HUT72191A - Novel anticoagulant cofactor activity - Google Patents
Novel anticoagulant cofactor activity Download PDFInfo
- Publication number
- HUT72191A HUT72191A HU9502190A HU9502190A HUT72191A HU T72191 A HUT72191 A HU T72191A HU 9502190 A HU9502190 A HU 9502190A HU 9502190 A HU9502190 A HU 9502190A HU T72191 A HUT72191 A HU T72191A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- factor
- activity
- apc
- protein
- cofactor
- Prior art date
Links
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims description 211
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 title claims description 20
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 title claims description 19
- 108010014172 Factor V Proteins 0.000 claims description 191
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 75
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 54
- 230000014508 negative regulation of coagulation Effects 0.000 claims description 54
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 claims description 54
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 claims description 53
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 claims description 53
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 claims description 53
- 108010066124 Protein S Proteins 0.000 claims description 53
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 claims description 53
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 claims description 53
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 52
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 33
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 31
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 30
- 108010074105 Factor Va Proteins 0.000 claims description 27
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 claims description 26
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 claims description 26
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 26
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 claims description 23
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 21
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 20
- 206010056867 Activated protein C resistance Diseases 0.000 claims description 19
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 19
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 19
- 239000000306 component Substances 0.000 claims description 18
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 17
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 15
- 108010074361 factor V clotting antigen Proteins 0.000 claims description 15
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 claims description 13
- 230000002947 procoagulating effect Effects 0.000 claims description 13
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 12
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 12
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 12
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 claims description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 11
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 11
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 claims description 10
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 claims description 10
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 claims description 10
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 claims description 10
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 claims description 10
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 claims description 9
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 claims description 9
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 claims description 9
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 9
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 9
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 claims description 9
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 claims description 9
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 claims description 9
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 claims description 9
- 230000009424 thromboembolic effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 claims description 7
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 7
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 claims description 6
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 6
- 108010061932 Factor VIIIa Proteins 0.000 claims description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 5
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 4
- 208000015294 blood coagulation disease Diseases 0.000 claims description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 4
- 230000009852 coagulant defect Effects 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 claims description 3
- 101710111620 Protein C activator Proteins 0.000 claims description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 claims description 3
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 claims description 3
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 claims description 2
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 claims description 2
- 239000012503 blood component Substances 0.000 claims description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 2
- 229940019333 vitamin k antagonists Drugs 0.000 claims description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims 1
- 239000003130 blood coagulation factor inhibitor Substances 0.000 claims 1
- 239000003914 blood derivative Substances 0.000 claims 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 claims 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 claims 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 claims 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 26
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 22
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 19
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 18
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 17
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 17
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 15
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 13
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 13
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 12
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 12
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 12
- 230000004044 response Effects 0.000 description 11
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 11
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 10
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 10
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 9
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 description 8
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 8
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 8
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 102100034540 Adenomatous polyposis coli protein Human genes 0.000 description 7
- 101710112282 Adenomatous polyposis coli protein Proteins 0.000 description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 7
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 6
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 6
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 6
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 6
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 6
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N benzamidine Chemical compound NC(=N)C1=CC=CC=C1 PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000007820 coagulation assay Methods 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 4
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 4
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 4
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010020608 Hypercoagulation Diseases 0.000 description 4
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 4
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 229940006612 barium citrate Drugs 0.000 description 4
- PAVWOHWZXOQYDB-UHFFFAOYSA-H barium(2+);2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate Chemical compound [Ba+2].[Ba+2].[Ba+2].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O PAVWOHWZXOQYDB-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N diisopropyl fluorophosphate Chemical compound CC(C)OP(F)(=O)OC(C)C MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 4
- 229960005051 fluostigmine Drugs 0.000 description 4
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 4
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 239000003805 procoagulant Substances 0.000 description 4
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 201000005665 thrombophilia Diseases 0.000 description 4
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 101000577630 Homo sapiens Vitamin K-dependent protein S Proteins 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 3
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 3
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 3
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 3
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 3
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 3
- 102000052932 human PROS1 Human genes 0.000 description 3
- 229940099815 human protein s Drugs 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 3
- 239000012268 protein inhibitor Substances 0.000 description 3
- 229940121649 protein inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 3
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 230000001732 thrombotic effect Effects 0.000 description 3
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 2
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 108010048049 Factor IXa Proteins 0.000 description 2
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 2
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 2
- 101000924577 Homo sapiens Adenomatous polyposis coli protein Proteins 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 102100026966 Thrombomodulin Human genes 0.000 description 2
- 108010079274 Thrombomodulin Proteins 0.000 description 2
- 108010046516 Wheat Germ Agglutinins Proteins 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 2
- 102000055691 human APC Human genes 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 2
- 239000003998 snake venom Substances 0.000 description 2
- 108010026668 snake venom protein C activator Proteins 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 4-nitroaniline Chemical compound NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800001401 Activation peptide Proteins 0.000 description 1
- 102400000069 Activation peptide Human genes 0.000 description 1
- 239000005995 Aluminium silicate Substances 0.000 description 1
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 206010003178 Arterial thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 101710117545 C protein Proteins 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001146702 Candidatus Entotheonella factor Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 102100037529 Coagulation factor V Human genes 0.000 description 1
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- AFSDNFLWKVMVRB-UHFFFAOYSA-N Ellagic acid Chemical compound OC1=C(O)C(OC2=O)=C3C4=C2C=C(O)C(O)=C4OC(=O)C3=C1 AFSDNFLWKVMVRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ATJXMQHAMYVHRX-CPCISQLKSA-N Ellagic acid Natural products OC1=C(O)[C@H]2OC(=O)c3cc(O)c(O)c4OC(=O)C(=C1)[C@H]2c34 ATJXMQHAMYVHRX-CPCISQLKSA-N 0.000 description 1
- 229920002079 Ellagic acid Polymers 0.000 description 1
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 1
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 1
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 108010054265 Factor VIIa Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108060005987 Kallikrein Proteins 0.000 description 1
- 102000001399 Kallikrein Human genes 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 1
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 201000005660 Protein C Deficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010051292 Protein S Deficiency Diseases 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 206010047249 Venous thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 108091005605 Vitamin K-dependent proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 235000012211 aluminium silicate Nutrition 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000003429 anti-cardiolipin effect Effects 0.000 description 1
- 239000002506 anticoagulant protein Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000012911 assay medium Substances 0.000 description 1
- 229910052788 barium Inorganic materials 0.000 description 1
- DSAJWYNOEDNPEQ-UHFFFAOYSA-N barium atom Chemical compound [Ba] DSAJWYNOEDNPEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- LZCZIHQBSCVGRD-UHFFFAOYSA-N benzenecarboximidamide;hydron;chloride Chemical compound [Cl-].NC(=[NH2+])C1=CC=CC=C1 LZCZIHQBSCVGRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960000182 blood factors Drugs 0.000 description 1
- 230000036765 blood level Effects 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- GKTWGGQPFAXNFI-HNNXBMFYSA-N clopidogrel Chemical compound C1([C@H](N2CC=3C=CSC=3CC2)C(=O)OC)=CC=CC=C1Cl GKTWGGQPFAXNFI-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 1
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000009190 disseminated intravascular coagulation Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000000440 effect on coagulation Effects 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 229960002852 ellagic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000004132 ellagic acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000006624 extrinsic pathway Effects 0.000 description 1
- 229940012414 factor viia Drugs 0.000 description 1
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 1
- 230000003480 fibrinolytic effect Effects 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002607 heparin antagonist Substances 0.000 description 1
- 208000013746 hereditary thrombophilia due to congenital protein C deficiency Diseases 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N kaolin Chemical compound O.O.O=[Al]O[Si](=O)O[Si](=O)O[Al]=O NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 239000003055 low molecular weight heparin Substances 0.000 description 1
- 229940127215 low-molecular weight heparin Drugs 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- FAARLWTXUUQFSN-UHFFFAOYSA-N methylellagic acid Natural products O1C(=O)C2=CC(O)=C(O)C3=C2C2=C1C(OC)=C(O)C=C2C(=O)O3 FAARLWTXUUQFSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 229940048914 protamine Drugs 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000002537 thrombolytic effect Effects 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 1
- 208000004043 venous thromboembolism Diseases 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/36—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against blood coagulation factors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
- G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
- G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
- G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
- G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
- G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)
- G01N2333/96441—Serine endopeptidases (3.4.21) with definite EC number
- G01N2333/96461—Protein C (3.4.21.69)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
- G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
- G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
- G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
- G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
- G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)
- G01N2333/96441—Serine endopeptidases (3.4.21) with definite EC number
- G01N2333/96463—Blood coagulation factors not provided for in a preceding group or according to more than one of the proceeding groups
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
Description
A találmány általánosságban egy olyan antikoaguláns (alvadásgátló) kofaktor aktivitásra vonatkozik, amely szerepet játszik az emberi véralvadás rendszerben és valószínűleg néhány más emlős faj véralvadási rendszerében is szerepe van.
A véralvadás nagyszámú olyan proteint tartalmazó komplex rendszer, amelyek együttműködnek a vérlemezkékkel (trombocitákkal) a hemosztázis érdekében. Az alvadási
rendszert szigorúan szabályozza egy sor plazmában és az endoteliális vérsejtek felületén jelenlévő antikoaguláns protein [Esmon, 7. Bioi. Chem., 264. . 4743-4746. (1989.); Bauer, Sem. Hematol., 28., 10-18. (1991.); Rapaport, Blood, 73., 359-365. (1989.)]. Fiziológiás körülmények között az alvadást és alvadást gátló mechanizmusok kényes egyensúlyban vannak, és így biztosítják a hemosztázist és a koagulációt. Ha ebben az egyensúlyban zavarok keletkeznek, ez vagy vérzést, vagy tromboembóliás rendellenességeket eredményez.
A találmány egy olyan új aktivitásra vonatkozik, amely a protein C-vel és protein S-sel összefüggő, fiziológiailag fontos alvadásgátló rendszerben fejti ki hatását. Az új aktivitást az utóbbi években értelmezték és mint részét a véralvadásban végbemenő kölcsönhatásoknak, az alábbi 1. sémán mutatjuk be.
• · · · · · · ·· ······
FIX
1. séma
FXI a
Szövet tromboplasztin
FVII
Ca2“
Ca2+
FX
Protein S protein C (APC)
Trombomodulin
Protein C
FIX -a Foszfolipid Ca2+
->
FVIII—>-FVIII . /a / / / X /
----K X
X X X *fv2
Protrombin FX2
Foszfolipid „ 2Ca
FV
Fibrinogén
--9- Fibrin
Trombin
Fibrin (oldhatatlan) (oldható)
---> prokoaguláns lépések --> gátlás
A fent említett antikoagulációs rendszerben a protein C - egy K vitamin-függő plazma protein - olyan kulcskomponens,
- 4 amely endoteliális sejteken a trombin/trombomodulin komplex által aktivált protein C-vé (Activated Protein C = APC) való aktiválódás után szelektíven lebontja az Va és Villa alvadási faktorokat, azaz az V, illetve VIII alvadási faktor aktivált formáit [Esmon, lásd előbb; Stenflo: Protein C and Related Proteins (szerk.: Bertina; Churchill Livingstone Longhaus Group, Egyesült Királyság; 1988.) című kiadvány, 21-54. old.; Mann et al., Amm. Rév. Biochem., 57., 915-956. (1988.); Kané et al., Blood, 71. . 539-555. (1988.)].
Az APC aktivitását egy másik K-vitamin-függő plazmaprotein, a protein-S befolyásolja, amely az APC kofaktoraként vesz részt az Va és Villa faktor lebontásában [Esmon, lásd előbb: Stenflo, lásd előbb; Dahlbáck, Thromb. Haemostas., 66., 49-61. (1991.)].
A fent említett Va és Villa faktor foszfolipidhez kötött kofaktorok, amelyek szerepet játszanak a X faktor és a protrombin aktiválásában és így közvetett módon részt vesznek a fibrinogén fibrinné alakításában, azaz az alvadékképzésben. Ennek megfelelően az alvadási reakció sebessége a VIII és V faktor aktiválása és ezek aktivált formáinak lebontása között fennálló egyensúlytól függ, ugyanis az aktiválatlan VIII és V faktor gyenge szubsztrátumok az APC számára.
A véralvadási rendszer zavarai súlyos és gyakran az életet is veszélyeztető állapotokként jelennek meg (manifesztálódnak) és e zavarok mélyebb okainak az ismerete gyakran döntő abból a szempontból, hogy lehetővé teszi a kialakult betegség diagnózisát és/vagy az eredményes terápiát vagy az olyan egyének szűrését, akiknél véralvadási betegségre való hajlam mutatkozik. Például a tisztított protein C terápiás használatát a trombofillával társult protein C hiányosság felfedezése eredményezte.
A trombofiliát úgy lehet meghatározni, mint tendenciát vénás tromboembóliás betegség korai kialakulására felnőttekben, ismert kockázati faktorok hiánya mellett. Bár néhány tromboembóliás betegnél észleltek rendellenességeket, azonban az ilyen esetek többségében a laboratóriumi vizs-
gálatok nem mutattak ki rendellenességeket.
A találmány az aktivált protein C-re adott antikoaguláns válasz egy új hiányosságára, az úgynevezett APCrezisztenciára vonatkozik, amelyről kimutattuk, hogy öröklődik és családi eredetű trombofi1iává1 van kapcsolatban.
Néhány esetben a trombofiliát olyan hipotetikus faktorokkal hozták összefüggésbe, mint az anti-protein C antitest [Mitchell et al., New Engl. J. Med., 316.. 16381642. (1987.)], anti-kardiolipin antitest [Amer et al., Thrombosis Rés., 57., 247-258. (1990.)] és egy hibás VIII faktormolekula [Dahlbáck et al., Thromb. Haemost., 39.. 658. (1991.)].
A WO 93/10261 számon nyilvánosságra hozott nemzetközi szabadalmi bejelentés, amely a jelenlegi bejelentéshez képest a legkorábbi elsőbbségi időpont után közzétett referencia, bizonyos manifeszt véralvadási zavar diagnózisára alkalmas in vitro módszerekre vonatkozik és olyan egyének szűrésére, akiknél véralvadási rendellenességre való hajlam mutatkozik. Ezek a módszerek exogén APC-re adott antikoaguláns válasz mérésén alapulnak, amikoris APC-t adunk a vizsgált egyénből vett plazma mintához és az APC-re adott gyenge antikoaguláns szakasz, azaz az APC- rezisztencia, nyilvánvaló véralvadási zavarokra vagy erre való hajlamra és főként tramboembóliás betegségre mutat. Nincs magyarázat az APC-rezisztenciára, de az APC-vel szembeni rezisztencia feltehetően a véralvadási rendszerben lévő ismeretlen kölcsönhatásoknak vagy ismeretlen faktor(ok)nak tudható be. Azonban számos olyan lehetséges magyarázatot, amelyek az APC-rezisztenciát egy funkcionális protein S hiányossággal vagy egy protein C gátló antitesttel vagy egy APC-re ható protein inhibitorral vagy egy APC rezisztens Va faktor molekulát eredményező mutációval, vagy egy VIII faktor gén mutációval hozták összefüggésbe, kizártak.
A találmány szerint megállapítottuk, hogy az APCrezisztencia egy előzőleg fel nem ismert olyan antikoaguláns kofaktor aktivitásnak tudható be, amely az APC-nek az Va
- 6 faktorral és Villa faktorral szembeni proteolitikus hatását fokozza. Azokat az adatokat, amelyek az említett antikoaguláns kofaktor aktivitás felfedezésének alapjául szolgálnak, Dahlbáck és munkatársai közölték [Proc. Natl. Acad. Sci., 90, 1004-1008 (1993)], ez a referencia a jelen bejelentés legkorábbi elsőbbségi időpontja után jelent meg.
Részletesebben kifejtve, úgy találtuk, hogy ezt az antikoaguláns aktivitást az V faktor fejti ki, és ez a felismerés eléggé meglepő, ugyanis az V faktor az Va faktor prokoaguláns prekurzora, és ez utóbbit az APC bontja a fent említett protein C antikoaguláns rendszerben. Tehát azt találtuk, hogy az V faktor az APC második kofaktora, lévén, hogy az első a protein S, amint a fentiekben említettük. Ennek megfelelően, az új antikoaguláns kofaktor aktivitás APC-kofaktor 2 aktivitás” vagy V faktor antikoaguláns aktivitás” elnevezést kapott, és ahol helyénvaló, ott az V faktort is APC-kofaktor 2-nek neveztük. Az V faktor előzőleg ismert aktivitását V faktor prokoaguláns aktivitás-nak nevezték. Azonban azt az eshetőséget, hogy az említett aktivitás kapcsolatban van az Va faktorral, nem lehet teljesen kizárni.
A találmány szerinti új antikoaguláns kofaktor aktivitás felismerésének alapja az volt, hogy találtunk egy trombózisos és rendellenes APC-rezisztenciát mutató beteget, amikor plazmáját a fent említett WO 93/10261 számon nyilvánosságra hozott nemzetközi szabadalmi bejelentésben (elsőbbségi időpont: 1991. november 13.) és a Dahlbáck és munkatársai közleményében [Thromb. Haemost., 65. . 39.
kivonat, 658. (1991.)] szereplő módszerekkel vizsgáltuk.
Amikor trombózisos betegeket nagy számban vizsgáltunk, azt találtuk, hogy az idiopátiás (ismeretlen eredetű) tromboembóliás események 30-40 %-ában az alapvető ok az APC-rezisztencia [Thromb. Haemost., 69. , 999., Kivonat (1993.)].
Később, a találmány szerint megállapítottuk, hogy egy normál plazmából kapott nyers frakció olyan aktivitást tartalmazott amely az APC-rezisztens plazma hibáját • · · • ♦ · ♦ · « · ·· • · · · • ♦·· ♦ · · · · • ·· ·«···· — 7 kijavította, míg egy kifejezett APC-rezisztenciát mutató betegből származó, APC-rezisztens plazma megfelelő frakciója inaktív volt. Ezenkívül, amikor erre az aktivitásra tisztított készítményeket használtunk olyan vizsgálatokban, amelyeket ezen aktivitás mérésére dolgoztunk ki, döntő bizonyítékot szereztünk az APC egy új kofaktora létezéséről.
A találmánynak megfelelően, meglepő módon, arra a következtetésre jutottunk, hogy a humán V faktornak jól ismert funkcióján kívül, miszerint a prokoaguláns Va faktor prekurzora, APC kofaktor aktivitása is van. Lehetséges, hogy a humán V faktornak ez a kettős funkciója néhány állatfaj főként emlősök - véréből származó V faktornál szintén megtalálható, de más fajokban nem nyilvánul meg ez a kettős aktivitás. Például az eddig kapott eredmények arra mutatnak, hogy a bovin plazma nem tartalmaz ilyen aktivitást.
Az V faktor ezen említett kofaktor aktivitása azt jelenti, hogy fokozza az aktivált protein C proteolitikus aktivitását, ez elősegíti az Va faktor, azaz az V faktor aktivált formájának a lebontását, valamint a Villa faktor lebontását.
Előzőleg is ismert volt, hogy az V faktor prokoaguláns aktivitása annak tudható be, hogy a trombin aktiválja, amikoris három elhasított peptid kötés a prokoaguláns Va faktor, képződését eredményezi, amely egy, a natív V faktor N- és C-terminális részei közötti komplex. Az V faktor centrális részéből származó két nagyméretű aktivációs peptid funkcióját azonban nem ismerjük. A találmány kísérleti részében be fogjuk mutatni, hogy nem találtunk APC-kofaktor 2 aktivitást az Va faktornál a használt APC-rezisztencia tesztben.
Tehát APC-kofaktor 2 aktivitást elsődlegesen az ép V faktor molekula fejt ki, valószínű, hogy Va faktorrá való aktiválódása folyamán a lehasadt nagyméretű fragmentumok az említett aktivitás nagy részéhez hozzájárulnak. Azonban nem lehet kizárni annak lehetőségét, hogy az említett aktivitás kapcsolatban van egy olyan molekula létezésével, amely igen erős komplexet alkot az V faktorral, amely nem bomlik el az • · · · · * ··· ·· ··· ··· • · · ♦ ··»··· ·· ·
- 8 APC-kofaktor 2 aktivitást kifejtő V faktor izolálására használt tisztítási eljárás alatt. Fentiek alapján a találmánnyal kapcsolatban az V faktor és APC-kofaktor 2 aktivitású V faktor és hasonló kifejezésekbe beleértjük az említett V faktor komplexet és az V faktor olyan fragmentumait is - előnyösen nem az V faktor trombinnal való hasítása révén keletkező fragmentumokat -, amelyeknek ilyen aktivitásuk van. Módosított V faktor, megtartott APCkofaktor aktivitással, más humán vagy nem humán eredetű enzimekkel - ilyenek a kígyóméreg enzimek és más proteázok való proteolitikus hasítással is kaphatunk. Ezenfelül azt találtuk, hogy az APC-kofaktor 2 aktivitás a tisztítása folyamán történő ismeretlen enzimmel való részleges proteolízis után megmarad, és ez APC-kofaktor 2 aktív V faktor fragmentumok potenciális létezését jelenti. Az antikoaguláns aktivitású APC-kofaktor 2 vagy antikoaguláns aktivitású V faktor kifejezés, az aktivitást kifejtő V/Va faktor fragmentumaira és alegységeire vagy egy olyan immunológiai determinánsra is vonatkozik, amely az említett aktivitással járó szakaszhoz kapcsolódik. Bár az egyszerűség kedvéért ebben a leírásban a koagulációs faktorokat és hasonlókat nem kapcsoljuk fajhoz, előnyösen emberi eredetű faktorokat értünk alattuk, hacsak másként nem jelezzük.
A leírás kísérleti részében ismertetjük a tisztítási eljárásokat és az új APC-kofaktor 2 aktivitás jellemzését és igazoljuk kapcsolatát az V faktorral.
Összefoglalva, az APC-kofaktor 2 aktivitás V faktoron való jelenlétének bizonyítékai a következők:
1. Az APC-kofaktor 2 aktivitás izolálására kidolgozott eljárás és az V faktor izolálására alkalmazott korábbi módszerek nagyon hasonlóak. SDS-PAGE rendszerben három sáv jelenik meg körülbelül 200-220 KD-nál (C-terminális rész), 140-160 KD-nál (N-terminális rész) és 330 KD-nál, és ez szintén nagyon hasonló ahhoz, amit az V faktorról közöltek [lásd a leírás kísérleti részét és Dahlbáck és munkatársai következő közleményét: J. Chem. Invest., 66., 583-591.
(1980.)]. A 330 KD sáv intenzitása fokozódik mind az APC···· ·· · ·· • · · « • ♦·· ····· » ·· ··*··· φ φφ *· ·* · ··· kofaktor 2 aktivitás, mind az V faktor esetében, ha a tisztítási eljárás folyamán magasabb koncentrációkban használjuk a protein inhibitorokat. Például 10 mM benzamidin-hidroklorid koncentráció jelentékeny savat eredményez 330 KD-nál.
2. Humán V faktor ellenes specifikus poliklonális antiszérum (Dakopatt A/S, Dánia) mindhárom APC-kofaktor 2 aktivitással társult sávval reagál Western blotting vizsgálatban.
3. Ha trombint adunk az APC-kofaktor 2 aktivitást tartalmazó találmány szerinti készítményekhez, a három sáv eltűnik és a kapott terméket nem lehet megkülönböztetni azoktól a termékektől, amelyek az V faktor trombinnal való aktiválására képződnek.
4. Tizenhét V faktorral reagáló monoklonális antitestet kaptunk, amikor egy APC-kofaktor 2 szempontjából tisztított készítményt használtunk immunogénként. A monoklonális antitestek közül kettő részben gátolta az APC-kofaktor 2 aktivitást, anélkül, hogy az V faktor prokoaguláns aktivitását gátolta volna.
5. Az V faktor prokoaguláns aktivitás és az APCkofaktor 2 aktivitás együtt oldódott le minden vizsgált kromatografáló anyagról. A következő anyagokat vizsgáltuk többek között: Heparin Sepharose,.Wheat Germ lektin Sepharose, Q-Sepharose és S-Sepharose (Pharmacia, Svédország).
6. Mind az V faktor prokoaguláns aktivitást, mind az APC-kofaktor 2 aktivitást visszatartotta egy humán V faktor elleni poliklonális antitestet hordozó mátrix (Dakopatts A/S, Dánia).
7. Mind az V faktor prokoaguláns aktivitást, mind az APC-kofaktor 2 aktivitást visszatartotta az a Sepharose és Affigel, amelyek a bovin V faktor különböző fragmentumai elleni olyan antiszérumokat hordoztak, amelyek humán V faktorral keresztreagálnak.
8. Mind az V faktor prokoaguláns aktivitás, mind az APC-kofaktor 2 aktivitás visszamarad egy olyan ·♦ · ·· ·* • · · • · · · ··· ··* ··»··· ·· • · · «· · «
- 10 kromatográfiás hordozón - ilyen az Affigel illetve innen együtt oldódnak le, amely nagy affinitású, olyan monoklonális antitestet tartalmaz, amelyet úgy állítottunk elő, hogy egy APC-kofaktor-2-re tisztított készítményt használtunk immunogénként. Magában ez az antitest sem az APC-kofaktor 2 aktivitást, sem az V faktor prokoaguláns aktivitást nem gátolta. Az eluálást pH 10,5-11 körül végeztük.
9. Egy legújabb közlemény [A. Kapur et al., A.J. Hematol., 42♦, 384-388. (1993.)] szerint az V faktor elleni autoantitestek trombózist okozhatnak.
APC-kofaktor 2 aktivitásra dúsított készítményeket ugyanazzal a módszerrel kaptunk, mint amelyet előzőleg az V faktor izolálására használtunk. Megállapítottuk, hogy a kétértékű fémionok, mint a kalciumion, stabilizáló hatással vannak az APC-kofaktor 2 aktivitásra, és ezért kalciumionokat adagolunk a tisztítás folyamán.
Lényegében ugyanazt a tisztítási eljárást használtuk, mint amikor először megkíséreltük magyarázatát adni az új aktivitásnak a fent említett WO 93/10261 számon nyilvánosságra hozott nemzetközi bejelentésben. Az itt előadott eredmények szerint az új aktivitást úgy azonosítottuk mint az APC-hez járuló egy kofaktor aktivitást, amelyet új tulajdonságaként az V faktor fejt ki, vagy feltehetően ennek komplexe vagy fragmentumai, amint azt a fentiekben tárgyaltuk. Ezért más és egyszerűbb előállítási eljárásokat választottunk. Általánosan elterjedt módszereket - mint gélkromatográfia, affinitáskromatográfia, ioncserés kromatográfia, stb. - használtunk megfelelő átdolgozás után. Ezenkívül rekombináns DNS technikán alapuló módszerek is használhatók.
Tehát a találmány egy olyan készítményre is vonatkozik, amely vérből vagy vérrel összefüggő termékekből - ilyen a plazma-származék - származik és az említett készítményt olyan véralvadási komponens nyerése céljából tisztítjuk, amely antikoaguláns aktivitást képes kifejteni, mint az APC kofaktora, és a tisztítás fokozza proteolitikus aktivitását • · ·
- 11 az Va faktorral és a Villa faktorral szemben. Az említett véralvadási komponenst az V faktor tartalmazza, vagy adott esetben az V faktor és egy önálló molekula stabil komplexe, amely képes az említett aktivitás kifejtésére.
Normál plazmában az V faktor szintje körülbelül 10-20 μg/ml. Más vér koagulációs/antikoagulációs faktorokkal analóg módszer 1 ml normál plazmában az APC-kofaktor 2 aktivitást önkényesen 1 egységnek (E) vesszük.
A találmány foglalkozik még az V faktor egy olyan szakaszára specifikus antitestekkel és antitest készítményekkel, amelyhez APC-kofaktor 2 aktivitás társul, azaz egy olyan szakaszára, amely vagy APC-kofaktor 2 aktivitást vagy APC-kofaktor 2 inaktivitást létrehozó epitópot hordozó helyet tartalmaz. Ezek az antitest készítmények lehetnek poliklonálisak, vagy előnyösen monoklonálisak. Előnyös, ha az ezekben a készítményekben lévő antitestek specifikusan kötődnek egy vagy több, APC-kofaktor 2 aktivitással járó V faktorhelyhez. Vagy másképpen, egy ilyen hely egy olyan epitópot tartalmazhat, amely szerepet játszik az V faktor APC-kofaktor 2 inaktivitásában, azaz az APC-rezisztenciában. A találmánnyal kapcsolatban az APC-kofaktor 2 inaktivitásában szerepet játszó epitóp kifejezés azt jelenti, hogy egy olyan epitópról van szó, amely kapcsolatban van az APC-kofaktor 2 aktivitás csökkenésével vagy elvesztésével.
A poliklonális antitesteket ismert módszerekkel állíthatjuk elő, úgy, hogy alkalmas állatokat, például egeret, patkányt, nyulat, kutyát, lovat, birkát, kecskét, madarakat - például tyúkot, csirkét, stb. - megfelelő immunogénnel immunizálunk és a találmány szerinti antitesteket az említett állatból származó megfelelő folyadékból, emlősök esetében például vérből vagy szérumból izoláljuk, vagy tojásokból, ha madarakat immunizálunk.
A találmány szerinti antitestek előnyösen monoklonális antitestek, amelyeket hagyományos módszerekkel állíthatunk elő, például lényegében G. Köhler és C. Milstein [Natúré, 256. 495 (1973)] szerint. A találmány szerinti monoklonális • · · • · antitestek előállítására alkalmas módszer általában a következőkből áll: állatot, előnyösen egeret, immunizálunk egy megfelelő immunogénnel, és hibrid sejteket állítunk elő úgy, hogy az immunizált emlősből származó limfocitákat például lépsejteket - mieloma sejtekkel fúziónáljuk, a fúzionált sejteket megfelelő táptalajban szelektáljuk és kiszűrjük az antitest termelő sejteket. Az antitest termelő sejteket, azaz a hibridóma sejteket klónozzuk és monoklonális antitesteket termelünk egerek ascites folyadékában, vagy adott esetben táptalajban, a hibridómák elszaporítása révén. Azonban a találmány szerinti monoklonális antitesteket és ezek antigén-kötő fragmentumait rekombináns technológián alapuló módszerekkel is megkaphatjuk, a szakterületen jól ismert módon. Ezekben a módszerekben eukarióta vagy prokarióta eredetű alkalmas gazdasejteket használhatunk. Az ilyen gazdasejtek jól ismertek ezen a szakterületen.
Immunogénként tisztított V faktor készítményt használhatunk vagy az V faktor fragmentumait és származékait, amelyek APC-kofaktor 2 aktivitásért felelős antigén determinánsokat tartalmaznak. Az ilyen fragmentumok vagy származékok immunogén hordozóval - rendszerint proteinnel konjugálhatók, hogy antigén hatásúvá váljanak.
APC-kofaktor 2 aktivitás hiányos humán V faktornak (előállítható az alább leírtak szerint) mint immunogénnek a használatával, kombinálva olyan monoklonális antitesteket termelő hibridómák szelektálására szolgáló kétlépéses szűrési eljárással, amelyek az immunogénnel reagálnak, de a normál ép V faktorral nem, potenciálisan olyan monoklonális antitestek nyerhetők, amelyek specifikusan reagálnak egy humán APC-kofaktor 2 inaktivitás epitóppal, azaz egy olyan epitóppal, amely az APC-kofaktor 2 aktivitás csökkenésével vagy elvesztésével van kapcsolatban.
A találmány egy előnyös kiviteli alakja olyan monoklonális antitestekre vonatkozik, amelyek kötődnek az V faktor APC-kofaktor 2 aktivitásához és ezt, legalábbis részben, gátolják is. A találmány tárgyát képezik ezen monoklonális • « • ··· ·· ·· ♦ · · · ·<·♦ · ·· ·· · «<
- 13 antitestek olyan származékai és fragmentumai is, amelyek képesek az antigénekhez kötődni.
A találmány szerint előnybe helyezzük az egér/egér hibridóma által termelt monoklonális antitesteket, ugyanis ezek egyszerűen állíthatók elő. Ilyen monoklonális antitesteket termel például egy új hibrid sejtvonal, amelyet 1993. december 8-án helyeztünk letétbe a PHLS Centre fór Applied Microbiology and Research, European Collection of Animál Cell Culture (Salisbury, Nagybritannia) intézményben, XAM-4-5-1 93120846 ideiglenes letéti számon. A találmánnyal összefüggésben az ezen hibridóma által termelt monoklonális antitestek jele M4 (Master 4).
Ha másképpen nem specifikáljuk, az antitest (vagy antitest készítmény) kifejezés az ép antitestet jelenti, két nehéz és két könnyű lánccal, valamint a különböző doméneket (Fv) - ilyen az Fab, Fab', F(ab')2 - tartalmazó antitest származékok különböző formáit: az egyláncú antitesteket; jelzett antitesteket, így a radiojelzett fluoreszceinnel jelzett vagy enzimmel konjugált antitesteket, a szilárd fázishoz kötött antitesteket; stb.
A találmány további kiviteli alakja olyan antitest készítményekkel foglalkozik, amelyek a fent említett specificitású monoklonális antitesteket meghatározott számban - 1^ 2, 3, 4, 5 vagy több különböző monoklonális antitestet - tartalmazzák vagy amelyek poliklonálisak. A poliklonális és monoklonális antitest készítmények speciálisan olyan epitópok ellen irányulnak, amelyek egy APC-kofaktor aktivitással kapcsolatban lévő helyen egyedül vannak jelen, és ezek a készítmények potenciálisan olyan immunassay-kben használhatók, amelyekkel egy mintában specifikusan meghatározhatjuk (mennyiségileg és minőségileg) az APC-kofaktor 2 jelenlétét vagy hiányát.
A találmány tárgyát képezik azok a hibridómák is, amelyek a találmány szerinti monoklonális antitesteket termelik, előnyös az a hibridóma, amelynek az ideiglenes letéti száma XAM-4-5-1 93120846.
Jóllehet az olyan V faktorra specifikus polinklonális ♦*· * ·· · ·« ·· • · · » · és monoklonális antitestek, amelyek az V faktor tisztítására használhatók, előzőleg is ismertek voltak, azonban olyan monoklonális antitesteket, amelyeket szándékoltan APCkofaktor 2 aktivitású V faktor szakasszal szemben termeltek, eddig még nem ismertettek.
A találmány szerinti antitest készítményt (monoklonális, valamint poliklonális) a legtöbb esetben affinitás kromatográfián alapuló tisztítási eljárásokban használhatjuk, amikoris a találmány szerinti antitestet szilárd hordozóhoz kapcsoljuk, és ezen az antitest szelektíven megköti például a plazmakészítményben jelenlévő V faktort. Ezután a szilárd hordozón megkötött V faktort eluáljuk és összegyűjtjük.
A találmány szerinti előnyös monoklonális antitesteket, amelyek kötődnek az V faktorhoz és gátolják - legalább részben - az V faktor APC-kofaktor 2 aktivitását, fel lehet használni az V faktor említett aktivitásának a gátlására. Ezeket a monoklonális antitesteket, mint az előzőleg ismert anti-V faktor antitesteket, APC-kofaktor 2 aktivitás hiányos plazmakészítmények előállítására is fel lehet használni.
A találmány fontos elemeit képezik a terápiás módszerek, gyógyszerek és gyógyszerkészítmények, amelyeknél felhasználjuk az V faktor új antikoaguláns aktivitását, azaz az APC-kofaktor 2 aktivitásnak az ismeretét.
Ennek megfelelően a találmány az V faktornak, valamint APC kofaktornak megfelelő antikoaguláns aktivitású alegységeinek vagy fragmentumainak olyan gyógyszer vagy gyógyszerkészítmény előállítására való felhasználására is vonatkozik, amellyel az APC antikoaguláns aktivitásának a fokozódását vagy helyreállítását érjük el. Pontosabban, ezeket a készítményeket olyan betegek kezelésére szánjuk, akik vaszkuláris betegségekben szenvednek, ilyenek a tromboembóliás zavarok, beleértve a trombózist és a disszeminált intravaszkuláris koagulációt (disseminated intravascular coagulation = DIC).
Egy ilyen gyógyszer vagy gyógyszerkészítmény nagyon tiszta V faktor készítményből állhat; amely alacsony hőmérsékleten, így -70°C-on tartható el.
A találmányt más olyan körülményekkel vagy állapotokkal kapcsolatosan is fel lehet használni, amelyekben egy egyénnek hasznára válna egy javított vagy fokozott antikoagulációs aktivitás, például különböző olyan klinikai állapotokban, amelyekhez artériás és vénás trombózis megnövekedett kockázata társul.
Ezenfelül, minthogy a találmány szerinti APC-kofaktor 2 aktivitás döntő az APC hatás szempontjából, ez az aktivitás magában vagy a protein C/APC-vel és/vagy protein S-sel kombinációban használható, amely fontosnak bizonyulhat olyan klinikai helyzetekben, amelyekben a betegek APC-kofaktor 2 aktivitás hiányosak és főként olyan helyzetekben, amelyekben a trombózis kockázata megnőtt. Ezenkívül a kiegészített APC-kofaktor 2 aktivitás jótékony hatású lenne miokardiális infarktussal kapcsolatos trombolitikus terápia után, valamint poszt-operatív szakaszban - főként veszélyeztetett betegeknél - mint adjuváns a trombózissal kezelt betegeknél, és mikrosebészeti betegekben, stb.
Az APC-kofaktor 2 aktivitás alkalmazási módja olyan, mint a vér koagulációs/antikoagulációs faktorokkal végzett terápiánál szokásos alkalmazás, azaz intravénásán vagy intraarteriális injekció vagy infúzió révén. Mint más véralvadási faktoroknál javasolták, az óráiig alkalmazás sem kizárható. A beadandó mennyiség legyen hatékony abban az értelemben, hogy legalább egy ideig teljesen vagy részben állítsa helyre a beteg saját aktivált protein C-je vagy a beadott protein C aktivált protein C hatását, azzal a tudattal, hogy még ilyen kis hatások is jótékonyak lehetnek olyan betegeknél, akiknél fennáll a trombózis veszélye. Hasznosnak fogadható el egy 1-100 mg/nap tartományon belüli mennyiség, esetleg 40-70 mg/nap. Előnyös az ismétlődő alkalmazás, mivel az APC-kofaktor 2 aktivitást kifejtő V faktort az emlős szervezet metabolizálja.
A rendelkezésre álló különböző típusú gyógyszerkészítmények ugyanolyanok, mint amelyek - más vér koagulációs/antikoagulációs faktoroknál használatban vannak, de ···· ·· • · · w * • ··· · · ··«
*..· “:· ·,.· ·. ·
- 16 megfelelnek azoknak a speciális stabilitási követelményeknek is, amelyek az APC-kofaktor 2 aktivitású V faktorhoz szükségesek. Használhatunk például liofilizált vagy porlasztva szárított porokat, adott esetben megfelelő vivőanyaggal hígítva, valamint steril vagy aszeptikus körülmények között előállított vizes oldatokat.
A találmány egy további eleme a protein C/aktivált protein C-nek és/vagy protein S-nek olyan rendellenességek kezelésére alkalmas gyógyszerkészítményekben való felhasználására vonatkozik, amelyek az APC-kofaktor 2 aktivitás hiányával kapcsolatosak. Ugyanolyan típusú összetételek alkalmazhatók, mint amilyeneket a protein C és protein S terápiás felhasználására szántak a szakemberek.
A találmány egy másik tárgya egy APC-kofaktor 2 hiányos V faktor készítmény, amely előnyösen humán eredetű. Ennek potenciális terápiás használata olyan esetekben, ahol a faktor Va aktivitás az APC-kofaktor 2 aktivitás felé nő, jótékonyan hat a betegre.
A fent említett terápiás módszereket és készítményeket emlősök, főként emberek számára szánjuk.
A találmány szerinti új antikoaguláns kofaktor aktivitást olyan vér koagulációs/antikoagulációs zavarok diagnózisára szolgáló módszerek kidolgozására használhatjuk, amelyek az APC funkcionális aktivitásával kapcsolatosak és olyan módszerek kifejlesztésére is, amelyek a vér koagulációs/antikoagulációs rendszerben szereplő olyan komponensek funkcionális aktivitásának monitorozására és/vagy mérésére alkalmasak, amelyek közvetlenül vagy közvetve az APC funkcionális aktivitásától függenek.
A találmány egy alkalmas kiviteli alakja tehát egy egyedben, főként emlősben - például emberben - egy vér koagulációs/antikoagulációs rendellenességnek, főként tromboembóliás rendellenességnek vagy egy erre való hajlamnak a diagnózisára alkalmas módszerre vonatkozik, és ez a módszer a következőket tartalmazza: egy mintában, előnyösen vér- vagy vérből származó mintában - ilyen az említett egyedből származó plazma - meghatározzuk egy anti···· ·« ·
- 17 koaguláns aktivitású vér-alkotórész szintjét. Az említett vér alkotórész tartalmazza az V faktort, meghatározzuk antikoaguláns aktivitása szintjét, mint APC kofaktorét, rendellenes, előnyösen csökkentett szint a szóbanforgó zavarok manifesztációját vagy az erre való hajlamot jelzi, közelebbről egy lecsökkent szint azt jelenti, hogy a rendellenesség egy tromboembóliás zavar.
A fenti módszer alkalmas kiviteli módja szerint megvizsgáljuk egy egyénből származó megfelelő mintában a protein C/APC, protein S vagy APC-kofaktor 2 aktivitást, és a kapott rendellenes szintet, azaz az alacsonyabb szintet összefüggésbe hozzuk egy diagnózissal, miszerint az egyénnek a vizsgált faktorral, azaz az aktivált protein C/protein Cvel, protein S-sel vagy az V faktor APC-kofaktor 2 kapacitásával összefüggő véralvadási zavara van, és ez a fogyatékosság okozhatja a tromboembóliás zavart, vagy ez válthatja ki a hajlamot erre a zavarra.
Az előbb említett módszerekben az antikoaguláns APCkofaktor 2 aktivitás szintjét előnyösen a funkcionális APCkofaktor 2 aktivitás vizsgálatára a találmány szerint kifejlesztett módszerekkel - amelyeket az alábbiakban írunk le - mérjük. Használhatunk immunológiai módszereken alapuló aktivitási vizsgálatokat és nem-funkcionális vizsgálatokat, amelyek specifikusak az V faktor APC-kofaktor 2 aktivitásával kapcsolatos szerkezeti elemekkel.
Tehát a találmány további elemei az aktivált protein C/ protein C, protein S és APC-kofaktor 2 aktivitású V faktor funkcionális vizsgálatára vonatkoznak, valamint az APCkofaktor 2 aktivitású V faktor vizsgálatára alkalmas immunassay-kre és nukleinsav hibridizációs assay-kre, valamint DNS és RNS szekvencia analízisekre.
Ezek az assay-k nemcsak mint diagnosztikumok használhatók, hanem például az APC-kofaktor rendszer alkotórészeinek tisztítási eljárásánál monitorozásra, kontroll plazmák standardizálására, stb. használhatók.
···» ·· · »
• · ·· • ·· • · ··
A. APC, protin C, APC-kofaktor 2 aktivitás és protein S funkcionális vizsgálatai
Ezeknek a vizsgálatoknak a technológiai leírása hasonló a már előzőleg ismertetett leírásokéhoz [Bertina et al., Rés. Chem. Láb., 20, 127-138 (1990); Wolf et al., Thrombo. Haemost., 62. 1144-1145 (1989): WO-A-9102812, WO-A-9101382, WO 93/10261 számon nyilvánosságra hozott nemzetközi szabadalmi bejelentések, Dahlbáck et al., Thromb. Haemost., 65. 39. Kivonat, 658. old (1991)]. Tehát az APC rendszer egy komponensét, a protein S-t és V faktort - ez utóbbit APCkofaktor 2 kapacitására nézve - a megfelelő APC szubsztrátum APC által történő konverziója szempontjából vizsgáljuk. Normál APC szubsztrátum az Va faktor és/vagy Villa faktor, amelyek közül az egyiket, vagy mindkettőt aktiválatlan (V faktor, VIII faktor) vagy aktivált proteinek formájában feldúsítva vagy magasan tisztított készítményekként, beleértve a rekombináns technológiával előállított készítményeket - adjuk a reakcióelegyhez.
Az összehasonlítandó minták sorozatán belül a reakcióelegyek lényegében az alábbi anyagokból azonos szinteket tartalmaznak:
a) APC vagy protein C vizsgálata esetén legalább egy, APC-kofaktor 2 aktivitású V faktor vagy egy inhibitor, amely blokkolja az ugyanezen mintából eredő aktivitást és protein S vagy egy inhibitor, amely blokkolja a mintából eredő protein S aktivitást;
b) APC-kofaktor 2 vizsgálata esetén legalább egy protein S vagy egy inhibitor, amely blokkolja a minta protein S aktivitását és APC; - és
c) protein S vizsgálata esetén legalább egy APCkofaktor 2 aktivitású V faktor vagy egy inhibitor, amely blokkolja az ugyanezen mintából eredő aktivitást és APC.
Egy sorozat összehasonlítandó mintánál tehát a végső reakcióelegyek a következőket tartalmazzák: minta és APC szubsztrátum és adott esetben az előnyös változatban egy vagy két, előnyösen két olyan anyag, amelyek nem a mintából ·*·· · · · · ♦ ·· • · · · · • ·«· · · · · w · · · « · · ··«··« «· · • « ·· « · e · ·
- 19 származnak, és amelyeket az APC, protein S vagy egy protein S inhibitor és APC-kofaktor 2 aktivitású V faktor, vagy ezen aktivitás inhibitora közül választunk, azzal a kikötéssel, hogy a fennmaradt anyagok egyike a vizsgálandó (azaz APC, protein C, protein S vagy APC-kofaktor 2 aktivitás).
A találmány szerinti módszer a következőkből áll:
a) a mintát és az APC egy szubsztrátumát egy vagy több lépésben vizes reakcióelegyben inkubáljuk, az említett szubsztrátumot vagy eleve a minta tartalmazza vagy hozzáadjuk a reakcióelegyhez , adott esetben további véralvadási komponenseket tartalmaz a minta vagy ezeket hozzáadjuk a reakcióelegyhez;
b) vizsgáljuk a szubsztrátum APC okozta konverzióját az
a) szerint végzett inkubáció alatt és
c) a mért értéket ismert módon a meghatározandó aktivitáshoz viszonyítjuk: ebben a módszerben, adott esetben egy vagy két anyagagot - előnyösen kettőt - adunk az a) szerinti vizsgálati közeghez, és az említett anyago(ka)t az APC, protein S, vagy egy protein S inhibitor és az antikoaguláns aktivitású V faktor vagy ezen aktivitás egy inhibitora közül választjuk ki, azzal a kikötéssel, hogy a fennmaradt ^anyagok - APC, protein S vagy APC-kofaktor 2 aktivitás - közül egy jelen van a mintában és ez az az alkotórész, amelynek az aktivitása a meghatározandó, s ami az V faktort illeti, az említett aktivitás antikoaguláns aktivitás, APC kofaktorként.
A jelenlévő további alkotórészek lehetnek például koagulációs enzimek és más olyan vér faktorok, amelyek elősegítik az Va és/vagy Villa faktor degradációjának mérését. Ezeket a faktorokat külön adagolhatjuk vagy már tartalmazhatja a minta. Abban az esetben, ha protein C-t tartalmaz a minta és az APC a vizsgálandó, protein C aktivátort kell hozzáadni. Abban az esetben, ha a minta a koagulációs faktorok (nem a a vizsgálandó faktorok) változó szintjeit tartalmazza, amelyek zavarják a vizsgálati
- 20 reakciókat, biztosítani kell ezek feleslegét (azaz lényegében a reakcióelegyekben a konstans szinteket) abból a célból, hogy a vizsgálati eredményekben elkerüljük a minták közötti különbségeket. Plazma mintáknál úgy érhetünk el konstans szinteket, hogy feleslegben olyan normál plazmát adunk hozzájuk, amely a vizsgálandó anyagra nézve hiányos. Ezeket az alkotórészeket adagolhatjuk feldúsított vagy magasan tisztított formában is. A VlII/VIIIa faktor és/vagy APC-kofaktor aktivitást nem tartalmazó V faktor formák hozzáadása megfelelő. APC-kofaktor aktivitást nem tartalmazó forma például az aktivitás hiányos V faktor, olyan fajból származó V faktor, amely normál módon nem fejez ki ilyen aktivitást (például a bovin V faktor és olyan V faktor fragmentumok, amelyek V faktor aktivitást kifejtenek, de APC-kofaktor 2 aktivitást nem).
A reakcióelegyhez azért adunk protein S-t, hogy elkerüljük a mért szint változásait, amelyet a protein S mintánként! különbözősége okoz, amikor APC-kofaktor 2 aktivitást vagy protein C-t mérünk. Ha protein S a mérendő anyag, APC-kofaktor 2 aktivitás adagolható ugyanezen okból. Ennek az a fő oka, hogy az egy meghatározandó faktoron kívül a többi faktor funkcionális aktivitási szintjét lényegében konstans szinten tartsuk a reakcióelegyben egy közti vizsgálat alapján. Amint a fentiekben már jeleztük, ezt úgy érjük el, hogy a reakcióelegyekhez feleslegben adjuk ezeket a faktorokat, például feleslegben adunk normál plazmát és/vagy funkcionális feleslegben adagoljuk ezen faktorok inhibitorait, például olyan antitesteket, amelyek az ilyen faktorok aktivitásáért felelős epitópokhoz kötődnek. Az APC-kofaktor 2 aktivitás vizsgálatához alkalmas reakcióelegy eredményesen tartalmazott olyan monoklonális antitestet, amely a protein S APC-kofaktor aktivitásért felelős epitópokra volt specifikus [HPS 54, Dahlbáck et al, J. Bioi. Chem., 265, 8127-8235 (1990)]. Ehhez hasonlóan, ha a protein S a vizsgálandó, az APC-kofaktor 2 aktivitás funkcionális inhibitorait - a fent említettekhez hasonló monoklonális antitesteket - tartalmazhatja potenciálisan a reakcióelegy.
• » • ·
- 21 A találmány szerint a funkcionális vizsgálatokat megfelelő módon, hozzáadott VlII/VIIIa faktor jelenlétében végezzük.
A hozzáadandó alkotórészek keverési sorrendjének elvei és a különböző mérési elvek jól ismertek ezen a szakterületen. Lásd a fent említett hivatkozásokat, amelyekből kitűnik, hogy az APC aktivitást olyan szubsztrátumokkal is kimutathatjuk, mint a fibrinogén (alvadási vizsgálatok) és az olyan alvadási enzimek kromogén szubsztrátumaival, amelyeknek az aktivitását az APC aktivitása befolyásolja. Megfelelő kromogén, flurogén és luminogén szubsztrátumok a trombin és X faktor a szubsztrátumok.
A minta rendszerint egy egyén/beteg plazmája, vagy lehet egy ellőállítási eljárásból származó APC-kofaktor 2 aktivitású V faktor, protein C (APC) vagy protein S, vagy a vizsgálatban használt standardok.
A natív V faktort (rövidítve: FV), amelyet rekombináns technológiával állítottunk elő (rFV), fel lehet használni a plazmából tisztított FV helyett, mint adduktumot a protein C/APC vagy protein S diagnosztizálására alkalmas módszerekben, vagy standardként vagy kontrollként a FV antikoaguláns aktivitási vizsgálatokban, vagy terápiás szerként olyan betegeknél alkalmazva, akiknél részben vagy teljesen APC-kofaktor 2 hiányosság áll fenn. Ugyanilyen célokra használhatók az FV rekombináns változatai vagy fragmentumai, amelyeknél a pro- vagy antikoaguláns aktivitás módosult és felhasználhatók adduktumokban is, FV antikoaguláns aktivitás mérésére szolgáló módszerekben. Ezeket a módosításokat a trombin vagy az FV-ben lévő APC hasítási helyek mutációi révén hozhatjuk létre. Az előző esetben a prokoaguláns aktivitás és az utóbbi esetben az FV antikoaguláns aktivitása részben vagy teljesen elvész. Ezenkívül az ilyen fajta anyagokat vagy ezek megfelelően immunogén peptid fragmentumait fel lehet használni diagnosztikai vagy terápiás célra használható monoklonális antitestek előállítására.
- 22 APC-kofaktor 2 aktivitási vizsgálatokban, amelyekben Va és/vagy Villa faktort használunk APC szubsztrátum gyanánt és a mintából származó faktorokat használjuk az APC szubsztrátum konverzió mérésére, az APC aktivitás iránti érzékenység jelentősen megnő olyan betegekből származó plazmában, akiket K vitamin antagonistákkal kezelnek. Ez az alvadási idő fokozott elhúzódását eredményezi bizonyos alvadási vizsgálatokban, különösen az APTT tesztekben. Az APC aktivitással szemben megnőtt érzékenység a K vitamin függő protermék - ilyen a IX, X és II faktor - csökkent szintjeivel magyarázható. Minthogy az APC-kofaktor 2 aktivitás nem K vitamin függő, ennélfogva az ilyen betegekből származó plazmákban ennek az aktivitásnak a mérése akkor válik lehetségessé, ha a reakcióelegyhez bizonyos exogén K-vitamin-függő protein(eke)t adunk legalább egyet a IX, IXa, X és II faktor közül - adott esetben protein S-sel kombinálva. Ezeket a proteineket, mielőtt az APC szubsztrátum konverzióját mérjük, nehéz fémsó formájában - ilyen a bárium-citrát eluátum [Dahlbáck, Biochem. J., 209, 837-846 (1983)] vagy alumínium-hidroxid eluátum [Bertina et al., Thrombos. Hemostas., 51. 1-5 (1984)] - vagy mint tisztított alkotórészét adagolhatjuk. Ha a plazma heparint (standard vagy alacsony molekulatömegű heparint) .tartalmaz, előnyös ennek hatását heparin felesleg hozzáadásával, vagy Polybrene vagy Protamine, vagy hasonló heparin inhibitorok hozzáadásával semlegesíteni, hogy csökkentsük a vizsgálati eredményekre gyakorolt zavaró hatását.
Mint fentebb megállapítottuk, a PC/APC vagy protein S funkcionális aktivitásainak vagy az V faktor antikoaguláns aktivitásainak a meghatározásására szolgáló jelen találmány szerinti módszerek hasonlóak a korábban leírt és a hivatkozott referenciákban leírt módszerekhez. Tehát nem szükséges ezeket a módszereket részletesen leírni. Azonban lényegében az ilyen módszerek egy szubsztrátum konverziójának a mérésén alapulnak. A konverzió sebessége közvetlenül vagy közvetve meghatározható és a vizsgálandó ·*
- 23 anyaghoz kapcsolható. A mérés koagulációs vagy kromogén vizsgálatokon alapul, alkalmas módon további, a konverzió sebességének kimutatásához szükséges alkotórészek jelenlétében, amelyeket vagy már eleve tartalmaz a minta, vagy hozzáadjuk a mintához.
Ezeket az alkotórészeket egy olyan reagens tartalmazhatja, amely egy aktivált koagulációs faktor bevezetésére szolgál, és ezt a faktort a szubsztrátum konverziója sebességének meghatározására használhatjuk. A reagensben legalább a IXa faktor van jelen és bizonyos koagulációs faktorból vagy egy olyan reagensből állhat, amely a rendszert vagy intrinsic vagy extrinsic úton aktiválja. Ennek megfelelően ez a reagens a következőkből állhat: IXa faktor vagy Xla faktor (intrinsic út), Xlla faktor (intrinsic út), kallikrein (intrinsic út), egy kontakt aktivátor (intrinsic út), mint a kaolin, celit vagy ellagsav (intrinsic út), egy APTT reagens [Activated Partial Thromboplastine Time (aktivált parciális tromboplasztin idő), azaz egy foszfolipidet és egy kontakt aktivátort tartalmazó reagens (intrinsic út)], szöveti tromboplasztin [PT-reagens; PT = Prothrombin Time (protrombin idő) (extrinsic út)], szöveti faktor, Vlla faktor és Xa faktor.
A többi hozzáadható alkotórész az alkalmazott módszertől függ. Szükségessé válhat plazma protein inhibitorok - nem a monitorozott enzimé - vagy egy fibrin 2+ .
polimerizáció inhibitor bevitele. A Ca ion plazmában 2+ oldódó só formában adható, amely a Ca ionokat szabad és 2+ .
nem komplex formában adja át, azaz erős Ca iont szolgáltat szabad, nem komplex formában. Ilyen további alkalmas alkotórész lehet a VlII/VIIIa faktor és V/Va faktor is.
A szubsztrátum, amelyre nézve a konverzió sebességét meghatározzuk, annak az enzimnek a szintetikus szubsztrátuma lehet, amelynek az aktivitását az aktivált protein C, például trombin ( = Ha faktor) és Xa faktor befolyásolja. Az előnyös szintetikus szubsztrátumok vízben oldódnak, előnyösen oligopeptid szerkezetűek, három, négy vagy öt aminosav maradékkal és egy olyan aminoterminális véggel,
- 24 amely védve van az aminopeptidázok támadásával szemben. A védelmet az aminoterminális végen vagy egy védőcsoport, vagy egy D-aminosav biztosítja. Abból a célból, hogy észlelhető választ kapjunk, a szintetikus szubsztrátum karboxi terminális végéhez olyan amidcsoportot kötünk, amely az aktuális vér koagulációs protein hatására leválik és meghatározható. A felszabaduló csoport lehet kromogén, fluorogén vagy kemiluminogén csoport, vagy más, analitikailag kimutatható csoport. Lásd: H.C. Hemker, Handbook of synthetic substrates fór the coagulation and fibrinolytic system [kiadó: Martinus Nijhoff (1983)] és J. Fareed és munkatársai, Synthetic peptide substrates in hemostatic testing [CRC Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences, 19, 71-134 (1983)]. Nem plazma minták esetén fibrinogén használható szubsztrátum gyanánt.
Annak érdekében, hogy a meghatározandó anyagra vonatkozóan specifikus eredményt kapjunk, bizonyos esetekben meg kell kísérelni, hogy a végső reakcióelegyben a plazma minta tartalmat a lehető legmagasabb szinten tartsuk. Ennek megfelelően a jó specificitású tesztekben a plazma-minta tartalom > 10% lehet, pontosabban > 20 % vagy > 35 % (térf/térf). Más esetekben azonban lényegesen alacsonyabb plazmatartalmat - 10 % (térf/térf) alatt - használhatunk.
B. APC-kofaktor 2 aktivitás immunológiai vizsgálatai
A találmány szerinti antitest készítmény lehetővé teszi az APC-kofaktor 2 aktivitás immunológiai vizsgálatait (immun-assay). Ilyen vizsgálatokban az anti-APC-kofaktor 2 antitest bizonyos mennyiségű immunkomplexet képez a mintában lévő APC-kofaktor 2 aktivitású V faktorral, amely a minta APC-kofaktor 2 aktivitás szintjeinek kvalitatív vagy kvantitatív mértékéül szolgál. A minták azonosak lehetnek a funkcionális vizsgálatokhoz használt mintákkal.
A találmány tárgyát képezik az A és B szerinti vizsgálathoz használt reagensek is.
A fent említett vizsgálatokban következőket ·
• · · · ·· ··· « * · · ··*»·· * · • ♦ · « · · «
- 25 használhatjuk reagensként, standardként vagy kontrollként: APC-kofaktor 2 aktivitást kifejtő V faktort tartalmazó tisztított készítmények, amelyeket plazmából tisztítottunk vagy rekombináns technológiával állítottunk elő; protein C készítmények, adott esetben aktivált formában vagy protein C aktivátorral kombinálva; és protein S készítmények, amelyek az illető faktor meghatározott mennyiségeit tartalmazzák. A protein C készítményt legalább egy K vitamin függő koagulációs faktorral kombinálhatjuk - a IX, X és II faktor közül választhatjuk - adott esetben protein S-sel kombinációban. A terápiás felhasználásra szánt termékeket és készítményeket rekombináns technológiával is előállíthatjuk. Rekombináns technológiával állíthatjuk elő továbbá a találmány szerinti monoklonális antitesteket és lényegében a jól ismert PCR technológiát használhatjuk a kívánt specificitású antitestek előállításához.
Vannak arra utaló jelek, hogy adatokat kaphatunk különböző V faktor mutációkról, az V faktor antikoaguláns aktivitása és a protein S közötti kölcsönhatások alapján. Módszerek dolgozhatók ki ilyen adatok megszerzése céljára, egy alkalmas antitest jelenlétében vagy enélkül. Egy analizálandó aktivitás vagy anyag - ilyen az V faktor antikoaguláns aktivitása és a protein S - kvantitatív meghatározására az ilyen módszereket antitest jelenlétében végezhetjük.
C. Hibridizációs vizsgálatok
Közvetlenül e szabadalmi leírás benyújtása előtt, egy öröklött APC rezisztenciát hordozó nagy családnál a hagyományos DNS-kapcsolatok tanulmányozása során kapott legújabb eredmények azt mutatták, hogy szoros összefüggés van az V faktor génben lévő természetes polimorfizmus és az APC-rezisztencia között. Ezek arra utalnak, hogy az V faktor gén mutációja okozza az APC-rezisztenciát. Végleges bizonyítéka van annak, hogy nukleinsav hibridizációs vizsgálatokat, valamint nukleinsav szekvenálást • · «
használhatunk - hagyományos módon - arra, hogy az APCkofaktor 2 aktivitás alacsony szintje miatt trombózis veszélynek kitett egyéneket felismerjük. Tehát az ilyen típusú vizsgálatokkal egy egyénben egy vagy több olyan nukleinsav fragmentum és/vagy szekvencia rendellenes jelenlétét vagy hiányát ellenőrizhetjük, amely(ek) akár APC-kofaktor 2 aktivitást hordozó, akár ilyen aktivitás hiányos V faktor molekula expressziójáért felelős(ek). A műveletek és a feltételek azonosak a más géneknél rendszerint alkalmazottakkal, kivéve, hogy ezekben V faktor génre specifikus fragmenseket és adott esetben APCrezisztenciával járó mutáció(k)ra vagy normál V faktor génre specifikus reagenseket használunk. Az egyénből származó bármilyen sejt-minta alkalmas lehet.
A találmány V faktorral, előnyösen humán V faktorral foglalkozik, amely aktiválódni képes, miáltal Va faktor prokoaguláns aktivitást fejt ki, de nem képes antikoaguláns aktivitás kifejtésére, azaz inkább nincs olyan antikoaguláns aktivitása, mint APC kofaktornak, a találmány lényegében az említett faktor tiszta formájára vonatkozik.
A találmány egy másik eleme olyan V faktorra, előnyösen humán V faktorra vonatkozik, amely mint az APC kofaktora antikoaguláns aktivitás kifejtésére képes, de nem képes Va faktor prokoaguláns aktivitást kifejteni.
Ezeket a faktorokat hasonló módszerekkel tisztíthatjuk a plazmából, mint a normál V faktort, vagy rekombináns technológiával állítjuk elő. Felhasználhatók standardokban, kiegészítő reagensekként és terápiás célra.
A találmány további részleteit a következő kísérleti rész tartalmazza, az ábrákra való hivatkozással együtt.
Az 1. ábra az APC-kofaktor 2 aktivitású V faktor kromatografálását mutatja be Q-Sephrose-on (A) és Sephacryl S-300-οη (B).
A 2. ábra az izolált APC-kofaktor 2 aktivitás/V faktor SDS-PAGE, Western blotting és agaróz gél elektroforézis vizsgálati eredményét ábrázolja.
A 3. ábra az APC-kofaktor 2 és V faktor együttes • · · * · • ·· · · tisztítását mutatja be monoklonális antitesttel végzett affinitás kromatográfiával.
A 4A és 4B ábra az APC-rezisztencia tisztított APCkofaktor 2 aktivitás/V faktor használatával végzett korrekcióját ábrázolja.
Anyagok és eljárásek
APC-kofaktor 2 aktivitási vizsgálat
A legutóbb leírt APC-APTT módszerre [PCT/SE9200781, és Dahlbáck et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90. 1004-1008, (1993)] módosítást dolgoztunk ki, az APC-kofaktor 2 aktivitás tisztítás alatti mérése céljára. A eljárás szerint egy olyan egyén plazmáját használtuk, akinek öröklött gyenge válaszadási készsége volt APC-re és normál plazmából kapott frakciókat használtunk, amelyeket arra teszteltünk, hogy képesek-e normalizálni a gyenge APC választ. A vizsgálatot, amelyet APC-kofaktor 2 aktivitási vizsgálatnak neveztünk, a következőképpen végezzük: gyenge APC választ mutató plazma (APC-rezisztens plazma elnevezést kapott) 50 μΐ-t 50 μΐ teszt frakcióval és 50 μΐ aktivált tromboplasztin idő (APTT) reagenssel inkubálunk [APTT-automated Organon Technica (USA)] 5 percig 37°C-on mielőtt megindítjuk az alvadást 5 μΐ APC-CaCl2 keverék hozzáadásával (ha másként nem jelezzük,
| összetétele 20 | nM humán APC 10 mM trisz.HCl-ben, 0,05 M |
| nátriumklorid, | 30 mM kalcium-klorid, pH 7,5, 1 % bovin |
| szérum albumin | (BSA)], majd mérjük az alvadási időt. Egy |
mintában az APC-kofaktor 2 aktivitás összefügg az alvadási idő megnövekedésével.
Minden mintát tehát párhuzamosan analizálunk úgy, hogy nem adunk APC-t a kalcium-klorid oldathoz és kiszárítjuk az APC-függő alvadási idő meghosszabbodást. Az APC-kofaktor 2 aktivitás dózis-válasz görbéjének a felvételéhez az APCkofaktor 2 aktivitás hiányos plazmát összekeverjük a kontroll plazmával és ezt az elegyet használjuk tesztplazmaként az APC-APTT módszerben. Az APC antikoaguláns válaszát a kontroll plazma százalékára vonatkoztatjuk, s így »··· · · · ·· ·· • * · · · • ··· ·· ··« ··· egy exponenciális görbét kapunk. Minthogy nem tudjuk, hogy az APC-kofaktor 2 hiányos plazmából vajon teljesen hiányzott-e az APC-kofaktor 2 aktivitású V faktor, a vizsgálat a különböző frakciókban lévő kofaktorról csak fél-kvantitatív eredményt ad. Azonban a vizsgálat csak eszközül szolgál arra, hogy nyomon kövessük az APC-kofaktor 2 aktivitást tisztítása folyamán.
Az V faktor alvadási vizsgálatot V faktor hiányos plazmával végeztük, mint előzőleg leírtuk [J.Clin. Invest., 66, 583-591 (1980)]. Az V faktor jelenléte a hiányos plazma alvadási idejének megrövidülését eredményezte. Mind az APCkofaktor 2 aktivitási vizsgálat, mind az V faktor alvadási vizsgálat az eredeti alvadási adatokat mutatja és nem az egységekre konvertált eredményeket.
Elektroforetikus, immunológiai és más eljárásek
Előzőleg leírt technikákkal [J. Bioi. Chem. 261, 94959501 (1986)] grádiens (5-15 %) poliakrilamid lemez gél elektroforézist - nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében (SDS-PAGE) - és Western blotting analízist végeztünk. Egy V faktorra specifikus nyúl poliklonális antiszérumot kaptunk a Dakopatts A/S cégtől. Az antiszérum speificitását közleményben ismertették (Blood, 68. 244-249 (1986)]. A nyúl poliklonális, antitesteket a bovin V faktorból izolált nehéz és könnyű lánc fragmentumokkal szemben termelték (J. Bioi. Chem., 261.9495-9501 (1986)]. Monoklonális antitesteket standard módszerekkel állítottunk elő a fentiekben leírt módon (J.Biol. Chem., 265 . 8127-8135 (1990)]. Az S-300 poolban lévő tisztított proteint használtuk antigénként Balb/c egerek immunizálására. Tizenkét különböző antitestet kaptunk és reaktivitásukat Western blotting eljárásrel vizsgáltuk. A Master 30 elnevezésű antitest körülbelül 20 mg-ját 4 mg Affigel 10-hez (BioRad) kötöttük az előállító cég előirata szerint. A humán V faktor és a bovin V faktor fragmentumai elleni poliklonális antitestek IgG frakcióit szintén Affigel-hez (körülbelül 5 mg/ml) kötöttük.
1. példa
APC-kofaktor 2 aktivitás tisztítása
A mintákkal történő minden manipulációt jégfürdőben végeztünk; a kromatografálásokat és a centrifügálásokat hűtőszobában, előnyösen 4°C-on végeztük. Vérbegyűjtés: frissen lefagyasztott (-70°C) citrátos humán plazmát a helyi véradó-állomástól kaptunk. A lefagyasztott plazmát (2,3 1) 37’C-on olvasztottuk fel és a következő proteáz inhibitorokat adtuk hozzá: fenil-metil-szulfonil-fluorid (PMSF) (1 mM) , diizopropil-fluorofoszfát (DFP) (1 mM), szójabab tripszin-inhibítor (50 mg/1), Trasyol (aprotizin) (1,5 mg/1, mely azonos 10 egység/ml-rel) és benzamidin (10 mM). A plazmát (jégfürdőben tartva) bárium-citrátra adszorbeáltuk, ahogyan előzőleg leírtuk [Dahlbáck Biochem. J. , 209 . 837-846 (1983)] és a bárium-adszorbeált plazmát szilárd PEG (PEG 6000) hozzáadásával (8 % tömeg/térf), polietilén-glikollal való frakcionálással csaptuk ki. Az APC-kofaktor aktivitást 8 % PEG felülúszóban kaptuk meg. A 8 % PEG felülúszót azonos mennyiségű 10 mM benzamidinnel hígítottuk, majd Q-Sepharose-zal (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Svédország) kevertük, amelyet 10 mM benzamidint tartalmazó 20 mM trisz.HCl, 0,1 M nátriumklorid és 1 mM kalcium-klorid (pH 7,5) oldattal hoztunk egyensúlyba. Egy órán át tartó óvatos keverés után a gélt Büchner tölcséren gyűjtöttük össze és a következő oldatokkal mostuk: A) 3 liter kiegyensúlyozó puffer, B) 1 liter 0,1 % Tween 20 tartalmú kiegyensúlyozó puffer és C) 2 liter - 0,1 M nátrium-klorid helyett - 0,15 M nátrium-kloridőt tartalmazó kiegyensúlyozó puffer. A gélt azután oszlopba (átmérő: 5 cm) töltöttük és az adszorbeált proteint nátrium-klorid lineáris grádiensével (0,15-0,5 M nátriumkloridot tartalmazó, 20 mM trisz.HCl, 1 mM kalcium-klorid, 10 mM benzamidin, pH 7,5 összetételű oldatban; a grádiens tartályok 1,5 1 oldatot tartalmaztak) eluáltuk. Az átfolyási sebesség 330 ml/óra volt és 11 ml-es frakciókat szedtünk. A frakciókat 1/10 hígításban APC-kofaktor 2 aktivitásra és V faktor aktivitásra analizáltuk (1. ábra).
• ·· · «4
- 30 A frakciókat úgy egyesítettük, ahogy a vízszintes beosztás jelzi, majd ammónium-szulfáttal csaptuk ki (70 %-os telítés). A csapadékot centrifugálással gyűjtöttük össze, amelyet kis mennyiségű, 20 mM trisz.HCl, 0,15 M nátriumklorid, 1 mM kalcium-klorid, pH 7,5, 10 mM benzamidin, 1 mM DFP és 1 mM PMSF tartalmú oldatban oldottunk fel. Ezt az oldatot az ugyanezen pufferrel - de DFP és PMSF nélkül egyensúlyba hozott Sepharyl S-300-zal töltött oszlopra (2,5 cm x 93 cm; Phrmacia) vittük fel. Az átfolyási sebességet 10 ml/órára állítottuk be, és 1,2 ml-es frakciókat szedtünk. A frakciókat 1/10-es hígításban APC-kofaktor 2 aktivitási vizsgálattal és V faktor vizsgálattal analizáltuk (1. ábra). A frakciókat a vízszintes beosztás szerint egyesítettük és -70°C-on tároltuk.
2. példa
Affinitás kromatográfia monoklonális antitestek használatával
Az 1. példa szerint S-300 kromatografálásnál (a bemutatott menetben 6 mg-ot kaptunk 20 mM trisz.HCl, 0,1 M nátrium-klorid, 2 mM kalcium-klorid, pH 7,5 tartalmú oldatban) kapott proteint olyan oszlopra (0,75 cm x 7,5 cm) vittük, amelybe a Master 30 nevű Affigel-en immobolizált, 3. példa szerinti monoklonális antitestet töltöttük. Az oszlopot és a proteint előzőleg 20 mM trisz.HCl, 0,1 M nátrium-klorid, 2 mM kalcium-klorid, pH 7,5, tartalmú oldattal hoztuk egyensúlyba. Az oszlopot addig mostuk, amíg az eluátum abszorpciója nulla nem lett, majd a megkötött proteineket 50 mM dietanol-amint és 2 mM kalcium-kloridot (pH 10,6) tartalmazó oldattal eluáltuk. Az eluátum pH-ját azonnal semlegesítettük 3 M trisz.HCl (pH 7,5) oldattal (50 μΐ per 1 ml frakció). A frakciókat (1/5 hígításban) APCkofaktor 2 aktivitási vizsgálattal és V faktor alvadási vizsgálattal analizáltuk. Az aktív frakciókat egyesítettük, ultraszűréssel (YM10 membránok) betöményítettük és -70°C-on tároltuk. A tisztított APC-kofaktor 2/V faktor-t trombinnal aktiváltuk, ahogy előzőleg leírtuk [J. Clin. Invest., 66, ·»·· ·· · · · · · • · · * « • «·· · « ··« ··· • · · ··*··* ·· · • · · » 4 · « ·'
- 31 583-591. (1980.)].
3. példa
Monoklonális antitestek előállítása
Az 1. példa szerinti tisztított proteint, azaz az V faktort (APC-kofaktor 2) immunogénként használtuk Balb/C egerek immunizálására, standard eljárás szerint. Az említett egerekből származó lépsejteket Sp 2/0 Agl4 egér mielóma sejtvonallal fuzionáltuk és hipoxantin-aminoprotein-timidin tartalmú DMEM táptalajban szelektáltuk Köhler és Milstein leírása (lásd előbb) szerint.
Szilárd fázisú enzim-immunassay-t (ELISA) használtunk az V faktor ellen termelt antitestek egér antiszérumból való kimutatására, valamint az antitest termelő hibrid sejtek kimutatására. Ezekben a vizsgálatokban az V faktor (10 pg/ml standard fedő puffer) a mikrotitráló lemezeken lévő tartályokhoz kötöttük. Az immunizált egerekből származó antiszérumot és a hibrid sejt-tenyészetből származó felülúszókat hígítva adtuk a tartályokhoz és az egyes tartályokat az V faktorhoz kötött antitestek jelenlétére vizsgáltuk egy enzimmel jelzett második antitesttel, ismert eljárás szerint.
A pozitív tartályokból származó hibrid sejteket, azaz az antitest termelő sejteket határhigításos eljárásrel klónoztuk, szubklónoztuk és szaporítottuk. Miután a Pristeene-vel előkezelt egerek hasüregébe juttattuk e sejteket, a monoklonális antitestek nagy mennyiségben termelődtek az ascites folyadékban.
Tizenhét olyan terméket kaptunk, amelyek az V faktor antigén determinánsaival reagáltak Western biot eljárásrel való kimutatás szerint. E monoklonális antitestek (mAt) nagy része az V faktor ugyanazon szakasza ellen irányult, azaz az V faktor középső, 150 KD szakaszában lévő aktivációs fragmentum ellen.
Az egyik ilyen mAt-et (jele: Master 30) használtuk az V faktor 2. példa szerinti affinitás tisztításához.
• «44 ··
Λ « • * · *4
V ·«· · ν · · 4V·· • · a · ···· · · ··
4 ·» · *4·
4. példa
Ebben a példában a 3. példa szerint előállított mAteket teszteltük, hogy meghatározzuk befolyásukat a koagulációs aktivitásra és a plazmában az APC-kofaktor 2 aktivitásra.
Tisztított mAt növekvő mennyiségeit - 400 μg/ml-ig adtuk normál plazmához és inkubálás (15-30 perc) után az V faktor aktivitást egy hagyományos, koagulációs analízisen alapuló V faktor vizsgáló eljárásrel mértük, majd az exogén APC-re adott választ a következőképpen határoztuk meg.
Különböző koncentrációjú mAt-et (10-400 Mg/ml) tartalmazó normál plazma mintákat inkubáltunk kereskedelmi APTT reagenssel. (Ebben a vizsgálatban Organon féle Automated APTT reagenst használtunk. Hasonló eredményeket ad a COATEST APC Resistance eredetű APTT reagens; Chromogenix AB, Mölndal, Svédország). Öt percig tartó 37’c-on való inkubálás után vagy 30 mM kalcium-kloridot [0,1 % bovinszérum albumint (BSA) tartalmazó, 20 mM trisz.HCl, 50 mM nátrium-klorid (pH =7,5) tartalmú oldatban] vagy körülbelül 2 pg/ml aktivált protein C-t (APC-t) [0,1 % BSA-t, 20 mM trisz.HCl-t, 50 mM nátrium-kloridot (pH 7,5) tartalmazó oldatban feloldott 30 mM kalcium-klorid oldatban] adunk hozzá és feljegyezzük az alvadási időt. Az APTT vizsgálatot lényegében Dahlbáck és munkatársai szerint [PNAS, 90, 10041008 (1993)] végeztük.
Ezen mAt-ek jelenléte egyáltalán nem befolyásolta a hagyományos APT időt, azaz azoknak a mintáknak az alvadási idejét, amelyekhez kalcium-kloridot adtunk, vagy csak enyhén befolyásolta, és 40-45 másodperces alvadási időt figyeltünk meg. Két mAt-t - jelük: Master 1 és Master 4 - azonban megrövidítette azoknál a mintáknál az alvadási időt, amelyekhez APC-t adtunk - kalcium-klorid tartalmú oldatban (APC idő).
A következő alvadási időket kaptuk:
APC idő mAt nélkül 110-120 másodperc
APC idő Master 4 jelenlétében 80-90 másodperc Ezek az eredmények arra mutatnak, hogy Master 4 ···· λ» «
- 33 jelenlétében a plazmában az APC-kofaktor 2 aktivitás részben gátolt. Úgy találtuk, hogy a Master 4 ezen részleges gátló hatása a hozzáadott mennyiségétől függ, maximális gátlást akkor kaptunk, amikor 50-100 μg Master 4-et adtunk plazma ml-enként. A Master 4-et - mint fent említettük - letétbe helyeztük.
A fenti vizsgálatok eredményeit alább részletesebben tárgyaljuk, hivatkozva az 1-4. (A, B) ábrákra.
Az 1. ábra az V faktor és az APC-kofaktor 2 aktivitás Q-Sephrose-on (A) és Sephacryl S-300-οη (B) végzett kromatografálását mutatja be. Az APC-kofaktor 2 aktivitás elúciós profilja (felső rész) az V faktoréval (középső rész) esik egybe. Kimutattuk, hogy az V faktor aktivitás az V faktor hiányos plazma alvadási idejét lerövidíti, míg az APC-kofaktor aktivitás az APC-rezisztens plazma alvadási idejének APC-függő meghosszabbodásával jár együtt. A frakciókat egyesítettük, ahogy a vízszintesen lévő vonalak mutatják.
A 2. ábrán az izolált APC-kofaktor 2/V faktor SDS-PAGE, Western blotting és agaróz gél elektroforézis alkalmazásával kapott vizsgálati eredménye látható. Az 1. példa szerint, az S-300 oszlopról kapott poolt SDS-PAGE eljárásrel analizáltuk, trombinnal való inkubálás előtt és után.
A géleket vagy Coomassie blue-vel (A) festettük meg vagy Western blotting eljárást alkalmaztunk a 3. példa szerint előállított monoklonális antitest (Master 30) (B) vagy poliklonális antitestek (C) használatával. Az SDS-PAGE módszerhez használt mintákat redukáltuk: körülbelül 20 μg proteint vittünk fel a protein festéssel előhívott gél minden nyomsávjára, míg körülbelül 1 μg-ot vittünk fel a Western blotting nyomsávokra. A trombinnal hasított proteint tartalmazó nyomsávokat T-vel jelöltük. A molekulatömeg markerek helyzetét a bal oldalon adtuk meg. Az V faktorral kapcsolatos polipeptideket nyíllal jelöltük meg, míg a trombin hatásra keletkezett fragmentumokat (J. Bioi. Chem., 257. 6556-6564) nyílhegyek jelzik. A 150 KD tömegű fragmentum gyengén festődött Coomassie-val, de jól tudtuk ·«·· ·* V • · · « · « ··« · 4 ··· ··» « · · · «··· · « · · ♦ · » ·♦ w
- 34 észlelni Western blotting révén. A köztes sávokat csillaggal jelöltük. Az S-300 poolt agaróz gél elektroforézissel is vizsgáltuk (alsó kép). Egy kontroll plazma albumin (alb), α , α2’ β1 és β2 sáv3a;*-t függőleges vonalakkal jeleztük.
A 3. ábra az APC-kofaktor 2 aktivitás és az V faktor monoklonális antitest affinitás kromatográfiával végzett együttes tisztítását ábrázolja. Az S-300 poolt tisztítottuk monoklonális antitest (Master 30) affinitás kromatográfiával. Amikor az oszlop kötő kapacitását túlléptük, a legtöbb protein áthaladt az oszlopon. Az oszlop mosása után a megkötött proteint magas pH-η eluáltuk (az elúció kezdetét nyíllal jeleztük). A frakciókat APC-kofaktor 2 aktivitási vizsgálattal és V faktor vizsgálattal ellenőriztük. Az V faktor aktivitás az V faktor hiányos plazma alvadási idejének rövidülésével járt, míg az APC-kofaktor 2 aktivitás az APC-rezisztens plazma alvadási idejének APC-függő meghosszabbodását idézte elő. A két szaggatott vonal a puffer kontrollok alvadási idejét mutatja.
A 4A és 4B ábra az APC-rezisztenciának tisztított APCkofaktor 2/V faktor-ral végzett korrekcióját mutatja be. Affinitással tisztított APC-kofaktor 2/V faktort (50 μΐ-ét) a jelzett koncentrációk mellett, APC-rezisztens plazmához (50 ml) kevertünk. A keverékeket ezután APC-kofaktor 2 aktivitási vizsgálattal (A) teszteltük APC-vel (·) és APC nélkül (o) kalcium-klorid oldatban és V faktor vizsgálattal (B). Minden pont párhuzamos mérések középértékének felel meg.
Eredmények
Az APC-kofaktor 2 aktivitást biológiai vizsgálattal analizáltuk, amikoris egy APC-rezisztenciával rendelkező egyéntől származó plazmát (jele: AS-plazma) használtunk teszt plazma gyanánt és eljárást dolgoztunk ki APC-kofaktor 2 normál plazmából való tisztítására. Az eljárás első lépése egy bárium-citrátos abszorpció, amely eltávolítja a Kvitamin-függő proteineket, beleértve a C és S proteint. A • · · V♦
V ··· · « ····»· • « · * «»·« · V · ·· ·ν · ··· bárium-citrát eluátumnak nem volt APC-kofaktor 2 aktivitása. A felülúszó plazma frakcionálásának - PEG 6000 kicsapatással - eredménye szerint a 8 % PEG felülúszóban volt jelen az APC-kofaktor 2 aktivitás, míg a feloldott 0-8 % PEG 6000 csapadéknak nem volt APC-kofaktor 2 aktivitása. A 8 % PEG felülúszóban lévő APC-kofaktor 2 aktivitást először anioncserés kromatográfiával tisztítottuk. Q-Sepharose oszlopon, majd gélszűréssel Sephacryl S-300-οη (1. ábra). Ez a tisztítási technika nagyon hasonló volt az V koagulációs faktor tisztítási eljárásához [J. Clin. Invest., 66. , 583591. (1980.)] és az APC-kofaktor 2 aktivitás frakcióiban V faktort is találtunk. A tisztítást legalább tízszer végeztük különböző módosításokkal és az V faktor és APC-kofaktor 2 aktivitás elúciús profilja következetesen nagyon hasonló volt. Az S-300 poolban lévő protein mind V faktor, mind APC-kofaktor 2 aktivitást fejtett ki és olyan jellemzőket mutatott, mint amilyeneket előzőleg az V faktorról közöltek [J.Clin. Invest., 66., 583-591. (1980.)]. A további próbálkozások arra vonatkozóan, hogy elválasszuk a két aktivitást számos kromatográfiás elv alapján - mint a Heparin Sephrose, Blue Sephrose és Wheat germ agglutinin Sepharose - eredménytelennek bizonyultak (nem ismertettük) és azt találtuk, hogy azok a kromatográfiás hordozók, amelyeket kipróbáltunk - az APC-kofaktor 2 aktivitást az V faktorral együtt tisztították.
Az S-300 poolban lévő protein SDS-poliakrilamid gél elektroforézise egy 330 KD sávot eredményezett (az egyláncú
V faktornak felel meg), továbbá körülbelül 220.000 és 130150.000 molekulatömegű sávokat (2. ábra). Ezek a sávok a hasított V faktornak feleltek meg és mint a 330 KD forma, az
V faktor elleni poliklonális antiszérummal reagáltak Western blotting vizsgálatban (2. ábra). A 220 KD tömegű sáv az V faktor C-terminális részének felel meg, amely az Va faktor 74 KD könnyű láncát és a két aktivációs fragmentum közül a nagyobb részt (150 KD) tartalmazza és amelyet a bovin Va faktor könnyű lánca elleni egy antiszérum ismert fel (az eredményeket nem mutattuk be). A 130-150 KD sávok tartalmazták az V faktor N-terminális részét (105 KD tömegű nehéz lánc és a két aktivációs fragmentum közül a kisebb rész) és ennek megfelelően egy, a bovin Va faktor nehéz lánca elleni antiszérummal reagált (az eredményeket nem mutattuk be). Néha láthatók voltak még alacsony molekulatömegű sávok, amelyek Western blotting vizsgálatban nem reagáltak poliklonális V faktor antiszérummal, de amikor megjelentek, elúciós profiljuk S-300 kromatografálás esetén (SDS-PAGE eljárásrel ellenőrizve) nem függött össze sem az V faktor aktivitással, sem az APC-kofaktor 2 aktivitással. A tisztított protein trombinnal való inkubálása olyan fragmentumokat eredményezett, amelyek jellemzőek a trombinnal hasított V faktorra és ezzel együtt járt, hogy az APCkofaktor 2 vizsgálatban eltűnt az aktivitás, ami arra mutatott, hogy APC-kofaktor 2 aktivitást csak az V faktor fejez ki és az Va faktor nem. Agaróz gél elektroforézisnél a tisztított protein, mint egyetlen forma, inter-alfa helyzetbe vándorol (2. ábra) és mind az V faktor, mind az APC-kofaktor 2 aktivitást a gélből erről a helyről lehetett kioldani (nem mutattuk be).
Minthogy az V faktor különösen érzékeny proteolízisre, a végső művelet feleslegben alkalmaz proteáz inhibitorokat. Ha proteáz inhibitorok nélkül végezzük a tisztítási eljárást, úgy egy elbomlott terméket kapunk, amelyben.nincs 330 KD forma, hanem 220 KD és 130-150 KD tömegű sávokat tartalmaz. Az V faktor stabilitásához kalcium szükséges; ha kalciumot nem tartalmaz a tisztítási eljárás, mind az V faktor, mind az APC-kofakator 2 aktivitás fokozatosan megszűnik.
Az S-300 poolban lévő proteint használtuk antigénként a
3. példában a monoklonális antitestek termelésére. Tizenkét antitestet kaptunk, és úgy találtuk, hogy mindegyik reagál a 330 KD tömegű egyláncú V faktorral és a 220 KD tömegű formával is, Western blotting eljárásban (2. ábra). Az V faktor trombinnal való hasítása után mindegyik antitest reagált a 150 KD tömegű aktivációs fragmentummal (a két aktivációs fragmentum közül a nagyobbikkai).
• ·
- 37 Az egyik antitestet (Master 30) Affigel-en immobilizáltuk és ezt használtuk affinitás kromatográfiához (3. ábra). Az S-300 poolt felvittük az oszlopra. Az oszlopon megkötött proteint eluáltuk és megállapítottuk, hogy mind V faktor, mind APC-kofaktor 2 aktivitást fejt ki. A két aktivitás elúciós profilja egybe vágott, de kifejezett elhúzódást mutatott. Más kioldási feltételeket, például magasabb vagy alacsonyabb pH-t és denaturáló szereket is kipróbáltunk, de eredménytelenül, minthogy mindkét aktivitás elvesztésével jártak. Az S-300 poolt humán V faktor elleni és bovin Va fragmentumok elleni immobolizált poliklonális antitestekkel töltött oszlopokra is felvittük. Az oszlopok mind az V faktor, mind az APC-kofaktor 2 aktivitást visszatartották, de a megkötött protein kioldásához szükséges denaturáló körülméények mindkét biológiai aktivitás elvesztését eredményezték (az eredményeket nem mutattuk be).
Az affinitással tisztított APC-kofaktor 2/V faktort növekvő koncentrációkban adtuk AS plazmához és vizsgáltuk az APC-re adott antikoaguláns választ. Az APC-re adott antikoaguláns válasz dózis-függő növekedését figyeltük meg (4A ábra). Körülbelül 25 mg/liter - ugyanaz a nagyságrend, mint a normál plazma V faktor koncentrációja - volt szükséges ahhoz, hogy az AS plazma olyan APC választ adjon, mind a normál plazma (azaz 90-110 másodperces alvadási időket APC jelenlétében). Az affinitással tisztított protein, V faktor vizsgálatban is aktív volt, ahogyan ezt az alvadási idő rövidülése mutatta (4B ábra).
Az APC-kofaktor rendszer alkotórészeinek vizsgálata
A következő példákban bemutatjuk, hogy az APC-ből, APC-kofaktor 2 aktivitású V faktorból és protein S-ből álló APC-kofaktor rendszer két alkotórészének állandó szinten tartásával és a fennmaradó egy alkotórész változtatásával, különböző szubsztrátum konverzió sebességeket érünk el. Ez azt jelenti, hogy a fent vázolt vizsgálatokat mindegyik alkotórészre ki lehet dolgozni. Az Anyagok és Módszer című fejezet foglalkozik egy olyan vizsgálattal, amely APC-
kofaktor 2 aktivitás hiányos plazmát alkalmaz.
5. példa
APC-kofaktor 2 hatása kromogén vizsgálatban
A vizsgálat elve azon alapul, hogy az FVIIIa-nak az APC hatására - az FX FXa-függő aktivitásán keresztül - beindult degradációját monitorozzuk, amely rendszerben az FVIIIa az FIXa fontos kofaktorául szolgál. Tehát az FVIIIa csökkent szintje az FXa csökkenő keletkezését fogja eredményezni, amely egy FXa-érzékeny kromogén peptid-szubsztrátum hidrolízise révén határozható meg.
I. 50 μΐ 50 mM trisz.HCl pufferrel (pH 7,3; I = 0,15) 1:20 higítású normál plazmát és 1 % bovin szérum albumin (BSA) tartalmú magasan tisztított FVIII koncentrátumból (Octonativ M, Kabi Pharmacia AB, Stockholm, Svédország) 2 NE/ml-t keverünk 50 μΐ bovin trombinnal (0,06 nkat/ml aktivitás S-2238 szubsztrátummal szemben; Chromogenix AB, Mölndal, Svédország) 30 másodpercig 37°C-on.
II. Fenti elegyhez ezután 100 μΐ reagenst (R) adunk, amelynek összetétele az alábbi: 40 mM trisz.HCl, pH 7,3, 0,15 % BSA, 12 mM kalcium-klorid, 30 μΜ foszfolipidekből és más alább meghatározott alkotórészekből. Inkubálás 2 percig 37°C-on.
III. Az elegyből kiveszünk 0,25. μΐ kismintát és felhígítjuk 1000 μΐ 0,2 % BSA-t tartalmazó 50 mM trisz.HCl pufferrel (pH: 7,3), majd meghatározzuk az FVIII aktivitást a COATEST FVIII vizsgálati előírásnak megfelelően (Chromogenix, Mölndal, Svédország).
IV. Bovin FIXa-t, bovin FX-et (COATEST FVIII, Chromogenix AB, Mölndal, Svédország) és foszfolipideket (30 μΜ) tartalmazó reagens 200 μΐ-ét 100 μΐ hígított kismintával és 100 μΐ 25 mM kalcium-kloriddal kevertük össze. Az elegyet 5 percig 37°C-on inkubáljuk, majd hozzáadunk 200 μΐ kromogén FXa-S-2765 szubsztrátum (0,09 mM; Chromogenix AB, Mölndal, Svédország) készítményt. Az elegyet további 3 percig inkubáljuk 37’c-on, a szubsztrátum hidrolízisét 100 μΐ 20 %-os ecetsav hozzáadásával állítjuk le és a felszabadult
kromofáv (pNA = p-nitro-anilin) abszorpcióját 405 mm-en, fotométeren olvassuk le. Ebben a vizsgálati rendszerben a minta aktív FVIII koncentrációja egyenesen arányos az abszorpcióval.
A különböző R-keverékek a következő kiegészítő alkotórészeket tartalmazzák:
A Nincs kiegészítve
B 0,4 Mg/ml APC
C 0,4 Mg/ml APC + 0,3 E/ml APC-kofaktor 2 aktivitás
D 0,4 μΐ/ml APC + 1 /xg/ml humán protein S
E 0,4 Mg/ml APC + 1 pg/ml humán protein S + 0,3 E/ml
APC-kofaktor 2 aktivitás
A normál plazma körülbelül 10 /ig/ml szabad protein S-t tartalmaz, tehát a minta hígításai a II lépésben 0,05 x 0,05 x 10 = 0,0025 μg-nak, a tisztított humán protein S hozzáadott mennyisége negyedének felel meg. Az APC-kofaktor 2 aktivitás tartalmat közelítő becslésnek kell tekinteni, mivel még nem áll rendelkezésre mennyiségi meghatározási eljárás.
Eredmények
R-keverék Protein S konc. A405 a II.lépésben
Mg/ml
APC-kofaktor 2 aktivitás hatása az APC aktivitásra A405-ben kifejezve
| A | 0,125 | 0,678 | |
| B | 0,125 | 0,623 | |
| C | 0,125 | 0,509 | - 0,114 (C-B) |
| D | 0,625 | 0,559 | |
| E | 0,625 | 0,389 | - 0,170 (E-D) |
| Az | eredmények azt | mutatják, | hogy az APC-kofaktor 2 |
aktivitás hozzáadása fokozza az APC aktivitást a protein S mindkét szintje mellett, ami az FXa-képződés csökkenésében, azaz a II lépésben az FVIIla inaktiválódás növekvő sebességében nyilvánul meg.
• ·
6. példa
Az APC-kofaktor 2 aktivitás hatása alvadási vizsgálatban
Az FVa és FVIIIa kofaktorok résztvesznek a trombin - a fibrin képződéséért felelős enzim - képzésében. Ezeket a kofaktorokat bontja az APC, így az APC aktivitást egy alvadási vizsgálatban a fibrin alvadék kialakulásához szükséges idő meghosszabbodása jeleníti meg. Minthogy a protein C (PC) mint proenzim van jelen a keringésben, a mintában a PC aktiválást a Protac C kígyóméreg enzim (Pentapharm, Bázel, Svájc) hozzáadásával végezzük el. A következő kísérleteket végeztük.
I. 10 μΐ FVIII koncentrátumhoz (10 NE/ml; Octaniv M, kabi Pharmacia AB, Svédország) 100 μΐ PC-hiányos plazmát, 100 μΐ APTT reagenst, 25 μΐ Protac C-t (1,5 E/ml) és 25 μΐ reagens (R) keveréket kevertünk, ez az elegy 50 mM trisz.HCl-t (pH 7,5, I = 0,15) és 0,2 % BSA-t tartalmazott, valamint további - alább meghatározott - alkotórészeket adtunk a fenti elegyhez.
II. A fenti elegyhez 100 μΐ 22 mM kálcium-kloridot adtunk és feljegyeztük az alvadék képződéséhez 37°C-on szükséges időt.
R-keverékek kiegészítése:
| A. | Nincs kiegészítve |
| B. | 2 Mg/ml PC |
| C. | 2 Mg/ml PC + 2,6 E/ml APC-kofaktor-2 aktivitás |
| D. | 4 Mg/ml PC |
| E. | 4 Mg/ml PC + 2,6 E/ml APC-kofaktor-2 aktivitás |
| F. | 2,6 E/ml APC-kofaktor 2 aktivitás |
A protein C hiányos plazma az alvadási folyamatban szereplő más plazma proteinekhez és a protein S-hez (az APC kofaktora) is hozzáadódik. Az I. lépésben az APC-kofaktor 2 végső koncentrációja megközelítőleg 0,2-0,3 E/ml (lásd előbb).
- 41 Eredmények
R-keverék PC koncentráció az I.lépésben
Mg/ml • ·
Alvadási idő APC-kofaktor 2-nek másodperc tulajdonítható APC aktivitás meghoszszabbodás másodperc
| A | 0 | 42,3 |
| B | 0,2 | 62,7 |
| C | 0,2 | 71,4 |
| D | 0,4 | 79,3 |
| E | 0,4 | 104,5 |
| F | 0 | 45,9 |
| + | 0,7 | (n = 5) | |
| + | 1,2 | (n = 5) | |
| + | 1,6 | (n = 3) | 8,7 |
| + | 2,9 | (n = 5) | |
| + | 8,6 | (n = 3) | 25,2 |
A kísérlet világosan mutatja, hogy az APC-kofaktor 2 aktivitás fokozza az APC aktivitást, amely az alvadási idő megnövekedett meghosszabbodásában nyilvánul meg. Az APCkofaktor 2 készítmény önmagában való adásának hatása PC távollétében csak csekély.
Claims (39)
- Szabadalmi igénypontok1. Eljárás olyan véralvadási komponens funkcionális aktivitásának meghatározására egy mintában, amelynek az említett aktivitása összefüggésbe hozható egy, az aktivált protein C-re (APC-re) specifikus szubsztrátum konverziójával; ahol az említett eljárás a protein C antikoaguláns rendszerben résztvevő alkotórészeknek a vizsgálatára szolgál, amikoris a protein C-t, aktivált protein C-t, protein S-t vagy antikoaguláns V faktort vizsgáljuk, ahol az említett eljárás a következő lépésekből áll: egy reakcióelegyben, amely a mintát és az APC egy szubsztrátumát tartalmazza, megmérjük a szubsztrátum APC okozta konverzióját és a mért értéket - ismert módon - a meghatározandó alkotórész aktivitásához viszonyítjuk, ahol az eljárás során adott esetben egy vagy két anyagot előnyösen kettőt - adunk a reakcióelegyhez, az említett anyago(ka)t a következők közül választjuk: APC, protein S vagy egy olyan inhibitor, amely a mintából eredő protein S aktivitást blokkolja, antikoaguláns aktivitású V faktor, vagy egy olyan inhibitor, amely az ugyanezen mintából származó aktivitást blokkolja; azzal a feltétellel, hogy a fennmaradt anyagok , azaz az APC, protein S és az antikoaguláns aktivitású V faktor közül egy benne van a mintában és ez az a komponens, amelynek a funkcionális aktivitása a meghatározandó, és az V faktort illetően, az említett aktivitás egy antikoaguláns aktivitás, amely kofaktora az APC-nek.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol az V faktor antikoaguláns aktivitását APC kofaktorként határozzuk meg, adott esetben hozzáadott protein S jelenlétében vagy egy olyan inhibitor jelenlétében, amely a minta eredetű protein S aktivitást blokkolja.
- 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol a protein C-t _ · a * · . . ··· · · I. ·APC-vé való aktiválás után határozzuk meg, amikoris legalább egy APC-kofaktor aktivitású V faktort vagy egy olyan inhibitort, amely blokkolja az ugyanezen mintából származó aktivitást és protein S-t vagy egy olyan inhibitort, amely a mintából származó protein S aktivitást blokkolja, adunk a reakcióelegyhez.
- 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol a protein S-t határozzuk meg, amikoris legalább egy APC-kofaktor aktivitású V faktort vagy egy olyan inhibitort, amely ugyanezen mintából származó aktivitást blokkolja, vagy APC-t adunk a reakcióelegyhez.
- 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol VIII faktort és/vagy Villa faktort adunk a reakcióelegyhez .
- 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol az V faktor antikoaguláns aktivitását mint APC kofaktor aktivitást határozzuk meg, adott esetben hozzáadott protein S vagy az említett protein S inhibitor jelenlétében, az APC szubsztrátumát az Va faktor és/vagy Villa faktor tartalmazza és a minta egy egyéntől származik, a minta koagulációs proteinjeit használjuk az APC szubsztrátum konverziójának mérésére; azzal a feltétellel, hogy ha a minta egy olyan egyénből származik, akit K-vitamin antagonistákkal kezelnek, vagy ha a minta K-vitamin-függő koagulációs faktorokra nézve hiányos, a mintában lévő ezen K-vitamin függő faktorok aktivitását úgy módosítjuk, hogy legalább egy K-vitaminfüggő koagulációs faktort - aktivált vagy aktiválatlan formában - adunk a mintához, adott esetben protein S-sel kombinálva.
- 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a reakcióelegyhez hozzáadott egyes kiválasztott anyagok funkcionális szintje lényegében konstans az összehasonlítandó minták reakcióelegyeiben.ί*· · · ·· ·.* *···
- 8. Α 7. igénypont szerinti eljárás, ahol a lényegében konstans szintet úgy érjük el, hogy a kiválasztott anyagot a mintában lévő szintjéhez viszonyítva funkcionális feleslegben adjuk a reakcióelegyhez.
- 9. A 7. igénypont szerinti eljárás, ahol inhibitorként olyan antitestet használunk, amely specifikusan kötődik egy epitóphoz, amely összefügg az APC, protein C vagy protein S aktivitásával vagy az V faktor, mint APC kofaktor antikoaguláns aktivitásával.
- 10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a minta vér vagy vér eredetű minta, például egy plazma minta.
- 11. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol az egy vagy két kiválasztott anyagot a vizsgálandó anyagból hiányos plazma formájában biztosítjuk.
- 12. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a vizsgált anyagra talált értéket használjuk fel azon egyén véralvadási zavarainak a diagnózisára, akiből a minta származik.
- 13. Eljárás vér koagulációs/antikoagulációs zavar, főként tromboembóliás zavar diagnózisára vagy az erre való hajlam meghatározására egy egyénben, előnyösen emlősben, így emberben, ahol az eljárás abból áll, hogy egy mintában, előnyösen vérben vagy vér eredetű mintában, így az említett egyénből származó plazmában meghatározzuk egy antikoaguláns aktivitást kifejtő véralkotórész szintjét, amely véralkotórészt az V faktor tartalmazza, amelynek a normálistól eltérő szintje jelzi az említett zavar megnyilvánulását vagy az említett zavarra való hajlamot, csökkent szint esetén ez a zavar leginkább tromboembóliás zavarra mutat.
- 14. A 13. igénypont szerinti eljárás, ahol az V faktor antikoaguláns aktivitásának a szintjét mint APC kofaktor szintet határozzuk meg.
- 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, ahol az antikoaguláns aktivitást a 2. igénypont szerinti eljárás szerint mérjük, amelyet az V faktor mint APC kofaktor antikoaguláns aktivitása meghatározásához adaptáltunk.
- 16. A 13. igénypont szerinti eljárás, ahol az antikoaguláns aktivitású V faktort APC kofaktorként, immunológiai eljárással határozzuk meg.
- 17. A 14. igénypont szerinti eljárás, ahol az V faktor aktivitását mint APC kofaktor aktivitást határozzuk meg a 6. igénypont szerinti eljárással.
- 18. A 15. igénypont szerinti eljárás, ahol az V faktor antikoaguláns aktivitását mint APC kofaktor aktivitást határozzuk meg a mintában, előnyösen a 2. igénypont szerinti eljárással, koagulációs analízissel, (i) a minta egy részét APC hozzáadása nélkül, adott esetben további, olyan véralvadási alkotórészek jelenlétében inkubáljuk, amelyek annak elősegítéséhez szükségesek, hogy az APC által átalakított szubsztrátum konverzióját mérjük és (ii) a minta egy részét hozzáadott APC jelenlétében inkubáljuk és adott esetben további, olyan véralvadási alkotórészek jelenlétében inkubáljuk, amelyek ahhoz szükségesek, hogy az APC által átalakított szubsztrátum konverziójának mérése lehetővé váljék: adott esetben megfelelő konverzió után az alvadási időt mérjük és ha az eredmény az ugyanilyen eljárásban, normál egyéneknél kapott alvadási időkre alapozott határérték alatt van, akkor ez hiányosságot jelent az V faktor mint APC kofaktor antikoaguláns aktivitás szempontjából .
- 19. Antitest készítmény, amely specifikusan reagál az V faktor egy szakaszával vagy helyével, amely ennek mint APC kofaktornak az antikoaguláns aktivitásával van kapcsolatban.
- 20. A 19. igénypont szerinti antitest készítmény, amely monoklonális készítmény és amely meghatározott számú például 1-től 5-ig választott számú - a 19. igénypontban meghatározott specificitású monoklonális antitestet tartalmaz.
- 21. Antitest készítmény, amely olyan poliklonális antitesteket tartalmaz, amelyek felismerik az V faktort és szelektíven kötődnek hozzá, előnyösen az V faktor egy olyan szakaszához vagy helyéhez, amely kapcsolatban van ennek mint APC kofaktornak antikoaguláns aktivitásával, és az említett szakasz vagy hely adott esetben egy, az említett aktivitásnak megfelelő epitópot tartalmaz.
- 22. A 20. igénypont szerinti antitest készítmény, amely monoklonális antitesteket tartalmaz, amely antitesteket egér/egér hibridóma sejtek használatával, előnyösen az European Collection of Animál Cell Culture intézménynél AM-4-5-1 93120846 szám alatt letétbe helyezett hibridóma sejtvonal használatával termeljük.
- 23. Sejtvonal, amely olyan (monoklonális) antitesteket termel, amelyek specifikusan reagálnak az V faktor egy szakaszával vagy helyével, és az V faktor olyan epitópot hordozhat, amely ennek mint APC kofaktornak az antikoaguláns aktivitásával van kapcsolatban.
- 24. A 23. igénypont szerinti sejtvonal, amely egy hibridóma sejtvonal.
- 25. A 24. igénypont szerinti sejtvonal, amely az European Collection of Animál Cell Culture intézménynél AM-4-5-1 93120846 számon letétbe helyezett hibridóma sejtvonal.
- 26. Kiszerelt, az V faktor mint APC kofaktor antikoaguláns aktivitásának meghatározására szánt plazma készítmény, amely készítmény olyan humán plazmából áll, amelyet az említett antikoaguláns aktivitásra nézve hiányP1 azmává alakítottunk, például immun-kimerítéssel olyan V faktorrá, amely ilyen aktivitást fejez ki, az említett plazmát adott esetben V faktorral egészítjük ki, például bovin V faktorral olyan fajból, amelyből ez az antikoaguláns aktivitás hiányzik, vagy Va faktorral, vagy a készítmény egy vagy több olyan egyénből származó plazmából áll, aki(k)nek a plazmája az említett aktivitásra nézve hiányos.
- 27. A 26. igénypont szerinti kiszerelt plazmakészítmény, amelyben a hiányplazmát normál plazmával vagy antikoaguláns aktivitású V faktorral van összekeverve, és a keverék az említett antikoaguláns aktivitás kifejtésére megfelelő alacsony szinten képes, például kontroll plazmaként történő alkalmazásra.
- 28. V faktor mint APC kofaktor antikoaguláns aktivitásának in vitro meghatározására alkalmas kiszerelt plazmakészítmény, amely részlegesen hiányos V faktor antikoaguláns aktivitású egyének plazmáinak keverékéből áll, és a keverék az említett antikoaguláns aktivitás kifejtésére megfelelő alacsony szinten képes, például kontroll plazmaként történő alkalmazásra.
- 29. V faktor mint APC kofaktor antikoaguláns aktivitás hiányos plazma, amely olyan humán plazmából áll, amelyet az említett antikoaguláns aktivitásra nézve hiány-plazmává van alakítva, például immun-kimerítéssel olyan V faktorra, amely az említett aktivitás kifejtésére képes, adott esetben az említett plazma V faktorral van kiegészítve, például bovin V faktorral olyan fajból, amelyben ez az aktivitás hiányzik vagy Va faktorral vagy pedig egy vagy több olyan egyénből származó humán plazmából áll, akiknek a plazmája az említett aktivitásra nézve hiányos.’··· ·· , • · · ·« ·.
- 30. Α 29. igénypont szerinti plazma, amelyben a hiányplazma normál plazmával van összekeverve vagy az említett aktivitású V faktorral vagy ez egy olyan plazma keverék, amely V faktor antikoaguláns aktivitás szempontjából részleges hiányosságot mutató egyénekből származik, és a keverék az említett antikoaguláns aktivitás kifejtésére olyan megfelelő alacsony szinten képes, például kontroll plazmaként történő alkalmazásra.
- 31. A 19-22. igénypontok bármelyike szerinti antitest készítmény felhasználása a 26. igénypont szerinti immunkimerített kiszerelt plazma vagy a 29. igénypont szerinti plazma előállítására.
- 32. Protein S készítmény, amely az V faktor mint APC kofaktor antikoaguláns aktivitásának meghatározására szolgál.
- 33. Protein C készítmény, amely adott esetben aktivált formában vagy egy protein C aktivátorral kombinálva az V faktor mint APC kofaktor antikoaguláns aktivitásának meghatározására szolgál.
- 34. A 33. igénypont szerinti protein C készítmény, amely legalább egy K vitamin függő koagulációs faktorral van kombinálva, amely(ek)et a következő csoportból választjuk ki: VII, IX, X és II faktor, adott esetben protein S-sel kombinálva.
- 35. V faktor, célszerűen humán V faktor, amely képes úgy aktiválódni, hogy Va faktor prokoaguláns aktivitást fejtsen ki, de nem képes antikoaguláns aktivitás, főként APC kofaktor antikoaguláns aktivitás kifejtésére, ahol a faktor lényegében tiszta formában van.
- 36. V faktor, célszerűen humán V faktor, amely antikoaguláns aktivitás kifejtésére képes, előnyösen mint ·*··APC kofaktor, de nem képes Va faktor prokoaguláns aktivitást kifejteni.
- 37. Egy egyénnél gén mutáció(k) által okozott öröklött APC-rezisztenica eredetű trombózis kialakulásra való hajlam meghatározására szolgáló eljárás, amely a következő lépésekből áll: meghatározzuk az említett egyénből származó sejt mintában az V faktor gén-mutáció(k) előfordulását, amely mutációk az V faktor gén egy vagy több nukleinsav fragmentumán és/vagy az V faktor gén szekvenciáin helyezkednek el, és ezek a mutációk olyan mutagenizált V/Va faktor molekula kifejeződését idézik elő, amelyek APCrezisztencia kifejeződéssel járnak együtt, és ez trombózis kialakulására való hajlamot jelent.
- 38. A 37. igénypont szerinti eljárás, ahol a mutáció(ka)t az V faktor génben mint a nukleinsav fragmentum(ok)nak és/vagy szekvenciá(k)nak az említett mutáció(k) által okozott abnormális hiányát vagy jelenlétét határozzuk meg ismert eljárásokkal, így a nukleinsav hibridizációs vizsgálatokon, nukleinsav szekvenáláson vagy immunassay-kon alapuló eljárással.
- 39. A 37. igénypont szerinti eljárás, ahol a mutáció(ka)t közvetett módon határozzuk meg, az V faktor génben előforduló természetes polimorfizmussal való összefüggésre alapozva.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE9300300A SE9300300D0 (sv) | 1993-01-29 | 1993-01-29 | A novel anticoagulant entity, antibodies reacting specifically with the entity, and diagnostic and therapeutic used of the entity |
| SE9302457A SE9302457D0 (sv) | 1993-07-20 | 1993-07-20 | A novel anticoagulant entity, antibodies reacting specifically with the enety, and diagnostic and therapeutic uses of the entity |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9502190D0 HU9502190D0 (en) | 1995-09-28 |
| HUT72191A true HUT72191A (en) | 1996-03-28 |
Family
ID=26661641
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9502190A HUT72191A (en) | 1993-01-29 | 1994-01-28 | Novel anticoagulant cofactor activity |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7169572B1 (hu) |
| EP (1) | EP0690991B2 (hu) |
| JP (1) | JPH08506181A (hu) |
| AT (1) | ATE168781T1 (hu) |
| AU (1) | AU690535B2 (hu) |
| BR (1) | BR9406223A (hu) |
| CA (1) | CA2154080C (hu) |
| CZ (1) | CZ184995A3 (hu) |
| DE (1) | DE69411898T3 (hu) |
| DK (1) | DK0690991T4 (hu) |
| ES (1) | ES2119165T5 (hu) |
| FI (1) | FI953565A0 (hu) |
| GR (1) | GR3027697T3 (hu) |
| HU (1) | HUT72191A (hu) |
| NZ (1) | NZ261190A (hu) |
| PL (1) | PL181102B1 (hu) |
| WO (1) | WO1994017415A1 (hu) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL181102B1 (pl) * | 1993-01-29 | 2001-05-31 | Dahlbaeck Bjoern | Sposób oznaczania w próbce funkcjonalnej aktywności wybranego składnika koagulacji krwi |
| US6518016B1 (en) | 1994-02-14 | 2003-02-11 | Rijks Universiteit Leiden | Method for diagnosing an increased risk for thrombosis or a genetic defect causing thrombosis and kit for use with the same |
| DE4418635C2 (de) * | 1994-05-27 | 1997-07-24 | Immuno Ag | Pharmazeutische Zusammensetzung zur Vorbeugung und Behandlung von Blutgerinnungsstörungen |
| DE4439756C2 (de) * | 1994-11-09 | 2002-07-18 | Dade Behring Marburg Gmbh | Kalibrator zur Verwendung in Testverfahren zum Nachweis eines defekten Gerinnungsfaktors V |
| ATE198772T1 (de) * | 1994-11-10 | 2001-02-15 | Dade Behring Marburg Gmbh | Verfahren zum spezifischen nachweis eines aktivierten gerinnungsfaktors v mit einer erhöhten stabilität gegenüber aktiviertem protein c |
| US6867045B1 (en) * | 1994-11-14 | 2005-03-15 | The Scripps Research Institute | Method for diagnosis of thrombotic disorders |
| ES2157295T5 (es) * | 1994-12-23 | 2005-07-01 | Diagnostic Reagents Limited | Metodo para diagnosticar trastornos de la coagulacion de la sangre. |
| US5874256A (en) * | 1995-06-06 | 1999-02-23 | Rijks Universiteit Leiden | Method for diagnosing an increased risk for thrombosis or a genetic defect causing thrombosis and kit for use with the same |
| US5863896A (en) * | 1995-11-09 | 1999-01-26 | Immuno Ag | Evaluation of substances for altering and for increasing APC response |
| US5766869A (en) * | 1995-11-30 | 1998-06-16 | Ahs Hospital Corp. | Factor V ratio blood test for susceptibility to thromboembolism |
| DE19634312A1 (de) * | 1996-08-24 | 1998-02-26 | Behringwerke Ag | Verfahren zur Herstellung von Faktor V-Mangelplasma und ein so erhaltenes Mangelplasma |
| CA2328493A1 (en) * | 1998-05-14 | 1999-11-18 | Battelle Memorial Institute | Transgenic plant-derived human blood coagulation factors |
| FR2778923B1 (fr) * | 1998-05-22 | 2000-08-18 | Stago Diagnostica | Compositions utiles comme controle pathologique dans une methode de detection d'une resistance a la proteine c activee, procede de preparation de ces compositions et utilisation dans ladite methode de detection |
| JP4377207B2 (ja) | 2003-11-28 | 2009-12-02 | シスメックス株式会社 | 血液凝固時間測定方法および血液凝固時間測定用試薬 |
| WO2008067056A2 (en) * | 2006-10-16 | 2008-06-05 | Novelmed Therapeutics, Inc. | Method of inhibiting coagulation with human anti-factor va antibodies and use thereof |
| US11650196B2 (en) * | 2017-01-06 | 2023-05-16 | Sony Corporation | Blood coagulation system analysis apparatus, blood coagulation system analysis system, blood coagulation system analysis method, blood coagulation system analysis program, blood loss prediction apparatus, blood loss prediction system, blood loss prediction method, and blood loss prediction program |
Family Cites Families (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3330699A1 (de) | 1983-08-25 | 1985-03-07 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur gleichzeitigen bestimmung von fibrinogen und fibrinogen-spaltprodukten im plasma |
| JPS60241900A (ja) | 1984-05-16 | 1985-11-30 | Nitto Boseki Co Ltd | 新規な第Ｘａ因子活性測定用基質 |
| DE3516579A1 (de) | 1984-11-19 | 1986-05-22 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Gerinnungstest auf teststreifen |
| US4849403A (en) | 1985-05-29 | 1989-07-18 | Pentapharm Ag | Protein C activator, methods of preparation and use thereof |
| DE3536903A1 (de) | 1985-10-16 | 1987-04-16 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur photometrischen bestimmung von protein c |
| DE3607559A1 (de) | 1986-03-07 | 1987-09-10 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur photometrischen bestimmung der protein c- und/oder protein s-aktivitaet |
| US5200322A (en) * | 1986-09-19 | 1993-04-06 | Nippon Zoki Pharmaceutical Co., Ltd. | Method for assaying protein C and measuring kit for the same |
| CA1339946C (en) | 1987-03-31 | 1998-07-07 | Michael J. Griffith | Ultrapurification process for polypeptides |
| US5472850A (en) | 1991-04-10 | 1995-12-05 | Oklahoma Medical Research Foundation | Quantitative clotting assay for activated factor VII |
| US5055412A (en) | 1989-03-21 | 1991-10-08 | Proksch Gary J | Factor sensitive reagent for testing of blood coagulation containing ellagic acid and divalent metal ions and method of making the same |
| IT1230744B (it) * | 1989-07-07 | 1991-10-29 | Instrumentation Lab Spa | Metodo per la determinazione della attivita' funzionale della proteina s nel plasma umano. |
| US5051357A (en) | 1989-07-14 | 1991-09-24 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Method and assay using inactivation of factors Va and VIIIa by activated Protein C to diagnose thrombic disease or assay for Protein C and kit therefor |
| WO1991001383A1 (en) | 1989-07-14 | 1991-02-07 | Michigan State University | Method for diagnosing blood clotting disorders |
| SE464135B (sv) | 1989-07-14 | 1991-03-11 | Kabivitrum Ab | Foerfarande foer bestaemning av funktionell aktivitet av fritt protein s eller protein c i ett plasmaprov |
| US5169786A (en) | 1989-12-19 | 1992-12-08 | Ortho Diagnostic Systems, Inc. | Method of determining levels of extrinsic and intrinsic clotting factors and protein c |
| US5314695A (en) | 1990-11-13 | 1994-05-24 | Corvas International, Inc. | Tissue factor based prothrombin time reagent |
| AT395597B (de) | 1991-01-25 | 1993-01-25 | Immuno Ag | Reagens zur bestimmung von faktor viii-aktivitaet |
| US5716795A (en) * | 1991-10-04 | 1998-02-10 | Matschiner; John T. | Thrombomodulin-based coagulometric assay of the protein C system |
| AU2870992A (en) * | 1991-10-04 | 1993-05-03 | Board Of Regents Of The University Of Nebraska, The | A soluble thrombomodulin-based one-stage assay for vitamin k-dependent coagulation-inhibiting proteins |
| ES2081618T5 (es) * | 1991-11-13 | 2005-09-01 | T.A.C. Thrombosis And Coagulation Aktiebolag | Metodo para diagnosticar anomalias de la coagulacion de la sangre. |
| SE470274B (sv) | 1991-11-13 | 1993-12-20 | Bjoern Dahlbaeck | Användning av en in vitro-metod för diagnos av blodkoagulationssjukdomar |
| US5308756A (en) * | 1991-11-20 | 1994-05-03 | Baxter Diagnostics Inc. | Protein S chromogenic assay |
| PL181102B1 (pl) * | 1993-01-29 | 2001-05-31 | Dahlbaeck Bjoern | Sposób oznaczania w próbce funkcjonalnej aktywności wybranego składnika koagulacji krwi |
| EP0656424B1 (de) * | 1993-12-03 | 2002-02-06 | Baxter Aktiengesellschaft | Test zur Bestimmung der Empfindlichkeit gegenüber aktiviertem Protein C |
| DE4427785A1 (de) * | 1994-08-08 | 1996-02-15 | Behringwerke Ag | Verfahren zum Nachweis von Störungen des Protein C/Protein S-Systems |
| DE4439756C2 (de) * | 1994-11-09 | 2002-07-18 | Dade Behring Marburg Gmbh | Kalibrator zur Verwendung in Testverfahren zum Nachweis eines defekten Gerinnungsfaktors V |
| US5705395A (en) * | 1994-11-14 | 1998-01-06 | The Scripps Research Institute | Method for diagnosis of thrombotic disorders |
| US5780255A (en) * | 1995-06-09 | 1998-07-14 | Instrumentation Laboratory, S.P.A. | Protein C pathway screening test |
| US20030143759A1 (en) | 1995-10-20 | 2003-07-31 | Bjorn Dahlback | Assays for determining anticoagulant cofactor activity |
| US5766869A (en) * | 1995-11-30 | 1998-06-16 | Ahs Hospital Corp. | Factor V ratio blood test for susceptibility to thromboembolism |
-
1994
- 1994-01-28 PL PL94310050A patent/PL181102B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1994-01-28 CZ CZ951849A patent/CZ184995A3/cs unknown
- 1994-01-28 BR BR9406223A patent/BR9406223A/pt not_active Application Discontinuation
- 1994-01-28 HU HU9502190A patent/HUT72191A/hu unknown
- 1994-01-28 JP JP6516938A patent/JPH08506181A/ja not_active Ceased
- 1994-01-28 NZ NZ261190A patent/NZ261190A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-01-28 US US08/500,917 patent/US7169572B1/en active Active
- 1994-01-28 EP EP94905908A patent/EP0690991B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-01-28 ES ES94905908T patent/ES2119165T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-01-28 CA CA002154080A patent/CA2154080C/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-01-28 AT AT94905908T patent/ATE168781T1/de active
- 1994-01-28 WO PCT/SE1994/000070 patent/WO1994017415A1/en not_active Application Discontinuation
- 1994-01-28 DE DE69411898T patent/DE69411898T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-01-28 DK DK94905908T patent/DK0690991T4/da active
- 1994-01-28 AU AU59827/94A patent/AU690535B2/en not_active Expired
-
1995
- 1995-07-26 FI FI953565A patent/FI953565A0/fi not_active Application Discontinuation
-
1998
- 1998-08-20 GR GR980401874T patent/GR3027697T3/el unknown
-
2006
- 2006-11-16 US US11/560,502 patent/US20070212743A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2154080A1 (en) | 1994-08-04 |
| CA2154080C (en) | 2006-03-21 |
| ES2119165T3 (es) | 1998-10-01 |
| PL181102B1 (pl) | 2001-05-31 |
| BR9406223A (pt) | 1996-01-09 |
| DK0690991T4 (da) | 2004-02-16 |
| ATE168781T1 (de) | 1998-08-15 |
| EP0690991A1 (en) | 1996-01-10 |
| HU9502190D0 (en) | 1995-09-28 |
| FI953565A (fi) | 1995-07-26 |
| NZ261190A (en) | 1997-12-19 |
| CZ184995A3 (en) | 1996-03-13 |
| US20070212743A1 (en) | 2007-09-13 |
| GR3027697T3 (en) | 1998-11-30 |
| US7169572B1 (en) | 2007-01-30 |
| DK0690991T3 (da) | 1999-02-01 |
| FI953565A0 (fi) | 1995-07-26 |
| EP0690991B2 (en) | 2004-01-14 |
| PL310050A1 (en) | 1995-11-13 |
| AU5982794A (en) | 1994-08-15 |
| DE69411898T2 (de) | 1998-12-17 |
| JPH08506181A (ja) | 1996-07-02 |
| EP0690991B1 (en) | 1998-07-22 |
| ES2119165T5 (es) | 2004-07-01 |
| WO1994017415A1 (en) | 1994-08-04 |
| DE69411898T3 (de) | 2004-07-08 |
| DE69411898D1 (de) | 1998-08-27 |
| AU690535B2 (en) | 1998-04-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20070212743A1 (en) | Assays for Determining Anticoagulant Cofactor Activity | |
| AU2005289774B2 (en) | Methods for a global assay of coagulation and fibrinolysis | |
| Cugno et al. | Autoantibodies to coagulation factors: from pathophysiology to diagnosis and therapy | |
| US7297336B2 (en) | Factor IXa specific antibodies displaying factor VIIIa like activity | |
| US20100144634A1 (en) | Compositions and Methods for Modulation of ADAMTS13 Activity | |
| JPH07501217A (ja) | 血液凝固疾患の診断方法 | |
| WO2009142744A2 (en) | Predicting hemostatic risk; dependence on plasma composition | |
| JP2017186340A (ja) | 血液凝固促進に使用するための化合物 | |
| Minami et al. | Emicizumab, the bispecific antibody to factors IX/IXa and X/Xa, potentiates coagulation function in factor XI‐deficient plasma in vitro | |
| Bradbury et al. | Thrombophilia and chronic venous ulceration | |
| Ziedins et al. | Factor VIIa replacement therapy in factor VII deficiency | |
| Shattil | Diagnosis and treatment of recurrent venous thromboembolism | |
| De La Cadena et al. | Naturally occurring human antibodies against two distinct functional domains in the heavy chain of FXI/FXIa | |
| US20030143759A1 (en) | Assays for determining anticoagulant cofactor activity | |
| KR100788435B1 (ko) | Ⅷ 안티팩터 동종항체 | |
| EP3861127A1 (en) | Method for the determination of protein s levels | |
| PL181638B1 (pl) | Sposób oznaczania sklonnosci do rozwoju zakrzepicy PL | |
| WO2001098782A1 (fr) | Kit de determination du pouvoir de coagulation du sang | |
| JP2022553753A (ja) | 好中球細胞外トラップに関連する線維素溶解不全の診断方法 | |
| Arnout et al. | 21 Antiphospholipid antibodies: prothrombotic mechanisms and laboratory diagnosis | |
| Miller | The molecular interactions of the catalytic domain of factor XIa (FXIa): Catalysis of substrates IX and S-2366, inhibition by the Kunitz protease inhibitory domain (KPI) of Protease Nexin 2 (PN2), and binding to the surface of activated platelets | |
| PC et al. | PROTEIN C PATHWAY-NORMAL FUNCTION | |
| Ramasamy | INHERITED RISK FACTORS FOR VENOUS | |
| Raul et al. | Naturally Occurring Human Antibodies Against Two Distinct Functional Domains in the Heavy Chain of FXI/FXIa |