JP2003505434A - 触媒活性抗ｖｉｉｉ因子アロ抗体 - Google Patents

触媒活性抗ｖｉｉｉ因子アロ抗体

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JP2003505434A JP2001512295A JP2001512295A JP2003505434A JP 2003505434 A JP2003505434 A JP 2003505434A JP 2001512295 A JP2001512295 A JP 2001512295A JP 2001512295 A JP2001512295 A JP 2001512295A JP 2003505434 A JP2003505434 A JP 2003505434A
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カヴェリ スリニヴァ
ラクロワ−デスマゼ セバスチャン
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アンスティテュート ナシオナル ド ラ サント エ ド ラ ルシェルシュ メディカル （アンセルム）
バイエル ファルマ
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、哺乳動物において、ＶＩＩＩ因子を分解することができる触媒活性抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体の存在を測定する方法及び上記触媒活性抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体による上記ＶＩＩＩ因子分子の切断の部位を特定する方法に関する。本発明はまた、抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体が触媒するＶＩＩＩ因子分解の阻害剤；上記測定方法から生じる、ＶＩＩＩ因子を分解することができる上記触媒活性抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体を含む医薬組成物；及び、更に上記抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体が触媒するＶＩＩＩ因子分解の阻害剤を含む医薬組成物に関する。最後に、本発明は、上記抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体が触媒するＶＩＩＩ因子分解の阻害剤、上記測定方法から生じる、ＶＩＩＩ因子を分解することができる上記触媒活性抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体を含む医薬組成物、及び、上記抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体が触媒するＶＩＩＩ因子分解の阻害剤を含む医薬組成物の治療への適用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の属する分野 本発明は、哺乳動物において、ＶＩＩＩ因子を分解することができる触媒活性抗
ＶＩＩＩ因子アロ抗体の存在を測定する方法及び上記触媒活性抗ＶＩＩＩ因子ア
ロ抗体による上記ＶＩＩＩ因子分子の切断の部位を特定する方法に関する。
【０００２】 本発明はまた、抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体が触媒するＶＩＩＩ因子分解の阻害剤に
関する。
【０００３】 更に、本発明は、上記測定方法から生じる、ＶＩＩＩ因子を分解することができ
る上記触媒活性抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体を含む医薬組成物、及び、上記抗ＶＩＩ
Ｉ因子アロ抗体が触媒するＶＩＩＩ因子分解の阻害剤を含む医薬組成物に関する
。
【０００４】 最後に、本発明は、上記抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体が触媒するＶＩＩＩ因子分解の
阻害剤、上記測定方法から生じる、ＶＩＩＩ因子を分解することができる上記触
媒活性抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体を含む医薬組成物、及び、上記抗ＶＩＩＩ因子ア
ロ抗体が触媒するＶＩＩＩ因子分解の阻害剤を含む医薬組成物の治療への適用に
関する。
【０００５】発明の背景 血友病Ａは、Ｘ染色体に関する劣性異常で、その結果、ＶＩＩＩ因子の欠陥又は
欠失となり、その重度の形態では生命を脅かす有害な出血性の疾患である。
【０００６】 重度の血友病Ａの患者に相同のＶＩＩＩ因子を注入すると、２５％のケースでは
、抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体が出現する（Ｅｈｒｅｎｆｏｒｔｈ，Ｓ．，Ｋｒｅｕ
ｚ，Ｗ．，Ｓｃｈａｒｒｅｒ，Ｉ．，Ｌｉｎｄｅ，Ｒ．，Ｆｕｎｋ，Ｍ．，Ｇｕ
ｎｇｏｒ，Ｔ．，Ｋｒａｃｋｈａｒｄｔ．Ｂ．及びＫｏｒｎｈｕｂｅｒ，Ｂ．，
＜＜Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｆａｃｔｏｒ
ＶＩＩＩ ａｎｄ ｆａｃｔｏｒ ＩＸ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｉｎ ｈａ
ｅｍｏｐｈｉｌｉａｃｓ＞＞，Ｌａｎｃｅｔ，１９９２，３３９：５９４−５９
８）結果となるが、これは、ＶＩＩＩ因子と安定化分子（Ｓａｅｎｋｏ，Ｅ．Ｌ
．，Ｓｈｉｍａ，Ｍ．，Ｒａｊａｌａｋｓｈｍｉ，Ｋ．Ｊ．及びＳｃａｎｄｅｌ
ｌａ，Ｄ．，＜＜Ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃ２ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ
ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂ
ｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ＞＞，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９４，２６９：
１１６０１−１１６０５；並びにＳａｅｎｋｏ，Ｅ．Ｌ．，Ｓｈｉｍａ，Ｍ．，
Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｇ．Ｅ．，及びＳｃａｎｄｅｌｌａ，Ｄ．，＜＜Ｓｌｏｗｅｄ
ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｔｈｒｏｍｂｉｎ−ｃｌｅａｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ
ＶＩＩＩ ｆｒｏｍ ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ ｂｙ ａ
ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｄ ａ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｓ
ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｉｎ
ｈｉｂｉｔｉｏｎ＞＞，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，２７１：２７４
２４−２７４３１）、又は、その活性に必須の分子（Ａｒａｉ，Ｍ．，Ｓｃａｎ
ｄｅｌｌａ，Ｄ．，及びＨｏｙｅｒ，Ｌ．Ｗ．，＜＜Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａ
ｓｉｓ ｏｆ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｂｙ ｈｕｍ
ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｂｉｎｄ ｔ
ｏ ｔｈｅ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｐｒｅｖｅｎ
ｔ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｗｉｔ
ｈ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ＞＞，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９８９
，８３：１９７８−１９８４；並びにＺｈｏｎｇ，Ｄ．，Ｓａｅｎｋｏ，Ｅ．Ｌ
．，Ｓｈｉｍａ，Ｍ．，Ｆｅｌｃｈ，Ｍ．及びＳｃａｎｄｅｌｌａ，Ｄ．，＜＜
Ｓｏｍｅ ｈｕｍａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎｔｅ
ｒｆｅｒｅ ｗｉｔｈ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ Ｆａ
ｃｔｏｒ ＩＸ＞＞，Ｂｌｏｏｄ，１９９８，９２：１３６−１４２）、又は、
活性化分子（Ｌｕｂａｈｎ，Ｂ．Ｃ．，Ｗａｒｅ，Ｊ．，Ｓｔａｆｆｏｒｄ，Ｄ
．Ｗ．，及びＲｅｉｓｅｒ，Ｈ．Ｍ．，＜＜Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏ
ｆ ａ ＦＶＩＩＩ ｅｐｉｔｏｐｅ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ ａ ｈｕ
ｍａｎ ｈｅｍｏｐｈｉｌｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ＞＞，Ｂｌｏｏｄ，１９８
９，７３：４９７−４９９；並びにＮｅｕｅｎｓｃｈｗａｎｄｅｒ，Ｐ．Ｆ．，
及びＪｅｓｔｙ，Ｊ．，＜＜Ｔｈｒｏｍｂｉｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ａｎｄ
ｆａｃｔｏｒ Ｘａ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ
Ｉ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｃｏｆａｃｔｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａ
ｎｄ ｄｅｃａｙ ｒａｔｅ＞＞，Ａｒｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．
，１９９２，２９６：４２６−４３４）のいずれかとの相互作用を立体的に妨害
することにより、ＶＩＩＩ因子の凝血促進活性を阻害する。
【０００７】発明の要約 本出願人らは、重度の血友病Ａ高応答患者２人のアロ抗体によりＶＩＩＩ因子が
分解されることを全く驚くべき方法で発見し、これまで知られていなかった、Ｖ
ＩＩＩ因子阻害剤がＶＩＩＩ因子の凝血促進作用を妨害するメカニズムを明らか
にした。
【０００８】 本出願人による触媒活性抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体の発見は、患者をＶＩＩＩ因子
で治療する際に誘導された触媒活性抗体の出現に関して、その知見の限り最初の
報告である。触媒的加水分解（＜＜タンパク質分解＞＞）によりＶＩＩＩ因子分
子を実際には不活性にする抗体がＶＩＩＩ因子の存在下で生成することは、今ま
でとても驚くべき、非常識又は信じられないとさえ考えられていた。しかし、現
在まで報告されている触媒活性抗体は、全て疾患の進行の過程又は生理的条件下
で発見されている自己抗体である。つまり、誘導された抗体はアロ抗体と呼ばれ
、その由来は、全ての自己免疫疾患での自己抗体の由来とは明らかに異なる。
【０００９】 患者のうちの１人の抗ＶＩＩＩ因子抗体の反応での平均Ｋｍ及び見かけのＶｍａ
ｘはそれぞれ、９．４６±５．６２μＭ、及び、８５±６０ｆｍｏｌ．ｍｉｎ− １ と計算された。ＶＩＩＩ因子加水分解の動力学的パラメーターは、生体内での
ＶＩＩＩ因子の不活性化における触媒による免疫応答への機能的役割を示唆して
いる。
【００１０】 つまり、抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体を部位特異的プロテアーゼと特定することは、
抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体を持つ患者の疾患の治療に新しいアプローチを提供する
。
【００１１】 つまり、第一の側面によると本発明は： ｉ） 哺乳動物から採取した血液サンプルから血漿を単離し、 ｉｉ） 上記血漿から抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体を単離し； ｉｉｉ） 上記抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体によりＶＩＩＩ因子の分解が全て起こる
のに充分な期間、上記抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体を上記ＶＩＩＩ因子と接触させ； ｉｖ） 上記期間の後、上記ＶＩＩＩ因子が上記抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体によ
り効率的に分解されたかどうかを測定することを特徴とする、 上記哺乳動物において、ＶＩＩＩ因子を分解することができる触媒活性抗ＶＩＩ
Ｉ因子アロ抗体の存在を測定する方法を提供する。
【００１２】 本発明の方法の工程ｉｉ）の形態によると、上記抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体は、好
ましくはマトリックスと結合した上記ＶＩＩＩ因子と上記血漿を混合することに
より血漿から単離される。工程ｉｉ）において、上記抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体は
、アフィニティークロマトグラフィーにより有利に単離される。工程ｉｉ）にお
いて、上記アフィニティークロマトグラフィーは、好ましくはセファロース（登
録商標）マトリックスを使用し、臭化シアンにより活性化されていることが好ま
しい。
【００１３】 本発明の方法の工程ｉｉｉ）の形態によると、上記ＶＩＩＩ因子は、特にＩ１２ ５ のような、好ましくは放射性ラベリング剤といったラベリング剤によりラベル
されている。工程ｉｉｉ）において、約０．５〜約３０時間の間、好ましくは約
１０時間、約１５〜約４０℃の温度、好ましくは３８℃で上記ＶＩＩＩ因子を抗
ＶＩＩＩ因子アロ抗体と好適に接触させる。
【００１４】 本発明の方法の工程ｉｖ）の形態によると、上記ＶＩＩＩ因子が上記抗ＶＩＩＩ
因子アロ抗体により効率的に分解されたかどうかの測定は、特にＳＤＳＰＡＧＥ
のようなゲル電気泳動、又は、特にファストプロテインリキッドクロマトグラフ
ィーゲル濾過のようなゲル濾過といった分離技術、及び、特にオートラジオグラ
フィーのような視覚化技術を含む測定により行われる。
【００１５】 本発明の方法のさらなる形態によると、上記方法は更に： ｖ） 上記抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体により切断された上記ＶＩＩＩ因子分子の
部位を特定する ことを含むことを特徴とする。
【００１６】 本発明の方法の工程ｖ）の形態によると、上記特定は、上記ＶＩＩＩ因子を、Ｖ
ＩＩＩ因子を分解することができる上記抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体と接触させ、分
離した後、そこから得られたＶＩＩＩ因子のフラグメントをシークエンスするこ
とにより行われる。上記分離は、特にＳＤＳＰＡＧＥのようなゲル電気泳動、又
は、ゲル濾過といった技術を用いて好適に行われる。上記シークエンシングは、
特に自動プロテインマイクロシークエンサーを用いるようなＮ末端シークエンシ
ングといった技術を用いて好適に行われる。上記シークエンシングを用いること
により、以下の切断しやすい結合の位置を示す：ＶＩＩＩ因子分子のＡ１及びＡ
２ドメインの間にあるＡｒｇ３７２−Ｓｅｒ３７３、Ａ３ドメインのＮ末端にあ
るＴｙｒ１６８０−Ａｓｐ１６８１、及び、Ａ３ドメイン中にあるＧｌｕ１７９ ４ −Ａｓｐ１７９５。
【００１７】 よって、第二の側面によると本発明は、アミノ酸配列： Ｓｅｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｐｒｏ； アミノ酸配列： Ａｓｐ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｓｅｒ；及び アミノ酸配列： Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｕ を提供する。
【００１８】 本発明はまた、抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体により分解されやすいＶＩＩＩ因子分子
中の全ての部位を阻害することができる、ＶＩＩＩ因子の種々の配列の変形若し
くはアナログにも及ぶ。本発明のコンテクストの中で、そのような変形は、例え
ば抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体により分解されやすいＶＩＩＩ因子分子中の全ての部
位を阻害する上述したアミノ酸配列のペプチド又は非ペプチドアナログである。
そのような変形は、抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体により分解されやすいＶＩＩＩ因子
分子中の全ての部位を阻害する変形であれば、例えばＮ末端、Ｃ末端又は両端に
おいて数アミノ酸短い、若しくは、数アミノ酸長い（このような変形は、化学合
成又は自然に存在する分子を酵素により分解することにより得ることができる）
配列の変形のいずれかでありうる。
【００１９】 よって、第三の側面によると本発明は、抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体が触媒するＶＩ
ＩＩ因子分解の阻害剤を提供する。この阻害剤は、プロテアーゼインヒビターを
含むことを有利な特徴とする。本発明のコンテクストの中で、抗ＶＩＩＩ因子ア
ロ抗体が触媒するＶＩＩＩ因子分解の阻害剤として使用しうるプロテアーゼイン
ヒビターの例は、これらに限定されないが、例えばＤＦＰのようなフルオロホス
フェート型阻害剤、若しくは、例えばＰＭＳＦ又はＡＥＢＳＦ（塩酸４−（２−
アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオライド（特にＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎ
ｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ＧｅｒｍａｎｙによりＰｅｆａｂ
ｌｏｃ（登録商標）の登録商標で販売））のようなスルホニルフルオライド型阻
害剤である。具体的には、この阻害剤は、上記阻害剤が：ＶＩＩＩ因子分子のＡ
１ドメインの間にあるＡｒｇ３７２−Ｓｅｒ３７３、Ａ３ドメインのＮ末端にあ
るＴｙｒ１６８０−Ａｓｐ１６８１、及び、Ａ３ドメイン中にあるＧｌｕ１７９ ４ −Ａｓｐ１７９５の切断しやすい結合の切断を阻害することを特徴とする。さ
らに好ましくは、この阻害剤はアミノ酸配列： Ｓｅｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｐｒｏ； のペプチド又は非ペプチドアナログ、 アミノ酸配列： Ａｓｐ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｓｅｒ； のペプチド又は非ペプチドアナログ、若しくは、 アミノ酸配列： Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｕ のペプチド又は非ペプチドアナログを含むことを特徴とする。
【００２０】 上記で定義したようなＶＩＩＩ因子分解の阻害剤は、それらの付加塩、特にそれ
らの医薬上許容される付加塩と同様に、それらが抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体に対し
て中和活性を持つという非常に価値のある薬学的な側面を持つ。
【００２１】 これらの性質はそれらを治療に適用することを正当化し、本発明は更に薬剤の手
段によって、それらの付加塩、特にそれらの医薬上許容される付加塩と同様に、
上記ＶＩＩＩ因子分解の阻害剤に関する。
【００２２】 よって、それらはとりわけ血友病性疾患、具体的にはＶＩＩＩ因子が不十分なこ
とによる凝血欠陥を伴う疾患の治療に特に示される。
【００２３】 それらの使用の例としては、一方では、例えば軽度又は重度の血友病Ａのような
疾患の高応答患者（これらの患者に触媒活性抗体が見られる場合）、及び／又は
、他方では、例えば自己免疫疾患を患う患者の治療が挙げられる。
【００２４】 よって、第四の主要な側面によると本発明は、上述したように、特に上述した方
法から得られる、ＶＩＩＩ因子を分解することができる少なくとも一つの抗ＶＩ
ＩＩ因子アロ抗体、若しくは、医薬上許容される賦形剤、基材又は担体に配合さ
れたその医薬上許容される付加塩の一つを医薬上有効量含むことを特徴とする医
薬組成物をもって、長年感じられてきた必要性への解決を提供する。
【００２５】 更に、第五の主要な側面によると本発明は、上述したように、ＶＩＩＩ因子を分
解することができる少なくとも一つの抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体、若しくは、医薬
上許容される賦形剤、基材又は担体に配合されたその医薬上許容される付加塩の
一つを医薬上有効量含むことを特徴とする医薬組成物を提供する。
【００２６】 これらの組成物は、例えば頬、直腸、非経口、経皮、目、鼻又は耳の経路から投
与されうる。
【００２７】 これらの組成物は固体又は液体であり、例えば純粋な又は被覆された錠剤、ゼラ
チンカプセル、粉末、坐剤、注射できる製剤、経皮系、点眼剤、エアゾール及び
スプレー、並びに、点耳剤のような通常ヒトの薬に使用される医薬上の形状で存
在しうる。これらは通常の方法で調製される。少なくとも一つの上述したような
ＶＩＩＩ因子分解の阻害剤、又は、その医薬上許容される付加塩の一つの医薬上
有効量を構成する有効成分は、タルク、アラビアゴム、ラクトース、デンプン、
ステアリン酸マグネシウム、ポリビドン、セルロース派生物、カカオバター、半
合成グリセリド、水性又は非水性基材、動物又は植物由来の脂肪、グリコール、
各種の湿潤剤、分散剤又は乳化剤、シリコーンゲル、特定の重合体又は共重合体
、防腐剤、風味及び色のような通常医薬組成物に使用される賦形剤と共にその中
に混合されうる。好ましい医薬上の形状は、注射できる形状である。
【００２８】 本発明は、中和活性を持つ医薬組成物も包含し、これは抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体
を生産する血友病Ａのような疾患；特に抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体を持つ自己免疫
疾患（これらの患者に触媒活性抗体が見られる場合）の有利な治療に特に使用で
き、上記の組成物は、少なくとも一つの上記ＶＩＩＩ因子分解の阻害剤、若しく
は、医薬上許容される賦形剤、基材又は担体に配合されたその医薬上許容される
付加塩の一つを医薬上有効量含むことを特徴とする。
【００２９】 本発明はまた、少なくとも一つの上述したＶＩＩＩ因子分解の阻害剤、又は、そ
の医薬上許容される付加塩の一つを医薬上有効量哺乳動物に投与することを特徴
とする、その血液中のＶＩＩＩ因子水準による疾患を患う上記哺乳動物の治療方
法を包含する。
【００３０】 この方法は、特にその血液中のＶＩＩＩ因子が欠失することによる疾患のような
血友病性疾患の有利な治療を特に提供する。
【００３１】 本発明はまた、抗トロンビン活性を持つ医薬組成物を包含し、これは特に血栓症
のような疾患の有利な治療に特に使用しうる。上記組成物は、特に上述した方法
で得られる、ＶＩＩＩ因子を分解することができる少なくとも一つの抗ＶＩＩＩ
因子アロ抗体、若しくは、医薬上許容される賦形剤、基材又は担体に配合された
その医薬上許容される付加塩の一つを医薬上有効量含むことを特徴とする。
【００３２】 本発明はまた、少なくとも一つの上述したような抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体、又は
、その医薬上許容される付加塩の一つを治療上有効量哺乳動物に投与する事を特
徴とする上記哺乳動物の治療方法を包含する。
【００３３】 この方法は、特にその血液中にＶＩＩＩ因子が過剰に存在することによる上記疾
患のような血栓性疾患の有利な治療を特に提供する。
【００３４】 ヒト及び動物の治療には、上述した抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体又はＶＩＩＩ因子分
解の阻害剤を単独、又は、生理学上許容される賦形剤と共に、特にゼラチンカプ
セル又は錠剤の形状のような経口、又は、注射できる溶液の形状の非経口のどの
ような形状でも投与しうる。坐剤、軟膏、クリーム、ゲル又はエアゾール製剤の
ような他の投与の形状を考えてもよい。
【００３５】 本発明のコンテクストの中で、以下の用語を使用する： ＜＜触媒活性抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体＞＞は、ＶＩＩＩ因子の治療上の製剤を注
入する際に血友病Ａ患者で誘導される、触媒活性を賦与されたＶＩＩＩ因子に対
する抗体を意味するものと解する； ＜＜ＶＩＩＩ因子＞＞は、血液凝固プロセス中で、Ｘ因子の酵素的切断における
ＩＸ因子の補酵素を意味するものと解する； ＜＜ＶＩＩＩ因子の分解＞＞は、自発的な加水分解、又は、生理的な切断酵素、
すなわちトロンビン、活性化ＩＸ因子、活性化Ｘ因子及び活性化プロテインＣに
よる加水分解によって出現しないＶＩＩＩ因子からのフラグメントの生成を意味
するものと解する； ＜＜抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体が触媒するＶＩＩＩ因子分解の阻害剤＞＞は、抗Ｖ
ＩＩＩ因子触媒活性抗体の加水分解活性を特異的に中和することができる、ＶＩ
ＩＩ因子配列に属する又は属さないペプチド、若しくは、プロテアーゼインヒビ
ターの全てを意味するものと解する；
【００３６】 本発明の好ましい形態の説明 ヒトリコンビナントＶＩＩＩ因子を１２５Ｉで放射性ラベルした。抗ＶＩＩＩ因
子アロ抗体は、阻害剤を持つ３人の血友病患者の血漿から、免疫精製したヒトＶ
ＩＩＩ因子を結合したセファロース（登録商標）マトリックスを用いてアフィニ
ティー精製した。患者Ｂｏｒ、Ｃｈｅ及びＷａｌのアフィニティー精製した抗Ｖ
ＩＩＩ因子抗体は、ＶＩＩＩ因子の凝血促進活性をそれぞれ５７．０、６４．０
及び４３．０ＢＵ／ｍｇ−ＩｇＧまで阻害した。
【００３７】 ラベルしたＶＩＩＩ因子を抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体と共にインキュベーションし
た結果、３人の患者のうち２人の場合、分子のタンパク質分解が起きた。ＩｇＧ
アイソタイプの抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体の部位に結合する抗体での加水分解の特
異性が示された。アプロチニン（０．１５μＭ）、Ｅ−６４（２８μＭ）、ＥＤ
ＴＡ（１．３μＭ）、ロイペプチン（１０μＭ）及びペプスタチン（１０μＭ）
のプロテアーゼインヒビターの存在下で、［１２５Ｉ］−ＶＩＩＩ因子を患者Ｂ
ｏｒ及びＷａｌのアフィニティー精製した抗ＶＩＩＩ因子ＩｇＧと共にインキュ
ベーションした結果、タンパク質分解活性は阻害されなかった。
【００３８】 本出願人らは、ＶＩＩＩ因子分子中の触媒活性ＩｇＧによる主要な切断部位を以
下のように特定した：Ａ１及びＡ２ドメインの間にあるＡｒｇ３７２−Ｓｅｒ３ ７３ 、Ａ３ドメインのＮ末端にあるＴｙｒ１６８０−Ａｓｐ１６８１、及び、Ａ
３ドメイン中にあるＧｌｕ１７９４−Ａｓｐ１７９５。
【００３９】 抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体によるＶＩＩＩ因子の加水分解の時間及び量依存性が示
された。特に、患者の血漿中に存在すると考えられるモル比より８０〜９５００
倍低いモル比で、抗ＶＩＩＩ因子ＩｇＧをＶＩＩＩ因子と共にインキュベーショ
ンする条件下で加水分解が観察され、加水分解は、生体内での患者のアロ抗体に
よるＶＩＩＩ因子不活性化のメカニズムであることが示唆された。
【００４０】 本出願人らは更に、一定濃度の［１２５Ｉ］−ＶＩＩＩ因子の存在下で、ラベル
していないＶＩＩＩ因子の濃度を増加させながら、患者Ｗａｌの抗ＶＩＩＩ因子
ＩｇＧを共にインキュベーションすることにより、抗体が仲介するＶＩＩＩ因子
の加水分解の動力学を研究した。速度の逆数を基質濃度の逆数と相関してプロッ
トしたカーブは直線（ｒ＝０．９９）であった事から、すでにポリクローナル触
媒活性自己抗体で観察されているように、反応は単純なＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍ
ｅｎｔｅｎ動力学と一致する事が示唆された。見かけの触媒効率、Ｖｍａｘ及び
抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体の加水分解速度を、患者Ｗａｌの場合について計算した
。加水分解の動力学的パラメーターを生体外で計算し、タンパク質分解は、生体
内での患者のアロ抗体によるＶＩＩＩ因子不活性化のメカニズムであると考えら
れる事が示唆された。
【００４１】 ＶＩＩＩ因子がｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（ｖＷＦ）と結合すると、Ｖ
ＩＩＩ因子に対するトロンビンの触媒速度が増加するが、それは活性化プロテイ
ンＣ（ＡＰＣ）による加水分解からＶＩＩＩ因子を保護する。ｖＷＦをＶＩＩＩ
因子に添加した結果、正常な血漿中に存在するのと同様の重量／重量比を用いて
、すなわち３０μｇ／ｍｌのｖＷＦに対して３００ｎｇ／ｍｌのＶＩＩＩ因子で
、精製したｖＷＦ及びＶＩＩＩ因子を混合した場合、抗ＶＩＩＩ因子ＩｇＧによ
るＶＩＩＩ因子の加水分解が、部分的、すなわち３６．９％阻害された。
【００４２】 抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体を触媒活性抗体として同定する事は、喘息患者における
血管作用性腸ペプチド（ＶＩＰ）に対する加水分解抗体、ＳＬＥ患者におけるＤ
ＮＡ加水分解抗体及び自己免疫性甲状腺炎患者におけるチログロブリン特異的触
媒活性抗体についての以前の報告に加えて、触媒活性免疫応答の範囲を拡張する
。また、本出願人の知見の限りでは、これは、タンパク質抗原の細胞外投与に応
答した、ヒトにおける触媒抗体の誘導についての最初の報告である。抗ＶＩＩＩ
因子ＩｇＧが示す触媒活性の性質によるＶＩＩＩ因子の加水分解の動力学的パラ
メーター、及び、血漿中でのこれらの抗体の推定量は、生体内でのＶＩＩＩ因子
の不活性化における触媒活性免疫応答の機能的役割を示唆する。その機能的性質
が異なる抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体のポリクローナル混合物中では、触媒活性抗体
は、非触媒活性抗ＶＩＩＩ因子抗体よりも早い速度でＶＩＩＩ因子の凝血促進活
性を阻害すると考えられる。よって、タンパク質分解活性抗ＶＩＩＩ因子抗体の
ターゲットであるペプチドエピトープを同定することは、我々がＶＩＩＩ因子阻
害剤応答の病態生理学を理解する上で不可欠である。更に、ＶＩＩＩ因子阻害剤
を部位特異的プロテアーゼとして特定する事は、抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体を持つ
患者の治療に新たなアプローチを提供する。
【００４３】 図の簡単な説明 添付した図を用いた以下の説明のための記述により、本発明はさらによく理解さ
れ、発明の他の目的、特徴及び利点はさらに明確に明らかになるが、これらは抗
ＶＩＩＩ因子アロ抗体によるＶＩＩＩ因子の切断の特異性を示す限定されない実
施例としてのみ示される。
【００４４】図１：阻害剤を持つ血友病Ａ患者のアフィニティー精製した抗ＶＩＩＩ因子Ｉｇ Ｇ抗体による［１２５Ｉ］−ＶＩＩＩ因子の加水分解 図１Ａ： ［１２５Ｉ］−ラベルしたＶＩＩＩ因子は、患者Ｂｏｒ（レーンＢｏｒ）、Ｃｈ
ｅ（レーンＣｈｅ）及びＷａｌ（レーンＷａｌ）のアフィニティー精製した抗Ｖ
ＩＩＩ因子ＩｇＧ、又は、緩衝液のみ（レーン１）と共に、３８℃で１０時間イ
ンキュベーションし、その後ＳＤＳＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィーを行っ
た。ＶＩＩＩ因子を、アフィニティー精製した抗ＶＩＩＩ因子ＩｇＧと共にイン
キュベーションした結果、３人の患者のうち２人（Ｂｏｒ及びＷａｌ）で、ＶＩ
ＩＩ因子分子が加水分解された。それに対して、［１２５Ｉ］−ラベルしたＶＩ
ＩＩ因子を、患者Ｃｈｅ（レーンＣｈｅ）の血漿から精製した抗ＶＩＩＩ因子Ｉ
ｇＧと共にインキュベーションした場合、ＶＩＩＩ因子の移動の概略（ｐｒｏｆ
ｉｌｅ）は変わらなかった。ＶＩＩＩ因子に対して阻害活性を示さないヒトモノ
クローナルＭ０６１抗ジゴキシンＩｇＧ（ｍＡｂ）、又は、通常の分画していな
いポリクローナルヒトＩｇＧ（サンドグロブリン（登録商標）、ＩＶＩｇ）と共
にインキュベーションした際にも、ＶＩＩＩ因子の移動の概略（ｐｒｏｆｉｌｅ
）は変わらなかった。
【００４５】図１（Ｂ）： アフィニティーカラムのフロースルーには、ＥＬＩＳＡの測定によると抗ＶＩＩ
Ｉ因子抗体が存在せず、［１２５Ｉ］−ラベルしたＶＩＩＩ因子を加水分解しな
かった。
【００４６】図１（Ｃ）： プロテインＧのクロマトグラフィーにより、患者Ｗａｌ及びＢｏｒのアフィニテ
ィー精製した抗ＶＩＩＩ因子抗体を含む酸性溶出物からＩｇＧを除去した結果、
ＶＩＩＩ因子に対するその加水分解活性が消失した。
【００４７】図２：抗ＶＩＩＩ因子抗体の触媒活性のサイズ排除クロマトグラフィー 図２（Ａ）： 抗体のタンパク質分解活性がプロテアーゼのコンタミネーションによるという可
能性をさらに排除するために、患者Ｗａｌのアフィニティー精製した抗ＶＩＩＩ
因子抗体を８Ｍ尿素と共に処理し、サイズ排除クロマトグラフィーに供した。フ
ラクション２５に主要なピークが単離され、ＥＬＩＳＡによりそれはＩｇＧに一
致する事が示された。加水分解活性はＩｇＧフラクションと共に溶出し、ＩｇＧ
が存在しないフラクション（例えばフラクション３５）では活性が検出されなか
った。
【００４８】図２（Ｂ）： フラクション２５に単離された主要なピークはＩｇＧと一致する事が、フラクシ
ョンの内容物を放射性ラベルしたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより示された。
【００４９】図３：阻害剤を持つ血友病Ａ患者のアフィニティー精製した抗ＶＩＩＩ因子抗体 による［１２５Ｉ］−ＶＩＩＩ因子のタンパク質分解の時間及び量依存性 患者Ｂｏｒ及びＷａｌの抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体によるＶＩＩＩ因子の加水分解
の動力学。患者Ｗａｌの抗ＶＩＩＩ因子ＩｇＧによる［１２５Ｉ］−ラベルした
ＶＩＩＩ因子の加水分解速度は、患者Ｂｏｒの抗ＶＩＩＩ因子ＩｇＧにより示さ
れたものより速かったが、このことは、患者の触媒活性抗体は異なる動力学的性
質を示す事、又は、抗ＶＩＩＩ因子抗体のうち触媒活性抗体の割合は患者の間で
異なる事のどちらかを示唆した。
【００５０】図４：量が増加している冷ＶＩＩＩ因子存在下での抗ＶＩＩＩ因子ＩｇＧによる ［１２５Ｉ］−ＶＩＩＩ因子の加水分解 一定濃度の［１２５Ｉ］−ＶＩＩＩ因子の存在下で、ラベルしていないＶＩＩＩ
因子の濃度を増加させながら患者Ｗａｌの抗ＶＩＩＩ因子ＩｇＧを共にインキュ
ベーションすることによる、抗体が仲介するＶＩＩＩ因子の加水分解の動力学。
ラベルしていないＶＩＩＩ因子の量を増加させながら添加した結果、抗ＶＩＩＩ
因子ＩｇＧによる［１２５Ｉ］−ＶＩＩＩ因子の加水分解の量依存性阻害が起き
た。使用したＶＩＩＩ因子の最大濃度（すなわち１．７μＭ）では、ＶＩＩＩ因
子の加水分解の飽和は達成されなかった。速度の逆数を基質濃度の逆数と相関し
てプロットしたカーブは直線（ｒ＝０．９９）であった事から、すでにポリクロ
ーナル触媒活性自己抗体で観察されているように、反応は単純なＭｉｃｈａｅｌ
ｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ動力学と一致する事が示唆された。
【００５１】図５：患者Ｗａｌの抗ＶＩＩＩ因子ＩｇＧの触媒活性阻害 Ｐｅｆａｂｌｏｃ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｇｍｂ
Ｈ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙにより販売）の存在下、抗体をＶＩＩＩ
因子と共にインキュベーションした場合、患者Ｗａｌの抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体
による放射性ラベルしたＶＩＩＩ因子のタンパク質分解は約６２％まで阻害され
たことから、ある触媒活性抗体の触媒活性を中和する特定のセリンプロテアーゼ
インヒビターの能力が示された。
【００５２】実施例 実施例Ｉ：抗ＶＩＩＩ因子抗体のアフィニティー精製 抗体を血漿から硫酸アンモニウム沈殿により単離した。次に、ＶＩＩＩ因子に対
して活性のある抗体を、免疫精製した市販のヒト血漿由来ＶＩＩＩ因子を結合し
た（２５０００Ｕ／３ｇ−ゲル）ＣＮＢｒ活性化セファロース（登録商標）４Ｂ
マトリックスでアフィニティー精製した。カラムのフロースルーを集めた。ＰＢ
Ｓ ｐＨ７．４で充分洗浄した後、抗ＶＩＩＩ因子抗体を０．２Ｍグリシン ｐ
Ｈ２．８を用いて溶出し、ＰＢＳで透析し、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ（登録商標）
で濃縮した。フロースルー及び溶出物は、使用するまで等分して−２０℃に保存
した。抗ＶＩＩＩ因子抗体のＦ（ａｂ′）２フラグメントは、以前の記載のよう
にして調製した。
【００５３】 抗ＶＩＩＩ因子ＩｇＧの濃度は、患者Ｂｏｒ、Ｃｈｅ及びＷａｌの場合、カラム
に使用したＩｇＧ１０ｍｇにつき、それぞれ１３０、２０及び２８０μｇ（すな
わち、１４３±１３０μｇ／ｍＩ−分画していない血漿）であったが、これは以
前の観察と一致していた。
【００５４】実施例ＩＩ：ＶＩＩＩ因子中和活性 抗ＶＩＩＩ因子抗体のＶＩＩＩ因子中和活性は、Ｋａｓｐｅｒらの方法により測
定され、Ｂｅｔｈｅｓｄａユニット（ＢＵ）（ｒｅｆ）で表した。ＢＵは、ＶＩ
ＩＩ因子凝血促進活性を５０％阻害するＩｇＧの濃度の逆数として定義された。
残存ＶＩＩＩ因子活性は、ＶＩＩＩ因子を涸渇させたヒト血漿（Ｂｅｈｒｉｎｇ
）を基質とし、ｈｕｍａｎ ｐｌａｃｅｎｔａｌ ｐａｔｈｒｏｍｔｉｎ（登録
商標）（Ｂｅｈｒｉｎｇ）をアクチベーターとして用いた活性化部分トロンボプ
ラスチン時間の測定による一段階アッセイにより測定した。試験される加熱した
血漿又は免疫精製した抗ＶＩＩＩ因子ＩｇＧは、プールしたクエン酸処理ヒト血
漿と共に、３７℃で２時間インキュベーションした。リファレンス血漿プール（
Ｉｍｍｕｎｏ ＡＧ，Ｗｉｅｎ）の４つの段階希釈の凝固時間を、試験される各
サンプルの３つの希釈の凝固時間と比較した。希釈は、Ｏｗｒｅｎ−Ｋｏｌｌｅ
ｒバッファー（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ）の中で行った。アッセイ
間の誤差は、１〜２．５％の間の範囲であった。
【００５５】 患者Ｂｏｒ、Ｃｈｅ及びＷａｌのアフィニティー精製した抗ＶＩＩＩ因子抗体は
、ＶＩＩＩ因子凝血促進活性をそれぞれ５７．０、６４．０及び４３．０ＢＵ／
ｍｇ−ＩｇＧまで阻害した。
【００５６】実施例ＩＩＩ：ＶＩＩＩ因子の加水分解アッセイ 市販のヒトリコンビナントＶＩＩＩ因子を、比活性１１．６ｎＣｉ／μｇまでヨ
ードゲン法を用いて１２５Ｉでラベルした。［１２５Ｉ］−ＶＩＩＩ因子（１．
５〜１５０ｎｇ）を、５０μｌの５０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．７、１
００ｍＭグリシン、０．０２５％ Ｔｗｅｅｎ−２０及び０．０２％ ＮａＮ３ 中で、単独又は１７〜１６６７ｎＭの免疫精製した抗ＶＩＩＩ因子ＩｇＧと共に
、３８℃で５分〜１０時間インキュベーションした。ヒトモノクローナル抗ジゴ
キシンＩｇＧ Ｍ０６１（ｍＡｂ）及び通常の分画していないヒトポリクローナ
ルＩｇＧ（ＩＶＩｇ，Ｓａｎｄｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（登録商標））を、ネガティ
ブコントロールとして使用した。サンプルを、メルカプトエタノールを含まない
Ｌａｅｍｍｌｉのバッファーと１：１で混合し、１レーンにつき２０μｌの各サ
ンプルをロードした後、ボイルせずにＳＤＳ電気泳動に供した。１レーンにつき
２０μｌの各サンプルをロードした後、サンプルを非変性条件下、並行して７．
５％及び１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。移動は、２５ｍＡ／ゲルで、ｍｉ
ｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ ＩＩシステムを用いて、先頭のダイがゲルの底に来るま
で室温で行った。その後、ゲルを乾燥させ、Ｘ−ＯＭＡＴ ＡＲを用いて、タン
パク質のバンドを現した。オートラジオグラフィーの後、抗ＶＩＩＩ因子ＩｇＧ
により一貫して加水分解されている明確な２００及び３００ｋＤａの分子量のＶ
ＩＩＩ因子のバンドをスキャンし、ラベルしたＶＩＩＩ因子の加水分解速度を計
算できるようにした。
【００５７】実施例ＩＶ：ファストリキッドプロテインクロマトグラフィーゲル濾過 １００μｌの等分の、８Ｍ尿素で処理した患者Ｗａｌの抗ＶＩＩＩ因子ＩｇＧ（
７４０μｇ）を、０．２ｍｌ／ｍｉｎの流速でＰＢＳ−０．０１％アジドで平衡
化したｓｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）−１２カラムのゲル濾過に供した。５００
μｌのフラクションを集め、サンドイッチＥＬＩＳＡによりＩｇＧの存在を、ま
た、１０倍希釈後のＶＩＩＩ因子タンパク質分解活性を分析した。フラクション
２５のタンパク質を１２５Ｉで放射性ラベルし、通常のヒトポリクローナルＩｇ
Ｇと並行して非変性条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ゲルをクマシーブルー
で染色し、オートラジオグラフィーも行った；そして、両方の像を重ね合わせた
。主要なピークはフラクション２５に単離され、ＥＬＩＳＡ及びフラクションの
内容物を放射性ラベルしたＳＤＳ−ＰＡＧＥで、ＩｇＧと一致する事が示された
。加水分解活性はＩｇＧフラクションと共に溶出し、ＩｇＧが存在していないフ
ラクション（例えばフラクション３５）では活性が検出されなかった。
【００５８】実施例Ｖ：ＮＨ２末端シークエンス分析 ラベルしていないヒトリコンビナントＶＩＩＩ因子スクロース処方（ｒＤＮＡ−
ＢＨＫ）（３００ｎｇ，ｏｃｔｏｃｏｇ ａｌｆａ，Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐｏｒ
ａｔｉｏｎ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）を、１５００μｌの５０ｍＭ ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ ｐＨ７．７、１００ｍＭグリシン、０．０２５％ ｔｗｅｅｎ−２０
及び０．０２％ ＮａＮ３中で、患者Ｗａｌの抗ＶＩＩＩ因子ＩｇＧ（７４μｇ
）と共に３８℃で２４時間処理した。得られたＶＩＩＩ因子フラグメントを非変
性条件下、５０ｍＡで１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ｐＨ１１．０の１０ｍＭ
ＣＡＰＳ、１０％エタノール中、１００ｍＡ、２時間でＨｙｂｏｎｄ−Ｐ Ｐ
ＶＤＦメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ， Ｅ
ｎｇｌａｎｄ）にトランスファーした。クマシーブルーで染色した後、見られる
バンドを切断して自動プロテインマイクロシークエンサーＰｒｏｓｉｚｅ４９２
ｃＬＣ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔ
ｙ，ＣＡ）を用いたＮ末端シークエンシングに供した。シークエンスされたタン
パク量は、フラグメントによって、０．５〜２ｐｍｏｌの範囲であった。
【００５９】 主要な切断しやすい結合は以下のようであった：ＶＩＩＩ因子のＡ１及びＡ２ド
メインの間にあるＡｒｇ３７２−Ｓｅｒ３７３（Ｒ３７２−Ｓ３７３）；Ａ３ド
メインのＮ末端にあるＴｙｒ１６８０−Ａｓｐ１６８１（Ｙ１６８０−Ｄ１６８ １ ）；及びＡ３ドメイン中にあるＧｌｕ１７９４−Ａｓｐ１７９５（Ｅ１７９４ −Ｄ１７９５）。抗ＶＩＩＩ因子抗体によるＶＩＩＩ因子の複数部位での切断は
、多種特異的触媒活性を持つ個々の抗体、又は、それぞれが独特の切断部位特異
性を示す抗体のポリクローナル集団に由来すると考えられた。
【００６０】
【表１】
【００６１】実施例ＶＩ：セリンプロテアーゼに属する阻害剤、Ｐｅｆａｂｌｏｃ（登録商標 ）を用いて阻害実験を行った Ｐｅｆａｂｌｏｃ（登録商標）存在下での、阻害剤を持つ血友病Ａ患者のアフィ
ニティー精製した抗ＶＩＩＩ因子ＩｇＧ抗体による［１２５Ｉ］−ＶＩＩＩ因子
の加水分解。［１２５Ｉ］−ＶＩＩＩ因子（１５０ｎｇ）は、単独、又は、患者
Ｗａｌの免疫精製した抗ＶＩＩＩ因子ＩｇＧ ５０μｇ／ｍｌと共に、又は、抗
ＶＩＩＩ因子ＩｇＧ及びセリンプロテアーゼインヒビターであるＰｅｆａｂｌｏ
ｃ（登録商標）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）４ｍＭの両方の存在下、３８℃で５時
間インキュベーションした。その後、非変性条件下、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
でＶＩＩＩ因子を分析した。オートラジオグラフィーの後、抗ＶＩＩＩ因子Ｉｇ
Ｇにより一貫して加水分解されている明確な２００及び３００ｋＤａの分子量の
ＶＩＩＩ因子のバンドをスキャンし、ラベルしたＶＩＩＩ因子の加水分解速度を
計算できるようにした。
【００６２】 Ｐｅｆａｂｌｏｃ（登録商標）の存在下、抗体をＶＩＩＩ因子と共にインキュベ
ーションした場合、患者Ｗａｌの抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体による放射性ラベルし
たＶＩＩＩ因子のタンパク質分解は約６２％まで阻害されたことから、ある触媒
活性抗体の触媒活性を中和するあるセリンプロテアーゼインヒビターの能力が示
された。
【００６３】更なる観察： １２５ Ｉ放射性ラベルしたＶＩＩＩ因子をターゲット分子として用いて、１０人
の血友病Ａ高応答患者の精製ＩｇＧをスクリーニングした際に、６人の患者の場
合でＶＩＩＩ因子の移動の概略（ｐｒｏｆｉｌｅ）に変化が観察された。これら
の結果は、本出願人の以前の観察を実証するものであり、触媒活性抗ＶＩＩＩ因
子抗体が約６０％の患者で見受けられる事を示した。
【図面の簡単な説明】
【図１】 阻害剤を持つ血友病Ａ患者のアフィニティー精製した抗ＶＩＩＩ因子ＩｇＧ抗体
による［１２５Ｉ］−ＶＩＩＩ因子の加水分解。
【図２】 抗ＶＩＩＩ因子抗体の触媒活性のサイズ排除クロマトグラフィー。
【図３】 阻害剤を持つ血友病Ａ患者のアフィニティー精製した抗ＶＩＩＩ因子抗体による
［１２５Ｉ］−ＶＩＩＩ因子のタンパク質分解の時間及び量依存性。
【図４】 量が増加している冷ＶＩＩＩ因子存在下での抗ＶＩＩＩ因子ＩｇＧによる［１２ ５ Ｉ］−ＶＩＩＩ因子の加水分解。
【図５】 患者Ｗａｌの抗ＶＩＩＩ因子ＩｇＧの触媒活性阻害。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 7/00 Ａ６１Ｐ 7/04 ４Ｈ０４５ 7/04 Ｃ０７Ｋ 7/06 ＺＮＡ Ｃ０７Ｋ 7/06 ＺＮＡ Ｃ１２Ｑ 1/26 Ｃ１２Ｑ 1/26 Ｇ０１Ｎ 30/48 Ｎ Ｇ０１Ｎ 27/447 30/88 Ｅ 30/48 33/15 Ｚ 30/88 33/483 Ｆ 33/15 33/50 Ｚ 33/483 33/53 Ｎ 33/50 27/26 ３１５Ｚ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/48 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 スリニヴァ カヴェリ フランス国 エフ−92240 マラコフ， ルー ルシアン エ エドゥアール ゲル ベ 15 (72)発明者 セバスチャン ラクロワ−デスマゼ フランス国 エフ−92410 ヴィーユ ダ ヴレー， ルー ド サンクロード 33 (72)発明者 ミシェル カザチキン フランス国 エフ−75005 パリ， ルー ル ゴフ １ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BB05 BB50 FB01 FB03 FB05 4B063 QA01 QQ22 QR58 QS31 4C084 AA02 AA06 AA17 BA02 BA08 BA17 BA23 CA59 DC15 NA14 ZA512 ZA532 4C085 AA13 BB11 CC14 DD33 EE01 4C206 AA01 AA02 JA04 MA02 MA04 NA05 NA14 ZA51 ZA53 4H045 AA10 AA30 BA14 DA56 EA22 FA16

Claims (27)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ｉ）哺乳動物から採取した血液サンプルから血漿を単離し、 ｉｉ） 前記血漿から抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体を単離し； ｉｉｉ） 前記抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体によりＶＩＩＩ因子の分解が全て起こる
    のに充分な期間、前記抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体を前記ＶＩＩＩ因子と接触させ； ｉｖ） 前記期間の後、前記ＶＩＩＩ因子が前記抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体によ
    り効率的に分解されたかどうかを測定することを特徴とする、 前記哺乳動物において、ＶＩＩＩ因子を分解することができる抗ＶＩＩＩ因子ア
    ロ抗体の存在を測定する方法。
  2. 【請求項２】 工程ｉｉ）において、前記抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体は、好まし
    くはマトリックスと結合した前記ＶＩＩＩ因子と前記血漿を混合することにより
    血漿から単離されることを特徴とする請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 工程ｉｉ）において、前記抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体は、アフィ
    ニティークロマトグラフィーにより単離されることを特徴とする請求項１又は２
    記載の方法。
  4. 【請求項４】 工程ｉｉ）において、前記アフィニティークロマトグラフィー
    は、好ましくは臭化シアンにより活性化されたセファロース（登録商標）マトリ
    ックスに共有結合しているＶＩＩＩ因子を使用することを特徴とする請求項３記
    載の方法。
  5. 【請求項５】 工程ｉｉｉ）において、前記ＶＩＩＩ因子は、特に１２５Ｉの
    ような、好ましくは放射性ラベリング剤といったラベリング剤によりラベルされ
    ていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 【請求項６】 工程ｉｉｉ）において、約０．５〜約３０時間の間、好ましく
    は約１０時間、約１５〜約４０℃の温度、好ましくは３８℃で前記ＶＩＩＩ因子
    を抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体と接触させることを特徴とする請求項１〜５のいずれ
    か１項に記載の方法。
  7. 【請求項７】 工程ｉｖ）は、特にＳＤＳＰＡＧＥのようなゲル電気泳動、又
    は、特にファストプロテインリキッドクロマトグラフィーゲル濾過のようなゲル
    濾過といった分離技術、及び、特にオートラジオグラフィーのような視覚化技術
    を含む測定により行われることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載
    の方法。
  8. 【請求項８】 更に： ｖ） 前記抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体により切断された前記ＶＩＩＩ因子分子の
    部位を特定する ことを含むことを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記特定は、前記ＶＩＩＩ因子を、ＶＩＩＩ因子を分解するこ
    とができる前記抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体と接触させ、分離した後、そこから得ら
    れたＶＩＩＩ因子のフラグメントをシークエンスすることにより行われることを
    特徴とする請求項８記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記分離は、特にＳＤＳＰＡＧＥのようなゲル電気泳動とい
    った技術を用いて行われることを特徴とする請求項８又は９記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記シークエンシングは、特に自動プロテインマイクロシー
    クエンサーを用いるようなＮ末端シークエンシングといった技術を用いて行われ
    ることを特徴とする請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記シークエンシングは：ＶＩＩＩ因子分子のＡ１及びＡ２
    ドメインの間にあるＡｒｇ３７２−Ｓｅｒ３７３、Ａ３ドメインのＮ末端にある
    Ｔｙｒ１６８０−Ａｓｐ１６８１、及び、Ａ３ドメイン中にあるＧｌｕ１７９４ −Ａｓｐ１７９５の切断しやすい結合の位置を示すことを特徴とする請求項８〜
    １１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 Ｓｅｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｐｒｏ
    のアミノ酸配列。
  14. 【請求項１４】 Ａｓｐ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｓｅｒ
    のアミノ酸配列。
  15. 【請求項１５】 Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｕ
    のアミノ酸配列。
  16. 【請求項１６】 抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体により分解されやすいＶＩＩＩ因子
    分子中の全ての部位を阻害することができることを特徴とする請求項１３〜１５
    のいずれか１項に記載のアミノ酸配列のペプチド又は非ペプチドアナログ。
  17. 【請求項１７】 抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体が触媒するＶＩＩＩ因子分解の阻害
    剤。
  18. 【請求項１８】 特に塩酸４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフル
    オライドのようなプロテアーゼインヒビターを含むことを特徴とする請求項１７
    記載の阻害剤。
  19. 【請求項１９】 前記阻害剤は：ＶＩＩＩ因子分子のＡ１ドメインの間にある
    Ａｒｇ３７２−Ｓｅｒ３７３、Ａ３ドメインのＮ末端にあるＴｙｒ１６８０−Ａ
    ｓｐ１６８１、及び、Ａ３ドメイン中にあるＧｌｕ１７９４−Ａｓｐ１７９５の
    切断しやすい結合の切断を阻害することを特徴とする請求項１７又は１８記載の
    阻害剤。
  20. 【請求項２０】 アミノ酸配列： Ｓｅｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｐｒｏ のペプチド又は非ペプチドアナログを含むことを特徴とする請求項１７〜１９の
    いずれか１項に記載の阻害剤。
  21. 【請求項２１】 アミノ酸配列： Ａｓｐ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｓｅｒ のペプチド又は非ペプチドアナログを含むことを特徴とする請求項１７〜１９の
    いずれか１項に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 アミノ酸配列： Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｕ のペプチド又は非ペプチドアナログを含むことを特徴とする請求項１７〜１９の
    いずれか１項に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 特に請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法から得られる
    、ＶＩＩＩ因子を分解することができる抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体を医薬上有効量
    含むことを特徴とする医薬組成物。
  24. 【請求項２４】 血液中のＶＩＩＩ因子水準の異常による疾患を患う哺乳動物
    を治療する医薬組成物を調製するための、ＶＩＩＩ因子を分解することができる
    抗ＶＩＩＩ因子アロ抗体の使用。
  25. 【請求項２５】 前記疾患は、その血液中にＶＩＩＩ因子が過剰に存在するこ
    とによるものであることを特徴とする請求項２４記載の使用。
  26. 【請求項２６】 請求項１７〜２２のいずれか１項に記載のＶＩＩＩ因子分解
    の阻害剤を医薬上有効量含むことを特徴とする医薬組成物。
  27. 【請求項２７】 血液中のＶＩＩＩ因子が生理的水準以下であることによる疾
    患を患う哺乳動物を特に治療する医薬組成物を調製するための、ＶＩＩＩ因子分
    解の阻害剤の使用。
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