KR102114506B1 - 트롬빈-결합 항체 분자 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본원은 트롬빈의 엑소사이트 1 에피토프를 인식하며, 출혈을 유도하지 않고 트롬빈을 선택적으로 저해하는, 분리된 항체에 대한 것이다. 이 항체 분자는 혈전증, 색전증 및 트롬빈 매개의 다른 질환들의 치료 및 예방에 유용할 수 있다.

Description

트롬빈-결합 항체 분자 및 이의 용도{Thrombin-Binding Antibody Molecules and Uses Thereof}
본원은 트롬빈을 저해하는 항체 분자에 관한 것이다.
혈액 응고(blood coagulation)는 손상된 혈관으로부터의 출혈을 방지(지혈)하는 주요 프로세스이다. 그러나, 혈전이 혈관을 통과하는 피의 흐름을 방해하거나(혈전증) 또는 혈전이 부서져 몸 내의 다른 혈관에 박히면(혈전 색전증) 건강에 심각한 위협이 될 수 있다.
병적인 혈액 응고를 치료하기 위하여 많은 혈액응고방지제 치료가 가능하다. 이들 치료들의 공통적인 문제는 출혈 위험의 증가이다 (Mackman (2008) Nature 451(7181): 914-918). 많은 혈액응고방지 약제들은 혈전증을 방지하는 용량과 출혈을 증가시키는 용량 사이의 치료 용량 범위(therapeutic window)가 좁다. 이 범위는 종종 개별 환자들에서의 반응의 변화에 따라 더욱 제한되기도 한다.
본원은 트롬빈의 엑소사이트 1 에피토프를 인식하는 항체 분자는 출혈을 유도하지 않고 트롬빈을 선택적으로 저해한다는 예기치 못한 발견에 대한 것이다. 이들 항체 분자들은 혈전증, 색전증 및 다른 트롬빈에 의해서 매개되는 질환들의 치료 및 방지에 유용할 수 있다.
본원의 일 측면은 트롬빈의 엑소사이트 1에 특이적으로 결합하는 분리된 항체 분자를 제공한다.
분리된 항-엑소사이트 1 항체 분자는 생체 내(in vivo)에서 출혈 유도 또는 출혈의 실질적인 유도 또는 일혈(hemorrhage) 없이 트롬빈을 저해할 수 있으며, 즉, 항체 분자는 혈관 손상의 일반적 생리적 반응 (즉, 지혈)을 저해하거나 실질적으로 저해하지 않는다. 예를 들어, 항체 분자에 의하여 지혈이 저해되지 않거나 최소로 저해될 수 있다 (즉, 환자의 안녕에 영향을 미치지 않거나 또는 추가적인 조정이 필요하지 않을 정도로 미미하게 저해된다). 항체 분자에 의하여 출혈이 증가되지 않거나 최소한도로 증가될 수 있다.
엑소사이트 1 ('음이온 결합 엑소사이트 1' 및 '피브리노겐 인식 엑소사이트'로 또한 알려짐)은 트롬빈 분자 상의 특성이 잘 밝혀진 부차적인 결합 위치이다 (예를 들어, James A. Huntington, 2008, Structural Insights into the Life History of Thrombin, in Recent Advances in Thrombosis and Hemostasis 2008, editors; K. Tanaka and E.W. Davie, Springer Japan KK, Tokyo, pp. 80-106 참조). 엑소사이트 1은 성숙한(mature) 트롬빈에 생성되나, 프로트롬빈에는 생성되지 않는다 (예를 들어, Anderson et al (2000) JBC 2775 16428-16434 참조).
엑소사이트 1은 피브리노겐과 같은 트롬빈 기질들을 인식하는 데에 관련되나, 효소 활성 부위로부터는 떨어져 있다. 혈액응고방지제인 도데카펩타이드 히루겐(dodecapeptide hirugen, Naski et al 1990 JBC 265 13484-13489), 요소 V(factor V), 요소 VIII(factor VIII), 트롬보모듈린(thrombomodulin, 단백질 C 및 TAFI 활성화를 위한 공요소(cofactor)), 피브리노겐, PAR1 및 피브린(요소 XIII 활성화를 위한 공-요소)을 포함하는 다양한 트롬빈 결합 요소들이 엑소사이트 1에 결합한다.
항-엑소사이트 1 항체는 성숙한 인간 트롬빈의 엑소사이트 1에 결합할 수 있다. 인간 프리프로트롬빈의 서열은 SEQ ID NO: 1에 제시되어 있다. 인간 프로트롬빈은 SEQ ID NO: 1의 잔기 44 내지 622의 서열을 가진다. 성숙한 인간 트롬빈은 잔기 314 내지 363(경사슬) 및 잔기 364 내지 622(중사슬)의 서열을 가진다.
일부 구현예에서, 항-엑소사이트 1 항체는 다른 종(species)의 성숙한 트롬빈의 엑소사이트 1에도 결합할 수 있다. 다른 종의 트롬빈 서열은 당업계에 알려져 있으며 Genbank와 같은 공용 데이터베이스에서 사용가능하다. 다른 종의 트롬빈 서열 내의 해당 잔기들은 서열 정렬(sequence alignment) 툴(tool)을 이용하여 용이하게 확인될 수 있다.
여기에 제시된 트롬빈 잔기들의 번호 부여 방식은 당업계에서 관례적인 것이며 키모트립신 주형에 기반한 것이다 (Bode W et al EMBO J. 1989 Nov; 8(11):3467-75). 트롬빈은 키모트립신에 비하여 삽입 고리(insertion loops)를 가지고있으며, 이는 소문자를 사용하여 순서대로 기재되었다.
성숙한 인간 트롬빈의 엑소사이트 1은 SEQ ID NO: 1에 밑줄로 표시되어 있으며, 하기 잔기들을 포함할 수 있다: M32, F34, R35, K36, S36a, P37, Q38, E39, L40, L65, R67, S72, R73, T74, R75, Y76, R77a, N78, E80, K81, I82, S83, M84, K109, K110, K149e, G150, Q151, S153 및 V154. 일부 구현예에서, 이들 잔기들 중 어느 하나에 근접하게 위치한 (즉, 0.5 nm 또는 1 nm 이내)다른 트롬빈 잔기들이 엑소사이트 1의 일부로서 고려될 수 있다.
항-엑소사이트 1 항체는 엑소사이트 1의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 20 초과의 잔기를 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다. 바람직하게는, 항-엑소사이트 1 항체는 엑소사이트 1의 전체 잔기들로 구성된 에피토프에 결합할 수 있다.
예를 들어, 항-엑소사이트 1 항체는 인간 트롬빈의 M32, F34, S36a, P37, Q38, E39, L40, L65, R67, R73, T74, R75, Y76, R77a, I82 및 Q151 또는 다른 종의 트롬빈 내의 대응 잔기들로 구성된 군으로부터 선택되는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 모든 16 개의 잔기를 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 에피토프는 트롬빈 잔기인 Q38, R73, T74, Y76 및 R77a, 및 선택적으로 하나 이상의 추가적인 잔기를 포함할 수 있다.
여기서 기술된 항-엑소사이트 1 항체 분자는 트롬빈 엑소사이트 1에 특이적이며, 다른 에피토프, 예를 들어 성숙한 트롬빈 외의 포유류 단백질들의 에피토프들에 비하여 높은 친화성으로 이 에피토프에 결합한다. 예를 들어, 항-엑소사이트 1 항체 분자는 트롬빈 엑소사이트 1에 대하여 다른 에피토프들보다 적어도 500 배, 적어도 1000 배 또는 적어도 2000 배 강한 결합 친화성을 보인다.
바람직하게는, 여기서 기술된 엑소사이트 1에 특이적인 항체 분자는 성숙한 트롬빈에 결합하나 프로트롬빈에는 결합을 나타내지 않거나 실질적으로 결합을 나타내지 않을 수 있다.
모든 이론에 구속되지 않고, 항-엑소사이트 1 항체는 지혈마개(hemostatic clot)의 중심 내부의 트롬빈에 접근할 수 없으므로, 혈관 손상 부위의 정상적인 트롬빈 기능을 방해하여 지혈에 영향을 미칠 수 없을 수 있다. 그러나, 항-엑소사이트 1 항체들은 소괴 표면 및 소괴(clot)의 바깥 껍질의 트롬빈에 여전히 결합할 수 있으므로, 혈전증이 방지된다. 즉, 비-지혈적 혈전(non-haemostatic clot)의 확산이 방지된다.
항-엑소사이트 1 항체 분자는 엑소사이트 1에 대하여 50 nM 미만, 40 nM 미만, 30 nM 미만, 20 nM 미만, 10 nM 미만, 또는 1 nM 미만의 해리 상수를 가질 수 있다. 예를 들어, 항체 분자는 엑소사이트 1에 대하여 0.1 내지 50 nM, 예를 들어 0.5 내지 10 nM의 친화성(affinity)을 가질 수 있다. 적절한 항-엑소사이트 1 항체 분자는, 예를 들어, 트롬빈의 엑소사이트 1에 대하여 약 1 nM의 친화성을 가질 수 있다.
항-엑소사이트 1 항체 분자의 결합 역학 및 친화성(평형 해리 상수 Kd로 또한 나타남)은 표면 플라즈몬 공명, 예를 들어 BIAcore 분석과 같은 표준 기술을 이용하여 결정될 수 있다.
여기서 기술된 항-엑소사이트 1 항체 분자는 면역글로불린 또는 그의 절편일 수 있으며, 자연적인 것 또는 일부가 또는 전체가 합성적으로 제조된 것, 예를 들어 재조합 분자일 수 있다.
항-엑소사이트 1 항체 분자는 Fab, Fab2, Fab3, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니바디 및 나노바디를 포함하는 단일-도메인 항체를 포함하는 항체 항원-결합 부위, 및 모든 이소타입 또는 서브-클래스의 완전항체를 포함하는 임의의 폴리펩티드 또는 단백질을 포함할 수 있다. 항체 분자 및 이들을 구성하는 방법 및 용도는, 예를 들어 Holliger & Hudson, Nature Biotechnology 23(9):1126-1136 (2005)에 기술되어 있다.
일부 바람직한 구현예에서, 항-엑소사이트 1 항체 분자는 완전항체일 수 있다. 에를 들어, 항-엑소사이트 1 항체 분자는 IgG, IgA, IgE 또는 IgM 또는 임의의 이소타입 서브-클래스, 특히 IgG1 및 IgG4일 수 있다. 항-엑소사이트 1 항체 분자는 단일클론 항체일 수 있다. 다른 바람직한 구현예에서, 항-엑소사이트 1 항체 분자는 항체 절편일 수 있다.
항-엑소사이트 1 항체 분자는 키메릭, 인간화 또는 인간 항체일 수 있다.
여기서 기술된 항-엑소사이트 1 항체 분자는, 항체가 결합할 수 있는 다른 폴리펩티드들 및/또는 혈청 성분들과 같은 오염 물질이 없다는 뜻으로, 분리될 수 있다. 비록 다클론 항체 역시 사용될 수 있으나, 단일클론 항체가 일부 목적을 위하여 선호된다.
항-엑소사이트 1 항체 분자는 당업계에서 표준인 기술들을 사용하여 수득될 수 있다. 항체를 생산하기 위한 방법들은 단백질 또는 그의 단편을 이용하여 포유류(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 말, 염소, 양 또는 원숭이)를 면역화(immunising) 하는 것을 포함한다. 항체는 당업계에 알려진 모든 다양한 기술을 사용하여 면역화된 동물로부터 수득될 수 있고, 바람직하게는 관심 항원에 대한 항체의 결합을 이용하여 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 웨스턴 블롯 기술 또는 면역침강법이 사용될 수 있다 (Armitage et al., 1992, Nature 357: 80-82). 항체 및/또는 항체-생산 세포를 동물로부터 분리하는 것은 동물을 희생시키는 단계를 동반할 수 있다.
펩타이드로 포유동물을 면역화하는 것에 대한 대안 또는 보조적으로, 예를 들어 표면에 기능적인 면역글로불린 결합 도메인을 나타내는 람다 박테리오파지 또는 섬유상 박테리오파지를 사용하여, 재조합적으로 제조된 발현된 면역글로불린 가변 도메인의 라이브러리로부터 단백질에 특이적인 항체가 수득될 수 있으며, 예로써 WO92/01047를 참조한다. 라이브러리는 어떠한 단백질들(또는 단편들)에 의해서도 면역화되지 않은 유기체로부터 수득된 서열들로 구성된 천연의 것일 수 있고, 또는 관심 항원에 노출되었던 유기체로부터 수득된 서열을 이용하여 구성된 것일 수 있다.
다른 항-엑소사이트 1 항체 분자는 환자의 혈청에서 엑소사이트 1에 결합하는 항체를 스크리닝함으로써 식별될 수 있다.
일부 구현예에서, 항-트롬빈 항체 분자는 예를 들어 상기 기술된 것과 같은 임의의 종래의 수단들에 의하여 제조되고, 이후 엑소사이트 1 돌연변이를 가지는 트롬빈, 감마 트롬빈(R75 및 R77a의 자가분해에 의해 엑소사이트 1에 결함이 있음) 또는 프로트롬빈과 비교하였을 때 성숙한 트롬빈에 차별적으로 결합하는 것을 스크리닝한다. 적절한 스크리닝 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
비-트롬빈 단백질, 엑소사이트 1 돌연변이를 가지는 트롬빈, 감마 트롬빈 또는 프로트롬빈에 비하여 성숙한 트롬빈에 증가된 결합을 나타내는 항체, 예를 들어 성숙한 트롬빈에 결합하지만 엑소사이트 1 돌연변이를 가지는 트롬빈, 감마 트롬빈 또는 프로트롬빈에 결합하지 않는 항체가 항-엑소사이트 1 항체 분자로서 식별될 수 있다.
제조 및/또는 분리 후에, 항-엑소사이트 1 항체 분자의 생물학적 활성이 시험될 수 있다. 예를 들어, 트롬빈 기질, 공요소(cofactor) 또는 저해제 결합 및/또는 트롬빈에 의한 절단을 저해하는 항체 분자의 기능이 측정되거나, 및/또는 출혈을 유도하지 않고 혈전증을 저해하는 항체 분자의 기능이 측정될 수 있다.
적절한 항체 분자는 피브리노겐 응고 또는 트롬빈 시간 분석을 이용하여 활성이 시험될 수 있다. 적절한 분석방법은 당업계에 알려져 있다.
응고(coagulation) 및 출혈에 대한 항체 분자의 효과는 표준 기술들을 이용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 혈전증에 대한 항체 분자의 효과는, 염화제이철을 적용하여 혈관 내의 혈전을 증가시킨 마우스 모델과 같은 동물 모델에서 측정될 수 있다. 지혈에 대한 효과 또한, 예를 들어 마우스의 꼬리 출혈을 측정함으로써, 동물 모델에서 측정될 수 있다.
비록 항체 결합 도메인이 단지 중사슬 가변 도메인(VH)만을 포함하는 경우도 가능하지만 (예를 들어, 카멜리드(camelid) 또는 샤크(shark) 항체들), 항체 분자는 일반적으로 면역 글로불린 중사슬 가변 도메인(VH) 및 면역 글로불린 경사슬 가변 도메인(VL)을 포함하는 항원 결합 도메인을 포함한다.
각각의 VH 및 VL 도메인들은 전형적으로, 항원 결합을 담당하며 뼈대 부위들(framework regions)에 의하여 배치된, 3 개의 상보성 결정 부위들(CDRs)을 포함한다.
일부 구현예에서, 엑소사이트 1에의 결합은 전적으로 항-엑소사이트 1 항체 분자의 VHCDR3에 의하여 또는 실질적으로 항-엑소사이트 1 항체 분자의 VHCDR3에 의하여 유발될 수 있다.
예를 들어, 항-엑소사이트 1 항체 분자는 SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:5의 서열에 1개 이상, 예를 들어 2, 3, 4 또는 5 또는 초과의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 가지는 아미노산 서열을 가지는 HCDR3을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다. 치환은 보존적 치환(conservative substitutios)일 수 있다. 일부 구현예에서, HCDR3은 SEQ ID NO:5의 4 내지 9 부위(SEFEPF)에 아미노산 잔기들을 또는 보다 바람직하게는 SEQ ID NO:5의 2 및 4 내지 10 부위(D 및 SEFEPFS)에 아미노산 잔기들을 포함할 수 있으며 SEQ ID NO: 5의 하나 이상의 다른 부위에 치환, 결실 또는 삽입을 포함할 수 있다. HCDR3은 트롬빈 엑소사이트 1 에피토프와 상호작용하는 항체 분자의 유일한 부위 또는 실질적으로 유일한 부위일 수 있다. HCDR3은 따라서 트롬빈의 엑소사이트 1 부위에 대한 항체 분자의 특이성 및/또는 친화성을 결정할 수 있다.
항-엑소사이트 1 항체 분자의 VH 도메인은, SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 4에 하나 이상, 예를 들어 2, 3, 4 또는 5 또는 초과의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 가지는 서열을 가지는 HCDR2를 추가적으로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, HCDR2는 SEQ ID NO:4의 3 내지 7 부위(DPQDG)에 아미노산 잔기들을 또는 SEQ ID NO:4의 2 및 4 내지 7 부위(L 및 PQDG)에 아미노산 잔기들을 포함할 수 있으며, SEQ ID NO: 4의 하나 이상의 다른 부위에 치환, 결실 또는 삽입을 포함할 수 있다.
항-엑소사이트 1 항체 분자의 VH 도메인은, SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 3에 하나 이상, 예를 들어 2, 3, 4 또는 5 또는 초과의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 가지는 서열을 가지는 HCDR1를 추가적으로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, HCDR1은 SEQ ID NO:3의 5 부위에 아미노산 잔기 T를 포함할 수 있으며, SEQ ID NO: 3의 하나 이상의 다른 부위에 치환, 결실 또는 삽입을 포함할 수 있다.
일부 구현예들에서, 항체 분자는 SEQ ID NOs 3, 4 및 5의 서열을 각각 가지는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 VH 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체 분자는 SEQ ID NO: 2의 서열 또는 SEQ ID NO: 2의 서열에 하나 이상, 예를 들어 SEQ ID NO: 2에 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 8, 10 또는 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입이 있는 서열을 가지는 VH 도메인을 포함할 수 있다.
항-엑소사이트 1 항체 분자는 VL 도메인, 예를 들어, SEQ ID NOs 7, 8 및 9의 서열을 각각 가지거나 또는 독립적으로 하나 이상, 예를 들어 2, 3, 4 또는 5 또는 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 각각 가지는 SEQ ID NOs 7, 8 및 9의 서열을 각각 가지는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3를 포함하는 VL 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 치환은 보존적 치환일 수 있다. 예를 들어, 항체 분자는 SEQ ID NO: 6의 서열 또는 SEQ ID NO: 6에 하나 이상, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 가지는 SEQ ID NO: 6 서열을 가지는 VL 도메인을 포함할 수 있다.
일부 구현예들에서, VL 도메인은 Tyr49를 포함할 수 있다.
항-엑소사이트 1 항체 분자는 예를 들어 항체의 하나 이상의 특성, 예를 들어 친화도, 기능의 반감기, 결합 해리 속도를 향상시키는 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 삽입을 포함할 수 있다.
CDRs, 항체 VH 또는 VL 도메인 및 항체의 아미노산 서열 내에 치환, 결실 또는 삽입을 도입하기 위해 필요한 기술들이 당업계에서 일반적으로 가능하다. 활성에 최소의 또는 유익한 효과를 가지는 것으로 예측되거나 예측되지 않을 수 있는 변종 서열들이 치환, 결실 또는 삽입에 의하여 만들어질 수 있으며, 트롬빈의 엑소사이트 1에 결합하는 능력 및/또는 다른 원하는 특성들이 시험될 수 있다.
일부 구현예들에서, 항-엑소사이트 1 항체 분자는 각각 SEQ ID NOs 3, 4, 및 5의 서열을 가지는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 VH 도메인 및, 각각 SEQ ID NOs 7, 8 및 9의 서열을 가지는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 VL 도메인을 포함할 수 있다.
예를 들어, VH 및 VL 도메인들은 각각 SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 가지거나; 또는 각각 독립적으로 하나 이상, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는 SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 치환은 보존적 치환일 수 있다.
일부 구현예들에서, 항체는 당화 자리(glycosylation site)를 제거하는 하나 이상의 치환, 결실 또는 삽입을 포함할 수 있다. 예를 들어, SEQ ID NO: 6의 VL 도메인의 당화 자리는 N28 또는 S30 각각에 치환을 도입함으로써 돌연변이되어 제거될 수 있다.
항-엑소사이트 1 항체 분자는 상기한 바와 같이 어떠한 구성으로도 존재할 수 있다. 일부 바람직한 구현예들에서, 항-엑소사이트 1 항체 분자는 예를 들어 IgG1 또는 IgG4와 같은 IgG, IgA, IgE 또는 IgM과 같은 완전항체일 수 있다.
본원의 항-엑소사이트 1 항체 분자는 상기에서 기술한 항체 분자와 엑소사이트 1에 경쟁적으로 결합하는 것일 수 있으며, 예를 들어 (i) 트롬빈 엑소사이트 1에 결합하고 그리고 (ii) SEQ ID NO: 2의 VH 도메인 및/또는 SEQ ID NO: 6의 VL 도메인; SEQ ID NO:5의 HCDR 3; SEQ ID NOs: 3, 4, 7, 8 또는 9 각각의 HCDR1, HCDR2, LCDR1, LCDR2, 또는 LCDR3; SEQ ID NOs: 3, 4 및 5 각각의 서열의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3를 포함하는 VH 도메인; 및/또는 SEQ ID NOs: 3, 4 및 5 각각의 서열의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3를 포함하는 VH 도메인 및 SEQ ID NOs: 7, 8 및 9 각각의 서열의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3를 포함하는 VL 도메인을 포함하는 항체 분자일 수 있다.
항체 분자들 간의 경쟁은 인 비트로에서 용이하게 분석될 수 있으며, 예를 들어 ELISA 및/또는 하나 이상의 다른 태그되지 않은 항체 분자의 존재 하에서 탐지되어 동일한 에피토프 또는 중복되는 에피토프에 결합하는 항체 분자의 식별을 가능하게 하는 특이적 리포터 분자를 항체 분자에 태깅(tagging)하는 것에 의하여 분석될 수 있다. 이러한 방법들은 당업자가 손쉽게 알 수 있다. 따라서, 본원의 추가적인 측면은, 예를 들어 상기 기술한 트롬빈의 엑소사이트 1에 결합하는 VH 및/또는 VL 도메인, HCDR3 또는 모항체의 CDRs 세트와 같은 CDR을 포함하는 항체 분자와 경쟁하는, 항체 항원-결합 부위를 포함하는 항체 분자를 제공한다. 적절한 항체 분자는, 항체 항원-결합 부위가 VH 도메인 및 VL 도메인으로 구성되며, VH 및 VL 도메인은 각각 SEQ ID NOs: 3, 4, 및 5의 서열의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 SEQ ID NOs: 7, 8, 및 9의 서열의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, 예를 들어 VH 및 VL 도메인은 SEQ ID NOs: 2 및 6인, 엑소사이트 1에 결합하는 항체 항원-결합 부위와 경쟁하는, 항체 항원-결합 부위를 포함할 수 있다.
여기서 기술된 항-엑소사이트 1 항체 분자는 엑소사이트 1에 결합하는 요소들을 포함하는 트롬빈-결합 요소들의 결합을 저해할 수 있다. 예를 들어, 항체 분자는 fV, fVIII, 트롬보모듈린, 피브리노겐 또는 피브린, PAR1 및/또는 히루겐 및 히루겐 아날로그 중 하나 이상의 트롬빈에 대한 결합을 경쟁적으로 또는 비-경쟁적으로 저해할 수 있다.
여기에서 기술한 항-엑소사이트 1 항체 분자는 트롬빈의 하나 이상의 활성을 저해할 수 있다. 예를 들어, 항-엑소사이트 1 항체 분자는 피브리노겐, 혈소판 수용체 PAR-1 및 응고 요소 FVIII와 같은 하나 이상의 트롬빈 기질의 가수 분해(hydrolytic cleavage)를 저해할 수 있다. 예를 들어, 항체 분자가 트롬빈에 결합하면, 피브리노겐, PAR-1, 응고 요소FVIII 및/또는 요소 V, 피브린 존재하의 요소 XIII, 및 트롬보모듈린 존재 하의 단백질 C 및/또는 TAFI와 같은 다른 트롬빈 기질의 가수 분해를 적어도 5배, 적어도 10배, 또는 적어도 15배 감소시킬 수 있다. 일부 구현예들에서, 항-엑소사이트 1 항체 분자가 트롬빈에 결합하면, 트롬빈의 트롬빈 기질에 대한 탐지가능한 절단이 야기되지 않을 수 있다.
트롬빈 활성을 측정하기 위한 기술, 예를 들어 인 비트로에서 트롬빈 기질의 가수 분해를 측정하는 것이 당업계에서 일반적이며 여기에서 기재된다.
항-엑소사이트 1 항체 분자는, 예를 들어 생체 내에서의 반감기를 증가시키는 것과 같은 약제학적 특성을 향상시키기 위하여, 페길레이션(PEGylation)과 같은 화학적 변형, 또는 리포솜 내로의 도입에 의하여 추가적으로 변형될 수 있다.
응고 및 출혈에서 항-엑소사이트 1 항체 분자의 효과는 일반적인 기술을 이용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 혈전증 모델에서의 항체의 효과가 측정될 수 있다. 적절한 모델들은 일반적인 지혈을 시험하기 위한, 쥐 모델의 혈관에서 염화제이철에 의해 유도되는 혈전 생성 및 이에 따른 꼬리 출혈을 포함할 수 있다. 다른 적절한 혈전증 모델들은 당업계에 잘 알려져 있다 (예를 들어 Westrick et al ATVB (2007) 27:2079-2093 참조).
항-엑소사이트 1 항체 분자는 약제학적으로 수용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 포함될 수 있다.
약제학적으로 수용가능한 부형제는, 2차 반응을 유발하지 않고, 예를 들어 항-엑소사이트 1 항체 분자의 투여를 용이하게 하고, 신체 내에서의 수명 및/또는 효율을 증가시키고 또는 용액에의 용해도를 증가시키는, 약제학적 조성물에 적용되는 화합물 또는 화합물들의 조합일 수 있다. 이들 약제학적으로 수용가능한 매개체들은 항-엑소사이트 1 항체 분자의 투여 방식의 기능으로서 당업자들에게 잘 알려져 있으며 용이하게 채용될 수 있다.
일부 구현예들에서, 항-엑소사이트 1 항체 분자는 투여에 앞서서 재용해(reconstitution)를 위하여 동결건조 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 동결건조된 항체 분자는 개체에 투여하기에 앞서 멸균수 내에 재용해되어 식염과 혼합될 수 있다.
항-엑소사이트 1 항체 분자는, 항체 분자에 추가적으로 적어도 하나의 요소를 포함하는 약제학적 조성물의 형태로 일반적으로 투여될 것이다. 따라서 약제학적 조성물은, 항-엑소사이트 1 항체 분자에 추가적으로, 당업자에게 잘 알려진 약제학적으로 수용가능한 부형제, 담체, 버퍼, 안정제 또는 다른 물질들을 포함할 수 있다. 그러한 재료들은 무독하여야 하고 항-엑소사이트 1 항체 분자의 약효에 간섭하여서는 안 된다. 하기에서 논의되는 바와 같이, 담체 또는 다른 물질들의 정확한 특성은 환약(bolus), 수액(infusion), 주사(injection) 또는 다른 적절한 경로에 의한 투여 경로에 의존할 것이다.
피하 또는 정맥내 투여, 예를 들어 주사와 같은 비경구 투여를 위하여, 항-엑소사이트 1 항체 분자를 포함하는 약제학적 조성물은 발열물질이 없고 적절한 pH, 등장성 및 안정성을 가지는, 비경구적으로 수용가능한 수용액의 형태일 수 있다. 당업자들은, 예를 들어, 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 락테이티드(lactated) 링거 주사액과 같은 등장성 매개체(vehicle)를 이용한 적절한 용액을 용이하게 준비할 수 있다. 인산염, 구연산염 및 다른 유기산류와 같은 버퍼류; 아스코르브산 및 메티오닌과 같은 항산화제류; (옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤류; 카테콜; 레조시놀; 시클로헥사놀; 3'-펜타놀; 및 m-크레졸과 같은) 보존제류; 저분자량 폴리펩티드류; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질류; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 고분자류; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신과 같은 아미노산류; 단당류, 이당류 및 포도당, 만노오스 또는 덱스트린류를 포함하는 다른 탄수화물류; EDTA와 같은 킬레이트 시약류; 수크로오스, 만니톨, 트레할로오스 또는 소르비톨과 같은 당류; 나트륨과 같은 염-형성 카운터-이온류; 금속 착물류 (예를 들어 아연-단백질 착물류); 및/또는 TWEENTM, PLURONICSTM 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 비-이온 계면활성제류를 포함하는, 보존제류, 안정제류, 버퍼류, 항산화제류 및/또는 다른 첨가제들이 필요에 따라 채용될 수 있다.
항-엑소사이트 1 항체 분자를 포함하는 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 처치(treatment)들과 조합하여, 처치 조건에 따라 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
여기에서 기술된 항-엑소사이트 1 항체 분자는, 예방을 위한 또는 방지를 위한 치료 (예를 들어 개체에서 발생하는 질환의 위험을 감소시키기 위한 개체에서 질환이 발생하기 전의; 발생의 지연; 또는 발생 후의 강도를 감소시키기 위한 치료)를 포함하는, 인간 또는 동물의 몸을 치료하는 방법에 사용될 수 있다. 치료 방법은 항-엑소사이트 항체 분자를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함할 수 있다.
투여는 일반적으로 환자에서 효과를 보이기에 충분한 "치료 유효량(therapeutically effective amount)"으로 투여된다. 그러한 효과는 적어도 하나의 증상의 적어도 개선일 수 있다. 실제 투여량, 그리고 투여의 속도 및 시간 경과는 투여 대상의 특성 및 심각도, 투여되는 특정 포유류, 개별 환자의 임상 질환, 장애의 원인, 조성물이 전달되는 부위, 투여 방법, 투여 계획 및 의사에게 알려진 다른 요소들에 따를 것이다. 치료의 처방, 예를 들어 투여량의 결정 등은 일반의(general practitioners) 및 다른 의사들의 책임일 것이며 치료 대상 질병의 증상 및/또는 진행의 정도에 따를 것이다. 항체 분자의 적절한 투여량은 당업계에 잘 알려져 있다(Ledermann J.A. et al. (1991) Int. J. Cancer 47: 659-664; Bagshawe K.D. et al. (1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922). 구체적인 투여량은 여기에 제시되어 있거나 또는 사용될 수 있는 투여되는 약제의 종류에 적합한 것으로 Physician's Desk Reference (2003)에 제시된 것일 수 있다. 항체 분자의 치료 유효량 또는 적절한 투여량은 동물 모델 내에서 인 비트로 활성과 인 비보 활성을 비교함으로써 결정될 수 있다. 마우스 및 다른 실험동물들에서의 유효량으로부터 인간의 유효량을 추정하는 방법은 알려져 있다. 정확한 투여량은 항체가 예방을 위한것 또는 치료를 위한 것인지, 치료 대상 부위의 크기 및 위치, 항체의 정확한 특성(예를 들어, 완전 항체 또는 절편) 및 항체에 부착된 어떠한 탐지가능한 표지 또는 다른 분자들의 특성을 포함하는 많은 요소들에 의존할 것이다.
전형적인 항체 투여량은, 전신 적용의 경우 100 ? 내지 1 g, 국소 적용의 경우 1 ? 내지 1 mg의 범위 내일 것이다. 초기의 높은 도입 용량 및 이에 따르는 하나 이상의 낮은 용량들이 투여될 수 있다. 전형적으로, 항체는 완전항체, 예를 들어 IgG1 또는 IgG4 이소타입일 것이다. 이는 성인 환자의 한 번의 치료를 위한 용량이며, 이는 어린이 및 유아를 위하여 비례적으로 조정될 수 있고, 또한 다른 항체 포맷을 위하여 분자량에 비례하여 조정될 수 있다. 치료들은 의사의 재량에 따라 매일, 일 주일에 두 번, 매주 또는 매달 간격으로 반복될 수 있다. 개체를 위한 치료 스케쥴은 항체 조성물의 약동학적 및 약역학적 특성, 투여 루트 및 치료 대상 질병의 특성에 의존할 것이다.
치료는 주기적일 수 있으며, 투여들 간의 주기는 약 2 주 이상, 예를 들어 약 3 주 이상, 약 4 주 이상, 약 1 달 이상, 약 5 주 이상, 또는 약 6 주 이상일 수 있다. 예를 들어, 치료는 매 2주 내지 4주마다 또는 매 4주 내지 8주마다일 수 있다. 치료는 수술의 전 및/또는 후, 및/또는 수술 치료 또는 침습적 처치의 해부학상 부위에 직접적으로 투여 또는 적용될 수 있다. 투여의 적절한 배합 및 루트는 상기에 기술되어 있다.
일부 구현예들에서, 여기에서 기술된 항-엑소사이트 1 항체 분자들은 피하 주사를 통하여 투여될 수 있다. 피하 주사는, 예를 들어 장기 예방/치료를 위한 자기 주사기를 이용할 수 있다.
일부 바람직한 구현예들에서, 항-엑소사이트 1 항체 분자의 치료 효과는, 용량에 따라, 수 반감기 동안 지속될 수 있다. 예를 들어, 항-엑소사이트 1 항체 분자의 1회 용량의 치료효과는 개체에서 1 달 이상, 2 달 이상, 3 달 이상, 4 달 이상, 5 달 이상, 또는 6 달 이상 지속될 수 있다.
여기에서 기술된 항-엑소사이트 1 항체 분자는 트롬빈을 저해하며, 트롬빈-매개 질환의 치료에 유용할 수 있다.
지혈은 일반적인 응고 반응, 즉, 예를 들어 손상된 혈관으로부터의 출혈 또는 울혈의 방지이다. 지혈은 신체 내의 혈관들로부터의 출혈 및 울혈을 저지한다.
항-엑소사이트 1 항체 분자는 지혈에 영향을 미치지 않거나 또는 실질적으로 영향을 미치지 않는다. 즉, 출혈 또는 울혈을 유도하지 않는다.
본원의 측면들은; 인간 또는 동물의 신체의 치료 방법에 사용되는 여기에 기재된 항-엑소사이트 1 항체 분자; 트롬빈-매개 장애의 치료 방법에 사용되는 여기에 기재된 항-엑소사이트 1 항체 분자; 트롬빈-매개 질환의 치료를 위한 약제의 제조에서의 여기에 기재된 항-엑소사이트 1 항체 분자의 용도; 필요에 따라 여기에 기재된 항-엑소사이트 항체 분자를 개체에 투여하는 것을 포함하는 트롬빈-매개 질환의 치료 방법을 제공한다.
여기에 기재된 항-엑소사이트 1 항체에 의한 트롬빈 저해는 임의의 트롬빈-매개 질환의 치료에 임상적으로 유익할 수 있다. 트롬빈-매개 질환은 트롬빈의 형성 또는 활성과 연관된 장애들을 포함할 수 있다.
트롬빈은 지혈, 응고 및 혈전증에서 중요한 역할을 한다. 트롬빈-매개 질환들은 혈전증 및 색전증과 같은 혈전증 질환들을 포함한다.
혈전증은 지혈에 요구되는 것보다 과잉의(즉, 과잉 응고), 또는 지혈에 필요하지 않은 응고(즉, 지혈 외의 또는 비 지혈적 응고)이다.
혈전증은 혈관강 내부의 혈액 응고이다. 이는 필요 이상의 또는 지혈에 필요하지 않은 혈괴(혈전)의 형성으로 특정된다. 혈괴는 혈관을 통한 혈류를 방해하여 의학적 문제를 야기한다. 혈괴는 형성된 장소로부터 파괴되어 흩어짐으로써, 순환계 내의 다른 곳에서 색전증을 야기할 수 있다. 동맥계에서는, 혈전증은 전형적인 죽상동맥 경화반(atherosclerotic plaque)의 파열의 결과이다.
일부 구현예들에서, 예를 들어 혈관 내의 내피세포의 손상에서, 초기 생리학적 지혈 반응 이후에 혈전증이 발생할 수 있다. 다른 구현예들에서, 다른 생리학적 지혈 반응 없이 혈전증이 발생할 수 있다.
혈전증은 혈전증에 대한 내재적 경향(즉, 혈전발현경향)을 가지는 개체에서 발생하거나, 또는 혈전증에 대한 내재적 경향이 없는 '일반적인' 개체에서, 예를 들어 외부 자극에 대한 반응으로 발생할 수 있다.
혈전증 및 색전증은 순환계 내의 모든 정맥, 동맥 또는 다른 혈관에서 발생할 수 있으며, 미세혈관 혈전증을 포함할 수 있다.
혈전증 및 색전증은 수술(수술 중 또는 후 모두) 또는 관상동맥 스텐트와 같은 외부 물질을 환자에 삽입하는 것과 결부될 수 있다.
예를 들어, 여기에서 기술된 항-엑소사이트 1 항체는, 개심수술 및 투석과 같이 혈액이 인공적인 표면에 노출되는 수술 및 다른 처치들에서 유용할 수 있다.
혈전증 질환은 혈전발현경향, 혈전성 뇌졸중 및 관상동맥 폐색을 포함할 수 있다.
여기에서 기술된 치료에 적합한 환자는, 증상 또는 치료의 부작용이 혈전증이거나 혈전증의 위험을 높이거나 또는 일반적인 사람들에 비하여 혈전증의 경향이 있거나 혈전증의 위험이 높은 상태의 환자들을 포함한다. 예를 들어, 여기에서 기술된 항-엑소사이트 1 항체 분자는 암환자들에서 정맥혈전증을 치료하거나 예방하는 데에, 그리고 정맥 혈전 색전증의 50%의 원인이 되는, 병원에서 수득된 혈전증의 치료 또는 예방에 또한 유용할 수 있다.
여기에서 기술된 항-엑소사이트 1 항체 분자는 혈전증 질환과 같은 트롬빈-매개 질환에서, 실질적으로 지혈을 저해 또는 억제하지 않고, 치료 효과 또는 다른 유익한 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 항-엑소사이트 1 항체 분자가 처치된 환자에서, 처치되지 않은 개체들에 비하여 울혈의 위험이 증가되지 않거나 실질적으로 증가되지 않을 수 있다.
천연의 및 합성 헤파린류, 와파린, 직접적인 세린 프로테아제 저해제류(예를 들어, 아가트로반(argatroban), 다비가트란(dabigatran), 아픽사반(apixaban), 및 리바록사반(rivaroxaban)), 히루딘 및 이들의 유도체들(예를 들어, 레피루딘(lepirudin) 및 비바리루딘(bivalirudin)), 및 항-혈소판 의약류(예를 들어, 클로피도그렐(clopidogrel), 티클로피딘(ticlopidine) 및 아브식시맵(abciximab))과 같은 종래의 항응고제가 처리된 개체는 출혈을 유발한다. 여기에서 기술된 항-엑소사이트 1 항체 분자가 처치된 환자에서 출혈의 위험은 종래의 항응고제가 처치된 개체들에 비하여 감소된다.
트롬빈-매개 질환들은 염증, 감염, 종양 성장 및 전이, 기관 거부 및 치매(혈관의 및 비 혈관의, 예를 들어 알츠하이머 병)를 포함하는, 트롬빈 활성과 결부된 비-혈전증 질환들을 포함한다(Licari et al J Vet Emerg Crit Care (San Antonio). 2009 Feb;19(1):11-22; Tsopanoglou et al Eur Cytokine Netw. 2009 Dec 1;20(4):171-9).
여기에서 기술된 항-엑소사이트 1 항체 분자는, 예를 들어 환자로부터 수득된 샘플에서, 예를 들어 분석 및 응고 특성 분석과 같은 인 비트로 분석에서 또한 유용할 수 있다.
항-엑소사이트 1 항체 분자는 트롬빈 생성의 측정에서 유용할 수 있다. 트롬빈 생성 분석 방법들은, 피브리노겐을 피브린으로 전환시켜, 간단한 종말점 비색법의 사용을 불가능하게 하는 혼탁을 유발하므로 기술적으로 문제가 있다.
여기에서 기술된 항-엑소사이트 항체 분자를 혈액 샘플에 첨가하면, 피브린의 형성 및 이에 따른 혼탁을 방지 또는 저해함으로써, 섬유소 제거 과정의 필요 없이 색소 기질을 사용하여 트롬빈 생성을 측정할 수 있게 한다.
예를 들어, 트롬빈 생성 분석 방법은, 혈액 샘플을 여기에서 기술된 항-엑소사이트 1 항체 분자의 존재 하에서 색소 트롬빈 기질과 접촉시키고 그리고 기질로부터 색상 신호를 측정하는 것을 포함하고; 색소 신호는 샘플 내의 트롬빈 생성을 나타내는 것일 수 있다.
색상 신호는 샘플의 섬유소 제거 과정 없이 곧바로 측정될 수 있다.
적절한 기질들은 당업계에 잘 알려져 있으며, S2238 (H-D-Phe-Pip-Arg-pNa), β-Ala-Gly-Arg-p-니트로아닐리드 디아세테이트(Prasa, D. et al. (1997) Thromb. Haemost. 78, 1215; Sigma Aldrich Inc) 및 Tos-Gly-Pro-Arg-pNa.AcOH (Biophen CS-01(81); Aniara Inc OH USA)를 포함한다.
항-엑소사이트 1 항체 분자는 혈액 투석 및 체외막 산소화법과 같은 체외순환에서 상기 기술된 것과 같은 혈액의 응고를 저해하거나 방지하는 데에 유용할 수 있다.
예를 들어, 시험관 내 또는 체외에서 혈액 응고를 저해하거나 방지하는 방법은 여기에서 기술된 항-엑소사이트 1 항체 분자를 혈액 샘플에 도입하는 것을 포함할 수 있다. 혈액 샘플은 항-엑소사이트 1 항체의 도입 그리고 선택적으로 혈액 투석 또는 산소화와 같은 처치를 거치기 전, 동시 또는 후에 체외순환계 내로 도입될 수 있다. 일부 구현예들에서, 처치된 혈액은 이어서 개체에게 투여될 수 있다. 다른 구현예들은 체외의 혈액 샘플에서 혈액 응고를 저해하거나 방지하는 방법을 위한 여기에서 기재된 항-엑소사이트 1 항체 분자, 및 체외의 혈액 샘플에서 혈액 응고를 저해하거나 방지하는 방법에 사용되는 약제의 제조에서의 여기에서 기재된 항-엑소사이트 1 항체 분자의 용도를 제공한다.
본원의 다른 측면들은 트롬빈의 엑소사이트 1 에피토프에 결합하는 항체 분자의 제조에 관한 것이며, 예를 들어 병적인 혈액 응고 또는 혈전증의 치료에 유용할 수 있다.
트롬빈의 엑소사이트 1 에피토프를 위한 항체 항원-결합 도메인을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 부모 VH 도메인의 아미노산 서열 내에 하나 이상의 아미노산을 부가, 결실, 치환 또는 삽입함으로써 부모 도메인의 아미노산 서열 변이인 VH 도메인을 제공하고; HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 각각 SEQ ID NOS: 3, 4 및 5의 아미노산 서열을 가지고, 그리고; 선택적으로 VH 도메인을 결합하고 하나 이상의 VL 도메인을 제공하여 하나 이상의 VH/VL 조합을 제공하고; 그리고 부모 VH 도메인의 아미노산 서열 변이 또는 VH/VL 조합 또는 조합들인 상기 VH 도메인을 시험하여 트롬빈의 엑소사이트 1 에피토프를 위한 항체 항원 결합 도메인을 식별하는 것을 포함하는 방법일 수 있다.
부모 VH 도메인의 아미노산 서열 변이인 VH 도메인은 SEQ NO: 5의 HCDR3 서열 또는 하나, 둘, 셋 또는 그 이상의 아미노산의 부가, 결실, 치환 또는 삽입을 가지는 변이를 포함할 수 있다.
부모 VH 도메인의 아미노산 서열 변이인 VH 도메인은 각각 SEQ NO: 3 및 4의 HCDR1 및 HCDR2 서열 또는 이들 서열의 하나, 둘, 셋 또는 그 이상의 아미노산의 부가, 결실, 치환 또는 삽입을 가지는 변이들을 포함할 수 있다.
트롬빈의 엑소사이트 1 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 분자를 제조하는 방법으로서, 이는 VH 도메인을 인코딩하는 개시 핵산 또는 각각 VH 도메인을 인코딩하는 핵산들의 개시 레퍼토리를 제공하고, VH 도메인 또는 VH 도메인들은 각각 대체될 HCDR1, HCDR2 및/또는 HCDR3을 포함하거나 또는 HCDR1, HCDR2 및/또는 HCDR3 인코딩 부위가 결실된 것이고; 상기 개시 핵산 또는 핵산 레퍼토리를 각각 SEQ ID NOS: 3, 4 및 5의 아미노산 서열을 가지는 HCDR1, HCDR2, 및/또는 HCDR3의 아미노산 서열의 돌연변이를 인코딩하거나 또는 그에 의하여 생성되는 공여 핵산 또는 공여 핵산들과 결합하고, 상기 공여 핵산 또는 공여 핵산들은 VH 도메인을 인코딩하는 핵산의 산물(product) 레퍼토리를 제공하기 위하여 개시 핵산 또는 개시 레퍼토리 내의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 부위에 삽입되고; 산물 VH 도메인을 제조하기 위하여 상기 산물 레퍼토리의 핵산을 발현시키고; 선택적으로 상기 산물 VH 도메인을 하나 이상의 VL 도메인과 결합시키고; 트롬빈의 엑소사이트 1에 결합하는 항체 분자를 선별하고, 상기 항체 분자는 산물 VH 도메인 및 선택적으로 VL 도메인을 포함하고; 그리고 상기 항체 분자 또는 이를 인코딩하는 핵산을 회수하는 것을 포함한다.
항체 분자의 성숙 및 최적화를 위한 적절한 기술들은 당업계에 잘 알려져 있다.
트롬빈의 엑소사이트 1 에피토프를 위한 항체 항원-결합 도메인 및 항체 분자는 상기 기술된 바와 같이 시험될 수 있다. 예를 들어, 트롬빈에 결합하는 능력 및/또는 트롬빈 기질의 절단을 저해하는 능력이 측정될 수 있다.
응고 및 출혈에 대한 항체 분자의 효과는 표준 기술들을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 대퇴 정맥 또는 경동맥과 같은 혈관 내에서의 염화제이철 혈전 유발 마우스 혈전증 모델에서 일반적인 지혈을 시험하기 위한 꼬리 출혈이 이용될 수 있다.
본원에서 다양한 추가적인 측면들 및 구현예들이 본원의 기재로부터 당업자에게 명백할 것이다.
본원 명세서에서 언급된 모든 문서들은 전체로서 여기에서 참고로 포함되었다.
다른 언급이 없다면, 여기에서 항체 잔기들의 번호는 Kabat 정의 방법(Kabat numbering scheme)에 따라 부여되었다.
여기에서 사용된 "및/또는"은 두 특정 대상들 또는 요소들 각각이 서로 다른 대상 또는 요소와 함께 또는 서로 다른 대상 또는 요소 없이 채용되는 것이다. 예를 들어, "A 및/또는 B"는, 여기에서 개별적으로 제시된 것 처럼, (i) A, (ii) B 및 (iii) A 및 B 각각을 특이적으로 개시하는 것이다.
다른 기재가 없다면, 상기에 제시된 대상의 기술 또는 정의들은 본원의 특정한 측면 또는 구현예에 제한되지 않고, 기술된 모든 측면들 및 구현예들에 동일하게 적용될 수 있다. 따라서, 상기 제시된 대상들은 모든 조합들 및 치환들로 개시된다.
본원의 특정 측면들 및 구현예들이 하기에 기술된 도면들 및 표들을 참조하여 예시적으로 설명될 것이다.
도 1은 인간 트롬빈-세파로오스 컬럼에의 IgA의 결합 및 용리를 보여주는 것이다. 도 1A는 트롬빈-세파로오스 컬럼에서 pH 구배(중간에서 낮은, 위로 기울어진 선으로 보여짐)를 이용한 IgA의 용리 프로필(좁은 피크)를 보여준다. 도 1B는 전체 IgA 로드, 인간 트롬빈 컬럼를 통과한 액체 및 낮은 pH에서 용리된 용출액을 나타내는 비변성 블루 겔을 보여준다.
도 2는 IgA가 트롬빈에 결합하지만 프로트롬빈에 결합하지 않음을 나타내는 비-환원 SDS PAGE 겔을 보여준다. 이 풀-다운 분석법에서, 트롬빈 또는 프로트롬빈의 존재 하에서 IgA와 결합하기 위해 렉틴 아가로즈가 사용되었다. 이후 상등액이 SDS 겔에서 전기영동되었다. 1열은 크기 표준들; 2열은 상등액으로부터의 트롬빈의 고갈을 보여주고; 3열은 고갈이 IgA의 존재에 의한 것이라는 것을 보여주고; 3열 및 4열은 프로트롬빈이 고갈되지 않았으며 따라서 IgA에 결합하지 않는다는 것을 보여준다.
도 3은 IgA의 존재 또는 부재 하에서 트롬빈에 의한 S2238의 상대적인 절단 속도를 보여준다 (즉, S2238의 가수분해에 대한 시간에 따른 Abs405의 단일 기울기). 이는 IgA가 트롬빈의 활성 부위에 결합하지 않는 것을 의미한다.
도 4는 트롬빈에의 결합에 있어서 IgA가 형광 표지된 도데카펩타이드 히루겐과 경쟁한다는 것을 나타내는 결합 연구의 결과를 보여준다.
도 5는 트롬빈에 의한 S2238의 절단에 대한 IgA의 영향을 보여주는 것이다. 이 분석은 12nM의 IgA-트롬빈 상호작용의 Kd의 추정을 가능하게 한다.
도 6은 환원 및 비-환원(ox) 조건 하에서 전체 IgA 및 Fab 절편의 SDS-PAGE 겔을 보여준다. 비-환원 IgA는 100-200 kDa 사이의 분자량을 가지며, 비-환원 Fab는 약 50 kDa의 분자량을 가지는 것으로 나타났다.
도 7은 트롬빈 엑소사이트 1과 Fab 절편의 HCDR3 사이의 상호작용을 나타내는 트롬빈-Fab 복합체의 결정구조를 보여준다.
도 8은 트롬빈 엑소사이트 1의 특정 잔기들과 Fab 절편의 HCDR3 사이의 상호작용을 나타내는 결정 구조의 세부사항을 보여준다.
도 9는 FITC 표지된 피브리노겐이 주입된 C57BL/6 마우스의 대퇴정맥 손상에서 FeCl3에 의해 유도된 혈전의 2 분 내지 30 분 사이에 수득된 형광현미경 이미지를 보여준다. 100 μl의 PBS가 주입되었다 (매개체(vehicle) 대조군).
도 10은 FITC 표지된 피브리노겐 및 40 nM(마우스 혈액 내의 최종 농도, 약 0.6 mg/Kg의 용량에 상응함)의 항-엑소사이트 1 IgA(100 μl PBS 내)가 주입된 C57BL/6 마우스의 대퇴정맥 손상에서 FeCl3에 의해 유도된 혈전의 형광현미경 이미지를 보여준다.
도 11은 FITC 표지된 피브리노겐 및 80 nM(마우스 혈액 내의 최종 농도, 약 1.2 mg/Kg의 용량에 상응함)의 항-엑소사이트 1 IgA(100 μl PBS 내)가 주입된 C57BL/6 마우스의 대퇴정맥 손상에서 FeCl3에 의해 유도된 혈전의 형광현미경 이미지, 및 비교를 위하여 손상부위의 바깥 영역을 보여준다.
도 12는 FITC 표지된 피브리노겐 및 200 nM(마우스 혈액 내의 최종 농도, 약 3 mg/Kg의 용량에 상응함)의 항-엑소사이트 1 IgA(100 μl PBS 내)가 주입된 C57BL/6 마우스의 대퇴정맥 손상에서 FeCl3에 의해 유도된 혈전의 형광현미경 이미지, 및 비교를 위하여 손상부위의 바깥 영역을 보여준다.
도 13은 FITC 표지된 피브리노겐 및 400 nM(마우스 혈액 내의 최종 농도, 약 6 mg/Kg의 용량에 상응함)의 항-엑소사이트 1 IgA(100 μl PBS 내)가 주입된 C57BL/6 마우스의 대퇴정맥 손상에서 FeCl3에 의해 유도된 혈전의 형광현미경 이미지를 보여준다.
도 14는 FITC 표지된 피브리노겐 및 4 μM(마우스 혈액 내의 최종 농도, 약 60 mg/Kg의 용량에 상응함)의 항-엑소사이트 1 IgA(100 μl PBS 내)가 처리된 C57BL/6 마우스의 대퇴정맥 손상에서 FeCl3에 의해 유도된 혈전의 형광현미경 이미지를 보여준다.
도 15는 도 9 내지 13의 형광 이미지로부터 항-엑소사이트 1 IgA의 용량 반응을 정량하여 나타낸 것이다.
도 16은 대조군 C57BL/6 마우스 및 항-엑소사이트 1 IgA의 증가된 양이 처치된 마우스에서의 꼬리 출혈 시간을 나타내는 것이다. 제 2의 평균은 이상치(outlier)를 제외한 것이다.
도 17은 야생형 수컷 C57BL/6 마우스(n=5)의 꼬리 정맥에 IgA 또는 PBS를 각각 주입한 후의 테일 클립 분석 결과를 나타내는 것이다. 주입 15 분 후, 꼬리는 3 mm 직경으로 절단되었고 출혈이 10 분 이상 모니터링되었다.
도 18A 내지 18D는 앞에서와 같이 2분간 5% FeCl3에 의해 손상되기 15 분 전에 400 nM 항-트롬빈 IgA(혈중 최종 농도, 약 6 mg/Kg의 용량에 상응함) 또는 PBS가 주입된 9주령 야생형 C57BL/6 수컷 생쥐FeCl3 경동맥 폐색 모델의 결과를 보여준다. 도 18A는 전형적인 PBS-주입 마우스를 보여주고(20분 후 폐색) 그리고 도 18B, 18C 및 18D는 400 nM 항-트롬빈 IgA가 처리된 마우스에서의 결과의 예를 보여준다.
도 19는 20 nM 인간 트롬빈 첨가시 본원의 IgG 및 IgA의 농도 상승에 따른 트롬빈시간(thrombin time, 즉 혼합혈장의 응고)을 보여준다.
도 20은 고정화된 트롬빈(ForteBio Octet Red 장비 상에)에의 합성 IgG의 결합을 보여준다.
도 21은 고정화된 IgG에 대한 24 nM S195A 트롬빈 결합의 전형적인 옥텟 트레이스(Octet trace)를 보여주며, 오프 페이즈(off phase)에 뒤이은 온 페이즈(on phase)를 보여준다. 검은 선은 피트(fit)이다.
도 22는 고정화된 IgG가 로딩된 팁과 함께 500 nM 프로트롬빈의 옥텟 트레이스를 보여준다. 도 21의 트롬빈 실험과 동일한 조건이 사용되었다. 높은 농도에서도 결합의 증거는 나타나지 않았다.
실험
1. 항체 분리 및 특성 분석
환자로부터 수득한 혈장 샘플에 대하여 응고 스크리닝이 수행되었다. 응고 검사는 두부 손상에 따른 경막하혈종(subdural haematoma)을 앓는 환자에서 수행되었다. 혈종은 외부 개입이 없이 자연적으로 치유되었다. 이전에 출혈 경력이 없으며, 환자가 나타난 후 4 년 동안 추가적인 출혈 사건이 없었다. 결과는 표 1에 나타나 있다.
프로트롬빈시간(PT),활성화 부분트롬보플라스틴시간(activated partial thromboplastin time, APTT), 및 트롬빈시간(TT)이 대조군들에 비해 환자에서 연장되었으나, 렙틸라제(reptilase)시간은 정상이었다.
트롬빈시간은 헤파리나제에 의해 수정되지 않았으며, 이는 헤파린 처리 또는 오염이 그 이유가 아님을 의미한다. 환자에서 피브리노겐 레벨은 ELISA 및 렙틸라제 분석에 따르면 정상이었다. Clauss 법은, 트롬빈 저해제의 존제에 의해 인공적으로 낮은 피브리노겐 수준을 나타내었다. 일반 개체들로부터 수득한 혼합혈장과 50:50으로 혼합한 것을 사용한 혼합 테스트 후에, PT 및 APTT 응고 시간은 여전히 연장되는 것으로 나타났다. 이는 환자의 샘플 내에 저해재가 존재한다는 것을 보여준다.
환자의 혈장은 높은 역가의 IgA를 가지는 것으로 나타났다. 이 IgA 분자는 인간 트롬빈 컬럼 (도 1)에 결합하는 것으로 나타났다. IgA 결합 렉틴-아가로즈는 IgA의 존재 하에서 트롬빈을 풀 다운(pull down)시켰으나 IgA의 부재 하에서는 그렇지 않았다. 프로트롬빈은 IgA의 존재 하에서 렉틴-아가로즈에 의해 풀 다운되지 않았으며, 이는 IgA가 트롬빈에 특이적으로 결합하며, 프로트롬빈에는 결합하지 않는다는 것을 나타낸다 (도 2).
트롬빈 분자 상의 IgA의 결합 부위가 이어서 조사되었다.
트롬빈에 의한 S2238의 미세하게 높은 속도의 절단이 IgA의 존재 하에 측정되었고, 이는 IgA가 트롬빈의 활성 부위를 차단하지 않음을 나타낸다 (도 3).
형광 표지된 히루겐의 트롬빈에 대한 결합은 700 nM의 IgA 존재하에 저해되었으며, 이는 항체의 에피토프가 트롬빈 상의 히루겐 결합부위, 즉 트롬빈의 엑소사이트 1과 중복된다는 것을 의미한다 (도 4).
일부 트롬빈의 응혈 촉진성(procoagulant) 기질의 가수분해에 대한 IgA의 영향이 테스트되었다. 결과는 표 2에 나타난다. 이 결과들은 환자 샘플로부터 분리된 IgA 분자가 트롬빈의 복수의 응혈 촉진 활성들을 저해한다는 것을 시사한다.
IgA의 존재하에서 안티트롬빈(AT)에 의한 트롬빈의 저해는 헤파린의 부재 및 존재 모두에서 단지 미미한 영향만을 미쳤다.
IgA의 트롬빈에 대한 해리상수(Kd)는 S2238 가수분해 속도에 기반하여 최초로 추정되었으며, 이는 약 12 nM (도 5)였다. S195A 트롬빈(반응성 세린의 돌연변이에 따른 불활성화)에 대한 IgA 결합의 Kd는 ForteBio Octet Red 기기를 사용하여 2 nM로 측정되었다 (표 4).
정제된 IgA는 파파인에 의해 절단되었고 (도 6), 그리고 Fab 절편이 분리되었고 이어서 인간 PPACK-트롬빈과 결합되었다 (PPACK 는 공유 활성 부위 저해제임). 인간 PPACK-트롬빈-Fab 복합체는 결정화되고 기기를 이용하여 분석되었다. 구조의 통계는 하기와 같이 수득되었다 : 해상도 1.9Å; Rfactor = 19.43%; Rfree = 23.42%; one complex in the asymmetric unit; Ramachandran: favoured = 97.0%, outliers = 0%. 결정 구조는 IgA Fab의 HCDR3과 트롬빈의 엑소사이트 1 사이의 긴밀한 연계를 나타내었다 (도 7).
특히, 엑소사이트 1의 M32, F34, Q38, E39, L40, L65, R67, R73, T74, R75, Y76, R77a 및 I82 잔기들은 모두 IgA Fab의 HCDR3 루프와 직접적으로 상호작용하였다 (도 8).
항체-트롬빈 접점의 PISA 분석은 복합체에서 총 매몰 표면 지역이 1075Å임을 나타낸다. IgA 중사슬 내에서 접촉 잔기는 (Kabat 넘버링): 30, 51, 52a, 53-55, 96, 98, 99, 100, 100a, 100b, 100c, 100d이었다. 이들은 모두 CDRs 내에 있다: CDRH1- GYTLTEAAIH; CDRH2- GLDPQDGETVYAQQFKG; CDRH3- GDFSEFEPFSMDYFHF (밑줄친 잔기들이 접촉하고 있음). CDRH3이 항체 상의 매몰 표면 지역의 85%를 제공하고 있어, 가장 중요한 것으로 밝혀졌다. 경사슬은 CDRL2 직전의 Tyr49와 하나의 미미한 결합을 만든다 (트롬빈의 Ser36a와). 매몰 표면에 기여하는 일부 개체는: Glu99 54Å2, Phe100 134.8Å2, Glu100a 80.6Å2, Phe100c 141.7Å2.
트롬빈 내의 접촉 잔기들은 하기로 나타났다 (키모트립신 넘버링): 32, 34, 36a-40, 65, 67, 73-76, 77a, 82, 및 151. 매몰 표면에 가장 중요하게 기여하는 개체들은: Gln38 86.4Å2, Arg73 44.5Å2, Thr74 60.1Å2, Tyr76 78.4Å2, Arg77a 86.9Å2.
환자는 이 IgA의 3g/l 순환 수준에도 불구하고 증가되거나 비정상적인 출혈 또는 울혈을 나타내지 않았으며, 이는 항체가 일반적인 지혈에 영향을 미치지 않고 트롬빈을 저해한다는 것을 시사한다.
2. 동물 혈전증 모델에서 IgA의 영향
C57BL/6 마우스가 마취되었다. 카테터가 경동맥 내에 삽입되었다 (화합물 주입을 위해). FITC 표지된 피브리노겐(2 mg/ml)이 경동맥을 통하여 주입되었다. PBS(대조군) 또는 IgA가 또한 경동맥을 통해 주입되었다. 대퇴부 경맥이 노출되었고 응고를 촉진하기 위해 3 분 동안10% FeCl3(길이 3 mm의 압지를 적신 것)이 적용되었다.
FeCl3 손상의 0, 5, 10, 및 20 분 후에 형광현미경 기술을 이용하여 손상 부위를 따라 형광현미경 이미지가 수득되었다.
대퇴부 정맥 내의 혈전들(피브린 퇴적물)이 밝은 부위들로 명백하게 관찰되었다 (도 9). 향체의 가장 낮은 용량에서 뚜렷한 응고 저해가 유발되는 것이 관찰되었으나, 용량이 증가함에 따라, 응고가 사라졌다 (도 10 내지 15).
마우스의 출혈 시간이 또한 측정되었다. 출혈 시간은 꼬리 절단 후 혈류가 중단되는 시간에 의하여 측정되었다. 단일 이상치 샘플의 존재에도 불구하고, 출혈 시간은 항-엑소사이트 1 IgA의 처리에 영향을 받지 않는 것으로 나타났다 (도 16).
이러한 결과들은 항-엑소사이트 1 IgA 항체가 혈전증의 강력한 저해제이나, 출혈 시간에는 영향을 미치지 않는다는 것을 보여준다.
3. 테일 클립 분석
400 nM IgA(혈중 최종 농도, 약 6 mg/Kg의 용량에 상응함) 또는 PBS를 각각 주입한 야생형 수컷 C57BL/6 마우스에서 테일 클립 분석이 수행되었다. 주입 후 15 분 후에 꼬리를 3 mm 직경으로 절단한 후 혈액 손실이 10 분 이상 모니터링되었다. 항-엑소사이트 1 IgA 처리에 의하여 총 혈액 손실이 영향을 받지 않는다는 것이 밝혀졌다 (도 17).
4. FeCl3 손상 경동맥 폐색
FeCl3 손상 경동맥 폐색 실험이 9주령 야생형 C57BL/6 수컷 마우스에서 수행되었다. 마우스에 2 분간 5% FeCl3에 의한 손상이 가해지기 15 분 전에 400 nM 항-IIa IgA(혈중 최종 농도, 약 6 mg/Kg의 용량에 상응함) 또는 PBS가 주입되었다. 이후 Doppler에 의해 혈류가 모니터링되었고 폐색까지의 시간이 측정되었다. "혈전"은 혈류가 전형적으로 0.1 ml/분 이하로 감소되고 감소된 상태로 유지되는 안정한 폐색혈전으로 정의된다. 대조군 마우스에서, 손상 후 약 20 분 후에 안정한 혈전이 형성되는 것이 관찰되었다 (도 18A). 그러나, 400 nM 항-IIa IgA가 처리된 마우스의 대부분에서는 안정한 혈전들이 형성될 수 없었고, 혈전들이 빠르게 용해되거나, 반복적으로 용해되거나 또는 형성되지 않은 트레이스(trace)들이 있었다. 세 개의 대표적인 트레이스들이 도 18B 내지 18D에서 보여진다.
5. 항-엑소사이트 1 IgG
상기에서 기술한 환자 내에서 확인된 IgA 분자가 표준 기술들을 이용하여 IgG로서 교정되었다(re-formatte).
증가된 양의 원래 IgA 및 새로운 IgG와 혼합된 혼합 인간 혈장의 응고 시간이 인간 트롬빈 20 nM 첨가 후에 테스트되었다. 모 IgA 및 합성 IgG 모두 동일한 농도-의존 방식으로 혈전 형성 시간이 증가하였으며, 이는 트롬빈에 대하여 동일한 친화성을 가진다는 것을 의미한다.
이는 ForteBioTM Octet Red 기기를 이용하여 고정화된 S195A 트롬빈에 대한 합성 IgG의 결합을 측정함으로써 확인되었다. 트롬빈은 프로브에 부착되고, 항체들(다양한 농도)에 대한 결합이 모니터링되었다. 온-속도 및 오프-속도가 측정되었다. 두 항체들 모두 유사한 속도의 약 3x105 M-1s-1의 온-속도 및 약 5x10-4 s-1의 오프-속도였으며, 해리상수(Kd)는 약 2 nM이었다. 약 2 nM의 Kds가 정상 상태 분석에 의하여 IgA 및 IgG에서 또한 수득되었다 (표 4). 대표적인 정상 상태 커브가 도 20에 나타난다. IgA의 특성은 따라서 IgG 뼈대에 의하여 복제된 것이다.
IgG 항체에 대한 프로트롬빈의 결합이 고정화된 IgG에 의해 옥텟 시스템을 이용하여 테스트되었다. 트롬빈은 고정화된 트롬빈을 사용하여 수득한 것과 비슷한 속도 및 친화성으로 고정화된 IgG에 결합하였고 (표 4); 프로트롬빈은 IgG에 결합하지 않았다. 도 21은 고정화된 IgG에 결합한 그리고 해리된 24 nM 트롬빈의 트레이스이다. 도 22는 500 nM 프로트롬빈을 이용한 동일한 실험이며, 결합의 증거는 보이지 않았다.
서열
인간 프리프로트롬빈의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 1; GeneID: 2147; NP_000497.1 GI: 4503635; 엑소사이트 1 잔기들은 밑줄로 표시됨)
1 mahvrglqlp gclalaalcs lvhsqhvfla pqqarsllqr vrrantflee vrkgnlerec
61 veetcsyeea fealesstat dvfwakytac etartprdkl aaclegncae glgtnyrghv
121 nitrsgiecq lwrsryphkp einstthpga dlqenfcrnp dssttgpwcy ttdptvrrqe
181 csipvcgqdq vtvamtprse gssvnlsppl eqcvpdrgqq yqgrlavtth glpclawasa
241 qakalskhqd fnsavqlven fcrnpdgdee gvwcyvagkp gdfgycdlny ceeaveeetg
301 dgldedsdra iegrtatsey qtffnprtfg sgeadcglrp lfekksledk terellesyi
361 dgrivegsda eigmspwqvm lfrkspqell cgaslisdrw vltaahclly ppwdknften
421 dllvrigkhs rtryerniek ismlekiyih prynwrenld rdialmklkk pvafsdyihp
481 vclpdretaa sllqagykgr vtgwgnlket wtanvgkgqp svlqvvnlpi verpvckdst
541 riritdnmfc agykpdegkr gdacegdsgg pfvmkspfnn rwyqmgivsw gegcdrdgky
601 gfythvfrlk kwiqkvidqf ge
항-엑소사이트 1 IgA 및 IgG VH 도메인의 Kabat 넘버링된 아미노산 서열 (CDRs 밑줄표시): (SEQ ID NO: 2).
QVQLIQSGSAVKKPGASVRVSCKVSGYTLTEAAIHWVRQAPGKGLEWMGG
10 20 30 40 50
LDPQDGETVYAQQFKGRVTMTEDRSTDTAYMEVNNLRSEDTATYYCTTGD
52a 60 70 8082abc 90
FSEFEPFSMDYFHFWGQGTVVTVAS
100abcdefgh 110
항-엑소사이트 1 IgA 및 IgG HCDR1의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 3).
GYTLTEAAIH
항-엑소사이트 1 IgA 및 IgG HCDR2의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 4).
GLDPQDGETVYAQQFKG
항-엑소사이트 IgA 및 IgG HCDR3의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 5).
GDFSEFEPFSMDYFHF
항-엑소사이트 1 IgA 및 IgG VL 도메인의 Kabat 넘버링된 아미노산 서열: (SEQ ID NO: 6).
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQNVSSFLAWYQHKPGQAPRLLIYD
10 20 30 40 50
ASSRATDIPIRFSGSGSGTDFTLTISGLEPEDFAVYYCQQRRSWPPLTFG
60 70 80 90 95a
GGTKVEIKR
100 108
항-엑소사이트 1 IgA 및 IgG LCDR1의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 7).
RASQNVSSFLA
항-엑소사이트 1 IgA 및 IgG LCDR2의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 8).
DASSRAT
항-엑소사이트 1 IgA 및 IgG LCDR3의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 9).
QQRRSWPPLT
응고 스크리닝 결과
시험 결과 Control/Normalised Ratio (NR)
프로트롬빈시간 43 sec. NR = 11-13 sec.
50:50 correction 35 sec.
활성화 부분트롬보플라스틴시간
157 sec.		 NR = 22-23 sec.
50:50 correction 105 sec.
트롬빈시간 >150 sec. NR = 10-13 sec.
렙틸라제시간 16 sec. Control = 15 sec.
피브리노겐 Clauss 0.7 g/l NR = 1.5-4.5 g/l
Antigenic 5.0 g/l
응혈 촉진성 기질의 트롬빈 가수분해에 대한 항-엑소사이트 1 IgA의 영향
트롬빈 기질 활성 항체 효과
피브리노겐 피브린 소괴 형성 측정가능한 절단 없음
혈소판 수용체 PAR-1 펩타이드 혈소판 활성화 가수분해 15배 감소
FVIII
Xase 복합체를 통한 트롬빈의 피드백 활성		 가수분해 7배 감소
1 nM 헤파린(Hep) 부재 또는 존재 하에서 안티트롬빈(AT)에 의한 트롬빈 저해에 대한 항-엑소사이트 1 IgA(Fab)의 포화농도의 영향
저해 속도(M-1s-1) 헤파린 효과
AT 4.8±0.2x103 2.4 배
AT+Hep 11.8±0.3x103
AT+Fab 1.7±0.1x103 3.3 배
AT+Hep+Fab 5.6±0.3x103
S195A 트롬빈(활성 부위가 없는 재조합 트롬빈)에 대한 항-엑소사이트 1 IgA (상기 특정 조건 하 n=1), IgG (n=3) 항체, 및 IgG-유래 Fab의 결합 상수. *Kd는 반응 대 농도의 정상 상태 분석으로부터 결정됨. # Kd는 속도로부터 계산됨. +고정화된 Fab를 이용하여 결정됨.
Kd (nM)* kon (M-1s-1) koff (s-1) Kd (nM)#
IgA 1.8 3.3x105 3.7x10-4 1.2
IgG 1.5±0.3 3.3±0.5x105 6.8±1.1x10-4 2.1±0.3
IgG FAB ND 5.0x105 2.7x10-3 5.3
IgG FAB+ 3.3±0.3 4.3x105 2.1x10-3 4.9
SEQUENCE LISTING <110> Cambridge Enterprise Limited <120> Thrombin-Binding Antibody Molecules and Uses Thereof <130> NRS/CP6863112 <140> PCT/GB2012/053140 <141> 2012-12-14 <150> GB 1121513.4 <151> 2011-12-14 <160> 13 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 622 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala His Val Arg Gly Leu Gln Leu Pro Gly Cys Leu Ala Leu Ala 1 5 10 15 Ala Leu Cys Ser Leu Val His Ser Gln His Val Phe Leu Ala Pro Gln 20 25 30 Gln Ala Arg Ser Leu Leu Gln Arg Val Arg Arg Ala Asn Thr Phe Leu 35 40 45 Glu Glu Val Arg Lys Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys Val Glu Glu Thr 50 55 60 Cys Ser Tyr Glu Glu Ala Phe Glu Ala Leu Glu Ser Ser Thr Ala Thr 65 70 75 80 Asp Val Phe Trp Ala Lys Tyr Thr Ala Cys Glu Thr Ala Arg Thr Pro 85 90 95 Arg Asp Lys Leu Ala Ala Cys Leu Glu Gly Asn Cys Ala Glu Gly Leu 100 105 110 Gly Thr Asn Tyr Arg Gly His Val Asn Ile Thr Arg Ser Gly Ile Glu 115 120 125 Cys Gln Leu Trp Arg Ser Arg Tyr Pro His Lys Pro Glu Ile Asn Ser 130 135 140 Thr Thr His Pro Gly Ala Asp Leu Gln Glu Asn Phe Cys Arg Asn Pro 145 150 155 160 Asp Ser Ser Thr Thr Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Thr Val 165 170 175 Arg Arg Gln Glu Cys Ser Ile Pro Val Cys Gly Gln Asp Gln Val Thr 180 185 190 Val Ala Met Thr Pro Arg Ser Glu Gly Ser Ser Val Asn Leu Ser Pro 195 200 205 Pro Leu Glu Gln Cys Val Pro Asp Arg Gly Gln Gln Tyr Gln Gly Arg 210 215 220 Leu Ala Val Thr Thr His Gly Leu Pro Cys Leu Ala Trp Ala Ser Ala 225 230 235 240 Gln Ala Lys Ala Leu Ser Lys His Gln Asp Phe Asn Ser Ala Val Gln 245 250 255 Leu Val Glu Asn Phe Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Glu Glu Gly Val 260 265 270 Trp Cys Tyr Val Ala Gly Lys Pro Gly Asp Phe Gly Tyr Cys Asp Leu 275 280 285 Asn Tyr Cys Glu Glu Ala Val Glu Glu Glu Thr Gly Asp Gly Leu Asp 290 295 300 Glu Asp Ser Asp Arg Ala Ile Glu Gly Arg Thr Ala Thr Ser Glu Tyr 305 310 315 320 Gln Thr Phe Phe Asn Pro Arg Thr Phe Gly Ser Gly Glu Ala Asp Cys 325 330 335 Gly Leu Arg Pro Leu Phe Glu Lys Lys Ser Leu Glu Asp Lys Thr Glu 340 345 350 Arg Glu Leu Leu Glu Ser Tyr Ile Asp Gly Arg Ile Val Glu Gly Ser 355 360 365 Asp Ala Glu Ile Gly Met Ser Pro Trp Gln Val Met Leu Phe Arg Lys 370 375 380 Ser Pro Gln Glu Leu Leu Cys Gly Ala Ser Leu Ile Ser Asp Arg Trp 385 390 395 400 Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Leu Tyr Pro Pro Trp Asp Lys Asn 405 410 415 Phe Thr Glu Asn Asp Leu Leu Val Arg Ile Gly Lys His Ser Arg Thr 420 425 430 Arg Tyr Glu Arg Asn Ile Glu Lys Ile Ser Met Leu Glu Lys Ile Tyr 435 440 445 Ile His Pro Arg Tyr Asn Trp Arg Glu Asn Leu Asp Arg Asp Ile Ala 450 455 460 Leu Met Lys Leu Lys Lys Pro Val Ala Phe Ser Asp Tyr Ile His Pro 465 470 475 480 Val Cys Leu Pro Asp Arg Glu Thr Ala Ala Ser Leu Leu Gln Ala Gly 485 490 495 Tyr Lys Gly Arg Val Thr Gly Trp Gly Asn Leu Lys Glu Thr Trp Thr 500 505 510 Ala Asn Val Gly Lys Gly Gln Pro Ser Val Leu Gln Val Val Asn Leu 515 520 525 Pro Ile Val Glu Arg Pro Val Cys Lys Asp Ser Thr Arg Ile Arg Ile 530 535 540 Thr Asp Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Lys Pro Asp Glu Gly Lys Arg 545 550 555 560 Gly Asp Ala Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly Pro Phe Val Met Lys Ser 565 570 575 Pro Phe Asn Asn Arg Trp Tyr Gln Met Gly Ile Val Ser Trp Gly Glu 580 585 590 Gly Cys Asp Arg Asp Gly Lys Tyr Gly Phe Tyr Thr His Val Phe Arg 595 600 605 Leu Lys Lys Trp Ile Gln Lys Val Ile Asp Gln Phe Gly Glu 610 615 620 <210> 2 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gln Val Gln Leu Ile Gln Ser Gly Ser Ala Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Ala 20 25 30 Ala Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Leu Asp Pro Gln Asp Gly Glu Thr Val Tyr Ala Gln Gln Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Arg Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Val Asn Asn Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Thr Gly Asp Phe Ser Glu Phe Glu Pro Phe Ser Met Asp Tyr Phe 100 105 110 His Phe Trp Gly Gln Gly Thr Val Val Thr Val Ala Ser 115 120 125 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Ala Ala Ile His 1 5 10 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gly Leu Asp Pro Gln Asp Gly Glu Thr Val Tyr Ala Gln Gln Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Gly Asp Phe Ser Glu Phe Glu Pro Phe Ser Met Asp Tyr Phe His Phe 1 5 10 15 <210> 6 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Ser Ser Phe 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Asp Ile Pro Ile Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Arg Ser Trp Pro Pro 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Arg Ala Ser Gln Asn Val Ser Ser Phe Leu Ala 1 5 10 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Gln Gln Arg Arg Ser Trp Pro Pro Leu Thr 1 5 10 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Ser Glu Phe Glu Pro Phe 1 5 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Ser Glu Phe Glu Pro Phe Ser 1 5 <210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Asp Pro Gln Asp Gly 1 5 <210> 13 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Pro Gln Asp Gly 1

Claims (28)

  1. 트롬빈의 엑소사이트 1 부위에 특이적으로 결합하는 분리된 항체 분자이고,
    상기 항체 분자는 각각 SEQ ID NO:3, 4 및 5의 서열을 갖는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 VH 도메인; 및
    각각 SEQ ID NO: 8 및 9의 서열을 갖는 LCDR2 및 LCDR3, 및 SEQ ID NO: 7의 서열을 갖는 LCDR1 또는 당화 자리(glycosylation site)가, SEQ ID NO: 6에서 N28 또는 S30에 상응하는 아미노산 잔기에 치환을 도입함으로써 돌연변이된 SEQ ID NO: 7의 서열을 갖는 LCDR1을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 것인, 분리된 항체 분자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 LCDR1이, 당화 자리가 S30에 치환을 도입함으로써 돌연변이된 SEQ ID NO: 7의 서열을 갖는 것인, 항체 분자.
  3. 제1항에 있어서, 트롬빈 활성을 저해하는 것인, 항체 분자.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항체 분자는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열, 또는 당화 자리가 N28 또는 S30에 치환을 도입함으로써 돌연변이된 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는, 항체 분자.
  5. 제1항에 있어서,
    SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 가지는 VH 도메인; 및
    SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열, 또는 N28 또는 S30에 치환이 도입되어 당화 자리가 돌연변이화된 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 가지는 VL 도메인을 포함하는, 항체 분자.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 가지는 VL 도메인을 포함하고, 여기서 당화 자리는 S30에 치환이 도입되어 돌연변이화된 것인, 항체 분자.
  7. 제1항에 있어서, 완전항체인, 항체 분자.
  8. 제7항에 있어서, IgA 또는 IgG인, 항체 분자.
  9. 제1항에 있어서, 단일클론 항체인, 항체 분자.
  10. 제1항에 있어서, 항체 절편인, 항체 분자.
  11. 제1항에 따른 항체 분자 및 약제학적으로 용인되는 부형제를 포함하는, 혈전증 및 색전증으로부터 선택된 트롬빈-매개 질환의 치료를 위한, 약제학적 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 인간 또는 동물의 몸을 치료하기 위한 방법용, 항체 분자.
  13. 제1항에 있어서, 혈전증 및 색전증으로부터 선택된 트롬빈-매개 질환의 치료를 위한 방법용, 항체 분자.
  14. 제1항에 따른 항체 분자를 이용한, 혈전증 및 색전증으로부터 선택된 트롬빈-매개 질환 치료용 약제의 제조 방법.
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
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  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201121513D0 (en) 2011-12-14 2012-01-25 Cambridge Entpr Ltd Thrombin-binding antibody molecules and uses thereof
US9518128B2 (en) 2011-12-14 2016-12-13 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Thrombin-binding antibody molecules
GB201310949D0 (en) * 2013-06-19 2013-07-31 Cambridge Entpr Ltd Binding Motif
GB201310948D0 (en) * 2013-06-19 2013-07-31 Cambridge Entpr Ltd Screening methods
CN107043423B (zh) * 2016-02-05 2021-02-26 江苏恒瑞医药股份有限公司 凝血酶抗体、其抗原结合片段及医药用途
WO2017133673A1 (zh) * 2016-02-05 2017-08-10 江苏恒瑞医药股份有限公司 凝血酶抗体、其抗原结合片段及医药用途
WO2018081534A1 (en) * 2016-10-28 2018-05-03 President And Fellows Of Harvard College Assay for exo-site binding molecules
WO2019030706A1 (en) 2017-08-10 2019-02-14 Janssen Pharmaceutica Nv ANTI-THROMBIN ANTIBODY MOLECULES AND METHODS OF USE IN ORTHOPEDIC SURGERY
WO2019035055A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Janssen Pharmaceutica Nv ANTI-THROMBIN ANTIBODY MOLECULES AND METHODS OF USE WITH PLATELET ANTI-AGGREGATE AGENTS
WO2020003077A1 (en) * 2018-06-25 2020-01-02 Janssen Pharmaceutica Nv Anti-thrombin antibody molecules for use in patients at risk for gastrointestinal (gi) bleeding

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010033167A2 (en) 2008-09-18 2010-03-25 Archemix Corp. Anti-thrombin aptamer formulations and methods for use

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE68908175T2 (de) * 1988-05-27 1994-03-03 Centocor Inc Gefriergetrocknete formulierung für antikörperprodukte.
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5240913A (en) 1989-08-18 1993-08-31 Biogen, Inc. Inhibitors of thrombin
US5196404B1 (en) 1989-08-18 1996-09-10 Biogen Inc Inhibitors of thrombin
WO1991017258A1 (en) 1990-05-10 1991-11-14 Cetus Corporation Inhibitors of factor xii activation and applications thereof
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5443827A (en) * 1993-05-03 1995-08-22 President And Fellows Of Harvard College Fibrin-targeted inhibitors of thrombin
AU1378495A (en) * 1993-12-27 1995-07-17 Hamilton Civic Hospitals Research Development, Inc. Methods and compositions for inhibiting thrombogenesis
GB9613718D0 (en) 1996-06-29 1996-08-28 Thrombosis Res Inst Thrombin inhibitors
US5985833A (en) 1996-09-17 1999-11-16 Wisconsin Alumni Research Foundation Thrombin inhibitor
AU5903000A (en) 1999-06-29 2001-01-31 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Novel anti-thrombin peptide
CA2378473A1 (en) 1999-07-23 2001-02-01 The Regents Of The University Of California Modulation of platelet activation
WO2001087339A1 (en) * 2000-05-15 2001-11-22 Smithkline Beecham Corporation Antithrombotic agents
AU2001286900A1 (en) 2000-08-31 2002-03-13 Cor Therapeutics, Inc. Therapeutics and diagnostics based on a novel signal transduction system in platelets
US7615527B2 (en) * 2001-07-06 2009-11-10 Oregon Health & Science University Peptides which modulate blood coagulation and methods of use thereof
TWI338009B (en) * 2001-10-29 2011-03-01 Genentech Inc Antibodies for inhibiting blood coagulation and methods of use thereof
MEP0208A (xx) 2005-08-26 2010-02-10 Archemix Corp Aptameri koji vezuje trombin sa visokim afininitetom
US20100158890A1 (en) 2006-03-15 2010-06-24 Kenichi Tanaka Use of thrombin mutants to inhibit the anticoagulation effect of thrombin inhibitors
GB0711779D0 (en) 2007-06-18 2007-07-25 Univ Singapore Thrombin inhibitor
EP2297207B1 (en) 2008-06-19 2018-10-03 Prothix BV Use of anti-factor xi antibodies for prevention or treatment of thrombus formation
US9518127B2 (en) 2011-07-22 2016-12-13 Csl Behring Gmbh Inhibitory anti-factor XII/XIIA monoclonal antibodies and their uses
US9518128B2 (en) 2011-12-14 2016-12-13 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Thrombin-binding antibody molecules
GB201121513D0 (en) 2011-12-14 2012-01-25 Cambridge Entpr Ltd Thrombin-binding antibody molecules and uses thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010033167A2 (en) 2008-09-18 2010-03-25 Archemix Corp. Anti-thrombin aptamer formulations and methods for use

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BBRC, 177(3):1198-1204(1991)

Also Published As

Publication number Publication date
JP2015501830A (ja) 2015-01-19
SI2791177T1 (en) 2018-03-30
GB201121513D0 (en) 2012-01-25
CY1119599T1 (el) 2018-04-04
JP2018039798A (ja) 2018-03-15
UA116531C2 (uk) 2018-04-10
CO7101192A2 (es) 2014-10-31
EP2791177B1 (en) 2017-09-06
ES2642718T3 (es) 2017-11-17
US10287363B2 (en) 2019-05-14
US9988463B2 (en) 2018-06-05
PH12014501169B1 (en) 2014-09-08
MY170980A (en) 2019-09-23
US20140370008A1 (en) 2014-12-18
RU2642276C2 (ru) 2018-01-24
MX2014007170A (es) 2015-04-17
BR112014014605A2 (pt) 2017-06-13
EP2791177A1 (en) 2014-10-22
US20180334511A1 (en) 2018-11-22
HK1202564A1 (en) 2015-10-02
CN104053673B (zh) 2018-01-12
US20210371543A1 (en) 2021-12-02
PT2791177T (pt) 2017-11-29
WO2013088164A1 (en) 2013-06-20
HRP20171775T1 (hr) 2017-12-29
AU2012351858B2 (en) 2017-10-05
MX353281B (es) 2018-01-08
US20190276558A1 (en) 2019-09-12
HK1246326A1 (zh) 2018-09-07
IL232797A0 (en) 2014-07-31
IL232797B (en) 2018-07-31
PE20141706A1 (es) 2014-11-13
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