ES2348161T3 - Métodos para dañar células usando funciones efectoras de anticuerpos anti-gfra1. - Google Patents

Abstract

Composición para su uso en el tratamiento de un cáncer que expresa GFRA1, comprendiendo la composición un anticuerpo anti-GFRA1 como principio activo, en la que el anticuerpo 5 comprende una función efectora de anticuerpo, en la que dicha función efectora es o bien citotoxicidad dependiente de anticuerpo o bien citotoxicidad dependiente de complemento, o ambas.

Description

Campo técnico

La presente invención se refiere a métodos para dañar células usando la función efectora de anticuerpos anti-GFRA1, o a composiciones para este fin.

Técnica anterior

El cáncer de mama, una enfermedad genéticamente heterogénea, es el tumor maligno más común en las mujeres. Una estimación de aproximadamente 800000 nuevos casos se notificó cada año a nivel mundial (Parkin DM, Pisani P, Ferlay J (1999). CA Cancer J Clin 49: 33-64). La mastectomía es la primera opción concurrente para el tratamiento de esta enfermedad. A pesar de la extirpación quirúrgica de los tumores primarios, puede producirse una recidiva en sitios localizados o distantes debido a micrometástasis no detectable (Saphner T, Tommey DC, Gray R (1996). J Clin Oncol, 14, 2738-2749) en el momento del diagnóstico. Los agentes citotóxicos se administran habitualmente como tratamiento complementario tras cirugía con el propósito de destruir aquellas células precancerosas o residuales.

El tratamiento con agentes quimioterápicos convencionales es a menudo empírico y se basa en gran parte en parámetros histológicos del tumor, y en la ausencia de un entendimiento mecanístico específico. Por tanto, los fármacos dirigidos a una diana se están convirtiendo en el tratamiento base para el cáncer de mama. Se ha demostrado que inhibidores de aromatasa y tamoxifeno, dos representantes de esta clase, tienen importantes respuestas usados como adyuvante o quimioprevención en pacientes con cáncer de mama con metástasis (Fisher B, Costantino JP, Wickerham DL, Redmond CK, Kavanah M, Cronin WM, Vogel V, Robidoux A, Dimitrov N, Atkins J, Daly M, Wieand S, Tan-Chiu E, Ford L, Wolmark N (1998). J Natl Cáncer Inst, 90, 1371-1388; Cuzick J (2002). Lancet 360, 817-824). Sin embargo, el

inconveniente es que sólo los pacientes que expresan receptores de estrógeno son sensibles a estos fármacos. Recientes preocupaciones se plantearon incluso respecto a sus efectos secundarios que recaían particularmente en la posibilidad de provocar cáncer de endometrio en el tratamiento a largo plazo con tamoxifeno así como un efecto perjudicial de fractura ósea en las mujeres postmenopáusicas en pacientes a las que se les prescribió aromatasa (Coleman RE (2004). Oncology. 18 (5 Supl. 3), 16-20). Debido a la aparición de efecto secundario y resistencia a fármacos, es obviamente necesario buscar dianas moleculares novedosas para fármacos inteligentes selectivos basándose en los mecanismos de acción caracterizados.

El cáncer gástrico es una de las principales causas de muerte por cáncer en el mundo, particularmente en el Extremo Oriente, con aproximadamente 700.000 nuevos casos diagnosticados a nivel mundial anualmente. La cirugía es el pilar en cuanto al tratamiento, debido a que la quimioterapia permanece sin resultados satisfactorios. Los cánceres gástricos en un estadio temprano pueden curarse mediante resección quirúrgica, pero el pronóstico de los cánceres gástricos avanzados sigue siendo muy malo.

El carcinoma hepatocelular (CHC) es uno de los cánceres más comunes a nivel mundial y su incidencia va en aumento gradualmente en Japón así como en los Estados Unidos (Akriviadis EA, et al., Br J Surg. 1998 Oct; 85(10):1319-31). Aunque los avances médicos recientes han realizado un gran progreso en el diagnóstico, un gran número de pacientes con CHC todavía se diagnostican en estadios avanzados y su curación completa de la enfermedad sigue siendo difícil. Además, dado que los pacientes con cirrosis hepática o hepatitis crónica tienen un alto riesgo de CHC, pueden desarrollar múltiples tumores de hígado, o nuevos tumores incluso tras la extirpación completa de los tumores iniciales. Por tanto, el desarrollo de fármacos quimioterápicos altamente eficaces y estrategias preventivas son asuntos de preocupación constante.

El carcinoma de células renales (CCR) es el tercer tumor maligno más común del sistema genitourinario y corresponde al 2

3% de todos los tumores malignos humanos. La resección quirúrgica es el tratamiento más eficaz para los pacientes con tumores de CCR localizados, pero tal tratamiento para pacientes con CCR en estadio avanzado no es satisfactorio. Aunque se ha notificado que algunos tratamientos biomédicos muestran una tasa de respuesta de 20%, a menudo provocan reacciones adversas graves y no mejoran generalmente la supervivencia de los pacientes. Entre los pacientes que tienen tratamiento quirúrgico, aproximadamente el 25-30% recaen tras la cirugía (Ljungberg B., Alamdari F. I., Rasmuson T. & Roos G. Follow-up guidelines for nonmetastatic renal cell carcinoma based on the occurrence of metastases after radical nephrectomy. BJU Int. 84, 405-411 (1999); Levy DA., Slaton JW., Swanson DA. & Dinney CP. Stage specific guidelines for surveillance after radical nephrectomy for local renal cell carninoma. J Urol. 159, 11631167 (1998)). El estadio del tumor y la respectiva cirugía son los factores pronósticos más importantes para el CCR; sin

embargo,

hasta la fecha, se conoce poco de los mecanismos

moleculares

subyacentes que influyen en esta va riedad en

pronósticos.

Los tumores de CCR pueden subdividirse basándose en las características histológicas en carcinomas de células claras (80%), papilar (10%), cromófobo (< 5%), granular, fusiforme y asociado a quiste (5-15%). Cada uno de estos subtipos histológicos muestra un comportamiento clínico único, tendiendo los tipos de células claras y granular a mostrar fenotipos clínicos más agresivos.

El cáncer de pulmón es uno de los tumores humanos letales más comunes. El cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) es la forma más común, representando aproximadamente el 80% de los tumores de pulmón (American Cancer Society, Cancer Facts and Figures 2001, Am. Chem. Soc. Atlanta, 2001). La mayoría de los CPCNP no se diagnostican hasta un estadio avanzado, y por tanto la tasa de supervivencia a 10 años global se ha quedado baja en el 10%, a pesar de avances recientes en tratamientos multimodales (Fry et al., Cancer, 86: 1867-76, 1999).

Actualmente, se considera que la quimioterapia que usa platino es un tratamiento fundamental para los CPCNP. Sin embargo, la acción terapéutica de agentes farmacéuticos no ha progresado más allá del punto de poder prolongar la supervivencia de los pacientes con CPCNP avanzado hasta un cierto grado (Chemotherapy in non-small cell lung cancer: a meta-analysis using updated data on individual patients from 52 randomized clinical trials, Non-small Cell Lung Cancer Collaborative Group, Bmj. 311: 899909, 1995). Varios tratamientos dirigidos están investigándose, incluyendo aquéllos que usan inhibidores de tirosina cinasa. Sin embargo, hasta la fecha, se han conseguido resultados prometedores sólo en un número limitado de pacientes y, en algunos pacientes, los efectos terapéuticos se han acompañado de efectos secundarios graves (Kris et al., Proc Am Soc Clin Oncol,

21: 292a (A1166), 2002).

La investigación dirigida a la elucidación de los mecanismos carcinógenos ha revelado una serie de moléculas diana candidatas para agentes antitumorales. Por ejemplo, el inhibidor de la farnesiltransferasa (FTI) es eficaz en la terapia de tumores dependientes de Ras en modelos animales (Sun J, et al., Oncogene. Marzo de 1998; 16(11):1467-73). Este agente farmacéutico se desarrolló para inhibir rutas de señales de crecimiento en relación con Ras, que depende de la farnesilación post-transcripcional. Los ensayos clínicos humanos en los que se aplicaron agentes antitumorales en combinación con el anticuerpo monoclonal anti-HER2 trastuzumab con el propósito de antagonizar el protooncogén HER2/neu han tenido éxito en mejorar la respuesta clínica, y han mejorado la tasa de supervivencia global de pacientes con cáncer de mama (Molina MA, et al., Cancer Res. 2001 Jun 15; 61(12): 4744-9).

El inhibidor de tirosina cinasa STI-571 es un inhibidor que desactiva selectivamente la proteína de fusión bcr-ab1. Este agente farmacéutico se desarrolló para el tratamiento de leucemia mieloide crónica, en la que la activación constante de la tirosina cinasa bcr-ab1 tiene un papel significativo en la transformación de los glóbulos blancos. Tales agentes farmacéuticos se diseñan para inhibir la actividad carcinógena

de productos génicos específicos (O’Dwyer ME & Druker BJ. Curr Opin Oncol. 2000 Nov; 12(6):594-7). Por tanto, en células cancerosas, los productos génicos con expresión estimulada son habitualmente dianas potenciales para el desarrollo de agentes antitumorales novedosos.

Otra estrategia para el tratamiento del cáncer es el uso de anticuerpos que se unen a células cancerosas. Los siguientes son mecanismos representativos de tratamiento del cáncer mediado por anticuerpos:

Terapia misil: en este enfoque un agente farmacéutico se une a un anticuerpo que se une específicamente a células cancerosas, y entonces el agente actúa específicamente sobre las células cancerosas. Incluso puede hacerse que agentes con fuertes efectos secundarios actúen intensamente sobre las células cancerosas. Además de los agentes farmacéuticos, también existen informes de enfoques en los que precursores de agentes farmacéuticos, enzimas que metabolizan los precursores a una forma activa, etc. se unen a los anticuerpos.

El uso de anticuerpos que se dirigen a moléculas funcionales: este enfoque inhibe la unión entre factores de crecimiento y células cancerosas usando, por ejemplo, anticuerpos que se unen a receptores de factores de crecimiento

o factores de crecimiento. Algunas células cancerosas proliferan dependiendo de factores de crecimiento. Por ejemplo, se conocen cánceres que dependen del factor de crecimiento epitelial (EGF)

o factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Para tales cánceres, puede esperarse que la inhibición de la unión entre un factor de crecimiento y las células cancerosas tenga un efecto terapéutico.

Citotoxicidad por anticuerpos: los anticuerpos que se unen a ciertos tipos de antígenos pueden comprender una citotoxicidad con respecto a las células cancerosas. Con estos tipos de anticuerpos, la propia molécula de anticuerpo comprende un efecto antitumoral directo. Los anticuerpos que muestran citotoxicidad con respecto a las células cancerosas están ganando atención como agentes con anticuerpos que se espera que sean altamente eficaces contra los tumores. Se encuentra que el

receptor alfa 1 de la familia de factores neurotróficos derivados de línea celular glial (GFRA1) se expresa en el riñón en desarrollo (EHRENFELS, et al., Dev Genet. 1999; 24(3-4):26372). Se proporciona un anticuerpo policlonal anti-GFRA1 (EHRENFELS, et al.; MATSUO, et al., Brain Res. 17 de marzo de 2000; 859(1):57-71; KLEIN RD, et al., documento WO 97/33912; y WIESENHOFER, et al., Acta Neuropathol. Febrero de 2000; 99(2):131-7). KLEIN RD enseña la aplicación terapéutica de anticuerpos que neutralizan GFRA1 en el tratamiento de los tumores celulares. Sin embargo, en KLEIN RD, no hay ningún ejemplo que indique el efecto terapéutico de los anticuerpos que neutralizan GFRA1.

Descripción de la invención

Los presentes inventores investigaron anticuerpos que pueden inducir citotoxicidad, que se dirigen a genes que muestran una expresión aumentada en células. Los resultados revelaron que puede inducirse una potente citotoxicidad en células que expresan GFRA1 cuando aquellas células se ponen en contacto con anticuerpos anti-GFRA1, completando así la presente invención.

Específicamente, la presente invención se refiere a las siguientes composiciones farmacéuticas o métodos:

[1] Composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo anti-GFRA1 como principio activo, en las que el anticuerpo anti-GFRA1 daña (es decir, destruye la célula, es tóxico para la célula, o inhibe de otro modo el crecimiento o la división celular) una célula que expresa GFRA1 usando la función efectora del anticuerpo.

[2] Las composiciones farmacéuticas se usan para tratar cualquier estado patológico asociado con células que expresan GFRA1. En realizaciones típicas, la célula es una célula cancerosa, tal como célula de cáncer de mama, gástrico, de hígado, renal o de pulmón.

[3] Los anticuerpos en las composiciones farmacéuticas de la invención son normalmente anticuerpos monoclonales.

[4] En algunas realizaciones, el anticuerpo de la invención comprende una función efectora tal como citotoxicidad dependiente de anticuerpo, citotoxicidad dependiente de complemento, o ambas.

[5] Métodos para dañar una célula que expresa GFRA1, que

comprenderá las etapas de: a) poner en contacto la célula que expresa GFRA1 con un anticuerpo anti-GFRA1. Como resultado de la unión del anticuerpo, la función efectora del anticuerpo provocará un daño (es decir, citotoxicidad) a la célula que expresa GFRA1.

[6] Composiciones inmunogénicas para inducir un anticuerpo que comprende una función efectora contra una célula que expresa GFRA1. Las composiciones comprenden normalmente como principio activo, un polipéptido de GFRA1, un fragmento inmunológicamente activo del mismo, o una molécula de ácido nucleico que expresa los polipéptidos o fragmentos.

[7] Métodos para inducir un anticuerpo que comprende una función efectora contra una célula que expresa GFRA1, en los que el método comprende administrar un polipéptido de GFRA1, un fragmento inmunológicamente activo del mismo, o una célula o un ADN que puede expresar los polipéptidos o fragmentos.

La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas para dañar células que expresan GFRA1 usando la función efectora de anticuerpo, comprendiendo las composiciones como principio activo un anticuerpo anti-GFRA1. La presente invención también se refiere a usos de un anticuerpo anti-GFRA1 para producir composiciones farmacéuticas para dañar células que expresan GFRA1 usando la función efectora de anticuerpo antiGFRA1. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden anticuerpos anti-GFRA1 y vehículos farmacéuticamente aceptables. Los presentes inventores usaron micromatrices de ADNc para el análisis de la expresión génica de células de cáncer de mama y células normales extraídas de pacientes con cáncer de mama.

Posteriormente se identificaron una serie de genes con expresión específicamente potenciada en células de cáncer de

mama. De estos genes con expresión alterada en células de cáncer de mama, un gen, el gen del receptor alfa 1 de la familia de factores neurotróficos derivados de línea celular glial (GDNF) (GFRA1) que codifica para una proteína de membrana citoplasmática con bajos niveles de expresión en órganos principales se seleccionó como gen diana candidato para tratamientos del cáncer. Seleccionando genes con bajos niveles de expresión en órganos principales, se creía que podía evitarse el peligro de efectos secundarios. Entre la proteína codificada por los genes seleccionados de este modo, se confirmó que los anticuerpos anti-GFRA1 tenían funciones efectoras contra las células que expresaban GFRA1. Además, se confirmó un efecto similar en otras líneas celulares de cáncer, tales como las líneas celulares de cáncer gástrico, de hígado, renal y de pulmón que este gen sobre-expresaba.

Los hallazgos obtenidos por los presentes inventores muestran que, en un sistema de expresión forzado, GFRA1 etiquetado con c-myc-His se localizaba en la membrana citoplasmática, lo que se confirmó usando microscopía de inmunofluorescencia. El gen de GFRA1 codifica para una secuencia de aminoácidos que se espera que comprenda un péptido señal en su extremo N-terminal. Tal como se mencionó anteriormente, se observó que esta proteína se localizaba principalmente en la membrana citoplasmática, y por tanto se creía que era una proteína transmembrana. Además, el bajo nivel de expresión de este gen en órganos principales, y su alta expresión en células de cáncer de mama, establece que GFRA1 es útil como marcador clínico y diana terapéutica.

Las condiciones requeridas para destruir células cancerosas usando la función efectora son, por ejemplo, las siguientes:  expresión de grandes números de moléculas antigénicas en la superficie de la membrana de células cancerosas,  distribución uniforme de los antígenos dentro de los tejidos cancerosos,  permanencia de los antígenos unidos a los anticuerpos en la superficie celular durante un largo tiempo.

Más específicamente, por ejemplo, antígenos reconocidos por anticuerpos deben expresarse en la superficie de la membrana celular. Además, es preferible que la razón de células positivas para antígeno sea tan alta como sea posible en células que forman tejidos cancerosos. En una situación ideal, todas las células cancerosas son positivas para antígeno. Cuando se mezclan células negativas y positivas para antígeno en poblaciones de células cancerosas, puede no esperarse el efecto terapéutico clínico de los anticuerpos.

Habitualmente, cuando se expresan tantas moléculas como sea posible en la superficie celular, pueden esperarse funciones efectoras potentes. También es importante que los anticuerpos unidos a los antígenos no se capten hacia el interior de las células. Algunos receptores se captan hacia el interior de las células (endocitosis) tras unirse a un ligando. Igualmente, los anticuerpos unidos a los antígenos de superficie celular también pueden captarse hacia el interior de la célula. Este tipo de fenómeno, mediante el cual los anticuerpos se captan hacia el interior de las células, se denomina internalización. Cuando se produce la internalización, la región constante (Fc) del anticuerpo se capta hacia el interior de la célula. Sin embargo, las células o moléculas esenciales para la función efectora están en el exterior de las células que expresan antígenos. Por tanto, la internalización inhibe la función efectora de anticuerpo. Por tanto, cuando se espera la función efectora de anticuerpo, es importante seleccionar un antígeno que provoque menos internalización de anticuerpos. Los presentes inventores revelaron por primera vez que GFRA1 es un antígeno diana que posee una propiedad de este tipo.

“Función efectora” en la presente invención se refiere a citotoxicidad implicada con las regiones Fc de los anticuerpos. Alternativamente, las funciones que dirigen el efecto mediante el cual las regiones Fc de los anticuerpos unidos a los antígenos dañan las células que comprenden aquellos antígenos, también pueden denominarse función efectora de anticuerpo. Específicamente, la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (CCDA), la citotoxicidad dependiente

de complemento (CDC) y la actividad neutralizante se conocen como funciones efectoras de anticuerpo. Cada función se describe a continuación.

Citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (CCDA):

Existen células que comprenden receptores Fc específicos para la región Fc de las clases de inmunoglobulina IgG, IgE o IgA. Las células que comprenden un receptor Fc correspondiente reconocen y se unen a anticuerpos unidos a membranas celulares o etc. Por ejemplo, un anticuerpo de clase IgG se reconoce por receptores Fc en células T, células NK, neutrófilos y macrófagos. Estas células se unen a y se activan por la región Fc de los anticuerpos de clase IgG, y expresan citotoxicidad contra las células a las que se han unido estos anticuerpos. Las células que adquieren citotoxicidad por medio de la función efectora de anticuerpo se denominan células efectoras. La CCDA puede dividirse basándose en el tipo de célula efectora, tal como sigue:

CMDA: citotoxicidad mediada por macrófagos dependientes de

IgG, y

CCDA: citotoxicidad mediada por células NK dependientes de

IgG.

No existe ninguna limitación sobre los tipos de células efectoras en la CCDA de la presente invención. En otras palabras, la CCDA de la presente invención también comprende CMDA, en la que los macrófagos son las células efectoras.

Se conoce que la CCDA de anticuerpos es un mecanismo importante de los efectos antitumorales, particularmente en tratamientos del cáncer que usan anticuerpos (Nature Med., 6: 443-446, 2000). Por ejemplo, se ha notificado una estrecha relación entre el efecto terapéutico de anticuerpos quiméricos de anticuerpo anti-CD20 y CCDA (Blood, 99: 754-758, 2002). Por tanto, la CCDA también es particularmente importante entre las funciones efectoras de anticuerpo en la presente invención.

Por ejemplo, se cree que la CCDA es un mecanismo importante en los efectos antitumorales de Rituxan, Herceptin, etc., para

los que ya ha comenzado la aplicación clínica. Rituxan y Herceptin son agentes terapéuticos para el linfoma no Hodgkin y el cáncer de mama metastásico, respectivamente.

Hoy en día, el mecanismo para la citotoxicidad mediada por CCDA se explica aproximadamente tal como sigue: se cree que las células efectoras, que se unen en puente a las células diana por medio de anticuerpos unidos a la superficie celular, inducen la apoptosis de las células diana transmitiendo algún tipo de señal letal a las células objetivo. En cualquier caso, los anticuerpos que inducen citotoxicidad mediante células efectoras están comprendidos en los anticuerpos que comprenden la función efectora de la presente invención.

Citotoxicidad dependiente de complemento (CDC):

Se conoce que las regiones Fc de inmunoglobulinas unidas a antígenos activan rutas complementarias. También se ha revelado que la ruta de activación puede diferir dependiendo de la clase de inmunoglobulina. Por ejemplo, de los anticuerpos humanos, IgM e IgG activan la ruta clásica. Por otro lado, IgA, IgD e IgE no activan esta ruta. Los complementos activados producen, por medio de una serie de reacciones, un complejo de ataque de membrana C5b-9 (CAM) que comprende actividad dañina de membrana celular. Se cree que los CAM generados de este modo dañan partículas virales y membranas celulares, independientemente de las células efectoras. El mecanismo para la citotoxicidad mediada por CAM se basa en lo siguiente. Los CAM comprenden una fuerte afinidad de unión por las membranas celulares. Los CAM unidos a una membrana celular abren un orificio en la membrana celular, facilitando que el agua entre y salga de la célula. Como resultado, se desestabiliza la membrana celular, o se cambia la presión osmótica, y se destruye la célula. La citotoxicidad debida a un complemento activado sólo se extiende a la membrana cercana al anticuerpo que se ha unido al antígeno. Por este motivo, la citotoxicidad mediada por CAM depende de la especificidad del anticuerpo. La CCDA y la CDC pueden expresar una citotoxicidad independiente de la otra. Sin embargo, en la

práctica, estas citotoxicidades pueden funcionar en conjunto en organismos vivos.

Actividad neutralizante:

Existen anticuerpos que tienen la función de privación de la infectividad de patógenos y la actividad de toxinas. La neutralización mediada por anticuerpos puede conseguirse mediante la unión de una región variable antigénica a un antígeno, o puede requerir mediación por complemento. Por ejemplo, en algunos casos, los anticuerpos antivirales requieren mediación del complemento con el fin de privar a un virus de su infectividad. Las regiones Fc son esenciales para la participación de los complementos. Por tanto, tales anticuerpos comprenden función efectora que requiere Fc para neutralizar los virus y células.

En la presente invención, también puede explicarse la función efectora como un papel que determina la actividad biológica desencadenada por el reconocimiento de antígeno de un anticuerpo. En el presente documento, células diana preferibles son células cancerosas. Además, las funciones celulares efectoras llevadas a cabo por las regiones Fc de diversos anticuerpos se basan fuertemente en la clase de anticuerpo. La región Fc de los anticuerpos de clase IgG, IgE e IgA se une cada una a un receptor Fc específico, y, por ejemplo, activa células que tienen receptores Fc, y funcionan en el transporte intracelular de anticuerpos. En particular, los anticuerpos de clase IgG activan células efectoras por medio de receptores Fc en estas células, y entonces destruyen células diana a las que se unen las regiones variables de los anticuerpos. Esto se denomina citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (CCDA). En la CCDA, células T, células NK, neutrófilos, macrófagos o similares funcionan como células efectoras. Por otro lado, la función de activación del complemento se limita a anticuerpos de clase IgM e IgG. Particularmente, la función de lisis de células a las que se unen las regiones variables de anticuerpos se denomina citotoxicidad dependiente de complemento (CDC).

De éstas, las funciones efectoras preferibles en el presente documento son o bien CCDA o bien CDC, o ambas. La presente invención se basa en el hallazgo de que anticuerpos anti-GFRA1 se unen a células que expresan GFRA1, y entonces expresan una función efectora.

La presente invención también se refiere a métodos para dañar células que expresan GFRA1, que comprenden las siguientes etapas:

1) poner en contacto las células que expresan GFRA1 con

anticuerpos anti-GFRA1, y

2) usar la función efectora de los anticuerpos que se han

unido a las células que expresan GFRA1 para dañar las

células.

En los métodos o composiciones farmacéuticas de la presente invención, puede dañarse o destruirse cualquier célula que expresa GFRA1. Por ejemplo, son preferibles células de cáncer de mama, gástrico, de hígado, renal o de pulmón como las células que expresan GFRA1 de la presente invención. De éstas, son preferibles células de adenocarcinoma de mama, carcinoma de mama, carcinoma adenoescamoso del estómago, carcinoma hepatocelular (CHC), adenocarcinoma de células renales (CCR) o cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP).

Pueden ponerse en contacto las células y los anticuerpos in vivo o in vitro. Cuando se seleccionan como diana células cancerosas in vivo como las células que expresan GFRA1, los métodos de la presente invención son de hecho métodos terapéuticos o métodos preventivos para cánceres. Específicamente, la presente invención proporciona métodos terapéuticos para cánceres que comprenden las siguientes etapas:

1) administrar un anticuerpo que se une a GFRA1 a un paciente

con cáncer, y

2) dañar células cancerosas usando la función efectora del

anticuerpo unido a aquellas células.

Los presentes inventores confirmaron que los anticuerpos que se unen a GFRA1 dañan eficazmente las células que expresan GFRA1, en particular, células de cáncer de mama, gástrico, de hígado, renal o de pulmón, usando la función efectora. Los

presentes inventores también confirmaron que GFRA1 se expresa altamente en células de cáncer de mama, gástrico, de hígado, renal o de pulmón, con una alta probabilidad. Además, los niveles de expresión de GFRA1 en tejidos normales son bajos. Reuniendo esta información, los métodos de tratamiento de cáncer de mama, gástrico, de hígado, renal o de pulmón en los que se administra un anticuerpo anti-GFRA1 pueden ser eficaces, con poco peligro de efectos secundarios.

Los anticuerpos de la presente invención no se limitan siempre que comprendan una función efectora deseada. Por ejemplo, los anticuerpos que comprenden la región Fc de IgA, IgE

o IgG son esenciales para expresar CCDA. Igualmente, la región Fc de anticuerpo de IgM o IgG es preferible para expresar CDC. Por tanto, los anticuerpos derivados de seres humanos que pertenecen a estas clases son preferibles en la presente invención. Pueden adquirirse los anticuerpos humanos usando células productoras de anticuerpos recolectadas de seres humanos, o animales quiméricos trasplantados con genes de anticuerpos humanos (Cloning and Stem Cells., 4: 85-95, 2002).

Además, regiones Fc de anticuerpo pueden enlazarse con regiones variables arbitrarias. Específicamente, se conocen anticuerpos quiméricos en los que las regiones variables de diferentes especies animales se unen a regiones constantes humanas. Alternativamente, también puede adquirirse un anticuerpo quimérico humano-humano uniendo regiones variables derivadas de ser humano a regiones constantes arbitrarias. Además, también se conoce la tecnología de injerto de CDR, en la que las regiones determinantes de complementariedad (las CDR) que se componen de regiones variables de anticuerpos humanos se reemplazan con los CDR de anticuerpos heterólogos (“Inmunoglobulin genes”, Academic Press (Londres), págs. 260274, 1989; Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91: 969-973, 1994). Reemplazando las CDR, se reemplaza la especificidad de unión de anticuerpo. Es decir, el GFRA1 humano se reconocerá por los anticuerpos humanizados en los que se ha transferido la CDR de los anticuerpos que se unen a GFRA1 humano. Los anticuerpos transferidos también pueden denominarse anticuerpos humanizados.

Los anticuerpos así obtenidos y equipados con una región Fc esencial para la función efectora pueden usarse como los anticuerpos de la presente invención, independientemente del origen de sus regiones variables. Por ejemplo, son preferibles anticuerpos que comprenden una Fc de IgG humana en la presente invención, incluso si sus regiones variables comprenden una secuencia de aminoácidos derivada de una inmunoglobulina de otra clase u otra especie.

Los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos monoclonales o anticuerpos policlonales. Incluso cuando se administran a seres humanos, los anticuerpos policlonales humanos pueden derivarse usando los animales mencionados anteriormente transferidos con un gen de anticuerpo humano. Alternativamente, pueden usarse inmunoglobulinas que se han construido usando técnicas de ingeniería genética, tales como anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos humano-no humano y anticuerpos quiméricos humano-humano. Además, también se conocen métodos para obtener anticuerpos monoclonales humanos clonando células productoras de anticuerpos humanos.

Puede usarse GFRA1, o un fragmento que comprende su péptido parcial, como inmunógenos para obtener los anticuerpos de la presente invención. El GFRA1 de la presente invención puede derivarse de cualquier especie, preferiblemente de un mamífero tal como un ser humano, ratón o rata, y más preferiblemente de un ser humano. Se conocen la secuencia de nucleótidos y secuencia de aminoácidos de GFRA1 humano (NM_005264). La secuencia de nucleótidos de ADNc de GFRA1 se describe en la SEQ ID NO: 1, y las secuencias de aminoácidos codificadas por esa secuencia de nucleótidos se describe en la SEQ ID NO: 2. Un experto en la técnica puede aislar de manera rutinaria genes que comprenden la secuencia de nucleótidos proporcionada, preparando un fragmento de la secuencia según se requiera, y obtener una proteína que comprenda la secuencia de aminoácidos diana.

Por ejemplo, el gen que codifica para la proteína de GFRA1

o su fragmento puede insertarse en un vector de expresión conocido, y usarse para transformar células huésped. La proteína deseada, o su fragmento, puede recogerse del interior o exterior

de las células huésped usando métodos convencionales y arbitrarios, y también puede usarse como antígeno. Además, proteínas, sus lisados, y proteínas sintetizadas químicamente pueden usarse como antígenos. Además, las células que expresan la proteína de GFRA1 o un fragmento del mismo pueden usarse en sí mismas como inmunógenos.

Cuando se usa un fragmento de péptido como el inmunógeno de GFRA1, es particularmente preferible seleccionar una secuencia de aminoácidos que comprende una región prevista que va a ser un dominio extracelular. La existencia de un péptido señal se prevé de las posiciones 1 a 19 en el extremo N-terminal de GFRA1 (Jing

S. et al., Cell. 28 de junio (1996);85 (7):1113-24.). Por tanto, por ejemplo, una región diferente del péptido señal N-terminal (19 residuos de aminoácidos) se prefiere como el inmunógeno para obtener los anticuerpos de la presente invención. Es decir, los anticuerpos que se unen a los dominios extracelulares de GFRA1 se prefieren como los anticuerpos de la presente invención.

Por tanto, anticuerpos preferibles en la presente invención son anticuerpos equipados con una Fc esencial para la función efectora, y una región variable que puede unirse a un dominio extracelular de GFRA1. Cuando se destina a administración a seres humanos, es preferible que se equipe con una Fc de IgG.

Cualquier mamífero puede inmunizarse con un antígeno de este tipo. Sin embargo, es preferible considerar la compatibilidad con células originales usadas en la fusión celular. Generalmente, se usan roedores, lagomorfos o primates.

Los roedores incluyen, por ejemplo, ratones, ratas y hámsteres. Los lagomorfos incluyen, por ejemplo, conejos. Los primates incluyen, por ejemplo, monos catarrinos (del Viejo Mundo) tales como Macaca fascicularis, Macaca mulatta, babuinos sagrados y chimpancés.

En el campo se conocen bien métodos para inmunizar animales con antígenos. Las inyecciones de antígenos intraperitoneales o subcutáneas son métodos convencionales para inmunizar mamíferos. Específicamente, los antígenos pueden diluirse y suspenderse en una cantidad apropiada de solución salina tamponada con fosfato (PBS), solución salina fisiológica, o etc. Según se desee, las

suspensiones de antígenos pueden mezclarse con una cantidad apropiada de un adyuvante convencional tal como adyuvante completo de Freund, y administrarse a los mamíferos tras emulsificación. Posteriormente, es preferible que los antígenos mezclados con una cantidad apropiada de adyuvante incompleto de Freund se administren en múltiples dosis cada cuatro a 21 días. También puede usarse un vehículo apropiado para la inmunización. Tras llevar a cabo la inmunización tal como se explicó de manera resumida anteriormente, pueden usarse métodos convencionales para examinar el suero para determinar un aumento en el nivel de anticuerpos deseados.

Los anticuerpos policlonales contra la proteína de GFRA1 pueden prepararse a partir de mamíferos inmunizados cuyo suero se ha investigado para determinar un aumento en los anticuerpos deseados. Esto puede conseguirse extrayendo sangre de estos animales, o usando un método habitual, arbitrario para aislar suero a partir de su sangre. Los anticuerpos policlonales comprenden suero que comprende anticuerpos policlonales, y fracciones que comprenden anticuerpos policlonales que pueden aislarse a partir del suero. Pueden prepararse IgG e IgM a partir de fracciones que reconocen la proteína de GFRA1 usando, por ejemplo, una columna de afinidad acoplada a la proteína de GFRA1, y entonces purificando adicionalmente esta fracción usando columnas de proteína A o proteína G. En la presente invención, puede usarse antisuero tal cual como anticuerpos policlonales. Alternativamente, también puede usarse IgG, IgM purificadas o similares.

Para preparar anticuerpos monoclonales, se extraen inmunocitos de mamíferos inmunizados con antígenos, se investigan para determinar el aumento del nivel de anticuerpos deseado en suero (tal como anteriormente), y se aplican en fusión celular. Los inmunocitos para su uso en fusión celular provienen preferiblemente del bazo. Otras células originales preferidas para su fusión con los inmunógenos anteriores incluyen, por ejemplo, células de mieloma de mamífero, y más preferiblemente, células de mieloma que han adquirido

propiedades para la selección de células de fusión mediante agentes farmacéuticos.

Las células de mieloma e inmunocitos anteriores pueden fusionarse usando métodos conocidos, por ejemplo los métodos de Milstein et al. (Galfre, G. y Milstein, C., Methods. Enzymol, 1981, 73. 3-46).

Los hibridomas producidos mediante fusión celular pueden seleccionarse cultivando en un medio selectivo convencional tal como medio HAT (medio que comprende hipoxantina, aminopterina y timidina). El cultivo celular en medio HAT se continua habitualmente durante varios días a varias semanas, un periodo suficiente para destruir todas las células diferentes de los hibridomas deseados (células no fusionadas). Entonces se llevan a cabo diluciones limitantes patrón, y se examinan y clonan las células de hibridoma que producen los anticuerpos deseados.

Pueden inmunizarse animales no humanos con antígenos para preparar hibridomas en el método anterior. Además, linfocitos humanos de células infectadas con virus de EB o similares, pueden inmunizarse in vitro usando proteínas, células que expresan proteínas, o suspensiones de las mismas. Entonces se fusionan los linfocitos inmunizados con células de mieloma derivado de ser humano que pueden dividirse ilimitadamente (U266, etc.), obteniendo así hibridomas que producen los anticuerpos humanos deseados que pueden unirse a la proteína (solicitud de patente japonesa publicada sin examinar n.º (JP-A) Sho 63-17688).

Entonces, los hibridomas obtenidos se trasplantan a las cavidades abdominales de ratones, y se extraen las ascitis. Los anticuerpos monoclonales obtenidos pueden purificarse usando, por ejemplo, precipitación con sulfato de amonio, columnas de proteína A o proteína G, cromatografía de intercambio iónico con DEAE, o columnas de afinidad acopladas a las proteínas de la presente invención. Los anticuerpos de la presente invención pueden usarse no sólo en la purificación y detección de las proteínas de la presente invención, sino también como candidatos para agonistas y antagonistas de las proteínas de la presente invención. Estos anticuerpos también pueden aplicarse a

tratamientos con anticuerpos para enfermedades relacionadas con las proteínas de la presente invención. Cuando se administran los anticuerpos obtenidos a organismos humanos (tratamiento con anticuerpos), se prefieren los anticuerpos humanos o anticuerpos humanizados debido a su baja inmunogenicidad.

Por ejemplo, pueden inmunizarse animales transgénicos que comprenden un repertorio de genes de anticuerpos humanos con antígenos seleccionados de proteínas, células que expresan proteínas, o suspensiones de las mismas. Entonces, se recuperan las células productoras de anticuerpos de los animales, se fusionan con células de mieloma para producir hibridomas, y pueden prepararse anticuerpos humanos anti-proteínas a partir de estos hibridomas (véase la publicación internacional n.º 9203918, 93-2227, 94-02602, 94-25585, 96-33735 y 96-34096).

Alternativamente, pueden inmortalizarse inmunocitos tales como linfocitos inmunizados que producen anticuerpos, usando genes de cáncer, y usarse para preparar anticuerpos monoclonales.

Los anticuerpos monoclonales obtenidos de este modo pueden prepararse usando métodos de ingeniería genética (por ejemplo, véase Borrebaeck, C.A.K. y Larrick, J.W., Therapeutic Monoclonal Antibodies, MacMillan Publishers, RU, 1990). Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos recombinantes clonando los ADN que codifican para anticuerpos a partir de inmunocitos tales como hibridomas o linfocitos inmunizados que producen anticuerpos; después insertando estos ADN en vectores apropiados; y transformando éstos en células huésped. Los anticuerpos recombinantes preparados tal como anteriormente también puede usarse en la presente invención.

Los anticuerpos pueden modificarse uniéndolos con una variedad de moléculas tales como polietilenglicoles (PEG). Los anticuerpos modificados de este modo también pueden usarse en la presente invención. Los anticuerpos modificados pueden obtenerse modificando químicamente los anticuerpos. Estos tipos de métodos de modificación son convencionales para los expertos en la técnica. Los anticuerpos también pueden modificarse mediante otras proteínas. Los anticuerpos modificados mediante moléculas

de proteínas pueden producirse usando ingeniería genética. Es decir, las proteínas diana pueden expresarse fusionando genes de anticuerpos con genes que codifican para proteínas de modificación. Por ejemplo, la función efectora de anticuerpo puede potenciarse mediante la unión con citocinas o quimiocinas. De hecho, se ha confirmado la potenciación de la función efectora de anticuerpo para proteínas fusionadas con IL-2, GMCSF, y similares (Human Antibody, 10: 43-49,2000). Pueden incluirse IL-2, IL-12, GM-CSF, TNF, sustancia quimiotáctica de eosinófilos (RANTES), etc. en las citocinas o quimiocinas que potencian la función efectora.

Alternativamente, los anticuerpos de la presente invención pueden obtenerse como anticuerpos quiméricos que comprenden una región variable derivada de anticuerpo no humano y una región constante derivada de anticuerpo humano, o como anticuerpos humanizados que comprenden una región determinante de complementariedad derivada de anticuerpo no humano (CDR), una región de entramado derivada de anticuerpo humano (FR), y una región constante. Tales anticuerpos pueden producirse usando métodos conocidos.

Los anticuerpos obtenidos tal como anteriormente pueden purificarse hasta uniformidad. Por ejemplo, los anticuerpos pueden purificarse o separarse según métodos generales usados para purificar y separar proteínas. Por ejemplo, los anticuerpos pueden separarse y aislarse usando combinaciones seleccionadas apropiadamente de cromatografía en columna, que comprenden, pero sin limitarse a cromatografía de afinidad, filtración, ultrafiltración, precipitación con sal, diálisis, electroforesis en gel de poliacrilamida SDS, isoelectroenfoque, etc. (Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y David, Lane (edit.), Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).

Las columnas de proteína A y las columnas de proteína G pueden usarse como columnas de afinidad. Las columnas de proteína A a modo de ejemplo en uso incluyen Hyper D, POROS y Sepharose F.F (Pharmacia).

Las cromatografías a modo de ejemplo (excluyendo la cromatografía de afinidad) incluyen cromatografía de intercambio

iónico, cromatografía hidrófoba, filtración en gel, cromatografía de fase inversa y cromatografía de adsorción (“Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual”. Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). La cromatografía puede realizarse según el procedimiento de las cromatografías en fase líquida tales como HPLC o FPLC.

Por ejemplo, la actividad de unión a antígenos de los anticuerpos de la presente invención puede medirse usando mediciones de absorbancia, ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA), inmunoensayos con enzimas (EIA), radioinmunoanálisis (RIA) y/o métodos de inmunofluorescencia. En ELISA, se inmoviliza un anticuerpo de la presente invención sobre una placa, se añade una proteína de la presente invención a la placa, y entonces se añade una muestra que comprende el anticuerpo deseado tal como el sobrenadante del cultivo de células que producen el anticuerpo o el anticuerpo purificado. Entonces se añade un anticuerpo secundario que reconoce el anticuerpo primario y se ha etiquetado con una enzima tal como fosfatasa alcalina y se incuba la placa. Tras lavar, se añade un sustrato enzimático tal como fosfato de p-nitrofenilo a la placa, se mide la absorbancia, y se evalúa la actividad de unión a antígeno de las muestras. Pueden usarse fragmentos de proteína (fragmentos C-terminal o N-terminal, y similares) del mismo modo que las proteínas. Puede evaluarse la actividad de unión de los anticuerpos de la presente invención usando BIAcore (Pharmacia).

Además, siguiendo los métodos explicados resumidamente en los ejemplos, también puede evaluarse la función efectora de anticuerpo. Por ejemplo, se incuban las células que expresan GFRA1 diana con células efectoras en presencia de un anticuerpo cuya función efectora va a evaluarse. Si se detecta la destrucción de las células diana, puede confirmarse que el anticuerpo comprende una función efectora que induce CCDA. El nivel de destrucción de las células diana observada, en ausencia de o bien anticuerpos o bien células efectoras, puede compararse como control con el nivel de la función efectora. Pueden usarse células que expresan claramente GFRA1 como células diana.

Específicamente, puede usarse una variedad de líneas celulares que se ha confirmado que expresan GFRA1 en los ejemplos. Pueden obtenerse estas líneas celulares a partir de bancos de células. Además, pueden seleccionarse anticuerpos monoclonales que comprenden una función efectora más poderosa.

En la presente invención, pueden administrarse anticuerpos anti-GFRA1 a seres humanos u otros animales como agentes farmacéuticos. En la presente invención, los animales diferentes de seres humanos a los que pueden administrarse los anticuerpos incluyen ratones, ratas, cobayas, conejos, pollos, gatos, perros, ovejas, cerdos, vacas, monos, babuinos y chimpancés. Pueden administrarse directamente los anticuerpos a los sujetos, y además, pueden formularse en formas farmacéuticas usando métodos de formulación farmacéutica conocidos. Por ejemplo, dependiendo de los requisitos, pueden administrarse por vía parenteral en una forma inyectable tal como una suspensión o disolución estéril con agua u otro fluido farmacéuticamente aceptable arbitrario. Por ejemplo, puede mezclarse este tipo de compuestos con disolventes o vehículos aceptables, específicamente agua estéril, solución salina fisiológica, aceites vegetales, emulsionantes, agentes de suspensión, tensioactivos, estabilizantes, agentes aromatizantes, excipientes, disolventes, conservantes, agentes de unión y similares, en una dosificación unitaria aceptada generalmente esencial para su uso como agente farmacéutico.

Pueden usarse otras disoluciones isotónicas que comprenden solución salina fisiológica, glucosa y adyuvantes (tales como Dsorbitol, D-manosa, D-manitol y cloruro de sodio) como la disolución acuosa inyectable. También pueden usarse con solubilizantes apropiados tales como alcoholes, específicamente etanoles y polialcoholes (por ejemplo, propilenglicoles y polietilenglicol) y tensioactivos no iónicos (por ejemplo polisorbato 80™ o HCO-50).

Pueden usarse aceites de sésamo o aceites de soja como disolución oleaginosa, y pueden usarse benzoato de bencilo o alcoholes bencílicos con las mismas como solubilizante. Pueden usarse disoluciones tampón (tampones fosfato, tampones acetato

de sodio o etc.), analgésicos (clorhidrato de procaína o similares), estabilizantes (alcohol bencílico, fenoles o etc.) y antioxidantes en la formulación. Pueden envasarse las inyecciones preparadas en ampollas apropiadas.

En la presente invención, pueden administrarse los anticuerpos anti-GFRA1 a pacientes, por ejemplo, por vía intraarterial, por vía intravenosa o por vía percutánea, o por vía intranasal, por vía transbronquial, por vía local o por vía intramuscular. La administración intravascular (intravenosa) mediante goteo o inyección es un ejemplo de un método general para la administración sistemática de anticuerpos a pacientes con cáncer de mama, gástrico, de hígado, renal o de pulmón. Los métodos de concentración local de los agentes con anticuerpos al foco primario o foco metastásico en el pulmón incluyen inyección local usando un broncoscopio (broncoscopia) e inyección local en orientación CT o con toracoscopia. Los métodos de concentración local de los agentes con anticuerpos al foco primario o foco metastásico en el hígado incluyen inyección local usando una infusión arterial o inyección portal hepática. Además, los métodos en los que se inserta un catéter intraarterial cerca de una vena que suministra nutrientes a las células cancerosas para inyectar localmente agentes anticancerígenos tales como agentes con anticuerpos, son eficaces como terapias de control local para focos metastásicos así como focos primarios de cáncer de mama, gástrico, de hígado, renal o de pulmón.

Aunque los métodos de administración y dosificación varían según la edad y el peso corporal del paciente, y el método de administración, un experto en la técnica puede seleccionarlos de manera rutinaria. Además, puede insertarse ADN que codifica para un anticuerpo en un vector para terapia génica, y puede administrarse el vector para terapia. Los métodos de administración y dosificación varían según el peso corporal, la edad y el estado del paciente, sin embargo, un experto en la técnica puede seleccionar éstos apropiadamente.

Pueden administrarse los anticuerpos anti-GFRA1 a organismos vivos en una cantidad tal que pueda confirmarse la citotoxicidad basándose en la función efectora contra las

células que expresan GFRA1. Por ejemplo, aunque existe una cierta cantidad de diferencia dependiendo de los síntomas, la dosificación de anticuerpos anti-GFRA1 es de 0,1 mg a 250 mg/kg al día. Habitualmente, la dosificación para un adulto (de 60 kg de peso) es de 5 mg a 17,5 g/día, preferiblemente de 5 mg a 10 g/día, y más preferiblemente de 100 mg a 3 g/día. El programa de dosificación es desde una hasta diez veces durante un intervalo de dos a diez días, y por ejemplo, se observa un progreso tras una administración de tres a seis veces.

Aunque los anticuerpos de la invención retienen una función efectora, en algunas realizaciones, pueden unirse agentes citotóxicos a los anticuerpos usando técnicas bien conocidas. Los agentes citotóxicos son numerosos y variados e incluyen, pero no se limitan a, fármacos citotóxicos o toxinas o fragmentos activos de tales toxinas. Las toxinas adecuadas y sus fragmentos correspondientes incluyen cadena A de difteria, cadena A de exotoxina, cadena A de ricina, cadena A de abrina, curcina, crotina, fenomicina, enomicina, auristatina y similares. Los agentes citotóxicos también incluyen radioquímicos preparados conjugando radioisótopos a los anticuerpos de la invención o mediante la unión de un radionúclido a un agente quelante que se ha unido de manera covalente al anticuerpo. En la técnica se conocen bien métodos para preparar tales conjugados.

Además, la presente invención proporciona composiciones inmunogénicas para inducir anticuerpos que comprenden funciones efectoras contra las células que expresan GFRA1, en las que las composiciones comprenden como principio activo GFRA1 o un fragmento de GFRA1 inmunológicamente activo, o un ADN o una célula que puede expresar el mismo. Alternativamente, la presente invención se refiere a usos de GFRA1 o un fragmento de GFRA1 inmunológicamente activo, o un ADN o una célula que puede expresar el mismo en la producción de composiciones inmunogénicas para inducir anticuerpos que comprenden funciones efectoras contra las células que expresan GFRA1.

La administración de anticuerpos anti-GFRA1 daña células cancerosas mediante la función efectora de aquellos anticuerpos.

Por tanto, si pueden inducirse in vivo anticuerpos GFRA1, pueden conseguirse efectos terapéuticos equivalentes a la administración de anticuerpos. Cuando se administran composiciones inmunogénicas que comprenden antígenos, puede inducirse in vivo los anticuerpos diana. Por tanto, las composiciones inmunogénicas de la presente invención son particularmente útiles en tratamiento con vacunas contra las células que expresan GFRA1. Por tanto, las composiciones inmunogénicas de la presente invención son eficaces como, por ejemplo, composiciones de vacuna para tratamientos de cáncer de mama, gástrico, de hígado, renal o de pulmón.

Las composiciones inmunogénicas de la presente invención pueden comprender GFRA1 o un fragmento de GFRA1 inmunológicamente activo, como principio activo. Un fragmento de GFRA1 inmunológicamente activo se refiere a un fragmento que puede inducir anticuerpos anti-GFRA1 que reconocen GFRA1 y comprenden una función efectora. A continuación, GFRA1 y el fragmento de GFRA1 inmunológicamente activo se describen como proteínas inmunogénicas. Puede determinarse si un fragmento dado induce anticuerpos diana inmunizando en realidad un animal, y confirmando la actividad de los anticuerpos inducidos. Puede llevarse a cabo la inducción de anticuerpos y la confirmación de su actividad, por ejemplo, usando métodos descritos en los ejemplos. Por ejemplo, pueden usarse fragmentos que comprenden una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 24 a 465 de GFRA1 como los inmunógenos de la presente invención.

Las composiciones inmunogénicas de la presente invención comprenden vehículos farmacéuticamente aceptables así como proteínas inmunogénicas, los principios activos. Si es necesario, también pueden combinarse las composiciones con un adyuvante. Pueden usarse bacterias de tuberculosis muertas, toxoide de difteria, saponina, etc. como el adyuvante.

Alternativamente, pueden usarse ADN que codifican para las proteínas inmunogénicas, o células que retienen aquellos ADN en un estado expresable, como las composiciones inmunogénicas. Se conocen bien métodos para usar ADN que expresan el antígeno diana como inmunógenos, denominados vacunas de ADN. Pueden

obtenerse vacunas de ADN insertando un ADN que codifica para GFRA1 o su fragmento en un vector de expresión apropiado.

Pueden usarse vectores de retrovirus, vectores de adenovirus, vectores de virus adeno-asociados, vectores de virus Sendai o similares como el vector. Además, pueden introducirse directamente ADN en los que un ADN que codifica para una proteína inmunogénica está conectado funcionalmente en el sentido de 3’ de un promotor en células como ADN desnudo, y entonces expresarse. Puede encapsularse el ADN desnudo en ribosomas o vectores de envuelta viral e introducirse en las células.

También pueden usarse los polinucleótidos y polipéptidos de GFRA1 de la invención para la inducción de una respuesta inmunitaria in vivo, incluyendo producción de anticuerpos y linfocitos T citotóxicos (LTC) específicos para las células que expresan GFRA1. En tales métodos, puede conseguirse la inducción de LTC mediante un péptido deseado presentando el péptido a una célula T por medio de una célula presentadora de antígeno (CPA)

o bien in vivo o bien ex vivo.

Por ejemplo, se extraen células sanguíneas del paciente por ejemplo, células mononucleares de sangre periférica (PBMC), se transforman usando un vector que puede expresar las proteínas inmunogénicas, y se regresan al paciente. Las células sanguíneas transformadas producen las proteínas inmunogénicas en el interior del organismo del paciente, e inducen los anticuerpos diana. Alternativamente, se extraen PBMC del paciente, se ponen en contacto las células con el polipéptido ex vivo, y tras la inducción de CPA o LTC, pueden administrarse las células al sujeto. Pueden clonarse CPA o LTC inducidos in vitro antes de la administración. Mediante la clonación y el crecimiento de células que tienen alta actividad de dañar células diana, puede realizarse la inmunoterapia celular más eficazmente. Además, las CPA y los LTC aislados de esta manera pueden usarse para inmunoterapia celular no sólo contra individuos de los que se derivan las células, sino también contra tipos similares de tumores de otros individuos.

Generalmente, cuando se usa un polipéptido para inmunoterapia celular, se conoce que se aumenta la eficacia de la inducción de LTC combinando una pluralidad de polipéptidos que tienen diferentes estructuras y poniéndolos en contacto con CPA, particularmente, células dendríticas. Por tanto, cuando se estimulan CPA con fragmentos de proteína, es ventajoso usar una mezcla de múltiples tipos de fragmentos.

Puede confirmarse la inducción de inmunidad antitumoral por un polipéptido observando la inducción de la producción de anticuerpos contra los tumores. Por ejemplo, cuando se inducen anticuerpos contra un polipéptido en un animal de laboratorio inmunizado con el polipéptido, y cuando aquellos anticuerpos suprimen el crecimiento de células tumorales, se considera que el polipéptido tiene la capacidad de inducir inmunidad antitumoral.

Cuando se usan los ADN que codifican para las proteínas inmunogénicas, o células transformadas con los mismos como composiciones inmunogénicas de la presente invención, pueden combinarse con proteínas inmunogénicas así como proteínas portadoras que potencian sus propiedades inmunogénicas.

Tal como se observó anteriormente, la presente invención proporciona métodos para inducir anticuerpos que comprenden una función efectora contra las células que expresan GFRA1, comprendiendo los métodos la etapa de administrar GFRA1, un fragmento de GFRA1 inmunológicamente activo, o ADN o células que pueden expresar el mismo. Los métodos de la presente invención inducen anticuerpos que comprenden una función efectora que daña las células que expresan GFRA1 tales como cánceres de mama, gástrico, de hígado, renal o de pulmón. Como resultado, pueden obtenerse efectos terapéuticos para los cánceres de mama, gástrico, de hígado, renal o de pulmón, etc.

Cada día, pueden administrarse por vía oral o por vía parenteral de 0,1 mg a 250 mg por kilogramo de las composiciones inmunogénicas de la presente invención. La administración parenteral incluye la inyección subcutánea y la inyección intravenosa. La dosis de administración para un solo adulto es

habitualmente de 5 mg a 17,5 g/día, preferiblemente de 5 mg a 10 g/día, y más preferiblemente de 100 mg a 3 g/día.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1 son fotografías que representan el resultado del análisis por RT-PCR semicuantitativa para el gen de GFRA1 en células cancerosas. A; para líneas celulares de cáncer de mama. B; para líneas celulares de cáncer gástrico. C, para líneas celulares de cáncer de hígado. D, para líneas celulares de cáncer renal. E, para líneas celulares de cáncer de pulmón. El nivel de expresión de gen diana de herceptin gen c-erbB2 para cáncer de mama se indica en el panel A (control positivo).

Figura 2 muestra los resultados de un ensayo de CCDA usando Herceptin contra (A) gen c-erbB-2 con sobre-expresión en MDA-MB-453 y (B) gen c-erbB-2 con baja-expresión en MCF-7.

Figura 3 muestra los resultados de un ensayo de CCDA usando el anticuerpo anti-GFRA1 Br003 contra la línea celular de cáncer de mama con sobre y baja-expresión de GFRA1, (A) MCF-7 y (B) MDA-MB-453, respectivamente.

Figura 4 muestra los resultados de un ensayo de CCDA usando el anticuerpo anti-GFRA1 Br003 contra la línea celular de cáncer gástrico con sobre-expresión de GFRA1, MKN1.

Figura 5 muestra los resultados de un ensayo de CCDA usando el anticuerpo anti-GFRA1 Br003 contra la línea celular de cáncer de hígado con sobre-expresión de GFRA1, SNU-398.

Figura 6 muestra los resultados de un ensayo de CCDA usando el anticuerpo anti-GFRA1 Br003 contra la línea celular de cáncer renal con sobre-expresión de GFRA1, ACHN.

Figura 7 muestra los resultados de un ensayo de CCDA usando el anticuerpo anti-GFRA1 Br003 contra la línea celular de cáncer de pulmón con sobre-expresión de GFRA1,

NCI-H1793.

Mejor modo para llevar a cabo la invención A continuación, se explica adicionalmente la presente invención basándose en ejemplos.

5

Línea celular:

Se propagaron líneas celulares de cáncer de mama, gástrico, de hígado, renal o de pulmón humano como una monocapa en un medio apropiado con suero bovino fetal al 10%. Las líneas

10 celulares usadas en el experimento se muestran en la tabla 1.

Tabla 1

Línea celular de cáncer de mama

Línea celular

Medio Lugar obtenido

BT-20

E-MEM*1 +FBS al 10% Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC); HTB-19

BT-474

D-MEM*2 +FBS al 10% ATCC; HTB-20

BT-549

RPMI+FBS al 10% ATCC; HTB-122

HCC1143

RPMI+FBS al 10% ATCC; CRL-2321

HCC1395

RPMI+FBS al 10%+Lglutamina 2 mM ATCC; CRL-2324

HCC1500

RPMI+FBS al 10%+Lglutamina 2 mM ATCC; CRL-2329

HCC1937

RPMI+FBS al 10%+Lglutamina 2 mM ATCC; CRL-2336

MCF-7

E-MEM*1 +FBS al 10% ATCC; HTB-22

MDA-MB157

L15*3 +FBS al 10% ATCC; HTB-24

MDA-MB231

L15*3 +FBS al 10% ATCC; HTB-26

MDA-MB435S

L15*3 +FBS al 10% ATCC; HTB-129

MDA-MB453

McCoy*4+FBS al 10% ATCC; HTB-131

SK-BR-3

RPMI+FBS al 10% ATCC; HTB-30

T-47D

RPMI+FBS al 10%+Lglutamina 2 mM ATCC; HTB-133

ZR-75-1

E-MEM*1 +FBS al 10% ATCC; CRL-1500

Línea celular de cáncer gástrico

Línea celular

Medio Lugar obtenido

MKN1

RPMI+FBS al 10% Health Science Research Resources Bank (HSRRB); JCRB0252

MKN7

RPMI+FBS al 10% HSRRB; JCRB1025

MKN45

RPMI+FBS al 10% HSRRB; JCRB0254

MKN74

RPMI+FBS al 10% HSRRB; JCRB0255

Línea celular de cáncer de hígado

Línea celular

Medio Lugar obtenido

Alexander

D-MEM*2 +FBS al 10% HSRRB; IFO50069

Hep G2

D-MEM*2 +FBS al 10% HSRRB; JCRB1054

HUH-6 Clon 5

E-MEM*1 +FBS al 10% HSRRB; JCRB0401

HuH-7

D-MEM*2 +FBS al 10% HSRRB; JCRB0403

SNU-398

RPMI+FBS al 10% (inactivado por calor) ATCC; CRL-2233

SNU-423

RPMI+FBS al 10% ATCC; CRL-2238

SNU-449

RPMI+FBS al 10% ATCC; CRL-2234

SNU-475

RPMI+FBS al 10% ATCC; CRL-2236

Línea celular de cáncer renal

Línea celular

Medio Lugar obtenido

ACHN

RPMI+FBS al 5% ATCC; CRL-1611

786-O

RPMI+FBS al 10% ATCC; CRL-1932

A-498

E-MEM*1 +FBS al 10% ATCC; HTB-44

Caki-1

McCoy*4+FBS al 10% HSRRB; JCRB0801

Caki-2

McCoy*4+FBS al 10% ATCC; HTB-47

Línea celular de cáncer de pulmón

Línea celular

Medio Lugar obtenido

NCI-H23

RPMI+FBS al 10% ATCC; CRL-5800

NCI-H358

RPMI+FBS al 10% ATCC; CRL-5807

NCI-H596

RPMI+FBS al 10% ATCC; HTB-178

NCI-H1650

RPMI+FBS al 10% ATCC; CRL-5883

NCI-H1793

F12*5+ D-MEM*2+FBS al 10% ATCC; CRL-5896

PC-14

RPMI+FBS al 10% RIKEN Bioresource Center

SK-MES-1

E-MEM*1 +FBS al 10%+ Lglutamina 2 mM ATCC; HTB-58

SK-LU-1

E-MEM*1 +FBS al 10%+ Lglutamina 2 mM ATCC; HTB-57

SW900

L15*3 +FBS al 10% ATCC; HTB-59

SW1573

L15*3 +FBS al 10% ATCC; CRL-2170

A549

RPMI+FBS al 10% ATCC; CCL-185

NCI-H522

RPMI+FBS al 10% ATCC; CRL-5810

PC-3

E-MEM*1+FBS al 10% HSRRB; JCRB0077

*1 Medio mínimo esencial de Eagle *2 Medio de Eagle modificado por Dulbecco *3 Medio L-15 de Leibovitz *4 Medio modificado 5A de McCoy

5 *5 Mezcla de nutrientes F-12 (HAM)

Además, se usaron las siguientes líneas celulares en ensayos de CCDA usando anticuerpos anti-GFRA1: Adenocarcinoma de mama (CM): MCF-7

10 Carcinoma de mama: MDA-MB-453. Carcinoma adenoescamoso de estómago: MKN1. Carcinoma hepatocelular (CHC): SNU-398. Adenocarcinoma de células renales (CCR): ACHN. Carcinoma de pulmón de células no pequeñas (CPCNP): NCI-H1793.

15

Producción de anticuerpos:

Según protocolos convencionales, se produjeron anticuerpos específicos de proteína individual usando proteínas de fusión etiquetadas con His expresadas en bacterias como inmunógenos.

20 Estas proteínas de fusión comprendían una parte de proteína que correspondía a una parte de la proteína (residuos 24 a 465).

RT-PCR semicuantitativa para GFRA1 y c-erbB2:

Se extrajo el ARN total de las líneas celulares usando el Kit Rneasy® (QIAGEN). Además, se purificó ARNm a partir del ARN total mediante una columna de oligo (dT)-celulosa (Amersham Biosciences) y se sintetizó para dar ADNc de primera cadena mediante transcripción inversa (RT) usando el sistema de síntesis de primera cadena SuperScript (Invitrogen). Se prepararon diluciones apropiadas de cada ADNc de primera cadena para la posterior amplificación por PCR monitorizando GAPDH como control cuantitativo. Las secuencias de cebador que usaron los presentes inventores fueron 5’-CTGAAGCAGAAGTCGCTCTA-3’ (SEQ.ID.NO.3) y 5’-GACAGCTGCTGACAGACCTT-3’ (SEQ.ID.NO.4) para GFRA1, 5’-GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3’ (SEQ.ID.NO.5) y 5’-GGTTGAGCACAGGGTACTTTATT 3’ (SEQ.ID.NO.6) para GAPDH. Todas las reacciones de PCR implicaron una desnaturalización inicial a 94ºC durante 2 min. y consistieron en 94ºC durante 30 s, 58ºC durante 30 s y 72ºC durante 1 min. en 21 ciclos (para GAPDH) o 30-40 ciclos (para GFRA1), en un sistema de PCR GeneAmp 9700 (PE Applied Biosystems).

Se encontró la sobre-expresión de GFRA1 en la línea celular de cáncer de mama MCF-7 (figura 1). Además, para elucidar la eficacia del anticuerpo anti-GFRA1 (Br003) sobre diversos cánceres, se confirmó la expresión de GFRA1. Se decidió la sobre-expresión de GFRA1 en la línea celular de cáncer gástrico MKN1, la línea celular de cáncer de hígado SNU-398, la línea celular de cáncer renal ACHN y la línea celular de cáncer de pulmón NCI-H1793.

Análisis de citometría de flujo:

Se incubaron las células cancerosas (5 x 106) a 4ºC durante 30 minutos con los anticuerpos policlonales purificados (AcP) o IgG de conejo (el control). Se lavaron las células con disolución tamponada con fosfato (PBS) y entonces se incubaron a 4ºC durante 30 minutos en Alexa Flúor 488 etiquetado con FITC. De nuevo se lavaron las células en PBS, y se analizaron en un citómetro de flujo (FACSCalibur®, Becton Dickinson) y entonces

se analizaron mediante software BD CellQuest™ Pro (Becton Dickinson). Se definió la intensidad de fluorescencia media (IFM) como una razón de la intensidad citométrica de flujo (intensidad por cada anticuerpo específico de proteína/intensidad por IgG de conejo).

Usando anticuerpos anti-GFRA1 Br003, se investigó la expresión de GFRA1 para células MCF-7, MKN1, SNU-398, ACHN y NCI-H1793. Como resultado, una mayor proporción de anticuerpos anti-GFRA1 (Br003) se unieron a células MCF-7, MKN1, SNU-398, ACHN y NCI-H1793 (IFM intensidad de fluorescencia media): 155,4, 5,2, 9,3, 78,5 y 9,4, respectivamente) de lo que lo hicieron a la IgG de conejo (el control).

Ensayos de CCDA:

Se expusieron las células objetivo con 0,8 M de éster acetoximetílico de calceína (calceína-AM, DOJINDO) a 37ºC durante 30 minutos. La calceína-AM se vuelve fluorescente tras la escisión de la calceína-AM por las esterasas celulares que producen un derivado fluorescente de calceína. Se lavaron las células cancerosas diana dos veces antes de añadirse al ensayo, y entonces se colocaron en placas las células en placas con fondo en forma de U de 96 pocillos (4 x 103 células/pocillo). Se recogieron células mononucleares de sangre periférica humana (PMBC) de una persona sana, se separaron usando centrifugación con gradiente de densidad Ficoll-Paque (Amersham Biosciences), y

entonces se usaron como células efectoras. Se incubaron conjuntamente las células cancerosas diana (T) y las células efectoras (E) en 200 l de medio AIM-V en placas con fondo en forma de U de 96 pocillos a diversas razones E:T (50:1, 25:1, 12,5:1 y 6,25:1) con anticuerpo anti-GFRA1 Br003 (2 g/pocillo)

o anticuerpo control Herceptin (2 g/pocillo, Roche). Se llevo a cabo esta incubación por triplicado, en 200 l de medio AIM-V (Life Technologies, Inc), a 37ºC durante seis horas. Los ensayos control incluyeron la incubación de las células diana con sólo

el anticuerpo anti-GFRA1 Br003 o las células efectoras. Se usó Herceptin como control en algunos experimentos.

Se evaluaron los efectos de CCDA del anticuerpo anti-GFRA1 (Br003) para las células MCF-7, MKN1, SNU-398, ACHN y NCI-H1793 basándose en las imágenes de fluorescencia de células viables que se adquirieron rápidamente usando el analizador IN Cell 1000 (Amersham Bioscience). Estas imágenes se convirtieron en números como recuento de células viables contando la vesícula u objeto fluorescente usando el software Developer tool ver. 5.21 (Amersham Bioscience). Se llevaron a cabo ensayos control incubando células diana con sólo anticuerpo anti-GFRA1 Br003 o sólo células efectoras. Se usó Herceptin como control en varios experimentos (figuras 2A, 2B). No se observó ningún daño celular directo de las células MCF-7, MKN1, SNU-398, ACHN y NCI-H1793 por el propio anticuerpo anti-GFRA1 Br003. Sin embargo, Br003 indujo CCDA en las células MCF-7, MKN1, SNU-398, ACHN y NCIH1793 que sobre-expresaban GFRA1 (figuras 3A, 4-7), mientras que ningún efecto contra las células MDA-MB-453 con baja expresión de GFRA1 (figura 3B).

Aplicabilidad industrial

La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que las células que expresan GFRA1 pueden dañarse mediante la citotoxicidad por anticuerpos. Los presentes inventores identificaron GFRA1 como un gen que se expresa fuertemente en cánceres de mama, gástrico, de hígado, renal o de pulmón. Por tanto, puede llevarse a cabo convenientemente el tratamiento de una enfermedad asociada con células que expresan GFRA1, por ejemplo, cáncer de mama, gástrico, de hígado, renal o de pulmón usando anticuerpos que se unen a GFRA1. Los resultados confirmados realmente por los presentes inventores muestran citotoxicidad debida al efecto de CCDA en líneas celulares de cáncer de mama, gástrico, de hígado, renal o de pulmón, en presencia de anticuerpos GFRA1.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> ONCOTHERAPY SCIENCE, INC.

<120> MÉTODOS PARA DAÑAR CÉLULAS USANDO FUNCIONES EFECTORAS DE ANTICUERPOS ANTI-GFRA1

<130> ONC-A0501P

<160> 6

<170> PatentIn versión 3.1

<210> 1

<211> 2542

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (550).. (1947)

<223>

<400> 1

imagen1

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<210> 2

<211> 465

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

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<210> 3

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Una secuencia de cebador sintetizada artificialmente para RT-PCR.

<400> 3 ctgaagcaga agtcgctcta 20

<210> 4

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Una secuencia de cebador sintetizada artificialmente para RT-PCR.

<400> 4 gacagctgct gacagacctt 20

<210> 5

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Una secuencia de cebador sintetizada artificialmente para RT-PCR.

<400> 5 gtcagtggtg gacctgacct 20

<210> 6

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Una secuencia de cebador sintetizada artificialmente para RT-PCR.

<400> 6 5 ggttgagcac agggtacttt att 23

50

Claims (2)

1. REIVINDICACIONES

   1. Composición para su uso en el tratamiento de un cáncer que expresa GFRA1, comprendiendo la composición un anticuerpo anti-GFRA1 como principio activo, en la que el anticuerpo

   5 comprende una función efectora de anticuerpo, en la que dicha función efectora es o bien citotoxicidad dependiente de anticuerpo o bien citotoxicidad dependiente de complemento, o ambas.
2. 2. Uso de un anticuerpo anti-GFRA1 para la preparación de una

   10 composición farmacéutica para tratar un cáncer que expresa GFRA1, en el que dicho anticuerpo comprende una función efectora de anticuerpo, en el que dicha función efectora es

   o bien citotoxicidad dependiente de anticuerpo o bien citotoxicidad dependiente de complemento, o ambas.

   15 3. Composición para su uso en el tratamiento de un cáncer que expresa GFRA1 según la reivindicación 1, o uso según la reivindicación 2, en los que el cáncer es cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer de hígado, cáncer renal o cáncer de pulmón.

   20 4. Composición para su uso en el tratamiento de un cáncer que expresa GFRA1 según la reivindicación 1 ó 3, o uso según la reivindicación 2 ó 3, en los que el anticuerpo anti-GFRA1 es un anticuerpo monoclonal.