ES2642718T3 - Moléculas de anticuerpos que se unen a la trombina y usos de las mismas - Google Patents

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

DESCRIPCION

Moleculas de anticuerpos que se unen a la trombina y usos de las mismas La presente invencion se refiere a moleculas de anticuerpos que inhiben la trombina.

La coagulacion sangumea es un proceso clave en la prevencion del sangrado de los vasos sangumeos danados (hemostasia). Sin embargo, un coagulo sangumeo que obstruya el flujo de la sangre a traves de un vaso (trombosis) o que se desprenda y se aloje en cualquier vaso del cuerpo (tromboembolia) puede ser un peligro serio para la salud.

Hay disponibles varias terapias anticoagulantes para tratar la coagulacion sangumea patologica. Un inconveniente de estas terapias es un aumento del riesgo de hemorragias (Mackman (2008) Nature 451(7181): 914-918). Muchos agentes anticoagulantes tienen una ventana terapeutica estrecha entre la dosis que previene la trombosis y la dosis que induce la hemorragia. Esta ventana a menudo esta restringida adicionalmente por variaciones den la respuesta de paciente individuales.

La presente invencion se refiere al hallazgo sorprendente de que las moleculas de anticuerpo que reconocen el epftopo exositio 1 de la trombina inhiben selectivamente la trombina sin promover hemorragias. Estas moleculas de anticuerpo pueden ser utiles en el tratamiento y prevencion de trombosis, embolia y otras afecciones mediadas por la trombina.

Un aspecto de la invencion proporciona una molecula de anticuerpo aislada que se une espedficamente al exositio 1 de la trombina, en el que la molecula de anticuerpo comprende un dominio VH que comprende unas HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 3, 4 y 5, respectivamente, y un dominio VL que comprende una LCDR2 y una LCDR3 que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 8 y 9, respectivamente, y una LCDR1 que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 7 o una LCDR1 que tiene la SEQ ID NO: 7 en la que el sitio de glicosilacion esta mutado mediante la introduccion de una sustitucion en un resto de aminoacido que corresponde con el S30 de la SEQ ID NO: 6.

Las moleculas de anticuerpo anti-exositio 1 aisladas pueden inhibir la trombina in vivo sin promover o sin promover sustancialmente el sangrado o hemorragia, es decir, las moleculas de anticuerpo no inhiben o no inhiben sustancialmente las respuestas fisiologicas frente a una lesion vascular (es decir, la hemostasia). Por ejemplo, la hemostasia puede no inhibirse o se inhibe mmimamente por las moleculas de anticuerpo (es decir, se inhibe en un grado insignificante que no afecta al bienestar del paciente o no necesita una intervencion adicional). El sangrado puede no estar aumentado o puede estar aumentar mmimamente por las moleculas de anticuerpo.

El exositio 1 (tambien conocido como 'exositio 1 de union anionica' y el 'exositio de reconocimiento del fibrinogeno') es un sitio de union secundario bien caracterizado en la molecula de trombina (vease, por ejemplo, James A. Huntington, 2008, Structural Insights into the Life History of Thrombin, in Recent Advances in Thrombosis and Hemostasis 2008, editores; K. Tanaka y E.W. Davie, Springer Japan KK, Tokyo, pp. 80-106). El exositio 1 se forma en la trombina madura pero no se forma en la protrombina (vease por ejemplo, Anderson et al (2000) JBC 2775 16428-16434).

El exositio 1 esta implicado en el reconocimiento de sustratos de la trombina tales como el fibrinogeno, pero esta alejado del sitio catalftico activo. Distintos factores de union a la trombina se unen al exositio 1, incluyendo el dodecapeptido hirugen anticoagulante (Naski et al 1990 JBC 265 13484-13489), factor V, factor VIII, trombomodulina (co-factor para la protema C y la activacion de TAFI), fibrinogeno, PAR1 y fibrina (el cofactor para la activacion del factor XIII). Wu et al (1994 JBC 269: 3725-3730) caracteriza el epftopo de un anticuerpo espedfico del exositio de la trombina que se ha descubierto que inhibe la coagulacion de fibrinogeno y las actividades de union a la trombomodulina de la trombina que se aislo de un paciente con trombosis arterial recurrente. ARNAUD E ET AL: "An autoantibody directed against human thrombin anion-binding exosite in a patient with arterial thrombosis: Effects on platelets, endothelial cells, and protein C activation”, BLOOD 19940915 uS, vol. 84, n° 6, 15 Septiembre 1994 (199409-15), paginas 1843-1850 exponen un autoanticuerpo dirigido contra el exositio de union anionica de la trombina humano en un paciente con trombosis arterial, en el que dicho Ab inhibe todas las interacciones de la trombina que necesitan un sitio de union secundario sin interferir con el sitio catalftico (resumen). Desvela un Ab contra el exositio de union anionica de la trombina humana aislado de pacientes, inhibiendo el Ab especfticamente la agregacion plaquetaria inducida por la trombina. El epftopo reconocido por el Ab engloba His 66, Arg 68, Arg 70, Por 23, Glu 24, Glu 25 de la cadena B de la trombina. El Ab retrasaba todas las acciones procoagulantes de la trombina tales como la formacion de fibrina y la agregacion plaquetaria, pero tambien la produccion de PGI2 por las celulas endoteliales. El Ab tambien inhibe la activacion de protemas por la trombina en presencia de trombomodulina.

CHANG A C ET AL: "The reaction of thrombin with platelet-derived nexin requires a secondary recognition site in addition to the catalytic site”, BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, ACADEMIC PRESS INC. ORLANDO, FL, US, vol. 177, n° 3, 28 de Junio de 1991 (1991-06-28), paginas 1198-1204 desvela un anticuerpo monoclonal EST-6 que bloquea las reacciones de trombina que implican el exositio de union anionica. El

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Ab inhibe la accion de la trombina sobre el fibrinogeno pero no inhibe la actividad amidolftica. El Ab reacciona con Arg 75-Arg 77a de la cadena B de la trombina.

QUINGYU WU ET AL: "ACTIVATION-INDUCED EXPOSURE OF THE THROMBIN ANION-BINDING EX-OSITE. OINTERACTIONS OF RECOMBINANT MUTANT PROTHROMBINS WITH THROMBOMODULIN AND A THROMBIN EXOSITE-SPECIFIC ANTIBODY”, JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, AMERICAN SOCIETY FOR BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, US, vol. 269, n° 5, 4 Febrero 1994 (1994-02-04), paginas 3725-3730 desvelan un autoanticuerpo de un paciente con trombosis arterial recurrente que inhibe la coagulacion del fibrinogeno y las actividades de union de la trombomodulina de la trombina, sugiriendo que el Ab reconoce un epftopo exositio en la trombina. Dicho Ab inhibe la interaccion de la trombina con el fibrinogeno y la trombomodulina pero no la actividad amidolftica de la trombina.

Un anticuerpo anti-exositio de la invencion se une al exositio 1 de la trombina humana madura. La secuencia de preprotrombina humana se expone en la SEQ ID NO: 1. La protrombina humana tiene la secuencia de los restos 44 a 622 de la SEQ ID NO: 1. La trombina humana madura tiene la secuencia de los restos 314-363 (cadena ligera) y los restos 364 a 622 (cadena pesada).

En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-exositio 1 tambien se puede unir al exositio 1 de la trombina madura de otras especies. Las secuencias de trombina de otras especies se conocen en la tecnica y estan disponibles en bases de datos publicas tales como GenBank. Lo restos correspondientes de las secuencias de trombina de otras especies se pueden identificar facilmente utilizando herramientas de alineamiento de secuencias.

El esquema de numeracion de los restos de trombina que se exponen en el presente documento es convencional en la tecnica y se basa en el armazon de la quimotripsina (Bode W et al EmBO J. 1989 Nov; 8(11):3467-75). La trombina tiene bucles de insercion relacionados con la quimotripsina que se representan con letras secuencialmente utilizando letras minusculas.

El exositio 1 de la trombina humana madura esta subrayada en la SEQ ID NO: 1 y puede incluir los siguientes restos: M32, F34, R35, K36, S36a, P37, Q38, E39, L40, L65, R67, S72, R73, T74, R75, Y76, R77a, N78, E80, K81, I82, S83, M84, K109, K110, K149e, G150, Q151, S153 y V154. En algunas realizaciones, otros restos de trombina que se localizan cerca de (es decir, a 0,5 nm o a 1 nm) de uno cualquiera de estos restos se pueden considerar que son parte del exositio 1. Un anticuerpo anti-exositio 1 se puede unir a un epftopo que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o mas de 20 restos de exositio 1. Preferentemente, un anticuerpo anti- exositio 1 se une a un epftopo que consiste completamente de restos de exositio 1.

Por ejemplo, un anticuerpo anti-exositio 1 se puede unir a un epftopo que puede unirse a un epftopo que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o los 16 restos que se seleccionan de entre el grupo que consiste en M32, F34, S36a, P37, Q38, E39, L40, L65, R67, R73, T74, R75, Y76, R77a, I82 y Q151 de la trombina humana o los restos de trombina equivalentes de otras especies. En algunas realizaciones preferidas, el epftopo puede comprender los restos de trombina Q38, R73, T74, Y76 y R77a y opcionalmente uno o mas restos adicionales.

Las moleculas de anticuerpo anti-exositio 1 como se describe en el presente documento son espedficos del exositio 1 de la trombina y se unen a este epftopo con alta afinidad con respecto a otros epftopos, por ejemplo, epftopos de protemas de mairftfero distintas de la trombina madura. Por ejemplo, una molecula de anticuerpo anti-exositio 1 puede presentar una afinidad de union por el exositio 1 de la trombina con al menos 500 veces, al menos 1000 veces, o al menos 2000 veces mayor que por los otros epftopos.

Preferentemente, una molecula de anticuerpo como se describe en el presente documento que es espedfica del exositio 1 se puede unir a la trombina madura pero no presentar uniones ni unirse sustancialmente a la protrombina.

Sin quedar unidos por teona alguna, los anticuerpos anti-exositio 1 pueden ser incapaces de acceder a la trombina en el centro de un coagulo hemostatico, y por lo tanto son incapaces de afectar la hemostasia interrumpiendo la funcion normal de la trombina en los sitios de lesion vascular. Sin embargo, debido a que los anticuerpos anti- exositio 1 se siguen uniendo a la trombina en la superficie del coagulo y en la cubierta externa del coagulo, se evita la trombosis, es decir, se evita la extension del coagulo no hemostatico.

Una molecula de anticuerpo anti-exositio 1 puede tener una constante de disociacion para el exositio 1 de menos de 50 nM, menos de 40 nM, menos de 30 nM, menos de 20 nM, menos de 10 nM, o menos de 1 nM. Por ejemplo, una molecula de anticuerpo puede tener una afinidad para el exositio 1 de 0,1 a 50 nM, por ejemplo, 0,5 a 10 nM. Una molecula de anticuerpo anti-exositio 1 adecuada puede, por ejemplo, tener una afinidad para el exositio 1 de la trombina de aproximadamente 1 nM.

La cinetica de union y la afinidad (expresada como la constante de disociacion en equilibrio, Kd) de las moleculas de anticuerpo anti-exositio 1 se puede determinar utilizando tecnicas convencionales, tales como la resonancia de plasmones superficiales, por ejemplo, utilizando un analisis BIAcore.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Una molecula de anticuerpo anti-exositio 1 como se describe en el presente documento puede ser una inmunoglobulina o un fragmento de la misma, y puede producirse naturalmente o de manera parcial o completamente sintetica.

Las moleculas de anticuerpo anti-exositio 1 pueden incluir cualquier polipeptido o protema que comprende un sitio de union al antfgeno del anticuerpo, incluyendo Fab, Fab2, Fab3, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos y anticuerpos de dominio sencillo, incluyendo los nanocuerpos, asf como anticuerpos completos de cualquier isotipo o sub-clase. Las moleculas de anticuerpo y los metodos para su construccion y uso, se describen, por ejemplo, en Holliger & Hudson, Nature Biotechnology 23(9):1126-1136 (2005).

En algunas realizaciones preferidas, la molecula de anticuerpo anti-exositio 1 puede ser un anticuerpo completo. Por ejemplo, la molecula de anticuerpo anti-exositio 1 puede ser una IgG, IgA, IgE, o IgM o cualquiera de las sub-clases de isotipo, particularmente IgG1, e IgG4. Las moleculas de anticuerpo anti-exositio 1 pueden ser anticuerpos monoclonales. En otras realizaciones preferidas, la molecula de anticuerpo anti-exositio 1 puede ser un fragmento de anticuerpo.

Las moleculas de anticuerpo anti-exositio 1 pueden ser anticuerpos quimericos, humanizados o humanos.

Las moleculas de anticuerpo anti-exositio como se describen en el presente documento se pueden aislar, en el sentido de estar libres de contaminantes, tales como anticuerpos capaces de unirse con otros polipeptidos y/o componentes del suero. Los anticuerpos monoclonales son preferidos para algunos propositos, aunque tambien se pueden emplear los anticuerpos policlonales.

Las moleculas de anticuerpos anti-exositio 1 se pueden obtener utilizando tecnicas que son convencionales en la tecnica. Los metodos de produccion de anticuerpos incluyen la inmunizacion de un mairnfero (por ejemplo, un raton, rata, conejo, caballo, cabra, oveja o mono) con la protema o un fragmento de la misma. Los anticuerpos se pueden obtener a partir de los animales inmunizados utilizando cualquiera de una variedad de tecnicas conocidas en la tecnica, y exploradas, preferentemente utilizando la union del anticuerpo al antfgeno de interes. Por ejemplo, se pueden utilizar tecnicas de transferencia de Western o inmunoprecipitacion (Armitage et al., 1992, Nature 357: 8082). El aislamiento de los anticuerpos y/o celulas productoras de anticuerpos de un animal puede acompanarse de una etapa de sacrificio del animal.

Como alternativa o suplemento a la inmunizacion de un marnffero con un peptido, se puede obtener un anticuerpo espedfico de una protema a partir de una biblioteca producida recombinantemente de dominios variables de inmunoglobulina expresados, por ejemplo, utilizando bacteriofagos lambda o bacteriofagos filamentosos que presentan dominios de union a inmunoglobulinas funcionales en sus superficies; por ejemplo vease el documento WO 92/01047. La biblioteca puede estar intacta, que esta construida con secuencias obtenidas de un organismo que no se ha inmunizado con ninguna de las protemas (o fragmentos), o puede estar construida utilizando secuencias obtenidas de un organismo que se ha expuesto al antfgeno de interes.

Otras moleculas de anticuerpo anti-exositio 1 se pueden identificar explorando el suero de pacientes en cuanto a anticuerpos que se unan al exositio 1.

En algunas realizaciones, las moleculas de anticuerpo anti-trombina se puede producir por cualquier medio conveniente, por ejemplo, u metodo descrito anteriormente, y despues explorando por union diferencial a la trombina madura con respecto a la trombina con una mutacion de exositio 1, gamma trombina (exositio 1 deficiente debido a autolisis en R75 y R77a) o protrombina. Los metodos de exploracion adecuados son bien conocidos en la tecnica.

Un anticuerpo que presenta un aumento de union con la trombina madura, con respecto a las protemas no trombinas, trombina con una mutacion exositio 1, gamma trombina, o protrombina, por ejemplo un anticuerpo que se une a la trombina madura pero no se une a la trombina con una mutacion exositio 1, gamma trombina o protrombina, se puede identificar como una molecula de anticuerpo anti-exositio 1.

Tras la produccion y/o aislamiento, se puede ensayar la actividad biologica de una molecula de anticuerpo anti- exositio 1. Por ejemplo, se puede determinar la capacidad de la molecula de anticuerpo para inhibir un sustrato de trombina, cofactor o union del inhibidor o escision por la trombina y/o se puede determinar la capacidad de la molecula de anticuerpo apara inhibir la trombosis sin promover el sangrado.

Las moleculas de anticuerpo adecuadas se pueden ensayar en cuanto a la actividad utilizando un ensayo de coagulacion de fibrinogeno o tiempo de trombina. Los ensayos adecuados son bien conocidos en la tecnica.

El efecto de una molecula de anticuerpo sobre la coagulacion y el sangrado se puede determinar utilizando tecnicas convencionales. Por ejemplo, el efecto de una molecula de anticuerpo sobre la trombosis se puede determinar en un modelo animal, tal como un modelo de raton con coagulos en los vasos sangumeos inducidos por cloruro ferrico. Los efectos sobre la hemostasia tambien se pueden determinar en un modelo animal, por ejemplo, midiendo la hemorragia en la cola de un raton.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Las moleculas de anticuerpo comprenden normalmente un dominio de union al antigeno que comprenden un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina (VH) y un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina (VL), aunque los dominios de union al antigeno que comprenden solo un dominio variable de cadena pesada (VH) tambien son posibles (por ejemplo, anticuerpos de camelidos o de tiburon).

Cada uno de los dominios VH y VL comprenden normalmente tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) responsables de la union al antfgeno, con regiones marco conservadas intercaladas.

En algunas realizaciones, la union al exositio 1 puede producirse completa o sustancialmente mediante la VHCDR3 de la molecula de anticuerpo anti-exositio 1.

Una molecula de anticuerpo anti-exositio 1 de la presente divulgacion puede comprender un dominio VH que comprende una HCDR3 que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 5 o la secuencia de SEQ ID NO: 5 con 1 o mas, por ejemplo 2, 3, 4 o 5 o mas sustituciones, eliminaciones o inserciones de aminoacidos. Las sustituciones pueden ser sustituciones conservadoras. La HCDR3 puede comprender los aminoacidos de las posiciones 4 a 9 de la SEQ ID NO: 5 (SEFEPF), o mas preferentemente los restos de aminoacidos de las posiciones 2 y 4 a 10 de la SEQ ID NO: 5 (D y SEFEPFS) con sustituciones, eliminaciones o inserciones en una o mas de otras posiciones de la SEQ ID NO: 5. La HCDR3 puede ser la unica region de la molecula de anticuerpo que interactue con un epttopo exositio 1 de la trombina o sustancialmente la unica region. La HCDR3 puede determinar por lo tanto la especificidad y/o afinidad de la molecula de anticuerpo para la region de exositio 1 de la trombina.

El dominio VH de una molecula de anticuerpo anti-exositio 1 de la presente divulgacion puede comprender adicionalmente una HCDR2 que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 4 o la secuencia de SEQ ID NO: 4 con 1 o mas, por ejemplo 2, 3, 4 o 5 o mas sustituciones, eliminaciones o inserciones de aminoacidos. La HCDR2 puede comprender los restos de aminoacidos en las posiciones 3 a 7 de la SEQ ID NO: 4 (DPQDG) o los restos de aminoacidos de las posiciones 2 y 4 a 7 de la sEq ID NO: 4 (L y PQDG) de la SEQ ID NO: 4, con sustituciones, eliminaciones o inserciones en una o mas de otras posiciones de la SEQ ID NO: 4.

El dominio VH de la molecula de anticuerpo anti-exositio 1 de la presente divulgacion puede comprender una HCDR1 que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 3 o la secuencia de SEQ ID NO: 3 con 1 o mas, por ejemplo, 2, 3, 4 o 5 o mas sustituciones, eliminaciones o inserciones de aminoacidos. La HCDR1 puede comprender un resto de aminoacido T en la posicion 5 de la SEQ ID NO: 3 con sustituciones, eliminaciones o inserciones en una o mas de otras posiciones de la SEQ ID NO: 3.

La molecula de anticuerpo que comprende un dominio VH que comprende una HCDR1, una HCDR2 y una HCDR3 que tiene las secuencias de SEQ ID NO: 3, 4 y 5 respectivamente. Una molecula de anticuerpo puede comprender un dominio VH que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 2 o la secuencia de SEQ ID NO: 2 con 1 o mas, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas sustituciones, eliminaciones o inserciones de aminoacidos de la SEQ ID NO: 2.

La molecula de anticuerpo anti-exositio 1 comprende adicionalmente un dominio VL, por ejemplo un dominio VL que comprende una LCDR1, LCDR2 y LCDR3 que tiene las secuencias de SEQ ID NO: 7, 8 y 9 respectivamente. Un dominio VL de la presente divulgacion puede comprender las secuencias de las SEQ ID NO: 7, 8 y 9 respectivamente, con, independientemente, 1 o mas, por ejemplo 2, 3, 4 o 5 o mas sustituciones, eliminaciones o inserciones de aminoacidos. Las sustituciones pueden ser sustituciones conservadoras. Por ejemplo, una molecula de anticuerpo puede comprender un dominio VL que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 6 o la secuencia de SEQ ID NO: 6 con 1 o mas, por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas sustituciones, eliminaciones o inserciones de aminoacidos de la SEQ ID NO: 6.

En algunas realizaciones, el dominio VL puede comprender la Tyr 49.

La molecula de anticuerpo anti-exositio 1 puede comprender por ejemplo una o mas sustituciones, eliminaciones o inserciones de aminoacidos que mejoran una o mas propiedades del anticuerpo, por ejemplo, la afinidad, la semivida funcional, tasa de activacion y anulacion.

Las tecnicas necesarias con el objetivo de introducir sustituciones, eliminaciones o inserciones en las secuencias de aminoacidos de las CDR dominios VH o VL de anticuerpo y anticuerpos estan disponibles en general en la tecnica. Las secuencias variantes se pueden producir, con sustituciones, eliminaciones o inserciones que pueden preverse o no que tengan un efecto mmimo o beneficioso sobre la actividad, y ensayarse para su capacidad para unirse al exositio 1 de la trombina y/o en cuanto a cualquier otra propiedad deseada.

En algunas realizaciones, la molecula de anticuerpo anti-exositio 1 puede comprender un dominio VH que comprende una HCDR1, una HCDR2 y una HCDR3 que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 3, 4 y 5, respectivamente, y un dominio VL que comprende una LCDR1, una LCDR2 y una LCDR3 que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 7, 8 y 9, respectivamente.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Por ejemplo, los dominios VH y VL puede tener la secuencias de aminoacidos de SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 6 respectivamente; o pueden tener las secuencias de aminoacidos de SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 6 que comprenden, independientemente, 1 o mas, por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas sustituciones, eliminaciones o inserciones de aminoacidos. Las sustituciones pueden ser sustituciones conservadoras.

En algunas realizaciones, un anticuerpo puede comprender una o mas sustituciones, eliminaciones o inserciones que retiran un sitio de glicosilacion. Por ejemplo, un sitio de glicosilacion en el dominio VL de la SEQ ID NO: 6 se puede mutar introduciendo una sustitucion en N28 o S30.

La molecula de anticuerpo anti-exositio 1 puede estar en cualquier formato, como se ha descrito anteriormente. En algunas realizaciones preferidas, la molecula de anticuerpo anti-exositio 1 puede ser un anticuerpo completo, por ejemplo una IgG, tal como IgG1 o IgG4, IgA, IgE o IgM.

Una molecula de anticuerpo anti-exositio 1 de la invencion puede ser la que compite por la union al exositio 1 con una molecula de anticuerpo descrita anteriormente, por ejemplo una molecula de anticuerpo que

(i) se une al exositio 1 de la trombina y

(ii) comprende un dominio VH de SEQ ID NO: 2 y/o un dominio VL de SEQ ID NO: 6; una HCDR3 de SEQ ID NO: 5; una HCDR1, HCDR2, LCDR1, LCDR2, o LCDR3 de SEQ ID NO: 3, 4, 7, 8 o 9 respectivamente; un dominio VH que comprende las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID NO: 3, 4 y 5 respectivamente; y/o un dominio VH que comprende las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ iD NO: 3, 4 y 5 y un dominio VL que comprende las secuencias LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 7, 8 y 9 respectivamente.

La competicion entre las moleculas de anticuerpo pueden ensayarse facilmente in vitro, por ejemplo, utilizando ELISA y/o marcando una molecula indicadora espedfica de una molecula de anticuerpo que se pueda detectar en presencia de una o mas moleculas de anticuerpo sin marcar, para hacer posible la identificacion de moleculas de anticuerpo que se unen al mismo epftopo o un epftopo solapado. Dichos metodos se conocen facilmente por un experto habituado en la tecnica. Por lo tanto, un aspecto adicional de la presente invencion proporciona una molecula de anticuerpo que comprende un sitio de union al antigeno del anticuerpo que compite con una molecula de anticuerpo, por ejemplo una molecula de anticuerpo que comprende un dominio VH y/o VL, una CDR, por ejemplo, la HCDR3 o un grupo de CDR del anticuerpo parental descrito anteriormente para la union al exositio 1 de la trombina. Una molecula de anticuerpo adecuada puede comprender un sitio de union al antigeno del anticuerpo que compite con un sitio de union al antigeno del anticuerpo para la union al exositio 1 donde el sitio de union al antigeno del anticuerpo esta compuesto por un dominio VH y un dominio VL, y donde los dominios VH y VL comprenden las secuencias de HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 3, 4 y 5 y secuencias de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las SEQ ID NO: 7, 8 y 9 respectivamente, por ejemplo los dominios VH y VL de las SEQ ID NO: 2 y 6.

Una molecula de anticuerpo anti-exositio 1 como se describe en el presente documento puede inhibir la union de factores de union a la trombina incluyendo factores que se unen al exositio 1. Por ejemplo, una molecula de anticuerpo puede inhibir la union competitiva o no competitivamente de uno o mas de FV, FVIII, trombomodulina fibrinogeno o fibrina, PAR1 y/o hirugen y analogos de la hirudina con la trombina.

Una molecula de anticuerpo anti-exositio 1 como se describe en el presente documento puede inhibir una o mas actividades de la trombina. Por ejemplo, una molecula de anticuerpo anti-exositio 1 puede inhibir la escision hidrolftica de uno o mas sustratos de trombina, tal como el fibrinogeno el receptor de plaquetas PAR-1 y el factor FVIII de coagulacion. Por ejemplo, la union de la molecula de anticuerpo a la trombina puede dar como resultado una disminucion de al menos 5 veces, al menos 10 veces, o al menos 15 veces en la hidrolisis del fibrinogeno, PAR- 1, factor de coagulacion FVIII y/u otros sustratos de la trombina, tal como el factor V, el factor XIII en presencia de fibrina y la protema C y/o TAFI en presencia de trombomodulina. En algunas realizaciones, la union de la trombina por la molecula de anticuerpo anti-exositio 1 puede dar como resultado una escision no detectable del sustrato de la trombina por la trombina.

Las tecnicas para medir la actividad de la trombina, por ejemplo, midiendo la hidrolisis de los sustratos de trombina in vitro son convencionales en la tecnica y se describen en el presente documento.

Las moleculas de anticuerpo anti-exositio 1 se pueden modificar adicionalmente por modificacion qmmica, por ejemplo mediante PEGilacion o mediante incorporacion en un liposoma, para mejorar sus propiedades farmaceuticas, por ejemplo aumentando su semivida in vivo.

El efecto de una molecula de anticuerpo anti-exositio 1 sobre la coagulacion y el sangrado se puede determinar utilizando tecnicas convencionales. Por ejemplo, se puede determinar el efecto de un anticuerpo en un modelo de trombosis. Los modelos adecuados incluyen la induccion de un coagulo en los vasos sangumeos con cloruro ferrico en un modelo murino, seguido por sangrado de la cola para ensayar la hemostasia normal. Otros modelos de trombosis adecuados se conocen bien en la tecnica (vease, por ejemplo, Westrick et al ATVB (2007) 27:2079-2093).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Las moleculas de anticuerpo anti-exositio 1 pueden estar comprendidas en composiciones farmaceuticas con un excipiente farmaceuticamente aceptable.

Un excipiente farmaceuticamente aceptable puede ser un compuesto o combinacion de compuestos que se meten en una composicion farmaceutica que no provoca reacciones secundarias que reacciona y que permite, por ejemplo, la facilitacion de la administracion de la molecula de anticuerpo anti-exositio 1, un aumento en su periodo de vida y/o en su eficacia en el cuerpo o un aumento de su solubilidad en solucion. Estos veldculos farmaceuticamente aceptables se conocen bien y seran adaptadas por el experto en la tecnica en funcion del modo de administracion de la molecula de anticuerpo anti-exositio 1.

En algunas realizaciones las moleculas de anticuerpo anti-exositio 1 pueden proporcionarse en forma liofilizada para su reconstitucion antes de la administracion. Por ejemplo, las moleculas de anticuerpo liofilizadas puede reconstitute en agua esteril y mezclarse con solucion salina antes de la administracion a un individuo.

Las moleculas de anticuerpo anti-exositio 1 se administraran habitualmente en forma de una composicion farmaceutica, que puede comprender al menos un componente ademas de la molecula de anticuerpo anti-exositio 1, un excipiente, veldculo, tampon, estabilizante farmaceuticamente aceptable, u otros materiales bien conocidos por los expertos en la tecnica. Dichos materiales no debenan ser toxicos y no debenan interferir en la eficacia de la molecula de anticuerpo anti-exositio 1. La naturaleza precisa del veldculo u otro material dependera de la via de administracion, que puede ser como embolada, infusion, inyeccion o cualquier otra via adecuada, como se expone posteriormente.

Para la administracion parenteral, por ejemplo subcutanea o intravenosa, por ejemplo, por inyeccion, la composicion farmaceutica que comprende la molecula de anticuerpo anti-exositio 1 puede estar en forma de una solucion acuosa parenteralmente aceptable que este libre de pirogenos y tenga un pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Los expertos en la tecnica son capaces de preparar soluciones adecuadas que utilizan, por ejemplo, veldculos isotonicos, tales como el cloruro sodico para inyeccion, solucion de Ringer, solucion de lactato de Ringer. Se pueden emplear conservantes, estabilizantes, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos segun sea necesario incluyendo tampones tales como de fosfato, citrato y otros acidos organicos; antioxidantes, tales como el acido ascorbico y la metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, butil o bencil alcohol, alquil parabenos, tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3'-pentanol; y m-cresol), polipeptidos de bajo peso molecular; protemas tales como la seroalbumina, gelatina o inmunoglobulinas; polfmeros hidrofilos, tales como polivinilpirrolidona; aminoacidos tales como la glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacaridos, disacaridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa o dextrina, agentes quelantes tales como el EDTA; azucares tales como la sacarosa, manitol, trealosa o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio; complejos metalicos (por ejemplo complejos de Zn-protema); y/o tensioactivos no ionicos, tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG).

Una composicion farmaceutica que comprende una molecula de anticuerpo anti-exositio 1 se puede administrar sola o en combinacion con otros tratamientos, sea simultanea o secuencialmente dependiendo de la afeccion que se va a tratar.

Una molecula de anticuerpo anti-exositio 1 como se describe en el presente documento se puede utilizar en un metodo de tratamiento del cuerpo humano o animal incluyendo un tratamiento profilactico o preventivo (por ejemplo, un tratamiento antes de la aparicion de una afeccion en un individuo para reducir el riesgo de que se produzca la afeccion en el individuo; retrasar su aparicion, o reducir su gravedad tras la aparicion). El metodo de tratamiento puede comprender la administracion de una molecula de anticuerpo anti-exositio 1 a un individuo que necesita el mismo.

La administracion es normalmente de una “cantidad terapeuticamente eficaz”, siendo suficiente para mostrar un beneficio en un paciente. Dicho beneficio puede sera la menos una mejora de al menos un smtoma. La cantidad actual administrada, y la tasa y curso en el tiempo de la administracion, dependera de la naturaleza y gravedad de la que se este tratando, el mairnfero en particular que se va a tratar, la afeccion clmica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de suministro de la composicion, el metodo de administracion, el calendario de administracion y otros factores conocidos por los medicos encargados. La prescripcion del tratamiento, por ejemplo, las decisiones de la dosificacion, etc., es responsabilidad de los medicos encargados en general y otros doctores medicos y puede depender de la gravedad de los smtomas y/o la progresion de la enfermedad que se va a tratar. Las dosis apropiadas de las moleculas de anticuerpo son bien conocidas en la tecnica (Ledermann J.A. et al. (1991) Int. J. Cancer 47: 659-664; Bagshawe K.D. et al. (1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915922). Se pueden utilizar las dosificaciones espedficas que pueden indicarse en el presente documento o en la Physician's Desk Reference (2003) segun sean apropiadas para el tipo de medicamento que se va a administrar. Una cantidad terapeuticamente eficaz o dosis adecuada de una molecula de anticuerpo se puede determinar comparando su actividad in vitro con su actividad in vivo en un modelo animal. Los metodos para la extrapolacion de las dosificaciones eficaces en ratones y otros animales de ensayo a los seres humanos son conocidos. La dosis precisa dependera de varios factores, incluyendo si el anticuerpo es para la prevencion o para el tratamiento, el

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

tamano y la localizacion del area a tratar, la naturaleza precisa del anticuerpo (por ejemplo, el anticuerpo completo, in fragmento) y la naturaleza de cualquier marcador detectable u otra molecula unida al anticuerpo.

Una dosis de anticuerpo tipica estara en el intervalo de 100 |jg a 1 mg para aplicaciones topicas. Se puede administrar una dosis de carga mas alta inicial, seguida por una o mas dosis mas bajas. Normalmente, el anticuerpo sera un anticuerpo completo, por ejemplo del isotipo IgG1 o IgG4. Esta es una dosis para un tratamiento unico de un paciente adulto, que se puede ajustar proporcionalmente para ninos y bebes, y tambien se ajusta para otros formatos de anticuerpo en proporcion al peso molecular. Los tratamientos se pueden repetir a intervalos diarios, de dos veces a la semana, semanales o mensuales, a discrecion del medico. El calendario de tratamiento para un individuo puede depender de las propiedades farmacocineticas y farmacodinamicas de la composicion de anticuerpo, la via de administracion y la naturaleza de la afeccion que se va a tratar.

El tratamiento puede ser periodico, y el periodo entre administraciones puede ser de aproximadamente dos semanas o mas, por ejemplo de aproximadamente tres semanas o mas, de aproximadamente cuatro semanas o mas, de aproximadamente una vez al mes o mas, de aproximadamente cinco semanas o mas o de aproximadamente seis semanas o mas. Por ejemplo, el tratamiento puede ser cada dos a cuatro semanas o cada cuatro a ochos semanas. El tratamiento se puede dar antes, y/o despues de la cirugfa, y/o se puede administrar o aplicar directamente en el sitio anatomico del tratamiento quirurgico o el procedimiento invasivo. Las formulaciones adecuadas y las vfas de administracion se describen anteriormente.

En algunas realizaciones, las moleculas de anticuerpo anti-exositio 1 como se describen en el presente documento se pueden administrar mediante inyecciones subcutaneas. Las inyecciones subcutaneas se pueden administrar utilizando un auto-inyector, por ejemplo para profilaxis/tratamiento a largo plazo.

En algunas realizaciones preferidas, el efecto terapeutico de la molecula de anticuerpo anti-exositio 1 puede persistir varias semividas, dependiendo de la dosis. Por ejemplo, el efecto terapeutico de una unica dosis de la molecula de anticuerpo anti-exositio 1 puede persistir en un individuo durante 1 mes o mas, 2 meses o mas, 3 meses o mas, 4 meses o mas, 5 meses o mas, o 6 meses o mas. Las moleculas de anticuerpo anti-exositio 1 descritas en el presente documento inhiben la trombina y pueden ser utiles en el tratamiento de afecciones mediadas por trombina.

La hemostasia es la respuesta de coagulacion normal, es decir, vita el sangrado o la hemorragia, por ejemplo de un vaso sangumeo danado. La hemostasia detiene el sangrado y la hemorragia de los vasos sangumeos del cuerpo.

Las moleculas de anticuerpo anti-exositio 1 pueden no tener efecto o no tener efecto sustancialmente sobre la hemostasia es decir, no promueven el sangrado o la hemorragia.

Unos aspectos de la invencion proporcionan: una molecula de anticuerpo anti-exositio 1 como se describe en el presente documento para su uso en un metodo de tratamiento del cuerpo humano o animal; una molecula de anticuerpo anti-exositio 1 como se describe en el presente documento para su uso en un metodo de tratamiento de un trastorno mediado por la trombina; el uso de una molecula de anticuerpo anti-exositio 1 como se describe en el presente documento en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de una afeccion mediada por la trombina, y un metodo de tratamiento para una afeccion mediada por la trombina que comprende la administracion de una molecula de anticuerpo anti-exositio 1 como se describe en el presente documento a un individuo que necesita la misma.

La inhibicion de la trombina por anticuerpos anti-exositio 1 como se describe en el presente documento puede tener un beneficio clmico en el tratamiento de cualquier afeccion mediada por trombina. Una afeccion mediada por trombina puede incluir trastornos asociados con la formacion o actividad de la trombina.

La trombina tiene un papel clave en la hemostasia, coagulacion y trombosis. Las afecciones mediadas por trombina incluyen las afecciones tromboticas, tales como la trombosis y la embolia.

La trombosis es la coagulacion que excede la necesaria para la hemostasia (es decir, la coagulacion excesiva), o que no es necesaria para la hemostasia (es decir, coagulacion extra-hemostatica o no hemostatica).

La trombosis es la coagulacion sangumea en la luz de los vasos sangumeos. Se caracteriza por la formacion de un coagulo (trombo) que excede la necesidad o que no se necesita para la hemostasia. El coagulo puede impedir el flujo sangumeo a traves de los vasos sangumeos dando lugar a complicaciones medicas. Un coagulo puede desprenderse de su sitio de formacion, dando lugar a una embolia en cualquier parte del sistema circulatorio. En el sistema arterial, la trombosis normalmente es resultado de una rotura de una placa aterosclerotica.

En algunas realizaciones, la trombosis puede ocurrir tras una respuesta hemostatica fisiologica inicial, por ejemplo, el dano de las celulas endoteliales en un vaso sangumeo. En otras realizaciones, la trombosis se puede producir en ausencia de cualquier respuesta hemostatica fisiologica.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

La trombosis puede producirse en individuos con una tendencia intrmseca a la trombosis (es dedr, trombofilia) o en individuos 'normales' sin tendencia intrmseca a la trombosis, por ejemplo, en respuesta a un estimulo extrmseco.

La trombosis y la embolia pueden producirse en cualquier vena, arteria u otro vaso sangumeo del sistema circulatorio y puede incluir la trombosis microvascular.

La trombosis y la embolia se puede asociar a la cirugfa (sea durante la cirugfa o despues) o la insercion de objetos extranos, tales como un estent coronario, en un paciente.

Por ejemplo, los anticuerpos anti-exositio 1 como se describen en el presente documento pueden ser utiles en procedimientos quirurgicos y otros en los que la sangre se expone a superficies artificiales, tales como cirugfa a corazon abierto y dialisis.

Las afecciones tromboticas pueden incluir la trombofilia, ictus trombotico y oclusion arterial coronaria.

Los pacientes adecuados para el tratamiento que se describe en el presente documento incluye pacientes con afecciones en las que la trombosis es un smtoma o un efecto secundario del tratamiento o que confiere un aumento del riesgo de trombosis o pacientes que estan predispuestos a un aumento del riesgo de trombosis, con respecto a la poblacion general. Por ejemplo, una molecula de anticuerpo anti-exositio 1 como se describe en el presente documento tambien puede ser util en el tratamiento o prevencion de la trombosis venosa en pacientes con cancer, y en el tratamiento o prevencion de la trombosis adquirida en el hospital, que es responsable del 50 % de los casos de tromboembolia venosa.

Las moleculas de anticuerpo anti-exositio 1 como se describen en el presente documento pueden ejercer un efecto terapeutico u otros beneficios en las afecciones mediadas por trombina, tales como las afecciones tromboticas, sin inhibir sustancialmente ni impedir la hemostasia. Por ejemplo, el riesgo de hemorragia en pacientes tratados con las moleculas de anticuerpo anti-exositio 1 puede no estar aumentado o sustancialmente aumentado con respecto a los individuos sin tratar.

Los individuos tratados con anticoagulantes convencionales, tales como las heparinas naturales y sinteticas, warfarina, inhibidores de la serina proteasa directos (por ejemplo, argatroban, dabigatran, apixaban, y rivaroxaban), hirudina y sus derivados (por ejemplo, lepirudina y bivalirudina), y farmacos anti-plaquetarios (por ejemplo, clopidogrel, ticlopidina y abciximab) producen sangrado. El riesgo de sangrado en los pacientes tratados con las moleculas de anticuerpo anti-exositio 1 como se describe en el presente documento puede reducirse con respecto a los individuos tratados con anticoagulantes convencionales.

Las afecciones mediadas por trombina incluyen afecciones no tromboticas asociadas con la actividad de la trombina, incluyendo la inflamacion, infeccion, crecimiento tumoral y metastasis, rechazo de organos y demencia (vascular y no vascular, por ejemplo, enfermedad de Alzheimer) (Licari et al J Vet Emerg Crit Care (San Antonio). 2009 Feb; 19(1):11-22; Tsopanoglou et al Eur Cytokine Netw. 2009 Dic 1; 20(4):171-9).

Las moleculas de anticuerpo anti-exositio 1 como se describen en el presente documento tambien pueden ser utiles en ensayos in vitro, por ejemplo, en el analisis y caracterizacion de la coagulacion, por ejemplo, en una muestra obtenida de un paciente.

Las moleculas de anticuerpo anti-exositio 1 pueden ser utiles en la medicion de la generacion de trombina. Los ensayos de generacion de trombina son tecnicamente problematicos debido a la conversion de fibrinogeno a fibrina que produce turbidez, que excluye el uso de un simple criterio de valoracion cromogenico.

La adicion de una molecula de anticuerpo anti-exositio 1 como se describe en el presente documento a una muestra de sangre evita o inhibe la formacion de fibrina y por lo tanto la turbidez y permite que se mida la generacion de trombina utilizando un sustrato criogenico sin la necesidad de una etapa de desfibrinacion.

Por ejemplo, un metodo de medicion de la generacion de trombina puede comprender poner en contacto una muestra de sangre con un sustrato de trombina cromogenico en presencia de una molecula de anticuerpo anti- exositio 1 como se describe en el presente documento y la medicion de la senal cromogenica del sustrato;

donde la senal cromogenica es indicativa de la generacion de trombina en la muestra

La senal cromogenica se puede medir directamente sin desfibrinacion de la muestra.

Los sustratos adecuados son bien conocidos en la tecnica e incluyen S2238 (H-D-Phe-Pip-Arg-pNa), diacetato de p- Ala-Gly-Arg-p-nitroanilida (Prasa, D. et al. (1997) Thromb. Haemost. 78, 1215; Sigma Aldrich Inc) y Tos-Gly-Pro-Arg- pNa.AcOH (Biophen CS-01(81); Aniara Inc OH USA).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Las moleculas de anticuerpo anti-exositio 1 tambien pueden ser utiles en la inhibicion o para evitar la coagulacion de la sangre como se ha descrito anteriormente en la circulacion extracorporea, tal como hemodialisis y la oxigenacion por membrana extracorporea.

Por ejemplo, un metodo de inhibicion o para evitar la coagulacion de la sangre in vitro o ex vivo puede comprender la introduccion de una molecula de anticuerpo anti-exositio 1 como se describe en el presente documento en una muestra de sangre. La muestra de sangre se puede introducir en un sistema de circulacion extracorporea antes, simultaneamente o tras la introduccion del anticuerpo anti-exositio 1 y opcionalmente someterse a un tratamiento tal como la hemodialisis o la oxigenacion. En algunas realizaciones, la sangre tratada puede administrarse posteriormente a un individuo. Otras realizaciones proporcionan molecula de anticuerpo anti-exositio 1 como se describe en el presente documento para su uso en un metodo de inhibicion o para evitar la coagulacion sangumea en una muestra de sangre ex vivo y el uso de una molecula de anticuerpo anti-exositio 1 como se describe en el presente documento para su uso en un metodo de inhibicion o para evitar la coagulacion sangumea en una muestra de sangre ex vivo.

Otros aspectos de la invencion se refieren a la produccion de moleculas de anticuerpo que se unen a un epftopo exositio 1 de la trombina y puede ser util, por ejemplo, en el tratamiento de la coagulacion sangumea patologica o trombosis.

Un metodo para producir un dominio de union al antfgeno del anticuerpo para el epftopo exositio 1 de la trombina, puede comprender:

proporcionar, mediante la adicion, eliminacion, sustitucion o insercion de uno o mas aminoacidos de la secuencia de aminoacidos de un dominio VH parental que comprende una HCDR1, HCDR2 y HCDR3, donde la HCDR1, HCDR2 y HCDR3 tienen las secuencias de aminoacidos de SEQ ID NO: 3, 4 y 5 respectivamente, un dominio VH que es una variante de secuencia de aminoacidos del dominio VH parental; y

combinar opcionalmente el domino VH proporcionado de esta manera con uno o mas dominios VL para proporcionar una o mas combinaciones VH/vL; y

ensayar dicho dominio VH que es una variante de secuencia de aminoacidos del dominio VH parental o la combinacion o combinaciones VH/VL para identificar un dominio de union al antfgeno del anticuerpo para el epftopo exositio 1 de la trombina.

Un dominio VH que es una variante de secuencia de aminoacidos del dominio VH parental puede tener la secuencia HCDR3 de la SEQ ID NO: 5 o una variante con adicion, eliminacion, sustitucion o insercion de uno, dos, tres o mas aminoacidos.

el dominio VH que es una variante de secuencia de aminoacidos del dominio VH parental puede tener las secuencias HCDR1 y HCDR2 de las SEQ ID NO: 3 y 4, respectivamente, o variantes de esas secuencias con la adicion, eliminacion, sustitucion o insercion de uno, dos, tres o mas aminoacidos.

Un metodo para producir una molecula de anticuerpo que se une espedficamente al epftopo exositio 1 de la trombina puede comprender:

proporcionar un acido nucleico de partida que codifica un dominio VH o un repertorio de partida de acidos nucleicos que codifican cada uno un dominio VH, donde el domino VH o los dominios VH comprenden una HCDR1, HCDR2 y/o HCDR3 que se va a remplazar o que carecen de una region codificante de HCDR1, HCDR2 y/o HCDR3;

combinar dicho acido nucleico de partida o repertorio de partida con un acido nucleico donante o acidos nucleicos donantes que codifican o se producen por mutacion de la secuencia de aminoacidos de una HCDR1, HCDR2 y/o HCDR3 que tiene las secuencias de aminoacidos de SEQ ID NO: 3, 4 y 5, respectivamente, de manera que dicho acido nucleico donante o acidos nucleicos donantes estan insertadas en la region de la CDR1, CDR2 y/o CDR3 del acido nucleico de partida o repertorio de partida, para proporcionar un producto que es un repertorio de acidos nucleicos que codifican los dominios VH;

expresar los acidos nucleicos de dicho producto que es un repertorio para producir un producto de dominios VH; combinar opcionalmente dichos producto de dominios VH con uno o mas dominios VL;

seleccionar una molecula de anticuerpo que se une al exositio 1 de la trombina, cuya molecula de anticuerpo comprende un producto que es un dominio VH y opcionalmente un dominio VL; y recuperar dicha molecula de anticuerpo o acido nucleico que la codifica.

Las tecnicas adecuadas para la maduracion y optimizacion de moleculas de anticuerpo se conocen bien en la tecnica.

Los dominios de union al antfgeno del anticuerpo y las moleculas de anticuerpo para el epftopo exositio 1 de la trombina se pueden ensayar como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, se puede determinar la capacidad de union a la trombina y/o la inhibicion de la escision de sustratos de trombina.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

El efecto de una molecula de anticuerpo sobre la coagulacion y el sangrado se puede determinar utilizando tecnicas convencionales. por ejemplo, se puede emplear un modelo de trombosis en raton o la induccion de un coagulo de cloruro ferrico en un vaso sangumeo, tal como la vena femoral o la arteria carotida, seguido por un sangrado de la cola para ensayar la hemostasia normal.

Distintos aspectos adicionales y realizaciones de la presente invencion seran evidentes para los expertos en la tecnica en vista de la presente divulgacion.

Todos los documentos mencionados en la presente memoria descriptiva se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad.

A menos de que se establezca otra cosa, los restos de anticuerpo se numeran en el presente documento de acuerdo con el esquema de numeracion de Kabat.

Cuando se utiliza “y/o” en el presente documento se tiene que tomar como la divulgacion espedfica de cada una de las dos caractensticas o componentes especificados con o sin el otro. Por ejemplo “A y/o B” se tiene que tomar como la divulgacion espedfica de cada uno de (i) A, (ii) B y (iii) A y B, como si cada uno se expusiera individualmente en el presente documento.

A menos de que el contexto dicte otra cosa, las descripciones y definiciones de las caractensticas expuestas anteriormente no se limitan a ningun aspecto o realizacion particular de la invencion y se aplica igualmente a todos los aspectos y realizaciones que se han descrito. Por lo tanto, las caractensticas expuestas anteriormente se desvelan en todas las combinaciones y permutaciones.

Ciertos aspectos y realizaciones de la invencion se ilustraran a hora mediante ejemplos y en referencia a las figuras y tablas que se describen posteriormente.

La Figura 1 muestra la union y la elucion de la IgA en una columna Sepharose-trombina humana. La Figura 1A muestra un perfil de elucion par IgA (pico estrecho) a partir de una columna de Sepharose-trombina utilizando un gradiente de pH (neutro a bajo, indicado por la lmea con pendiente hacia arriba). La Figura 1B muestra un gel azul nativo que muestra la carga total de IgA, el flujo continuo a partir de la columna de trombina humana y el elrndo tras la elucion a pH bajo.

La Figura 2 muestra un gel de SDS-PAGE no reductor que indica que la IgA se une a la trombina pero no a la protrombina. En este ensayo de purificacion por afinidad tipo pull-down, se utiliza lectina de agarosa para unirse a la IgA en presencia de trombina o protrombina. El sobrenadante se pasa entonces en un gel SDS. La calle 1 son las referencias de tamano; la calle 2 muestra un agotamiento de trombina en el sobrenadante; la calle 3 muestra que el agotamiento depende de la presencia de IgA; las calles 3 y 4 muestran que la protrombina no se agota, y por lo tanto no se une a la IgA.

La Figura 3 muestra la tasa de escision de S2238 por la trombina en presencia o ausencia de IgA (es decir, una pendiente unica de Abs405 con tiempo para la hidrolisis de S2238). Esto indica que la IgA no se une en el sitio activo de la trombina.

La Figura 4 muestra los resultados de los estudios de union que indican que la IgA compite con el dodecapeptido hirugen marcado fluorescentemente por la union a la trombina.

La Figura 5 muestra el efecto de la IgA sobre la escision de S2238 por la trombina. Este analisis permite estimar la Kd de la interaccion IgA-trombina se 12 nM.

La Figura 6 muestra un gel SDS-PAGE de IgA completa y fragmentos Fab en condiciones reductoras y no reductoras (ox). La IgA no reducida muestra que tiene un peso molecular de 100-200 kDa y el Fab no reducido tiene un peso molecular de aproximadamente 50 kDa.

La Figura 7 muestra la estructura cristalina del complejo trombina-Fab que muestra la interaccion entre el exositio 1 de la trombina y la HCDR3 del fragmento Fab.

La Figura 8 muestra en detalle la estructura cristalina que muestra la interaccion entre restos espedficos del exositio de trombina y la HCDR3 del fragmento Fab.

La Figura 9 muestra imagenes de microscopfa de fluorescencia de los coagulos sangumeos inducidos por el FeCl3 en danos de la vena femoral en ratones C57BL/6 inyectados con fibrinogeno marcado con FITC tomadas entre los 2 y 30 minutos. Se administraron 100 ul de PBS (vehmulo de control).

La Figura 10 muestra imagenes de microscopfa de fluorescencia de coagulos sangumeos inducidos por el FeCh en lesiones de la vena femoral en ratones C57BL/6 inyectados con fibrinogeno marcado con FITC y 40 nM

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

(concentracion final en la sangre del raton, equivalente a una dosis de aproximadamente 0,6 mg/kg) de IgA anti- exositio 1 (100 |jl en PBS).

La Figura 11 muestra imagenes de microscop^a de fluorescencia de coagulos sangumeos inducidos por el FeCh en lesiones de la vena femoral en ratones C57BL/6 inyectados con fibrinogeno marcado con FITC y 80 nM (concentracion final en la sangre del raton, equivalente a una dosis de aproximadamente 1,2 mg/kg) de IgA anti- exositio 1 (100 jl en PBS), y una region fuera del sitio de la lesion para la comparacion.

La Figura 12 muestra imagenes de microscopfa de fluorescencia de coagulos sangumeos inducidos por el FeCh en lesiones de la vena femoral en ratones C57BL/6 inyectados con fibrinogeno marcado con FITC y 200 nM (concentracion final en la sangre del raton, equivalente a una dosis de aproximadamente 3 mg/kg) de IgA anti- exositio 1 (100 jl en PBS), y una region fuera del sitio de la lesion para la comparacion.

La Figura 13 muestra imagenes de microscopfa de fluorescencia de coagulos sangumeos inducidos por el FeCh en lesiones de la vena femoral en ratones C57BL/6 inyectados con fibrinogeno marcado con FITC y 400 nM (concentracion final en la sangre del raton, equivalente a una dosis de aproximadamente 6 mg/kg) de IgA anti- exositio 1 (100 jl en PBS).

La Figura 14 muestra imagenes de microscopfa de fluorescencia de coagulos sangumeos inducidos por el FeCh en lesiones de la vena femoral en ratones C57BL/6 inyectados con fibrinogeno marcado con FITC y 4 jM (concentracion final en la sangre del raton, equivalente a una dosis de aproximadamente 60 mg/kg) de IgA anti- exositio 1 (100 jl en PBS).

La Figura 15 muestra una cuantificacion de la respuesta a la dosis frente a la IgA anti-exositio 1 a partir de imagenes fluorescentes que se muestran en las Figuras 9 a 13.

La Figura 16 muestra los tiempos de sangrado por la cola en ratones C57BL/6 de control tratados con cantidades crecientes de IgA anti-exositio 1. La segunda media excluye los casos atipicos.

La Figura 17 muestra los resultados de los ensayos de corte de rabo en machos de tipo silvestre de ratones C57BL/6 (n = 5) tras la inyeccion en la vena caudal con IgA o PBS. Se cortaron los rabos 15 min despues de la inyeccion en un diametro de 3 mm y se controlo la perdida de sangre durante 10 min.

La Figura 18A a 18D muestra los resultados de un modelo de oclusion de la arteria carotida con FeCh en ratones macho C57BL/6 TS de 9 semanas de edad inyectados como anteriormente con 400 nM de IgA anti-trombina (concentracion final en la sangre, equivalentes a una dosis de aproximadamente 6 mg/kg) o PBS 15 minutos antes de la lesion con un 5% de FeCh durante 2 min. La Figura 18A muestra los resultados de un raton inyectado con PBS tfpico (oclusion en 20 min) y las figuras 18B, 18C y 18D muestra ejemplos de resultados para los ratones tratados con 400 nM de IgA anti-trombina (no hay oclusion).

La Figura 19 muestra los tiempos de trombina (es decir, la coagulacion de plasma agrupado) con concentraciones crecientes de IgG e IgA de la invencion, al anadir 20 nM de trombina humana.

La Figura 20 muestra la union de la IgG sintetica a la trombina inmovilizada (en un instrumento ForteBio Octet Red).

La Figura 21 muestra una representacion Octet tfpica de la union de 24 nM de trombina S195A a la IgG inmovilizada que muestra la fase activada, seguida por una fase inactivada. La lmea negra es el ajuste.

La Figura 22 muestra una representacion Octet de 500 nM de protrombina con una punta cargada con IgG inmovilizada. Se utilizaron las mismas condiciones como el experimento con trombina de la Fig. 21. No hay evidencia de union, incluso a esta alta concentracion.

Experimentos

1. Aislamiento y caracterizacion de anticuerpos

La exploracion de la coagulacion se llevo a cabo en una muestra de plasma sangumeo de un paciente. Los ensayos de coagulacion se llevaron a cabo en un paciente que padecfa un hematoma subdural despues de una lesion en la cabeza. El hematoma se resolvio espontaneamente sin intervencion. No habfa una historia previa de sangrado en los 4 anos desde que se presento el paciente, no habfa habido episodios de sangrado adicionales. Los resultados se mostraron en la Tabla 1.

El tiempo de protrombina (PT), tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT) y tiempo de trombina (TT) se prolongaron en el paciente en comparacion con los controles, pero el tiempo de reptilasa era normal.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

El tiempo de trombina o se corregfa con heparinasa, indicando que el tratamiento con heparina o la contaminacion no era responsable. los niveles de fibrinogeno eran normales en el paciente, segun el ELISA y los ensayos con Reptilasa. El ensayo de Clauss daba un nivel de fibrinogeno bajo artificialmente debido a la presencia del inhibidor de trombina. Se descubrio que los tiempos de coagulacion PT y APTT se manteman prolongados tras un ensayo mixto utilizando una mezcla 50:50 con plasma agrupado de individuos normales. Esto demostraba la presencia de un inhibidor en la muestra del paciente.

Se descubrio que el plasma sangumeo del paciente tema un alto tttulo de una IgA. Se descubrio que esta molecula de IgA se urna a una columna de trombina humana (Figura 1). La union de IgA a lectina de agarosa purificaba por afinidad tipo pull down la trombina en presencia pero no en ausencia de la IgA. La protrombina no se purificaba por afinidad tipo pull down por la lectina de agarosa en presencia de IgA, indicando que la IgA se une espedficamente a la trombina pero no a la protrombina (Figura 2).

El sitio de union de la IgA sobre la molecula de trombina se investigo entonces.

Se midio una tasa ligeramente mayor de escision de S2238 por la trombina en presencia de IgA, indicando que la IgA no bloquea el sitio activo de la trombina (Figura 3).

La union de hirugen marcado fluorescentemente a la trombina se inhibe por la presencia de 700 nM de la IgA, indicando que el epftopo para el anticuerpo se solapa con el sitio de union del hirugen a la trombina, a saber el exositio 1 de la trombina.

Se ensayo el efecto de la IgA en la hidrolisis de algunos sustratos procoagulantes de trombina. Los resultados se muestran en la Tabla 2. Estos resultados demuestran que la molecula de IgA aislada a partir de la muestra del paciente inhibe multiples actividades procoagulantes de la trombina.

La inhibicion de la trombina por la antitrombina (AT) en presencia de IgA estaba afectada solo marginalmente tanto en ausencia como en presencia de heparina (Tabla 3).

La constante de disociacion (Kd) de la IgA para la trombina se estimo inicialmente basandose en la tasa de hidrolisis de S2238 que era de 12 nM (Figura 5). La Kd para la union de la IgA a la trombina S195A (inactivada por mutacion de la serina catalttica) se determino que era de 2 nM utilizando el instrumento ForteBio Octet Red (Tabla 4).

La IgA purificada se escindio con papama (Figura 6), y se aislo el fragmento Fab y se combino con el PPACK- Trombina humana (PPACK es un inhibidor del sitio activo covalente). Se cristalizo el complejo PPACK-Trombina humana-FAB y se utilizo para el analisis estructural. Las estadfsticas de la estructura obtenidas eran las siguientes: resolucion de 1,9 A; factorR= 19,43%; Rlibre = 23,42%; un complejo en la unidad asimetrica; Ramachandran: favorecido = 97,0 %, valores atfpicos = 0 %. La estructura cristalina revelaba una estrecha asociacion entre la HCDR3 del Fab de IgA y el exositio 1 de la trombina (Figura 7).

En particular, los restos M32, F34, Q38, E39, L40, L65, R67, R73, T74, R75, Y76, R77a y I82 del exositio 1 interactuan directamente con el bucle de la HCDR3 del Fab de IgA (Figura 8).

El analisis PISA de la interfaz anticuerpo-trombina mostraba que la superficie del area no expuesta total en el complejo es de 1075 A2. Los restos de contacto en la cadena pesada de la IgA eran (numeracion de Kabat): 30, 51, 52a, 53-55, 96, 98, 99, 100, 100a, 100b, 100c, 100d). Todos estan en las CDR: HCDR1- GYTLTEAAIH; HCDR2- GLDPQDGETVYAQQFKG; HCDR3-GDFSEFEPFSMDYFHF (restos en contacto subrayados). Se descubrio que la HCDR3 era la mas importante, proporcionando el 85 % del area de superficie no expuesta del anticuerpo. La cadena ligera produce un contacto marginal con Tyr 49, justo antes de la LCDR2 (con la Ser 36a de la trombina). Algunas contribuciones de la superficie no expuesta eran: Glu 99 54 A2, Phe 100 134,8 A2, Glu 100a 80,6 A2, Phe 100c 141,7 A2.

Se descubrio que los restos de la trombina en contacto eran (numeracion de quimotripsina): 32, 34, 36a-40, 65, 67, 73-76, 77a, 82, y 151. Los contribuyentes individuales mas importantes de la superficie no expuesta eran: Gln 38 86,4 A2, Arg 73 44,5 A2, Thr 74 60,1 A2, Tyr 76 78,4 A2, Arg 77a 86,9 A2.

El paciente no presentaba un sangrado o hemorragia anormales o aumentados, a pesar de los niveles circulantes de 3 g/l de esta IgA, demostrando que el anticuerpo inhibe la trombina sin afectar la hemostasia normal.

2. Efecto de la IgA en modelos animales de trombosis

Los ratones C57BL/6 se anestesiaron. Se inserto un cateter en la arteria carotida (para la inyeccion de compuestos). Se inyecto fibrinogeno marcado con FITC (2 mg/ml) por la arteria carotida. Tambien se inyecto PBS (control) o IgA por la arteria carotida. Se expuso la vena femoral y se aplico FeCh al 10 % (en papel de transferencia saturado de 3 mm de longitud) durante 3 minutos para inducir la coagulacion.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Se tomaron imagenes de microscop^a de fluorescencia a lo largo de la longitud del sitio de la lesion a 0, 5, 10 y 20 min tras la lesion con FeCh utilizando tecnicas de microscopfa de fluorescencia.

Los coagulos (depositos de fibrina) en la vena femoral eran claramente visibles como areas brillantes (Figura 9). Se observo que la dosis menor de anticuerpo produda una inhibicion significativa de la coagulacion, pero segun se aumentaba la dosis, la coagulacion se abolfa (Figuras 10 a 15).

Tambien se midieron los tiempos de sangrado de los ratones. Los tiempos de sangrado se evaluaron en el momento del cese de flujo sangumeo tras un corte en la cola. A pesar de la presencia de una unica muestra de valores atfpicos, se descubrio que el tiempo de sangrado no estaba afectado por el tratamiento con la IgA anti-exositio 1 (Figura 16).

Estos resultados muestran que el anticuerpo IgA anti-exositio 1 es un potente inhibidor de la trombosis pero que no tiene efecto sobre el tiempo de sangrado.

3. Ensayos de corte de cola

Se llevo a cabo ensayos de corte de cola en machos de ratones C57BL/6 tipo silvestre inyectados con 400 nM de IgA (concentracion sangumea final, equivalente a una dosis de aproximadamente 6 mg/kg) o PBS. Se controlo la perdida de sangre durante 10 min despues de que se cortara la cola a 3 mm de diametro 15 minutos despues de la inyeccion. Se descubrio que la perdida de sangre total no estaba afectada por el tratamiento con una IgA anti- exositio 1 (Figura 17).

4. Oclusion de la arteria carotida por la lesion por FeCh

Se llevaron a cabo la oclusion de la arteria carotida por una lesion con FeCh en ratones macho C57BL/6 TS de 9 semanas de edad. Se inyecto a los ratones 400 nM de IgA anti-IIa (concentracion final en la sangre, equivalente a una dosis de aproximadamente 6 mg/kg) o PBS 15 min antes de la lesion con FeCh al 5% durante 2 min. Se controlo entonces el flujo sangumeo por Doppler y se midio el tiempo de oclusion. Se definio un “coagulo” como el trombo oclusivo estable donde el flujo sangumeo se reduda a valores normalmente menores de 0,1 ml/min y permaneda reducido. En los ratones de control, se observaba un coagulo estable que se formaba aproximadamente a los 20 min tras la lesion (Figura 18A). Sin embargo, la mayona de los ratones tratados con 400 nM de IgA anti-IIa eran incapaces de formar coagulos estables y daban trazos en los que los coagulos se resolvfan rapidamente, se resolvfan repetidamente o nunca se formaban. Se muestran tres trazos representativos en las Figuras 18B a 18D.

5. IgG anti-exositio 1

La molecula de IgA identificada en el paciente descrito anteriormente se re-formateo a IgG utilizando tecnicas convencionales.

El tiempo de coagulacion del plasma humano agrupado vertido con cantidades crecientes de la IgA original y se ensayo la nueva IgG al anadirse trombina humana a 20 nM (Figura 19). Tanto la IgA parental como la IgG sintetica aumentaban el tiempo de formacion del coagulo de una manera dependiente de la concentracion identica, implicando afinidades identicas para la protrombina.

Esto se confirmo midiendo la union de la IgG sintetica a trombina S195A inmovilizada utilizando un instrumento ForteBio™ Octet Red. Se unio la trombina a una sonda y se controlo la union de los anticuerpos (a distintas concentraciones). Se determinaron las tasas de activacion e inactivacion. Ambos anticuerpos daban tasas de activacion similares de aproximadamente 3 x 105 M-1 s-1 y tasas de inactivacion de aproximadamente 5 x 104 s-1, y constantes de disociacion (Kd) de aproximadamente 2 nM. Tambien se obtuvieron tasas de aproximadamente 2 nM para la IgA y la IgG por el analisis de estado estacionario (Tabla 4). Se muestra una curva representativa del estado estacionario en la Figura 20. Las propiedades de la IgA por lo tanto se reprodujeron en un armazon de IgG.

La union de la protrombina al anticuerpo IgG se ensayo utilizando el sistema Octet inmovilizando la IgG. La trombina unida a la IgG inmovilizada con tasas y afinidades comparables a las obtenidas utilizando la trombina (Tabla 4); la protrombina no se urna a la IgG. La Figura 21 es una representacion de 24 nM de trombina unida y disociada de la IgG inmovilizada. La Figura 22 es el mismo experimento utilizando 500 nM de protrombina, y no muestra evidencias de union.

Secuencias

Secuencia de aminoacidos de la preprotrombina humana (SEQ ID NO: 1; GeneID: 2147, NP_000497.1 GI: 4503635; los restos del exositio 1 estan subrayados).

5

10

15

20

25

1 mahvrglqlp gclalaalcs lvhsqhvfla pqqarsllqr vrrantflee vrkgnlerec

61 veetcsyeea fealesstat dvfwakytac etartprdkl aaclegncae glgtnyrghv

121 nitrsgiecq lwrsryphkp einstthpga dlqenfcrnp dssttgpwcy ttdptvrrqe

181 csipvcgqdq vtvamtprse gssvnlsppl eqcvpdrgqq yqgrlavtth glpclawasa

241 qakalskhqd fnsavqlven fcrnpdgdee gvwcyvagkp gdfgycdlny ceeaveeetg

301 dgldedsdra iegrtatsey qtffnprtfg sgeadcglrp lfekksledk terellesyi

361 dgrivegsda eigmspwqvm Ifrkspqell cgaslisdrw vltaahclly ppwdknften

421 dl_lvrigkhs rtryerniek ismlekiyih prynwrenld rdialmklkk pvafsdyihp

481 vclpdretaa sllqagykgr vtgwgnlket wtanvgkgqp svlqvvnlpi verpvckdst

541 riritdnmfc agykpdegkr gdacegdsgg pfvmkspfnn rwyqmgivsw gegcdrdgky

601 gfythvfrlk kwiqkvidqf ge

Secuencia de aminoacidos de la IgA anti-exositio 1 y el domino VH de IgG con la numeracion de Kabat (las CDR estan subrayadas): (SEQ ID NO: 2).

QVQLIQS GSAVKKPGASVRVS CKVSGYTLTEAAIHWVRQAPGKGLEWMGG

10 20 30 40 50

LDPQDGETVYAQQFKGRVTMTEDRSTDTAYMEVNNLRSEDTATYYCTTGD

52a 60 70 8082abc 90

FSEFEPFSMDYFHFWGQGTWTVAS

lOOabcdefgh 110

Secuencia de aminoacidos de la IgA anti-exositio 1 y HCDR1 de IgG (SEQ ID NO GYTLTEAAIH

Secuencia de aminoacidos de la IgA anti-exositio 1 y HCDR2 de IgG (SEQ ID NO GLDPQDGETVYAQQFKG

Secuencia de aminoacidos de la IgA anti-exositio 1 y HCDR3 de IgG (SEQ ID NO GDFSEFEPFSMDYFHF

Secuencia de aminoacidos de la IgA anti-exositio 1 y el domino VL de IgG con la numeracion de Kabat: (SEQ ID NO: 6).

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQNVSSFLAWYQHKPGQAPRLLIYD

10 20 30 40 50

ASSRATDIPIRFSGSGSGTDFTLTISGLEPEDFAVYYCQQRRSWPPLTFG

60 70 80 90 95a

GGTKVEIKR

100 108

Secuencia de aminoacidos de la IgA anti-exositio 1 y LCDR1 de IgG (SEQ ID NO: 7).

RASQNVSSFLA

Secuencia de aminoacidos de la IgA anti-exositio 1 y LCDR2 de IgG (SEQ ID NO: 8).

DASSRAT

Secuencia de aminoacidos de la IgA anti-exositio 1 y LCDR3 de IgG (SEQ ID NO: 9).

QQRRSWPPLT

: 3). : 4). : 5).

Tabla 1 -

Resultados de la ex ploracion de la coagulacion

Ensayo

Resultado Relacion Control/Normalizado (NR)

Tiempo de protrombina

43 s NR = 11-13 s

50:50 correccion 35 s

Tiempo de tromboplastina parc. act.

157 s NR = 22-23 s

50:50 correccion 105 s

Tiempo de protrombina

>150 s NR = 10-13 s

Tiempo de Reptilasa

16 s Control = 15 s

Fibrinogeno

Clauss 0,7 g/l NR = 1,5-4,5 g/l

Antigenico 5,0 g/l

Tabla 2. Efecto de la IgA anti-exositio 1 sobre la hidrolisis por la trombina de los sustratos procoagulantes

Sustrato de trombina

Actividad Efecto del anticuerpo

Fibrinogeno

Formacion del coagulo de fibrina Escision no detectable

Peptido receptor de plaquetas PAR-1

Activacion de plaquetas Disminucion de 15 veces de la hidrolisis

FVIII

Activacion retroalimentada de la trombina mediante el complejo Xasa Disminucion de 7 veces de la hidrolisis

5 Tabla 3. Efecto de la concentracion de saturacion de IgA anti-exositio 1 (Fab) sobre la inhibicion de la trombina por la ________________antitrombina (AT) en ausencia o presencia de 1 nM de heparina (Hep)________________

Tasa de inhibicion (M-1 s'1) Efecto de heparina

AT

4,8 ± 0,2 x 103 2,4 veces

AT+Hep

11,8 ± 0,3 x 103

AT+Fab

1,7 ± 0,1 x 103 3,3 veces

AT+Hep+Fab

5,6 ± 0,3 x 103

Tabla 4. Constantes de union de la IgA anti-exositio 1 (n = 1 en esta condicion precisa), anticuerpos IgG (n = 3), y FAB derivado de IgG para la trombina S195A (sitio activo libre, trombina recombinante). *Kd determinada por el 10 analisis de estado estatico de la respuesta frente a la concentracion. # Kd calculada a partir de las tasas. +

Determinada utilizando FAB inmovilizado

Kd (nM)* kon(MV) koff (s1) Kd (nM)#

IgA

1,8 3,3 x 105 3,7 x 10-4 1,2

IgG

1,5 ± 0,3 3,3 ± 0,5 x 105 6,8 ± 1,1 x 10-4 2,1 ± 0,3

IgG FAB

ND 5,0 x 105 2,7 x 10-3 5,3

IgG FAB+

3,3 ± 0.3 4,3 x 105 2,1 x 10-3 4,9

Claims (11)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   REIVINDICACIONES

   1. Una molecula de anticuerpo aislada que se une espedficamente en la region del exositio 1 de la trombina, donde la molecula de anticuerpo comprende un dominio VH que comprende unas HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 3, 4 y 5, respectivamente, y un dominio VL que comprende unas LCDR2 y LCDR3 que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 8 y 9, respectivamente, y una LCDR1 que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 7 o una LCDR1 que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 7 en la que el sitio de glicosilacion esta mutado por la introduccion de una sustitucion de un resto de aminoacido que se corresponde con la S30 de la SEQ ID NO: 6.
2. 2. La molecula de anticuerpo de acuerdo con la reivindicacion 1 que inhibe la actividad de la trombina.
3. 3. La molecula de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, donde la molecula de anticuerpo comprende un dominio VH que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2.
4. 4. La molecula de anticuerpo de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente, donde la molecula de anticuerpo comprende un dominio VL que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 6 o la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 6 en la que un sitio de glicosilacion esta mutado introduciendo una sustitucion en un resto de aminoacido que se corresponde con la S30.
5. 5. La molecula de anticuerpo de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente, que es un anticuerpo completo.
6. 6. La molecula de anticuerpo de acuerdo con la reivindicacion 5, que es una IgA o IgG.
7. 7. La molecula de anticuerpos de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente, que es un anticuerpo monoclonal.
8. 8. La molecula de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que es un fragmento de anticuerpo.
9. 9. Una composicion farmaceutica que comprende una molecula de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y un excipiente farmaceuticamente aceptable.
10. 10. Una molecula de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso en un metodo de tratamiento del cuerpo humano o animal.
11. 11. Una molecula de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso en un metodo de tratamiento de una afeccion mediada por la trombina que se selecciona de entre trombosis y embolia.