KR100788435B1

KR100788435B1 - Ⅷ 안티팩터 동종항체

Info

Publication number: KR100788435B1
Application number: KR1020027000657A
Authority: KR
Inventors: 스리니바스 카베리; 사베스티엔 라크로익스-데스마제스; 미셸 카자취킨
Original assignee: 인스티튜트 내셔날 드 라 싼테 에 드 라 리셰르셰메디칼르(인썸); 베이어 파마
Priority date: 1999-07-21
Filing date: 2000-07-18
Publication date: 2007-12-24
Also published as: NO20020253L; AU6824500A; JP2003505434A; CA2379818A1; HUP0201941A3; CN1229646C; NZ516702A; MXPA02000752A; BR0012613A; EP1196782A1; US20090208512A1; IS6238A; RU2258935C2; NO20020253D0; SK862002A3; HK1044372A1; EP1074842A1; CZ2002248A3; KR20020042618A; JP2009292823A

Abstract

본 발명은 포유동물에서 VIII 팩터를 분해할 수 있는 VIII 안티팩터 동종항체를 측정하는 방법, 및 상기 VIII 안티팩터 동종항체에 의한 상기 VIII 팩터의 절단부위 결정방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 VIII 안티팩터 동종항체에 의한 VIII 팩터의 분해 억제제; 및 VIII 팩터를 분해할 수 있고 상기 측정방법으로부터 제조되는 상기 VIII 안티팩터 동종항체로 이루어지는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물; 및 더욱이 상기 VIII 안티팩터 동종항체에 의한 VIII 팩터의 분해 억제제로 이루어지는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 마지막으로, 본 발명은 VIII 팩터의 분해 억제제의 촉매에 영향을 미치는 상기 VIII 안티팩터 동종항체, VIII 팩터를 분해할 수 있고 상기 측정방법으로부터 제조되는 상기 VIII 안티팩터 동종항체로 이루어지는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물 및 상기 VIII 안티팩터 동종항체에 의한 VIII 팩터의 분해 억제제로 이루어지는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 치료용도에 관한 것이다.

VIII 팩터, III 안티팩터, 동종항체, VIII 안티팩터 동종항체에 의한 VIII 팩터의 분해 억제제, IgG, 혈우병

Description

Ⅷ 안티팩터 동종항체{ANTI-FACTOR VIII ALLO-ANTIBODIES}

본 발명은 포유동물에서 VIII 팩터를 분해할 수 있는 VIII 안티팩터 동종항체를 측정하는 방법, 및 상기 VIII 안티팩터 동종항체에 의한 상기 VIII 팩터의 절단부위 결정방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 VIII 안티팩터 동종항체에 의한 VIII 팩터의 분해 억제제에 관한 것이다.

나아가, 본 발명은 VIII 팩터를 분해할 수 있고 상기 측정방법으로부터 제조되는 상기 VIII 안티팩터 동종항체로 이루어지는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물, 및 상기 VIII 안티팩터 동종항체에 의한 VIII 팩터의 분해 억제제로 이루어지는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

마지막으로, 본 발명은 VIII 팩터의 분해 억제제의 촉매에 영향을 미치는 상기 VIII 안티팩터 동종항체, VIII 팩터를 분해할 수 있고 상기 측정방법으로부터 제조되는 상기 VIII 안티팩터 동종항체로 이루어지는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물, 및 상기 VIII 안티팩터 동종항체에 의한 VIII 팩터의 분해 억제제로 이루어지는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 치료용도에 관한 것이다.

혈우병(Haemophilia A)은 X 염색체에 연관된 열성 질환으로써 결과적으로 VIII 팩터에 결함이 생겨 심각한 형태로 생명을 위협하는 부자연스러운 출혈성 질병이다.

심각한 혈우병 환자에게 동종의 VIII 팩터를 투여한 결과, 25%정도에서 VIII 안티팩터 동종항체가 생겼다(Ehrenforth, S., Kreuz, W., Scharrer, I., Linde, R., Funk, M., Gungor, T., Krackhardt, B. and Kornhuber, B., <<Incidence of development of factor VIII and factor IX inhibitors in haemophiliacs>>, Lancet, 1992, 339:594-598). 상기 VIII 안티팩터 동종항체는 분자를 안정화시키거나(Saenko, E.L., Shima, M., Rajalakshmi, K.J. and Scandella, D., <<A role for the C2 domain of factor VIII in binding to von Willebrand factor>>, J. Biol. Chem., 1994,269:11601-11605; and Saenko, E.L., Shima, M., Gilbert, G.E., and Scandella, D., <<Slowed relese of thrombin-cleaved factor VIII from von Willebrand factor by a monoclonal and a human antibody is a novel mechanism for factor VIII inhibition>>, J. Biol. Chem., 1996, 271:27424-27431) 그것의 활성에 필수적인 분자들(Arai, M., Scandella, D., and Hoyer, L.W.,<<Molecular basis of factor VIII inhibition by human antibodies: Antibodies that bind to the factor VIII light chain prevent the interaction of factor VIII with phospholipid>>, J.Clin.Invest., 1989, 83:1978-1984; and Zhong, D., Saenko, E.L., Shima, M., Felch, M. and Scandella, D.,<<Some human inhibitor antibodies interfere with factor VIII binding to Factor IX>>, Blood, 1998,92:136-142)과 혹은 분자를 활성화시킴으로써(Lubahn, B.C., Ware, J., Stafford, D.W., and Reiser, H.M., <<Identification of a FVIII epitope recognized by a human hemophilic inhibitor>>, Blood, 1989, 73:497-499; and Neuenschwander, P.F., and Jesty, J.,<<Thrombin-activated and factor Xa-activated human factor VIII: differences in cofactor activity and decay rate>>, Arc. Biochem, Biophys., 1992, 296:426-434) VIII 팩터와 상호작용으로 인한 공간적 방해에 의해 VIII 팩터의 응고제 활성을 억제한다.

발명의 요약

놀랍게도, 출원인들은 VIII 팩터 억제제가 VIII 팩터의 응고제 기능을 억제하리라는 지금까지는 알려지지 않은 메카니즘을 입증함과 동시에 두명의 심각한 혈우병 환자 응답자의 동종항체에 의한 VIII 팩터의 분해를 발견하였다.

출원인의 촉매성 VIII 안티팩터 동종항체의 발견은 VIII 팩터를 갖는 환자들의 치료시 유도되는 촉매성 항체들의 출현에 대한 최초의 보고 중 최상의 것이다. 이제까지를 고려해 보건대, VIII 팩터가 있을때 촉매적 가수분해("proteolysis", 단백질가수분해)로 인해 VIII 팩터를 실제로 불활성화시키는 항체들이 생성된다는 것은 매우 놀라운 일이며 심지어 이치에 맞지 않거나 혹은 믿을 수 없는 일이다. 그러나, 지금까지 보고된 촉매성 항체들은 모두 질병 과정중에 혹은 생리적 조건에서 발견되는 자가-항체들이다. 따라서, 유도된 항체들을 동종항체(ALLO-antibodies)라고 부르며, 어떠한 자가면역성 질병에서 생기는 자가-항체(AUTO-antibodies)와는 명백하게 다르다.

환자들중 VIII 안티팩터의 항체의 반응에 대한 평균 Km 계산치와 표면적인 Vmax는 각각 9.43±5.62μM과 85±60fmol.min^-1이다. VIII 팩터의 가수분해의 반응속도의 매개변수는 생체내에서 VIII 팩터의 불활성화에 있어서 촉매성 면역 반응을 위한 기능적인 역할을 제안하고 있다.

따라서, 위치 특이성 프로테아제(proteases)로써 VIII 안티팩터 동종항체의 특징은 VIII 안티팩터 동종항체를 갖는 환자의 질병 치료에 대한 새로운 접근을 제공하고 있다.

따라서, 첫째로, 본 발명은 포유동물에서 VIII 팩터를 분해할 수 있는 촉매성 VIII 안티팩터 동종항체를 측정하는 방법을 제공하는 것이며, 상기 방법은

i) 상기 포유동물로부터 얻은 혈약 샘플로부터 혈장 분리,

ii) 상기 혈장으로부터 VIII 안티팩터 동종항체 분리

iii) 상기 VIII 안티팩터 동종항체에 의해 상기 VIII 팩터의 어떠한 분해를 허용하기에 충분한 시간동안 VIII 팩터와 VIII 안티팩터 동종항체를 반응시키고; 및

iv) 상기 시간이 흐른후, 상기 VIII 안티팩터 동종항체에 의해 효과적으로 분해되는 상기 VIII 팩터를 측정하는 것으로 이루어진다.

본 발명의 방법중 ii) 단계를 구체적으로 설명하자면, 상기 VIII 안티팩터 동종항체는 상기 VIII 팩터와 그들을 결합시킴으로써 상기 혈장으로부터 분리되며, 상기 VIII 팩터는 바람직하게는 매트릭스와 결합된다. 유리하게는, ii)단계에서, 상기 VIII 안티팩터 동종항체는 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)에 의해 분리된다. 바람직하게는, ii)단계에서, 상기 친화성 크로마토그래피는 세팔로우즈 매트릭스(Sepharose matrix)를 사용하며, 바람직하게는 시아노겐 브로마이드(cyanogen bromide)로 활성화된다.

본 발명의 방법중 iii)단계를 구체적으로 설명하자면, 상기 VIII 팩터는 표지자(labelling agent)로 표지되며, 바람직하게는 특히 ¹²⁵I와 같은 방사성 표지자로 표지된다. 유리하게는, iii)단계에서, 상기 VIII 팩터는 약 15 내지 약 40℃에서, 바람직하게는 38℃에서, 약 0.5 내지 약 30사간동안, 바람직하게는 약 10시간동안 VIII 안티팩터 동종항체와 반응시킨다.

본 발명의 방법중 iv)단계를 구체적으로 설명하자면, 상기 VIII 팩터가 상기 VIII 안티팩터 동종항체에 의해 효과적으로 분해되는지의 측정은 전기영동, 특히 SDS PAGE, 혹은 젤 여과, 특히 빠른 단백질 액체 크로마토그래피 젤 여과와 같은 분리 기술, 및 시각화 기술, 특히 자가방사선촬영법에 의해 실시된다.

본 발명의 방법의 이후의 과정을 설명하자면, 상기 방법은

v) 상기 VIII 안티팩터 동종항체에 의해 분해되는 상기 VIII 팩터의 절단부위(site)의 특징을 결정하는 것으로 이루어진다.

본 발명의 방법중 v)단계를 구체적으로 설명하자면, 상기 특징의 결정은 VIII 팩터를 분해할 수 있는 상기 VIII 안티팩터 동종항체와 상기 VIII 팩터를 반응시키고, 분리후 그것으로부터 VIII 팩터의 프래그먼트의 시퀀싱하여 실시한다. 유리하게는, 상기 분리는 전기영동, 특히 SDS PAGE 또는 젤여과와 같은 기술을 이용하여 실시한다. 유리하게는, 상기 시퀀싱은 N-터미널 시퀀싱, 특히 자동 단백질 마이크로시퀀서(automatic protein microsequencer)를 이용하여 실시된다. 상기 시퀀싱 결과, 다음의 잘라지는 결합은 VIII 팩터의: Arg³⁷²-Ser³⁷³는 A1과 A2 도메인 사이에 위치하고, Tyr¹⁶⁸⁰-Asp¹⁶⁸¹은 A3 도메인의 N-터미널에 위치하며, Glu¹⁷⁹⁴-Asp¹⁷⁹⁵는 VIII 팩터의 A3 도메인내에 위치하고 있다.

따라서, 둘째로, 본 발명은,

아미노산 시퀀스:

Ser Val Ala Lys Lys His Pro;

아미노산 시퀀스:

Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser; 및

아미노산 시퀀스:

Asp Gln Arg Gln Gly Ala GLu를 제공한다.

또한, 본 발명은 VIII 안티팩터 동종항체에 의해 분해되기 쉬운 VIII 팩터에 있는 어떠한 부위를 억제할 수 있는 VIII 팩터의 어떠한 다른 시퀀스나 혹은 이것의 변이체 혹은 유사체에도 해당된다. 본 발명의 이러한 맥락으로 보아, 그러한 변이체는 예를 들어, VIII 안티팩터 동종항체에 의해 분해되기 쉬운 VIII 팩터에 있는 어떠한 부위를 억제하는 상기에 묘사된 아미노산 시퀀스의 중합체 혹은 비중합체 유사체일 수 있다. VIII 안티팩터 동종항체에 의해 분해되기 쉬운 VIII 팩터에 있는 어떠한 부위를 억제하는 변이체인 경우, 그러한 변이체는 예를들어, N-말단의, C-말단의 혹은 양쪽 말단의 몇몇 아미노산에 의해 더 짧거나 혹은 예를 들어, 몇몇 아미노산(화학적 합성 혹은 천연물질의 효소적 분해에 의해 그러한 변이체를 얻을 가능성이 있다)에 의해 더 긴 시퀀스의 변이체일 수 있다.

셋째로, 본 발명은 VIII 안티팩터 동종항체-촉매성 VIII 팩터의 분해 억제제를 제공한다. 유리하게는, 이 억제제는 프로테아제 억제제로 이루어지는 것을 특징으로 한다. 게다가, 본 발명의 맥락으로 보아 VIII 안티팩터 동종항체-촉매성 VIII 팩터의 분해 억제제로써 이용될 수 있는 프로테아제 억제제의 예로 DFP와 같은 플루오로포스페이트형 (fluorophosphate-type)의 억제제 혹은 PMSF 혹은 AEBSF(4-(2-aminoethyl)benzenesulphonyl fluoride hydrochloride(독일의 로쉐 다이아그노스틱 게엠바하사에서 제조된 상표명 Pefabloc)와 같은 설포닐 플루오라이드형(Sulphonyl fluoride-type)의 억제제가 있다. 보다 특별하게는, 이 억제제는 잘리는 결합의 분해를 억제하는 상기 억제제인 것을 특징으로 한다: VIII 팩터의 A1과 A2 도메인들 사이에 위치하고 있는 Arg³⁷²-Ser³⁷³, A3 도메인의 N-말단에 위치한 Tyr¹⁶⁸⁰-Asp¹⁶⁸¹, 및 A3 도메인내에 위치한 Glu¹⁷⁹⁴-Asp¹⁷⁹⁵. 보다 바람직하게는, 이 억제제는

아미노산 시퀀스의 중합체 또는 비중합체 유사체:

Ser Val Ala Lys Lys His Pro;

아미노산 시퀀스의 중합체 또는 비중합체 유사체:

Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser; 혹은

아미노산 시퀀스의 중합체 또는 비중합체 유사체:

Asp Gln Arg Gln GLy Ala Glu로 이루어지는 것을 특징으로 한다

그들의 가성염 특히 약학적으로 적합한 가성염뿐만 아니라 상기에 설명한 VIII 팩터의 분해 억제제는 그들이 VIII 안티팩터 동종항체에 대한 중화 활성을 갖는다는 점에서 매우 다양한 약학적 측면을 갖는다.

이들 특징들은 치료용도의 근거가 되며 게다가 본 발명은 그들의 가성염 특히, 약학적으로 적합한 가성염뿐만 아니라 상기 VIII 팩터의 분해 억제제와도 관련이 있다.

그러므로, 특히 inter alia, 혈우병인, 보다 특이하게는 VIII 팩터의 부족으로 인한 혈액응고 결함과 관련된 질병의 치료에 바람직할 것이다.

언급되고 있는 그들의 용도의 예로 한편으로는 약하거나 혹은 심각한 혈우병과 같은 질병을 가진 높은 응답자 환자들의 치료(이런 경우, 이들 환자들에서는 촉매성 항체들이 발견된다)이고 또는 다른 한편으로는 예를 들어 자가면역질환을 겪는 환자들의 치료이다(이런 경우, 이들 환자들에서는 촉매성 항체가 발견된다).

따라서, 네번째로, 본 발명은 상기에서 설명한 것 처럼, 특히 상기에서 설명한 방법으로부터 얻은 VIII 팩터를 분해할 수 있는 약학적으로 유효한 양의 VIII 안티팩터 동종항체중 적어도 하나, 또는 약학적으로 적합한 부형체, 운반체 또는 담체로 만들어진 약학적으로 적합한 가성염중 하나로 이루어지는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물을 통한 장기적 투여에 대한 해결책을 제공한다.

이들 조성물은 예를 들어, 구강, 직장, 주사, 경피, 눈, 코, 또는 이도로 투여될 수 있다.

이들 조성물은 고체 혹은 액체일 수 있으며 일반적으로, 인간 약품 예를들어, 단순 또는 코팅된 정제, 젤라틴 캡슐, 과립체, 좌약, 주사약, 경피계, 안약, 연무제 및 분무제 및 점이제에 이용되는 약학적 형태로써 제조될 수 있다. 그들은 관례에 따라 제조된다. 상기에서 설명하는 것처럼 약학적으로 유효한 양의 VIII 팩터의 분해 억제제중 적어도 하나 또는 약학적으로 적합한 가성염중 하나로 구성된 실제적인 형태는 활석, 아라비아산 고무, 젖당, 녹말, 마그네슘 스테아르산, 폴리비돈, 셀룰로우즈 유도체, 코코아 버터, 반합성 글리세라이드, 수용성 혹은 비수용성 운반체, 동물 혹은 식물의 지방, 글리콜, 다양한 가습제, 분산제 혹은 유화제, 실리콘젤, 몇몇 중합체 혹은 공중합체, 방부제, 향신료 및 착료와 같은 보통 약학적 조성물에서 사용되는 부형체와 함께 제조될 수 있다.

또한, 본 발명은 특히 VIII 안티팩터 동종항체를 생성하는 혈우병과 같은 질병 특히 VIII 안티팩터 동종항체(이 경우, 이들 환자들에게서 촉매성 항체가 발견된다)를 갖는 자가면역질환의 효과적인 치료로 이용될 수 있는 중화 활성을 갖는약학적 조성물을 포함한다. 상기 조성물은 약학적으로 유효한 양의 상기 VIII 팩터의 분해 억제제중 적어도 하나 혹은 약학적으로 적합한 가성염중 하나는 약학적으로 적합한 부형체, 운반체 혹은 담체에 제조되는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 그것의 혈액에서 VIII 팩터의 레벨로 인해 병인을 겪는 포유동물의 치료용 투여 방법을 포함하며, 상기에서 설명한 것처럼 치료용으로 적합한 양의 VIII 팩터의 분해 억제제중 적어도 하나 또는 약학적으로 적합한 가성염중 하나는 상기 포유동물에 투여되는 것을 특징으로 한다.

특히, 이 방법은 혈우병, 특히 그것의 혈액에서 VIII 팩터의 부족으로 인한 병인의 치료에 바람직하다.

또한, 본 발명은 특히 혈전증과 같은 질병 치료에 이용될 수 있는 항혈전 활성을 갖는 약학적 조성물을 포함하며, 상기 조성물은 특히, 상기에서 설명한 방법으로부터 얻을 수 있는 약학적으로 유효한 양의 VIII 안티팩터 동종항체중 적어도 하나 혹은 약학적으로 적합한 가성염중 하나는 약학적으로 적합한 부형체, 운반체 또는 담체에 제조되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 포유동물의 치료용 투여 방법을 포함하며, 상기에서 설명한 것처럼 치료적으로 유효한 양의 VIII 안티팩터 동종항체중 적어도 하나 또는 약학적으로 적합한 가성염중 하나는 상기 포유동물에 투여되는 것을 특징으로 한다.

특히, 이 방법은 혈전성 질병 특히, 그것의 혈액에서 VIII 팩터의 과다로 인한 상기 병인의 치료에 바람직하다.

인간과 동물 치료에 있어서, 상기에서 설명한 것처럼, VIII 안티팩터 동종항체 또는 VIII 팩터의 분해 억제제는 그들만으로 투여될 수 있거나, 생리적으로 적합한 부형체와 결합한 형태, 어떠한 형태 특히, 젤라틴 캡슐 또는 정제 형태로 구강으로, 혹은 주사약의 형태로 비경구적으로 투여될 수 있다. 좌약, 연고, 크림, 젤 또는 연무제와 같은 다른 투여 형태를 고려할 수도 있다.

본 발명의 전반에 걸쳐 하기의 용어들이 사용된다:

<<촉매성 VIII 안티팩터 동종항체>>란, VIII 팩터의 치료제 수혈시 혈우병 환자들에서 유도된 촉매적 활성을 갖는 VIII 팩터에 대한 항체를 의미한다;

<<VIII 팩터>>란, 혈액응고과정중 X 팩터의 효소적 분해에 있어서 IX 팩터의 조효소를 의미한다;

<<VIII 팩터의 분해>>란, 자발적인 가수분해때문에 혹은 생리적으로 분해하는 효소 즉, 트롬빈, 활성팩터 IX, 활성팩터 X 및 활성단백질 C 에 의한 가수분해때문에 나타나지 않는 VIII 팩터로부터 프래그먼트가 생성됨을 의미한다;

<<VIII 안티팩터 동종항체에 의한 VIII 팩터의 분해 억제제>>란, VIII 안티팩터의 촉매성 항체의 가수분해 활성을 특이적으로 중화할 수 있는 프로테아제 억제제 또는 VIII 팩터 시퀀스에 속하거나 그렇지 않는 어떠한 중합체를 의미한다;

발명의 상세한 설명

인간 재조합 VIII 팩터는 ¹²⁵I로 방사성 표지되었다. VIII 안티팩터 동종항체는 면역분리된 인간 VIII 팩터가 결합된 세팔로우즈 매트릭스상에서 억제제를 갖는 3명의 혈우병 환자들의 혈장으로부터 친화성을 이용하여 분리하였다. Bor, Che 및 Wal 환자들의 친화성을 이용하여 분리한 VIII 안티팩터의 항체들은 VIII 팩터의 응고제 활성을 각각 57.0, 64.0 및 43.0 BU/mg of IgG으로 억제하였다.

VIII 안티팩터 동종항체와 표지된 VIII 팩터를 함께 항온처리한 결과 셋중 두명의 환자에서 분자의 단백질분해가 일어났다. IgG 아이소타입(isotype)의 VIII 안티팩터 동종항체의 항체결합부위에서 가수분해의 특이성이 입증되었다. 프로테아제 억제제인 아프로티닌(aprotinin, 0.15μM), E-64(28μM), EDTA(1.3μM), 류펩틴(leupeptin, 10μM), 및 펩스타틴(pepstatin, 10μM)이 있는 경우, Bor과 Wal 환자들의 친화성-분리된 VIII 안티팩터의 IgG와 [¹²⁵I]VIII 팩터를 함께 항온처리하면 단백질분해 활성의 억제가 나타나지 않는다.

출원인들은 다음과 같이 VIII 팩터에서 촉매성 IgG에 대한 주요 절단부위를 묘사하였다: VIII 팩터의 A1과 A2 도메인 사이에 위치한 Arg³⁷²-Ser^373;; A3 도메인의 N-말단에 위치한 Tyr¹⁶⁸⁰-Asp¹⁶⁸¹; A3 도메인내에 위치한 Glu¹⁷⁹⁴-Asp¹⁷⁹⁵.

VIII 안티팩터 동종항체에 의한 VIII 팩터의 가수분해의 시간 및 투여량의 관련성은 입증되어 있다. 특히, 가수분해는 VIII 안티팩터의 IgG와 VIII 팩터는 환자의 혈장에서 나타나는 것으로 기대되는 것들보다 80 내지 9500배 낮은 몰비율로 항온처리되는 조건하에서 관찰되었다. 이는 가수분해가 생체내의 환자의 동종항체들에 의한 VIII 팩터의 불활성화 메카니즘이라는 것을 제안하는 것이다.

게다가, 출원인들은 [¹²⁵I]-VIII 팩터의 농도를 고정한 상태에서 표지되지 않은 VIII 팩터의 농도를 증가시켜 환자 Wal의 VIII 안티팩터의 IgG를 항온처리함으로써 VIII 팩터의 항체매개성 가수분해의 반응속도론을 조사하였다. 기질 농도의 역수와 속도의 역수간의 그래프는 직선(r=0.99)을 나타낸다. 이는 반응이 다클론성의 촉매성 항체들에서 이미 관찰된 것처럼, 단순 Michaelis-Menten 반응속도론을 따름을 제안하는 것이다. 표면상으로 보이는 촉매 활성, Vmax와 VIII 안티팩터 동종항체의 가수분해속도는 환자 Wal의 경우에서 계산하였다. 생체내에서 계산된 가수분해의 반응속도 매개변수로 보아 단백질분해는 생체내에서 환자들의 동종항체들에 의한 VIII 팩터의 불활성화 메카니즘일 것이다.

반 윌리브랜드 팩터(von Willebrand Factor, vWF)와 VIII 팩터의 결합은 VIII 팩터에 대한 트롬빈의 촉매율을 증가시키는 반면, 활성단백질 C(APC)에 의한 가수분해로부터 VIII 팩터를 보호한다. VIII 팩터에 vWF를 첨가한 결과, 분리된 vWF와 VIII 팩터가 정상 혈장에서 나타나는 것과 유사한 즉, vWF 30㎍/㎖/ VIII 팩터 300ng/㎖의 wt/wt 비율로 혼합될 때, VIII 안티팩터의 IgG에 의한 VIII 팩터의 가수분해를 36.9%정도로 부분적으로 억제하였다.

촉매성 항체로써 VIII 안티팩터 동종항체의 동정은 천식환자들에서 혈관작용 소장펩타이드(vasoactive intestinal peptide, VIP)에 가수분해 항체, SLE를 갖는 환자들에서 DNA-가수분해 항체들과 자가면역성 갑상선염 환자들에서 타이로글로불린-특이 촉매성 항체에 대한 이전 보고와 더불어 촉매성 면역 반응까지 확대된다. 이는 또한, 단백질 항원의 외부투여에 대한 반응으로 인간에서 촉매성 항체의 유도에 대한 출원인의 첫번째 보고서에 나타나 있다. 촉매적 특징들을 나타내는 VIII 안티팩터의 IgG에 의한 VIII 팩터의 가수분해의 반응속도론의 매개변수와 혈장에서 이들 항체들의 개산량은 생체내에서 VIII 팩터를 불활성화시키는 촉매적 면역반응에 대한 기능적 역할을 수행하리라는 것을 제안하고 있다. 그들의 기능적인 특징들이 다른 VIII 안티팩터 동종항체들의 다클론 혼합물내에서, 촉매성 항체들은 비촉매성 VIII 안티팩터의 항체들 보다 빠른 속도로 VIII 팩터의 응고제 활성을 억제할 것이다. 그리하여, 단백질분해성의 VIII 안티팩터의 항체에 대한 표적이 되는 중합체 에피톱(epitope)의 동정은 VIII 팩터의 억제제 반응의 병생리학에 대한 이해의 기준이 될 것이다. 향후, 부위-특이 프로테아제로써 VIII 팩터 억제제의 특징은 VIII 안티팩터 동종항체를 갖는 환자들의 치료에 대해 새로운 접근을 제공할 것이다.

본 발명의 다른 목적들, 특징들 및 그것의 장점들은 첨부된 도면에 의거하여 이하, 상세한 설명에서 보다 명확하게 이해될 것이나 VIII 안티팩터 동종항체에 의한 VIII 팩터의 절단 특이성을 포함하는 이들 실시예로 한정하는 것은 아니다.

도 1: 억제제를 갖는 혈우병 환자의 친화성-분리된 VIII안티팩터의 IgG 항체에 의한 [ ¹²⁵ I]-VIII 팩터의 가수분해

도 1(A):

[¹²⁵I]-표지된 VIII 팩터는 Bor(레인 Bor), Che(레인 Che) 및 Wal(레인 Wal) 환자들의 친화성-분리된 VIII 안티팩터의 IgG로 항온처리되거나, 혹은 38℃에서 10시간동안 완충액만을 넣어 항온처리한 후, SDS-PAGE 및 자가방사선촬영법을 실시하였다. 세명의 환자들중 두명(Bor 및 Wal)에서, 친화성-분리된 VIII 안티팩터의 IgG와 VIII 팩터를 항온처리한 결과, VIII 팩터의 가수분해가 일어났다. 대조적으로, [¹²⁵I]-표지된 VIII 팩터를 Che 환자(레인 Che)의 혈장으로부터 분리된 VIII 안티팩터의 IgG와 함께 항온처리했을 때 VIII 팩터의 이동상은 바뀌지 않았다. 또한, VIII 팩터의 이동상은 VIII 팩터에 대한 억제활성을 나타내지 않는 인간 단클론성 M061 항-다이고신 IgG(mAb) 또는 정상적인 분획되지않은 다클론성 인간 IgG(Sandoglobulin^ⓡ, IVIg)와 함께 항온처리시에도 바뀌지 않았다.

도 1(B):

친화성 컬럼의 유속-통과시 ELISA로 측정했을때 VIII 안티팩터의 항체가 없었으며, [¹²⁵I]-표지된 VIII 팩터는 가수분해되지 않았다.

도 1(C):

단백질 C에 대한 크로마토그래피 결과, Wal과 Bor 환자들의 친화성-분리된 VIII 안티팩터의 항체를 포함하는 산용출액(acid eluates)으로부터 IgG를 제거한 결과 VIII 팩터에 대한 그들의 가수분해 활성이 상실되었다.

도 2: VIII 안티팩터의 항체의 촉매적 활성의 크기 배재 크로마토그래피

도 2(A):

또한, 항체의 단백질분해 활성이 오염된 프로테아제때문일 가능성을 배재하기 위해, Wal 환자의 친화성-분리된 VIII 안티팩터의 항체를 8M 우레아로 처리하고나서 크기 배재 크로마토그래피를 실시하였다. 주(主) 피크는 ELISA를 통해 알려진 IgG에 해당하는 25번 분획에서 분리하였다. 가수분해 활성은 IgG 분획과 함께 용출되었고 그 활성은 IgG가 나타나지 않은 분획(예를 들어, 35번 분획)에서는 측정되지 않았다.

도 2(B):

주(主) 피크는 분획의 방사성-표지된 내용물의 SDS-PAGE 결과 알려진 IgG에 해당하는 25번 분획에서 분리하였다.

도 3: 억제제를 갖는 혈우병 환자들의 친화성-분리된 VIII 안티팩터의 항체에 의해 [ ¹²⁵ I]-표지된 VIII 팩터의 단배질분해의 투여량과 시간과의 연관성

Bor과 Wal 환자들의 VIII 안티팩터 동종항체들에 의한 VIII 팩터의 가수분해의 속도반응론. Wal 환자의 VIII 안티팩터의 IgG에 의한 [¹²⁵I]-표지된 VIII 팩터의 가수분해 속도는 Bor 환자의 VIII 안티팩터의 IgG에 의해 나타나는 것보다 빠르다. 이는 환자들의 촉매성 항체들이 다른 동력학적 특징들을 나타내거나 혹은 VIII 안티팩터의 항체간의 촉매성 항체들의 비율이 환자마다 다름을 제안하고 있다.

도 4: VIII 한랭팩터의 양이 증가할때 VIII 안티팩터의 IgG 항체들에 의한 [ ¹²⁵ I]-표지된 VIII 팩터의 가수분해

[¹²⁵I]-표지된 VIII 팩터의 농도를 고정시키고 표지되지 않은 VIII 팩터의 농도를 증가시키면서 Wal 환자의 VIII 안티팩터의 IgG를 항온처리한 결과 VIII 팩터의 항체-매개성 가수분해의 반응속도론. 표지되지 않은 VIII 팩터의 양을 증가시킨 결과, VIII 안티팩터의 IgG에 의한 [¹²⁵I]-표지된 VIII 팩터의 가수분해는 투여량 의존적 억제를 보였다. 사용된 VIII 팩터의 최고 농도(1.7μM)로도 VIII 팩터의 가수분해는 포화에 도달되지 않았다. 기질농도의 역수와 속도 역수간의 그래프는 직선을 나타냈다(r=0.99). 이는 다클론성 촉매적 자가 항체들에서 이미 관찰된 것처럼, 반응은 단순 Michaelis-menten 반응속도론을 따름을 제안하고 있다.

도 5: Wal 환자의 VIIII 안티팩터의 IgG의 촉매 활성의 억제

Wal 환자의 VIII 안티팩터 동종항체에 의한 방사성-표지된 VIII 팩터의 단백질분해는 항체와 VIII 팩터를 페파블럭(Pefablocⓡ, 독일 로쉐 다이아그노스틱스 게엠바하사에서 제조됨) 함께 항온처리했을 때 약 62%정도 억제되었다. 이는 어떤 촉매성 항체들의 촉매 활성을 중화시키기 위한 특정한 세린 프로테아제 억제제의 효과를 지적하는 것이다.

실시예 1: VIII 안티팩터의 항체의 친화성-분리

항체들은 암모늄 설페이트 침전을 이용하여 혈장으로부터 분리하였다. VIII 팩터와 반응하는 항체들은 면역정제된 상업용 인간 혈장에서 얻은 VIII 팩터가 결합된(25000 U/3g of gel) CNBr-활성화된 세팔로우즈 4B 매트릭스상에서 친화성-분리되었다. 컬럼 유속통과물을 수집하였다. pH7.4의 PBS로 충분히 세척한 후, VIII 안티팩터의 항체들을 pH2.8의 0.2M 글라이신으로 용출한 후 PBS로 투석하고 센트리프렙(Centriprep)으로 농축하였다. 유속통과물과 용출액을 앨리쿼트하고 사용하기전까지는 -20℃에서 보관하였다. VIII 안티팩터의 항체의 F(ab')₂프레그먼트는 상기에서 설명한대로 제조하였다.

Bor, Che 및 Wal 환자들의 경우, 컬럼에 넣은 VIII 안티팩터의 IgG의 농도는 각각 130, 20 및 280㎍/10mg of IgG이며 상기와 일치한다(즉, 143±130㎍/mI of 분획되지않은 혈장).

실시예 2: VIII 팩터의 중화활성

VIII 안티팩터의 항체의 활성을 중화하는 VIII 팩터는 Kasper et al.의 방법에 따라 측정되며 Bethesda 단위(BU)로 표시하였다. BU는 VIII 팩터의 응고제 활성을 50% 억제하는 IgG의 농도의 역수로 정의한다. 나머지 VIII 팩터의 활성은 VIII 팩터를 뺀 인간 혈장(베링사 제품)을 기질로, 인간 태반의 패스롬틴(pathromtinⓡ, 베링사)을 활성제로 사용하여 활성화된 부분트롬보플라스틴시간을 측정한 일주기 분석으로 측정하였다. 가열처리된 혈장 또는 실험에 사용되는 면역분리된 VIII 안티팩터의 IgG를 37℃에서 2시간동안 울혈된 시트르화된 인간 혈장과 함께 항온처리하였다. 4번 연속 희석한 대조군 혈장 울혈(Immuno AG, 비엔사)의 응고시간은 3번 연속 희석한 실험에 사용되는 각 샘플의 응고시간과 비교하였다. 희석은 Owren-Koller 완충액(Diagnostica Stago)을 사용하여 실시하였다. 분석시 오차범위는 1~2.5%였다.

Bor, Che 및 Wal 환자들의 친화성-분리된 VIII 안티팩터의 항체들은 VIII 팩터의 응고제 활성을 각각 57.0, 64.0 및 43.0 BU/mg of IgG로 억제하였다.

실시예 3: VIII 팩터의 가수분해 분석

상업용 인간 재조합 VIII 팩터를 요오드젠(iodogen) 방법을 사용하여 11.6nCi/㎍의 특이 활성을 갖도록 ¹²⁵I으로 표지하였다. [¹²⁵I]-VIII 팩터(1.5~150ng)는 17~1667nM의 면역분리된 VIII 안티팩터의 IgG를 함께 넣거나 혹은 단독으로 38℃에서 5분 내지 10시간동안, 50㎕의 50mM tris-HCl pH 7.7, 100mM 글라이신, 0.025% Tween-20 및 0.02% NaN₃에서 항온처리하였다. 인간 단클론성 항-다이고신 IgG M061(mAb) 및 정상상태의 분획되지않은 인간 다클론성 IgG(IVIg, 산도글로불린, Sandoglobulinⓡ)을 음성 대조군으로 사용하였다. 샘플들을 머캅토에탄올(mercaptoethanol)을 뺀 Laemmli's 완충액과 1:1로 혼합한 후, 레인(lane)당 각 샘플을 20㎕씩 부하시킨후, 끓이지않고 SDS 전기영동을 실시하였다. 25mA/gel에서 미니-프로테안 II 시스템(mini-PROTEAN II system)을 사용하여 선행 색소가 젤의 아래쪽에 도달할 때까지 실온에서 이동(migration)을 실시하였다. 그후, 젤을 건조시켜 S-OMAT AR를 사용하여 단백질 밴드가 나타나도록 하였다. 자가방사선촬영법을 실시하여, VIII 팩터 밴드는 VIII 안티팩터의 IgG에 의해 가수분해되어 200kDa 과 300kDa으로 일관되게 나타나며, 표지된 VIII 팩터의 가수분해율을 계산하기위해 스캐닝하였다.

실시예 4: 빠른 단백질 액체 크로마토그래피 젤 여과

8M 우레아가 처리된 Wal(740㎍) 환자의 VIII 안티팩터의 IgG 100㎕를 PBS-0.01%아자이드(azide)로 평형화시키고, 유속율이 일분당 0.2ml인 수퍼로우즈-12(superose-12) 컬럼상에서 젤 여과를 실시하였다. 500㎕의 분획물을 모은 후, 샌드위치 ELISA로 IgG의 유무 및 10배 희석후 VIII 팩터의 활성을 분석하였다. 25번 분획물의 단백질을 ¹²⁵I으로 방사성표지하여 비환원성 조건하에서 정상상태의 다클론성 인간 IgG와 함께 SDS-PAGE를 실시하였다. 젤을 쿠마시블루(Comassie Blue)로 염색한 후 자가방사선촬영법을 실시하였다; 두개의 상을 겹쳐놓는다. 주(主)피크는 방사성표지된 분획물들을 ELISA와 SDS-PAGE 실시한 결과에서 지적한 대로 IgG에 해당하는 25번 분획물에서 분리하였다. IgG 분획과 더불어 가수분해활성이 함께 용출되며, IgG가 나타나지않는 분획물(예를들어, 35번 분획)에서는 그 활성이 나타나지 않았다.

실시예 5: NH ₂ -말단 시퀀스의 분석

표지되지않은 인간 재조합 VIII 팩터의 수크로우즈 제조(rDNA-BHK)(300㎍, 캐나다 버클리의 베이어 주식회사의 옥토코 알파제품)시, 38℃에서 24시간동안 1500㎕의 50mM tris-HCl pH7.7, 100mM 글라이신, 0.025% Tween-20 및 0.02% NaN₃에서 Wal 환자의 VIII 안티팩터의 IgG(74㎍)를 처리하였다. 상기결과로 얻은 VIII 팩터의 프래그먼트는 하이본드-P PVDF 멤브레인(Hybond-P PVDF membrane, 영국 리틀찰폰트 아머샴사 제품)상에서 10mM CAPS, pH11.0의 10% 에탄올에서 50mA로 10% SDS-PAGE를 실시하였다. 쿠마시블루로 염색한 후, 나타나는 밴드를 절단하여 자동 단백질 마이크로시퀀서 프로사이즈 492 cLC(캐나다 포스터시의 PE-어플라이드 바이오시스템사 제품)를 사용하여 N-말단 시퀀싱을 실시하였다. 프래크먼트에 따라 시퀀스된 단백질양은 0.5 ~ 2pmoles이었다.

주로 잘려지는 밴드는 다음과 같다: VIII 팩터의 A1과 A2 도메인 사이에 위치한 Arg³⁷²-Ser³⁷³(R³⁷²-S³⁷³); A3 도메인의 N-말단에 위치한 Tyr¹⁶⁸⁰-Asp¹⁶⁸¹(Y¹⁶⁸⁰-D¹⁶⁸¹); 및 A3 도메인내에 위치한 Glu¹⁷⁹⁴-Asp¹⁷⁹⁵(E¹⁷⁹⁴-D¹⁷⁹⁵). VIII 안티팩터의 항체에 의한 VIII 팩터의 다중절단부위(multiple site cleavage)는 각각 단일절단부위 특이성을 나타내는 다특이 촉매 활성을 갖는 개개의 항체 또는 다클론성 항체군으로부터 유 래할 것이다.

아미노산 시퀀스	절단부위
Ser Val Ala Lys Lsys His Pro (SVAKKHP) Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu (DQRQGAE) Asp Glu Asp GLu Asn Gln Ser (DEDENQS)	Arg³⁷²-Ser³⁷³ (R³⁷²-S³⁷³) Glu¹⁷⁹⁴-Asp¹⁷⁹⁵ (E¹⁷⁹⁴-D¹⁷⁹⁵) Tyr¹⁶⁸⁰-Asp¹⁶⁸¹ (Y¹⁶⁸⁰-D¹⁶⁸¹)

실시예 6: 세린 프로테아제의 유전적 억제제인 페파블럭(Pefablocⓡ)를 이용한 억제 연구

페파블럭(Pefablocⓡ)를 사용함으로써 억제제를 갖게된 혈우병 환자의 친화성-분리된 VIII 안티팩터의 IgG 항체에 의한 [¹²⁵I]-VIII 팩터의 가수분해. [¹²⁵I]-VIII 팩터(150ng)를 50㎍/ml의 Wal 환자의 면역분리된 VIII 안티팩터의 IgG 와 함께 항온처리하거나 혹은 VIII 안티팩터의 IgG와 세린 프로테아제 억제제인 4mM 페파블럭(Pefablocⓡ, 베링어사)을 둘다 넣고 38℃에서 5시간동안 항온처리하였다. 그리고 나서, VIII 팩터를 비환원성 조건하에서 7.5% SDS-PAGE로 분석하였다. 자가방사선촬영후, VIII 안티팩터의 IgG에 의해 가수분해되어 200kDa과 300kDa의 밴드로 나타나는 VIII 팩터를 스캐닝하여 표지된 VIII 팩터의 가수분해를 퍼센트율로 계산하였다.

Wal 환자의 VIII 안티팩터 동종항체에 의한 방사성표지된 VIII 팩터의 단백질분해는 항체와 VIII 팩터를 페파블럭(Pefablocⓡ)과 함께 항온처리하였을 때 약 62%정도 억제되었다. 이는 어떤 촉매성 항체들의 촉매활성을 중화시키는데 있어 어떤 세린 프로테아제 억제제가 영향을 미치리라는 것을 지적하는 것이다.

앞으로의 관찰:

표적물질로써 ¹²⁵I-방사성표지된 VIII 팩터를 사용하여 혈우병을 앓고 있는 TEN 높은 응답자 환자들의 분리된 IgG를 스크리닝하였을 때, 6명의 환자들에게서 VIII 팩터의 이동상이 관찰되었다. 이러한 결과는 출원인의 이전의 관찰을 입증하는 것이며, 촉매성 VIII 안티팩터의 항체들이 환자의 약 60%에서 발견된다는 점을 말하는 것이다.

촉매적 특징들을 나타내는 VIII 안티팩터의 IgG에 의한 VIII 팩터의 가수분해의 반응속도론의 매개변수와 혈장에서 이들 항체들의 개산량은 생체내에서 VIII 팩터를 불활성화시키는 촉매적 면역반응에 대한 기능적 역할을 수행하리라는 것을 제안하고 있다. 그들의 기능적인 특징들이 다른 VIII 안티팩터 동종항체들의 다클론 혼합물내에서, 촉매성 항체들은 비촉매성 VIII 안티팩터의 항체들 보다 빠른 속도로 VIII 팩터의 응고제 활성을 억제할 것이다. 그리하여, 단백질분해성의 VIII 안티팩터의 항체에 대한 표적이 되는 중합체 에피톱(epitope)의 동정은 VIII 팩터의 억제제 반응의 병생리학에 대한 이해의 기준이 될 것이다. 향후, 부위-특이 프로테아제로써 VIII 팩터 억제제의 특징은 VIII 안티팩터 동종항체를 갖는 환자들의 치료에 대해 새로운 접근을 제공할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

i) 혈우병 환자로부터 얻은 혈액 샘플로부터 혈장을 분리하는 단계;

ii) 상기 혈장으로부터 VIII 안티팩터 동종항체를 분리하는 단계;

iii) 상기 VIII 안티팩터 동종항체와 VIII 팩터를 반응시켜 VIII 팩터의 가수분해를 유도하는 단계; 및

iv) 상기 VIII 팩터의 분해 정도를 측정하는 단계로 구성됨을 특징으로 하는 인간의 혈장에서 VIII 팩터를 분해할 수 있는 VIII 안티팩터 동종항체를 측정하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 ii)에서, VIII 안티팩터 동종항체는 VIII 팩터와 그들을 함께 혼합함으로써 상기 혈장으로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 인간의 혈장에서 VIII 팩터를 분해할 수 있는 VIII 안티팩터 동종항체를 측정하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 ii)에서, VIII 안티팩터 동종항체는 친화성 크로마토그래피에 의해 분리되는 것을 특징으로 하는 인간의 혈장에서 VIII 팩터를 분해할 수 있는 VIII 안티팩터 동종항체를 측정하는 방법.
제3항에 있어서, 단계 ii)에서, 상기 친화성 크로마토그래피는 시아노겐 브로마이드(cyanogen bromide)에 의해 활성화되는 세팔로우즈 매트릭스(Sepharose matrix)와 공유적으로 결합하는 VIII 팩터를 사용하는 것을 특징으로 하는 인간의 혈장에서 VIII 팩터를 분해할 수 있는 VIII 안티팩터 동종항체를 측정하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 iii)에서, VIII 팩터는 ¹²⁵I의 방사성 표지자(labelling agent)로 표지되는 것을 특징으로 하는 인간의 혈장에서 VIII 팩터를 분해할 수 있는 VIII 안티팩터 동종항체를 측정하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 iii)에서, VIII 팩터는 15~40℃에서 0.5~30시간 동안 VIII 안티팩터 동종항체와 반응하는 것을 특징으로 하는 인간의 혈장에서 VIII 팩터를 분해할 수 있는 VIII 안티팩터 동종항체를 측정하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 iv)의 측정방법은 SDS-PAGE 혹은 패스트 프로테인 리퀴드 크로마토그래피(fast protein liquid chromatography) 및 자가방사선촬영법에 의해 실시됨을 특징으로 하는 인간의 혈장에서 VIII 팩터를 분해할 수 있는 VIII 안티팩터 동종항체를 측정하는 방법.
제1항에 있어서, VIII 안티팩터 동종항체에 의해 분해되는 VIII 팩터의 부위(site)를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 인간의 혈장에서 VIII 팩터를 분해할 수 있는 VIII 안티팩터 동종항체를 측정하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 결정단계는 VIII 안티팩터 동종항체와 VIII 팩터를 반응시키고 분리한 다음, 그로부터 얻은 VIII 팩터의 프래그먼트를 시퀀싱하여 실시되는 것을 특징으로 하는 인간의 혈장에서 VIII 팩터를 분해할 수 있는 VIII 안티팩터 동종항체를 측정하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 분리는 SDS-PAGE를 이용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 인간의 혈장에서 VIII 팩터를 분해할 수 있는 VIII 안티팩터 동종항체를 측정하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 시퀀싱은 자동 단백질 마이크로시퀀서를 이용한 N-말단 시퀀싱을 통해 실시하는 것을 특징으로 하는 인간의 혈장에서 VIII 팩터를 분해할 수 있는 VIII 안티팩터 동종항체를 측정하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 시퀀싱은 VIII 팩터의 A1과 A2 도메인 사이에 위치한 Arg³⁷²-Ser³⁷³(R³⁷²-S³⁷³); A3 도메인의 N-말단에 위치한 Tyr¹⁶⁸⁰-Asp¹⁶⁸¹(Y¹⁶⁸⁰-D¹⁶⁸¹); 및 A3 도메인 내에 위치한 Glu¹⁷⁹⁴-Asp¹⁷⁹⁵(E¹⁷⁹⁴-D¹⁷⁹⁵)의 분리가 용이한 결합을 시퀀싱함을 특징으로 하는 인간의 혈장에서 VIII 팩터를 분해할 수 있는 VIII 안티팩터 동종항체를 측정하는 방법.
삭제
삭제
삭제
삭제
VIII 팩터 분자의 A1과 A2 도메인 사이에 위치한 Arg³⁷²-Ser³⁷³; A3 도메인의 N-말단에 위치한 Tyr¹⁶⁸⁰-Asp¹⁶⁸¹; 및 A3 도메인내에 위치한 Glu¹⁷⁹⁴-Asp¹⁷⁹⁵의 분리가 용이한 결합의 분해를 억제하여 VIII 안티팩터 동종항체에 의한 VIII 팩터의 분해를 억제하는 프로테아제 억제제를 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 VIII 안티팩터 동종항체의 활성 중화용 조성물.
제17항에 있어서, 상기 프로테아제 억제제는 4-(2-아미노에틸)벤젠설포닐 플루오라이드 하이드로클로라이드(4-(2-aminoethyl)benzenesulphonyl fluoride hydrochloride)임을 특징으로 VIII 안티팩터 동종항체의 활성 중화용 조성물.
삭제
VIII 안티팩터 동종항체에 의한 VIII 팩터의 분해를 억제하는 서열목록 서열번호 1의 아미노산 서열로 된 펩티드를 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 VIII 안티팩터 동종항체의 활성 중화용 조성물.
VIII 안티팩터 동종항체에 의한 VIII 팩터의 분해를 억제하는 서열목록 서열번호 2의 아미노산 서열로 된 펩티드를 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 VIII 안티팩터 동종항체의 활성 중화용 조성물.
VIII 안티팩터 동종항체에 의한 VIII 팩터의 분해를 억제하는 서열목록 서열번호 3의 아미노산 서열로 된 펩티드를 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 VIII 안티팩터 동종항체의 활성 중화용 조성물.
삭제
제1항의 방법에 의해 분리되고, VIII 팩터 분자의 A1과 A2 도메인 사이에 위치한 Arg³⁷²-Ser³⁷³; A3 도메인의 N-말단에 위치한 Tyr¹⁶⁸⁰-Asp¹⁶⁸¹; 및 A3 도메인내에 위치한 Glu¹⁷⁹⁴-Asp¹⁷⁹⁵을 분해하여 7.5% SDS-PAGE 전기영동 결과 VIII 팩터는 200kDa와 300kDa의 밴드로 나타나고, 친화성 크로마토그래피의 결과 분획 25번에서 검출되며, 서열목록 서열번호 1, 2 또는 3의 서열로 된 펩티드 중 어느 하나에 의해 VIII 팩터에 대한 분해 활성이 억제되는 VIII 안티팩터 동종항체를 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 혈전증 치료용 약학적 조성물.
삭제
삭제
삭제
VIII 팩터 분자의 A1과 A2 도메인 사이에 위치한 Arg³⁷²-Ser³⁷³; A3 도메인의 N-말단에 위치한 Tyr¹⁶⁸⁰-Asp¹⁶⁸¹; 및 A3 도메인내에 위치한 Glu¹⁷⁹⁴-Asp¹⁷⁹⁵의 분리가 용이한 결합의 분해를 억제하여 VIII 안티팩터 동종항체에 의한 VIII 팩터의 분해를 억제하는 프로테아제 억제제를 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 혈우병 A 치료용 약학적 조성물.
제28항에 있어서, 상기 프로테아제 억제제는 4-(2-아미노에틸)벤젠설포닐 플루오라이드 하이드로클로라이드임을 특징으로 하는 혈우병 A 치료용 약학적 조성물.
삭제
VIII 안티팩터 동종항체에 의한 VIII 팩터의 분해를 억제하는 서열목록 서열번호 1의 아미노산 서열로 된 펩티드를 유효성분으로 함유하는 혈우병 A 치료용 약학적 조성물.
VIII 안티팩터 동종항체에 의한 VIII 팩터의 분해를 억제하는 서열목록 서열번호 2의 아미노산 서열로 된 펩티드를 유효성분으로 함유하는 혈우병 A 치료용 약학적 조성물.
VIII 안티팩터 동종항체에 의한 VIII 팩터의 분해를 억제하는 서열목록 서열번호 3의 아미노산 서열로 된 펩티드를 유효성분으로 함유하는 혈우병 A 치료용 약학적 조성물.
삭제
서열목록 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 VIII 안티팩터 동종항체에 의한 VIII 팩터의 분해를 억제하는 억제제.
서열목록 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 VIII 안티팩터 동종항체에 의한 VIII 팩터의 분해를 억제하는 억제제.
서열목록 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 VIII 안티팩터 동종항체에 의한 VIII 팩터의 분해를 억제하는 억제제.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
제1항의 방법에 의해 분리되고, VIII 팩터 분자의 A1과 A2 도메인 사이에 위치한 Arg³⁷²-Ser³⁷³; A3 도메인의 N-말단에 위치한 Tyr¹⁶⁸⁰-Asp¹⁶⁸¹; 및 A3 도메인내에 위치한 Glu¹⁷⁹⁴-Asp¹⁷⁹⁵을 분해하여 7.5% SDS-PAGE 전기영동 결과 VIII 팩터는 200kDa와 300kDa의 밴드로 나타나고, 친화성 크로마토그래피의 결과 분획 25번에서 검출되며, 서열목록 서열번호 1, 2 또는 3의 서열로 된 펩티드 중 어느 하나에 의해 VIII 팩터에 대한 분해 활성이 억제됨을 특징으로 하는 VIII 안티팩터 동종항체.
삭제
삭제