CN1229646C - 起催化作用的抗因子ⅷ同种抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种测定能降解哺乳动物中因子VIII的起催化作用的抗因子VIII同种抗体的存在的方法，以及由所述催化作用的抗因子VIII同种抗体使所述因子VIII分子中裂解位点特征化的方法。本发明还涉及一种抗因子VIII同种抗体催化的因子VIII降解抑制剂；以及包含所述能降解哺乳动物中因子VIII并从所述测定方法中获得的起催化作用的抗因子VIII同种抗体的药物组合物；本发明还涉及一种包含抗因子VIII同种抗体催化的因子VIII降解抑制剂的药物组合物。最后本发明涉及所述抗因子VIII同种抗体催化的因子VIII降解抑制剂，包含所述能降解因子VIII以及起源于所述测定方法的起催化作用的抗因子VIII同种抗体的药物组合物，以及包含所述抗因子VIII同种抗体催化的因子VIII降解抑制剂的药物组合物在治疗中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种测定能降解哺乳动物中因子VIII的起催化作用的抗因子VIII同种抗体的存在的方法，以及由所述起催化作用的抗因子VIII同种抗体使所述因子VIII分子中裂解部位特征化的方法。
本发明还涉及一种被抗因子VIII同种抗体催化的因子VIII降解抑制剂。
本发明进一步涉及一种药物组合物，其中包含所述的能降解因子VIII并来源于所述测定方法的起催化作用的抗因子VIII同种抗体，还涉及一种药物组合物，其中包含被所述抗因子VIII同种抗体催化的因子VIII降解抑制剂。
最后，本发明涉及以下这些物质在治疗上的应用，即所述抗因子VIII同种抗体催化的因子VIII降解抑制剂，包含所述能降解因子VIII以及起源于所述测定方法的起催化作用的抗因子VIII同种抗体的药物组合物，以及包含所述抗因子VIII同种抗体催化的因子VIII降解抑制剂的药物组合物。
背景技术
血友病A是一种导致因子VIII分子缺陷或不足的与X染色体连锁的隐性病症，其重型是威胁生命和导致残废的出血疾病。
给具有严重血友病A的病人注入同源的因子VIII导致25％的病案出现抗因子VIII同种抗体(Ehrenforth，S.，Kreuz，W.，Scharrer，I.，Linde，R.，Funk，M.，Güngr，T.，Krackhardt，B.和Komhuber，B.，《Incidence of development of factor VIII and factor IX inhibitors inhaemophiliac》，Lancet，1992，339：594-598)，该同种抗体通过因子VIII与稳定化分子(Saenko，E.L.，Shima，M.，Rajalakshmi，K.J.和Scandella，D.，《A role for the C2 domain of factor VIII in bindingto von Willebrand factor》，J.Biol.Chem.，1994，269：11601-11605；和Saenko，E.L.，Shima，M.，Gilbert，G.E.，和Scandella，D.，《Slowed release of thrombin-cleaved factor VIII from von Willebrandfactor by a monoclonal and a human antibody is a novel mechanismfor factor VIII inhibition》，J.Biol.Chem.，1996，271：27424-27431)，或与对其活性来说必要的分子(Arai，M.，Scandella，D.，和Hoyer，L.W.，《Molecular basis of factor VIII inhibi tion by human antibodies：Antibodies that bind to the factor VIII light chain prevent theinteraction of factor VIII with phospholipid》，J.Clin.Invest.，1989，83：1978-1984；和Zhong，D.，Saenko，E.L.，Shima，M.，Felch，M.和Scandella，D.，《Some human inhibitor antibodies interfere withfactor VIII binding to Factor IX》.，Blood，1998，92：136-142)，或与活化分子(Lubahn，B.C.，Ware，J.，Stafford，D.W.，和Reiser，H.M.，《IdentificatIon of a FVIII epitope recognized by a humanhemophilic inhibitor》，Blood，1989，73：497-499；和Neuenschwander，P.F.，and Jesty，J.，《Thrombin-activated and factor Xa-activatedhuman factor VIII：differences in cofactor activity and decay rate》，Arc.Biochem.Biophys.，1992，296：426-434)的相互作用的空间位阻来抑制因子VIII的促凝血活性。
发明内容
以一种令人完全意外的方式，申请人已发现具有严重血友病A的两位高应答病人的同种抗体造成的因子VIII的降解，显示出迄今为止未知的一种机理，通过该机理因子VIII抑制剂能阻止因子VIII的促凝血功能。
申请人发现的起催化作用的抗因子VIII同种抗体是就他所知在治疗带有因子VIII的病人时出现被诱导的催化抗体的第一次报告。迄今为止仍认为在因子VIII存在下形成抗体是令人非常惊讶的，甚至是荒谬或难以置信的，因为实际上这将通过催化水解使因子VIII分子失去活性(《蛋白质水解(proteolysis)》)。但是至今已报道的在疾病过程中或在生理条件下发现的催化抗体都是自身抗体。因此，被诱发的抗体称作同种抗体(ALLO-antibodies)，其起源与任何自身免疫疾病中的自身抗体(AUTO-antibodies)的起源明显不同。
对于一个病人的抗因子VIII抗体的反应来说，算术平均值Km和表观Vmax分别是9.46±5.62μM和85±60fmol.min-1。因子VIII水解动力参数表明在活体内因子VIII钝化作用中催化免疫应答的功能性作用。
由此抗因子VIII同种抗体作为位点特异蛋白酶的特性给具有抗因子VIII同种抗体的病人提供了新的疾病治疗方法。
因此依据本发明第一方面，本发明提供了一种测定能够降解哺乳动物中因子VIII的、起催化作用的抗因子VIII同种抗体是否存在的方法，其特征在于该方法包括：
i)从所述哺乳动物中取得的血样分离出血浆；
ii)从所述血浆中分离出抗因子VIII同种抗体；
iii)放置所述抗因子VIII同种抗体，使之与因子VIII接触一段时间，该时间足以使所述因子VIII被所述抗因子VIII同种抗体任意降解；以及
iv)在所述的一段时间后，测定所述因子VIII是否被所述的抗因子VIII同种抗体有效地降解。
依据本发明方法步骤ii)的实施方式，所述抗因子VIII同种抗体通过与所述因子VIII组合而从所述血浆中分离出来，所述因子VIII优选与一种基质偶合。有利的是，在步骤ii)中，所述抗因子VIII同种抗体通过亲合色谱法分离出来。优选地在步骤ii)中，所述亲合色谱法包括使用琼脂糖凝胶(Sepharose)基质，优选用溴化氰活化。
依据本发明方法步骤iii)的实施方式，所述因子VIII用一种标记试剂所标记，优选用放射性标记试剂，具体来说如125I。有利的是在步骤iii)中，在约15℃到约40℃，优选为38℃的温度下，所述因子VIII与所述抗因子VIII同种抗体接触放置的时间在约0.5到约30小时之间，优选约10小时。
依据本发明方法步骤iV)的实施方式，测定所述因子VIII是否被所述抗因子VIII同种抗体有效地降解的方法是通过包括分离技术的测定方法来完成的，例如凝胶电泳，具体来说例如SDS PAGE，或凝胶过滤，具体来说例如快速蛋白质液相色谱凝胶过滤，以及造影术，具体来说例如放射自显影术。
依据本发明方法进一步的实施方式，所述方法的特征在于其进一步包括：
V)使被所述抗因子VIII同种抗体裂解的所述因子VIII分子中一个(多个)部位特征化。
依据本发明方法的步骤V)的实施方式，所述的特征化是通过将所述因子VIII与能够降解因子VIII的所述抗因子VIII同种抗体接触放置，分离，然后对由此得到因子VIII片段测序来完成的。有利的是所述分离是用例如凝胶电泳，具体而言如SDS PAGE，或凝胶过滤的技术来实施的。所述测序方法有利地是用例如N-终端测序，具体而言如用自动蛋白质微层序的技术来实施的。通过使用这种测序，将以下易裂开的价键定位：Arg372-Ser373，定位于因子VIII分子A1和A2结构域(domain)之间，Tyr1680-Asp1681，定位于因子VIII分子A3结构域的N-终端上，Glu1794-Asp1795，定位在因子VIII分子的A3结构域内。
依据本发明的第二方面，本发明提供了一种氨基酸序列：
Ser Val Ala Lys Lys His Pro；
一种氨基酸序列：
Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser；和
一种氨基酸序列：
Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu。
本发明还扩展到因子VIII的这种或任何其它序列的变异体(variant)或类似物(analogue)，这些序列能够抑制因子VIII分子中任意容易被抗因子VIII同种抗体水解的位点。在本发明的上下文中，这种变异体可以是以上所述的如一种氨基酸序列的肽或非肽类似物，该氨基酸序列抑制因子VIII分子中任何容易被抗因子VIII同种抗体水解的位点。这种变异体可以是例如在N-端，C-端或两端短几个氨基酸或者长几个氨基酸的该序列的变异体(通过化学合成或通过酶解天然分子可能得到这种变异体)，只要该变异体抑制因子VIII分子中任何易被抗因子VIII同种抗体水解的位点。
因此，依据本发明的第三方面，本发明提供了一种被抗因子VIII同种抗体催化的因子VIII降解抑制剂。有利的是，这种抑制剂的特征在于其包括蛋白酶抑制剂。这种在本发明范围内的能用作抗因子VIII同种抗体催化的因子VIII降解抑制剂的蛋白酶抑制剂的例子是，但不限于，氟代磷酸酯型抑制剂，例如DFP，或磺酰氟化物型抑制剂，例如PMSF或AEBSF(4-(2-氨基乙基)苯基磺酰氟化物)氢氯化物(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德国的著名商标，商标名称是Pefabloc)。更具体而言，这种抑制剂的特征在于所述抑制剂抑制易断裂价键的裂解：Arg372-Ser373，位于因子VIII分子的A1和A2结构域之间，Tyr1680-Asp1681，位于因子VIII分子的A3结构域的N-末端，和Glu1794-Asp1795，位于因子VIII分子的A3结构域内。更优选的是，该抑制剂的特征在于其包括一种氨基酸序列的肽或非肽类似物：
Ser Val Ala Lys Lys His Pro；
一种氨基酸序列的肽或非肽类似物：
Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser；或
一种氨基酸序列的肽或非肽类似物：
Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu。
如上所述的因子VIII降解抑制剂，以及其加成盐，尤其是其药用可接受的加成盐，具有非常有价值的药理学性质(pharmaceutical profile)，因为这些物质对抗因子VIII同种抗体具有中和活性。
这些性能证明了它们在治疗上的应用，且本发明通过药剂的方式进一步涉及因子VIII降解抑制剂，及其加成盐，尤其是它们的在药理学上可接受的加成盐。
因此，尤其是在血友病性质的疾病，更具体地说涉及由于因子VIII缺乏造成的凝血缺陷的疾病的治疗中将具体指明这些物质。
可以提及到的这些物质的应用的例子是具有如轻微或严重血友病A的高响应病人的治疗，例如，一方面(当在这些病人中发现催化抗体的情况下)，和/或另一方面，遭受例如自身免疫疾病的病人(当在这些病人中发现催化抗体的情况下)。
因此，根据本发明的第四主要方面，本发明通过一种药物组合物解决一种长期需要，其特征在于该药物组合物包含如上所述的，特别是可以从以上所述的方法得到的，药用有效量的、能够降解因子VIII的至少一种抗因子VIII同种抗体，或者至少一种加入到药用可接受的赋形剂、媒介物或载体中的其加成盐。
此外，依据本发明的第五主要方面，本发明提供一种药物组合物，其特征在于其包含如上所述的，药用有效量的至少一种因子VIII降解抑制剂，或者至少一种加入到药用可接受的赋形剂、媒介物或载体中的其加成盐。
这些组合物可通过如口腔、直肠、肠胃外、透皮肤的、眼的、鼻的、耳的途径用药。
这些组合物可以是固态或液态的，可以存在于人类药品通常使用的药用形式中，例如，简单或涂布的片剂、胶囊、颗粒、栓剂、注射制剂、透皮体系、滴眼药、气雾剂、喷雾剂和滴耳剂。这些药剂用传统方法制备。其活性主要成分，包括由如上所述的，药用有效量的至少一种因子VIII降解抑制剂或者一种药用可接受的其加成盐组成，可以将其与药用组合物中通常使用的赋形剂掺杂在一起，例如滑石，阿拉伯胶，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，聚维酮，纤维素衍生物，可可脂，半合成的甘油酯，水性或非水性媒介物，从动物或植物得到的脂肪，乙二醇，各种湿润剂，分散剂或乳化剂，硅酮胶，某些聚合物或共聚物，防腐剂，香料和颜料。优选的药剂形式是注射剂形式。
本发明还包括了一种具有中和活性的药物组合物，该组合物可用作尤其是如产生抗因子VIII同种抗体的血友病A疾病的有利疗法；尤其是带有抗因子VIII同种抗体的自身免疫疾病(当在这些病人中发现催化抗体的情况下)，所述组合物的特征在于其包含如上所述的，药用有效量的至少一种因子VIII降解抑制剂，或者至少一种加入到药用可接受的赋形剂、媒介物或载体中的其药用可接受的加成盐。
本发明还包括一种治疗哺乳动物的治病方法，该哺乳动物遭受由其血液中因子VIII水平导致的病状，该治病方法的特征在于将药用有效量的至少一种如上所述的因子VIII降解抑制剂，或者一种其药用可接受的加成盐给所述的哺乳动物用药。
这种方法特别提供了一种治疗血友病特性，尤其是在血液中缺乏因子VIII造成的疾病的有利疗法。
本发明还包括因子VIII降解抑制剂的用途，用于制备一种尤其用于治疗受到血液中因子VIII的负生理级别导致的疾病的哺乳动物的药物组合物。
本发明还包括一种具有抗血栓活性的药物组合物，其尤其可作为治疗如血栓症疾病的有利疗法，所述组合物的特征在于其包括特别是可以从以上所述的方法得到的，药用有效量的能够降解因子VIII的至少一种抗因子VIII同种抗体，或者一种加入到药用可接受的赋形剂、媒介物或载体中的其药用可接受的加成盐。
本发明还包括一种哺乳动物的治疗方法，其特征在于将治疗有效量的至少一种如上所述的抗因子VIII同种抗体，或者一种其药用可接受的加成盐给所述的哺乳动物用药。
这种方法特别提供了一种治疗血栓特性，尤其是在血液中存在过量因子VIII造成的所述病理的有利疗法。
在人类和动物的疗法中，如上所述的抗因子VIII同种抗体或因子VIII降解抑制剂可以任何形式，特别是胶囊或片剂的口服形式，或肠胃外使用的注射液形式，就其本身给药，或与病理生理可接受的赋形剂一起给药。可以想到其它的给药形式，如栓剂，软膏，膏状物，凝胶体或气溶胶制剂。
在本发明的内容中，使用以下术语：
《起催化作用的抗因子VIII同种抗体》的意义应当理解为这样的抗体：该抗体通过因子VIII治疗制剂的输血过程被导向因子VIII，在血友病A病人中引发并赋予因子VIII催化活性；
《因子VIII》的意义应当理解为：在凝血过程中在因子X酶切中的因子IX的一种辅酶；
《因子VIII的降解》的意义应当理解为：从因子VIII产生的片段，其出现不是由于自发水解，或由生理性裂解酶，即凝血酶、活化因子IX、活化因子X和活化蛋白质C造成的水解。
《抗因子VIII同种抗体催化的因子VIII降解抑制剂》的意义应当理解为：属于或不属于因子VIII序列的任何肽，或能特异地中和抗因子VIII催化抗体的水解活性的蛋白酶抑制剂。
人类重组因子VIII被125I放射性标记。从琼脂糖凝胶基质(Sepharosematrix)上带有抑制剂的三位血友病人的血浆中将抗因子VIII同种抗体亲和纯化，且琼脂糖凝胶基质已被免疫纯化的人类因子VIII偶联。亲和纯化的病人Bor，Che和Wal的抗因子VIII抗体抑制因子VIII促凝血活性的数值分别达到IgG 57.0，64.0和43.0BU/mg。
在三人中有两个病人出现以下情况：被标记的因子VIII与抗因子VIII同种抗体共孵育导致分子蛋白水解。证实了IgG同型的抗因子VIII同种抗体的抗体结合部位上的水解特异性。在蛋白酶抑制剂-抑肽酶(0.15μM)，E-64(28μM)，EDTA(1.3μM)，亮肽素(10μM)和胃酶抑素(10μM)存在下，病人Bor和Wal的[125I]-因子VIII与亲和纯化的抗因子VIII IgG的共孵育不会导致蛋白水解活性的抑制。
申请人已经使因子VIII分子中催化IgG的主要裂解部位特征化，如下所示：Arg372-Ser373，位于因子VIII的A1和A2结构域；Tyr1680-Asp1681，位于A3结构域的N-端；Glu1794-Asp1795，位于A3结构域内。
已证实了因子VIII水解对抗因子VIII同种抗体的时间和剂量的依赖性。具体而言，在抗因子VIII IgG和因子VIII共孵育的摩尔比比预计存在于病人血浆中的摩尔比低80到9500倍的条件下观察到水解，表明水解是因子VIII被病人体内的同种抗体钝化的机理。
申请人进一步研究了抗体介导的因子VIII的水解动力学，在固定浓度的[125I]-因子VIII的存在下，使增加浓度的未标记的因子VIII与病人Wal的抗因子VIII IgG一起孵育。将速度倒数作为基质浓度倒数的函数所画的曲线是线性的(r＝0.99)，表明该反应符合简单的Michaelis-Menten动力学，正如已在多克隆催化自身抗体中观察到的。该表观催化效率，Vmax和抗因子VIII同种抗体的水解速率是以病人Wal的情况计算出来的。在体内计算出的水解动力参数表明蛋白水解是病人体内同种抗体造成因子VIII钝化的机理。
将因子VIII与von Willebrand因子(vWF)相连对于因子VIII来说增加了凝血酶的催化速率，在此其保护因子VIII不被活化的蛋白质C(APC)水解。当用类似于普通血浆中存在的重量/重量比，即30μg/ml vWF对300ng/ml因子VIII混合纯化了的vWF和因子VIII时，将vWF加入到因子VIII中，将导致抗因子VIII IgG对因子VIII水解的部分抑制，即36.9％。
抗因子VIII同种抗体作为催化抗体的证实扩展了催化免疫应答的范围，除了先前报道的在哮喘病人中作用于血管的肠内肽(VIP)的水解抗体，还有SLE病人中的DNA水解抗体，以及自身免疫甲状腺炎病人中的对甲状腺球蛋白有特异性的催化抗体。这也是申请人就其所知人体内对蛋白质抗原的外部给药应答，诱导催化抗体的第一次报道。因子VIII被抗因子VIII IgG水解的显示催化特性的动力学参数，以及在血浆中的这些抗体的估计量表明在体内使因子VIII钝化的催化免疫应答的功能作用。对功能特性互相不同的抗因子VIII同种抗体多克隆混合物中，催化抗体能抑制因子VIII的促凝血活性，且抑制速度比非催化的抗因子VIII抗体的速度快。因此证实作为分解蛋白的抗因子VIII抗体的目标的肽抗原决定部位对于我们理解因子VIII抑制剂响应的病理生理学来说是至关重要的。此外，因子VIII抑制剂作为位点特异蛋白酶的特性将给具有抗因子VIII同种抗体的病人提供新的治疗方法。
附图说明
从以下参考附图的解释性说明中将更好地理解本发明及本发明的其它目的、特征和优点，这些附图仅仅是以非限制性例子的方式给出的，说明了因子VIII被抗因子VIII同种抗体的裂解的特异性。
图1：带抑制剂的血友病A病人的亲和纯化抗因子VIII IgG抗体对[125I]-因子VIII的水解。
图1(A)
在SDS-PAGE和反射自显影之前，使[125I]标记的因子VIII与病人Bor(泳道Bor)，Che(泳道Che)和Wal(泳道Wal)的亲和纯化抗因子VIII IgG，或者与缓冲剂单独(泳道1)在38℃下孵育10小时。在三位病人的两位(Bor和Wal)中，因子VIII与亲和纯化的抗因子VIII IgG的孵育导致因子VIII分子的水解。相反，当[125I]标记的因子VIII与从病人Che(泳道Che)的血浆中纯化的抗因子VIII IgG一起孵育时，因子VIII的迁移轮廓不变。当因子VIII与人类单克隆M061抗地高辛IgG(mAb)或与通常未分级的多克隆人类IgG(Sandoglobulin，IVIg)一起孵育时，因子VIII的迁移轮廓也不变。
图1(B)
由ELISA所测定的亲和柱的流通物缺少抗因子VIII抗体，并且[125I]标记的因子VIII未水解。
图1(C)
从含有病人Wal和Bor的亲和纯化抗因子VIII抗体的酸洗脱液中，通过色谱法除去蛋白质G上的IgG导致它们对因子VIII的水解活性丧失。
图2：抗因子VIII抗体的催化活性的尺寸排阻色谱法。
图2(A)
为进一步排除抗体蛋白水解活性造成的蛋白酶污染的可能性，用8M尿素处理病人Wal的亲和纯化的抗因子VIII抗体，并对其进行尺寸排阻色谱法。在馏分(fraction)25中分离出相应于ELISA指示的IgG的一个主峰。水解活性随着IgG馏分一起共洗脱，而在IgG不存在的馏分(例如馏分35)中未检测到该活性。
图2(B)
馏分25中分离出相应于IgG的主峰，其由馏分的SDS-PAGE放射性标记含量指示。
图3：[125I]-因子VIII蛋白质水解作用对于带抑制剂的血友病A病人的亲和纯化的抗因子VIII抗体的剂量和时间的依赖性。
研究因子VIII被病人Bor和Wal的抗因子VIII同种抗体水解的动力学。[125I]标记的因子VIII被病人Wal的抗因子VIII IgG水解的速率比被病人Bor的抗因子VIII IgG水解显示出的速率快，这表明病人的催化抗体显示出不同的动力学特性，或者病人之间抗因子VIII抗体中催化抗体的比例不同。
例4：在增加量的冷却因子VIII存在下，抗因子VIII IgG抗体对[125I]-因子VIII的水解。
在固定浓度的[125I]-因子VIII存在下，通过将病人Wal的抗因子VIII IgG与增加浓度的未标记因子VIII一起孵育，研究抗体介导的因子VIII的水解动力学。加入增加量的未标记因子VIII导致抗因子VIII IgG对[125I]-因子VIII水解的剂量依赖的抑制。在使用最大浓度(即1.7μM)的因子VIII时，因子VIII水解未达到饱和。将速度倒数作为基质浓度倒数的函数画出的曲线是线性的(r＝0.99)，表明该反应符合简单的Michaelis-Menten动力学，如同已在多克隆催化自身抗体中观察到的。
图5：病人Wal的抗因子VIII IgG的催化活性的抑制。
在Pefabloc(由Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德国销售)存在下，当抗体和因子VIII共孵育时，病人Wal的放射性标记的抗因子VIII同种抗体对因子VIII的蛋白质水解抑制到约62％，表明了某些丝氨酸蛋白酶抑制剂中和一些催化抗体的催化活性的效力。
具体实施方式
实施例
例I：抗因子VIII抗体的亲和纯化
通过硫酸铵沉淀(法)从血浆中分离出抗体。抗体与因子VIII反应，然后在CNBr活化的Sepharose 4B matrix上亲和纯化，在该Sepharose 4Bmatrix上已经偶联了免疫纯化的从市售人类血浆得到的因子VIII(25000U/3g凝胶)。收集柱流通物。用pH为7.4的PBS进行大量冲洗，用pH为2.8的0.2M甘氨酸洗脱抗因子VIII抗体，对PBS进行渗析，并用Centriperep浓缩。将流通物和洗脱液等分并在-20℃下保存直至使用。抗因子VIII抗体的F(ab’)2片断用先前所述的方法制备。
在病人Bor，Che和Wal中，施加到柱子上的抗因子VIII IgG的浓度分别为每10mg IgG含130、20和280μg(即，143±130μg/mI的未分级的血浆)，这与以前观察到的一致。
例II：因子VIII的中和活性
用Kasper等人的方法测定抗因子VIII抗体的因子VIII中和活性，并用Bethesda单位(BU)(ref)表示。BU的定义是使得因子VIII促凝血活性被抑制50％的IgG浓度的倒数。残留的因子VIII活性用一步测定法测定，用缺乏因子VIII(Behring)的人类血浆作为基质，将人类胎盘pathromtin(Behring)作为活化剂，测定被活化的部分促凝血酶原激酶的时间。被测试的加热了的血浆或免疫纯化的抗因子VIII IgG与贮存的含枸橼酸盐人类血浆在37℃下孵育2小时。将参比血浆池(免疫AG，Wien)的四种顺次的稀释物的凝结时间与要测试的各试样的三种稀释物的凝结时间对比。在Owren-Koller缓冲器中(Diagnostica Stago)进行稀释。中间测试变化范围在1和2.5％之间。
病人Bor，Che和Wal的亲和纯化的抗因子VIII抗体抑制因子VIII促凝血活性分别达到57.0，64.0和43.0 BU/mg IgG。
例III：因子VIII的水解测试
用生碘方法用125I对市售人类重组体因子VIII标记，使其具有特定活性11.6nCi/μg。[125I]-因子VIII(1.5到150ng)单独或与17到1667nM的免疫纯化的抗因子VIII IgG在50μl的50mM的tris-HCI pH7.7、100mM的甘氨酸、0.025％的土温-20和0.02％NaN3中，在38℃下孵育5分钟到10小时。人类单克隆抗地高辛IgG M061(mAb)和通常未分级的人类多克隆IgG(IVIg，Sand-oglobulin)用作阴性对照。将试样与不带有巯基乙醇的Laemmli’缓冲液以1∶1混合，在每个泳道中装载20μl各试样后，不煮沸对其进行SDS电泳。在各泳道装载了20μl各试样之后，在不减速的条件下，使试样在7.5％和15％SDS-PAGE平行跑(电泳)。用微型PROTEAN II体系以25m A/gel在室温下进行迁移，直至染料前部到达凝胶底部。然后将凝胶干燥，用X-OMAT AR显示蛋白质带。在放射自显影之后，因子VIII带的表观分子量200和300kDa与其被抗因子VIII IgG水解的一致，扫描因子VIII带，以计算被标记的因子VIII的水解速率。
例IV：快速蛋白质液相色谱凝胶过滤
用8M尿素处理病人Wal(740μg)的一百μl等分的抗因子VIII IgG，以0.2ml/min的流动速率在用PBS-0.01％叠氮化物平衡了的superose-12柱子上进行凝胶过滤。收集500μl的馏分，用夹心ELISA测试IgG的存在，并在稀释10倍后测试因子VIII分解蛋白的活性。在馏分25中的蛋白质被125I放射标记，并在不减速的情况下与通常的多克隆人类IgG平行地进行SDS-PAGE。凝胶用Comassie Blue染色，并进行放射自显影；然后将两个影像重叠。在相应于ELISA指示的IgG以及馏分的放射性标记含量SDS-PAGE的馏分25中分离出一个主峰。与IgG馏分共洗脱出水解活性，而在不存在IgG的馏分(例如馏分35)中未检测到该活性。
例V：NH2 端序列的分析
未标记的人类重组体因子VIII蔗糖制剂(rDNA-BHK)(300μg，八齿芦苇草，Bayer Corporation，Berkeley，CA)在38℃下被在1500μl的50mM tris-HCI pH7.7、100mM的甘氨酸、0.025％吐温-20和0.02％NaN3中的病人Wal(74μg)的抗因子VIII IgG处理24小时。在不减速的条件下，以50m A在10％的SDS-PAGE上跑(电泳)所得的因子VIII片断，并在pH为11.0时，在10mM CAPS，10％乙醇中的Hybond-P PVDF薄膜(Amersham，Little Chalfont，England)上以100mA交换2小时。用考马斯蓝染色后，切断可见带，并用自动蛋白质微序列器Prosize 492cLC(PE-AppliedBiosystems，Foster City，CA)进行N末端测序。被测序的蛋白质的量的范围是0.5到2pmol，这取决于片断。
主要的易断裂键如下：Arg372-Ser373(R372-S373)，位于因子VIII的A1和A2结构域之间；Tyr1680-Asp1681(Y1680-D1681)，位于A3结构域的N-端上，Glu1794-Asp1795(E1794-D1795)位于A 3结构域之内。抗因子VIII抗体对因子VIII多个部位的裂解可能是从带有多特征催化活性的单个抗体或多克隆抗体群产生的，均显示出独特的裂解部位特异性。
| 氨基酸序列 | 裂解部位 |
| Ser Val Ala Lys Lys His Pro(SVAKKHP)Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu(DQRQGAE)Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser(DEDENQS) | Arg372-Ser373(R372-S373)Glu1794-Asp1795(E1794-D1795)Tyr1680-Asp1681(Y1680-D1681) |
例VI：用Pefabloc，一种丝氨酸蛋白酶种属抑制剂进行抑制剂研究
在Pefabloc存在下，用带抑制剂的血友病A病人的亲和纯化的抗因子VIII IgG抗体进行[125I]-因子VIII的水解。在38℃下，[125I]-因子VIII(150ng)与病人Wal的50μg/ml的免疫纯化的抗因子VIII IgG单独共孵育，或在抗因子VIII IgG和4mM丝氨酸蛋白酶抑制剂Pefabloc(Boehringer)同时存在下孵育5小时。然后在不减速的情况下，用7.5％SDS-PAGE分析因子VIII。在放射自显影之后，扫描与抗因子VIII IgG造成的水解一致的表观分子量为200和300kDa的因子VIII带，以计算被标记的因子VIII的水解％。
当在Pefabloc存在下，抗体和因子VIII共孵育时，放射性标记的因子VIII被病人Wal的抗因子VIII同种抗体的蛋白质水解的抑制为约62％，表明某些丝氨酸蛋白酶抑制剂中和一些催化抗体的催化活性的效力。
进一步观察：
使用125I放射性标记的因子VIII作为目标分子，对带有血友病A的十位高响应病人的纯化IgG进行筛选，在六位病人中观察到因子VIII迁移轮廓的变化。这些结果证实了申请人前面的观察，并表明在约60％的病人中发现起催化作用的抗因子VIII抗体。
Claims (48)
1.一种测定能够降解哺乳动物中因子VIII的抗因子VIII同种抗体存在的方法，其特征在于该方法包括：
i)从所述哺乳动物中取得的血样分离出血浆；
ii)从所述血浆中分离出抗因子VIII同种抗体；
iii)放置所述抗因子VIII同种抗体，使之与因子VIIII接触一段时间，该时间足以使所述因子VIII被所述抗因子VIII同种抗体任意降解；以及
iV)在所述的一段时间后，测定所述因子VIII是否被所述的抗因子VIII同种抗体有效地降解。
2.如权利要求1的方法，其特征在于在步骤ii)中，所述抗因子VIII同种抗体通过与所述因子VIII结合而从所述血浆中分离出来。
3.如权利要求2的方法，其特征在于，所述因子VIII与一种基质偶合。
4.如权利要求1或2的方法，其特征在于在步骤ii)中，所述抗因子VIII同种抗体通过亲和色谱法分离。
5.如权利要求4的方法，其特征在于在步骤ii)中，所述亲合色谱法包括使用与琼脂糖凝胶基质共价键合的因子VIII。
6.如权利要求5的方法，其特征在于，所述琼脂糖凝胶基质用溴化氰活化。
7.如权利要求1的方法，其特征在于在步骤iii)中，所述因子VIII用一种标记试剂标记。
8.如权利要求7的方法，其特征在于，所述标记试剂标记是放射性标记试剂。
9.如权利要求8的方法，其特征在于，所述标记试剂标记是125I。
10.如权利要求1的方法，其特征在于在步骤iii)中，在15℃到40℃，所述因子VIII与抗因子VIII同种抗体接触放置的时间在0.5到30小时之间。
11.如权利要求10的方法，其特征在于在步骤iii)中，在15℃到40℃，所述因子VIII与抗因子VIII同种抗体接触放置的时间为10小时。
12.如权利要求10的方法，其特征在于在步骤iii)中，在38℃的温度下，所述因子VIII与抗因子VIII同种抗体接触放置的时间在0.5到30小时之间。
13.如权利要求10的方法，其特征在于在步骤iii)中，在38℃的温度下，所述因子VIII与抗因子VIII同种抗体接触放置的时间为10小时。
14.如权利要求1的方法，其特征在于步骤iV)是通过包括分离技术和造影术的测定方法来完成的。
15.如权利要求14的方法，其特征在于，所述分离技术选自凝胶电泳或凝胶过滤。
16.如权利要求15的方法，其特征在于，所述凝胶电泳为SDS PAGE。
17.如权利要求15的方法，其特征在于，所述凝胶过滤为快速蛋白质液相色谱。
18.如权利要求14的方法，其特征在于，所述造影术为放射自显影术。
19.如权利要求1的方法，其特征在于其进一步包括：
V)使所述因子VIII分子被所述抗因子VIII同种抗体裂解的一个或多个部位特征化。
20.如权利要求19的方法，其特征在于所述的特征化是通过将所述因子VIII与能够降解因子VIII的抗因子VIII同种抗体接触放置，然后分离，并对由此得到因子VIII片段测序来完成的。
21.如权利要求20的方法，其特征在于所述分离是用凝胶电泳技术来完成的。
22.如权利要求21的方法，其特征在于所述凝胶电泳为SDS PAGE。
23.如权利要求20的方法，其特征在于所述测序方法是用N末端测序技术来完成的。
24.如权利要求23的方法，其特征在于所述N末端测序技术为自动蛋白质微序列器。
25.如权利要求20的方法，其特征在于所述测序位于以下易裂开的价键处：Arg372-Ser373，位于因子VIII分子A1和A2结构域之间，Tyr1680-Asp1681，位于因子VIII分子A3结构域的N末端上，Glu1794-Asp1795位于因子VIII分子的A3结构域之内。
26.一种氨基酸序列：
Ser Val Ala Lys Lys His Pro。
27.一种氨基酸序列：
Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser。
28.一种氨基酸序列：
Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu。
29.一种如权利要求26-28任何一项的氨基酸序列的物质，其特征在于其能抑制因子VIII分子中易被抗因子VIII同种抗体水解的部位。
30.一种抗因子VIII同种抗体催化的因子VIII降解抑制剂在用于中和起催化作用的抗因子VIII同种抗体的药物制备中的用途，所述抑制剂包括如下氨基酸序列的物质：
Ser Val Ala Lys Lys His Pro，
Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser或
Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu。
31.如权利要求30的用途，其特征在于所述抑制剂包括蛋白酶抑制剂。
32.如权利要求31的用途，其特征在于所述蛋白酶抑制剂是4-(2-氨基乙基)苯基磺酰氟化物氢氯化物。
33.如权利要求30或31的用途，其特征在于所述抑制剂抑制如下易裂开的价键的裂解：Arg372-Ser373，位于因子VIII分子A1和A2结构域之间，Tyr1680-Asp1681，位于因子VIII分子A3结构域的N末端，和Glu1794-Asp1795，位于因子VIII分子的A3结构域之内。
34.一种药物组合物，其特征在于其包括如权利要求29所述的药用有效量的因子VIII降解抑制剂。
35.因子VIII降解抑制剂的用途，用于制备用于治疗受到血液中因子VIII的负生理级别导致的疾病的哺乳动物的药物组合物，所述抑制剂包括如下氨基酸序列的物质：
Ser Val Ala Lys Lys His Pro，
Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser或
Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu。
36.如权利要求35的用途，其特征在于所述抑制剂包括蛋白酶抑制剂。
37.如权利要求36的用途，其特征在于所述蛋白酶抑制剂是4-(2-氨基乙基)苯基磺酰氟化物氢氯化物。
38.如权利要求35或36的用途，其特征在于所述抑制剂抑制如下易裂开的价键的裂解：Arg372-Ser373，位于因子VIII分子A1和A2结构域之间，Tyr1680-Asp1681，位于因子VIII分子A3结构域的N末端，和Glu1794-Asp1795，位于因子VIII分子的A3结构域之内。
39.如权利要求35的用途，其中所述疾病具有血友病性质。
40.如权利要求39的用途，其中所述血友病性质是涉及由于因子VIII缺乏造成的凝血缺陷的疾病。
41.如权利要求40的用途，其中所述涉及由于因子VIII缺乏造成的凝血缺陷的疾病是血友病A。
42.一种抗因子VIII同种抗体催化的因子VIII降解抑制剂，其特征在于其包括如下氨基酸序列的物质：
Ser Val Ala Lys Lys His Pro。
43.一种抗因子VIII同种抗体催化的因子VIII降解抑制剂，其特征在于其包括如下氨基酸序列的物质：
Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser。
44.一种抗因子VIII同种抗体催化的因子VIII降解抑制剂，其特征在于其包括如下氨基酸序列的物质：
Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu。
45.一种药物组合物，其特征在于其包括药用有效量的抗因子VIII同种抗体催化的因子VIII降解抑制剂，该抑制剂包括如下氨基酸序列的物质：
Ser Val Ala Lys Lys His Pro，
Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser或
Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu。
46.如权利要求45所述的药物组合物，其特征在于其还包括蛋白酶抑制剂。
47.如权利要求46所述的药物组合物，其特征在于所述蛋白酶抑制剂是4-(2-氨基乙基)苯基磺酰氟化物氢氯化物。
48.如权利要求45或46所述的药物组合物，其特征在于所述抑制剂抑制如下易裂开的价键的裂解：Arg372-Ser373，位于因子VIII分子A1和A2结构域之间，Tyr1680-Asp1681，位于因子VIII分子A3结构域的N末端，和Glu1794-Asp1795，位于因子VIII分子的A3结构域之内。
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