JP4746048B2 - 抗gfra1抗体のエフェクター機能を用いて細胞を障害する方法 - Google Patents
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Description
本発明は、抗GFRA1抗体のエフェクター機能を用いて細胞を障害する方法、またはこの目的のための組成物に関する。
乳癌は遺伝的に不均一な疾患であり、女性で最も一般的な悪性腫瘍である。全世界で毎年、推定で約80万件の新たな症例が報告されている(Parkin DM, Pisani P, Ferlay J (1999) CA Cancer J Clin 49:33-64(非特許文献1))。本疾患の処置のための同時併用的な選択肢のうち第一のものは乳房切除術である。原発性腫瘍の外科的除去を行っても、診断時点では検出不可能な微小転移(Saphner T, Tommey DC, Gray R (1996) J Clin Oncol, 14, 2738-2749(非特許文献2))のため、局所または遠隔部位での再発が起こる可能性がある。このような残存細胞または前癌細胞を死滅させるため、手術後には通常、補助療法として細胞毒性剤が投与される。
本アプローチにおいて、癌細胞に特異的に結合する抗体に薬剤を結合し、薬剤を癌細胞に特異的に作用させる。副作用が強い薬剤であっても、癌細胞に集中的に作用させることができる。薬剤に加えて、薬剤の前駆体、前駆体を活性型に代謝する酵素などを抗体に結合するアプローチも報告されている。
例えば増殖因子受容体または増殖因子に結合する抗体を用いて、増殖因子と癌細胞の結合を阻害するアプローチである。癌細胞には、増殖因子に依存して増殖するものがある。例えば、上皮細胞増殖因子(EGF)または血管内皮増殖因子(VEGF)依存性の癌が知られている。このような癌においては、増殖因子と癌細胞の結合を阻害することで治療効果が期待できる。
ある種の抗原に結合する抗体は、癌細胞に対して細胞障害作用を含む場合がある。このようなタイプの抗体は、抗体分子そのものが、直接的な抗腫瘍効果を含む。癌細胞に対して細胞障害作用を示す抗体は、高い抗腫瘍効果を期待される抗体薬剤として注目されている。
本発明者らは、細胞障害作用を誘導し、細胞において発現増加を示している遺伝子を標的とすることが可能な抗体を研究した。結果は、それらの細胞が抗GFRA1抗体に接触する場合、強力な細胞障害作用がGFRA1発現細胞において誘導され得ることを明らかとし、したがって、本発明は完成した。
[1]活性成分として抗GFRA1抗体を含む薬学的組成物であって、抗GFRA1抗体が、抗体エフェクター機能を用いてGFRA1発現細胞を障害する(すなわち、細胞を死滅させ、細胞に対して毒性であり、またはそうでなければ増殖もしくは細胞分裂を阻害する)、薬学的組成物。
[2]薬学的組成物は、GFRA1発現細胞と関連している任意の病理学的状態を処置するために用いられる。典型的な態様において、細胞は、乳癌、胃癌、肝臓癌、腎臓癌、または肺癌細胞のような癌細胞である。
[3]本発明の薬学的組成物における抗体は、典型的にモノクローナル抗体である。
[4]いくつかの態様において、本発明の抗体は、抗体依存性の細胞障害作用、補体依存性細胞障害作用、またはその両方のようなエフェクター機能を含む。
[5]GFRA1発現細胞を障害する方法は、以下の段階を含む:a)GFRA1発現細胞を抗GFRA1抗体と接触させる段階。抗体の結合の結果として、抗体のエフェクター機能がGFRA1発現細胞に障害(すなわち細胞障害作用)を引き起こす。
[6]GFRA1発現細胞に対するエフェクター機能を含む抗体を誘導するための免疫原性組成物。この組成物は、活性成分としてGFRA1ポリペプチド、その免疫学的活性断片、または、ポリペプチドもしくは断片を発現する核酸分子を典型的に含む。
[7]GFRA1ポリペプチド、その免疫学的活性断片、または、ポリペプチドもしくは断片を発現することができる細胞もしくはDNAを投与する段階を含む、GFRA1発現細胞に対するエフェクター機能を含む抗体を誘導する方法。
癌細胞の膜表面上の多くの抗原分子の発現、
癌組織内での抗原の均一な分布、
抗体と結合した抗原が長く細胞表面に留まっていること。
IgG、IgE、またはIgAクラスの免疫グロブリンのFc領域に特異的なFc受容体を含む細胞が存在する。対応するFc受容体を含む細胞は、細胞膜などに結合した抗体を認識して結合する。例えば、IgGクラス抗体は、T細胞、NK細胞、好中球、およびマクロファージ上のFc受容体に認識される。これらの細胞は、IgGクラス抗体のFc領域に結合して活性化され、抗体が結合した細胞に対する障害作用を発現する。抗体のエフェクター機能を介して細胞障害作用を獲得する細胞は、エフェクター細胞と呼ばれる。エフェクター細胞の種類に基づいて、ADCCを以下のように区別することができる:
ADMC:IgG依存性マクロファージ媒介細胞障害作用、および
ADCC:IgG依存性NK細胞媒介細胞障害作用。
抗原と結合した免疫グロブリンのFc領域は、補体系路を活性化することが知られている。免疫グロブリンのクラスにより、活性化経路が異なる場合があることも明らかにされている。例えばヒト抗体のうち、IgMおよびIgGが古典経路を活性化する。一方、IgA、IgD、およびIgEは、古典経路を活性化しない。活性化された補体は、多くの反応を経て、細胞膜障害活性を含むC5b-9膜侵襲複合体(MAC)を生成する。こうして生成されたMACは、エフェクター細胞に依存することなくウイルス粒子および細胞膜を障害すると考えられている。MACによる細胞障害作用は次のようなメカニズムに基づいている。MACは細胞膜に対する強い結合親和性を含む。細胞膜に結合したMACは細胞膜に穴をあけ、それによって細胞への水の流出入が容易となる。その結果、細胞膜が不安定化され、または浸透圧が変化し、細胞が破壊される。補体の活性化による細胞障害作用は、抗原に結合した抗体の近傍の膜にしか及ばない。そのため、MACによる細胞障害作用は抗体の特異性に依存している。ADCCとCDCは相互に依存することなく細胞障害作用を発現することができる。しかしながら実際には、生体内でこれらの細胞障害作用が、複合的に作用している場合もある。
病原体の感染能力および毒素の活性を奪う機能を有する抗体が存在する。抗体による中和は、抗原性可変領域の抗原への結合によって達成される場合と、補体の介在を必要とする場合がある。例えば、抗ウイルス抗体は、ウイルスの感染能の喪失のために補体の介在を必要とする場合がある。補体の関与には、Fc領域が必要である。すなわちこのような抗体は、ウイルスおよび細胞の中和のためにFcを必要とするエフェクター機能を含む抗体である。
1)GFRA1発現細胞を抗GFRA1抗体と接触させる段階、および
2)GFRA1発現細胞に結合し細胞を障害する抗体のエフェクター機能を用いる段階。
1)GFRA1に結合する抗体を癌患者に投与する段階、および
2)癌細胞に結合した抗体のエフェクター機能を用いて癌細胞を障害する段階。
以下、実施例に基づいて本発明をさらに説明する。
ヒト乳癌、胃癌、肝臓癌、腎臓癌、または肺癌細胞株は、10%ウシ胎仔血清を添加した適切な培地中で、単層として増殖させた。実験に用いた細胞株を表1に示す。
乳腺癌(BC):MCF-7。
乳癌:MDA-MB-453。
胃腺扁平上皮癌:MKN1。
肝細胞癌(HCC):SNU-398。
腎細胞腺癌(RCC):ACHN。
非小細胞肺癌(NSCLC):NCI-H1793。
標準のプロトコールに従い、個々のタンパク質特異的抗体を、細菌内で発現させたHisタグ付加融合タンパク質を免疫原として用いて産生させた。これらの融合タンパク質はタンパク質の一部(24〜465残基)に相当するタンパク質部分を含んだ。
総RNAはRneasy(登録商標)キット(QIAGEN)を用いて細胞株から抽出した。さらに、mRNAを、オリゴ(dT)-セルロースカラム(Amersham Biosciences)によって総RNAから精製し、SuperScriptファーストストランド合成システム(Invitrogen)を用いて、逆転写(RT)によってファーストストランドcDNAへと合成した。GAPDHを定量対照としてモニタリングすることにより、その後のPCR増幅のための各ファーストストランドcDNAの適切な希釈物を調製した。本発明者らが用いたプライマー配列は以下である:
GFRA1に対して、5'-CTGAAGCAGAAGTCGCTCTA-3'(SEQ ID NO:3)および
5'-GACAGCTGCTGACAGACCTT-3'(SEQ ID NO:4)、
GAPDHに対して、5'-GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3'(SEQ ID NO:5)および
5'-GGTTGAGCACAGGGTACTTTATT-3'(SEQ ID NO:6)。
PCR反応は全て、GeneAmp PCRシステム9700(PE Applied Biosystems)により、94℃ 2分間の初期変性を含み、94℃ 30秒間、58℃ 30秒間、および72℃ 1分間の21サイクル(GAPDHの場合)または30〜40サイクル(GFRA1の場合)からなった。
癌細胞(5×106)を精製ポリクローナル抗体(pAb)またはウサギIgG(対照)と共に、4℃で30分間インキュベーションした。細胞をリン酸緩衝溶液(PBS)で洗浄した後、FITC標識Alexa Flour 488中4℃で30分間インキュベーションした。細胞をPBSで再度洗浄し、フローサイトメーター(FACSCalibur(登録商標)、Becton Dickinson)で分析してBD CellQuest(商標)Proソフトウェア(Becton Dickinson)により解析した。平均蛍光強度(MFI)は、フローサイトリー強度の比率(各タンパク質特異的抗体による強度/ウサギIgGによる強度)として定義した。
標的細胞を、0.8μMのカルセインアセトキシメチルエステル(カルセイン-AM、DOJINDO)と共に、37℃で30分間曝露した。カルセイン-AMは、蛍光性誘導体カルセインを産生する細胞エステラーゼによるカルセイン-AMの切断後、蛍光性となる。アッセイ用に添加する前に標的癌細胞を2回洗浄し、その後96ウェルU底プレートに播種した(4×103細胞/ウェル)。ヒト末梢血単核細胞(PMBC)を健常者から採取し、Ficoll-Paque(Amersham Biosciences)密度勾配遠心分離により分離し、エフェクター細胞として使用した。標的癌細胞(T)およびエフェクター細胞(E)を、様々なE:T比(50:1、25:1、12.5:1、および6.25:1)で、Br003 抗GFRA1抗体(2μg/ウェル)または対照抗体ハーセプチン(2μg/ウェル;Roche)と共に、96ウェルU底プレートでAIM-V培地200μl中で共インキュベーションした。このインキュベーションは、200μLのAIM-V培地(Life Technologies, Inc)中で、37℃で6時間、三連で行った。対照アッセイには、抗GFRA1抗体Br003またはエフェクター細胞のみと共に標的細胞をインキュベーションすることを含んだ。ハーセプチンは、いくつかの実験において対照として用いた。
本発明は、GFRA1発現細胞を抗体の細胞障害作用によって障害できるという知見に、少なくとも一部基づいている。GFRA1は、乳癌、胃癌、肝臓癌、腎臓癌、または肺癌で強く発現している遺伝子として本発明者らにより同定された。したがって、GFRA1発現細胞と関連する疾患、例えば乳癌、胃癌、肝臓癌、腎臓癌、または肺癌の処置は、GFRA1に結合する抗体を用いて適宜行われる。実際、本発明者らが確認した結果は、乳癌、胃癌、肝臓癌、腎臓癌、または肺癌細胞株において、GFRA1抗体の存在下でのADCC効果による細胞障害作用を示した。
Claims (3)
- Fc領域を含む抗GFRA1抗体を活性成分として含む、GFRA1発現細胞を破壊するための薬学的組成物であって、GFRA1発現細胞が、乳癌、胃癌、肝臓癌、腎細胞腺癌、または肺癌細胞である薬学的組成物。
- 抗GFRA1抗体がモノクローナル抗体である、請求項1記載の薬学的組成物。
- 抗GFRA1抗体のGFRA1発現細胞を破壊するための薬学的組成物の製造における使用であって、前記GFRA1発現細胞が、乳癌、胃癌、肝臓癌、腎細胞腺癌、または肺癌細胞である使用。
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