que presentan predisposición para una alteración de la coagulación de la sangre. Por ejemplo, se ha desarrollado el uso terapéutico de Proteína C purificada como resultado del descubrimiento de deficiencia de Proteína C asociada con la trombofilia.

La trombofilia puede definirse como una tendencia hacia una enfermedad tromboembólica venosa de iniciación precoz, en adultos, en ausencia de factores de riesgo conocidos. Aun cuando han sido determinadas anomalías para algunos pacientes trombofílicos, en la mayoría de tales casos no fueron identificadas anomalías en ensayos de laboratorio.

La presente invención está relacionada con un nuevo defecto en la respuesta anticoagulante a la proteína C activada, denominada resistencia a APC, que se ha puesto de manifiesto que es heredada y que está asociada con la trombofilia familiar.

En unos pocos casos la trombofilia ha sido asociada con factores hipotéticos, tales como un anticuerpo anti-Proteína C (Mitchell et al., New England Journal of Medicine, Vol. 316, 1638-1642, (1987)), un anticuerpo anti-cardiolipina (Amer et al., Thrombosis Research, 57, 247-258 (1990)) y una molécula de Factor VIII con defecto (Dahlbäck et al., Thromb Haemost, 65, Abstract 39, 658 (1991)).

En el documento WO 93/10261, que es una referencia bibliográfica publicada después de la fecha de prioridad más anticipada reivindicada para la presente solicitud de patente, se describen métodos in vitro para la diagnosis de una alteración de la coagulación de la sangre manifestada o para el escrutinio de individuos predispuestos para una alteración de la coagulación de la sangre. Estos métodos están basados en la medida de la respuesta anticoagulante a APC exógena añadida a una muestra de plasma procedente del individuo que ha de ser sometido a ensayo, indicando una respuesta anticoagulante débil frente a APC, es decir resistencia a APC, manifestación de alteraciones de la coagulación de la sangre o predisposición a las mismas, y en especial a trastornos tromboembólicos. No se da explicación alguna de la resistencia a APC pero se sugiere que la resistencia a APC se debe a interacciones desconocidas en el sistema de la coagulación de la sangre o a factor o factores desconocidos de la misma. Sin embargo, fueron desestimadas varias explicaciones posibles que relacionan la resistencia a APC con una deficiencia funcional de Proteína S, un anticuerpo inhibidor de la Proteína C, un inhibidor de proteasa para la APC o una mutación que proporciona una molécula de Factor V_{a} resistente a APC, o una mutación génica del Factor VIII.

Según la presente invención, se ha encontrado que la resistencia a APC es debida a deficiencia de actividad de un cofactor anticoagulante, no reconocida con anterioridad, que acrecienta el efecto proteolítico de la APC dirigido contra el Factor V_{a} y el Factor VIII_{a}. Los hallazgos que forman la base del descubrimiento de la presente actividad de cofactor anticoagulante han sido descritos por Dahlbäck et al., en Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1004-1008 (1993), cuya referencia bibliográfica tiene una fecha de publicación posterior a la fecha de prioridad más anticipada reivindicada para la presente solicitud de patente.

Más específicamente, se ha encontrado que esta actividad anticoagulante es expresada por el Factor V, un descubrimiento que es bastante sorprendente, dado que el Factor V es el precursor del Factor V_{a} procoagulante, siendo este último degradado por la APC en el sistema anticoagulante de Proteína C anteriormente citado. Así pues, el factor V es el segundo cofactor que se ha encontrado de la APC, siendo el primero la Proteína S anteriormente citada. Inicialmente, la presente nueva actividad de cofactor anticoagulante se ha denominado "actividad de cofactor 2 de APC" y el cofactor, per se, fue designado "cofactor 2 de APC". No obstante, dado que su conexión con el Factor V ha quedado establecida en esta invención, se emplea principalmente en esta descripción la designación "actividad anticoagulante del Factor V" o semejante. La actividad del Factor V anteriormente conocida se designa "actividad procoagulante del Factor V". Sin embargo, la posibilidad de que dicha actividad esté asociada con el Factor V_{a} no puede ser desestimada totalmente. Puesto que la actividad de cofactor anticoagulante del Factor V es una actividad anticoagulante del Factor V como cofactor de la APC, se alude también a esta actividad del Factor V como una actividad de cofactor de APC.

El descubrimiento de la nueva actividad de cofactor anticoagulante según la presente invención, se basa en el descubrimiento de un paciente con trombosis y una respuesta anormal a la APC, es decir, resistencia a APC, cuando su plasma fue analizado con los métodos descritos en el documento WQ 93/10261 antes citado (con una fecha de prioridad de 13 de Noviembre de 1991, siendo los EE.UU. uno de los estados designados, incorporándose en esta memoria la descripción de dicha cita bibliográfica como referencia) y por Dahlbäck et al., (Thromb Haemost 65, Abstract 39, 658 (1991)). Al estudiar un gran número de pacientes con trombosis, se encontró que la resistencia a APC era la causa subyacente en el 30-40% de los episodios tromboembólicos idiopáticos (Thromb Haemostas 69, 999, Abstract (1993)).

Más tarde, se ha descubierto, según la presente invención, que una fracción cruda obtenida de plasma normal contenía una actividad que corregía el defecto de plasma resistente a APC, mientras que la fracción correspondiente procedente de plasma resistente a APC, procedente de un paciente con resistencia a APC pronunciada, era inactiva. Esto prueba la existencia de un nuevo cofactor de la APC. Además, empleando en ensayos preparaciones purificadas en la citada actividad, ensayos que han sido ideados para medir esta actividad, se ha conseguido una evidencia concluyente de la existencia de un nuevo cofactor de la APC.

Conforme a la presente invención, por tanto, se ha descubierto sorprendentemente que el Factor V humano posee actividad como cofactor de la APC además de su bien conocida función como precursor del Factor V_{a} procoagulante. Posiblemente, esta doble función del Factor V humano es expresada también por el Factor V que deriva de sangre procedente de algunas especies de animales, en especial mamíferos, pero no es expresada en otras especies. Por ejemplo, todos los resultados obtenidos hasta la fecha indican que el plasma bovino carece de dicha actividad.

Dicha actividad de cofactor del Factor V significa que acrecienta el efecto proteolítico de la Proteína C activada, favoreciendo por tanto la degradación del Factor V_{a} es decir, la forma activada del Factor V, así como también la degradación del Factor VIII_{a}.

Se sabe, desde antes, que la actividad procoagulante del Factor V se debe a su activación por la trombina, desdoblándose tres uniones peptídicas, lo que da como resultado la formación del Factor V_{a} procoagulante como un complejo entre las porciones N terminal y C terminal del Factor V natural. La función de los dos péptidos de activación largos que derivan de la parte central del Factor V es, no obstante, desconocida. Como podrá apreciarse en la parte experimental de esta descripción. la actividad de cofactor anticoagulante del Factor V no ha sido encontrada en el Factor V_{a} en el ensayo de resistencia a APC empleado.

Por tanto, la actividad de cofactor anticoagulante del Factor V es expresada preferentemente por la molécula de Factor V intacta, contribuyendo, probablemente, los fragmentos largos segmentados durante su activación a Factor V_{a}, a la mayor parte de dicha actividad. Sin embargo, la posibilidad de que dicha actividad esté asociada con una entidad molecular que forma un complejo altamente estable con el Factor V, que no es segmentado bajo los procedimientos operatorios de purificación usados para aislar el Factor V, que posee actividad de cofactor anticoagulante, no puede ser desestimada completamente. Por consiguiente, en relación con la presente invención, las expresiones "Factor V" y "Factor V que posee actividad de cofactor anticoagulante" y semejantes, están destinadas también a incluir dicho complejo de Factor V así como fragmentos de Factor V, preferiblemente distintos de los fragmentos que se originan de la segmentación con trombina del Factor V, que tienen dicha actividad. Factor V modificado con actividad de cofactor anticoagulante retenida, puede obtenerse también por segmentación proteolítica mediante otras enzimas de origen humano o no humano tales como enzimas de veneno de ofidios y otras proteasas. Además, se encontró que la actividad de cofactor anticoagulante del Factor V permanecía después de proteólisis parcial por enzimas desconocidas durante su purificación, lo que indica la existencia potencial de fragmentos de Factor V activos como cofactor anticoagulante. La expresión "Factor V qque posee actividad (cofactor anticoagulante" incluye fragmentos y subunidades de Factor V/V_{a} que expresan la actividad o un determinante inmunológico relacionado con una región asociada con dicha actividad. Aun cuando por motivos de conveniencia los factores de coagulación y semejantes, no son especies a las que se alude a lo largo de esta descripción, son deseados preferiblemente factores tales de origen humano, a menos que se especifique de otro modo.

En la parte experimental de esta descripción, se describen los procedimientos operatorios empleados para la purificación y caracterización de la presente nueva actividad de cofactor de APC y se verifica su conexión con el Factor V.

En resumen, las evidencias de la presencia de la acctividad de cofactor de APC en el Factor V son:

1. El procedimiento operatorio ideado para el aislamiento de dicha actividad de cofactor de APC y métodos anteriores para el aislamiento del Factor V son muy similares. En la electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) aparecen tres bandas en aproximadamente 200-220 kDa (parte C-terminal), 140-160 kDa (parte N terminal) y 330 kDa que también es muy similar a la que ha sido indicada para el Factor V. (véase la sección experimental de la descripción y la referencia bibliográfica de Dahlbäck et al., J. Clin. Invest. 66, 583-91 (1980)). La intensidad de la banda de 330 kDa está acrecentada por ambos, dicha actividad de cofactor de APC y el Factor V cuando se usan concentraciones superiores de inhibidores de proteasas durante el procedimiento de purificación, Por ejemplo, una concentración de hidrocloruro de benzamidina de 10 mM da lugar a una banda significante en 330 kDa.

2. El antisuero policlonal específico contra el Factor V humano (Dakopatt A/S, Dinamarca) reacciona con cada una de las tres bandas asociadas con dicha actividad de cofactor de APC en la transferencia Western.

3. Después de la adición de trombina a las presentes preparaciones que comprenden dicha actividad de cofactor de APC las tres bandas desaparecen y los productos obtenidos se hacen indistinguibles de los productos formados por activación del Factor V con trombina.

4. Han sido obtenidos diecisiete anticuerpos monoclonales que reaccionan con el Factor V usando una preparación purificada con respecto a dicha actividad de cofactor de APC como inmunógeno. Dos de los anticuerpos monoclonales inhibían parcialmente dicha actividad de cofactor de APC sin inhibir la actividad procoagulante del Factor V.

5. La actividad procoagulante de Factor V y dicha actividad de cofactor de APC son eluídas conjuntamente sobre todos los materiales cromatográficos ensayados, Sepharose Heparinizada, Azul-Sepharose, Sepharose lectina de germen de trigo, Q-Sepharose y S-Sepharose (Pharmacia, Suecia), materiales ilustrativos que han sido ensayados.

6. Ambas, la actividad procoagulante del Factor V y la actividad de cofactor de APC, están retenidas sobre una matriz que transporta anticuerpos policlonales contra el Factor V humano (Dakopatta A/S, Dinamarca).

7. Ambas, la actividad procoagulante del Factor V y dicha actividad de cofactor de APC, están retenidas sobre matrices tales como Sepharose y Affigel, que transportan antisueros contra fragmentos diferentes de Factor V bovino, que reaccionan en reacción cruzada con el Factor V humano.

8. Ambas, la actividad procoagulante del Factor V y dicha actividad de cofactor de APC, están retenidas y son eluídas conjuntamente sobre un soporte cromatográfico tal como Affigel, que transporta un anticuerpo monoclonal de alta afinidad, que había sido preparado usado una preparación purificada con respecto a dicha actividad de cofactor de APC como inmunógeno, Por sí mismo, este anticuerpo no inhibía ni dicha actividad de cofactor de APC ni la actividad procoagulante del Factor V. La elución se llevó a cabo a un pH de aproximadamente 10,5-11.

9. Una publicación reciente que describe que anticuerpos contra el Factor V pueden dar como resultado trombosis (Kapur et al., A. J. Hematol. 42, 384-388 (1993)).

Se han obtenido preparaciones enriquecidas en la presente actividad de cofactor de APC mediante los mismos métodos que han sido empleados con anterioridad para el aislamiento del Factor V. Se ha encontrado que iones de metales divalentes, tales como los iones calcio, ejercen un efecto de estabilización sobre la presente actividad de cofactor de APC y, por tanto, se añadieron iones calcio durante la purificación.

Se ha usado esencialmente el mismo procedimiento operatorio de purificación en un primer intento con objeto de esclarecer la nueva actividad descrita en el documento WO 93/10261 antes citado. Conforme a los resultados aquí presentados, la nueva actividad ha sido identificada como una actividad de cofactor de la APC expresada como una nueva propiedad del Factor V, o, posiblemente, una complejo o fragmentos del mismo como se ha discutido antes. Así pues, podrán estar disponibles métodos de preparación alternativos y más sencillos. Se han usado los métodos actuales tales como cromatografía en gel, cromatografía de afinidad con, por ejemplo, anticuerpo anti-actividad de cofactor anticoagulante del Factor V como ligando de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, etc., adecuadamente después de mejora. Además, pueden ser aplicables métodos basados en la técnica del DNA recombinante.

Por consiguiente, la presente invención está relacionada asimismo con una preparación que deriva de sangre o de productos afines a la sangre, tales como plasma, purificándose dicha preparación con respecto a un componente de coagulación de la sangre, que puede expresar actividad anticoagulante como un cofactor de la APC, mejorando con ello su actividad proteolítica, dirigida contra el Factor V_{a} y el Factor VIII_{a}, estando constituido dicho componente de la coagulación de la sangre por el Factor V o, opcionalmente, un complejo estable del Factor V y una entidad molecular, que puede expresar dicha actividad.

El nivel plasmático normal de Factor V es aproximadamente de 10-20 \mug/ml. Por analogía con otros factores sanguíneos de coagulación/anticoagulación, la presente actividad de cofactor de APC en 1 ml de plasma normal se designa arbitrariamente 1 unidad (U).

La presente invención está relacionada también con anticuerpos y preparaciones de anticuerpos específicas de una región del Factor V que está asociada con actividad de cofactor de APC, es decir, una región en la que hay un sitio portador de un epítopo que causa o bien actividad de cofactor de APC o inactividad de cofactor de APC. Tales preparaciones de anticuerpos pueden ser policlonales o, preferiblemente, monoclonales. Preferiblemente, los anticuerpos de tales preparaciones se unen específicamente a uno o más sitios del Factor V asociados con actividad de cofactor de APC. Alternativamente, tal sitio podría comprender un epítopo implicado en inactividad de cofactor de APC del Factor V y, por tanto, en resistencia de APC. En 10 referente a esta invención, la expresión "epítopo implicado en inactividad de cofactor de APC" se entiende que incluye un epítopo relacionado con la disminución o pérdida de actividad de cofactor de APC.

Pueden obtenerse anticuerpos policlonales según métodos conocidos que comprenden inmunizar animales adecuados, tales como ratón, rata, conejo, perro, caballo, oveja, cabra, aves, por ejemplo, gallina, pollo, etc., con un inmunógeno apropiado, y recuperar los anticuerpos presentes desde un fluido apropiado derivado de dicho animal, por ejemplo, desde sangre o suero en el caso de mamíferos, o desde huevos, cuando son inmunizadas aves.

Preferiblemente, los anticuerpos presentes son anticuerpos monoclonales que pueden ser obtenidos mediante métodos convencionales, por ejemplo, esencialmente como ha sido descrito por Köhler, G, y Milstein, C., Nature 256, 495 (1975). En general, el método de preparación de anticuerpos monoclonales de la presente invención incluye inmunizar un mamífero, preferiblemente un ratón, con un inmunógeno apropiado, producir células híbridas por fusión de linfocitos, tales como células esplénicas, procedentes del mamífero inmunizado, con células de mieloma, seleccionar las células fusionadas en un medio adecuado, rastrear las células que producen anticuerpos, clonar las células que producen anticuerpos, es decir, hibridomas, y producir anticuerpos monoclonales en el fluido ascítico del ratón o, de como opcional, en un medio de cultivo mediante propagación en él del hibridoma. Sin embargo, los presentes anticuerpos monoclonales, y sus fragmentos que se unen a antígeno, pueden ser obtenidos también según los métodos basados en la tecnología recombinante, como es bien sabido en esta técnica. En tales métodos pueden usarse células hospedantes adecuadas de origen eucariótico o procariótico. Tales células hospedantes son bien conocidas en este campo de la técnica.

Como inmunógeno puede usarse una preparación purificada de Factor V o fragmentos y derivados de los mismos que comprendan los determinantes antigénicos responsables de la expresión de la actividad de cofactor de APC. Tales fragmentos o pueden conjugarse a un soporte inmunógeno, una proteína, para hacerse antigénicos.

Usando como inmunógeno Factor V humano deficiente en actividad de cofactor de APC (que puede ser obtenido como se describe más adelante), combinado con un procedimiento de escrutinio de dos etapas para seleccionar hibridomas que producen anticuerpos monoclonales reactivos con el inmunógeno pero no con Factor V humano intacto, pueden obtenerse potencialmente anticuerpos monoclonales que reaccionan específicamente con un epítopo de inactividad de cofactor de APC humano, es decir, un epítopo relacionado con la disminución o pérdida de actividad de cofactor de APC.

Una realización preferida de la presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales que se unen a, e inhiben también, la actividad de cofactor de APC del Factor V, al menos en parte. La presente invención se refiere también a derivados y fragmentos de tales anticuerpos monoclonales, que son capaces de unirse a antígenos.

Según la presente invención, se prefieren los anticuerpos monoclonales producidos por hibridomas de ratón/ratón, ya que estos son sencillos de obtener. Son ilustrativos de tales anticuerpos monoclonales los producidos mediante una nueva línea celular híbrida depositada el 8 de Diciembre de 1993 en el PHLS Centre for Applied Microbiology and Research, European Collection of Animal Cell Culture, Salisbury, Gran Bretaña, con el número de entrada 93120846. En relación con la presente invención los anticuerpos monoclonales producidos mediante este hibridoma son designados M4 (Master 4).

Si no se especifica de otro modo, la expresión "anticuerpo (o preparación de anticuerpo" incluye el anticuerpo intacto con sus dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, así como también formas diferentes de anticuerpos derivatizados que contienen los dominios variables (Fv), por ejemplo fragmentos tales como Fab, Fab', F(ab')_{2}; anticuerpos de una sola cadena; anticuerpos marcados, tales como anticuerpos radiomarcados, fluorescentes o acoplados a enzimas; anticuerpos unidos a fases sólidas, etc.

Otra realización de la presente invención se refiere a preparaciones de anticuerpos que comprenden un número definido de anticuerpos monoclonales de la especificidad anteriormente citada, tales como 1, 2, 3, 4, 5 o mas anticuerpos monoclonales diferentes, o son policlonales. Las preparaciones de anticuerpos policlonales y monoclona1es dirigidas específicamente contra epítopos presentes únicamente en un sitio asociado con la actividad de cofactor de APC, son potencialmente útiles en inmunoensayos para determinar específicamente la presencia o ausencia de actividad de cofactor de APC en una muestra (cuantitativa y cualitativamente).

La presente invención se refiere también a hibridomas que producen los anticuerpos monoclonales de la presente invención, y preferiblemente al hibridoma antes citado que tiene el número de entrada 93120846.

Aun cuando se conocen desde tiempo atrás anticuerpos policlonales, y también monoclonales, específicos para el Factor V, que pueden ser usados para purificar el Factor V, no se habían descrito con anterioridad anticuerpos monoclonales inducidos deliberadamente contra una región del Factor V asociada con actividad de cofactor de APC.

La preparación de anticuerpos (monoclonales así como policlonales) de la presente invención puede ser usada en muchos casos en procedimientos operatorios de purificación basados en cromatografía de afinidad en la que anticuerpos de esta invención se fijan a un soporte sólido y se usan para unirse selectivamente al Factor V presente, por ejemplo, en una preparación de plasma. Seguidamente el Factor V que se ha unido al soporte sólido, es eluído y recogido.

Los anticuerpos monoclonales preferidos de esta invención que se unen al Factor V e inhiben, al menos en parte, la actividad de cofactor de APC del Factor V, pueden ser usados para inhibir dicha actividad del Factor V. Tales anticuerpos monoclonales, a semejanza de los anticuerpos anti-Factor V conocidos con anterioridad, pueden ser usados también para obtener preparaciones plasmáticas deficientes en actividad de cofactor de APC.

Aspectos importantes de la presente invención conciernen a métodos terapéuticos, medicamentos y preparaciones farmacéuticas, para los que se usa el conocimiento de la nueva actividad anticoagulante del Factor V, es decir actividad de cofactor de APC.

Por consiguiente, la presente invención se refiere también al uso de Factor V, subunidades o fragmentos del mismo, que poseen actividad anticoagulante como cofactor de la APC para fabricar un medicamento o una preparación farmacéuticas destinada a mejorar o restaurar la actividad anticoagulante de la APC, in vivo. Específicamente, tales preparaciones están destinadas al tratamiento de pacientes que padecen enfermedades vasculares, o que están predispuestos a ellas, tales como trastornos tromboembólicos incluyendo las trombosis y la coagulación intravascular diseminada (abreviadamente DIC por sus iniciales en inglés disseminated intravascular coagulation).

Tal medicamento o preparación farmacéutica puede estar constituido por una preparación de Factor V altamente purificado, que puede mantenerse a temperaturas bajas, tales como -70ºC.

Las presentes preparaciones pueden ser usadas también en conexión con otras condiciones o situaciones en las que un individuo pudiera beneficiarse de una actividad anticoagulante de la sangre corregida o mejorada, por ejemplo, en diversos estados clínicos que están asociados con riesgos acrecentados de trombosis arterial y venosa.

Además, dado que la presente actividad de cofactor de APC es crucial para el efecto de la APC, esta actividad puede ser usada por sí misma o en combinación con Proteína C/APC y/o Proteína S. Situaciones clínicas en las que esto puede probar que es importante, incluyen pacientes que son deficientes en actividad de cofactor de APC, en particular en situaciones que aumentan los riesgos de trombosis. En adición a esto, una actividad de cofactor de APC suplementaria puede ser beneficiosa en conexión con los infartos de miocardio después del tratamiento terapéutico tromboembólico, en los períodos post-operativos - en particular en pacientes de riesgo, como coadyuvante de pacientes tratados de trombosis, en pacientes sometidos a microcirugía, etc.

La vía de administración de la actividad de cofactor de APC es la normalmente aplicada en los tratamientos terapéuticos con factores sanguíneos de coagulación/anticoagulación, tales como inyección o infusión intravenosa o intraarterial. Al igual que ha sido sugerido para otros factores sanguíneos, no puede excluirse la administración oral. La cantidad a administrar ha de ser eficaz en el sentido de que al menos durante un período de tiempo, restaure total o parcialmente el efecto de la Proteína C activada propia del paciente, o de la Proteína C/Proteína C activada administradas conjuntamente, con el entendimiento de que incluso efectos más pequeños pueden ser beneficiosos para un paciente en riesgo de trombosis. Una cantidad en el intervalo de 1-100, posiblemente 40-70, mg/día, puede suponerse que es útil. Se prefiere la administración repetida, debido a que el Factor V que expresa actividad de cofactor de APC es metabolizado en el cuerpo del mamífero.

Los diferentes tipos de composiciones farmacéuticas disponibles son las mismas que están en uso para otros factores sanguíneos de coagulación/anticoagulación, pero adaptados a los requisitos específicos de estabilidad que son necesarios para el Factor V que posee actividad de cofactor de APC. Por ejemplo, pueden usarse polvos liofilizados o secados por pulverización, opcionalmente diluidos con vehículos apropiados, así como también soluciones acuosas estériles o producidas asépticamente.

Un aspecto adicional de la presente invención está relacionado con el uso de Proteína C/Proteína C activada y/o Proteína S para fabricar una composición farmacéutica para el tratamiento de trastornos relacionados con la deficiencia de actividad de cofactor de APC. Son aplicables los mismos tipos de composiciones destinadas al uso terapéutico de la técnica anterior, de Proteína C y Proteína S.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una preparación de Factor V deficiente en actividad de cofactor de APC y se deriva, preferiblemente, de seres humanos. Un uso terapéutico potencial de la misma es en los casos en que es beneficioso para un paciente un aumento de la actividad del Factor Va sobre la actividad de cofactor de APC.

Los métodos terapéuticos y las preparaciones que se han citado están destinados a mamíferos en particular el hombre.

Por tanto, una realización adecuada de la presente invención se refiere a un método para diagnosticar en un individuo un trastorno de coagulación/anticoagulación de la sangre, preferiblemente un trastorno tromboembólico, o determinar predisposición al mismo, preferiblemente un mamífero, tal como un ser humano, comprendiendo dicho método determinar en una muestra, preferiblemente una muestra de sangre o de un derivado de la sangre, tal como plasma, procedente de dicho individuo, en la que se añade plasma deficiente en Factor V, el nivel de un componente de la sangre que expresa actividad anticoagulante, comprendiendo dicho componente de la sangre Factor V, determinándose el nivel de su actividad anticoagulante como un cofactor de la APC, indicando un nivel anormal, preferiblemente un nivel disminuido, la manifestación de una predisposición a dichos trastornos, en particular siendo dicho trastorno para un nivel disminuido un trastorno tromboembólico.

Realizaciones adecuadas del método anterior se refieren a ensayar una muestra apropiada procedente de un individuo para determinar actividad de cofactor de APC, y relacionar un nivel anormal encontrado, preferiblemente un nivel disminuido, con el diagnóstico de que el individuo padece un trastorno de la coagulación de la sangre relacionado con el factor analizado, es decir, con Factor V en su capacidad como cofactor de APC, cuyo defecto puede ser la causa subyacente de un trastorno tromboembólico, o de una predisposición a tal trastorno.

En los métodos anteriores el nivel de la actividad de cofactor de APC anticoagulante se mide preferiblemente conforme a métodos desarrollados según la presente invención para analizar la actividad de cofactor de APC funcional, que se describen más adelante. También pueden usarse ensayos de actividad de base inmunológica y análisis no funcionales específicos del Factor V que llevan elementos estructurales asociados con su actividad de cofactor de APC.

Por tanto, aspectos adicionales de la presente invención están relacionados con ensayos funcionales de Factor V que expresa actividad de cofactor de APC, así como también ensayos inmunológicos y ensayos de hibridación de ácidos nucleicos de Factor V que expresa actividad de cofactor de APC, métodos de secuenciación de DNA y RNA.

Los ensayos como tales, pueden tener usos diferentes de diagnósticos, por ejemplo la monitorización de procedimientos operatorios de purificación de componentes del sistema de cofactor de APC, la normalización de plasmas testigo, etc.

A. Ensayos funcionales de actividad de cofactor de APC

Estos ensayos utilizan protocolos similares a los descritos con anterioridad (Bertina et al., Res. Clin. Lab. 20 127-138 (1990); Wolf et al., Thromb. Haemost. 62, 1144-1145 (1989); documento WO 91/02812: documento WO 91/01382; documento WO 93/10261, la designación de EE.UU. de los cuales se incorpora en esta memoria como referencia; Dahlbäck et al., Thromb. Hemost. 65, Abstract 39, 658 (1991)). Por tanto, se analiza Factor V en su capacidad como cofactor de APC, partiendo de la conversión por APC del sustrato de APC apropiado. Son sustratos normales de APC los Factores V_{a} y/o VIII_{a}, uno de los cuales o ambos, preferiblemente, se añaden al medio de ensayo en forma de preparaciones enriquecidas o altamente purificadas, incluyendo preparaciones obtenidas mediante tecnología recombinante, de proteínas inactivadas (Factor V, Factor VIII) o proteínas activadas. Dentro de una serie de muestras que han de ser comparadas, los medios de ensayo tienen esencialmente los mismos niveles de:

Por consiguiente, los medios de ensayo finales para una serie de muestras que han de ser comparadas, contienen la muestra y sustrato para APC, y opcionalmente también en las variantes preferidas, una o dos, preferiblemente dos sustancias que no derivan de la muestra y que son seleccionadas entre APC, Proteína S o un inhibidor de la

\hbox{Proteína S.}

El método presente puede comprender a) incubar en una o más etapas, en un medio de ensayo acuoso, la muestra y un sustrato para la APC, estando dicho sustrato intrínsecamente presente en la muestra o habiendo sido añadido al medio de ensayo, y opcionalmente componentes adicionales de la coagulación de la sangre intrínsecamente presentes en la muestra o que han sido añadidos al medio de ensayo, b) medir la conversión del sustrato ocasionada por la APC durante la incubación según a), y c) correlacionar de un modo conocido el valor medido con la actividad que ha de determinarse; en cuyo método se añaden al medio de ensayo de a), opcionalmente, una o dos, preferiblemente dos, sustancias, seleccionándose dicha sustancia o sustancias entre APC, Proteína S o un inhibidor de la Proteína S, con la condición de que la actividad de cofactor de APC, se encuentre presente en la muestra y sea el componente cuya actividad funcional ha de determinarse, para el Factor V, siendo dicha actividad anticoagulante como cofactor de APC.

Son ilustrativos de otros componentes que pueden estar presentes, enzimas de coagulación y otros factores sanguíneos que permiten la medida de la degradación de los Factores V_{a} y/o VIII_{a}. Estos otros factores pueden ser añadidos por separado o pueden encontrarse presentes ya en la muestra. En el caso de que la muestra contenga niveles variables de factores de coagulación (distintos del que ha de ensayarse) que interfieran con las reacciones del ensayo, debe asegurarse un exceso de ellos (es decir, niveles esencialmente constantes en el medio de ensayo) con objeto de evitar variaciones entre las muestras, en los resultados de los ensayos. Para muestras de plasma pueden conseguirse niveles constantes añadiendo, en exceso, plasma normal deficiente en la entidad que de analizarse. Los componentes que han de ser añadidos pueden ser también formas enriquecidas o formas altamente purificadas. Puede considerarse que es adecuada la adición de Factor VIII/VIII_{a} y/o formas de Factor V que no expresen la actividad de cofactor de APC. Ejemplos de formas que carecen de actividad de cofactor de APC son Factor V humano deficiente en la actividad, Factor V procedente de una especie que no expresa normalmente la actividad (por ejemplo Factor V bovino, y fragmentos de Factor V que expresan actividad de Factor V pero no actividad de cofactor de APC).

La adición de Proteína S en el medio de ensayo se hace con objeto de evitar variaciones en el nivel medido ocasionadas por variaciones de Proteína S entre muestras, cuando ha de medirse la presente actividad de cofactor de APC. La idea principal tras esto es la de mantener esencialmente constante en el medio de ensayo, entre operaciones, el nivel de actividad funcional de factores distintos del que ha de ser determinado. Como se ha indicado anteriormente esto puede conseguirse incluyendo en el medio de ensayo tales factores en exceso, por ejemplo, añadiendo plasma normal en exceso, y/o incluyendo un exceso funcional de inhibidores de tales factores, por ejemplo, anticuerpos que se unen a epítopos responsables de la actividad de tales factores. Así, un anticuerpo monoclona1 específico para los epítopos responsables de la actividad de cofactor de APC de la Proteína S, ha sido incluido con éxito (HPS 54, Dahlbäck et al., J. Biol. Chem. 265, 8127-8235 (1990)) en medios de ensayo para analizar la presente actividad de cofactor de APC. De modo semejante, pueden incluirse potencialmente en los medios de ensayo, cuando ha de analizarse Proteína S, inhibidores funcionales de la presente actividad de cofactor de APC, semejantes a los anticuerpos monoclonales antes citados.

Según la presente invención, los ensayos funcionales se llevan a cabo adecuadamente en presencia de Factor VIII/VIII_{a} añadido.

Los principios para el orden de mezcla, componentes que han de ser añadidos y los diferentes principios de medida, son bien conocidos en este campo. Véanse las citas bibliográficas anteriormente mencionadas. Esto incluye también que la actividad de APC puede ser seguida mediante sustratos tales como fibrinógeno (ensayos de coagulación) y sustratos cromógenos para enzimas de coagulación, la actividad de los cuales viene influida por la actividad de APC. Así pues son sustratos cromógenos, fluorógenos y luminógenos adecuados, la trombina y sustratos del Factor X_{a}.

La muestra es, normalmente, plasma procedente de un individuo/paciente, o la muestra puede ser Factor V que posee actividad de cofactor de APC, Proteína C (APC) o Proteína S, todos ellos derivados de un proceso de fabricación, o patrones que han de ser usados en el ensayo.

Factor V natural (abreviadamente FV) producido mediante tecnología recombinante (rFV) puede ser usado en lugar de FV purificado procedente de plasma como un aducto en métodos de diagnóstico para determinar la actividad anticoagulante de FV o como agente terapéutico para su administración a pacientes parcial o completamente deficientes en la presente actividad de cofactor de APC. Alternativamente, variantes recombinantes o fragmentos de FV con expresiones modificadas de actividad pro- o anticoagulante, pueden ser utilizados para el mismo fin y también en aductos en métodos para determinar la actividad anticoagulante de FV. Tales modificaciones pueden ser generadas mediante mutaciones de los sitios de segmentación con trombina o APC en FV. En el primer caso la actividad procoagulante, y en el último caso, la actividad anticoagulante del FV, se pierde parcial o totalmente. Además, tales especies o fragmentos peptídicos inmunógenos adecuados de las mismas, pueden ser usados para la preparación de anticuerpos monoclonales para uso de diagnóstico o terapéutico.

En ensayos de la presente actividad de cofactor de APC utilizando Factores V_{a} y/o VIII_{a} como el sustrato de APC y factores procedentes de la muestra para medir la conversión de sus trato de APC, la sensibilidad hacia la actividad de APC está considerablemente aumentada en plasmas procedentes de pacientes en tratamiento con antagonistas de la vitamina K, lo que da como resultado una prolongación mejorada del tiempo de coagulación en ciertos ensayos de coagulación, en especial ensayos APTT. La sensibilidad aumentada hacia actividad de APC puede ser explicada por los niveles disminuidos de proteínas dependientes de vitamina K tales como los Factores IX, X y II. Puesto que la presente actividad de cofactor de APC no es dependiente de la vitamina K, puede llegar a ser posible, por consiguiente, medir esta actividad en plasmas procedentes de pacientes mediante adición exógena al medio de ensayo de cierta(s) proteina(s) dependiente(s) de la vitamina K, tales como al menos uno de los Factores IX, IX_{a}, X y II, combinadas, opcionalmente, con Proteína S. Estas proteínas pueden ser añadidas en forma de eluato con sales de metales pesados, tal como eluato con citrato de bario (Dahlbäck, Biochem. J. 209, 837-46 (1983)) o un eluato con hidróxido de aluminio (Bertina et al., Thrombos Hemostas. 51, 1-5 (1984)) o como componentes purificados antes de (medir la conversión del sustrato de APC. Si el plasma contiene heparina (estándar o de peso molecular bajo) es adecuado neutralizar este efecto añadiendo exceso de heparina, o añadiendo polibreno o Protamina, o semejante, ya que los inhibidores de la heparina reducen las interferencias sobre los resultados de los ensayos.

Como se ha indicado antes, los métodos presentes para determinar actividades funcionales de actividad anticoagulante de Factor V, son similares a los métodos descritos previamente, por ejemplo, indicados en las referencias bibliográficas citadas, cuyas descripciones se incluyen aquí como referencia. Así pues, una descripción detallada de estos métodos no debe requerirse. En principio, sin embargo, tales métodos están basados en la medida de la conversión de un sustrato, la velocidad de la cual puede ser determinada directa o indirectamente y estar relacionada con la sustancia que ha de ser ensayada, por ejemplo, basada en ensayos de coagulación o ensayos cromógenos, adecuadamente en presencia de componentes adicionales necesarios para detectar la velocidad de conversión, que están intrínsecamente presentes en la muestra o que han sido añadidos a la misma.

Tales componentes pueden estar constituidos por un reactivo que sirve para introducir un factor de coagulación activado que puede ser usado para determinar la velocidad de conversión del sustrato. Este reactivo conduce a la presencia de al menos el Factor IX_{a}. y puede comprender un cierto factor de coagulación o un reactivo que activa el sistema mediante la vía intrínseca o extrínseca. Por consiguiente, este reactivo puede ser Factor IX_{a} o Factor XI_{a} (vía intrínseca), Factor XII_{a} (vía intrínseca), calicreína (vía intrínseca), un activador de contacto (vía intrínseca) tal como caolín, celita o ácido elágico (vía intrínseca), un reactivo APTT (Activated Partial Thromboplastin Time) (Tiempo de tromboplastina parcial activado); es decir, un reactivo quee contiene un fosfolípido y u activador de contacto (vía intrínseca), tromboplastina tisular (reactivo PT, PT = tiempo de protrombina (vía extrínseca), factor tisular, Factor VII_{a} y Factor X_{a}.

Otros componentes, que pueden ser añadidos, dependen del modo empleado y pueden necesitar la inclusión de inhibidores de la proteasa plasmática para enzimas distintos de la verificada o de un inhibidor de polimerización de fibrina. El Ca^{2+} puede estar en la forma de una sal soluble en el plasma que proporciona el ion Ca^{2+} en forma libre, sin complejar, es decir, iones Ca^{2+} fuertes en forma libre sin complejar. Tales componentes adicionales incluyen también adecuadamente Factor VIII/VIII_{a} y Factor V/V_{a}.

El sustrato para el que se determina la velocidad de conversión, puede estar constituido por un sustrato sintético para una enzima, cuya actividad está influida por Proteína C activada, por ejemplo, trombina (= Factor II_{a}) y Factor X_{a}. Los sustratos sintéticos adecuados con solubles en agua y poseen preferiblemente la estructura de un oligopéptido con tres, cuatro o cinco restos de aminoácidos y un extremo amino terminal que está protegido del ataque por amino-peptidasas. La protección se consigue o bien mediante un grupo protector o por tener un aminoácido D en el extremo amino terminal. Con objeto de proporcionar una respuesta detectable, el extremo carboxilo terminal de un sustrato sintético es amidado con un grupo que específicamente puede ser liberado y detectado por la acción de la proteasa de coagulación de la sangre relevante. El grupo que ha de ser liberado se selecciona entre grupos cromógenos, fluorógenos o quimiluminógenos y otros grupos detectables analíticamente. Véanse, además, "Handbook of synthetic substrates for the coagulation and fibrinolytic system" de H.C. Hemker, Martinus Nijhoff Publishers, 1983 y "Synthetic peptide substrates in hemostatic testing", de J. Fareed et al., en CRC Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences, Vol 19, Número 2, 71-134 (1983). En el caso de muestras diferentes de muestras de plasma puede añadirse como sustrato fibrinógeno exógeno.

Con objeto de lograr un resultado específico con respecto a la sustancia que ha de ser determinada, en algunos casos pudiera intentarse mantener el contenido de la muestra de plasma del medio de ensayo final tan alto como sea posible. Por consiguiente, el contenido de la muestra de plasma en ensayos que tienen una buena especificidad podría ser >10%, en particular >20% o >35% (v/v). En otros casos, sin embargo, puede emplearse un contenido esencialmente bajo, es decir, inferior al 10% (v/v).

B. Inmunoensayos para determinar la actividad de cofactor de APC del Factor V

La preparación de anticuerpos de la invención permite realizar inmunoensayos de actividad de cofactor de APC del Factor V. Tales ensayos significan que se permite que un anticuerpo hacia la actividad de cofactor de APC del Factor V, forme un complejo inmune con el Factor V que posee actividad de cofactor de APC en la muestra, en una cantidad que es una medida cualitativa o cuantitativa del nivel de actividad de cofactor de APC en la muestra. Las muestras pueden ser las mismas que para los ensayos funcionales.

La presente invención está relacionada también con reactivos para usar en ensayos de A y B.

Pueden usarse preparaciones purificadas que comprendan Factor V que expresen la actividad de cofactor de APC, que hayan sido purificadas a partir de plasma o que hayan sido preparadas mediante tecnología recombinante, preparaciones de Proteína C, opcionalmente en forma activada o combinada con un activador de Proteína C, y preparaciones de Proteína S, que contengan cantidades definidas de sus factores respectivos, como reactivo o como estándar o como testigo en los ensayos antes citados. La preparación de Proteína C puede combinarse con al menos un factor de coagulación dependiente de la vitamina K seleccionado entre los Factores IX, X y II, combinado opcionalmente con Proteína S. También pueden obtenerse mediante tecnología recombinante, productos y preparaciones para uso terapéutico. Además, los presentes anticuerpos monoclonales pueden ser obtenidos mediante tecnología recombinante, y esencialmente puede usarse tecnología de PCR, que es bien conocida, para obtener tales anticuerpos con la especificidad deseada.

Hay indicaciones de que puede obtenerse información acerca de diversas mutaciones del Factor V, basadas en más interacciones entre actividad anticoagulante del Factor V y la Proteína S. Pueden idearse métodos para obtener tal información en presencia o en ausencia de un anticuerpo adecuado. Tales métodos, en presencia de anticuerpo, pueden ser usados como método cuantitativo para detectar un analito, tal como actividad anticoagulante del Factor V y la Proteína S.

C. Ensayos de hibridación

Resultados recientes obtenidos justamente antes de la presentación de esta memoria descriptiva de patente han mostrado en un estudio convencional de unión con DNA de una gran familia con resistencia a la APC heredada que existe una relación fuerte entre un polimorfismo neutro en el gen del Factor V y la expresión de resistencia a la APC. Esto sugiere vivamente que la mutación en el gen del Factor V es la causa de la resistencia a la APC. Esta es una evidencia concluyente de que ensayos de hibridación de ácidos nucleicos así como de secuenciación de ácidos nucleicos, pueden usarse de modos convencionales con objeto de detectar individuos con riesgo de episodios trombóticos debidos a un nivel bajo de actividad de cofactor de APC del Factor V. Así pues, estos tipos de ensayos pueden ser usados para comprobar, en un individuo, la presencia o ausencia anormal de uno o más fragmentos y/o secuencias de ácidos nucleicos únicas para detectar la presencia o ausencia de expresión de una molécula de Factor V que o bien es portadora de dicha actividad de cofactor de APC o bien es deficiente en esta actividad. Los protocolos y condiciones son los mismos que se aplican normalmente para otros genes, excepto por el uso ahora de reactivos específicos para el gel del Factor V y opcionalmente mutaciones asociadas con resistencia a la APC o específicos para el gen normal del Factor V. Puede ser apropiada cualquier muestra de células procedente del individuo.

Además, la presente invención está relacionada con el Factor V, adecuadamente Factor V humano, capaz de llegar a activarse para ejercer actividad procoagulante del Factor V_{a} pero incapaz de ejercer actividad anticoagulante, preferentemente actividad no anticoagulante como un cofactor de la APC, estando dicho factor en una forma sustancialmente pura.

Otro aspecto de la invención se refiere a Factor V, adecuadamente Factor V humano, capaz de ejercer actividad anticoagulante, preferentemente como un cofactor de la APC, pero incapaz de expresar actividad procoagulante de Factor V_{a}.

Tales Factores pueden ser purificados a partir de plasma con métodos similares a los del Factor V normal, o prepararse mediante tecnología recombinante. Son aplicaciones posibles en patrones y como reactivos suplementarios, así como para uso terapéutico.

La presente invención se describe además en la sección experimental que sigue, con referencia a los dibujos. En estos dibujos:

La Fig. 1 ilustra una cromatografía sobre Q-Sepharose (A) y Sephacryl S-300 (B) de Factor V y de actividad de cofactor 2 de APC;

la Fig. 2 ilustra los resultados de la caracterización de actividad de cofactor 2 de APC/Factor V aislada, sobre SDS-PAGE, transferencia Western, y electroforesis en gel de agarosa;

la Fig. 3 ilustra la purificación conjunta de actividad de cofactor 2 de APC y Factor V en cromatografía de afinidad con anticuerpos monoclonales; y

las Fig. 4 A y B ilustran la corrección de resistencia a la APC mediante actividad de cofactor 2 de APC/Factor V.

Por conveniencia, la expresión usada inicialmente "(actividad) de cofactor 2 de APC" se ha mantenido en la parte experimental que sigue como una designación de la actividad de cofactor anticoagulante del Factor V.

Materiales y métodos Ensayo de actividad de cofactor 2 de APC

Una modificación del método APC-APTT recientemente descrito (PCT/SE/9200781; y Dahlbäck et al., en Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1004-1008 (1993), fue desarrollada para medir la actividad de cofactor 2 de la APC durante su purificación. El método empleó plasma procedente de un individuo que tenía una mala respuesta heredada a APC y fracciones obtenidas de plasma normal que fueron ensayados para determinar su aptitud para normalizar la mala respuesta a la APC. El ensayo, al que se aludirá como ensayo de actividad de cofactor 2 de APC, fue llevado a cabo del modo siguiente: 50 \mul de plasma que manifestaba una respuesta mala a la APC (al que se aludirá como plasma resistente a la APC) fueron incubados con 50 \mul de la fracción a ensayar y 50 \mul de un reactivo (APTT) de tiempo de tromboplastina activado (APTT-automatizado Organon Technica (EE.UU.)) durante 5 minutos a 37ºC antes de que la coagulación fuese iniciada mediante la adición de 5 \mul de una mezcla de APC-CaCl_{2} (si no se indica de otro modo, APC humana 20 nM en Tris-HCl 10 mM, NaCl 0,05 M, CaCl_{2} 30 mM, pH 7,5, conteniendo albúmina de suero bovino (BSA) al 0,1%) midiéndose el tiempo de coagulación. La presencia de actividad de cofactor 2 de APC en una muestra de ensayo está asociada con un aumento en el tiempo de coagulación.

Adecuadamente, cada una de las muestras se analiza también en paralelo sin la adición de APC a la solución de CaCl_{2} y se calculó la prolongación del tiempo de coagulación dependiente de la APC. Para construir una curva de dosis-respuesta de actividad de cofactor 2 de APC el plasma deficiente en actividad de cofactor 2 de APC se mezcló con plasma testigo y se usó como plasma de ensayo en el método de APC-APTT. La respuesta anticoagulante de la APC estaba relacionada con el porcentaje de plasma testigo y la curva tenía una forma exponencial. Dado que no se sabía si el plasma deficiente en actividad de cofactor 2 de APC estaba completamente desprovisto de Factor V que expresa actividad de cofactor 2 de APC, el ensayo proporcionó solamente una semicuantización del cofactor en diferentes fracciones. Sin embargo, el ensayo sirvió para la finalidad de proporcionar medios de seguir la actividad de cofactor 2 de APC durante su purificación.

Se llevó a cabo un ensayo de coagulación de factor V usando plasma deficiente en factor V según ha sido descrito con anterioridad (J. Clin. Invest. 66, 583-591 (1980)). La presencia de actividad de Factor V dio como resultado un acortamiento del tiempo de coagulación del plasma deficiente. En ambos ensayos, el ensayo de actividad de cofactor 2 de APC y el ensayo de coagulación del Factor V, han sido mostrados los datos de coagulación originales en vez de convertir los resultados en unidades.

Métodos electroforético, inmunológico y otros: Electroforesis en gel de poliacrilamida con gradiente (5-15%) en presencia de dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) y transferencia Western se llevaron a cabo a cabo usando técnicas que han sido descritas con anterioridad (J. Biol. Chem: 261, 9495-9501 (1986)). Un antisuero polic1onal de conejo, específico, contra Factor V fue obsequio de Dakopatts A/S. Datos que demuestran la especificidad del antisuero han sido indicados con anterioridad (Blood 68, 244-249 (1986)). Fueron inducidos anticuerpos policlonales de conejo contra los fragmentos aislados de las cadenas pesadas y ligeras de Factor V bovino (J. Biol. Chem. 261, 9495-9501 (1986)). Se obtuvieron anticuerpos monoclonales usando métodos estándar, según ha sido descrito con detalle con anterioridad (J. Biol. Chem. 265, 8127-8135 (1990). La proteína purificada en el agrupamiento de S-300 se usó como antígeno en la inmunización de ratones Balb/c. Se obtuvieron diecisiete anticuerpos diferentes y sus reactividades fueron ensayadas con transferencia Western. Aproximadamente 20 mg de un anticuerpo designado Master 30, fueron acoplados a 4 ml de Affigel 10 (Biorad) siguiendo las instrucciones del fabricante. Fracciones de IgG de los antisueros policlonales contra Factor V humano y los fragmentos de Factor V bovino fueron acoplados también a Affigel (aproximadamente 5 mg/ml).

Ejemplo 1 Purificación de actividad de cofactor 2 de APC

Todas las manipulaciones de las muestras fueron llevadas a cabo en un baño de hielo; las cromatografías y las centrifugaciones fueron realizadas en sala fría, adecuadamente a 4ºC. Recogida de sangre: Plasma humano, tratado con citrato, recientemente congelado (-70ºC), se obtuvo del banco de sangre local. El plasma congelado (2,3 litros) se descongeló a 37ºC y se añadieron los inhibidores de proteasa siguientes: fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF) (1 mM), fluorofosfato de diisopropilo (DFP) (1 mM), inhibidor de tripsina de soja (50 mg/l), Trasylol (aprotinina) (1,5 mg/l que es igual a 10 unidades/ml), y benzamidina (10 mM). El plasma (mantenido en un baño de hielo) se sometió a adsorción en bario-citrato según se ha descrito con anterioridad (Dahlbäck, Biochem. J. 209, 837-846 (1983) y el plasma adsorbido en bario se sometió a precipitación fraccionada con polietilenglicol (PEG 6000) (8%, p/v) mediante la adición de PEG sólido. La actividad de cofactor de APC se recuperó en el sobrenadante del PEG al 8%. El sobrenadante del PEG al 8% se diluyó con un volumen igual de benzamidina 10 mM Y después se mezcló con Q-Sepharose (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Suecia) equilibrada en Tris-HCl 20 mM, NaCl 0,1 M, CaCl_{2} 1 mM, pH 7,5. comprendiendo benzamidina 10 mM. Después de 1 hora de mezclar suavemente, se recogió el gel en un embudo Buchner y se lavó con A, 3 litros de disolución tampón de equilibrio, B 1 litro de disolución tampón de equilibrio con Tween 20 al 0,1% y C 2 litros de disolución tampón de equilibrio que contenía NaCl 0,15 M en lugar de NaCl 0,1 M. El gel fue rellenado después en una columna (5 cm de diámetro) y las proteínas absorbidas fueron eluídas con un gradiente lineal de NaCl (NaCl 0,15-0,5 M en Tris-HCl 20 mM, CaCl_{2} 1 mM, benzamidina 10 mM, pH 7,5, 1,5 litros en cada recipiente de gradiente). El caudal fue 330 ml/hora y se recogieron fracciones de 11 ml. Las fracciones fueron analizadas para determinar la actividad de cofactor 2 de APC y la actividad de Factor V en diluciones 1/10 (Fig. 1).

Se agruparon fracciones según está indicado por la barra horizontal y se sometieron a precipitación con (NH_{4})_{2}SO_{4} (saturación de 70%). Se recogió el precipitado mediante centrifugación, se disolvió en un volumen mínimo de Tris-HCl 20 mM, NaCl 0,15 M, CaCl_{2} 1 mM, pH 7,5, que contenía benzamidina 10 mM, DFP 1 mM y PMSF 1 mM, y se aplicó a una columna (2,5 cm x 93 cm) con Sephacryl S-300 equilibrado en la misma disolución amortiguadora pero sin DFP ni PMSF. La columna se hizo funcionar a 10 ml/hora y se recogieron fracciones de 1,2 ml. Las fracciones fueron analizadas con el ensayo de actividad de cofactor 2 de APC y el ensayo de Factor V a diluciones 1/10 (Fig. 1). Se agruparon fracciones como indica la barra horizontal y se guardaron a -70ºC.

Ejemplo 2 Cromatoqrafía de afinidad usando anticuerpos monoclonales

La proteína obtenida en el Ejemplo 1 procedente de una cromatografía con 8-300 (en la operación ilustrada aproximadamente 6 mg en Tris-HCl 20 mM, NaCl 0,1 M, CaCl_{2}, 2 mM, pH 7,5) se aplicó a una columna (0,75 cm x 7,5 cm) de Affigel con anticuerpo monoclonal inmovilizado designado Master 30 y obtenido en el Ejemplo 3, equilibrándose la columna y la proteína en Tris-HCl 20 mM, NaCl 0,1 M, CaCl_{2}, 2 mM, pH 7,5. Después de lavar la columna hasta que la absorbancia del eluato llegó a ser cero, las proteínas unidas fueron eluídas con dietanolamina 50 mM, CaCl_{2}, 2 mM, pH 10,6. El pH del eluato se neutralizó inmediatamente con Tris-HCl 3 M, pH 7,5 (50 \mul por fracción de 1 mI). Las fracciones fueron analizadas (a dilución 1/5) con ensayo de actividad de cofactor 2 de APC y ensayo de coagulación de Factor V. Las fracciones activas fueron agrupadas, concentradas mediante ultrafiltración (membranas YM10) y guardadas a -70ºC. El cofactor 2 de APC/Factor V purificado fue activado con trombina según se ha descrito con anterioridad (J. Clin. Invest. 66, 583-591(1980).

Ejemplo 3 Preparación de anticuerpos monoclonales

La proteína purificada procedente del Ejemplo 1, es decir, Factor V (cofactor 2 de APC) fue usada como inmunógeno para la inmunización de ratones Balb/c según un protocolo estándar. Células esplénicas procedentes de dicho ratón fueron fusionadas con células de la línea celular de mieloma de ratón Sp 2/0 Ag14 y seleccionadas en medio de DMEM de hipoxantina-aminopterina-timidina, según ha sido descrito por Köhler y Milstein (loc. cit.).

Se usó un en ensayo inmunoabsorbente con enzimas ligadas (ELISA) de fase sólida para detectar los anticuerpos producidos contra el Factor V en antisueros procedentes de los ratones así como para detectar células híbridas que producen anticuerpos. En tales ensayos, Factor V (10 \mug/ml en disolución tampón de revestimiento estándar) fue depositado como revestimiento en pocillos sobre placas de microtitulación. Antisueros procedentes de ratones inmunizados y sobrenadantes de los cultivos de células híbridas fueron añadidos en dilución a los pocillos y se analizaron pocillos individuales para determinar la presencia de anticuerpos unidos a Factor V con ayuda de un anticuerpo secundario marcado con una enzima, de un modo conocido per se.

Células híbridas procedentes de pocillos positivos, es decir, células que producen anticuerpos, fueron clonadas mediante dilución limitante, subclonadas y expandidas. Después de implantación en la cavidad abdominal de ratones previamente tratados con pristano, se produjeron anticuerpos monoclonales en grandes cantidades en el fluido ascítico.

Se obtuvieron diecisiete "masters", todos los cuales reaccionaban con determinantes antigénicos sobre el Factor V como se puso de manifiesto según el método de transferencia Western, estando dirigidos la mayoría de estos anticuerpos monoclonales (abreviadamente MAb) a la misma región del Factor V, a saber, el fragmento de activación que comprende la región central de 150 kDa del Factor V.

Uno de estos MAb, designado Master 30, fue usado para la purificación por afinidad del Factor V, según el Ejemplo 2.

Ejemplo 4

En este ejemplo, los MAb preparados en el Ejemplo 3 fueron ensayados para determinar su influencia sobre la actividad de coagulación y sobre la actividad de cofactor 2-APC en el plasma.

Cantidades crecientes de MAb purificado, hasta 400 \mug/ml, fueron añadidas a plasma normal y después de incubación (15-30 minutos), se midió la actividad de Factor V con un ensayo convencional de Factor V basado en análisis de coagulación y se determinó la respuesta a APC exógena según el método siguiente.

Muestras de plasma normal que comprendían concentraciones variables de Mab (10-400 \mug/ml) fueron incubadas con un reactivo APTT comercial. (En los presente ensayos se usó Automated APTT de Organon). Se obtuvieron resultados similares con el reactivo APTT procedente de COATEST APC Resistance, Chromogenix AB, Mölndal, Suecia). Después de incubación durante 5 minutos a 37ºC se añadieron o bien CaCl_{2}, 30 mM (en Tris-HCl 20 mM, NaCl 50 mM, pH 7,5, que comprendía albúmina de suero bovino (BSA) al 0,1%), o bien Proteína C activada (APC) (aproximadamente 2 \mug/ml en CaCl_{2}, 30 mM, disueltos en Tris-HCl, 20 mM, NaCl 50 mM, pH 7,5 que comprendía BSA al 0,1%), y se registraron los tiempos de coagulación. El ensayo APTT se llevó a cabo esencialmente según ha sido descrito por Dahlbäck et al., PNAS 90, 1004-1008 (1993).

La presencia de estos MAb no afectó al tiempo de APT convencional, es decir, el tiempo de coagulación para muestras que comprendían CaCl_{2} añadido, enteramente, o solo moderadamente, se observó un tiempo de coagulación de 40-45 segundos. Se encontró, no obstante, que dos de los MAb designados Master 1 y Master 4, acortaban el tiempo de coagulación de muestras a las que se había añadido APC en una solución de CaCl_{2} (tiempo de APC).

Se obtuvieron los tiempos de coagulación siguientes:

Tiempo de APC en ausencia de Mab	110-120 segundos
Tiempo de APC en presencia de Master 4.	80-90 segundos

Estos resultados indican una inhibición en parte de la actividad de cofactor 2-de APC en plasma en presencia de Master 4. Esta actividad parcial de la inhibición de Master 4 se encontró que era dependiente de la cantidad añadida, obteniéndose la inhibición máxima cuando se añadieron 50-100 \mug de Master 4 por ml de plasma. El Master 4 ha sido depositado como se ha indicado anteriormente.

Los resultados de los ensayos anteriores se discuten a continuación con referencia a las Fig. 1-4 (A,B). Más específicamente:

La Fig. 1 ilustra una cromatografía sobre Q-Sepharose (A) y Sephacryl 8-300 (B) de actividad de Factor V y actividad de cofactor 2 de APC. Sobre ambas columnas, el perfil de elución de la actividad de cofactor 2 de APC (secciones superiores) coincidía con el Factor V (secciones medias). La actividad del Factor V fue demostrada como un acortamiento del tiempo de coagulación de plasma deficiente en Factor V, mientras que la actividad de cofactor de la APC estaba asociada con una prolongación del tiempo de coagulación de plasma resistente a APC, dependiente de APC. Las fracciones fueron agrupadas como muestran las barras horizontales.

La Fig. 2 ilustra los resultados de caracterización de cofactor 2 de APC/Factor V aislados sobre SDS-PAGE, transferencia Western y electroforesis en gel de agarosa. El conjunto procedente de la columna de S-300 obtenido en el Ejemplo 1 fue analizado mediante SDS-PAGE, antes y después de incubación con trombina. Los geles fueron o bien teñidos con azul de Coomassie (A) o sometidos a transferencia Western usando el anticuerpo monoclonal (Master 30) obtenido en el Ejemplo 3 (B) o anticuerpos policlonales (C). Las muestras aplicadas a la SDS-PAGE fueron reducidas; aproximadamente 20 \mug de proteína fueron aplicados a cada pista en el gel teñido de proteína mientras que se aplicó aproximadamente 1 \mug a cada una de las pistas empleadas para la transferencia Western. Las pistas con proteína segmentada con trombina están marcadas T. Las posiciones de los marcadores de pesos moleculares se proporcionan en la parte izquierda. Los polipéptidos relacionados con el Factor V están marcados con flechas, mientras que los fragmentos formados por la trombina (J. Biol. Chem. 257, 6556-6564, 1982) están indicados por puntas de flecha. El fragmento de 150 kDa se tiñó mal con el azul de Coomassie, pero se observa con facilidad en la transferencia Western. Las bandas observadas intermitentemente se indican por asteriscos. El conjunto de 8-300 se analizó también mediante electroforesis en gel de agarosa (sección del fondo). Las posiciones de las bandas de albúmina (alb), \alpha1, \alpha2, \beta1 y \beta2 de un testigo de plasma están indicadas por líneas verticales.

La Figura 3 ilustra la purificación conjunta de actividad de cofactor 2 de APC y Factor V en cromatografía de afinidad con anticuerpo monoclonal. El conjunto de 8-300 se aplicó a una cromatografía de afinidad con anticuerpo monoclonal (Master 30). Como la capacidad de unión de la columna fue excedida, la mayor parte de la proteína pasó a través de la columna. Después de lavar la columna, la proteína unida fue eluída con pH alto (el comienzo de la elución está indicado por una flecha). Las fracciones fueron analizadas con ensayo de actividad de cofactor 2 de APC y ensayo de Factor V. La actividad de Factor V estaba asociada con un acortamiento del tiempo de coagulación de plasma deficiente en Factor V, mientras que la actividad de cofactor de APC proporcionó una prolongación del tiempo de coagulación de plasma resistente a APC, dependiente de la APC. Las dos líneas de trazos representan los tiempos de coagulación de testigos de disolución tampón.

Las Fig. 4 A-B ilustran la corrección de resistencia a APC mediante cofactor 2 de APC/Factor V purificado. El cofactor 2 de APC/Factor V purificado por afinidad (en las concentraciones indicadas en un volumen de 50 \mul) se mezcló con plasma resiste a APC (50 ml). Las mezclas fueron ensayadas luego en el ensayo de actividad de cofactor 2 de APC (A) con (\bullet) y sin (\circ) APC en la solución de CaCl_{2} y en el ensayo de Factor V (B). Cada uno de los puntos representa la media de medidas duplicadas.

Resultados

La actividad de cofactor 2 de APC fue analizada con un ensayo biológico empleando plasma procedente de un individuo (designado plasma AS) con resistencia a APC como plasma de ensayo, y se ideó un procedimiento operatorio para purificar el cofactor 2 de APC procedente de plasma normal. La primera etapa del procedimiento operatorio fue absorción en bario-citrato, que retiró las proteínas dependientes de vitamina K, incluyendo las proteínas C y S. El eluato de bario-citrato no tenía actividad de cofactor 2 de APC. Al fraccionar el plasma del sobrenadante con precipitación con PEG 6000, la actividad del cofactor 2 de APC estaba presente en el sobrenadante de PEG al 8%, mientras que el precipitado de PEG 6000 0-8% disuelto no tenía actividad de cofactor 2 de APC. La actividad de cofactor 2 de APC en el sobrenadante de PEG al 8% fue purificado primeramente mediante cromatografía de intercambio aniónico en una columna con Q-Sepharose y después por filtración en gel sobre Sephacryl S-300 (Fig. 1). Este protocolo de purificación era muy similar a un procedimiento de purificación del Factor V de coagulación (J. Clin. Invest. 66, 583-591 (1980)). y se encontró Factor V en las mismas fracciones de actividad de cofactor 2 de APC, La purificación se llevó a cabo al menos 10 veces con modificaciones diferentes, y los perfiles de elución del Factor V y de la actividad de cofactor 2 de APC eran, consistentemente, muy similares. La proteína en el conjunto de 8-300 expresaba ambas actividades, de Factor V y de cofactor 2 de APC, y manifestaba las características indicadas con anterioridad para el Factor V (J. Clin. Invest. 66, 583-591 (1980)). Esfuerzos adicionales llevados a cabo para separar las dos actividades usando otros diversos principios cromatográficos, tales como Sepharose Heparinizada, Sepharose Azul y Sepharose con aglutinina de germen de trigo, no tuvieron éxito (no se indican), y se encontró, en efecto, que la actividad de cofactor 2 de APC se purificaba junto con el Factor V sobre todos los soportes cromatográficos que se ensayaron.

La electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS de la proteína en el conjunto de S-300 proporcionó una banda de 330 kDa (que correspondía a Factor V de una sola cadena) además de bandas con pesos moleculares de, aproximadamente, 220.000 y 130-150.000 (Fig. 2). Estas bandas representaban Factor V segmentado y, a semejanza de las especies de 330 kDa, reaccionaban con un antisuero policlonal contra el Factor V en el ensayo de transferencia Western (Fig. 2). La banda de 220 kDa representaba la parte del extremo C terminal del Factor V, incluyendo la cadena ligera de 74 kDa del Factor V_{a} y la más larga (150 kDa) de los dos fragmentos de activación, y fue reconocida por un antisuero contra la cadena ligera del Factor V_{a} bovino (no se indican los resultados). Las bandas de 130-150 kDa comprendían la parte del extremo N terminal del Factor V (cadena pesada de 105 kDa más la más pequeña de los dos fragmentos de activación) y por consiguiente reaccionaba con un antisuero contra la cadena pesada del Factor V_{a} bovino (no se indican los resultados). Bandas adicionales de pesos moleculares inferiores que no reaccionaban con antisuero policlonal de Factor V en el ensayo de transferencia Western, fueron vistas a veces, pero cuando estaban presentes, sus perfiles de elución (como se estimó mediante SDS-PAGE) sobre la cromatografía de S-300 no se correlacionaban con la actividad de Factor V ni con la actividad de cofactor 2 de APC. La incubación de la proteína purificada con trombina proporcionó fragmentos característicos de Factor V segmentado con trombina, y simultáneamente se perdió la actividad en el ensayo de cofactor de APC, lo que sugiere que la actividad de cofactor 2 de APC solamente es expresada por el Factor V pero no por el Factor V_{a}. En la electroforesis en gel de agarosa, la proteína purificada emigraba como una especie única hasta una posición inter-alfa (Fig. 2), y ambas actividades, de Factor V y de cofactor 2 de APC, pudieron eluirse desde esta posición del gel (no se indica).

Puesto que el Factor V es sumamente sensible a la proteólisis, una abundancia de inhibidores de proteasa fue incluida en el protocolo final. Cuando se actuó en ausencia de inhibidores de proteasa, el procedimiento operatorio de purificación dio como resultado un producto más degradado que carecía de la especie de 330 kDa, pero que contenía las bandas de 220 kDa y 130-150 kDa. Este producto purificado 15 expresaba ambas actividades, la de Factor V y la de cofactor 2 de APC. El Factor V requiere calcio para su estabilidad, y cuando no se incluyó calcio en la purificación, ambas actividades, la de Factor V y la de cofactor 2 de APC, se perdieron gradualmente.

La proteína en el conjunto de 5-300 fue usada como antígeno en el Ejemplo 3, para la producción de anticuerpos monoclonales. Se obtuvieron diecisiete anticuerpos, y se encontró que todos ellos reaccionaban con el Factor V de una sola cadena de 330 kDa así como también con la especie de 220 kDa, como se estimó por análisis de transferencia Western (Fig. 2). Después de la segmentación del Factor V con trombina todos los anticuerpos reaccionaron con el fragmento de activación de 150 kDa (el más largo de los dos fragmentos de activación).

Uno de los anticuerpos (Master 30) se inmovilizó sobre Affigel y se usó para la cromatografía de afinidad (Fig. 3). El conjunto de 5-300 se aplicó a la columna. La proteína que estaba unida a la columna fue eluída y se encontró que tenía ambas actividades, la de Factor V y la de cofactor 2 de APC. Los perfiles de elución de ambas actividades coincidían, pero manifestaron una estela considerable. Otras condiciones de elución tales como el uso de valores de pH superiores o inferiores, o de agentes de desnaturalización, fueron intentadas pero no tuvieron éxito ya que dieron como resultado pérdida de ambas actividades. El conjunto de S-300 fue aplicado también a columnas con anticuerpos policlonales inmovilizados, contra Factor V humano o contra fragmentos de Factor V_{a} bovino. Ambas actividades, de Factor V y de cofactor 2 de APC, quedaron retenidas en la columna, pero las condiciones de desnaturalización requeridas para eluir la proteína unida dieron como resultado la pérdida de ambas actividades biológicas (no se muestran los resultados).

Concentraciones crecientes de cofactor 2 de APC/Factor V purificados por afinidad fueron añadidos a plasma AS y se ensayo la respuesta anticoagulante a APC. Se observó un aumento, dependiente de la dosis, en respuesta anticoagulante a APC (Fig. 4A). Aproximadamente 25 mg/l, que del mismo orden de magnitud que la concentración plasmática normal de Factor V, fue necesaria para obtener una respuesta de APC del plasma AS comparable a la del plasma normal (tiempos de coagulación en presencia de APC de 90-110 segundos). La proteína purificada por cromatografía de afinidad era activa también en el ensayo de Factor V, como se demuestra por un acortamiento del tiempo de coagulación (Fig. 4B).

Los ejemplos que siguen muestran que manteniendo constantes los niveles de dos de los componentes en el sistema de cofactor de APC compuestos de APC, Factor V que posee actividad de cofactor 2 de APC y Proteína S, y variando el restante, se consiguen diferentes grados de conversión del sustrato. Esto implica que pueden construirse ensayos según se ha indicado antes en términos generales para cada uno de los componentes. Un ensayo que emplea plasma deficiente en actividad de cofactor 2 de APC ha sido descrito en la sección Materiales y Métodos.

Ejemplo 5 Efecto del cofactor 2 de APC en un ensayo cromógeno

El principio del ensayo se basa en la monitorización de la degradación de FVIII_{a} por APC a través de la activación de FX dependiente de FIX_{a}, en cuyo sistema el FVIII_{a} sirve como un cofactor importante del FIXa. Así, un nivel aumentado de FVIIIa dará como resultado una generación disminuida de FX_{a} determinada mediante la hidrólisis de un sustrato peptídico cromógeno sensible al FX_{a}.

I.: 50 ml de una dilución de plasma normal 1:20 en disolución tampón de Tris-HCl de 50 mmol/l, pH 7,3, 1 = 0,15 y albúmina de suero bovino (BSA) al 1% que contenía concentrado de FVIII altamente purificado (Octonativ M®., Rabi Pharmacia AB, Estocolmo, Suecia), 2 UI/ml, se mezcló con 50 \mul de trombina bovina, 0,06 nkat/ml (actividad frente al sustrato S-2238, (Chromogenix AB, Mölndal, Suecia)) durante 30 s a 37ºC.

II.: Después de esto se añadieron a la mezcla anterior 100 \mul de una mezcla reactiva (R) que contenía Tris-HCl, 40 mmol/l, pH 7,3 y BSA al 0,15%, CaCl_{2} ,12 mmol/l, y fosfolípidos, 30 \mumol/l, así como otros componentes definidos a continuación, seguido de incubación durante 2 min a 37ºC.

III.: Se tomaron como submuestra desde esta mezcla 25 pl y se diluyeron con 1000 \mul de tampón de Tris-HCl 50 mmol/l, pH 7,3,1 = 0,15 con BSA al 0,2%, seguido de análisis de la actividad de FVIII según el principio del ensayo de FVIII COATEST®. (Chromogenix AB, Mölndal, Suecia).

IV.: 200 pl de un reactivo que contenía FIXa bovino y FX bovino (COATEST FVIII®., Chromogenix AB, Mölndal, Suecia y fosfolípidos, 30 \mumol/litro, se mezclaron con 100 \mul de la submuestra diluida y con 100 \mul de CaCl_{2}, 25 mmol/litro. Después de 5 minutos de incubación a 37ºC, se añadieron 200 \mul del sus trato S-2765 de FX_{a} cromógeno (Chromogenix AB, Mölndal, Suecia), 0,9 mmol/litro. Al cabo de 3 minutos más de incubación a 37ºC, la hidrólisis del sustrato fue detenida mediante 100 \mul de ácido acético al 20%, y se leyó a 405 nm, la absorbancia de la pNA cromóforo liberada.

En este sistema de ensayo la concentración de FVIII activo en la muestra es directamente proporcional a la absorbancia. El contenido de componentes suplementarios en las diferentes mezclas R son:

A. Ninguno

B. APC, 0,4 \mug/ml

C. APC, 0,4 \mug/ml + actividad

D. APC, 0,4 \mug/ml + Proteína S humana, 1 \mug/ml

E. APC, 0,4 \mug/ml + Proteína S humana, 1 \mug/ml + actividad de cofactor 2 de APC, 0,3 \mug/ml.

El plasma normal contiene aproximadamente 10 \mug/ml de Proteína S libre; por tanto las diluciones de la muestra contribuyen con 0,05x0,05xl0 = 0,025 \mug/ml correspondiendo a una cuarta parte de la cantidad añadida de Proteína S purificada. El contenido de actividad de cofactor 2 de APC debe ser considerado como una estimación aproximada ya que no existe todavía método cuantitativo alguno.

Resultados

30

Así pues, los resultados muestran que la adición de actividad de cofactor 2 de APC mejora la actividad de la APC en ambos niveles de Proteína S, ilustrada como una disminución de la generación de FX_{a}, es decir, una velocidad de inactivación del FVIIIa aumentada en la etapa II.

Ejemplo 6 Efecto de la actividad de cofactor 2 de APC en un ensayo de coagulación

Los cofactores FV_{a} y FVIII_{a} están implicados en la generación de trombina, la enzima responsable de la formación de fibrina. Estos cofactores son degradados por la APC y por tanto la actividad de APC se ilustra en un ensayo de coagulación como una prolongación del tiempo necesario para la generación del coágulo de fibrina. Dado que la Proteína C (PC) circula como una proenzima, la activación de PC en la muestra se consigue por adición de la enzima Protac C de veneno de ofidio (Pentapharm, Basilea, Suiza). Se llevó a cabo el experimento siguiente:

I.: 10 \mul de concentrado de FVIII (Octonativ M® Kabi Pharmacia AB, Estocolmo, Suecia), 10 UI/ml, se mezclaron con 100 \mul de plasma deficiente en PC, 100 pl de reactivo APTT, 25 pl de Protac C®, 1,5 U/ml, y 25 \mul de una mezcla de reactivos (R), que contenía Tris-HCl, 50 mmol/l, pH 7,5, I = 0,15, BSA al 0,2% y otros componentes adicionales definidos a continuación, se añadieron a la mezcla anterior. La mezcla completa se incubó durante 4 minutos a 37ºC.

II.: 100 \mul de CaCl_{2}, 22 mmol/litro, se añadieron luego a la mezcla anterior y se registró el tiempo necesario para la formación de coágulos a 37ºC.

Suplementación en mezclas R

A. Ninguna

B. PC, 2 \mug/ml

C. PC, 2 \mug/ml + actividad de cofactor de APC, 2,6 U/ml

D. PC, 4 \mug/ml

E. PC, 4 pg \mug/ml + actividad de cofactor 2 de APC, 2,6 U/ml

F. Cofactor 2 de APC, 2,6 U/ml.

El plasma deficiente en Proteína C contribuye con las otras proteínas plasmáticas implicadas en el proceso de coagulación y también con la Proteína S, APC. La concentración final de actividad de en la etapa I es aproximadamente 0,2-0,3 U/ml (véase anteriormente)

Resultados

40

Por tanto, los experimentos demuestran con claridad que la adición de actividad de cofactor 2 de APC mejora la actividad de la APC, expresada como una prolongación aumentada del tiempo de coagulación. El efecto por sí mismo de la adición de la preparación de cofactor 2 de APC en ausencia de PC es solamente menor.

Claims

1. Un método para diagnosticar un trastorno de la coagulación/anticoagulación de la sangre, preferiblemente un trastorno tromboembólico, o para determinar una redisposición al mismo, en un individuo, preferiblemente un mamífero, tal como un ser humano, en cuyo método se determina el nivel de actividad anticoagulante de Factor V como cofactor para APC en una muestra, preferiblemente una muestra de sangre o una muestra derivada de sangre, tal como plasma, derivado de dicho individuo, en el que se añade plasma deficiente en Factor V indicando un nivel anormal la manifestación de, o una predisposición a, dicho trastorno, siendo preferiblemente dicho trastorno de nivel disminuido un trastorno tromboembólico.

2. El método según la reivindicación 1, en el que se determina el nivel de actividad anticoagulante del Factor V asociado con la resistencia a la APC.

3. El método según la reivindicación 1, en el que se mide la actividad anticoagulante en presencia de Proteína S añadida o un inhibidor que bloquea la actividad de Proteína S derivada de la muestra, adaptado para determinar Factor V anticoagulante asociado con resistencia a la APC o adaptado para determinar Factor anticoagulante V asociado con la resistencia a la APC.

4. El método según la reivindicación 1 ó 2, en el que la actividad anticoagulante de Factor V se determina con un método inmunológico.

5. El método según la reivindicación 1 ó 2, en el que se añade al medio de ensayo Proteína S o el inhibidor de dicha Proteína S, el sustrato para APC está constituido por Factor V_{a} y/o Factor VIII_{a}, y la muestra se deriva de proteínas de coagulación de un individuo, utilizándose la muestra para medir la conversión del sustrato APC: con la condición de que cuando la muestra se deriva de un individuo sometido a terapia con antagonistas de vitamina K o de otro modo deficiente en factores de coagulación dependientes de vitamina K, las actividades de tales factores dependientes de vitamina K se modifican por la adición de al menos un factor de coagulación dependiente de vitamina K en forma activada o no activada, opcionalmente en combinación con Proteína S.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que dicha actividad anticoagulante de Factor V se determina en la muestra basada en análisis de coagulación, adecuadamente en presencia de Proteína S añadida, o un inhibidor que bloquea la actividad de Proteína S, derivada de la muestra, (i) incubándose una porción de la muestra en ausencia de APC añadida pero, opcionalmente, en presencia de componentes de coagulación de la sangre adicionales requeridos para permitir la medida de la conversión del sustrato por la APC, y (ii) incubándose una porción de la muestra en presencia de APC añadida y, opcionalmente, en presencia de otros componentes de coagulación de la sangre requeridos para permitir la medida de la conversión del sustrato por APC; empleándose el tiempo de coagulación, opcionalmente después de la conversión adecuada, y los resultados por debajo de un valor de corte establecido basados en tiempo de coagulación, obtenidos con el mismo procedimiento para individuos normales, siendo indicativos de una deficiencia en dicha actividad anticoagulante de Factor V.

7. Un método según la reivindicación 6, en el que la sustancia a analizar es un Factor V anticoagulante asociado con la resistencia a APC y en el que el plasma deficiente en la sustancia a analizar está constituido por un plasma deficiente en Factor V.

8. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la sustancia a analizar es el Factor V anticoagulante como co-factor de la APC o asociado con la resistencia a APC y en el que se añade al medio de ensayo un factor de coagulación de la sangre o un reactivo que activa el sistema de coagulación de la sangre vía la ruta intrínseca o extrínseca.

9. Método según la reivindicación 8, comprendiendo el método añadir otros componentes de coagulación de la sangre, seleccionándose dichos componentes del grupo que consiste en Factor VII/VII_{a}, Factor IX, Factor IX_{a}, Factor X/X_{a}, Factor II, Factor XI_{a}, Factor XII_{a} y un reactivo que sirve para introducir un factor de coagulación activado, tal como un activador de contacto o factor tisular.

10. El método según la reivindicaciones 1 a 6, en el que el plasma deficiente en factor V que está constituido por plasma humano, que ha sido hecho deficiente en dicha actividad o de plasma humano de uno o más individuos, cuyo plasma es deficiente en dicha actividad.

11. Una preparación de anticuerpo que reacciona específicamente con una región o un sitio del Factor V asociado con su actividad anticoagulante como cofactor para APC y, opcionalmente, que comprende un epítopo para dicha actividad, o que reacciona específicamente con una región o sitio del Factor V que comprende un epítopo implicado en la resistencia a la APC.

12. La preparación de anticuerpos según la reivindicación 11, siendo dicha preparación monoclonal y comprendiendo un número definido, por ejemplo un número seleccionado en el intervalo de 1 a 5, de anticuerpos monoclonales que tienen la especificidad definida en la reivindicación 11.

13. Una preparación de anticuerpos que comprende anticuerpos policlonales que reconocen y se unen selectivamente al Factor V anticoagulante, los cuales anticuerpos se unen a una región o sitio del Factor V que está asociada con su actividad anticoagulante como co-factor de la APC, comprendiendo opcionalmente dicha región o sitio, un epítopo para dicha actividad, o se unen para dicha actividad, o se unen a una región o sitio del Factor V que comprende una epítopo implicado en la resistencia a la APC.

14. La preparación de anticuerpos de la reivindicación 12, que comprende anticuerpos monoclonales, produciéndose dichos anticuerpos por células de hibridoma de ratón/ratón, y preferiblemente producidos por la línea celular de hibridoma en la European Collection of Animal Cell Culture bajo el número de entrada 93120846.

15. Una línea celular que produce anticuerpos, adecuadamente monoclonales, que reaccionan específicamente con una región o sitio del Factor V asociado con su actividad anticoagulante como co-factor para APC y que comprenden opcionalmente un epítopo para dicha actividad o que reacciona específicamente con una región o sitio del Factor V que comprende un epítopo implicado en la resistencia a la APC.

16. La línea celular según la reivindicación 15, que es una línea celular hibridoma.

17. La línea celular de la reivindicación 16, que es la línea celular hibridoma depositada en la European Collection of Animal Cell Culture bajo el número de entrada 93120846.

18. Uso de una preparación de paquete de plasma para la determinación in vitro de la actividad anticoagulante del Factor V según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, comprendiendo dicha preparación de plasma, preferentemente plasma humano que se ha hecho deficiente en dicha actividad anticoagulante, por ejemplo mediante agotamiento inmune con respecto al Factor V, capaz de expresar dicha actividad, suplementándose opcionalmente dicho plasma con Factor V al que inherentemente le falta dicha actividad anticoagulante, por ejemplo, Factor V bovino, o suplementado con Factor V_{a}, o comprendiendo dicha preparación de plasma humano de uno o más individuos cuyo plasma es deficiente en dicha actividad.

19. Uso según la reivindicación 18, en el que el plasma deficiente se mezcla con plasma normal o con Factor V que tiene actividad anticoagulante, siendo la mezcla capaz de expresar dicha actividad anticoagulante a un nivel adecuado bajo, por ejemplo para uso como plasma de control.

20. Una preparación de paquete de plasma para la determinación in vitro de la actividad anticoagulante del Factor V como co-factor para APC o Factor V asociado con la resistencia al APC, siendo dicha preparación una mezcla de plasma de individuos que tienen una deficiencia parcial en la actividad anticoagulante del Factor V, siendo dicha mezcla capaz de expresar dicha actividad anticoagulante a un nivel bajo adecuado, por ejemplo para uso como plasma de control.

21. Un plasma deficiente en actividad anticoagulante de Factor V como co-factor para APC o Factor V asociado a la resistencia a la APC, siendo dicho plasma capaz de expresar actividad de Factor V pro-coagulante y estando constituido por plasma, preferentemente plasma humano, que ha sido hecho deficiente en dicha actividad anticoagulante, por ejemplo por agotamiento inmune con respecto al Factor V capaz de expresar dicha actividad, estando suplementado dicho plasma opcionalmente con Factor V al que inherentemente le falta dicha actividad anticoagulante, por ejemplo Factor V bovino o suplementado con Factor V_{a}, o que comprende plasma humano de uno o más individuos cuyo plasma es deficiente en dicha actividad.

22. Un plasma deficiente en actividad anticoagulante de Factor V como co-factor para la APC o Factor V asociado a la resistencia a la APC, comprendiendo dicho plasma preferiblemente plasma humano, que sido hecho deficiente en dicha actividad anticoagulante, por ejemplo por agotamiento inmune con respecto al Factor V capaz de expresar dicha actividad, estando suplementado dicho plasma opcionalmente con Factor V, al que inherentemente le falta dicha actividad anticoagulante, por ejemplo Factor V bovino o suplementado con Factor V_{a} o que está constituido por plasma humano de uno o más individuos cuyo plasma es deficiente en dicha actividad, el cual plasma deficiente se mezcla con plasma normal o con Factor V que tiene dicha actividad, o es una mezcla de plasma de individuos que tiene deficiencia parcial en actividad anticoagulante del Factor V, siendo dicha mezcla capaz de expresar dicha actividad anticoagulante a un nivel bajo adecuado, por ejemplo para uso como plasma de control.

23. Uso de la preparación de anticuerpos según cualquiera de las reivindicaciones 11-14, para obtener una preparación de paquete de plasma agotado e inmune como se ha definido en la reivindicación 18 o plasma de la reivindicación 21.

24. Uso de una preparación de Proteína S para el método según la reivindicación 1, para la determinación de la actividad anticoagulante del Factor V como co-factor para la APC o Factor V asociado con la resistencia a la APC.

25. Uso de una preparación de Proteína C, opcionalmente en forma activada o combinada con un activador para la proteína C en el método de la reivindicación 1 para la determinación de la actividad anticoagulante del Factor V como co-factor para la APC o Factor V asociado con la resistencia a la APC.

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26. El uso de la reivindicación 25, en el que dicha preparación está combinada con al menos un factor de coagulación dependiente de vitamina K seleccionado de Factores VII, IX, X y II, y opcionalmente combinado con Proteína S.

27. Factor V, adecuadamente u Factor V humano, capaz de llegar a ser activado para ejercer actividad pro-coagulante de Factor V_{a} pero no capaz de ejercer actividad anticoagulante de Factor V, o Factor para APC o actividad anticoagulante de Factor V asociado con la resistencia a la APC, estando dicho factor en una forma sustancialmente pura.

28. Factor V, adecuadamente Factor V humano, capaz de ejercer actividad anticoagulante de Factor V como co-factor para la APC o actividad anticoagulante de Factor V asociado con resistencia a la APC, pero no capaz de expresar la actividad pro-coagulante de Factor V_{a}.

29. Un método para determinar la presencia de mutaciones génicas del Factor V, las cuales mutaciones están situadas en uno o más fragmentos de ácido nucleico y/o secuencias del gen del Factor V y dan lugar a la expresión de molécula de Factor V mutadas asociadas con la expresión del Factor V anticoagulante defectuoso, en donde dicho Factor V anticoagulante defectuoso no expresa actividad de co-factor APC como una ausencia o presencia normal de fragmentos de ácido nucleicos y/o secuencias en el gen del Factor V causadas por dicha(s) mutación(es), empleándose métodos corrientes tales como métodos basados en análisis de hibridación de ácido nucleicos o secuenciación de ácido nucleicos.