JP5745486B2 - 血管新生標的免疫複合体 - Google Patents
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Description
本出願は、1999年7月1日に出願された米国特許出願番号第60/142,161に基づく優先権を主張する。
本発明は、一部、アメリカ国立衛生研究所(アメリカ合衆国公衆衛生局)からの研究グランドHL-29019-17に基づく政府のサポートによって作られた。政府は、本発明に対し、一定の権利を有する。
本発明は、癌、慢性関節リウマチ、滲出性形態の黄斑変性、及びアテローム性動脈硬化症のような新しい血管の増殖(血管新生:neovascularization)に関連する疾患を有する患者を治療するための免疫複合体試薬の設計、合成及び投与に関する。本発明の免疫複合体の標的は、新生血管系の内皮細胞によって発現される膜貫通レセプタ組織因子である。組織因子はまた、多くの型の腫瘍細胞によっても発現される。それ故、本発明の治療方法は広い範囲の固体腫瘍に対する免疫療法において特に有効である。治療試薬は、標的ドメインとエフェクタードメインから成る免疫複合体である(図1)。標的ドメインは、高い親和性と特異性で組織因子に結合するが、血液凝固を開始させない、突然変異形態の第VII因子である。エフェクタードメインはIgG1免疫グロブリンのFc領域である。
典型的には血管内皮細胞に対して特異的な成長因子の放出が引き金となる様々な疾患において、病的血管形成、すなわち周辺組織中の脈管からの血管増殖の誘導が認められる。病的血管形成は、固体腫瘍の成長と転移を可能にし、眼障害における視覚機能不全を引き起こし、炎症性疾患における白血球の血管外遊出を促進し、及び/又はアテローム性動脈硬化症のような心臓血管疾患の結果に影響を及ぼす、血管新生をもたらしうる。集合的に、これらは時に血管形成性疾患と称される。
本発明の課題は癌、慢性関節リウマチ、滲出性形態の黄斑変性、及びアテローム性動脈硬化症を含めて、新しい血管の増殖(新生血管系)に関連する疾患のための新規治療を提供することである。より具体的な課題は、本発明はこれらの疾患状態において認められる血管形成を抑制するだけでなく、新生血管系構造も破壊する、新生血管標的療法を提供することである。
これらやその他の目的は、組織因子に選択的に結合する標的ドメインと、標的細胞に対する細胞溶解応答又は細胞傷害性応答を動員するエフェクタードメインを含む免疫複合体を含有する組成物を提供する、本発明によって実現される。典型的な免疫療法の処置では、各々が、組織因子に結合(bind)するが血液凝固を開始させない、リシン−341がアラニンに置換された、及び/又はセリン−344がアラニンに置換された第VII因子のような、ヒト第VII因子の突然変異形態を含む標的ドメインに複合(conjugate)した免疫複合体であって、ヒンジを含めたヒトIgG1免疫グロブリンのFc領域であるエフェクタードメインを持ち、2つの同一の鎖の二量体として構築される少なくとも1つの免疫複合体を含む組成物を、血管新生に関連する疾患を有する患者に有効量で投与する。組織因子は、正常血管系ではなく腫瘍新生血管系の裏側にある内皮細胞によって、また多くの型の腫瘍細胞によっても発現されるので、本発明の第VII因子免疫複合体は広い範囲の固体腫瘍に対する免疫療法において特に有効である。新生血管系での凝固を活性化する及び/又は新生血管系に組織因子又は組織因子突然変異体を導入するというこれまでに記述されている発明(米国特許第6,001,978号においてEdgingtonとMorrisseyが述べているような)は、組織因子は新生血管系の内皮細胞によって特異的に発現されているのであるから無意味であり、本発明は2つの主要な点でこれらの発明と異なっている:組織因子は、血液凝固プロセスのイニシエーターとしてではなく、本発明の免疫複合体によって仲介される細胞溶解免疫応答を誘導するための標的として使用される、および血液凝固経路を活性化せずに新生血管系を破壊する細胞溶解免疫応答が開始される。
抗血管系免疫複合体療法は、血管形成の活性状態にある増殖中の腫瘍のようなある種の疾患状態で形成される新生血管系と異なって、正常な成体哺乳類血管系は一般に静止状態(女性の生殖周期や創傷治癒のような特定のプロセスを除く)にあるという所見に基づく。それ故、静止状態にある血管内皮細胞と増殖性血管内皮細胞との分子的な相違が病的血管系についての標的なると考えられる。
ヒトIgG1のFcエフェクタードメインに複合したヒト一本鎖Fv(scFv)標的ドメインを含む免疫複合体をこの実施例において合成し、試験する。最初に、ワクチン接種した黒色腫患者の抗体リストから誘導した、scFv融合ファージライブラリーからの黒色腫特異的クローンとしてscFv標的ドメインを単離した(上記で引用したCaiとGarenの参考文献の中で詳細に述べられている)。精製免疫複合体は融合ファージクローンと同様の結合特異性を示した:ヒト黒色腫に対しては結合が起こったが、ヒトメラノサイトあるいは他のいくつかの型の正常細胞及び腫瘍細胞に対しては結合が生じなかった。
細胞培養
永久ヒト黒色腫細胞系統A2058(American Type Culture Collection,Rockville,MD)及びTF2をDMEM+10%FCS中で増殖させた。ヒト微小血管内皮細胞と線維芽細胞の一次培養を新生児包皮から吸い出し、8%FBSと2%ヒト周産期血清を補足したRPMI培地中で培養した;内皮細胞には33mM 3−イソブチル−1−メチルキサンテン(IBMX)と0.5mMジブチリルcAMPをさらに補足した。新生児包皮からのヒトメラノサイトの一次培養はSkin Disease Research Center at Yale University School of Medicineによって調製された。形質転換ヒト腎細胞293−EBNA(Invitrogen)及びチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞をRPMI+10%FCS中で増殖させた。(v)ショウジョウバエ細胞(Schneider S2)をEx−cell 301培地(JRH Biosciences)+10%FBS中25℃で増殖させた。静止NK細胞をロイコホレシスと免疫的選択によって健常ドナーから単離し、単離後18時間以内に使用した;細胞の大部分(>97%)がCD3−、CD56+及びCD16+であった。
手順は、発現ベクターpcDNA3.1(Invitrogen)のCHO細胞へのトランスフェクション、又は発現ベクターpMK33/pMtHyのショウジョウバエ細胞へのトランスフェクションを伴った;各々のベクターは分泌された免疫複合体をコードするcDNAを保有していた(図1)。scFv標的ドメインについてのcDNAを、対応する融合ファージ(1)から次のようなSacI又はBamHI部位を含むPCRプライマーを使用して合成した:a)GTCGAGCAGAGCTCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAGGTGAAGAAGCC(配列番号:1);b)ACGTTCAGGGGATCCACCTAGGACGGTCAGCTTGGTCCC(配列番号:2)。ヒトFcエフェクタードメインは、次のようなBamHI又はSalI部位を含むPCRプライマーを使用して、ヒト末梢血リンパ球由来のcDNAライブラリーから合成した:a)ACCTTGCAGGATCCGCAAGACCCAAATCTTGTGACAAAACTCAC(配列番号:3);b)GATCACGTGTCGACTTATCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTTCTG(配列番号:4)。IgG1リーダーについてのcDNAを、次のようなEcoRI及びSacI末端を含む2個の相補的オリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることによって合成した:a)AATTCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTTGCTGCATTAAGAGGTGTCCAGTCCGAGCT(配列番号:5);b)CGGACTGGACACCTGTTAATGCAGCAACAAGAAAAGCCAGCTCAGCCCAAACTCATG(配列番号:6)。
黒色腫細胞と対照細胞を非酵素的解離培地(Sigma)において採集し、PBS/BSA+0.1%アジ化ナトリウムで洗って、免疫複合体(1μg/ml)を加えたPBS/BSA中で、又は対照として免疫複合体なしのPBS/BSA中でインキュベートした。細胞をPBS/BSAで洗い、蛍光標識抗ヒトFcγ鎖(Vector)と共に4℃で30分間インキュベートして、Becton−Dickenson FACsort装置で分析した。
ヒト黒色腫細胞A2058系統からの約1×107細胞のサンプルを、PBS中免疫複合体10μg/ml、1%BSA及び0.05%アジ化ナトリウムを含む溶液に懸濁し、氷上で30分間インキュベートした。細胞をPBSで2回洗い、PBS中1%NP−40、免疫複合体1μg/ml及びPMSF 0.2mMを含む溶液に20分氷上で溶解した。溶解産物をマイクロヒュージにおいて13,000RPMで5分間遠心し、上清を回収して、回転装置でひと晩プロテイン−Gビーズと共にインキュベートした。ビーズを採集し、PBS中1%NP−40を含む溶液で2回、PBSで1回洗って、ビーズを採集し、PAGEを負荷した緩衝液中で煮沸して、PAGEによって分析した。
クマシーブルーで染色した蛋白質バンドをゲルから切り出して、http://info.med.yale.edu/wmkeck/geldig3.htmに述べられているようにトリプシンで消化した。トリプシン消化物のサンプルをMicromass TofSpecSEでのMALDI−MSによって分析した。ペプチド質量検索に必要な高レベルの精度を達成するために、1060.57のプロトン化モノ同位体質量を持つブラジキニン100fmol、及び2465.2のプロトン化モノ同位体質量を持つACTHクリップを内部標準として使用した。生じたトリプシンペプチドのモノ同位体質量を、0.2ダルトンのマストレランスを用いてProFoundプログラムによりOWLデータベースに対して、及び0.015%のマストレランスを用いてPeptideSearchプログラムによりEMBL/非重複データベースに対して検索した。検索に使用した他の重要な判定基準は、140−560Kdaにわたる質量範囲、最大限1つの開裂ミス、そしてタキソノミー(分類学)に関しては制限なしとした。蛋白質化学及び質量分析試験はすべてYale UniversityのW.M.Keck Foundation & HHMI Biopolymer Laboratoryにおいて実施した。http://info.med.yale.edu/wmkekc/でさらなる情報が入手できる。
カルセイン−AM保持手順を両方のアッセイに使用した。ヒト黒色腫細胞系統又は一次ひと線維芽細胞のいずれかの標的細胞を非酵素的解離培地(Sigma)中で培養フラスコから分離し、96穴プレートに加えた(2×104細胞/穴)。付着標的細胞をPBSで1回洗い、その後免疫複合体(1μg/ml)を含む又は対照として免疫複合体を含まない無血清培地(GIBCO−BRL)中37℃で20分間インキュベートした。次に標的細胞を無血清培地中37℃で40分間、カルセイン−AM(Molecular Probes Inc.,Eugene,OR)7μMで標識した。カルセイン−AMは細胞に入り込む蛍光色素であり、そこで酵素的に変化して、細胞が溶解するまで細胞内にとどまる。NK細胞に関する細胞溶解アッセイについては、標識した標的細胞を、NK細胞対標的細胞の指示されている比率を用いてヒトNK細胞と共に37℃で3〜4時間インキュベートした。補体に関する細胞溶解アッセイについては、標識標的細胞をヒト血清又は精製ウサギ補体成分(Cedarlane laboratories,Ontario,Canada)と共に37℃で1時間インキュベートした。NK細胞又は補体とのインキュベーション後、標的細胞をPBSで2回洗い、残存する付着細胞中の蛍光(残留蛍光)をプレートリーダーで測定した。溶解緩衝液(ホウ酸ナトリウム50mM、0.1%Triton X−100、pH9.0)により37℃で3時間処理した後、標的細胞の残留蛍光を測定して、標的細胞の達成可能な最大細胞溶解を判定した。NK細胞又は補体に接触しなかった付着標的細胞の蛍光を測定して、最大残留蛍光を判定した。標的細胞の各サンプルについての%細胞溶解を次のように算定した:(サンプル標的細胞の残留蛍光−溶解標的細胞の残留蛍光)/(標的細胞の最大残留蛍光−溶解標的細胞の残留蛍光)。
抗黒色腫免疫複合体の合成と特性指摘
免疫複合体は、分泌についてのヒトIgG1リーダー、標的黒色腫細胞についてのヒトscFvドメイン、及びヒトIgG1−Fcエフェクタードメインをコード化した(図1)。免疫複合体分子をトランスフェクションしたCHO及びショウジョウバエS2細胞において発現させ、Fcドメインのヒンジ領域におけるジスルフィド架橋によって連結された二本鎖分子として培地から精製した(図1)。各々が融合ファージクローンE26−1又はG71−1から誘導されたscFv標的ドメインを含む、2つの免疫複合体を合成した。免疫複合体E26−1及びG71−1の結合特異性を、2つのヒト黒色腫細胞系統を用いた細胞選別(FACS)によって試験した;対照は、正常ヒトメラノサイト、線維芽細胞、微小血管及び臍血管内皮細胞、及びヒト腎細胞系統293−EBNAの一次培養であった。結果は、E26−1及びG71−1融合ファージクローンに関して得た結果と一致して、免疫複合体は黒色腫細胞系統に強く結合するが、対照には結合しないことを示した。黒色腫細胞への結合は、非酵素的解離培地(Sigma)を使用して培養フラスコから細胞を採集したときに起こったが、解離培地がトリプシンを含むとき、又は解離した細胞をその後トリプシンで処理したときには結合が起こらなかった。この所見は、免疫複合体についての同種黒色腫抗原が黒色腫細胞の表面に位置することを示唆した。同じトリプシンへの曝露が、細胞表面分子ICAM−1、MHCクラス−I及び組織因子に対する抗体の黒色腫細胞への結合には影響を及ぼさなかったことから、上記抗原はトリプシンに対して例外的に感受性であると思われる。
ヒト黒色腫細胞系統A2058からの培養細胞を免疫複合体G71−1又はE26−1と平衡させ、細胞を界面活性剤で溶解した。溶解産物中の免疫複合体−抗原複合体をプロテイン−Gビーズ上に採集し、PAGEによって分析した。250kdaの見かけ分子量を持つ蛋白質バンドが黒色腫細胞において検出されたが、対照では検出されなかった。MALDI−MS法による蛋白質バンドのトリプシン消化物を分析すると、対照ゲル切片の消化物には存在しなかった75のペプチド塊が同定された。ProFoundによる蛋白質配列データベースの検索は、MCSPコア蛋白質中のペプチド塊と適合し、完全な蛋白質配列の26%に及ぶ50のペプチド塊を生じた。この同定に関するProFoundの確率スコアは1.0であり、次に最も近いスコアは2.2E−61であった。Peptide Searchによる検索では、45のペプチドがMCSPコア蛋白質に適合し、38ペプチドがそれに続く最も近い適合であった。
免疫系の細胞溶解経路の1つは、標的細胞に直接結合して、標的細胞の抗体依存性溶解を引き起こすことができるNK細胞を含む。NK細胞はまた、抗体のFcエフェクタードメインに結合して、抗体の標的ドメインに結合する細胞の抗体依存性溶解をもたらすことができる。この抗体依存性細胞を介する細胞溶解経路(ADCC)は同時に、Fcエフェクタードメインを含む免疫複合体の標的ドメインに結合する細胞の溶解も引き起こすはずである。免疫複合体E26−1及びG71−1に依存するADCC応答を試験するため、黒色腫細胞と線維芽細胞を蛍光色素カルセイン−AMで標識し、標識細胞をヒトNK細胞単独又はNK細胞と免疫複合体と共にインキュベートした。無傷のままで細胞中に保持された蛍光色素の量を測定することによって細胞溶解を検定した。E26−1についての結果(図2)は、免疫複合体及びNK細胞とのインキュベーション後、溶解黒色腫細胞のパーセンテージが免疫複合体なしで得られる基線値を上回って上昇し、NK細胞対黒色腫細胞の比率が20/1でほぼ100%に達した。黒色腫細胞の効率的な溶解に対し、線維芽細胞は、免疫複合体及びNK細胞とのインキュベーション後細胞溶解の有意の上昇を示さなかった。G71−1免疫複合体に関しても同様の結果が得られた。
本試験については、2個のクローンからのscFv分子を、ヒトIgG1−Fcエフェクタードメインを含む免疫複合体を構築するための標的ドメインとして使用した(図1)。2つの免疫複合体によってヒト黒色腫細胞から免疫沈降した蛋白質を、黒色腫関連硫酸コンドロイチンプロテオグリカン(MCSP)のコア蛋白質として質量分析法によって同定した(Bumol,T.F.& Reisfeld,R.A.(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79,1245−1249及びBumol,T.ら(1984)J.Biol.Chem.259,12733−12741)。MCSP分子は最初mAb 9.2.27によって認識される同種抗原として同定されたが、これはいくつかの他のmAbについての同種抗原であると思われる(Reisfeld,R.A.& Cheresh,D.A.(1987)Adv.Immunol.40,323−377;Wilson,B.S.ら(1981)Int.J.Cancer 28,293−300;Hellstrom,I.ら(1983)J.Immunol.130,1467−1472)。おそらくMCSPと同じである、黒色腫抗原HMW−MAAに結合するいくつかのscFv融合ファージクローンが、精製HMW−MAAに対するパニングによって合成ヒトscFvライブラリーから同定されている(Desai,S.A.ら(1998)Cancer Res.58,2417−2425)。MCSP分子は主として大部分のヒト黒色腫細胞の表面で発現されるが、グリア腫瘍の毛細管内皮細胞でも発現される。MCSPが、黒色腫細胞に対するパニングによって黒色腫患者のscFv融合ファージライブラリーから単離された少なくとも2つの黒色腫特異的クローンについての同種抗原であるという所見は、MCSPがin vivoでの支配的な黒色腫抗原であることを示唆する。
この実施例は、腫瘍血管系と腫瘍細胞の両方を標的する免疫療法治療が、ヒト黒色腫の重篤な複合型免疫欠損マウス異種移植モデルにおいて有望な成績を示したことを報告する。手順は、各々がヒトIgG1のFcエフェクタードメイン領域に複合した腫瘍標的ドメインから成る2つの免疫複合体の、SCIDマウスへの全身送達を伴った。エフェクタードメインは、ナチュラルキラー(NK)細胞及び補体による標的細胞に対しての細胞溶解性免疫応答を誘導する。免疫複合体は、複製不全アデノウイルスベクターにおいて分泌分子としてコードされる。
細胞系統
黒色腫細胞系統LXSN、TF2及びLXSN/VEGFを、レトロウイルス仲介のトランスフェクションとクローニングによってヒト黒色腫細胞系統YU−SIT1から誘導した。LXSN系統は対照レトロウイルスでトランスフェクションされており、低レベルのTFを発現する。TF2系統はTF cDNAをコードするレトロウイルスでトランスフェクションされており、高レベルのTFを発現する。LXSN/VEGF系統はVEGF cDNAをコードするレトロウイルスでトランスフェクションされており、高レベルのVEGFを発現する。ヒト腎細胞系統293をAmerican Type Culture Collectionから購入した。
scFv(G71−1)免疫複合体をコードするプラスミドベクターの構築を実施例1で述べた(配列番号:11参照)。マウス第VII因子(mfVII)免疫複合体をコードするベクターの構築のために、5'プライマーACGATCTTAAGCTTCCCCACAGTCTCATCATGGTTCCA(配列番号:7)及び3'プライマーACGGTAACGGATCCCAGTAGTGGGAGTCGGAAAACCCC(配列番号:8)を使用して、マウス肝臓cDNAライブラリー(Quick−Clone cDNA,Clonetech)からのPCRによってmfVII cDNAを増幅した。停止コドンを含まないリーダー及びコード配列を含む、増幅したmfVII cDNAを、ヒトIgG1 FcドメインをコードするcDNAと共にpcDNA3.1(+)ベクター(Invitrogen)のフレーム内のHindIII及びBamHI部位にクローニングした。ベクターDNAをHB101コンピテント細胞(Life Technologies)において増幅し、配列決定した。リシン−341をアラニンコドンで置換することによってmfVII cDNAの活性部位を突然変異させた(Dickinson,C.D.ら(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93,14379−14384)。突然変異誘発の手順は、QuickChange部位特定突然変異誘発マニュアル(Stratagene)の中で述べられているように実施した。5'プライマーはGGTACCAAGGACGCCTGCGCGGGTGACAGCGGTGGCCCA(配列番号:9)であり、3'プライマーはTGGGCCACCGCTGTCACCCGCGCAGGCGTCCTTGGTACC(配列番号:10)であった。活性部位突然変異を有するmfVII cDNAをmfVIIasmと称する。mfVIIasm cDNAを含むプラスミドをHB101コンピテント細胞に形質転換し、2×TY/カルベニシリン寒天上で形質転換コロニーを選択した。プラスミドDNAの配列は、mfVIIasm DNAにおけるlys−341コドン(AAG)のアラニンコドン(GCG)による置換を示した。
免疫複合体cDNAをCHO細胞に形質移入し、クローンを単離するための手順を実施例1で述べた。形質移入したCHO細胞をCHO血清不含培地(EX−CELL 301,JRH Biosciences)で培養した;mfVIIasm免疫複合体の合成のため、CHO血清不含培地に最終濃度1μg/mlまでビタミンK1(Sigma)を補足した。免疫複合体をプロテインAビーズ(Pierce)でのアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、濃縮して、Ultrafree−15 Biomax−50フィルター(Millipore)を通しての遠心分離によって脱塩し、Tris−HCl pH8.0 10mMに調整した。Bio−Rad蛋白質アッセイ手順によって免疫複合体の濃度を測定した。
黒色腫細胞を非酵素的解離溶液(Sigma)中で採集し、洗って、TBS/BSA/Ca2+(Tris−HCl pH7.4 10mM、NaCl 150mM、CaCl2 20mM、1%BSA及び0.1%NaN3)に再懸濁した。免疫複合体を加えて(最終濃度5μg/ml)、mfVIIasm免疫複合体については37℃で30分間、G71−1免疫複合体については氷上で30分間、細胞をインキュベートした;対照細胞は免疫複合体を加えずにインキュベートした。インキュベーション後、細胞をTBS/BSAで洗い、蛍光標識抗ヒトFcγ鎖(Vector Laboratories)と共に氷上で30分間インキュベートし、Becton−Dickenson FACsort装置で分析した。
アデノウイルスベクター系は、シャトルベクターpAdTrack−CMV及びpShuttle−CMVと、バックボーンベクターpAdEasy−1から成る(He,T.C.ら(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95,2509−2514)。免疫複合体cDNAを、HindIIIで消化してpcDNA3.1プラスミドベクターから単離し、次いでクレノウ断片で消化して3'陥凹末端を埋め、その後Not1で消化してcDNA挿入物を放出させ、それをアガロースゲル電気泳動によって精製した。シャトルベクターは、最初にKpn1で消化し、次にクレノウ断片で消化して、その後Not1で消化した。免疫複合体cDNAをT4 DNAリガーゼと共に16℃でひと晩インキュベートしてシャトルベクターにライゲートし、かかるシャトルベクターを熱ショックによってHB101コンピテント細胞に形質転換した。形質転換コロニーを2×TY/カナマイシン寒天上で選択し、シャトルベクターを抽出して精製した。精製シャトルベクターとpAdTrack−CMV DNAをPmelにより37℃で2時間消化した。シャトルベクターDNA 500ngとpAdEasy−1 DNA 100ngの混合物をBJ5183コンピテント細胞に電気穿孔し、細胞を37℃で15分間振とうして、LB/カナマイシン寒天に接種した。プレートを37℃でひと晩インキュベートし、形質転換コロニーを単離した。プラスミドDNAをミニプレップから精製し、0.6%アガロースゲルでの電気泳動によって組換えアデノウイルスDNAに関してスクリーニングした。
SCIDマウスはTaconic Laboratoriesからの4週齢から5週齢の雌性であった。マウスの右ひ腹に5×105のTF2又はLXSNヒト黒色腫細胞を皮下注射した。腫瘍が、皮膚表面下で触知可能な大きさ(〜5mm3)又は皮膚表面より上のより大きなサイズ(〜50mm3)に成長したあと、尾静脈を通して免疫複合体をコードするアデノウイルスベクター、又は対照として免疫複合体をコードしないアデノウイルスベクターをマウスに注入した。血液中に分泌される免疫複合体蛋白質の濃度を、一方の眼からの血液約0.1mlをヘパリン被覆した微小毛管に採集し、血液を遠心分離にかけて細胞を取り出すことによって測定した。上清血漿を炭酸水素ナトリウム緩衝液pH9.6で希釈し、プロ結合アッセイプレート(Falcon)の穴に分配して、プレートを37℃で2時間、次いで4℃でひと晩インキュベートした。穴をPBS中5%脱脂乳で30分間遮断し、PBSで3回洗って、5%脱脂乳中1:2000に希釈したペルオキシダーゼ標識抗ヒトIgG抗体を穴に加えた。プレートを室温で1時間インキュベートし、PBS中で洗って、ペルオキシダーゼ基質OPDを加え、マイクロプレートリーダーにおいて490nmで吸光度を測定した。蛋白質標準は、プロテインAビーズでのクロマトグラフィーによって精製したヒトIgG(Sigma)であった。
腫瘍と器官のパラフィン切片をPBS+0.3%H2O2中で30分間インキュベートし、TBS/BSA緩衝液中で30分間遮断した。TBS/BSA/Ca2+緩衝液中にmfVIIasm免疫複合体10μg/mlを含む溶液、又は対照として免疫複合体を含まない緩衝液を切片に加え、37℃で1時間インキュベートした。同じ緩衝液で3回洗った後、切片をアルカリホスファターゼで標識した抗ヒトγ鎖抗体と共に室温で1時間インキュベートして、青色を生じるBCIP/NBTで染色し、メチルグリーンで対比染色した。
免疫複合体の特性
scFv(G71−1)及び突然変異マウス第VII因子(mfVIIasm)免疫複合体をCHO細胞において合成し、プロテインAビーズでのアフィニティークロマトグラフィーによって培地から精製した。SDS−PAGEによる先の分析は、G71−1免疫複合体が、おそらくFcドメインのヒンジ領域間のジスルフィド架橋によって結合した、2つの同じ鎖から成ることを示した(実施例1)。mfVIIasm免疫複合体に関して同じ結果を得た。(配列番号:11及び配列番号:12参照)。mfVIIasm免疫複合体は2つの標的ドメインを持つので、単量体内因性fVII分子における1つの標的ドメインと比較して、2個のTF分子に協力的に結合し、TFを発現する細胞に対して内因性fVIIよりも強い結合をもたらすことができる。競合的FACSアッセイは、ヒトfVIIaが、ヒト黒色腫細胞上のアクセス可能部位の半数への結合に関して等モルベースでmfVIIasm免疫複合体と競合することを示した。これはおそらく、免疫複合体上の標的ドメインの1つだけがこれらの部位でTFに結合することができるからであろう。残りの部位へのmfVIIasm免疫複合体の結合は、10倍過剰のヒトfVIIaの存在下で競合することができず、免疫複合体分子の両方の標的ドメインがこれらの部位で結合することができ、強いアビディティ効果をもたらすことを示唆した。黒色腫細胞上のTF分子の約半分だけが第二TF分子に十分に近接していて、mfVIIasm免疫複合体上の両方の標的ドメインについて協力的結合部位を形成すると思われる。
SCIDマウスへの全身送達のために、各々の免疫複合体をpAdEasy−1に基づく複製不全アデノウイルスベクター系(Heら、前出)において分泌分子としてコードし、最初にヒト黒色腫細胞を皮下注入しておいたマウスの尾静脈に前記ベクターを注入した。最初の免疫療法試験は、触知可能なTF2異種移植片を発現したマウスに、各々のベクターを別個に、及び両方のベクターを一緒に注入することを伴った。合計3回の注入を週に1回の間隔で投与し、最後の注入から6日後に実験を終了した。1回目と2回目の注入後にELISAによって血液中の免疫複合体の濃度をモニターした(図5)。1回目の注入後の平均濃度は、G71−1免疫複合体については4mg/ml、mfVIIasm免疫複合体については0.04mg/mlであり、合成の速度がG71−1免疫複合体についてはmfVIIasm免疫複合体よりも約100倍高いことを示唆した。2回目の注射後各々の免疫複合体の濃度が上昇し、さらなる細胞がアデノウイルスに感染していたことを示した。皮膚表面に現われた腫瘍の大きさを二次元で測定し、腫瘍容積を評価するための測定法を用いて、異種移植片の成長をモニターした(図6)。免疫複合体をコードしないアデノウイルスを注入した対照マウスでは、腫瘍が比較的速い速度で持続的に成長し、20日後に約2,000mm3の平均容積に達した。免疫複合体をコードするアデノウイルスを注入したマウスでは、腫瘍の成長が阻害された;阻害はG71−1免疫複合体よりもmfVIIasm免疫複合体の方が強力であった。実験終了時にすべてのマウスが活動的なままであり、健康と思われ、肝臓、脾臓、肺、腎臓及び脳の組織学的検査は壊死、凝固又は出血の兆候を示さなかった。剖検後の腫瘍重量は、推定腫瘍容積と一致して、対照マウスでは免疫複合体で処置したマウスよりも低かった(図7)。腫瘍重量の最強の低下は、両方の免疫複合体で処置したマウスで起こった。
この実施例における免疫療法処置は、各々がヒトIgG1 H鎖のFc領域に複合した腫瘍標的ドメインから成り、カメリド(Camelid)H鎖抗体に類似したホモダイマー分子を形成する、2つの免疫複合体をSCIDマウスに全身送達することを伴った。1つの型の免疫複合体については、腫瘍標的ドメインは、異種移植片において黒色腫細胞によって発現される黒色腫抗原MCSPに結合するヒトscFv分子G71−1であった。他の型の免疫複合体では、腫瘍標的ドメインは、腫瘍血管系内皮細胞によって発現されるマウスTFと異種移植片において黒色腫細胞によって発現されるヒトTFの両方の組織因子(TF)に特異的且つ強力に結合するマウス第VII因子分子であった。第VII因子免疫複合体のTFへの結合から起こりうる播種性血管内凝固(DIC)の危険性を低下させるために、活性部位の突然変異をマウスfVII標的ドメイン(mfVIIasm)に導入し、血液凝固経路を開始させるために必要な蛋白質分解活性を阻害した。
この実施例は、ヒト皮膚及び転移性肺黒色腫のSCIDマウスモデル、及びマウス黒色腫の免疫コンピテントマウスモデルにおいて検討した癌治療のためのプロトコールの効果と安全性の試験を報告する。プロトコールは、標的新生血管系内皮細胞及び腫瘍細胞に対する細胞溶解性免疫応答を誘導する、本発明の免疫複合体をコードする複製不全アデノウイルスベクターの腫瘍内注入を伴った。マウスモデルの実験は、単独で又は一本鎖Fv免疫複合体と共に第VII因子免疫複合体を腫瘍内送達すると、正常器官への損傷の兆候を伴わずに、注入した腫瘍、そして同時に離れた非注入転移性腫瘍の成長の阻害と退縮も生じさせることを示した。おそらく新生血管系内皮細胞上の組織因子に結合した第VII因子免疫複合体によって仲介される、腫瘍新生血管系の広い範囲に及ぶ破壊が存在した。組織因子は一般に新生血管内皮細胞と腫瘍細胞で発現されるので、第VII因子免疫複合体は広い範囲のヒト腫瘍に対する免疫療法のために使用することができる。
細胞系統
LXSN、TF2及びYusac2はヒト黒色腫細胞系統であり、Cakiはヒト腎腫瘍細胞系統であり、LnCapはヒト前立腺癌細胞系統であり、A204はヒト神経線維芽細胞腫系統であり、B16F10はマウス黒色腫細胞系統であり、EMT6はマウス乳腺癌細胞系統であり、BT20はヒト乳癌細胞系統であり、Colo 357はヒト膵癌細胞系統であり、MSはヒト胃癌細胞系統であり、293はアデノウイルスベクターをパッケージングするために使用されるヒト腎細胞系統(ATCC、CRL−1573)である。培地は、LnCapを除くすべての腫瘍系統についてDMEM+10%FBSであった。LnCapはRPMI 1640+10%FBSで培養した。
1)mfVIIasm及びG71−1免疫複合体をコードするアデノウイルスベクターを作製し、精製するための上記実施例2で要約した手順を、次の修正を加えて使用した。シャトルベクターDNAをPmeIで消化した後、エタノール沈殿ステップの代わりにアガロースゲルでの電気泳動によってDNAを精製し、その後QIAEX IIキット(Qiagen)を用いてDNAバンドを単離した。2)精製した試料中のベクター濃度を、次のような感染粒子(IP)及び感染単位(IU)についてのアッセイによって測定した。(i)IPアッセイは、ベクター試料を溶解緩衝液(PBS中0.1%SDS)で20倍に希釈し、260nmで吸光度を測定することを含む;IPへの換算は、1O.D.単位=1×1012IPである。(ii)IUアッセイは、293細胞培養を連続希釈ベクター試料に感染させ、感染培養を2日間インキュベートして、細胞をベクターゲノムにおけるグリーン蛍光蛋白質(Green Fluorescent Protein,GFP)遺伝子の発現に関して蛍光顕微鏡で検査することを含む。GFP遺伝子を発現する細胞数からIU力価を算定する。IP及びIU力価は±10%以内で一致した。
腫瘍細胞を150mmの皿でほぼ集密まで増殖させ、10IU/細胞の感染多重度でmfVIIasmをコードするアデノウイルスに細胞を感染させた。感染細胞を無血清培地で4日間培養し、培地1.5mlをプロテインAビーズ(Pierce)の懸濁液10μlと混合して、4℃でひと晩回転流動した。SDS−PAGE負荷緩衝液15μl中80℃で3分間ビーズを加熱して、結合mfVIIasm免疫複合体を溶出し、溶離液をSDS−PAGEによって分別して、ニトロセルロース膜に移した。免疫複合体のバンドを、ヤギ抗ヒト又は抗マウスIgG(Fc特異的)プローブでの免疫染色によって検出した。
4から5週齢の雌性C.B−17 SCIDマウス(Taconic Farms)を免疫欠損マウスに関するすべての実験に使用した。ヒト黒色腫細胞系統LXSN又はTFの単層培養をPBS+2mM EDTA中で解離し、洗って、PBSに再懸濁した。5×105細胞を右ひ腹に皮下注入して皮膚腫瘍を生成し、6×105TF細胞を尾静脈に静脈内注入して転移性肺腫瘍を生成した。皮膚腫瘍の大きさをカリパスにより二次元で測定し、腫瘍容積を(幅)2(長さ)/2として評価した。皮膚腫瘍が約100mm3の容積まで成長したときに、ヒトFcエフェクタードメインを含むアデノウイルスベクターの腫瘍内注入を開始した。各々の注入ステップに関して、総容量50μlのベクター試料を腫瘍の3又は4部位に注入した。実験の終了時に剖検を実施して血液サンプルを採集し、腫瘍と正常器官を形態学的及び組織学的検査用に調製した。
4から5週齢の雌性C57BL/6マウス(Charles River Laboratories)を免疫コンピテントマウスに関するすべての実験に使用した。B16F10マウス黒色腫細胞の単層培養をPBS+2mM EDTAに懸濁し、洗って、PBSに再懸濁した。5×105細胞を右ひ腹に皮下注入して皮膚腫瘍を生成した。皮膚腫瘍が約140−325mm3の推定容積まで成長したときに、マウスFcエフェクタードメインを含むmfVIIasm免疫複合体をコードするアデノウイルスベクターの尾静脈注入を開始した。プロトコールの効果と安全性をモニターするための手順は、SCIDマウスについて上述したのと同じである。
マウスから血清サンプルを採集し、凍結して、標準診断キットを用いてグルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼについてアッセイした。
この試験に使用した2つの免疫複合体は、腫瘍標的ドメインとエフェクタードメインから成る(図1)。標的ドメインは、腫瘍血管内皮細胞及び腫瘍細胞で発現されるTFに結合するが、血液凝固を開始させない(実施例2)、突然変異マウス第VII因子分子(mfVIIasm)、若しくはヒト黒色腫細胞で選択的に発現されるその同種抗原に結合するscFv抗体G71−1のいずれかである(CaiとGaren,前出、及び実施例1)。エフェクタードメインは、標的細胞に対する細胞溶解性免疫応答を誘導するヒト又はマウスIgG1免疫グロブリンのFc領域である(実施例1)。免疫複合体を送達するためのベクターは、分泌形態の免疫複合体をコードする複製不全アデノウイルスである(実施例1)。実施例1において、免疫複合体をコードするベクターのSCIDマウスへの静脈内注入は腫瘍の成長を阻害したが、静脈内注入したベクターによる感染の主要標的である肝臓への組織学的損傷を引き起こした。一次感染が肝細胞から腫瘍細胞に再指令されうるかどうかを調べるため、ベクターをSCIDマウスにおいて増殖するヒト皮膚黒色腫に腫瘍内注入し、ベクターゲノムに挿入したグリーン蛍光蛋白質(GFP)遺伝子の発現によって腫瘍と肝臓におけるベクターの分布をマッピングした(図14)。腫瘍においては強いGFPの発現が検出されたが、肝臓では検出されず、注入した腫瘍がベクターによる感染の主要標的であることを示した。腫瘍におけるGFP発現のパターンは、注射針が横切る経路に隣接する数層の腫瘍細胞に限定されると思われた。
この実施例で述べた癌の免疫療法プロトコールは、腫瘍血管系及び腫瘍細胞に対する細胞溶解性免疫応答を仲介する免疫複合体分子をコードする、複製不全アデノウイルスベクターの腫瘍内注入を含む(図1)。ベクターに感染した細胞はコードされた免疫複合体を合成し、それらは血液中に分泌されて、腫瘍血管系内皮細胞及び腫瘍細胞上の同種標的に結合する。ベクターは主として肝細胞ではなく注入された腫瘍の細胞に感染するので、ベクターの腫瘍内注入は静脈内注入に比べて重要な安全上の利点を提供する。マウスの肝臓も他のいずれの器官も、繰り返された腫瘍内注入から深刻な損傷を示さなかった。黒色腫以外のいくつかの型のヒト腫瘍細胞も、ベクターに感染してコードされた免疫複合体を合成し、分泌することができる。それ故、ベクターの腫瘍内注入経路はヒト固体腫瘍に一般的に適用しうる。注入のためにアクセス可能な腫瘍がない場合には、罹病性の正常組織にベクターを注入することができるであろう。
Claims (11)
- リシン−341がアラニンに置換された第VII因子の突然変異形態を含む標的ドメインに複合したヒトIgG1免疫グロブリンのFcドメインを含む、免疫複合体蛋白質であって、組織因子に結合する、前記免疫複合体蛋白質。
- 標的ドメインが、リシン−341がアラニンに置換されたヒト第VII因子を含む、請求項1記載の免疫複合体。
- 免疫複合体蛋白質の標的ドメインが、セリン−344がアラニンに置換されたヒト第VII因子を含む、請求項1記載の免疫複合体。
- 免疫複合体蛋白質が、免疫複合体をコードする発現ベクターを含む細胞を培養するプロセスにより生産される、請求項1記載の免疫複合体。
- 発現ベクターが複製欠損アデノウイルスベクターである、請求項4記載の免疫複合体。
- 発現ベクターがアデノ関連発現ベクターである、請求項4記載の免疫複合体。
- 免疫複合体蛋白質が、各々が、ヒトIgG1免疫グロブリンのFc領域と標的ドメインを有する2つの同一の鎖の二量体を形成する、請求項1記載の免疫複合体。
- 免疫複合体蛋白質の標的ドメインが、セリン−344およびリシン−341のそれぞれがアラニンに置換されたヒト第VII因子を含む、請求項1記載の免疫複合体。
- 細胞障害性放射性タグをさらに含む、請求項1に記載の免疫複合体蛋白質。
- 第VII因子の突然変異形態が、リシン−341がアラニンに置換された天然ヒト第VII因子である、請求項1記載の免疫複合体蛋白質。
- 第VII因子の突然変異形態が、リシン−341がアラニンに置換され、かつセリン−344がアラニンに置換された天然ヒト第VII因子である、請求項1記載の免疫複合体蛋白質。
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