CZ2002248A3

CZ2002248A3 - Způsob stanovení přítomnosti katalytické aloprotilátky anti-faktor VIII schopné degradovat faktor VIII

Info

Publication number: CZ2002248A3
Application number: CZ2002248A
Authority: CZ
Inventors: Srinivas Kaveri; Sébastien Lacroix-Desmazes; Michel Kazatchkine
Original assignee: Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
Priority date: 1999-07-21
Filing date: 2000-07-18
Publication date: 2002-07-17
Also published as: NO20020253L; AU6824500A; JP2003505434A; CA2379818A1; HUP0201941A3; CN1229646C; NZ516702A; MXPA02000752A; BR0012613A; EP1196782A1; US20090208512A1; IS6238A; RU2258935C2; NO20020253D0; SK862002A3; HK1044372A1; KR100788435B1; EP1074842A1; KR20020042618A; JP2009292823A

Description

Způsob stanovení přítomnosti katalytické aloprotilátky anti-faktor VIII schopné degradovat faktor VIII

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká způsobu zjišťování výskytu katalytických aloprotilátek anti-faktor VIII (tj. protilátek namířených proti faktoru VIII) schopných degradovat faktor VIII u savce, a charakterizace štěpných míst v molekule uvedeného faktoru VIII uvedenými katalytickými aloprotilátkami anti-faktor VIII.

Předkládaný vynález se také týká inhibitoru degradace faktoru VIII katalyzované aloprotilátkou anti-faktor VIII.

Dále se předkládaný vynález týká farmaceutického přípravku obsahujícího uvedené katalytické aloprotilátky anti-faktor VIII, které jsou schopné degradovat faktor VIII a které pocházejí z uvedeného způsobu zjišťování, a farmaceutického přípravku obsahujícího uvedený inhibitor degradace faktoru VIII katalyzované aloprotilátkou anti-faktor VIII.

Konečně se předkládaný vynález týká aplikace uvedeného inhibitoru degradace faktoru VIII katalyzované aloprotilátkou anti-faktor VIII v léčivech, farmaceutického přípravku obsahujícího uvedené katalytické aloprotilátky anti-faktor VIII, které jsou schopné degradovat faktor VIII a které pocházejí z uvedeného způsobu zjišťování, a farmaceutického přípravku obsahujícího uvedený inhibitor degradace faktoru VIII katalyzované aloprotilátkou anti-faktor VIII.

Dosavadní stav techniky

Hemofilie A je recesivní porucha vázaná na X chromozom, která má za následek vadné nebo neúplné molekuly faktoru VIII, a ve své vážné formě to je život ohrožující a ochromující hemoragická diatéza.

Infúze homologního faktoru VIII pacientům se závažnou hemofiíií A má ve 25¾ případů za následek postupný vývoj aloprotilátek anti-faktor VIII (Ehrenforth, S., Kreuz, W., Scharrer, L, Lindě, R., Funk, M., Gungbr, T., Krackhardt, B. a Kornhuber, B., „Incidence of development of factor VIII and factor IX inhibitors in haemophiliacs, Lancet, 1992, 339:

594-598), které inhibují prokoagulační aktivitu faktoru VIII stérickou zábranou interakce faktoru VIII buď se stabilizačními molekulami (Saenko, E. L., Shima, M., Rajalakshmi, K. J. a Scandella, D., „A role for the C2 domain of factor VIII in binding to von Willebrand faktor», J, Biol. Chem., 1994, 269: 11601-1160, a Saenko. E. L., Shima, M.,

Gilbert. G, E., a Scandella. D., „Slowed release of thrombincleaved factor VIII from von Willebrand factor by a monoclonal and a human antibody is a novel mechanism for factor VIII inhibition», J. Biol, Chem., 1996, 271: 27424-27431), s molekulami podstatnými pro jeho aktivitu (Arai, M., Scandella, D., a Hoyer, 1. W., „Molecular basis of factor VIII inhibition by human antibodies: Antibodies that bind to the factor VIII light Chain prevent the interaction of factor VIII with phospholipid, J. Clin. Invest., 1989, 83: 1978-1984, a Zhong, D., Saenko, E. L., Shima, M., Felch. M. and Scandella, D., „Some human inhibitor antibodies interfere with factor VIII binding to factor IX, Blood, 1998, 92: 136-142) nebo s aktivačními molekulami (Lubahn, B. C., Ware, J., Stafford, D. W., a Reiser, Η. M., „Identification of a FVIII epitope recognized by a human hemophilic inhibitor», Blood, 1989, 73: 497-499, a Neuenschwander, P. F., and Jesty, J., „Thrombinactivated and factor Xa-activated human factor VIII: differences in cofactor activity and decay rate, Are. Biochem. Biophys., 1992, 296: 426-434).

4 4444

4 4 » •444 44

Podstata vynálezu

Původci zcela překvapivě objevili degradaci faktoru VIII prostřednictvím aloprotilátek u dvou silně reagujících pacientů se závažnou formou hemofilie A, ukazující na doposud neznámý mechanismus, pomocí kterého inhibitory faktoru VIII mohou zabránit prokoagulační funkci faktoru VIII.

Objev katalytických aloprotilátek anti-faktor VIII (tj. protilátek namířených proti faktoru VIII) je podle nej lepších znalostí původců první zjištění o postupném vývoji katalytických protilátek, které jsou indukovány při léčbě pacientů faktorem VIII. Dříve bylo považováno za velice překvapivé, dokonce absurdní nebo neuvěřitelné, že jsou vytvářeny protilátky v přítomnosti faktoru VIII, které by mohly ve skutečnosti učinit molekulu faktoru VIII inaktivní prostřednictvím katalytické hydrolýzy („proteolýzy). Ale doposud publikované katalytické protilátky jsou všechny autoprotilátky nalezené v průběhu chorobného procesu nebo za fyziologických podmínek. Tudíž takovéto indukované protilátky byly nazvány aioprotilátkami, neboť jejich původ je jasně odlišný od původu autoprotilátek u kterékoliv auto-imunitní nemoci.

Vypočtená průměrná Km a zjevná Vmax pro reakci protilátek anti-faktor VIII jednoho pacienta byly 9,46 ± 5,62 μΜ a 85 ± 60 fmol.min^-1, v daném pořadí. Kinetické parametry hydrolýzy faktoru VIII svědčí pro funkční úlohu katalytické imunitní reakce při inaktivaci faktoru VIII in vivo.

Charakterizace aloprotilátek anti-faktor VIII jako místně specifických proteáz proto poskytuje nové přístupy k léčení onemocnění pacientů, kteří mají aloprotilátky anti-faktor VIII.

* » 999 ♦ ·· ··

9· ··

9 999 9

Tudíž podle prvního aspektu poskytuje předkládaný vynález způsob zjišťování výskytu katalytických aloprotilátek anti-faktor Vlil schopných degradovat faktor VIII u savce, charakteristický tím, že obsahuje kroky

i) izolaci plazmy ze vzorku krve odebraného uvedenému savci, ii) izolaci aloprotilátek anti-faktor VIII z uvedené plazmy, iii) umístění uvedených aloprotilátek anti-faktor VIII do kontaktu s faktorem VIII po dobu postačující umožnit jakoukoliv degradaci uvedeného faktoru VIII uvedenými aloprotilátkami anti-faktor VIII a iv) zjišťováni, po uvedené době, zda uvedený faktor VIII byl účinně degradován uvedenými aloprotilátkami antifaktor VIII.

Podle provedení kroku ii) způsobu podle předkládaného vynálezu jsou uvedené aloprotilátky anti-faktor VIII izolovány z uvedené plazmy jejich kombinací s uvedeným faktorem VIII, kdy uvedený faktor VIII je výhodně navázán na matrix. Výhodně jsou v kroku ii) uvedené aloprotilátky anti-faktor VIII izolovány pomocí afinitní chromatografie. Výhodně v kroku ii) , uvedená afinitní chromatografie obsahuje použití Sepharose (sefarózy) jakožto matrix, výhodně Sepharose aktivované bromkyanem.

Podle provedení kroku iii) způsobu podle předkládaného vynálezu je faktor VIII značen s značícím činidlem labelling agent, výhodně radioaktivním značícím činidlem, jako je například zejména ¹²⁵I. Výhodně je v kroku iii) uvedený faktor VIII umístěn do kontaktu s aloprotilátkami anti-faktor VIII po dobu přibližně od 0,5 hodiny přibližně do 30 hodin, výhodně přibližně 10 hodin, při teplotě přibližně od 15 °C přibližně do 40°C, výhodně 38°C.

» a · * · • ··· · « « · · 0 a

404 · · 44

Podle provedení kroku iv) způsobu podle předkládaného vynálezu zjišťování, zda uvedený faktor VIII byl účinně degradován uvedenými aloprotilátkami anti-faktor VIII, je prováděno stanovením obsahujícím separační techniky, jako je například elektroforéza v gelu, jako je například zejména

SDS-PAGE nebo gelová filtrace, jako je například zejména rychlá proteinová kapalinová chromatografie s gelovou filtrací a vhodnou zobrazovací techniku, jako je například zejména autoradiografie.

Podle dalšího provedení způsobu podle předkládaného vynálezu je uvedený způsob charakterizován tím, že dále obsahuje krok

v) charakterizací míst(a) v molekule uvedeného faktoru VIII štěpené uvedenými aloprotilátkami anti-faktor VIII.

Podle provedení kroku v) způsobu podle předkládaného vynálezu je uvedená charakterizace prováděna uvedením faktoru VIII do kontaktu s aloprotilátkami anti-faktor VIII schopnými degradovat faktor VIII, separací a sekvencováním výsledných fragmentů faktoru VIII. Výhodně je uvedená separace prováděna s použitím techniky, jako je například elektroforéza v gelu, obzvláště jako je například SDS-PAGE nebo gelová filtrace. Sekvencování je výhodně prováděno s použitím techniky, jako je například N-koncové sekvencování, obzvláště například s použitím automatického proteinového mikrosekvenátoru.

uvedeného sekvencování byly lokalizovány štěpné vazby: Arg³⁷²-Ser³⁷³, lokalizovaná mezi doménami Al a A2, TyR₁₆ ⁸⁰-Asp¹⁶⁸¹, lokalizovaná na N-konci domény A3 a Glu¹⁷⁹⁴-Asp^179S lokalizovaná v doméně A3 molekuly faktoru VIII.

S použitím následuj ící

Podle druhého aspektu tedy předkládaný vynález poskytuje aminokyselinovou sekvenci:

Ser Val Ala Lys Lys His Pro, « · · 4 « · • 4 f k « « 1

I · «444 aminokyselinovou sekvenci:

Asp Glu Asp Glu Asn Gin Ser a aminokyselinovou sekvenci:

Asp Gin Arg Gin Gly Ala Glu.

Předkládaný vynález také poskytuje varianty nebo analogy těchto nebo kterýchkoliv dalších sekvencí faktoru VIII, které jsou schopné inhibovat jakékoliv místo v molekule faktoru VIII, které podléhá lýzi aloprotilátkou anti-faktor VIII. V kontextu předkládaného vynálezu takovou variantou může být například peptidový nebo nepeptidový analog aminokyselinové sekvence popsané výše, který inhibuje jakékoliv místo v molekule faktoru VIII, které podléhá lýzi aloprotilátkou anti-faktor VIII. Takovou variantou může být například varianta sekvence, která je buď kratší o několik aminokyselin na N-koncové časti, C-koncové části nebo na obou koncích, , nebo delší o několik aminokyselin (tyto varianty je možné získat chemickou syntézou nebo enzymatickým štěpením přirozeně se vyskytující molekuly), dokud varianta inhibuje kterékoliv místo v molekule faktoru VIII, které podléhá lýzi aloprotilátkou anti-faktor VIII.

Proto tedy podle třetího aspektu předkládaný vynález poskytuje inhibitor degradace faktoru VIII katalyzované aloprotilátkou anti-faktor VIII. Výhodně je tento inhibitor charakterizován tím, že obsahuje inhibitor proteáz. Příklady inhibitorů proteáz, které mohou být použity jako inhibitory degradace faktoru VIII katalyzované aloprotilátkou anti-faktor VIII v kontextu předkládaného vynálezu, aniž by tento výčet byl omezující, jsou inhibitory fluorfosfátového typu, jako je například DFP nebo inhibitory sulfonylfluoridového typu, jako je například PMSF nebo AEBSF hydrochlorid (4-(2-aminoethyl)benzensulfonylfluoridu (uváděný na trh firmou Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Německo, pod obchodní značkou wv -W » «««« ·· ·· • 9* * · 9 9 9 9 · •9·· 99 9 99 ·

J 999· 99 99 «· 99 9999

Pefabloc®). Konkrétněji je tento inhibitor charakterizován tím, že uvedený inhibitor inhibuje štěpení štěpné vazby: Arg³⁷²-Ser³⁷³, lokalizované mezi doménami Al, Tyr¹⁶⁸⁰-Asp^16S1, lokalizované na N-koncové části domény A3 a Glu¹⁷⁹⁴-Asp¹⁷⁹⁵lokalizované v doméně A3 molekuly faktoru VIII. Ještě výhodněji je tento inhibitor charakterizován tím, že obsahuje peptidový nebo nepeptidový analog aminokyselinové sekvence:

Ser Val Ala Lys Lys His Pro peptidový nebo nepeptidový analog aminokyselinové sekvence:

Asp Glu Asp Glu Asn Gin Ser nebo peptidový nebo nepeptidový analog aminokyselinové sekvence:

Asp Gin Arg Gin Gly Ala Glu.

Inhibitory degradace faktoru VIII, jak je definováno výše, a také jejich adiční soli, obzvláště jejich farmaceuticky přijatelné adiční soli, mají velmi cenný farmakologický profil tím, že mají aktivitu neutralizující aloprotilátky anti-faktor VIII.

Tyto vlastnosti opravňují jejich použití v léčivech a vynález se dále týká, inhibitorů degradace faktoru VIII uvedených výše, a také jejich adičních solí, obzvláště jejich farmaceuticky přijatelných adičních solí.

Tato léčiva jsou tudíž indikovány obzvláště pro léčení onemocnění hemofilické povahy, kromě dalších, konkrétně onemocnění spojených s poruchami koagulace způsobenými nedostatečností faktoru VIII.

Příkladem jejich použití, který může být zmíněn, je léčení silně reagujících pacientů s nemocemi, jako je například mírná nebo závažná hemofilie A (v případě, že jsou u těchto pacientů zjištěny katalytické protilátky), na jedné straně a/nebo, na druhé straně, například pacientů trpících autoimunitními chorobami (v případě, že jsou u těchto pacientů zjištěny katalytické protilátky).

·♦ «φ φφφφ

ΦΦ φφ • φ φ φ φ · φ · φ φ φφφ φ φ · φ φ φ φφφ φφ φφ «φ φφ φφφφ

Tudíž podle čtvrtého hlavního aspektu předkládaný vynález poskytuje řešení dlouho pociťované potřeby farmaceutického přípravku charakterizovaného tím, že obsahuje farmaceuticky účinné množství alespoň jedné aloprotilátky anti-faktor VIII schopné degradovat faktor VIII, jak je definováno výše, zejména jak lze získat způsobem popsaným výše, nebo jedné z jejich farmaceuticky přijatelných adičních solí, začleněné do farmaceuticky přijatelného excipientu, vehikula nebo nosiče.

Dále podle pátého hlavního aspektu předkládaný vynález poskytuje farmaceutický přípravek charakterizovaný tím, že obsahuje farmaceuticky účinné množství alespoň jednoho inhibitoru degradace faktoru VIII, jak je definováno výše, nebo jedné z jeho farmaceuticky přijatelných adičních solí začleněné do farmaceuticky přijatelného excipientu, vehikula nebo nosiče.

Tyto přípravky mohou být podávány například bukálně, rektálně, parenterálně, transdermálně, do oka, nazálně nebo do ucha.

Tyto přípravky mohou být pevné nebo tekuté a mohou být předloženy ve farmaceutických formách obecně používaných v humánní medicíně, jako jsou například jednoduché nebo potahované tablety, želatinové tobolky, granule, čípky, přípravky pro injekci, transdermélni systémy, oční kapky, aerosoly a spreje a ušní kapky. Připravují se obvyklými metodami. Účinný princip, který spočívá v tom, že farmaceuticky účinné množství alespoň jednoho inhibitoru degradace faktoru VIII, jak je definován výše, nebo jedné z jeho farmaceuticky přijatelných adičních solí může být začleněno společně s excipienty normálně používanými ve farmaceutických přípravcích, jako je například talek, arabská guma, laktóza, škrob, stearát horečnatý, polyvidon, deriváty celulózy, kakaové máslo, polosyntetické glyceridy, vodná nebo nevodná vehikula, tuky živočišného nebo rostlinného původu,

9« 999» • 9 99

9 9 ·

9 9

9 9 •9 9999 glykoly, různá smáčedla, dispergační činidla nebo emulgátory, silikonové gely, určité polymery nebo kopolymery, konzervační činidla, aromatizační činidla a barviva. Výhodná farmaceutická forma je injekční forma.

Vynález se také týká farmaceutického přípravku s neutralizující aktivitou, který může být použit zejména jako výhodná léčba nemocí, jako je například hemofilie A, s produkcí aloprotilátek anti-faktor VIII, autoimunitních onemocnění obzvláště s aloprotilátkami anti-faktor VIII (v případě, že jsou u těchto pacientů zjištěny katalytické protilátky), uvedený přípravek je charakterizován tím, že obsahuje farmaceuticky účinné množství alespoň jednoho inhibitoru degradace faktoru VIII uvedeného výše nebo jedné z jeho farmaceuticky přijatelných adičních solí začleněné do farmaceuticky přijatelného excipientu, vehikula nebo nosiče.

Vynález se také týká léčebného ošetření savce trpícího patologickým stavem plynoucím z hladiny faktoru VIII v jeho krvi, spočívajícího v tom, že je uvedenému savci podáváno terapeuticky účinné množství alespoň jednoho inhibitoru degradace faktoru VIII uvedeného výše nebo jedné z jeho farmaceuticky přijatelných adičních solí.

Tento vynález tak umožňuje obzvláště výhodné léčení nemocí hemofilické povahy, obzvláště patologických stavů plynoucích z nedostatku faktoru VIII v krvi.

Vynález se také týká farmaceutického přípravku s anti-trombotickou aktivitou, který může být použit zejména jako výhodná léčba nemocí, jako je například obzvláště trombóza, uvedený přípravek je charakterizován tím, že obsahuje farmaceuticky účinné množství alespoň jedné aloprotilátky anti-faktor VIII schopné degradovat faktor VIII, zejména jak lze získat způsobem popsaným výše, nebo jedné z jejích farmaceuticky přijatelných adičních solí, začleněné do farmaceuticky přijatelného excipientu, vehikula nebo nosiče.

·· ·4 ♦ Β · Β Β • ««· 4 4 · 4 4 ·

4444 *4 44 ·« ··

Β 4 4 4 4 • 4 4 4

Β * 4 4 Β

44 4444 ·· Μ··

Vynález se také týká léčebného ošetření savců, spočívajícího v tom, že je uvedenému savci podáváno terapeuticky účinné množství alespoň jedné aloprotilátky anti-faktor VIII, jak je definováno výše, nebo jedné z jeho farmaceuticky přijatelných adičních solí.

Tento vynález tak umožňuje obzvláště výhodné léčení nemocí trombotické povahy, obzvláště uvedených patologických stavů plynoucích z přítomnosti nadbytku faktoru VIII v krvi.

V léčivech pro humánní a veterinární medicínu mohou být aloprotilátky anti-faktor VIII nebo inhibitory degradace faktoru VIII, jak jsou definovány výše, podávány samotné nebo ve spojení s fyziologicky přijatelným excipientem, v jakékoliv formě, zejména perorálně ve formě želatinových tobolek nebo tablet nebo parenterálně ve formě roztoků pro injekci. Je možné uvažovat o dalších formách podávání, jako jsou například čípky, masti, krémy, gely nebo aerosolové přípravky.

V kontextu předkládaného vynálezu jsou použity následující terminy:

„Katalytické aloprotilátky anti-faktor VIII, kterým se rozumí protilátky namířené proti faktoru VIII mající katalytickou aktivitu, indukované u pacientů s hemofilií A po transfúzi terapeutických přípravků faktoru VIII.

„Faktor VIII, kterým se rozumí koenzym faktoru IX v enzymatickém štěpení faktoru X v průběhu krevní koagulace.

„Degradace faktoru VIII, kterým se rozumí vytváření fragmentů faktoru VIII, které není způsobeno spontánní hydrolýzou nebo není způsobeno hydrolýzou pomocí fyziologicky štěpících enzymů, tj, trombinu, aktivovaného faktoru IX, aktivovaného faktoru X a aktivovaného proteinu C.

„Inhibitor degradace faktoru VIII katalyzované aloprotilátkou anti-faktor VIII, kterým se označuje kterýkoliv peptid, který je nebo není součástí sekvence ·· ·· • · · • ««v ν· ·*· ν· ·· β · · ···· ·«· ···« ·· II ·« ·» ···* faktoru VIII nebo inhibitoru proteázy, a který je schopný specificky neutralizovat hydrolytickou aktivitu katalytických protilátek anti-faktor VIII.

Popis výhodných provedení předkládaného vynálezu

Humánní rekombinantní faktor VIII byl radioaktivně označen pomocí ¹²⁵I. Aloprotilátky anti-faktor VIII byly afinitně purifikovány z plazmy tří pacientů s hemofilií s výskytem inhibitoru na Sepharosové matrix, na které byl kondenzován imunitně purifikovaný humánní faktor VIII. Afinitně purifikované protilátky anti-faktor VIII pacientů Bor, Che a Wal inhibovaly prokoagulační aktivitu faktoru VIII až do- 57,0, 64,0 a 43,0 BU/mg IgG, v daném pořadí.

Ko-inkubace značeného faktoru VIII s aloprotilátkami anti-faktor VIII měla za následek, v případě dvou pacientů ze tří, proteolýzu molekul. Byla prokázána specifičnost hydrolýzy na protilátková kombinační místa aloprotilátek anti-faktor VIII izotypu IgG. Ko-inkubace [^1Z5I]-faktoru VIII s afinitně purifikovaným IgG anti-faktor VIII pacientů Bor a Wal v přítomnosti inhibitorů proteáz aprotininu (0,15 μΜ), E-64 (28 μΜ), EDTA (1,3 μΜ), leupeptinu (10 μΜ) a pepstatinu (10 μΜ) neměla za následek inhibici proteolytické aktivity.

Původci charakterizovali hlavní štěpná místa pro katalytický IgG v molekule faktoru VIII takto: Arg³⁷²-Ser³⁷³, lokalizované mezi doménami AI a A2 faktoru VIII, TyR₁₆ ⁸⁰-Asp¹⁶⁸¹, lokalizované na N-koncové části domény A3 a Glu¹⁷⁹⁴-Asp¹⁷⁹⁵lokalizované v doméně A3.

Byla prokázána závislost hydrolýzy faktoru VIII aloprotilátkami anti-faktor VIII na čase a dávce. Hydrolýza byla pozorována obzvláště za podmínek, kdy IgG anti-faktor VIII a faktor VIII byly společně inkubovány v molérním poměru, který byl 80- až 9500-krát nižší než poměr očekávaný v pacientově plazmě, což svědčí pro to, že hydrolýza je ·· ·*·· «· ·· • ··· mechanismus inaktivace faktoru VIII pacientovými aloprotilátkami in vivo.

Původci dále zkoumali kinetiku hydrolýzy zprostředkované protilátkou faktoru VIII inkubací IgG anti-faktor Vlil pacienta Wal se stoupající koncentrací neznačeného faktoru VIII v přítomnosti stálé koncentrace [¹²⁵I]-faktoru VIII. Křivky reciproční rychlosti vynesené do grafu jako funkce reciproční koncentrace substrátu byly lineární (r=0,99), což svědčí pro to, že se reakce řídí jednoduchou kinetikou podle Michaelise-Mentenové, jako to již dříve bylo pozorováno u polyklonálních katalytických autoprotilétek. Zjevná katalytická účinnost, Vmax a rychlost hydrolýzy aloprotilátkami anti-faktor VIII byly vypočteny v případě pacienta Wal. Kinetické parametry hydrolýzy vypočtené in vitro svědčí pro to, že proteolýza může být mechanismus inaktivace faktoru VIII pacientovými aloprotilátkami in vivo.

Vazba faktoru VIII s von Willebrandovým faktorem (vWF) zvyšuje katalytickou rychlost zatímco chrání faktor VIII trombinu pro faktor VIII, před hydrolýzou aktivovaným proteinem C (APC) . Přidání faktoru vWF k faktoru VIII mělo za následek částečnou inhibici hydrolýzy faktoru VIII prostřednictvím IgG anti-faktor VIII, tj. 36,9 %, když byly purifikovaný faktor vWF a faktor VIII smíchány s použitim poměru (hmotnost/hmotnost), který byl podobný poměru předpokládanému v normální plazmě, tj. 30 gg/ml vWF proti 300 ng/ml faktoru VIII.

Identifikace aloprotilátek anti-faktor VIII jako katalytických protilátek rozšiřuje spektrum katalytických imunitních reakcí, navíc k předešlým publikacím týkajících se hydrolyzujících protilátek proti vazoaktivnímu intestinálnímu peptidu (VIP) u pacientů s astmatem, DNA-hydrolyzujících protilátek u pacientů se SLE a katalytických protilátek specifických pro tyeroglobulin u pacientů s autoimunitní • · • · · * · · · · t • φ · · · · · » ««««·« «··· 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 |3 ···· Φ· ·· 99 ♦ · 9999 tyreoiditidou. Toto je také podle nej lepších znalostí původců první záznam o indukci katalytických protilátek u člověka, jako odpověď na exogenní podávání antigenu proteinové povahy. Kinetické parametry hydrolýzy faktoru VIII prostřednictvím IgG anti-faktor VIII projevují katalytické vlastnosti a zjištěná množství těchto protilátek v plazmě svědčí pro funkční úlohu katalytické imunitní reakce při inaktivaci faktoru VIII in vivo. V polyklonální směsi aloprotilátek anti-faktor VIII, které se liší svými funkčními vlastnostmi, mohou katalytické protilátky inhibovat prokoagulační aktivitu faktoru VIII rychleji, než nekatalytické protilátky anti-faktor VIII. Identifikace peptidových epitopů, které jsou cíli pro proteolytické protilátky anti-faktor VIII, může tedy být kritická pro naše porozumění patofyziologii reakce inhibitoru faktoru VIII. Kromě toho charakterizace inhibitorů faktoru VIII jako místně specifických proteáz poskytne nové přístupy k léčení pacientů majících aloprotilátky anti-faktor VIII.

Popis obrázků

Vynález bude dále ještě lépe vysvětlen, a také další předměty, charakteristické vlastnosti a jeho výhody budou jasnější, na základě následujícího vysvětlujícího popisu týkajícího se připojených obrázků, které jsou podávány pouze jako neomezující příklady ilustrující specifičnost štěpení faktoru VIII aloprotilátkami anti-faktor VIII.

Obrázek 1 Hydrolýza [¹²⁵I]-faktoru VIII prostřednictvím afinitně purifikovaných protilátek IgG anti-faktor VIII pacientů s hemofilií A s výskytem inhibitoru

Obrázek 1(A):

[¹²⁵I]-značený faktor VIII byl inkubován s afinitně purifikovaným IgG anti-faktor VIII pacientů Bor (dráha Bor), • »·· • · • ··· • t ·· • · * · » 9

9 9 9 9 4 ·· H *1 «»·*

Che {dráha Che) a Wal (dráha Wal) nebo se samotným pufrem (dráha 1) po dobu 10 hodin v 38 °C před prováděním SDS-PAGE a autoradiografií. U dvou ze tří pacientů (Bor a Wal) měla inkubace faktoru VIII s afinitně purifikovaným IgG anti-faktor VIII za následek hydrolýzu molekuly faktoru VIII. Na rozdíl od toho, migrační profil faktoru VIII byl nezměněn, když [¹²⁵I]-značený faktor VIII byl inkubován s IgG anti-faktor VIII purifikovaným z plazmy pacienta Che (dráha Che). Migrační profil faktoru VIII byl také nezměněn po inkubaci s humánním monoklonálním IgG M061 anti-digoxin (mAb) nebo s normálním nefrakcionovaným polyklonálním humánním IgG (Sandoglobulin®, IVIg), které neprojevovaly žádnou inhibiční aktivitu vůči faktoru VIII.

Obrázek 1(B):

Pufry po průtoku afinitní kolonou byly zbaveny protilátek anti-faktor VIII, jak bylo zjištěno prostřednictvím ELISA a nehydrolyzovaly [¹²⁵I]-značený faktor VIII.

Obrázek 1(C) :

Odstranění IgG z kyselých eluátů obsahujících afinitně purifikované protilátky anti-faktor VIII pacientů Wal a Bor prostřednictvím chromatografie na proteinu G, mělo za následek ztrátu jejich hydrolytické aktivity vůči faktoru VIII.

Obrázek 2: Vylučovací chromatografie katalytické aktivity protilátek anti-faktor Vlil

Obrázek 2(A): Aby se dále vyloučila možnost, že proteolytícká aktivita protilátek byla způsobena kontaminujícími proteázami, byly afinitně purifikované protilátky anti-faktor VIII pacienta Wal podrobeny působení 8M močoviny a podrobeny vylučovací chromatografií. Hlavní vrchol byl izolován ve frakci 25, která odpovídala IgG, jak ukázáno pomocí testu ELISA. Hydrolyzující aktivita byla eluována

0···

O ··

0· 0 0 « 0«·· • ··# · 0 0 0 0 « *0 0000 000 15 0000 >0 00 0« 0* «·«· »

společně s IgG frakcí a tato aktivita nebyla detekována ve frakcích, kde se nevyskytoval IgG (např. frakce 35).

Obrázek 2(B):

Hlavní vrchol, který byl izolován ve frakci 25, odpovídal IgG, jak bylo prokázáno prostřednictvím SDS-PAGE radioaktivně značeného obsahu frakce.

Obrázek 3: Závislost proteolýzy [¹²⁵I]-faktoru VIII afinitně purifikovanými protilátkami anti-faktor VIII pacientů s hemofilií A s výskytem inhibitoru na dávce a čase

Kinetika hydrolýzy faktoru VIII aloprotilátkami anti-faktor VIII pacientů Bor a Wal. Rychlost hydrolýzy [¹²⁵I]-značeného faktoru VIII prostřednictvím IgG anti-faktor VIII pacienta Wal byla rychlejší, než rychlost projevovaná IgG anti-faktor VIII pacienta Bor, což svědčilo buď proto, že katalytické protilátky pacientů projevovaly odlišné kinetické vlastnosti nebo, alternativně, že se podíl katalytických protilátek v protilátkách anti-faktor VIII mezi pacienty lišil.

Obrázek 4: Hydrolýza [^12SI]-faktoru VIII prostřednictvím IgG protilátek anti-faktor VIII v přítomnosti stoupajícího množství „studeného faktoru VIII

Kinetika hydrolýzy zprostředkované protilátkou faktoru VIII inkubací IgG anti-faktor VIII pacienta Wal se stoupající koncentrací neznačeného faktoru VIII v přítomnosti stálé koncentrace [¹²⁵I]-faktoru VIII. Přidání stoupajícího množství neznačeného faktoru VIII mělo za následek inhibici hydrolýzy [¹²⁵I]-faktoru VIII prostřednictvím IgG anti-faktor VIII, která byla závislá na dávce. Při maximální koncentraci faktoru VIII, která byla použita (tj. 1,7 μΜ) , nebylo dosaženo saturace hydrolýzy faktoru VIII. Křivky reciproční rychlosti vynesené do grafu jako funkce reciproční koncentrace substrátu byly φ· ·*·Φ »« · · ···« • ·»· φφφ φ · « * < * · φ * ··· · φ

Φ ·· ΦΦΦΦ φ » « ·<·· *· tl * · »· »«** lineární (r=0,99), což svědčí pro to, že se reakce řídí jednoduchou kinetikou podle Michaelise-Mentenové, jako bylo již pozorováno u polyklonálních katalytických autoprotilátek.

Obrázek 5: Inhibice katalytické aktivity IgG anti-faktor VIII pacienta Wal. Proteolýza radioaktivně značeného faktoru VIII aloprotilátkami anti-faktor VIII pacienta Wal byla inhibována přibližně na 62%, když byly protilátky a faktor VIII společně inkubovány v přítomnosti Pefabloc® (na trhu prostřednictvím firmy Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Německo), což ukazovalo účinnost určitého inhibitoru serinových proteáz neutralizovat katalytickou aktivitu některých katalytických protilátek.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Afinitní purifikace protilátek anti-faktor VIII

Protilátky byly izolovány z plazmy prostřednictvím precipitace se sulfátem amonným. Protilátky reaktivní k faktoru VIII pak byly afinitně purifikovány na CNBr aktivované matrix Sepharose 4B, na kterou byl kondenzován imunitně purifikovány komerčně dostupný humánní plazmatický faktor VIII (25 000 U/3 g gelu) . Pufr po průtoku kolonou byl sbírán. Po důkladném promytí s PBS pH 7,4, byly eluovány protilátky anti-faktor VIII s použitím 0,2M glycinu, pH 2,8, dialyzovány proti PBS a koncentrovány pomocí Centriprep. Pufry po průtoku kolonou a eluáty byly rozděleny do alikvotů a uloženy v -20 °C do dalšího použití. F(ab')₂ fragmenty protilátek anti-faktor VIII byly připraveny tak, jak bylo popsáno dříve.

• ··*

Koncentrace IgG anti-faktor VIII byla 130, 20 a 280 pg na 10 mg IgG nanesených na kolonu v případě pacientů Bor, Che a Wal, v daném pořadí, (tj. 143 + 130 pg/ml nefrakcionované plazmy), což je v souladu s předešlým pozorováním.

Příklad 2

Aktivita neutralizující faktor VIII

Aktivita neutralizující faktor VIII protilátek anti-faktor VIII byla zjišťována metodou podle autorů Kasper a kol., a byla vyjádřena jako Bethesda jednotky (BU) (ref.). BU byly definovány jako převrácená hodnota koncentrace IgG, která způsobí 50% inhibici prokoagulační aktivity faktoru VIII. Reziduální aktivita faktoru VIII byla měřena jednostupňovým testem určením aktivovaného parciálního tromboplastlnového Času s použitím humánní plazmy zbavené faktoru VIII (Behring) jako substrátu a humánního placentárního Pathromtinu® (Behring) jako aktivátoru. Zahřátá plazma nebo imunitně purifikovaný IgG anti-faktor VIII, které měly být testovány, byly inkubovány se sloučenou citrátovou humánní plazmou po dobu 2 hodin ve 37 °C. Koagulační čas čtyř sériových ředění referenční sloučené plazmy (Imuno AG, Wien) byl srovnán s koagulačním časem tří ředění každého testovaného vzorku. Ředění byla prováděna v Owren-Kollerově pufru (Diagnostica Stago). Variace mezi testy se pohybovaly v rozmezí mezi 1 a 2,5%.

Afinitně purifikované protilátky anti-faktor VIII pacientů Bor, Che a Wal inhibovaly prokoagulační aktivitu faktoru VIII až do 57,0, 64,0 a 43,0 BU/mg IgG, v daném pořadí.

• ···

Příklad 3

Test hydrolýzy faktoru VIII

Komerčně dostupný humánní rekombinantní faktor VIII byl značen s ^12&I na specifickou aktivitu 11,6 nCi/gg s použitím jodgenové metody. 1,5 až 150 ng [¹²⁵I]-faktoru VIII bylo inkubováno v 50 μΐ 50 mM tris-HCl, pH 7,7, 100 mM glycinu,

0,025% Tween-20 a 0,02% NaNg buď samotné nebo se 17 až 1667 nM imunitně purifikovaného IgG anti-faktor VIII po dobu 5 min až 10 hodin ve 38^QC. Humánní monoklonální IgG anti-digoxin M061 (mAb) a normální nefrakcionovaný humánní polyklonální IgG (IVIg, Sandoglobulin®) byly použity jako negativní kontroly. Vzorky byly smíchány v poměru 1:1 s Laemmliho pufrem bez merkaptoethanolu a byly podrobeny SDS elektroforéze bez povaření, po nanesení 20 μΐ každého vzorku na dráhu. Vzorky byly zpracovány paralelně na 7,5% a 15% SDS-PAGE v neredukujících podmínkách, po nanesení 20 μΐ každého vzorku na dráhu. Migrace byly prováděny při teplotě místnosti s použitím systému mini-PROTEAN II při 25 mA/gel, dokud přední barvivo nedosáhlo konce gelu. Gely pak byly usušeny a proteinové pásy zobrazeny s použitím X-OMAT AR. Po autoradiografíi byly pásy faktoru VIII zjevné molekulární hmotnosti 200 a 300 kD, které byly důsledně hydrolyzovány prostřednictvím IgG anti-faktor VIII, skenovány, aby byl možný výpočet rychlosti hydrolýzy značeného faktoru VIII.

Φ φφφ φφφ φ φ • · φφφ φ φ φ » * φ •φφφ φφ φφ φφ φφ φφφφ

Příklad 4

Rychlá kapalinová chromatografie proteinů gelovou filtrací

100 μΐ alikvot IgG anti-faktor VIII pacienta Wal (740 μ9), podrobený působení 8M urey, byl podroben gelové filtraci na superose-12 koloně ekvilibrované s PBS-0,01% azidem při rychlosti průtoku 0,2 ml/min. Frakce 500 μΐ byly sbírány a testovány na přítomnost IgG pomocí „sendvičového testu ELISA a na proteolytickou aktivitu vůči faktoru VIII po desetinásobném ředění. Proteiny z frakce 25 byly radioaktivně značeny s ¹²⁵I a podrobeny SDS-PAGE za neredukčních podmínek paralelně s normálním polyklonálním humánním IgG. Gel byl obarven Comassie modří, a také byla provedena autoradiografie, oba obrazy pak byly položeny na sebe. Hlavní vrchol byl izolován ve frakci 25, která odpovídala IgG, jak bylo ukázáno pomocí testu ELISA a SDS-PAGE s radioaktivně značeným obsahem frakce. Hydrolyzujicí aktivita byla eluována společně s frakcí IgG a tato aktivita nebyla detekována ve frakcích, ve kterých nebyl přítomný IgG (např. frakce 35).

Příklad 5

Analýza NH-koncové sekvence

Sacharózový přípravek neznačeného humánního rekombinantního faktoru VIII (rDNA-BHK) (300 μς, „octocog alfa, Bayer Corporation, Berkeley, CA) byl podroben působení IgG anti-faktor VIII pacienta Wal (74 pg) v 1500 μΐ 50 mM trisHC1, pH 7,7, 100 mM glycinu, 0, 025% Tween-20 a 0,02% NaN₃ po dobu 24 hodin ve 38^0. Výsledné fragmenty faktoru VIII byly zpracovány na 10% SDS-PAGE při 50 mA v neredukčních podmínkách * 4

4 4 .* I «44« 44 * 4 * 4 4 • 4 4 4 4 «

4« 4· 4444 a přeneseny během 2 hodin v 100 mA na membránu Hybond-P PVDF {Amersham, Little Chalfont, Anglie) v 10 mM CAPS, 10% ethanolu, při pH 11,0. Po značení modří Coomassie byly viditelné pásy vyřezány a podrobeny N-koncovému sekvencování, s použitím automatického proteinového mikrosekvenátoru Prosize 492 cLC (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) . Množství sekvencovaného proteinu se pohybovalo v rozmezí od 0,5 do 2 pmol, v závislosti na fragmentu.

Hlavní štěpné vazby byly tyto: Arg³⁷²-Ser³⁷³ (R3⁷²-S3⁷³), lokalizovaná mezi Al a A2 doménami faktoru VIII, TyRi₆ ⁸⁰-Asp^16S1(Y^ies0-D¹⁶⁸¹) lokalizovaná v N-koncové části domény A3 a Glu¹⁷⁹⁴Asp¹⁷⁹⁵ (e¹⁷⁹⁴-D¹⁷⁹⁵) lokalizované v doméně A3. Několikanásobné místo štěpení faktoru VIII protilátkami anti-faktor VIII může mít původ v jednotlivých protilátkách s polyspecifřekou katalytickou aktivitou nebo polyklonální populací protilátek, z nichž každá projevuje specifičnost pro unikátní místo štěpení.

Aminokyselinová sekvence	Místo štěpení
Ser Val Ala Lys Lys His Pro	Arg^3/Z-Ser³⁷³
(SVAKKHP)	(R₃ ⁷²-S₃ ⁷³ )
Asp Gin Arg Gin Gly Ala Glu	Glu¹⁷”-Asp^J
(DQRQGAE)	(E¹⁷⁹⁴-D¹⁷⁹⁵)
Asp Glu Asp Glu Asn Gin Ser	TyRi6⁸⁰-Asp¹⁶⁸¹
(DEDENQS)	, γ!630_^1661 j

* · • ··· · I ·

4 4 4 4* 4 · 4 4 4

04 4 4 4 « 00« «44* 00 4· 0* 00 4004

Příklad 6

Inhibiční studie prováděné pomocí Pefabloc®, generického inhibitoru serinových proteáz

Hydrolýza [¹²⁵I]-faktoru VIII pomocí afinitně purifikovaných protilátek IgG anti-faktor VIII pacientů s hemofilií A s výskytem inhibitoru v přítomnosti Pefabloc®. 150 ng [¹²⁵I]-faktoru VIII bylo inkubováno buď samotné, s 50 gg/ml nM imunitně purifikovaného IgG anti-faktor VIII pacienta Wal nebo v přítomnosti jak IgG anti-faktor VIII, tak 4mM inhibitoru serinových proteáz Pefabloc® (Boehringer) po dobu 5 hodin ve 38°C. Faktor VIII pak byl analyzován pomocí 7,5% SDS-PAGE v neredukčních podmínkách. Po autoradíografii byly pásy faktoru VIII zjevné molekulární hmotnosti 200 a 300 kD, které byly důsledně hydrolyzovány prostřednictvím IgG anti-faktor VIII, skenovány, aby byl možný výpočet procenta hydrolýzy značeného faktoru VIII.

Proteolýza radioaktivně značeného faktoru VIII aloprotilátkami anti-faktor VIII pacienta Wal byla inhibována přibližně na 62%, když byly protilátky a faktor VIII společně inkubovány v přítomnosti Pefabloc®, což ukazovalo účinnost některého inhibitoru serinových proteáz neutralizovat katalytickou aktivitu některých katalytických protilátek.

Další pozorování

Při provádění screeningu purifikovaného IgG deseti silně odpovídavých pacientů s hemofilií A s použitím ¹²⁵I-radioaktivně značeného faktoru VIII jako cílové molekuly byla pozorována změna migračního profilu faktoru VIII v případě šesti pacientů. Tyto výsledky dokládají předešlá pozorování původců a ukazují, že katalytické protilátky antifaktor VIII jsou zjištěny u přibližně 60% pacientů.

Claims

NÁROKY

1. Způsob zjišťování výskytu aloprotilátek anti-faktor VIII schopných degradovat faktor VIII u savce, vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy se i} izoluje plazma ze vzorku krve odebraného savci, ii) izolují aloprotilátky anti-faktor VIII z plazmy, iii) aloprotilátky anti-faktor VIII se přivedou do kontaktu s faktorem VIII po dobu dostatečnou k tomu, aby byla možná jakákoliv degradace faktoru VIII aloprotilátkami anti-faktor VIII a iv) zjistí, po dané době, zda faktor VIII byl účinně degradován aloprotilátkami anti-faktor VIII.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že v kroku ii) se aloprotilátky anti-faktor VIII izolují z plazmy jejich kombinací s faktorem VIII, přičemž faktor VIII je výhodně navázán na matrix.
3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že v kroku ii) se aloprotilátky anti-faktor VIII izolují pomocí afinitní chromatografie.
4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že v kroku ii) afinitní chromatografie obsahuje použití faktoru VIII kovalentně kondenzovaného na Sepharosovou matrix, výhodně aktivovanou bromkyanem.
5. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že v kroku iii) se faktor VIII značí pomocí značícího činidla, výhodně radioaktivního značícího činidla, jako je například zejména ¹²⁶I.

• **· · * · * · · • « «·· ι 9*9 · · • ·· · 9 · 9 · 9 9 «·«« 99 «9 ·· 99 «·9·
6. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že v kroku iii) se faktor VIII přivede do kontaktu s aloprotilátkami anti-faktor VIII na dobu od 0,5 hodiny do 30 hodin, výhodně přibližně 10 hodin, při teplotě od 15 °C do 40°C, výhodně 38°C.
7. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že krok iv) se provádí stanovením, které zahrnuje užití separační techniky, jako je například elektroforéza v gelu, jako je například zejména SDS PAGE nebo gelová filtrace, jako je například zejména rychlá

proteinová kapalinová chromatografie s gelovou filtrací, a zobrazovací techniku, jako je například zejména autoradiografie. 8. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, vyznač u j i c í se tím, že dále obsahuje kroky, kdy

se

v) charakterizuje se místo nebo místa v molekule faktoru VIII štěpená aloprotilátkami anti-faktor VIII.
9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že charakterizace se provádí přivedením faktoru VIII do kontaktu s aloprotilátkami anti-faktor VIII schopnými degradovat faktor VIII, separací a sekvencováním výsledných fragmentů faktoru VIII.
10. Způsob podle nároku 8 nebo 9, vyznačující se tím, že separace se provádí s použitím techniky, jako je například elektroforéza v gelu, zejména například SDS PAGE.

444 4 4 4 » 4 4 · 4 4

4 »4 4 4 4 4 4 · 4

4444 4* 44 44 4· 4444 *
11. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 8 až 10, vyznačující se tím, že sekvencování se provádí s použitím techniky, jako je například N-koncové sekvencování, zejména například s použitím automatického proteinového mikrosekvenátoru.
12. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 8 až 11, vyznačující se tím, že sekvencování lokalizuje štěpitelné vazby: Arg³⁷²-Ser³⁷³, lokalizovanou mezi doménami Al a A2, TyRi6^0O-Asp¹⁶⁰¹, lokalizovanou na N-konci domény A3, a Glu¹⁷⁹⁴-Asp¹⁷⁹⁵, lokalizovanou v doméně A3 molekuly faktoru VIII.
13. Aminokyselinová sekvence:

Ser Val Ala Lys Lys His Pro.
14. Aminokyselinová sekvence:

Asp Glu Asp Glu Asn Gin Ser.
15. Aminokyselinová sekvence:

Asp Gin Arg Gin Gly Ala Glu.
16. Peptidový nebo nepeptidový analog aminokyselinové sekvence podle kteréhokoliv z nároků 13 až 15, který je schopný inhibovat kterékoliv místo v molekule faktoru VIII, které podléhá lýzi aloprotilátkou anti-faktor VIII.
17. Inhibitor degradace faktoru VIII katalyzované aloprotilátkou anti-faktor VIII.
18. Inhibitor podle nároku 17, který obsahuje inhibitor proteáz, jako je zejména hydrochlorid 4-(2-aminoethyl)benzensulfony1fluoridu.

• 9*9 • «•9 99 99 99 ·· 9999
19. Inhibitor podle nároku 17 nebo 18, který inhibuje štěpeni štěpitelné vazby: Arg³⁷²-Ser³⁷³, lokalizované mezi doménami AI, Tyr¹⁶⁸⁰-Asp¹⁶⁸¹, lokalizované na N-koncové části domény A3 a Glu¹⁷⁹⁴-Asp¹⁷⁹⁵ lokalizované v doméně A3 molekuly faktoru VIII.
20. Inhibitor podle kteréhokoliv z nároků 17 až 19, který obsahuje peptidový nebo nepeptidový analog aminokyselinové sekvence:

Ser Val Ala Lys Lys His Pro.
21. Inhibitor podle kteréhokoliv z nároků 17 až 19, který obsahuje peptidový nebo nepeptidový analog aminokyselinové sekvence:

Asp Glu Asp Glu Asn Gin Ser.
22. Inhibitor podle kteréhokoliv z nároků 17 až 19, který obsahuje peptidový nebo nepeptidový analog aminokyselinové sekvence:

Asp Gin Arg Gin Gly Ala Glu.
23. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje farmaceuticky účinné množství aloprotilátky anti-faktor VIII schopné degradovat faktor VIII, zejména připravitelné způsobem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6.
24. Použití aloprotilátek anti-faktor VIII schopných degradovat faktor VIII pro výrobu farmaceutického přípravku pro léčení savce trpícího patologickým stavem vyplývajícím z abnormální hladiny faktoru VIII v jeho krvi.
25. Použití podle nároku 24, kdy patologický stav vyplývá z přítomnosti nadbytku faktoru VIII v krvi savce.

• *·· • · · · · · · «·· ··«« ·« «· «· ·· ·«·
26. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje farmaceuticky účinné množství inhibitoru degradace faktoru VIII podle kteréhokoliv z nároků 17 až 22.
27. Použití inhibitoru degradace faktoru VIII pro výrobu farmaceutického přípravku pro léčení savce trpícího patologickým stavem vyplývajícím z hladiny faktoru VIII v jeho krvi, která je nižší než fyziologická.