ES2307517T3 - Inmunoconjugados dirigidos contra diana neovascular. - Google Patents

Abstract

Composición útil en el tratamiento de estados patológicos caracterizados porque presentan neovascularización que comprende una proteína de inmunoconjugado construida como un dímero de dos cadenas idénticas, presentando cada una un dominio efector que es el dominio Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina IgG1 conjugado con un dominio de direccionamiento que es una forma mutante del factor VII que se une al factor tisular pero que no inicia la coagulación sanguínea, en la que dicha forma mutante del factor VII comprende una mutación seleccionada de entre el grupo constituido por alanina por la lisina 341 y una alanina por la serina 344.

Description

Inmunoconjugados dirigidos contra diana neovascular.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

Esta invención se refiere al diseño, la síntesis y la administración de reactivos de inmunoconjugados para tratar pacientes que presentan enfermedades asociadas con el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos (neovascularización) tales como cáncer, artritis reumatoide, la forma exudativa de degeneración macular y aterosclerosis. La diana para los inmunoconjugados de la invención es el factor tisular de receptor transmembrana expresado por células endoteliales de la neovasculatura. El factor tisular también se expresa por muchos tipos de células tumorales. Por tanto, los métodos terapéuticos de la invención son especialmente eficaces en la inmunoterapia frente a una amplia gama de tumores sólidos. El reactivo terapéutico es un inmunoconjugado compuesto por un dominio de direccionamiento y un dominio efector (figura 1). El dominio de direccionamiento es una forma mutada del factor VII que se une con alta afinidad y especificidad al factor tisular, pero que no inicia la coagulación sanguínea. El dominio efector es la región Fc de una inmunoglobulina IgG1.

Antecedentes de la invención

Se observa angiogénesis patológica, la inducción del crecimiento de vasos sanguíneos a partir de los vasos del tejido circundante, en una variedad de enfermedades, desencadenadas normalmente por la liberación de factores de crecimiento específicos para células endoteliales vasculares. La angiogénesis patológica puede dar como resultado neovascularización, que permite al tumor sólido crecer y experimentar metástasis, provocando disfunción visual en trastornos oculares, estimulando la extravasación de leucocitos en trastornos inflamatorios y/o influyendo en las consecuencias de enfermedades cardiovasculares tales como aterosclerosis. De manera colectiva, éstas se denominan algunas veces enfermedades angiogénicas.

Dado que la supervivencia y el crecimiento de un tumor sólido depende críticamente del desarrollo de una neovasculatura, el cáncer es una enfermedad angiogénica primordial (Folkman, J. (1995) N. Engl. J. Med. 333, 1757-1763). Muchos cánceres progresan en estadios, comenzando con proliferación de células tumorales primarias, a continuación penetración de células tumorales en el sistema circulatorio, colonización en sitios metastásicos diseminados y proliferación de las células tumorales metastatizadas que son responsables de la mayoría de muertes por cáncer (Vogelstein, B., y Kinzler, K.W. (1993) TIG 9, 141-143). Debido a que el cáncer permanece a menudo sin detectar hasta que la enfermedad ha alcanzado el estadio metastásico, las terapias de cáncer que pueden erradicar la infraestructura vascular y las células tumorales metastásicas son particularmente deseables.

La angiogénesis también desempeña un papel significativo en la artritis reumatoide (Szekanez, Z., et al. (1998) J. Invest. Med. 46, 27-41). La artritis reumatoide (RA) es una enfermedad inflamatoria sistémica crónica que se produce en todo el mundo en todos los grupos étnicos y que afecta predominantemente a las articulaciones diartrodiales y frecuentemente a una variedad de otros órganos. El tejido sinovial con RA está exhaustivamente neovascularizado. En la RA, migran leucocitos inflamatorios al sinovio a través de la capa endotelial de los vasos sanguíneos, dando como resultado una inflamación sinovial y, finalmente, la destrucción de la articulación.

La angiogénesis subyace a la mayoría de las enfermedades oculares que dan como resultado pérdida de visión catastrófica (Friedlander, M., et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 9764-9769). La causa principal de ceguera en individuos por encima de 55 años de edad es la forma exudativa ("húmeda") de degeneración macular relacionada con la edad (ARMD) y, por debajo de 55 de edad, retinopatía diabética proliferativa (PDR). Aunque la ARMD y PDR son enfermedades prototípicas para la neovascularización coroidal y retinal, respectivamente, otros estados degenerativos o inflamatorios pueden provocar selectivamente angiogénesis de cualquier vasculatura (ibidem.).

Por tanto, un enfoque al tratamiento de estos estados patológicos, y particularmente de cáncer, ha sido comprometer la función o el crecimiento de la neovasculatura principalmente inhibiendo el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos (Chaplin, D.J., y Dougherty, G.J., (1999) Br. J. Cancer, 80, 57-64). Existen varias ventajas en el direccionamiento vascular. En primer lugar, el daño a los vasos sanguíneos puede detener el flujo sanguíneo y, aplicado al cáncer, puede desencadenar la muerte de muchas células tumorales dependientes. En segundo lugar, las células diana están adyacentes al torrente sanguíneo, potenciando la administración del fármaco. En tercer lugar, no es probable que surjan mutaciones resistentes al tratamiento en células endoteliales vasculares.

Se han sugerido varias terapias antiangiogénicas, incluyendo enfoques basados en terapia génica, de anticuerpos y farmacológica. Éstos incluyen inhibidores de metaloproteinasa, polisulfato de pentosano y TNP-470, inhibidores selectivos de la tirosina cinasa e inhibidores peptídicos de angiostatina y endostatina (ibidem, y revisiones citadas en la misma). Éstos previenen normalmente la angiogénesis en diversos estadios de la formación de vasos, es decir, degradación de la membrana basal, migración de células endoteliales, proliferación de células endoteliales y formación del tubo. Sería deseable poseer terapias mejoradas que se dirijan no solo a la angiogénesis, sino también a la neovasculatura ya formada en estados patológicos angiogénicos.

Sumario de la invención

Un objetivo de la invención consiste en proporcionar un nuevo tratamiento para enfermedades que implican el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos (neovasculatura), incluyendo cáncer, artritis reumatoide, la forma exudativa de degeneración macular y aterosclerosis. Otro y más específico objetivo de la invención consiste en proporcionar una terapia dirigida a la neovasculatura que no sólo inhibe la angiogénesis observada en estos estados patológicos, sino que también destruye la estructura neovascular.

Estos y otros objetivos se logran mediante la presente invención, que proporciona una composición que contiene por lo menos un inmunoconjugado construido como un dímero de dos cadenas idénticas, presentando cada una un dominio efector que es la región Fc de una inmunoglobulina IgG1 humana conjugado con un dominio de direccionamiento que comprende una forma mutante del factor VII humano, tal como un factor VII con una sustitución de alanina por lisina 341 y/o alanina por serina 344. Dado que el factor tisular se expresa por células endoteliales que revisten la neovasculatura del tumor pero no la neovasculatura normal, y también por muchos tipos de células tumorales, los inmunoconjugados del factor VII de la invención son especialmente eficaces en la inmunoterapia frente a una amplia gama de tumores sólidos. La invención difiere de las invenciones descritas anteriormente que activan la coagulación en la neovasculatura y/o introducen factor tisular o mutantes de factor tisular en la neovasculatura (tal como se describió por Edgington y Morrissey en la patente US nº 6.001.978), lo que es superfluo porque se expresa específicamente factor tisular por las células endoteliales de la neovasculatura, en dos aspectos principales: se utiliza factor tisular como una diana para inducir una respuesta inmunitaria citolítica mediada por inmunoconjugados de la invención, en lugar de cómo un iniciador del proceso de coagulación sanguínea, y se inicia una respuesta inmunitaria citolítica que destruye la neovasculatura sin activar la ruta de la coagulación sanguínea.

También se dan a conocer procedimientos para la administración sistémica o local de los inmunoconjugados, que implican la utilización de proteínas de inmunoconjugado purificadas en composiciones farmacéuticas convencionales, o sistemas de vector portadores de un ADNc que codifica para una forma secretada del inmunoconjugado. Los tratamientos según la invención incluyen, pero no se limitan a, inyección intravenosa o intratumoral periódica o continua, o inyección en otros sitios, o cantidades eficaces de uno o más tipos de proteína de inmunoconjugado purificada. Las formas de realización alternativas implican el tratamiento de pacientes mediante inyección intravenosa o intratumoral, o inyección en otros sitios, de una cantidad eficaz de un vector de expresión portador de un ADN que codifica para una forma secretada de uno o más tipos de la proteína de inmunoconjugado. Los ejemplos de lo último incluyen el tratamiento de pacientes mediante inyección intravenosa o intratumoral, o inyección en otros sitios, de una vector adenoviral de replicación deficiente o un vector adenoasociado portador de un ADNc que codifica para una forma secretada de los inmunoconjugados de la invención.

En algunas formas de realización tales como inmunoterapia del cáncer, se administran los inmunoconjugados de la invención junto con otro tipo de inmunoconjugado que presenta un dominio de direccionamiento diferente. Éstos son normalmente fragmentos de molécula Fv o V_{H} de cadena única aislados a partir de bibliotecas de fagos de fusión de scFv o V_{H} humanas que se unen selectivamente a moléculas de la superficie celular expresadas en células tumorales, células endoteliales vasculares, células invasivas en el sinovio en condiciones patológicas y similares.

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Breve descripción de las figuras

La figura 1 es un diagrama que ilustra la organización de una molécula de inmunoconjugado de la invención. TD: dominio de direccionamiento. H: región de bisagra de una inmunoglobulina IgG1 con 2 puentes disulfuro. CH2 y CH3: regiones constantes de una inmunoglobulina IgG1. El dominio de direccionamiento consiste normalmente en el factor VII humano con un sitio activo mutado o una molécula scFv o V_{H} humana. El dominio efector consiste normalmente en la región Fc de una IgG1 humana, sin modificar o conjugada con un agente citotóxico tal como una molécula radiactiva o una molécula de colorante fotoactivable.

La figura 2 es un gráfico de barras que muestra la lisis dependiente de inmunoconjugado de células de melanoma humanas mediante células citolíticas naturales (NK) humanas. El dominio de direccionamiento del inmunoconjugado es una molécula scFv humana específica de melanoma y el dominio efector es la región Fc de una inmunoglobulina IgG1 humana. Se marcaron la línea celular de melanoma humano A-2058 y el control de células de fibroblastos humanos con el colorante fluorescente Calcein-AM. Se midió mediante fluorescencia residual la fracción de melanoma o células de fibroblastos que permanecían intactas tras su exposición a células NK solas (barra A) o a células NK con el inmunoconjugado de scFV E26-1 (barra B). Se varió la porporción de células efectoras NK con respecto a células diana (E/T) desde 3 hasta 20. Se realizaron tres juegos completos de experimentos tanto para las células de melanoma como para las de fibroblastos; para cada experimento, los ensayos de citólisis se realizaron por cuadriplicado. Las barras representadas en la figura representan el promedio de los ensayos de citólisis para los tres experimentos, que generalmente coincidían en el 10%. Se calculó el % de citólisis tal como se describe en el ejemplo 1. Se obtuvieron resultados similares con el inmunoconjugado de scFv G71-1.

La figura 3 es un gráfico de barras que muestra la lisis dependiente de inmunoconjugado de células de melanoma humanas mediante el complemento. El procedimiento fue tal como se describió en la leyenda de la figura 2, con la excepción de que se utilizó suero humano o componentes del complemento del conejo purificados en lugar de células NK. El inmunoconjugado y reactivos del complemento para cada ensayo fueron tal como se muestran en el ejemplo 1, tabla 1.

La figura 4 representa un ensayo inmunohistoquímico para detectar la unión de un inmunoconjugado de factor VII de ratón mutado (mfVIIasm) a células tumorales y células endoteliales vasculares tumorales en un xenoinjerto hecho crecer en ratones SCID. El 2º anticuerpo fue anticuerpo anticadena \gamma humana marcado con AP, y el sustrato de AP fue BCIP/NBT que produce un color azul, la contratinción fue verde de metilo. Panel A: control teñido con hematoxilina + eosina que muestra una vascularización extensa del xenoinjerto. Panel B: inmunohistoquímica con el inmunoconjugado mfVIIasm que muestra tinción intensa tanto de células endoteliales vasculares como tumorales. Panel C: control inmunohistoquímico sin el inmunoconjugado mfVIIasm.

La figura 5 son gráficos de líneas que muestran concentraciones de los inmunoconjugados G71-1 scFv y mfVIIasm en la sangre de ratones SCID tras inyecciones intravenosas de vectores adenovirales de replicación deficiente que codifican para los inmunoconjugados. Se les inyectó a los ratones en el día 0 y el día 7 2x10^{11} adenovirus que codifican para el inmunoconjugado G71-1 (A) o 4x10^{11} adenovirus que codifican para el inmunoconjugado mfVIIasm (B). Se determinó la concentración del inmunoconjugado codificado en la sangre mediante ELISA. Cada punto es el promedio de la concentración para los 5 ratones en cada grupo.

La figura 6 es un gráfico de líneas que muestra el efecto inhibidor de los inmunoconjugados G71-1 y mfVIIasm sobre el crecimiento de un xenoinjerto de melanoma humano en ratones SCID. Para cada curva, se les inyectó a 5 ratones SCID por vía subcutánea 5x10^{5} células TF2. Cuando los xenoinjertos habían crecido hasta un tamaño palpable, los ratones recibieron inyecciones en la vena de la cola en los días 0, 7 y 14 de los adenovirus indicados en la figura. La cantidad de adenovirus inyectados fue de 4x10^{11} para el control, 2x10^{11} para el adenovirus que codifica para el inmunoconjugado G71-1 y 4x10^{11} para el adenovirus que codifica para el inmunoconjugado mfVIIasm. Los volúmenes tumorales estimados son los promedios para los 5 ratones en cada grupo.

La figura 7 es un gráfico de barras que muestra los pesos tumorales de los xenoinjertos del experimento del que se informa en la figura 6 y el ejemplo 2. Se diseccionaron los xenoinjertos de los ratones en el día 20, que era 6 días tras la última inyección de adenovirus. Las alturas de las barras son los pesos promedio para los 5 ratones en cada
grupo.

La figura 8 es un gráfico de líneas que muestra el efecto inhibidor de los inmunoconjugados G71-1 y mfVIIasm sobre el crecimiento de un xenoinjerto de melanoma humano grande en ratones SCID. A cada ratón se le inyectó por vía subcutánea 5x10^{5} células de melanoma, y se dejaron crecer los xenoinjertos hasta un volumen tumoral estimado de 50 mm^{3} sobre la superficie de la piel (día 1). Se inyectó una mezcla de 2x10^{11} adenovirus que codifican para el inmunoconjugado G71-1 y 7x10^{11} adenovirus que codifican para el inmunoconjugado mfVIIasm en la vena de la cola de 5 ratones en los días 1, 6, 12 y 19. Como control, se les inyectó a 5 ratones 4x10^{11} adenovirus que no codificaban para un inmunoconjugado. Los volúmenes tumorales estimados son los promedios para los 5 ratones en cada grupo. Uno de los ratones inyectados con los adenovirus que codifican para los inmunoconjugados se encontró muerto en el día 17; los volúmenes tumorales estimados en los días posteriores son los promedios para los 4 ratones restantes.

La figura 9 es un gráfico de líneas que representa el efecto inhibidor del inmunoconjugado mfVIIasm sobre el crecimiento de un xenoinjerto de melanoma humano que expresa un nivel bajo de factor tisular. Se les inyectó a los ratones por vía subcutánea 5x10^{5} células LXSN, y cuando el xenoinjerto había crecido hasta un tamaño palpable (día 0), se les inyectó a 5 ratones por vía intravenosa 9 x10^{11} adenovirus que codifican para el inmunoconjugado mfVIIasm y se les inyectó a 5 ratones 4x10^{11} adenovirus control. Se realizaron inyecciones adicionales en los días 7, 13, 21 y 24 y en el día 25 se diseccionaron los ratones para el examen morfológico e inmunohistoquímico. Los volúmenes tumorales estimados son los promedios para los 5 ratones en cada grupo.

La figura 10 ilustra la histoquímica de los xenoinjertos de melanoma humanos del experimento del que se informa o en la leyenda de la figura 9 y el ejemplo 2. Se diseccionaron los xenoinjertos en el día 25, se incrustaron en parafina y se tiñeron secciones con hematoxilina + eosina. Panel A: xenoinjerto de un ratón control inyectado con el adenovirus que no codifica para un inmunoconjugado. Panel B: xenoinjerto de un ratón inyectado con el adenovirus que codifica para el inmunoconjugado mfVIIasm.

La figura 11 es un gráfico de líneas que muestra el efecto de la dosificación de vectores adenovirales inyectados por vía intratumoral sobre el crecimiento de un tumor de melanoma humano en ratones SCID. En primer lugar, se les inyectó a los ratones por vía subcutánea la línea celular de melanoma humano TF2, y cuando había crecido un tumor cutáneo hasta el tamaño indicado en el día 0, se le inyectó al tumor una mezcla de los dos vectores adenovirales que codifican para los inmunoconjugados mfVIIasm y G71-1. La dosis para los dos vectores fueron las siguientes. \medcirc: 7x10^{8} UI; \nabla: 2x10^{9} UI; \Box: 6x10^{9} UI. La dosis para el control, \lozenge, se inyectó con 6x10^{9} UI de un vector adenoviral que no codificaba para un inmunoconjugado.

La figura 12 es un gráfico de líneas que muestra el efecto de una alta dosis de vectores adenovirales inyectados por vía intratumoral sobre el crecimiento de un tumor de melanoma humano en ratones SCID. En primer lugar, se les inyectó a los ratones por vía subcutánea la línea de melanoma humano TF2, y cuando el tumor cutáneo había crecido hasta el tamaño indicado en el día 0, se le inyectó al tumor 6x10^{9} UI de los siguientes vectores adenovirales: \medbullet, vector control (3 ratones); \blacksquare, vector que codifica para el inmunoconjugado mfVIIasm (5 ratones); >, mezcla de los dos vectores que codifican para los inmunoconjugados mfVIIasm y G71-1 (6 ratones). Se realizaron inyecciones adicionales en los días 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15 y 17. Los puntos en cada curva son el promedio (\pm 20%) de las mediciones para todos los ratones en el grupo correspondiente.

La figura 13 son fotografías de tumores de melanoma de ratones SCID a los que se les inyectaron por vía intratumoral los vectores adenovirales que codifican para una mezcla de los inmunoconjugados mfVIIasm y G71-1 o un control de vector adenoviral vacío. El experimento se describe en la leyenda de la figura 12 anterior y en el ejemplo 3. Se diseccionaron los tumores 2 días tras la última inyección y se fotografiaron. La escala completa en la parte superior de la figura es de 1 cm.

La figura 14 son fotografías que muestran la distribución de un vector adenoviral en el tumor y en el hígado tras la inyección intratumoral. Se inyectó el vector control que codifica para la proteína GFP pero no para un inmunoconjugado en 3 sitios de un tumor cutáneo de melanoma humano que crece en ratones SCID. La dosis de vector total fue de 6x10^{9} UI. Se diseccionaron el tumor y el hígado 40 h tras la inyección y se examinaron intactos bajo un microscopio de disección con óptica de fluorescencia. Se detectó la señal de GFP con 480 nm de excitación y 630 nm de emisión, y se detectó la señal de fondo con 577 nm de excitación y 630 nm de emisión. Panel A: GFP de tumor. Panel B: fondo de tumor. Panel C: GFP hepática. Panel D: fondo hepático. También se detectó una mancha fluorescente brillante similar a la del panel A en otros dos sitios de tumor, presumiblemente correspondientes a los sitios de inyección. Las fotografías están enfocadas a un nivel en los tejidos. Sin embargo, también pudo detectarse la mancha de GFP enfocando por encima y por debajo de ese nivel, lo que sugiere que las células tumorales adyacentes a la trayectoria atravesada por la aguja de inyección son las únicas células infectadas por el vector.

La figura 15 muestra secciones hepáticas de ratones SCID a los que se les inyectó por vía intravenosa o intratumoral los vectores adenovirales. El experimento intravenoso se describe en el ejemplo 2, y el experimento intratumoral se describe en el ejemplo 3. A los paneles en la izquierda se les inyectó el vector control y a los paneles a la derecha se les inyectó una mezcla de los dos vectores que codifican para los inmunoconjugados mfVIIasm y G71-1. Se diseccionaron los hígados 2 días tras la última inyección, se fijaron en formaldehído y se incrustaron en parafina. Se tiñeron las secciones con hematoxilina y eosina y se fotografiaron a un aumento de 100X.

La figura 16 es un gráfico de líneas que muestra el efecto de inyecciones intravenosas en ratones inmunocompetentes del vector adenoviral que codifica para el inmunoconjugado mfVIIasm sobre el crecimiento de un melanoma cutáneo de ratón. A los ratones C57BL/6 se les inyectó por vía subcutánea la línea de melanoma de ratón B16F10, y cuando había crecido un tumor cutáneo hasta el tamaño indicado en el día 0, se le inyectó al tumor 3x10^{10} PI del vector que codifica para el inmunoconjugado mfVIIasm. El dominio Fc del inmunoconugado se derivó de una inmunoglobulina IgG1 de ratón. Se le inyectó de nuevo al tumor en el día 5 1,5x10^{10} PI.

Descripción detallada de la invención

La terapia de inmunoconjugado antivasculatura se basa en la observación de que la vasculatura de mamíferos adultos normales está generalmente en un estado quiescente (excepto para ciertos procesos tales como el ciclo reproductor femenino y la curación de heridas), al contrario que la neovasculatura que se forma en ciertos estados patológicos tales como un tumor en crecimiento que está en un estado activo de angiogénesis. Por tanto, cualquier diferencia molecular entre células endoteliales vasculares quiescentes o en proliferación sirve como diana para la vasculatura patológica.

Normalmente, se activa un cambio desde un estado quiescente hasta un estado angiogénico en el tejido vascular patológico tal como el observado en el cáncer mediante el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), que se secreta por células tumorales y se une con alta afinidad y especificidad a receptores de VEGF en células endoteliales vasculares. Otra respuesta activada por la unión de VEGF a receptores en células endoteliales vasculares es la expresión de factor tisular, un receptor transmembrana que se une al factor plasmático VII/VIIa para iniciar la coagulación sanguínea. Debido a que sólo las células endoteliales vasculares que presentan VEGF unido expresan factor tisular, una diana supuesta para la vasculatura del tumor es el factor tisular expresado en células endoteliales que debe unirse al factor VII/VIIa que circula en la sangre.

Esta invención se basa en el hallazgo de que los inmunoconjugados de la invención median una respuesta citolítica frente a células seleccionadas como objetivo por las células citolíticas naturales (NK) y las rutas del complemento del sistema inmunitario (Wang, B., et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 1627-1632). Dado que la unión entre el factor tisular de receptor de la superficie celular expresado en la superficie interna de vasos sanguíneos en crecimiento, pero no en vasos sanguíneos estables presentes en tejidos normales, y su factor VII de ligando natural muestra alta especificidad y afinidad (Hu, Z., et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 8161-8166), la invención proporciona un nuevo protocolo de inmunoterapia para el tratamiento de enfermedades asociadas con la neovascularización. La invención también proporciona una eficacia potenciada para tratamientos del cáncer debido a que el factor tisular también se expresa por muchos tipos de células tumorales (Callander, N.S., et al. (1992) Cancer, 70, 1194-1201).

Sin embargo, debido a que la unión de un inmunoconjugado de factor VII al factor tisular podría provocar coagulación intravascular diseminada, se utilizan en la invención mutantes del factor VII que inhiben la coagulación sin afectar a su afinidad por el factor tisular. Estos inmunoconjugados que se unen al factor tisular pero que no inician la coagulación sanguínea compiten con el factor VII/VIIa endógeno por la unión al factor tisular. Esta competición favorece fuertemente al inmunoconjugado (Hu, et al., mencionado anteriormente) debido a que contiene dos dominios de direccionamiento del factor VII (figura 1), proporcionando un efecto de avidez que falta en la molécula de factor VII endógena monomérica. El sitio activo del factor VII humano se muta mediante mutagénesis dirigida al sitio, sustituyendo alanina por Lys 341 y/o por Ser 344, con el fin de bloquear la actividad proteolítica que inicia el proceso de coagulación sanguínea cuando el factor VII se une al factor tisular. Debido a que tanto los dominios de direccionamiento como efector pueden derivarse de fuentes humanas, se minimizan las respuestas de rechazo inmunitario significativas en pacientes humanos.

En la práctica generalizada de la invención, se construyen inmunoconjugados tales como los expuestos en la figura 1 como un dímero de proteína que comprende dos cadenas, presentando cada una un dominio efector conjugado con un dominio de direccionamiento. Pueden utilizarse varios tipos de dominio efector, siempre que estos muestren citotoxicidad tras la unión del inmunoconjugado a su diana. Muchas proteínas de inmunoconjugado típicas de la invención presentan, como dominio efector, la región Fc de una inmunoglobulina IgG1. Tal como se utiliza en la presente memoria, éste incluye variantes y versiones truncadas que muestran la misma función biológica que la región Fc. El dominio efector está conjugado con un dominio de direccionamiento que comprende una forma mutante de factor VII que se une al factor tisular pero que no inicia la coagulación sanguínea tal como se describió anteriormente.

Las proteínas de inmunoconjugado de la invención se administran a un paciente que presenta una enfermedad asociada con la neovascularización tal como cáncer, artritis reumatoide, la forma exudativa ("húmeda") de degeneración macular o aterosclerosis. La administración puede ser local o sistémica, dependiendo del tipo de estado patológico implicado en la terapia. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "paciente" incluye tanto seres humanos como otras especies; la invención presenta así tanto aplicaciones médicas como veterinarias. En composiciones y tratamientos veterinarios, se construyen inmunoconjugados que utilizan dominios de direccionamiento y efector derivados de las especies correspondientes.

La administración puede ser mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica tal como, por ejemplo, inyección intravenosa, intramuscular, intratumoral, subcutánea, intrasinovial, intraocular, intraplaca o intradérmica del inmunoconjugado purificado o de un vector adenoviral de replicación deficiente, u otros vectores virales que portan un ADNc que codifica para una forma secretada del inmunoconjugado. Otras vías de administración pueden ser administración parenteral de líquidos y similares. En las formas de realización preferidas, el paciente se trata mediante inyección intravenosa o intratumoral, o inyección en otros sitios, de una o más proteínas de inmunoconjugado, o mediante inyección intravenosa o intratumoral, o inyección en otros sitios, de uno o más vectores de expresión que portan un ADNc que codifica para una forma secretada de uno o más tipos de proteínas de inmunoconjugado. En algunas formas de realización, el paciente se trata mediante inyección intravenosa o intratumoral de una cantidad eficaz de uno o más vectores adenovirales de replicación deficiente, o uno o más vectores adenoasociados que portan un ADNc que codifica para una forma secretada de uno o más tipos de proteínas de inmunoconjugado. Se ilustra un procedimiento que utiliza un vector adenoviral de replicación deficiente a continuación en la presente memoria. Muchas formas de realización típicas implican inyecciones intratumorales y/o intramusculares de cantidades eficaces de un vector que codifica para una forma secretada de un inmunoconjugado. Cuando se utilizan vectores para cáncer, la inyección intratumoral del vector proporciona una ventaja de seguridad importante sobre la inyección intravenosa, debido a que el vector infecta predominantemente las células del tumor inyectado.

Las administraciones que implican inyecciones de proteínas de inmunoconjugado utilizan composiciones en las que la proteína de inmunoconjugado, o una combinación de proteínas, se dispersa o solubiliza en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunos casos, se sintetizan inmunoconjugados en células S2 de Drosophila transfectadas con el vector de expresión pMK33/higromicina, o en células de ovario de hámster chino (CHO) transfectadas con el vector de expresión pcDNA3.1, o en un sistema de expresión de baculovirus, portando cada vector un ADNc que codifica para una forma secretada del inmunoconjugado.

La cantidad de inmunoconjugado necesaria para llevar a cabo el tratamiento terapéutico no es fija per se, y depende necesariamente de la concentración de componentes en la composición administrada junto con un vehículo farmacéutico, compuestos adyuvantes en la composición administrada que potencian la respuesta del sistema inmunitario ilustrados de modo más completo a continuación y de la edad, peso y estado clínico del paciente que va a tratarse. Las composiciones preferidas administran inmunoconjugado(s) en cantidades eficaces sin producir toxicidad inaceptable para el paciente. Las composiciones farmacéuticas o formulaciones de la invención también pueden incluir otros vehículos, adyuvantes, estabilizadores, conservantes, agentes de dispersión y otros agentes convencionales en la técnica que se consideran en el tipo de formulación en cuestión.

Tal como se aplica en el cáncer, la invención utiliza inmunoconjugados que presentan un dominio de direccionamiento que selecciona específicamente como diana células tumorales humanas o células endoteliales de la vasculatura del tumor o ambas, y un dominio efector que activa una respuesta inmunitaria citolítica o efecto citotóxico frente a las células seleccionadas como diana. Tal como se describió anteriormente, los inmunoconjugados que presentan, como dominio efector, la región Fc de la inmunoglobulina IgG1, incluyendo la bisagra, conjugado con un factor VII humano mutante que no inicia la coagulación sanguínea, son particularmente eficaces en muchos tratamientos del cáncer debido a que seleccionan como diana factor tisular expresado tanto en células tumorales como de la vasculatura del tumor. En algunas formas de realización, los efectos terapéuticos pueden potenciarse adicionalmente administrando al paciente otra clase de inmunoconjugados que seleccionan selectivamente como diana el tumor, tales como inmunoconjugados que presentan, como dominio de direccionamiento, un fragmento de anticuerpo scFv o V_{H} anti-célula tumoral humana aislado seleccionando una biblioteca de fagos de fusión de scFv o V_{H}, derivada de linfocitos de sangre periférica de pacientes con cáncer, frente a las células tumorales descritas previamente (Cai, X., y Garen, A. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 9261-9266). Combinaciones de inmunoconjugados, administrados simultánea o secuencialmente tal como se describió anteriormente, son particularmente ventajosas cuando se observa sinergia que potencia la citólisis de las células seleccionadas como diana.

En tratamientos del cáncer, se usan inmunoconjugados antitumorales para tratar una variedad de cánceres, particularmente tumores sólidos primarios o metastásicos, incluyendo cáncer de melanoma, renal, de próstata, de mama, de ovarios, cerebral, neuroblastoma, de cabeza y cuello, pancreático, de vejiga y pulmonar. Los inmunoconjugados pueden utilizarse para seleccionar como diana la vasculatura del tumor, particularmente células endoteliales vasculares y/o células tumorales. La vasculatura del tumor ofrece varias ventajas para la inmunoterapia, tal como sigue. (i) Algunas de las dianas vasculares, incluyendo el factor tisular, deben ser iguales para todos los tumores. (ii) Los inmunoconjugados dirigidos a la vasculatura no tienen que infiltrar una masa tumoral con el fin de alcanzar sus dianas. (iii) El direccionamiento a la vasculatura del tumor debe generar una respuesta terapéutica amplificada, debido a que cada vaso sanguíneo nutre numerosas células tumorales cuya viabilidad depende de la integridad funcional del vaso. (iv) No es probable que la vasculatura desarrolle resistencia a un inmunoconjugado, debido a que requeriría modificación de la capa de endotelio completa que reviste un vaso. A diferencia de procedimientos antiangiogénicos descritos previamente que inhiben el nuevo crecimiento vascular, los inmunoconjugados de la invención provocan una respuesta citolítica frente a la neovasculatura.

Los inmunoconjugados de la invención también pueden ser eficaces para tratar pacientes con artritis reumatoide, la forma exudativa ("húmeda") de degeneración macular, aterosclerosis y otras enfermedades asociadas con la neovascularización. La administración de un inmunoconjugado dirigido al factor tisular mediante un factor VII humano mutado, que está conjugado con el dominio Fc de una inmunoglobulina IgG1, puede generar una respuesta inmunitaria citolítica frente a las células endoteliales vasculares que invaden el sinovio en la artritis reumatoide y que expresan factor tisular. Asimismo, los inmunoconjugados del factor VII también pueden ser eficaces para tratar la forma exudativa (húmeda) de degeneración macular debido a la neovascularización extensa observada en ese estado patológico. Los inmunoconjugados de la invención también pueden ser eficaces para el tratamiento de aterosclerosis generando una respuesta inmunitaria citolítica frente a células que expresan factor tisular en placas.

En resumen, un programa de inmunoterapia global según la invención implica la construcción de inmunoconjugados que contienen, como dominio de direccionamiento, el factor VII con un sitio activo mutado, que se une con alta avidez y especificidad al factor tisular expresado en células endoteliales neovasculares y también en células tumorales sin provocar coagulación sanguínea. Los inmunoconjugados que contienen como dominio efector la región Fc de una inmunoglobulina IgG1 median la lisis de células seleccionadas como diana por células NK y el complemento, dando como resultado la destrucción de la neovasculatura. Una ventaja significativa de la invención es el hecho de que los inmunoconjugados que contienen dos dominios de direccionamiento de factor VII, al contrario que moléculas monoméricas de factor VII endógenas, muestran una unión significativamente superior a la del factor VII exógeno a células que expresan el factor tisular, compitiendo de manera satisfactoria en presencia de ligando natural en exceso. El ejemplo 2 a continuación ilustra un inmunoconjugado que compitió de manera satisfactoria en presencia de un exceso molar de por lo menos aproximadamente diez veces de ligando natural, pero la invención comprende otras formas de realización que muestran afinidad inferior o superior. La unión entre el factor VII endógeno al factor tisular es una de las reacciones más específicas y fuertes conocidas, con una K_{d} en el intervalo picomolar. No obstante, esta invención mejora significativamente la unión normal del factor VII al factor tisular como resultado del efecto de avidez de presentar dos secuencias de factor VII en una molécula de inmunoconjugado. Este efecto de avidez potencia el direccionamiento y la unión de los inmunoconjugados de la invención, de modo que compiten eficazmente con el factor VII endógeno y la unión persiste durante más tiempo, de modo que la respuesta inmunitaria provocada se maximiza. La respuesta inmunitaria puede maximizarse adicionalmente administrando a un paciente, como terapia complementaria, otro inmunoconjugado que presenta un dominio efector, que es la región Fc de una inmunoglobulina IgG1, conjugado con un dominio de direccionamiento que es un fragmento de anticuerpo scFv o V_{H} que se une a la neovasculatura y/o, en el caso de cáncer, al tipo de célula tumoral del paciente.

Ejemplos

Los ejemplos presentados en la presente memoria ilustran y explican adicionalmente la presente invención y no deben considerarse como limitativos en ningún aspecto. Algunos de los procedimientos usados para generar y caracterizar inmunoconjugados de la invención y anticuerpos monoclonales componentes se han descrito en Cai, X., y Garen, A. (1995) Proc Natl. Acad. Sci. USA 92, 6537-6541, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 6280-6285 y la referencia de 1997 mencionada anteriormente; en el documento PCT/IB96/01032 de la Yale University y Garen y Cai, publicado el 23 de enero de 1997 como documento WO 97/02479, en trámite actualmente en los EE.UU. como solicitud con número de serie 08/983.607 presentada el 27/04/98, admitida el 3/3/00; en Wang, et al., mencionado anteriormente; y en Hu, Z., et al., mencionado anteriormente.

Ejemplo 1

En este ejemplo, se sintetizan y se someten a prueba inmunoconjugados que contienen un dominio de direccionamiento de Fv de cadena sencilla (scFv) humano conjugado con el dominio efector Fc de IgG1 humana. Se aislaron originalmente los dominios de direccionamiento de scFv como clones específicos de melanoma a partir de una biblioteca de fagos de fusión de scFv, derivados del repertorio de anticuerpos de un paciente con melanoma vacunado (descrito con más detalle en las referencias de Cai y Garen mencionadas anteriormente). Los inmunoconjugados purificados mostraron una especificidad de unión similar a la de los clones de fagos de fusión: se produjo unión a células de melanoma humano pero no a melanocitos humanos ni a otros tipos varios de células normales y células
tumorales.

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Materiales y métodos

Cultivos celulares. Se hicieron crecer las líneas de melanoma humano permanentes A2058 (Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville, MD) y TF2 en DMEM + FCS al 10%. Se extruyeron cultivos primarios de células endoteliales microvasculares humanas y células de fibroblastos del prepucio de recién nacidos y se cultivaron en medio RPMI complementado con FBS al 8% y suero de periparto humano al 2%; se complementaron adicionalmente las células endoteliales con 3-isobutil-1-metilxanteno (IBMX) 33 mM y dibutiril-AMPc 0,5 mM. Se prepararon cultivos primarios de melanocitos humanos a partir de prepucio de recién nacidos por el Skin Disease Research Center en la Yale University School of Medicine. Se hicieron crecer las células de riñón humano transformadas 293-EBNA (Invitrogen) y las células de ovario de hámster chino (CHO) en RPMI + FCS al 10%. (v) Se hicieron crecer células de Drosophila (Schneider S2) a 25ºC en medio Ex-cell 301 (JRH biosciences) + FBS al 10%. Se aislaron las células NK en reposo de donantes normales mediante leucoforesis e inmunoselección y se utilizaron en el plazo de 18 h tras el aislamiento; la mayoría de las células (>97%) eran CD3-, CD56+ y CD16+.

Preparación de los inmunoconjugados. Los procedimientos implicaron la transfección del vector de expresión pcDNA3.1 (Invitrogen) en células CHO, o el vector de expresión pMK33/pMtHy en células de Drosophila; cada vector portaba un ADNc que codificaba para un inmunoconjugado secretado (figura 1). Se sintetizaron los ADNc para los dominios de direccionamiento de scFv a partir del fago de fusión correspondiente (1) usando cebadores de PCR que contenían sitios SacI o BamHI tal como sigue: a) GTCGAGCAGAGCTCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCT
GAGGTGAGGTGAAGAAGCC (SEC ID nº: 1); b) ACGTTCAGGGGATCCACCTAGGACGGTCAGCTTGGTCCC (SEC ID nº: 2). Se sintetizó el dominio efector Fc humano a partir de una biblioteca de ADNc derivada de linfocitos de sangre periférica humana, usando PCR con cebadores que contenían sitios BamHI y SalI, tal como sigue: a) ACCTTGCAGGATCCGCAAGACCCAAATCTTGTGACAAAACTCAC (SEC ID nº: 3); b) GATCACGTGTC
GACTTATCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTTCTG (SEC ID nº: 4). Se sintetizó el ADNc para la secuencia líder de IgG1 hibridando dos oligonucleótidos complementarios que contenían extremos EcoRI y SacI,
tal como sigue: a) AATTCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTTGCTGCATTAAGAGGTGTCCAGT
CCGAGCT (SEC ID nº: 5); b) CGGACTGGACACCTGTTAATGCAGCAACAAGAAAAGCCAGCTCAGCCCAAA
CTCATG (SEC ID nº: 6).

Se ligaron en primer lugar estos tres ADNc que codificaban para un inmunoconjugado secretado en un vector de clonación para la secuenciación y luego en los vectores de expresión pcDNA3.1 y pMK33/pMtHy para la transfección en células CHO o S2 de Drosophila, respectivamente. El procedimiento de transfección para las células CHO implicó el crecimiento de las células en RPMI + FCS al 10% y la transfección con 5 \mug de un vector de expresión usando SuperfectTM (Qiagen). Se seleccionaron transfectantes estables en RPMI + FCS al 10% + G418 1 mg/ml. Para la expresión de proteínas, se adaptaron en primer lugar células CHO transfectadas para crecer en CHO medio libre de suero (Sigma) y luego se hicieron crecer durante 3 días como cultivo en suspensión (2 x 10^{5} células/ml) en el medio libre de suero. El procedimiento de transfección para células S2 de Drosophila implicó hacer crecer las células en medio Ex-cell + FBS al 10% y transfectar con 10 \mug de un vector de expresión usando LipofectinTM (Gibco-BRL). Se seleccionaron transfectantes estables en medio Ex-cell + FBS al 10% + higromicina 300 \mug/ml, y se adaptaron para su crecimiento como un cultivo en suspensión en medio Ex-cell libre de suero. Se indujo la expresión del inmunoconjugado codificado en el cultivo en suspensión mediante la adición de sulfato de cobre 500 \muM.

Se purificaron los inmunoconjugados secretados por las células S2 de Drosophila o CHO transfectadas del medio de cultivo mediante cromatografía de afinidad sobre una matriz de proteína A (Pierce).

Especificidad de unión de los inmunoconjugados medida mediante citometría de flujo activada por fluorescencia (FACS). Se recogieron células de melanoma y células control en medio de disociación no enzimático (Sigma), se lavaron con PBS/BSA + azida sódica al 0,1% y se incubaron en PBS/BSA con inmunoconjugado añadido (1 \mug/ml) o en PBS/BSA sin inmunoconjugado como control. Se lavaron las células con PBS/BSA, se incubaron 30 min. a 4ºC con anticadena \gamma de Fc humano marcado con fluoresceína (Vector) y se analizaron en un instrumento FACsort de Becton-Dickenson.

Inmunoprecipitación de un extracto celular de melanoma con un inmunoconjugado. Se suspendió una mezcla de aproximadamente 1x10^{7} células de la línea de melanoma humano A2058 en una disolución que contenía immunoconjugado 10 \mug/ml, BSA al 1% y azida de sodio al 0,05% en PBS y se incubó durante 30 minutos en hielo. Se lavaron las células dos veces con PBS y se lisaron en una disolución que contenía NP-40 al 1%, inmunoconjugado 1 \mug/ml y PMSF 0,2 mM en PBS durante 20 minutos en hielo. Se centrifugó el lisado a 13.000 RPM en microcentrífuga durante 5 min. y se recuperaron los sobrenadantes y se incubaron con perlas de proteína G durante la noche en un aparato rotador. Se recogieron las perlas, se lavaron dos veces con una disolución que contenía NP-40 al 1% en PBS y una vez con PBS, y se recogieron las perlas, se sometieron a ebullición en tampón de carga de PAGE y se analizaron mediante PAGE.

Espectrometría de masas por ionización/desorción mediante láser asistida por matriz (MALDI-MS) e identificación de proteínas por MS en tándem/cromatografía de líquidos (LC/MS/MS). Se extrajo del gel una banda de proteínas teñida con azul de Coomassie y se digirió con tripsina tal como se describe en http://info.med.yale.edu/wmkeck/
geldig3.htm. Se analizó una muestra del digesto tríptico mediante MALDI-MS en un aparato Micromass TofSpec SE. Para lograr el alto nivel de precisión necesario para buscar las masas peptídicas, se utilizó como calibrador interno bradiquinina 100 fmol que tenía una masa monoisotópica protonada de 1060,57, y ACTH/CLIP que tenía una masa monoisotópica protonada de 2465,2. Se buscaron las masas monoisotópicas resultantes de los péptidos trípticos en la base de datos OWL con el programa ProFound usando una tolerancia de masa de 0,2 dalton y en la base de datos EMBL/no-redundante con el programa PeptideSearch usando una tolerancia de masa del 0,015%. Otros criterios importantes usados en la búsqueda fueron un intervalo de masas que se extendía desde 140-560 Kda, un máximo de 1 escisión que falta y sin limitación con respecto a la taxonomía. Se llevaron a cabo estudios de química de proteínas y espectrometría de masas en la W.M. Keck Foundation & HHMI Biopolymer Laboratory en la Yale University. Puede encontrarse información adicional en http://info.med.yale.edu/wmkekc/.

También se analizó una muestra de la banda de proteína digerida con tripsina usada para el análisis de MALDI-MS en un espectrómetro de masas de trampa iónica LCQ. Se realizó una búsqueda Sequest de los datos de MS/MS, usando un algoritmo de correlación de masas en tándem con una tolerancia de masa de 2,0 dalton, para determinar si existen similitudes significativas entre péptidos del digesto tríptico y los espectros teóricos reconstruidos para una proteína en la base de datos de NCBI nr. Puede obtenerse información adicional sobre este procedimiento en http://info.med.yale.edu/wmkeck/prochem.htm#ms/mspi.

Ensayos para determinar la citólisis dependiente de inmunoconjugado de células de melanoma humano por células NK y el complemento. Se utilizó el procedimiento de retención de Calcein-AM para ambos ensayos. Las células diana, o bien líneas de melanoma humano o bien células de fibroblastos humanos primarios, se aislaron de frascos de cultivo en un medio de disociación no enzimático (Sigma) y se añadieron a placas de 96 pocillos (2 x 10^{4} células/pocillo). Se lavaron las células diana adherentes una vez con PBS, y después de eso se incubaron durante 20 minutos a 37ºC en medio de cultivo libre de suero (GIBCO-BRL) que contenía un inmunoconjugado (1 \mug/ml) o sin inmunoconjugado como control. Entonces se marcaron las células diana con Calcein-AM 7 \muM (Molecular Probes Inc., Eugene, OR) en medio libre de suero durante 40 min. a 37ºC. Calcein-AM es un colorante fluorescente que entra en las células, en las que se altera enzimáticamente y permanece intracelular hasta que las células se lisan. Para los ensayos citolíticos que implican células NK, se incubaron las células diana marcadas 3-4 h a 37ºC con células NK humanas usando las razones indicadas de células NK con respecto a células diana. Para los ensayos citolíticos que implican el complemento, se incubaron las células diana marcadas 1 h a 37ºC con suero humano o componentes del complemento de conejo purificados (Cedarlane Laboratories, Ontario, Canadá). Tras la incubación con células NK o el complemento, se lavaron las células diana dos veces con PBS, y se midió la fluorescencia en las células adherentes restantes (fluorescencia residual) con un lector de placas. Se determinó la máxima citólisis alcanzable de las células diana midiendo la fluorescencia residual de las células diana tras el tratamiento con tampón de lisis (borato de sodio 50 mM, Triton X-100 al 0,1%, pH 9,0) durante 3 h a 37ºC. Se determinó la fluorescencia residual máxima midiendo la fluorescencia de células diana adherentes que no se expusieron a células NK o el complemento. Se calculó el % de citólisis para cada muestra de células diana tal como sigue: (fluorescencia residual de las células diana de muestra menos fluorescencia residual de las células diana lisadas)/(fluorescencia residual máxima de las células diana menos fluorescencia residual de las células diana lisadas).

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Resultados

Síntesis y caracterización de los inmunoconjugados antimelanoma. El inmunoconjugado codificó para una secuencia líder de IgG1 humana para la secreción, para un dominio scFv humano para seleccionar como diana células de melanoma y un dominio efector Fc de IgG1 humana (figura 1). Se expresaron las moléculas de inmunoconjugado en células S2 de Drosophila y CHO transfectadas y se purificaron del medio de cultivo como moléculas bicatenarias unidas por puentes disulfuro en la región de bisagra del dominio Fc (figura 1). Se sintetizaron dos inmunoconjugados, que contenían cada uno un dominio de direccionamiento de scFV derivado del clon de fago de fusión E26-1 o G71-1. Se sometieron a prueba las especificidades de unión de los inmunoconjugados E26-1 y G71-1 mediante citometría de flujo (FACS) usando dos líneas de melanoma humano; los controles fueron cultivos primarios de células endoteliales vasculares umbilicales y microvasculares, fibroblastos y melanocitos humanos normales, y la línea de riñón humano 293-EBNA. Los resultados mostraron que los inmunoconjugados se unen fuertemente a las líneas celulares de melanoma pero no se unen a los controles, lo que está de acuerdo con los resultados obtenidos con los clones de fago de fusión E26-1 y G71-1. La unión a células de melanoma se produjo cuando se recogieron las células del frasco de cultivo usando un medio de disociación celular no enzimático (Sigma), pero no cuando el medio de disociación contenía tripsina o cuando las células disociadas se trataron posteriormente con tripsina. Este hallazgo indicó que el/los antígeno(s) de melanoma relacionado(s) para los inmunoconjugados se ubican en la superficie de células de melanoma. El/los antígeno(s) parecen ser excepcionalmente sensibles a la tripsina, ya que la misma exposición a tripsina no afectó a la unión a células de melanoma de anticuerpos frente a las moléculas de la superficie celular ICAM-1, CMH de clase I y factor tisular.

Identificación del antígeno de melanoma relacionado para los inmunoconjugados. Se equilibraron células cultivadas de la línea de melanoma humano A2058 con los inmunoconjugados G71-1 o E26-1 y se lisaron las células con detergente. Se recogió el complejo de inmunoconjugado-antígeno en el lisado sobre perlas de proteína G y se analizó mediante PAGE. Se detectó una banda de proteína con un peso molecular aparente de 250 kda en las células de melanoma pero no en el control. El análisis de un digesto tríptico de la banda de proteína mediante el procedimiento de MALDI-MS identificó 75 masas peptídicas que no estaban presentes en un digesto de un corte de gel control. Una búsqueda de bases de datos de secuencias de proteínas mediante ProFound produjo 50 masas peptídicas que se correspondían con las masas peptídicas en la proteína núcleo MCSP, comprendiendo el 26% de la secuencia de proteína completa. La puntuación de probabilidad de ProFound para esta identificación fue de 1,0, y la puntuación próxima más cercana fue de 2,2E-61. Una búsqueda mediante Peptide Search hizo coincidir 45 péptidos a la proteína núcleo MCSP, representando 38 péptidos la coincidencia próxima más cercana.

También se analizó el digesto tríptico de la proteína de 250 kda mediante el procedimiento de LC/MS/MS (Stone, K.L., et al. (1998) Electrophoresis 19, 1046-1052). Una búsqueda Sequest de los datos de MS/MS del digesto tríptico mostró una similitud significativa entre los espectros de MS/MS para dos o más péptidos y los espectros de MS/MS teóricos reconstruidos para dos o más péptidos de la proteína núcleo MCSP en la base de datos de NCBI nr.

Los resultados de ambos análisis de espectroscopia de masas indican que la proteína de melanoma inmunoprecipitada por los inmunoconjugados G71-1 y E26-1 correspondía a la proteína núcleo MCSP.

Citólisis dependiente de inmunoconjugado de células de melanoma mediada por células NK y el complemento. Una de las rutas citolíticas del sistema inmunitario implica a células NK que pueden unirse directamente a células diana, provocando la lisis independiente de anticuerpos de las células diana. Las células NK también se unen al dominio efector Fc de un anticuerpo, dando como resultado la lisis dependiente de anticuerpos de células que se unen al dominio de direccionamiento del anticuerpo. Esta ruta citolítica mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) también debe provocar la lisis de células que se unen al dominio de direccionamiento de inmunoconjugados que contienen un dominio efector Fc. Para someter a prueba para detectar una respuesta ADCC dependiente de los inmunoconjugados E26-1 y G71-1, se marcaron células de melanoma y células control de fibroblastos con el colorante fluorescente Calcein-AM, y se incubaron las células marcadas con células NK humanas solas o junto con un inmunoconjugado. Se sometió a ensayo la citólisis midiendo la cantidad de colorante fluorescente retenido en las células que permanecieron intactas. Los resultados para E26-1 (figura 2) muestran que tras la incubación con el inmunoconjugado y células NK, el porcentaje de células de melanoma lisadas aumentó por encima del nivel basal que se produce sin el inmunoconjugado, alcanzando casi el 100% de lisis a una razón 20/1 de células NK con respecto a células de melanoma. Al contrario que en la lisis eficaz de células de melanoma, las células de fibroblastos no mostraron un aumento significativo en la lisis celular tras su incubación con el inmunoconjugado y células NK. Se obtuvieron resultados similares con el inmunoconjugado G71-1.

La sensibilidad de las células diana a la lisis por células NK aumenta mediante la expresión en la superficie de las células diana de moléculas de adhesión tales como ICAM, y se reduce mediante la expresión de moléculas del CMH de clase I (Zami, L., et al. (1995) Cell. Immunol. 164, 100-104 y Storkus, W.J., et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 2361-2364). Para determinar si las diferencias en la expresión de estas moléculas podrían contribuir a las diferencias en las sensibilidades de células de melanoma y células de fibroblastos en los ensayos de ADCC, se midió la expresión de moléculas de ICAM-1 y del CMH de clase I por células de melanoma y de fibroblastos mediante FACS. La expresión de ambas moléculas era similar en los dos tipos de células, indicando que la lisis específica de células de melanoma por células NK depende de la unión de los inmunoconjugados a los antígenos relacionados expresados en células de melanoma.

Otra ruta citolítica del sistema inmunitario implica la cascada del complemento, que se activa cuando la molécula C1q reacciona con la región Fc de anticuerpos unidos a una célula diana (Bruggemann M., et al. (1987) J. Exp. Med. 166, 1351-1361). Para someter a prueba para detectar una respuesta citolítica mediada por el complemento frente a células de melanoma, dependiente de los inmunoconjugados E26-1 y G71-1, se utilizó el mismo procedimiento de ensayo utilizado para la respuesta citolítica mediada por NK notificado anteriormente con un cambio, concretamente que se sustituyó el suero humano o el suero de conejo, que contienen los componentes de la cascada del complemento, por células NK. Los resultados (figura 3 y tabla 1) muestran que tras la incubación con los inmunoconjugados y o bien suero humano o bien suero de conejo, hubo un aumento en la fracción de células de melanoma lisadas de desde el 4% hasta casi el 100%. Al contrario que en la lisis eficaz de células de melanoma, las células de fibroblastos mostraron un pequeño aumento en la fracción de células lisadas tras su incubación con los inmunoconjugados y suero humano, y no mostraron un aumento significativo tras su incubación con los inmunoconjugados y el suero de conejo.

TABLA 1 Inmunoconjugado y reactivos del complemento usados para los ensayos de la figura 3

1

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Discusión

Para el presente estudio, se utilizaron las moléculas de scFv de dos de los clones como dominios de direccionamiento para construir inmunoconjugados que contienen un dominio efector Fc de IgG1 humana (figura 1). Se identificó la proteína inmunoprecipitada a partir de células de melanoma humano por ambos inmunoconjugados mediante análisis espectroscópicos de masas como la proteína núcleo de un proteoglicano de sulfato de condroitina asociado a melanoma (MCSP) (Bumol, T.F. & Reisfeld, R.A. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 1245-1249 y Bumol, T., et al. (1984) J. Biol. Chem. 259, 12733-12741). Se identificó por primera vez la molécula MCSP como el antígeno relacionado reconocido por el AcM 9.2.27, y parece ser el antígeno relacionado para otros varios AcM (Reisfeld, R.A. & Cheresh, D.A. (1987) Adv. Immunol. 40, 323-377; Wilson, B.S., et al. (1981) Int. J. Cancer 28, 293-300; Hellstrøm, I., et al. (1983) J. Immunol. 130, 1467-1472). Se han aislado varios clones de fago de fusión de scFv que se unen al antígeno de melanoma HMW-MAA, que probablemente es el mismo que MCSP, a partir de una biblioteca de scFv humano seleccionando frente a HMW-MAA purificado (Desai, S.A., et al. (1998) Cancer Res. 58, 2417-2425). La molécula de MCSP se expresa predominantemente en la superficie de la mayoría de las células de melanoma humano, y también en células endoteliales capilares de tumores gliales. El hallazgo de que MCSP es el antígeno relacionado para por lo menos dos de los clones específicos de melanoma aislados a partir de una biblioteca de fagos de fusión de scFv de un paciente con melanoma seleccionando frente a células de melanoma, sugiere que MCSP es un antígeno de melanoma dominante in vivo.

Como prueba inicial del potencial terapéutico de los dos inmunoconjugados, se utilizó un ensayo citolítico in vitro que implicaba células diana marcadas con fluorescencia para determinar la capacidad de los inmunoconjugados para seleccionar como diana células de melanoma humano para su lisis por células NK y por el complemento. Ambos inmunoconjugados produjeron un aumento brusco en la actividad citolítica de células NK y el complemento frente a células de melanoma, dando como resultado la lisis prácticamente completa de la población de células de melanoma seleccionadas como diana y sólo un aumento menor o ninguno en la lisis de las células de fibroblastos usadas como control. También hubo un fondo significativo de citólisis independiente de inmunoconjugado de células de melanoma y células de fibroblastos por células NK y el complemento, lo que se espera para un ensayo alogénico en el que las células tumorales, las células NK y el complemento se aíslan a partir de individuos diferentes (Ciccone, E., et al. (1992) J. Exp. Med. 175, 709-718). Este fondo debe reducirse en un paciente con cáncer, porque todos estos componentes son autólogos.

Los resultados de las pruebas citolíticas in vitro proporcionan evidencia preliminar de que los inmunoconjugados podrían presentar un posible papel en protocolos de inmunoterapia con melanoma y otros cánceres para los que están disponibles dominios de direccionamiento de VH o scFv específicos de tumor. Un ensayo clínico de fase I limitado para la inmunoterapia de melanomas con el AcM de ratón 9.2.27, que se une a MCSP, mostró la ubicación específica del anticuerpo en los tumores sin evidencia de toxicidad asociada (Oldham, R.K., et al. (1984) J. Clin. Oncol. 2, 1235-1244). Los inmunoconjugados de scFv que se unen a MCSP deben ser más eficaces que un AcM de ratón para la inmunoterapia, porque el menor tamaño molecular debe mejorar la penetración en el tumor y la derivación humana de la molécula debe minimizar una respuesta de rechazo inmunitario. Los inmunoconjugados G71-1 y E26-1 se unen probablemente a diferentes epítopos de MCSP, tal como se sugiere por las diferencias principales en sus secuencias de V_{H} (véanse SEC ID nº: 11 y SEC ID nº: 12 y el siguiente ejemplo), y por tanto podrían administrarse juntos para potenciar su eficacia terapéutica.

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Ejemplo 2

Este ejemplo notifica que un tratamiento de inmunoterapia para el cáncer que selecciona como diana tanto la vasculatura del tumor como células tumorales ha mostrado resultados prometedores en un modelo de xenoinjerto de ratón inmunodeficiente combinado grave de melanoma humano. El procedimiento implicaba la administración sistemática a ratones SCID de dos inmunoconjugados, compuesto cada uno por un dominio de direccionamiento al tumor conjugado con una región de dominio efector Fc de una IgG1 humana. El dominio efector induce una respuesta inmunitaria citolítica frente a las células seleccionadas como diana por células citolíticas naturales (NK) y el complemento. Los inmunoconjugados se codifican como moléculas secretadas en un vector adenoviral de replicación incompetente.

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Materiales y métodos

Líneas celulares. Se derivaron las líneas celulares de melanoma LXSN, TF2 y LXSN/VEGF de la línea de melanoma humano YU-SIT1 mediante transfección y clonación mediadas por retrovirus. Se transfectó la línea LXSN con el retrovirus control y expresa un nivel bajo de TF. Se transfectó la línea TF2 con un retrovirus que codifica para ADNc de TF y expresa un nivel alto de TF. Se transfectó la línea LXSN/VEGF con un retrovirus que codifica para ADNc de VEGF y expresa un nivel alto de VEGF. Se adquirió la línea de riñón humano 293 de la Colección Americana de Cultivos Tipo.

Vector de plásmido. La construcción del vector de plásmido que codifica para el inmunoconjugado de scFv (G71-1) se describió en el ejemplo 1 (véase también SEC ID nº: 11). Para la construcción del vector que codifica para el inmunoconjugado de factor VII de ratón (mfVII), se amplificó el ADNc de mfVII mediante PCR a partir de una biblioteca de ADNc de hígado de ratón (Quick-Clone cDNA, Clonetech) usando el cebador en 5' ACGA-TCTTAAGCTTCCC
CACAGTCTCATCATGGTTCCA (SEC ID nº: 7) y el cebador en 3' ACGGTAACGGATCCCAGTAGTGGGAGTCG
GAAAACCCC (SEC ID nº: 8). El ADNc de mfVII amplificado, que contiene las secuencias líder y codificante sin un codón de terminación, se clonó en los sitios HindIII y BamHI del vector pcDNA3.1 (+) (Invitrogen) en marco con un ADNc que codifica para el dominio Fc de IgG1 humana. Se amplificó el ADN del vector en células competentes HB101 (Life Technologies) y se secuenció. Se mutó el sitio activo del ADNc de mfVII sustituyendo un codón de alanina por lisina 341 (Dickinson, C.D., et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 14379-14384). El procedimiento de mutagénesis se realizó tal como se describe en el manual de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange (Stratagene). El cebador en 5' era GGTACCAAGGACGCCTGCGCGGGTGACAGCGGTGGCCCA (SEC ID nº: 9) y el cebador en 3' era TGGGCCACCGCTGTCACCCGCGCAG-GCGTCCTTGGTACC (SEC ID nº: 10). El ADNc de mfVII con la mutación del sitio activo se denomina mfVIIasm. Se transformó el plásmido que contiene el ADNc de mfVIIasm en células competentes HB101 y se seleccionaron colonias transformadas en agar 2XTY/carbenicilina. La secuencia del ADN de plásmido mostraba una sustitución de un codón de alanina (GCG) por el codón de lys 341 (AAG) en el ADN de mfVIIasm.

Síntesis de inmunoconjugados en células CHO. Los procedimientos para transfectar los ADNc de los inmunoconjugados en células CHO y aislar clones se describieron en el ejemplo 1. Se cultivaron las células CHO transfectadas en medio libre de suero de CHO (EX-CELL 301, JRH Biosciences); para la síntesis del inmunoconjugado mfVIIasm, se complementó el medio libre de suero de CHO con vitamina K1 (Sigma) hasta una concentración final de 1 \mug/ml. Se purificaron los inmunoconjugados mediante cromatografía de afinidad sobre perlas de proteína A (Pierce) y se concentraron y desalaron mediante centrifugación a través de un filtro Ultrafree-15 Biomax-50 (Millipore) y se ajustaron hasta Tris-HCl 10 mM pH 8,0. Se midieron las concentraciones de inmunoconjugado mediante el procedimiento de ensayo de proteínas de Bio-Rad.

Citometría de flujo activada por fluorescencia (FACS). Se recogieron las células de melanoma en disolución de disociación no enzimática (Sigma), se lavaron y se resuspendieron en TBS/BSA/Ca^{2+} (Tris-HCl 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, CaCl_{2} 20 mM, BSA al 1% y NaN_{3} al_{ }0,1%). Se añadió un inmunoconjugado (concentración final de 5 \mug/ml) y se incubaron las células durante 30 min. o bien a 37ºC para el inmunoconjugado mfVIIasm o bien en hielo para el inmunoconjugado G71-1; se incubaron las células control sin inmunoconjugado añadido. Tras la incubación, se lavaron las células con TBS/BSA, se incubaron 30 min. en hielo con cadena \gamma anti-Fc humano marcada con fluoresceína (Vector Laboratories) y se analizaron en un instrumento FACsort de Becton-Dickenson.

Vectores adenovirales. El sistema de vector adenoviral consiste en los vectores lanzadera pAdTrack-CMV y pShuttle-CMV, y el vector de estructura principal pAdEasy-1 (He, T.C., et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 2509-2514). Se aislaron los ADNc de los inmunoconjugados a partir de vectores de plásmido pcDNA3.1 mediante digestión con HindIII seguido por el fragmento Klenow para rellenar el extremo 3' con huecos y entonces se digirieron con Not1 para liberar el inserto de ADNc que se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa. Se digirieron en primer lugar los vectores lanzadera con Kpn1 seguido por el fragmento Klenow y entonces se digirieron con Not1 . Se ligaron los ADNc de los inmunoconjugados en los vectores lanzadera mediante incubación con ADN ligasa de T4 a 16ºC durante la noche y se transformaron los vectores lanzadera en células competentes HB101 mediante choque térmico. Se seleccionaron colonias transformadas sobre agar 2XTY/kanamicina y se extrajeron y purificaron los vectores lanzadera. Los ADN de pAdTrack-CMV y los vectores lanzadera purificados se digirieron con Pme1 a 37ºC durante 2 h. Se sometió a electroporación una mezcla de 500 ng de ADN de vector lanzadera y 100 ng de ADN de pAdEasy-1 en células competentes BJ5183 y se agitaron las células a 37ºC durante 15 min. y se sembraron en placas en agar LB/kanamicina. Se incubaron las placas a 37ºC durante la noche y se aislaron colonias transformadas. Se purificaron los ADN de plásmido a partir de minipreparaciones y se examinaron para seleccionar ADN adenoviral recombinante mediante electroforesis en geles de agarosa al 0,6%.

Se transfectaron los ADN adenovirales recombinantes que codifican para los inmunoconjugados en 1x10^{5} células 293, siguiendo el protocolo descrito anteriormente para transfectar células CHO. Se recogieron las células 7 días tras la transfección y se liberaron los adenovirus mediante 3 ciclos de congelación-descongelación y se amplificaron infectando células 293 en una placa de cultivo de 150 mm. Tras 2 días, se recogieron los adenovirus tal como se describió anteriormente y se amplificaron de nuevo infectando células 293 en 20 placas de cultivo. Se recogieron los adenovirus amplificados 2 días después y se purificaron mediante centrifugación en CsCl. Los rendimientos finales fueron habitualmente de 10^{13} partículas de virus tal como se estimó mediante la absorbancia a 260 nm; la conversión es 1 unidad de D.O. = 1x10^{12} partículas. Se dializaron los adenovirus purificados frente a PBS y se almacenaron a -80ºC.

Experimentos con ratones SCID. Los ratones SCID eran hembras de 4 a 5 semanas de edad de Taconic laboratories. Se les inyectó a los ratones por vía subcutánea en el flanco trasero derecho 5x10^{5} células de melanoma humano TF2 o LXSN. Después de que los tumores hubiesen crecido hasta un tamaño palpable por debajo de la superficie de la piel (\sim5 mm^{3}) o hasta un tamaño mayor por encima de la superficie de la piel (\sim50 mm^{3}), se les inyectó a los ratones por la vena de la cola el vector adenoviral que codifica para un inmunoconjugado, o como control el vector adenoviral que no codifica para un inmunoconjugado. Se midió la concentración de proteína de inmunoconjugado secretada a la sangre recogiendo aproximadamente 0,1 ml de sangre de un ojo en un tubo microcapilar recubierto con heparina y centrifugando la sangre para eliminar las células. Se diluyó el plasma sobrenadante con tampón bicarbonato de sodio pH 9,6 y se distribuyó en pocillos de placas de ensayo Pro-Bind (Falcon), y las placas se incubaron en primer lugar a 37ºC durante 2 h y luego a 4ºC durante la noche. Se bloquearon los pocillos con leche desnatada al 5% en PBS durante 30 min. y se lavaron 3 veces con PBS, y se añadió a los pocillos un anticuerpo anti-IgG humana marcado con peroxidasa diluido 1:2000 en leche desnadata al 5%. Se incubaron las placas durante 1 h a temperatura ambiente y se lavaron con PBS, y se añadió el sustrato de peroxidasa OPD y se midió la absorbancia a 490 nm en un lector de microplacas. El patrón de proteína era IgG humana (Sigma) purificada mediante cromatografía sobre perlas de proteína A.

Se midió el tamaño de un tumor que aparecía sobre la piel de un ratón SCID en dos dimensiones con un calibrador y se estimó el volumen tumoral mediante la fórmula (anchura)^{2} (longitud)/2. Al final de un experimento, se diseccionaron los ratones y se pesaron los tumores. Se examinaron los órganos para detectar evidencia morfológica de daño y se prepararon secciones en parafina para el examen histológico.

Inmunohistoquímica. Se incubaron secciones en parafina de los tumores y órganos en PBS+H_{2}O_{2} al 0,3% durante 30 min. y se bloquearon en tampón TBS/BSA durante 30 min. Se añadió a las secciones una disolución que contenía 10 \mug/ml del inmunoconjugado mfVIIasm en tampón TBS/BSA/Ca^{2+}, o como control el tampón sin el inmunoconjugado, y se incubaron a 37ºC durante 1 h. Tras lavar 3 veces en el mismo tampón, se incubaron las secciones a temperatura ambiente durante 1 h con anticuerpo anticadena \gamma humana marcado con fosfatasa alcalina, se tiñeron con BCIP/NBT que produce un color azul y se contratiñeron con verde de metilo.

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Resultados

Propiedades de los inmunoconjugados. Se sintetizaron los inmunoconjugados de scFv (G71-1) y del factor VII de ratón mutado (mfVIIasm) en células CHO y se purificaron del medio de cultivo mediante cromatografía de afinidad sobre perlas de proteína A. Un análisis anterior mediante SDS-PAGE mostró que el inmunoconjugado G71-1 está compuesto por dos cadenas idénticas, presumiblemente acopladas mediante puentes disulfuro entre las regiones de bisagra de los dominios Fc (ejemplo 1). Se obtuvo el mismo resultado con el inmunoconjugado mfVIIasm. (Véanse SEC ID nº: 11 y SEC ID nº: 12.). Debido a que el inmunoconjugado mfVIIasm presenta dos dominios de direccionamiento, en comparación con el único dominio de direccionamiento en la molécula de fVII endógena monomérica, puede unirse cooperativamente a dos moléculas de TF, dando como resultado una unión más fuerte que fVII endógeno a células que expresan TF. Un ensayo FACS competitivo mostró que el fVIIa humano compite en una base equimolar con el inmunoconjugado mfVIIasm por la unión a la mitad de los sitios accesibles en células de melanoma humano, probablemente debido a que sólo uno de los dominios de direccionamiento en la molécula de inmnoconjugado puede unirse a TF en estos sitios. La unión del inmunoconjugado mfVIIasm a los sitios restantes no pudo competir en presencia de un exceso de diez veces de fVIIa humano, lo que sugiere que ambos dominios de direccionamiento de la molécula de inmunoconjugado pueden unirse en estos sitios y proporcionar un efecto de avidez fuerte. Parece que aproximadamente sólo la mitad de las moléculas de TF en las células de melanoma están suficientemente cercanas a una segunda molécula de TF para formar un sitio de unión cooperativa para ambos dominios de direccionamiento en un inmnoconjugado mfVIIasm.

Se generaron los xenoinjertos para las pruebas de inmunoterapia a partir de las líneas de melanoma humano LXSN y TF2 que expresan, respectivamente, niveles bajos y altos de TF. El inmunoconjugado mfVIIasm se une más exhaustivamente a las células TF2 que a las células LXSN tal como se determinó mediante FACS, lo que está de acuerdo con el nivel superior de expresión de TF por células TF2. También se sometió a prueba el inmunoconjugado mfVIIasm mediante inmunohistoquímica para detectar la unión a secciones de un xenoinjerto de melanoma humano generado a partir de la línea de melanoma LXSN/VEGF que produce un nivel alto de VEGF, dando como resultado un xenoinjerto densamente vascularizado. Se produjo unión a las células endoteliales vasculares del tumor así como a las células tumorales (figura 4), lo que indica que se expresa TF por ambos tipos de células en el xenoinjerto. Las pruebas de inmunohistoquimímica con secciones de cerebro, pulmón, riñón e hígado de ratón normales mostraron que el inmunoconjugado mfVIIasm no se une a células endoteliales vasculares en estos tejidos, lo que está de acuerdo con otras evidencias de que no se expresa TF por células endoteliales vasculares de tejidos no tumorales.

Pruebas de inmunoterapia. Para la administración sistémica a ratones SCID, se codificó cada inmunoconjugado como una molécula secretada en el sistema de vector adenoviral de replicación deficiente basado en pAdEasy-1 (He, et al., mencionado anteriormente) y se inyectaron los vectores en la vena de la cola de los ratones a los que se les había inyectado en primer lugar por vía subcutánea células de melanoma humano. Las pruebas de inmunoterapia iniciales implicaban inyectar cada vector por separado y ambos vectores juntos en los ratones que habían desarrollado un xenoinjerto de TF2 palpable. Se administraron un total de tres inyecciones a intervalos semanales y se terminó el experimento 6 días tras la última inyección. Se monitorizó la concentración de los inmunoconjugados en la sangre mediante ELISA tras las primera y segunda inyecciones (figura 5). La concentración promedio tras la primera inyección era de 4 mg/ml para el inmunoconjugado G71-1 y de 0,04 mg/ml para el inmunoconjugado mfVIIasm, lo que indica que la tasa de síntesis era aproximadamente 100 veces superior para el inmunoconjugado G71-1 que para el inmunoconjugado mfVIIasm. La concentración de cada inmunoconjugado aumentó tras la segunda inyección, lo que indica que se habían infectado células adicionales por los adenovirus. El crecimiento de los xenoinjertos se monitorizó midiendo en dos dimensiones el tamaño del tumor que aparece en la superficie de la piel, y usando las mediciones para estimar el volumen tumoral (figura 6). En los ratones control a los que se les inyectó el adenovirus que no codifica para un inmunoconjugado, el tumor creció de manera continua a una tasa relativamente rápida, alcanzando un volumen promedio de aproximadamente 2.000 mm^{3} tras 20 días. En los ratones a los que se les inyectó un adenovirus que codificaba para un inmunoconjugado, se inhibió el crecimiento tumoral, la inhibición fue más fuerte para el inmunoconjugado mfVIIasm que para el inmunoconjugado G71-1. Todos los ratones permanecieron activos y parecían sanos al final del experimento y el examen histológico del hígado, bazo, pulmón, riñón y cerebro no mostró ninguna evidencia de necrosis, coagulación o hemorragia. Los pesos del tumor tras la autopsia fueron inferiores en los ratones tratados con los inmunoconjugados que en los ratones control, lo que está de acuerdo con los volúmenes tumorales estimados (figura 7). La reducción más fuerte del peso del tumor se produjo en los ratones tratados con ambos inmunoconjugados.

Se concibieron los dos experimentos siguientes para someter a prueba dos parámetros que podrían afectar a la eficacia terapéutica de los inmunoconjugados, concretamente el tamaño inicial del xenoinjerto y el nivel de expresión de TF por las células de melanoma. (i) Las pruebas de inmunoterapia precedentes implicaban xenoinjertos de melanoma palpables que habían crecido hasta un volumen estimado de aproximadamente 5 mm^{3}, correspondiente a un tumor pequeño en seres humanos. Para someter a prueba la eficacia terapéutica de los inmunoconjugados frente a un xenoinjerto mayor, se dejaron crecer xenoinjertos de TF2 hasta un volumen estimado de aproximadamente 50 mm^{3} antes de comenzar las inyecciones en la vena de la cola de los dos vectores adenovirales. Los ratones recibieron 4 inyecciones durante un periodo de 3 semanas y el experimento finalizó 2 días tras la última inyección. El volumen tumoral promedio en los ratones a los que se les inyectaron los adenovirus que codifican para los inmunoconjugados fue aproximadamente el mismo al final que al comienzo del experimento, al contrario que el volumen tumoral promedio en los ratones a los que se les inyectó el adenovirus control que aumentó en un factor de aproximadamente 27 durante el mismo periodo (figura 8). Estos resultados muestran que se inhibe el crecimiento tumoral tan eficazmente con el tumor mayor que con el tumor más pequeño. Uno de los 5 ratones a los que se les inyectó el adenovirus que codifica para los inmunoconjugados murió 5 días tras la tercera inyección; la causa de la muerte no pudo determinarse debido a que no se recuperó el ratón a tiempo para su examen. (ii) Un parámetro que podría afectar a la eficacia del inmunoconjugado mfVIIasm es el nivel de expresión de TF, que varía entre diferentes tumores (Callender, N.S., et al. (1992) Cancer 70, 1194-1201). Para estudiar el efecto de variar la expresión de TF por las células de melanoma en un xenoinjerto, se utilizó la línea de melanoma LXSN para generar un xenoinjerto que expresaba un nivel bajo de TF, para su comparación con el xenoinjerto generado a partir de la línea relacionada TF2 que expresa un nivel superior de TF (Bromberg, M.E., et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 8205-8209). Después de que los xenoinjertos alcanzaran un tamaño palpable, los ratones recibieron durante las siguientes 3 semanas 5 inyecciones del adenovirus que codifica para el inmunoconjugado fVIIasm o el adenovirus control (figura 11). En los 5 ratones a los que se les inyectó el adenovirus control, el xenoinjerto creció de manera continua, aumentando el volumen promedio hasta 1350 mm^{3} en el segundo día tras la última inyección. Durante el mismo periodo, el volumen promedio de los xenoinjertos en los ratones a los que se les inyectó el inmunoconjugado mfVIIasm aumentó hasta 20 mm^{3}, lo que indica que la inhibición del desarrollo tumoral es comparable para los xenoinjertos de LXSN y TF2 (comparar las figuras 9 y 6). Las autopsias realizadas un día tras la última inyección mostraron que se había erradicado el xenoinjerto en 2 de los 5 ratones a los que se les inyectó el adenovirus que codifica para el inmunoconjugado mfVIIasm; el peso de tumor promedio en los otros 3 ratones fue de 0,11 g en comparación con el peso promedio de 0,75 g en los 5 ratones a los que se les inyectó el adenovirus control. Los tumores pequeños recuperados de estos 3 ratones mostraron regiones extensas de necrosis celular, que no se produjeron en los tumores mayores de los ratones control (figura 10). Todos los ratones parecían sanos al final de este experimento, pero un examen morfológico de los ratones diseccionados reveló daño en el hígado y bazo en los 5 ratones a los que se les inyectó el adenovirus que codifica para el inmunoconjugado mfVIIasm. El examen histológico del hígado y bazo mostró que muchas de las células hepáticas estaban ampliadas y el bazo estaba exhaustivamente infiltrado con eritrocitos. También se produjeron células hepáticas ampliadas en un experimento previo tras 3 inyecciones de los adenovirus que codifican para el inmunoconjugado mfVIIasm, pero el bazo era normal, lo que indica que los defectos en el bazo se desarrollaron en el transcurso de las últimas 2 inyecciones. Uno de los ratones también presentaba una hemorragia cerebral subdural, que no se produjo en los otros ratones de este experimento ni en ninguno de los experimentos previos. Es dudoso si este efecto se indujo por la unión del inmunoconjugado mfVIIasm a TF expresado en la vasculatura cerebral o si se produjo espontáneamente.

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Exposición

El procedimiento de inmunoterapia en este ejemplo implicaba la administración sistemática a ratones SCID de dos inmunoconjugados, compuesto cada uno por un dominio de direccionamiento al tumor conjugado con la región Fc de una cadena pesada de IgG1 humana, formando una molécula homodimérica similar a un anticuerpo de cadena pesada de camélidos. Para un tipo de inmunoconjugado, el dominio de direccionamiento al tumor era la molécula de scFv humana G71-1 que se une al antígeno de melanoma MCSP expresado por las células de melanoma en los xenoinjertos. Para el otro tipo de inmunoconjugado, el dominio de direccionamiento al tumor era una molécula de factor VII de ratón que se une específica y fuertemente al factor tisular (TF), tanto a TF de ratón expresado por las células endoteliales de la vasculatura del tumor como a TF humano expresado por las células de melanoma en los xenoinjertos. Para disminuir el riesgo de coagulación intravascular diseminada (DIC) que podría resultar de la unión de un inmunoconjugado de factor VII a TF, se introdujo una mutación de sitio activo en el dominio de direccionamiento de fVII de ratón (mfVIIasm), que inhibe la actividad proteolítica requerida para iniciar la ruta de coagulación sanguínea.

El estudio notificado en el ejemplo 1 mostró que el inmunoconjugado G71-1 media la citólisis de células de melanoma humano cultivadas por células NK y el complemento, Debido a que los ratones SCID conservan la capacidad de producir complemento y células NK funcionales, los inmunoconjugados también podrán mediar la citólisis de las células endoteliales vasculares y las células tumorales seleccionadas como diana de un xenoinjerto de melanoma humano que se hace crecer en ratones SCID. La administración sistémica de los inmunoconjugados a ratones SCID se logró mediante inyecciones en la vena de la cola de un vector adenoviral de replicación deficiente que codifica para los inmunoconjugados, que se secretaron a la sangre durante por lo menos una semana tras cada inyección. En primer lugar, se les inyectó a los ratones por vía subcutánea una línea celular de melanoma humano que expresaba un nivel o bien bajo o bien alto de TF y se dejó crecer el xenoinjerto resultante para dar un tumor pequeño (\sim5 mm^{3}) o mayor (\sim50 mm^{3}) antes de comenzar las inyecciones de los vectores adenovirales. Se evitó el crecimiento adicional de todos los xenoinjertos durante el periodo de 3 a 4 semanas de los experimentos mediante inyecciones múltiples de los adenovirus que codifican para el inmunoconjugado mfVIIasm, administrado por separado o junto con el adenovirus que codifica para el inmunoconjugado G71-1; en algunos de los ratones, el xenoinjerto experimentó regresión completa. En los ratones control, a los que se les inyectó un adenovirus que no codificaba para un inmunoconjugado, el volumen promedio de los xenoinjertos aumentó en un factor de aproximadamente 25 durante el mismo periodo. En los ratones que recibieron 5 inyecciones de los vectores adenovirales que codifican para los inmunoconjugados, muchas de las células hepáticas estaban ampliadas y el bazo se infiltró con eritrocitos. Los defectos no estaban provocados por los inmunoconjugados secretados, que no se unen a las células hepáticas o del bazo. La causa principal es probablemente la síntesis de nivel alto continua de los inmunoconjugados codificados por las células hepáticas, que son las células de ratón infectadas predominantemente por los vectores adenovirales inyectados por vía intravenosa. Aunque la concentración de inmunoconjugado en la sangre de ratones SCID a los que se les inyectó un vector adenoviral era aproximadamente 100 veces superior para el inmunoconjugado G71-1 que para el inmunoconjugado mfVIIasm, sin embargo el efecto inhibidor en un xenoinjerto de melanoma humano era más fuerte con el inmunoconjugado mfVIIasm. Una ventaja clave del inmunoconjugado mfVIIasm es la unión que se produce a células endoteliales vasculares del tumor así como a células tumorales, al contrario que el inmunoconjugado G71-1, que se une sólo a células de melanoma. La unión a la vasculatura del tumor debe ser específica del tumor, porque TF no se expresa por la vasculatura normal. Aunque se expresa TF por varios otros tejidos normales, tales como el cerebro, pulmón y glomérulos renales, estas moléculas de TF no son accesibles para fVII endógeno o inmunoconjugado de fVII debido a que las paredes de los vasos sanguíneos forman una barrera que separa los componentes sanguíneos mayores de células adyacentes. Sin embargo, los vasos sanguíneos del tumor son porosos, permitiendo el acceso de TF expresado por células tumorales. Por tanto, un inmunoconjugado fVIIasm humano puede ser un agente terapéutico eficaz para un amplio espectro de tumores humanos que expresan TF en las células endoteliales vasculares y células tumorales. La eficacia terapéutica de un inmunoconjugado fVIIasm humano puede potenciarse administrando también un inmunoconjugado de scFv humano que se une a una diana de célula tumoral diferente de TF.

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Ejemplo 3

Este ejemplo notifica un estudio de la eficacia y seguridad de un protocolo para el tratamiento contra el cáncer sometido a prueba en un modelo de ratón SCID de melanoma de pulmón metastásico y de piel humana, y en un modelo de ratón inmunocompetente de melanoma de ratón. El protocolo implicaba inyecciones intratumorales de vectores adenovirales de replicación incompetente que codifican para inmunoconjugados de la invención que provocan una respuesta inmunitaria citolítica frente a las células tumorales y células endoteliales de la neovasculatura seleccionadas como diana. Los experimentos de modelo de ratón mostraron que la administración intratumoral del inmunoconjugado de factor VII, o bien solo o bien junto con el inmunoconjugado de Fv de cadena sencilla, dio como resultado una inhibición del crecimiento y una regresión del tumor inyectado, y también de tumores metastásicos no inyectados distantes, sin evidencia de daño a órganos normales. Hubo una destrucción extensa de la neovasculatura del tumor, presumiblemente mediada por el inmunoconjugado de factor VII unido al factor tisular en células endoteliales de la neovasculatura. Debido a que el factor tisular se expresa generalmente en células tumorales y células endoteliales neovasculares, puede utilizarse un inmunoconjugado de factor VII para inmunoterapia frente a una amplia gama de tumores humanos.

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Materiales y métodos

Líneas celulares. LXSN, TF2 y Yusac2 son líneas de melanoma humano, Caki es una línea de tumor renal humano, LnCap es una línea de tumor de próstata humano, A204 es una línea de neuroblastoma humano, B16F10 es una línea de melanoma de ratón, EMT6 es una línea de tumor mamario de ratón, BT20 es una línea de tumor de mama humano, Colo 357 es una línea de tumor pancreático humano, MS es una línea de tumor gástrico humano y 293 es una línea de riñón humano (ATCC, CRL-1573) usadas para empaquetar los vectores adenovirales. El medio de cultivo era DMEM+FBS al 10% para todas las líneas de tumor excepto LnCap, que se cultivó en RPMI 1640 + FBS al 10%.

Vectores adenovirales. 1) Se usaron los procedimientos resumidos en el ejemplo 2 anterior para producir y purificar los vectores adenovirales que codifican para los inmunoconjugados mfVIIasm y G71-1 con la siguiente modificación. Tras digerir los ADN de vector lanzadera con PmeI, en lugar de una etapa de precipitación con etanol, se purificaron los ADN mediante electroforesis en gel de agarosa seguido por el aislamiento de las bandas de ADN usando el kit QIAEX II (Qiagen). 2). Se determinaron las concentraciones de vector en las preparaciones purificadas mediante ensayos para determinar partículas infecciosas (IP) y unidades infecciosas (IU), tal como sigue. (i) El ensayo de IP implica diluir la preparación de vector 20 veces en tampón de lisis (SDS al 0,1% en PBS) y medir la absorbancia a 260 nm; la conversión en IP es 1 unidad de D.O. = 1 X 10^{12} IP. (ii) El ensayo de IU implica infectar cultivos de células 293 con diluciones en serie de la preparación de vector, incubar los cultivos infectados durante 2 días y examinar las células en un microscopio de fluorescencia para determinar la expresión del gen de la proteína fluorescente verde (GFP) en el genoma del vector. Se calcula el título de IU a partir del número de células que expresan el gen de GFP. Los títulos de IP y IU coincidían en \pm10%.

Síntesis del inmunoconjugado mfVIIasm en células tumorales. Se hicieron crecer células tumorales casi hasta confluencia en placas de 150 mm y se infectaron las células con el adenovirus que codifica para el inmunoconjugado mfVIIasm a una multiplicidad de 10 IU por célula. Se cultivaron las células infectadas en medio libre de suero durante 4 días y se mezclaron 1,5 ml del medio con 10 \mul de una suspensión de perlas de proteína A (Pierce) y se hicieron rotar a 4ºC durante la noche. Se eluyó el inmunoconjugado mfVIIasm unido calentando las perlas en 15 \mul de tampón de carga de SDS-PAGE a 80ºC durante 3 min. y se fraccionó el eluato mediante SDS-PAGE y se transfirió a una membrana de nitrocelulosa. Se detectó la banda de inmunoconjugado sometiendo a inmunotinción con una sonda de anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón o anti-ser humano (específica para Fc).

Pruebas de inmunoterapia en ratones inmunodeficientes. Se usaron ratones C.B-17 SCID hembra de 4 a 5 semanas de edad (Taconic Farms) para todos los experimentos con ratones inmunodeficientes. Se disociaron cultivos monocapa de las líneas de melanoma humano LXSN o TF en PBS + EDTA 2 mM, se lavaron y se resuspendieron en PBS. Se generaron tumores de piel mediante inyecciones subcutáneas de 5 X 10^{5} células en el flanco trasero derecho y se generaron tumores de pulmón metastásicos mediante inyecciones intravenosas de 6 X 10^{5} células TF en la vena de la cola. Se midió el tamaño del tumor de piel en dos dimensiones con un calibrador y se estimó el volumen del tumor como (anchura)^{2} (longitud)/2. Cuando un tumor de piel había crecido hasta un volumen de aproximadamente 100 mm^{3}, se iniciaron inyecciones intratumorales de un vector adenoviral que contenía un dominio efector Fc humano. Para cada etapa de inyección, se inyectó un volumen total de 50 \mul de la preparación de vector en 3 ó 4 sitios en el tumor. Al final del experimento, se realizaron autopsias para tomar muestras de sangre y para preparar los tumores y los órganos normales para el examen morfológico e histológico.

Pruebas de inmunoterapia en ratones inmunocompetentes. Se utilizaron ratones C57BL/6 hembra de 4 a 5 semanas de edad (Charles River Laboratories) para todos los experimentos que implicaban ratones inmunocompetentes. Se suspendieron cultivos monocapa de células de melanoma de ratón B16F10 en PBS + EDTA 2 mM, se lavaron y se resuspendieron en PBS. Se generaron tumores de piel mediante inyecciones subcutáneas de 5 X 10^{5} células en el flanco trasero derecho. Cuando los tumores de piel habían crecido hasta un volumen estimado de 140 a 325 mm^{3}, se iniciaron inyecciones en la vena de la cola del vector adenoviral que codifica para el inmunoconjugado mfVIIasm que contiene un dominio efector Fc de ratón. Los procedimientos para monitorizar la eficacia y seguridad del protocolo son los mismos que los descritos anteriormente para ratones SCID.

Ensayos de SGOT. Se tomaron muestras de suero de ratones, se congelaron y se sometieron a ensayo para determinar la transaminasa glutámico-oxalacética utilizando un kit de diagnóstico convencional.

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Resultados

Los dos inmunoconjugados usados para este estudio están compuestos por un dominio de direccionamiento al tumor y un dominio efector (figura 1). El dominio de direccionamiento es o bien una molécula de factor VII de ratón mutada (mfVIIasm) que se une a TF expresada en células tumorales y células endoteliales vasculares tumorales pero no inicia la coagulación sanguínea (ejemplo 2), o bien anticuerpo scFv G71-1 que se une a su antígeno relacionado expresado de manera selectiva en células de melanoma humano (Cai y Garen, mencionados anteriormente, y ejemplo 1). El dominio efector es la región Fc de una inmunoglobulina IgG1 humana o de ratón que induce una respuesta inmunitaria citolítica frente a las células seleccionadas como diana (ejemplo 1). El vector para administrar los inmunoconjugados es un adenovirus de replicación incompetente que codifica para una forma secretada de los inmunoconjugados (ejemplo 1). En el ejemplo 1, las inyecciones intravenosas en ratones SCID de los vectores que codifican para los inmunoconjugados inhibieron el crecimiento tumoral pero provocaron un daño histológico en el hígado, que es la diana primaria para la infección mediante el vector inyectado por vía intravenosa. Con el fin de determinar si la infección primaria podría redirigirse desde células hepáticas a células tumorales, se inyectaron los vectores por vía intratumoral en un melanoma de piel humana hecho crecer en ratones SCID, y se mapeó la distribución del vector en el tumor e hígado mediante la expresión del gen de la proteína fluorescente verde (GFP) insertado en el genoma del vector (figura 14). Se detectó una expresión de GFP intensa en el tumor pero no el hígado, lo que indica que un tumor inyectado es la diana principal para la infección mediante el vector. El patrón de expresión de GFP en el tumor parecía estar restringido a unas pocas capas de células tumorales adyacentes a la trayectoria atravesada por la aguja de inyección.

El efecto de la dosis de vector sobre el crecimiento tumoral se sometió a prueba inyectando una mezcla de los dos vectores que codifican para los inmunoconjugados mfVIIasm y G71-1 en una tumor de piel de melanoma humano que se ha hecho crecer en ratones SCID, y midiendo el volumen tumoral durante los siguientes 5 días. La razón del vector de mfVIIasm con respecto al vector de G71-1 en la mezcla era de 5 a 1, con el fin de compensar el alto título del inmunoconjugado G71-1 secretado a la sangre (ejemplo 2). La dosis combinada de los dos vectores usados para las inyecciones se varió desde 7 X 10^{8} hasta 6 X 10^{9} unidades infecciosas (IU). Para un control, se inyectó un vector vacío sin un inmunoconjugado codificado a una dosis de 6 X 10^{9} IU. Se obtuvo la inhibición más fuerte del crecimiento tumoral con la mayor dosis de los vectores que codifican para los inmunoconjugados. Se usó esta dosis de vector para todos los experimentos con ratones SCID siguientes.

En el siguiente experimento, se monitorizó el efecto inhibidor sobre el crecimiento tumoral de la administración de inyecciones intratumorales múltiples de los dos vectores que codifican para los inmunoconjugados mfVIIasm y G71-1 durante19 días. El título de las proteínas de inmunoconjugados en la sangre de los ratones 2 días tras la última inyección de los vectores adenovirales estaba comprendido entre 1 mg/ml y 2 mg/ml, que representa aproximadamente un cuarto del título producido mediante vectores inyectados por vía intravenosa (ejemplo 2). El volumen promedio de estos tumores disminuyó en aproximadamente el 70% en el plazo de un día tras la primera inyección de los dos vectores, y los volúmenes no aumentaron posteriormente durante el resto del experimento. Los tumores a los que se les inyectó un vector control vacío crecieron de manera continua, alcanzando al final del experimento un volumen promedio de 1.900 mm^{3} en comparación con 30 mm^{3} para los tumores a los que se les inyectó los vectores que codifican para los dos inmunoconjugados. Los tumores a los se les inyectó sólo el vector que codifica para el inmunoconjugado mfVIIasm se inhibieron casi tan fuertemente como los tumores inyectados con ambos vectores, lo que está de acuerdo con los experimentos preliminares que implicaban inyecciones intravenosas de los vectores (ejemplo 2). Los ratones permanecieron activos durante todo el experimento y en autopsias realizadas 2 días tras las inyecciones finales todos los órganos parecían morfológica e histológicamente normales y no había evidencia de hemorragia. Dado que los ratones SCID inyectados a los que se les inyectaron por vía intravenosa los vectores que codifican para los inmunoconjugados mostraron un daño histológica en las células hepáticas (ejemplo 2), se sometieron a prueba los hígados de ratones SCID inyectados por vía intratumoral para determinar el daño histológico y también funcional. Al contrario que los cambios histológicos importantes observados en las secciones de hígado de ratones inyectados por vía intravenosa, las secciones de hígado de los ratones inyectados por vía intratumoral mostraron cambios relativamente menores (figura 15). Se monitorizó la función hepática mediante ensayos para determinar la enzima transaminasa glutámico-oxalacética (SGOT) en sueros obtenidos de los ratones durante la autopsia. Los niveles de SGOT en los ratones control y los ratones a los que se les inyectó los vectores que codifican para los inmunoconjugados permanecieron dentro del intervalo normal (210 \pm 28 U/L), lo que indica que la función hepática no resultó afectada.

Los tumores recuperados de los ratones inyectados con los vectores que codifican para los inmunoconjugados mfVIIasm y G71-1 carecían casi completamente de vasos sanguíneos (figura 13), presumiblemente como resultado de una respuesta inmunitaria citolítica frente a células endoteliales vasculares inducida por el inmunoconjugado mfVIIasm unido a TF.

La eficacia del protocolo de inyección intratumoral depende no solo de la inhibición del tumor de piel inyectado sino también de los tumores metastásicos que no son accesibles para la inyección. Para someter a prueba un efecto inhibidor sobre tumores metastásicos, se usó un modelo de ratón SCID en el que se inyectan células TF de melanoma humano en la vena de la cola, dando como resultado el transporte a través de la sangre de las metástasis hasta los pulmones. También se les inyectó a los ratones por vía subcutánea células LXSN de melanoma humano al mismo tiempo y se les inyectó a los tumores de piel que se formaron 12 días más tarde los vectores que codifican para los dos inmunoconjugados o un vector control vacío. Se continuó con las inyecciones intratumorales con un programa bisemanal durante las siguientes 8 semanas y se realizaron autopsias 2 días tras la última inyección para determinar el número de nódulos tumorales sobre la superficie de los pulmones (tabla 2). Los dos ratones a los que se les inyectó el vector control presentaban 14 y 29 nódulos pulmonares, respectivamente, al contrario que los cinco ratones a los que se les inyectó los vectores que codifican para los dos inmunoconjugados, tres de los cuales no presentaban nódulos pulmonares y dos presentaban 1 y 5 nódulos, respectivamente. Estos resultados indican que las inyecciones intratumorales de los vectores que codifican para los dos inmunoconjugados pueden inhibir el crecimiento de tumores metastásicos distantes así como del tumor inyectado.

TABLA 2 Inhibición de tumores pulmonares metastásicos mediante inyecciones intratumorales de vectores adenovirales que codifican para los inmunoconjugados

2

Se inyectaron ratones SCID en el día 0 con células de melanoma humano por vía intravenosa para generar tumores pulmonares metastásicos transportados a través de la sangre y por vía subcutánea para generar un tumor de la piel. Se iniciaron las inyecciones intratumorales de los vectores adenovirales que codifican para los inmunoconjugados mfVIIasm y G71-1 en el tumor de la piel en el día 10 y se realizaron inyecciones adicionales bisemanalmente durante 7 semanas. Se realizaron las autopsias 2 semanas tras la última inyección. El número de ratones era de 2 para el vector control y 5 para el vector que codifica para los inmunoconjugados.

Otro parámetro que puede afectar a la eficacia del protocolo en una práctica clínica es la respuesta inmunitaria de un paciente a los inmunoconjugados o el vector adenoviral. Debido a que los dominios de direccionamiento y efector de inmunoconjugados para uso clínico se derivarán de proteínas humanas, los pacientes no deben mostrar una respuesta inmunitaria significativa a los inmunoconjugados. Sin embargo, el vector adenoviral es fuertemente inmunogénico en seres humanos y también en ratones. Para evaluar el efecto de una respuesta inmunitaria al vector adenoviral en ratones, se sometió a prueba el protocolo en ratones inmunocompetentes que portan un tumor de piel de melanoma de ratón. El experimento implicaba inyecciones intravenosas en vez de intratumorales del vector, porque las células de melanoma de ratón no pueden infectarse mediante el vector. Además, sólo el inmunoconjugado mfVIIasm pudo someterse a prueba, porque las células de melanoma de ratón se unen al inmunoconjugado mfVIIasm pero no al inmunoconjugado G71-1. El dominio efector de Fc del inmunoconjugado para este experimento se derivaba de una inmunoglobulina IgG1 de ratón. Los resultados muestran que las inyecciones intravenosas del vector adenoviral que codifica para el inmunoconjugado mfVIIasm da como resultado la inhibición del crecimiento de un tumor de melanoma en ratones inmunocompetentes así como en ratones SCID (figura 16).

Debido a que TF se expresa generalmente mediante células endoteliales vasculares tumorales y también mediante la mayoría de las células tumorales metastásicas, un inmunoconjugado fVIIasm pudo mediar una respuesta inmunitaria citolítica no sólo frente a melanomas humanos sino también frente a un amplio espectro de otros tumores humanos. Tal como se muestra en el estudio notificado en la presente memoria, las inyecciones intratumorales de un vector adenoviral que codifica para el inmunoconjugado mfVIIasm en un tumor humano parecen ser un protocolo seguro y eficaz para establecer y mantener un elevado título en sangre del inmunoconjugado. Sin embargo, las células del tumor inyectado deben ser susceptibles a una infección por el adenovirus y poder sintetizar y secretar el inmunoconjugado codificado. Un panel de líneas de tumor humano y de ratón, que consistía en líneas de melanoma, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de riñón, cáncer gástrico y neuroblastoma humano y líneas de melanoma y cáncer de mama de ratón, se sometió a prueba como huésped para el vector adenoviral que codifica para el inmunoconjugado mfVIIasm. Todas las líneas de tumor humano produjeron y secretaron aproximadamente la misma cantidad de la proteína inmunoconjugada, lo que indica que el protocolo de inyección intratumoral podría usarse también para otros tipos de tumores sólidos humanos además de melanoma. Las líneas de tumor de ratón no produjeron la proteína inmunoconjugada, probablemente porque las células de ratón no se infectaron por el vector adenoviral.

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Exposición

El protocolo de inmunoterapia contra el cáncer descrito en este ejemplo implica inyecciones intratumorales de vectores adenovirales de replicación incompetente que codifican para moléculas inmunoconjugadas que median en una respuesta inmunitaria citolítica frente a la vasculatura del tumor y células tumorales (figura 1). Las células infectadas por los vectores sintetizan los inmunoconjugados codificados, que se secretan a la sangre y se unen a las dianas homólogas en células tumorales y células endoteliales de la vasculatura. La inyección intratumoral de los vectores proporciona una ventaja de seguridad importante con respecto a la inyección intravenosa, porque el vector infecta predominantemente las células del tumor inyectado en lugar de las células hepáticas. Ni el hígado ni otro órgano de los ratones mostraron un daño significativo a partir de las inyecciones intratumorales repetidas. También pueden infectarse mediante el vector varios tipos de células de tumor humano distintos de melanoma y pueden sintetizar y secretar el inmunoconjugado codificado. Por tanto, la vía de inyección intratumoral para los vectores podrá aplicarse generalmente a tumores sólidos humanos. Si ningún tumor es accesible para la inyección, el vector podrá inyectarse en un tejido normal susceptible.

La eficacia terapéutica del protocolo de inyección se sometió a prueba en un modelo de ratón SCID de melanoma de piel humana y melanoma de pulmón metastásico. Las pruebas implicaban dos inmunoconjugados que contenían diferentes dominios de direccionamiento. 1) Un dominio de direccionamiento es el zimógeno sanguíneo, factor VII (fVII), que se une con alta afinidad y especificidad al factor tisular de receptor transmembrana expresado mediante células endoteliales de vasos sanguíneos en crecimiento, incluyendo los vasos de la neovasculatura del tumor, y también por la mayoría de las células de tumor humano. Un inmunoconjugado de fVII debe competir in vivo con un factor VII endógeno para unirse al factor tisular en las células seleccionadas como diana. Esta competición favorece enormemente la molécula inmunoconjugada homodimérica (figura 1) con respecto a la molécula endógeno monomérica, porque el efecto de avidez de dos dominios de direccionamiento potencia la unión a células que expresan múltiples copias de factor tisular (ejemplo 2); además, el título en sangre es mayor para el inmunoconjugado de fVII codificado por el vector que para el factor VII endógeno. Se usó un dominio de direccionamiento de fVII de ratón para los experimentos que implican xenoinjertos de tumor humano que se hicieron crecer en ratones SCID, porque se une estrechamente tanto al factor tisular humano en las células tumorales como al factor tisular de ratón en las células endoteliales de ratón en la vasculatura del tumor. Para impedir la iniciación de la ruta de coagulación sanguínea mediante la unión de un inmunoconjugado de fVII al factor tisular, lo que podría provocar coagulación intravascular diseminada, se introdujo una mutación en el sitio activo del dominio de direccionamiento de fVII de ratón (mfVIIasm) . 2) El segundo dominio de direccionamiento es el anticuerpo Fv monocatenario (scFv) G71-1 que se une a un proteoglicano de condroitina sulfato expresado de manera selectiva mediante células de melanoma humano (ejemplos 1 y 2). Los resultados de las pruebas de inmunoterapia mostraron que las inyecciones intratumorales del vector que codifica para el inmunoconjugado mfVIIasm, o bien solo o bien con el vector que codifica para el inmunoconjugado G71-1, inhibieron el crecimiento del tumor de piel inyectado y también los tumores de pulmón metastásicos (figura 16 y tabla 2). El tejido tumoral residual restante tras las inyecciones intratumorales de los vectores que codifican para los inmunoconjugados carecía casi de vasos sanguíneos (figura 13), lo que indica que el inmunoconjugado mfVIIasm induce una respuesta inmunitaria citolítica potente que da como resultado una destrucción extensa de la neovasculatura del tumor.

La descripción anterior se proporciona con el fin de enseñar al experto ordinario en la materia cómo poner en práctica la presente invención y no pretende detallar todas las modificaciones y variaciones obvias de la misma que resultarán evidentes para un experto a partir de la descripción. Sin embargo, se pretende que todas las modificaciones y variaciones obvias de este tipo estén incluidas dentro del alcance de la presente invención, que se define mediante las reivindicaciones siguientes. Las reivindicaciones pretenden cubrir los componentes y las etapas reivindicados en cualquier secuencia que sea eficaz para cumplir los objetivos pretendidos por los mismos, a menos que el contexto indique específicamente lo contrario.

<110> Alan Garen

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<120> Inmunoconjugados dirigidos contra diana neovascular

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<130> OCR-679B

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<140> Documento PCT/US00/

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<141> 14/06/2000

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<150> Documento US 60/142.161

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<151> 01/07/1999

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<160> 12

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<170> MS DOS

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<210> 1

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<211> 60

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<212> ADN

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<221> cebador

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<223> usado en constructos

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<400> 1

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3

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<210> 2

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<211> 39

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<212> ADN

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<221> cebador

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<223> usado en constructos

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<400> 2

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4

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<210> 3

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<211> 44

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<212> ADN

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<221> cebador

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<223> usado en constructos

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<400> 3

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5

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<210> 4

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<211> 50

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<212> ADN

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<221> cebador

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<223> usado en constructos

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<400> 4

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6

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<210> 5

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<211> 67

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<221> cebador

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<223> usado en constructos

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<400> 5

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7

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<210> 6

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<211> 57

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<212> ADN

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<221> cebador

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<223> usado en constructos

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<400> 6

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8

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<210> 7

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<211> 38

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<212> ADN

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<221> cebador

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<223> usado en constructos

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<400> 7

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9

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<210> 8

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<211> 38

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<212> ADN

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<221> cebador

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<223> usado en constructos

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<400> 8

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10

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<210> 9

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<211> 39

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<212> ADN

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<221> cebador

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<223> usado en constructos

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<400> 9

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11

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<210> 10

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<211> 49

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<212> ADN

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<221> cebador

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<223> usado en constructos

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<400> 10

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\hskip1cm

12

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<210> 11

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<211> 1569

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<212> ADN

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<221> inmunoconjugado G71-1

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<223> incluye líder + G71 + ligador + VL + IgG1Fc

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<400> 11

13

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<210> 12

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<211> 2139

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<212> AND

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<221> inmunoconjugado hfVIIasm

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<223> incluye líder + hfVIIasm + IgG1Fc humana

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<400> 12

14

Claims (16)

1. Composición útil en el tratamiento de estados patológicos caracterizados porque presentan neovascularización que comprende una proteína de inmunoconjugado construida como un dímero de dos cadenas idénticas, presentando cada una un dominio efector que es el dominio Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina IgG1 conjugado con un dominio de direccionamiento que es una forma mutante del factor VII que se une al factor tisular pero que no inicia la coagulación sanguínea, en la que dicha forma mutante del factor VII comprende una mutación seleccionada de entre el grupo constituido por alanina por la lisina 341 y una alanina por la serina 344.

2. Composición según la reivindicación 1, que comprende además una segunda proteína de inmunoconjugado construida como un dímero de dos cadenas idénticas, presentando cada una un dominio efector que es el dominio Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina IgG1 humana conjugado con un dominio de direccionamiento que es un fragmento de anticuerpo scFv o V_{H} humano que se une a la neovasculatura.

3. Composición según la reivindicación 1, que comprende además una segunda proteína de inmunoconjugado construida como un dímero de dos cadenas idénticas, presentando cada una un dominio efector que es el dominio Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina IgG1 conjugado con un dominio de direccionamiento que es un fragmento de anticuerpo scFv o V_{H} que se une a un tipo particular de célula tumoral.

4. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la proteína de inmunoconjugado se codifica como una molécula secretada en un vector de expresión.

5. Composición según la reivindicación 4, en la que el vector de expresión es un vector adenoviral de replicación deficiente.

6. Composición según la reivindicación 4, en la que el vector de expresión es un vector de expresión adenoasociado.

7. Utilización de por lo menos un tipo de proteína de inmunoconjugado en la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de una enfermedad asociada con la neovascularización en un paciente, comprendiendo dicha proteína de inmunoconjugado el dominio Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina IgG1 conjugado con un dominio de direccionamiento que comprende una forma mutante del factor VII que se une al factor tisular pero que no inicia la coagulación sanguínea, en la que dicha forma mutante del factor VII comprende una mutación seleccionada de entre el grupo constituido por alanina por la lisina 341 y una alanina por la serina 344.

8. Utilización según la reivindicación 7, en la que se administra al paciente como terapia complementaria una segunda proteína de inmunoconjugado que presenta un dominio efector que es el dominio Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina IgG1 conjugado con un dominio de direccionamiento que es un fragmento de anticuerpo scFv o V_{H} humano que se une a la neovasculatura o a las células tumorales.

9. Utilización según la reivindicación 7, que es un tratamiento para una enfermedad seleccionada de entre el grupo constituido por cáncer que implica un tumor vascularizado, artritis reumatoide y la forma exudativa de la degeneración macular.

10. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en la que el paciente es tratado mediante la administración de una proteína de inmunoconjugado en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

11. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en la que el paciente es tratado mediante la administración de un vector adenoviral de replicación deficiente o un vector adenoasociado que es portador de un ADNc que codifica para una forma secretada de uno o más tipos de proteína de inmunoconjugado.

12. Utilización según la reivindicación 11, en la que se utiliza un vector adenoviral de replicación deficiente.

13. Utilización de por lo menos un tipo de proteína de inmunoconjugado en la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer en un paciente, comprendiendo dicha proteína de inmunoconjugado el dominio Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina IgG1 humana conjugado con un dominio de direccionamiento que comprende una forma mutante del factor VII humano seleccionada de entre el grupo constituido por factor VII nativo que presenta una sustitución de alanina por lisina 341, factor VII nativo que presenta una sustitución de alanina por serina 344 y mezclas de las mismas.

14. Utilización según la reivindicación 13, en la que se administra al paciente como terapia complementaria una segunda proteína de inmunoconjugado que presenta un dominio efector que es el dominio Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina IgG1 humana conjugado con un dominio de direccionamiento que es un fragmento de anticuerpo scFv o V_{H} humano que se une al tipo de célula tumoral del paciente.

15. Utilización según la reivindicación 13 ó 14, en la que el paciente es tratado mediante la administración del inmunoconjugado en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

16. Utilización según la reivindicación 13 ó 14, en la que el paciente es tratado mediante la administración de un vector adenoviral de replicación deficiente que es portador de un ADNc que codifica para una forma secretada de uno o más tipos de la proteína de inmunoconjugado.