CN110831622A - Fgl2单克隆抗体及其在治疗恶性肿瘤中的用途 - Google Patents

Abstract

本文提供了抗FGL2单克隆抗体。本文还提供了用以逆转抑制性免疫机制，如用于治疗癌症或感染性疾病的方法。

Description

FGL2单克隆抗体及其在治疗恶性肿瘤中的用途

本申请要求2017年5月5日提交的美国临时申请序列号62/501,870的权益，所述申请的全部内容以引用方式并入本文。

序列表并入

本文件中包含的名为“UTFCP1322WO_ST25.txt”的序列表为6KB(如在Microsoft

中测量的)且于2018年5月7日创建，该序列表同此通过电子提交的方式提交，并以引用方式并入本文。

背景技术

1.领域

本发明总体上涉及医学和免疫学领域。更特别地，本发明涉及针对FGL2的单克隆抗体及其使用方法，如用于治疗癌症。

2.相关技术的描述

尽管靶向免疫检查点(例如PD-L1、PD-1和CTLA-4)的单克隆抗体在某些癌症的治疗中显现出前景，但诸如多形性胶质母细胞瘤(GBM)的癌症具有多种冗余的免疫抑制机制，这降低了免疫疗法的功效。

纤维蛋白原样蛋白2(FGL2)是一种在体内发挥多效作用的蛋白，是先天及适应性应答的重要免疫调节剂。FGL2在病毒感染、同种异体移植物排斥和流产中具有凝血酶原酶活性和免疫调节功能(Selzner等人,2010)。一些研究者已经提出，FGL2通过以FoxP3依赖性方式抑制T细胞活性而充当调节性T细胞效应分子。其他研究者发现FGL2通过与FcγRIIB结合抑制树突状细胞(DC)和B细胞功能。此外，新出现的数据表明FGL2经由Th1和Th2细胞因子调节适应性免疫。最近的研究还表明，FGL2可以促进肝细胞癌异种移植肿瘤生长和血管生成，这表示其具有肿瘤促进功能。

研究表明，FGL2可能通过诱导多种免疫抑制机制来促进GBM癌症的发展(Yan等人,2015)。Yan等人的研究中的数据表明，FGL2可以通过上调阴性免疫检查点表达来促进GBM的进展，因此可能是治疗靶标。因此，阻断FGL2的疗法可能会对逆转免疫抑制系统产生广泛影响，并且可能在对其他治疗无反应的肿瘤中起作用。因此，需要靶向FGL2的单克隆抗体来治疗癌症。

发明内容

在某些实施方案中，本公开提供了抗FGL2抗体及其使用方法。在第一实施方案中，提供了分离的单克隆抗体，其中所述抗体特异性地结合FGL2并且包含由杂交瘤克隆F48或F59编码的抗体的V_H结构域的CDR 1-3和V_L结构域的CDR 1-3。在一些方面，所述抗体包含：(a)与F48的V_H CDR1(SEQ ID NO:5)或F59至少80％相同的第一V_H CDR；(b)与F48的V_H CDR2(SEQ ID NO:6)或F59至少80％相同的第二V_H CDR；(c)与F48的V_H CDR3(SEQ ID NO:7)或F59至少80％相同的第三V_H CDR；(d)与F48的V_L CDR1(SEQ ID NO:8)或F59至少80％相同的第一V_L CDR；(e)与F48的V_L CDR2(SEQ ID NO:9)或F59至少80％相同的第二V_L CDR；以及(f)与F48的V_L CDR3(SEQ ID NO:10)或F59至少80％相同的第三V_L CDR。

在某些方面，所述抗体包含与SEQ ID NO:5至少90％相同的第一V_H CDR、与SEQ IDNO:6至少90％相同的第二V_H CDR、与SEQ ID NO:7至少90％相同的第三V_H CDR、与SEQ IDNO:8至少90％相同的第一V_L CDR、与SEQ ID NO:9至少90％相同的第二V_L CDR，以及与SEQID NO:10至少90％相同的第三V_L CDR。在具体方面，所述抗体包含与SEQ ID NO:5相同的第一V_H CDR、与SEQ ID NO:6相同的第二V_H CDR、与SEQ ID NO:7相同的第三V_H CDR、与SEQ IDNO:8相同的第一V_L CDR、与SEQ ID NO:9相同的第二V_L CDR，以及与SEQ ID NO:10相同的第三V_L CDR。

在一些方面，所述抗体包含由杂交瘤克隆F48(SEQ ID NO:1-4)编码的抗体的V_H结构域的CDR 1-3和V_L结构域的CDR 1-3。在某些方面，所述抗体包含由杂交瘤克隆F59编码的抗体的V_H结构域的CDR 1-3和V_L结构域的CDR 1-3。技术人员会立即识别出对应于VH和VL结构域CDR序列的序列，因为这些序列的定位在本领域中是众所周知的(参见例如Kabat等人,1987，其以引用方式并入本文)。

在某些方面，所述抗体包含与F48的V_H结构域(SEQ ID NO:1-2)至少约80％(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的V_H结构域和与F48的V_L结构域(SEQ ID NO:3-4)至少约80％(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的V_L结构域。在一些方面，所述抗体包含与F48的V_H结构域(SEQ ID NO:1-2)相同的V_H结构域和与F48的V_L结构域(SEQ ID NO:3-4)相同的V_L结构域。

在一些方面，所述抗体包含与F59的V_H结构域至少约80％(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的V_H结构域和与F59的V_L结构域至少约80％(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的V_L结构域。在一些方面，所述抗体包含与F59的V_H结构域相同的V_H结构域和与F59的V_L结构域相同的V_L结构域。在一个特定方面，所述抗体是F48或F59抗体。在另外的方面，所述抗体是重组抗体。

在其他方面，所述抗体是IgG、IgM、IgA或其抗原结合片段。在某些方面，所述抗体是Fab'、F(ab')2、F(ab')3、单价scFv、二价scFv或单结构域抗体。在具体方面，所述抗体可以是人抗体、人源化抗体或去免疫化抗体。在一些方面，所述抗体与成像剂、化学治疗剂、毒素或放射性核素缀合。

本公开的另一个实施方案提供了一种组合物，所述组合物包含在药学上可接受的载剂中的本文所述的实施方案和方面的抗体。

在另一个实施方案中，本公开提供了一种分离的多核苷酸分子，所述分离的多核苷酸分子包含编码本文所述的实施方案和方面的抗体的核酸序列。

另一个实施方案提供了一种重组多肽，所述重组多肽包含抗体V_H结构域，所述抗体V_H结构域包含F48的V_H结构域的CDR 1-3；或F59的V_H结构域的CDR 1-3。

在另一个实施方案中，提供了一种重组多肽，所述重组多肽包含抗体V_L结构域，所述抗体V_L结构域包含F48或F59的V_L结构域的CDR 1-3。

另一个实施方案提供了一种分离的多核苷酸分子，所述分离的多核苷酸分子包含编码本文所述的实施方案和方面的多肽的核酸序列。

在另一个实施方案中，本公开提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含一种或多种多核苷酸分子，所述一种或多种多核苷酸分子编码本文所述的实施方案和方面的抗体或本文所述的实施方案和方面的重组多肽。在一些方面，所述宿主细胞是哺乳动物细胞、酵母细胞、细菌细胞、纤毛虫细胞或昆虫细胞。

本公开的另一个实施方案提供了一种制造抗体的方法，所述方法包括(a)在细胞中表达编码本文所述的实施方案和方面的抗体的V_L和V_H链的一种或多种多核苷酸分子；以及(b)从所述细胞中纯化所述抗体。

另一个实施方案提供了一种包含有效量的本文所述的实施方案和方面中任一项的抗体的组合物，所述组合物用于治疗受试者的癌症。本文还提供了包含有效量的本文所述的实施方案和方面的抗体的组合物用于治疗受试者的癌症的用途。

在另一个实施方案中，本公开提供了一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括施用有效量的本文所述的实施方案和方面中任一项的抗体。在某些方面，所述癌症是乳腺癌、肺癌、头颈癌、前列腺癌、食管癌、气管癌、皮肤癌脑癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、子宫颈癌、睾丸癌、结肠癌、直肠癌或皮肤癌。在特定方面，所述癌症是胶质母细胞瘤、肺癌或黑素瘤。在特定方面，所述抗体是在药学上可接受的组合物中。在一些具体方面，所述抗体以全身性方式施用。在其他方面，所述抗体以静脉内、皮内、肿瘤内、肌内、腹膜内、皮下或局部方式施用。

在另外的方面，所述方法还包括向所述受试者施用至少第二抗癌疗法。在这些方面中的一些方面中，所述第二抗癌疗法是手术疗法、化学疗法、放射疗法、冷冻疗法、激素疗法、免疫疗法或细胞因子疗法。在特定方面，所述第二抗癌疗法是化学疗法。在一些方面，所述化学疗法是替莫唑胺(temolozolomide)或阿扎胞苷。在另外的方面，所述第二抗癌疗法是HDAC抑制剂，诸如ACY-1215(罗西诺他(Rocilinostat))或图巴他汀(Tubastatin)。在特定方面，所述第二抗癌疗法包括免疫疗法，诸如免疫检查点抑制剂。在具体方面，所述至少一种免疫检查点抑制剂是抗CTLA-4抗体、抗PD-L1抗体和/或抗PD-1抗体。在一些方面，所述免疫检查点抑制剂是人程序性细胞死亡1(PD-1)结合拮抗剂、PDL1结合拮抗剂或PDL2结合拮抗剂。在某些方面，所述PD-1结合拮抗剂是单克隆抗体或其抗原结合片段。在一些方面，所述PD-1结合拮抗剂是纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、CT-011、BMS936559、MPDL328OA或AMP-224。

本公开的另一个实施方案提供了一种用于检测受试者中的癌症的方法，所述方法包括测试来自所述受试者的样品中相对于对照物FGL2升高的存在，其中所述测试包括使所述样品与本文所述的实施方案或方面中任一项的抗体接触。在一些方面，所述方法被进一步定义为体外方法。

如本文所用，就指定组分而言，“基本上不含”在本文中是指未有目的地将所述指定组分配制成组合物和/或所述指定组分仅作为污染物或仅以痕量存在。因此，由组合物的任何意外污染造成的指定组分的总量远低于0.05％。最优选的是用标准分析方法在其中检测不到指定组分的组合物。

如本文在说明书中所用的，“一个/种”可以表示一个/种或多个/种。如本文在权利要求中所用的，当与单词“包括”结合使用时，单词“一个/种”可以表示一个/种或多于一个/种。

在权利要求中使用的术语“或”是用于表示“和/或”，除非明确指示仅指代替代方案或者各替代方案是互相排斥的，但是本公开支持仅指代替代方案以及“和/或”的定义。如本文所用，“另一个”可以表示至少第二个或更多个。

在本申请通篇中，术语“约”用于指示一个值包括装置的固有误差变化、用于确定该值的方法或研究对象之间存在的变化。

通过下面的详细描述，本发明的其他目的、特征和优点将变得显而易见。然而，应当理解，尽管详细描述和具体实例指示了本发明的优选实施方案，但是这些详细描述和具体实例仅是以例示的方式给出的，因为通过此详细描述，在本发明的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员而言将变得显而易见。

附图说明

以下附图构成了本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个附图，结合本文呈现的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本发明。

图1A-1C：(图1A)通过免疫组织化学显示的正常脑和GBM组织中的FGL2表达。在胶质瘤组织中观察到染色增加。(图1B)用IgG对照物或F48抗FGL2抗体治疗的胶质母细胞瘤肿瘤细胞中F4/80和CD206的表达的流式细胞术分析。(图1C)用IgG对照物或F48抗FGL2抗体治疗的胶质母细胞瘤肿瘤中M2巨噬细胞的百分比。

图2：示出了接种CT2A肿瘤细胞并用IgG、抗PDL1或抗PDL1+抗FGL2抗体治疗的小鼠的额叶和肿瘤的重量。

图3A-3C：(图3A)用替莫唑胺(TMZ)与IgG、F59、抗PDL1或F48的组合治疗的胶质瘤GL261肿瘤的存活百分比。在单独用IgG治疗的小鼠中观察到最低的存活百分比，接着是TMZ+抗PDL1抗体，和TMZ+IgG。在用TMZ+F59抗体治疗的小鼠中观察到最高的存活百分比，接着是用TMZ+F48抗体治疗的小鼠。(图3B)TMZ与F48或F59抗体的组合减少了肿瘤体积。对各种抗体下的FLG2表达进行蛋白质印迹分析。在用抗FGL2抗体治疗的肿瘤中FGLS表达降低。(图3C)接种GL261并用IgG对照物或F59治疗的小鼠的存活百分比。F59治疗可提高存活百分比。

图4A-4B：(图4A)用单独的抗FGL2抗体F59或其与抗PDL1抗体的组合治疗的路易斯氏肺癌(Lewis lung carcinoma，LLC)肿瘤模型小鼠的存活百分比。抗PDL1抗体和抗FGL2抗体抑制LLC进展。(图4B)经治疗的小鼠的肺、肾和肝的图像。F59和PDL1使得肺和肝中的肿瘤结节数量都减少。

图5A-5C：(图5A)用IgG对照物或F48抗FGL2抗体治疗的黑素瘤模型小鼠的肿瘤重量以及肿瘤图像。(图5B)在首次治疗后长达17天用IgG对照物或F48抗FGL2抗体治疗的单个小鼠中的肿瘤体积。(图5C)在首次治疗后长达17天用IgG对照物或F48抗FGL2抗体治疗的小鼠中的肿瘤体积。

图6A-6B：接种B16F10黑素瘤细胞并用指定的疗法组合治疗的小鼠的肿瘤体积(图6A)和重量(图6B)。

图7A-7E：脑肿瘤细胞中的CRISPR/Cas9介导的FGL2敲除废止了鼠模型中的肿瘤进展。(图7A)通过蛋白质印迹检测FGL2在三种肿瘤细胞系(对照(Ctrl)和FGL2-敲除(KO)或敲低(KD)肿瘤细胞)中的表达水平。所示的蛋白质印迹代表三个独立的实验。(图7B)植入GL261-Ctrl或GL261-FGL2KO肿瘤细胞(每只小鼠5×10⁴个细胞；n＝9/组)的野生型(WT)免疫活性C57BL/6小鼠的存活曲线。植入FGL2KO细胞的小鼠具有最高的存活百分比。(图7C)植入路易斯氏肺癌(LLC)-Ctrl或LLC-FGL2KO肿瘤细胞(每只小鼠5×10⁴个细胞；n＝4/组)的WT免疫活性C57BL/6小鼠的存活曲线。植入FGL2KO细胞的小鼠具有最高的存活百分比。(图7D)植入小鼠星形细胞瘤(DBT)-Ctrl细胞或DBT-FGL2KD肿瘤细胞(每只小鼠5×10⁴个细胞；n＝4/组)的WT免疫活性BALB/C小鼠的存活曲线。植入FGL2KO细胞的小鼠具有最高的存活百分比。(图7E)示出在肿瘤细胞植入后第1天和第7天的DBT-Ctrl和DBT-FGL2KD肿瘤的生物发光成像。

图8：FGL2抗体促进活化诱导的T细胞生长。将OT-I T细胞用αCD3/CD28活化，接着分到不同的培养皿中，以检查在+OVA肽(pep)的存在或不存在下、在FGL2 mAb F48的存在或不存在下以及在F48的存在或不存在下的增殖。在不同的日子计数细胞数。

具体实施方式

如上文所讨论，需要另外的免疫疗法来治疗具有冗余免疫抑制机制的癌症，诸如胶质母细胞瘤。因此，在某些实施方案中，本公开提供了阻断FGL2的单克隆抗体。

在特定实施方案中，本文提供的抗FGL2单克隆抗体是F48和F59抗体。F48和F59均可阻断CD39和CD73调节性T细胞的表达，并具有跨物种结合的特性。鉴于CD39和CD73的组合将ATP、ADP和AMP降解为腺苷，可以将它们视为将ATP驱动的促炎性免疫细胞活性转变为由腺苷介导的抗炎状态的“免疫开关”。CD39和CD73均在几种免疫细胞的功能调节中发挥作用，所述免疫细胞包括淋巴细胞、中性粒细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突状细胞和内皮细胞(Antonioli等人,2013)。

因此，尽管当前的抗免疫检查点抗体诸如PDL1抗体阻断一种免疫抑制蛋白，但是本文提供的抗FGL2抗体阻断了广泛的免疫抑制系统和免疫检查点，因为FGL2调节多种免疫检查点蛋白的表达。因此，可证明FGL2阻断抗体能更有效地治疗癌症，包括已知表达高水平的FGL2的高度恶性和转移性肿瘤。

在本研究中，已显示单独的抗FGL2抗体或其与其他抗癌疗法的组合可有效治疗多种癌症，包括胶质母细胞瘤、肺癌和黑素瘤。抗癌疗法可包括免疫检查点抑制剂(诸如抗PDL1抗体)和/或化学疗法(诸如TMZ)。

因此，本公开还提供了通过施用本文提供的一种或多种抗FGL2抗体来逆转免疫抑制的方法。所述方法可适用于癌症或感染性疾病的治疗。在特定方面，抗FGL2可用于抑制肿瘤生长和/或肿瘤转移。

I.定义

“治疗”是指为了获得疾病或健康相关疾患的治疗益处而向受试者施用或应用治疗剂或对受试者进行手术或用药程式。例如，治疗可包括施用抑制FGL2信号转导的抗体。

“受试者”和“患者”是指人或非人动物，诸如灵长类动物、哺乳动物和脊椎动物。在特定实施方案中，受试者是人。

在本申请通篇中使用的术语“治疗益处”或“治疗有效的”是指就该疾患的医学治疗而言促进或增强受试者的健康的任何事物。这包括但不限于降低疾病迹象或症状的频率或严重程度。例如，癌症的治疗可涉及例如肿瘤大小的减小、肿瘤侵袭性的减小、癌症生长速率的降低或转移的预防。癌症的治疗还可以指延长患有癌症的受试者的存活期。

“抗癌”剂能够例如通过促进癌细胞的杀伤、诱导癌细胞的凋亡、降低癌细胞的生长速率、降低转移的发生率或数量、减小肿瘤大小、抑制肿瘤生长、减少向肿瘤或癌细胞的血液供应、促进针对癌细胞或肿瘤的免疫应答、预防或抑制癌症的进展或延长患有癌症的受试者的寿命来对受试者的癌细胞/肿瘤产生负面影响。

本文的术语“抗体”是以最广泛的含义使用并且具体地涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的生物活性即可。

如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群体获得的抗体，例如除可能的突变如可以少量存在的天然存在的突变之外，构成所述群体的个别抗体是相同的。因此，修饰语“单克隆”指示抗体的特征，即并非不同抗体的混合物。在某些实施方案中，这种单克隆抗体通常包括含有结合靶标的多肽序列的抗体，其中所述靶标结合多肽序列通过包括从多个多肽序列中选择单个靶标结合多肽序列的方法获得。例如，所述选择方法可以是从多个克隆，诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的库中选择一个独特的克隆。应当理解，可以进一步改变所选的靶标结合序列，目的是例如提高对靶标的亲和力，使靶标结合序列人源化，改善细胞培养物中靶标结合序列的产生，降低靶标结合序列的体内免疫原性，产生多特异性抗体等，而且包含所述改变的靶结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。单克隆抗体制剂除了特异性之外，它们的优点还在于它们通常不被其他免疫球蛋白污染。

短语“药学上或药理学上可接受的”是指当适当地施用于动物诸如人时不会产生不利、过敏或其他不良反应的分子实体和组合物。根据本公开，包含抗体或另外的活性成分的药物组合物的制备将是本领域技术人员已知的。此外，应当理解，对于动物(例如人)施用，制备还应符合FDA生物学标准办公室所要求的无菌性、热原性、整体安全性和纯度标准。

如本文所用，如本领域普通技术人员所了解的，“药学上可接受的载剂”包括任何和所有的水性溶剂(例如水、醇/水性溶液、盐水溶液、肠胃外媒介物，诸如氯化钠、林格氏右旋糖等)、非水性溶剂(例如丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射的有机酯，诸如油酸乙酯)、分散介质、衣料、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗菌剂或抗真菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料、液体和营养补充剂，诸如此类的物质以及它们的组合。根据众所周知的参数调整药物组合物中各种组分的pH和确切浓度。

术语“单位剂量”或“剂型”是指适于在受试者中使用的物理上离散的单位，每个单位含有经计算产生上文所讨论的与其施用(即适当途径和治疗方案)相关的所需反应的预定量的治疗性组合物。根据治疗次数和单位剂量的待施用量取决于所需的效果。施用于患者或受试者的本发明实施方案的组合物的实际剂量可通过物理和生理因素来确定，所述因素诸如有受试者的体重、年龄、健康状况和性别、所治疗疾病的类型、疾病侵入的程度、既往或并行的治疗性干预、患者的自发病、施用途径，以及特定治疗性物质的效力、稳定性和毒性。例如，剂量还可包括每次施用约1μg/kg/体重至约1000mg/kg/体重(该范围包括中间剂量)或更多，以及其中可衍生的任何范围。在从本文列出的数字衍生的范围的非限制性实例中，可以施用的范围为约5μg/kg/体重至约100mg/kg/体重、约5μg/kg/体重至约500mg/kg/体重等。在任何情况下，负责施用的执业医生都将确定组合物中一种或多种活性成分的浓度和适于个体受试者的一个或多个剂量。

当应用于细胞时，术语“接触的”和“暴露的”在本文中用于描述将治疗性构建体和化学治疗剂或放射治疗剂递送至靶细胞或与靶细胞直接并置安置的过程。为了实现细胞杀伤，例如将两种剂以有效杀死细胞或防止细胞分裂的组合量递送至细胞。

术语“免疫检查点”是指免疫系统中向其组分提供抑制信号以平衡免疫反应的分子诸如蛋白质。已知的免疫检查点蛋白包括CTLA-4、PDl及其配体PD-Ll和PD-L2，以及LAG-3、BTLA、B7H3、B7H4、TIM3、KIR。涉及LAG3、BTLA、B7H3、B7H4、TIM3和KIR的途径在本领域中被认为构成类似于CTLA-4和PD-1依赖性途径的免疫检查点途径(参见例如Pardoll,2012；Mellman等人,2011)。

“免疫检查点抑制剂”是指抑制免疫检查点蛋白的功能的任何化合物。抑制包括功能降低和完全阻断。特别地，免疫检查点蛋白是人免疫检查点蛋白。因此，免疫检查点蛋白抑制剂特别地是人免疫检查点蛋白的抑制剂。

II.抗FGL2抗体

在某些实施方案中，考虑了与FGL2蛋白的至少一部分结合并抑制FGL2信号传导的抗体或其片段。所述抗体可以选自由以下组成的组：嵌合抗体、亲和力成熟的抗体(affinity matured antibody)、多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人抗体或抗原结合抗体片段或天然或合成配体。优选地，抗FGL2抗体是单克隆抗体或人源化抗体。

因此，通过已知手段并如本文所述，可以产生对FGL2蛋白、其一个或多个对应表位或前述任一项的缀合物特异的多克隆或单克隆抗体、抗体片段，以及结合结构域和CDR(包括前述任一项的工程化形式)，无论此类抗原或表位是从天然来源中分离而来，抑或是天然化合物的合成衍生物或变体。

适于本发明实施方案的抗体片段的实例包括但不限于：(i)由V_L、V_H、C_L和C_H1结构域组成的Fab片段；(ii)由V_H和C_H1结构域组成的“Fd”片段；(iii)由单个抗体的V_L和V_H结构域组成的“Fv”片段；(iv)由V_H结构域组成的“dAb”片段；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab')2片段，即包含两个连接的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(“scFv”)，其中V_H结构域和V_L结构域通过肽接头连接，所述肽接头允许这两个结构域缔合以形成结合结构域；(viii)双特异性单链Fv二聚体(参见美国专利号5,091,513)；以及(ix)双抗体，即通过基因融合构建的多价或多特异性片段(美国专利公布号20050214860)。Fv、scFv或双抗体分子可以通过掺入连接V_H和V_L结构域的二硫键来稳定。还可以制备包含与CH3结构域连接的scFv的微抗体(Hu等人,1996)。

在一些实施方案中，抗FGL2抗体包含SEQ ID NO:2的重链的CDR 1-3(SYWMQ；EIDPSDSYTNYNQKFKG；NGNYYGSTYDY(SEQ ID NO:5-7))和SEQ ID NO:4的轻链的CDR 1-3(RASQDVSNYLN；YTSRLHS；QQGNTLPPWT(SEQ ID NO:8-10))。抗FGL2抗体可与SEQ ID NO:1-4具有至少80％，诸如85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。重链和轻链序列如下所示，其中CDR带有下划线，前导序列用斜体表示。

F48重链(SEQ ID NO:1)

F48重链(SEQ ID NO:2)

F48轻链(SEQ ID NO:3)

F48轻链(SEQ ID NO:4)

在实施方案中还考虑了抗体样结合拟肽。Liu等人(2003)描述了“抗体样结合拟肽”(ABiP)，其是充当被削减的抗体并且具有血清半衰期更长且合成方法不那么繁琐等某些优点的肽。

可以给动物接种抗原，诸如FGL2胞外结构域(ECD)蛋白，以产生对FGL2蛋白特异的抗体。在很多情况下，抗原与另一分子结合或缀合以增强免疫应答。如本文所用，缀合物是与抗原结合的任何肽、多肽、蛋白质或非蛋白质性物质，其用于在动物中引发免疫应答。响应于抗原接种而在动物中产生的抗体包括由多种产生单个抗体的B淋巴细胞制成的多种不同分子(多克隆抗体)。多克隆抗体是多个抗体种类的混合群体，每种抗体都可以识别相同抗原上的不同表位。给定在动物中产生多克隆抗体的正确条件，动物血清中的大多数抗体将识别动物已经免疫过的抗原性化合物上的集合表位。通过亲和纯化以仅选择那些识别感兴趣的抗原或表位的抗体，可以进一步增强特异性。

单克隆抗体是单一种类的抗体，其中每个抗体分子都识别相同的表位，因为所有产生抗体的细胞均衍生自单个B淋巴细胞细胞系。产生单克隆抗体(MAb)的方法通常与制备多克隆抗体的方法相同。在一些实施方案中，将啮齿动物诸如小鼠和大鼠用于产生单克隆抗体。在一些实施方案中，将兔、绵羊或青蛙细胞用于产生单克隆抗体。使用大鼠是众所周知的，并且可以提供某些优点。按照惯例使用小鼠(例如BALB/c小鼠)，并且通常产生高百分比的稳定融合物。

杂交瘤技术涉及将先前用FGL2抗原免疫的小鼠的单个B淋巴细胞与永生性骨髓瘤细胞(通常为小鼠骨髓瘤)融合。该技术提供了使单个产生抗体的细胞无限期繁殖的方法，使得可以产生无限量的具有相同抗原或表位特异性的结构相同的抗体(单克隆抗体)。

血浆B细胞(CD45⁺CD5^-CD19⁺)可以从新鲜制备的免疫兔的兔外周血单核细胞中分离，并进一步选择用于FGL2结合细胞。在富集产生抗体的B细胞后，可以分离总RNA并合成cDNA。可将来自重链和轻链的抗体可变区的DNA序列扩增，构建成噬菌体展示Fab表达载体，并转化为大肠杆菌。FGL2特异性结合Fab可以通过多轮富集淘选来选择并测序。可以使用哺乳动物表达载体系统在人胚胎肾脏(HEK293)细胞(Invitrogen)中作为兔和兔/人嵌合形式的全长IgG表达所选的FGL2结合命中物，并使用快速蛋白质液相色谱法(FPLC)分离单元使用蛋白G树脂进行纯化。

在一个实施方案中，抗体是嵌合抗体，例如包含接枝到异源非人、人或人源化序列(例如构架和/或恒定结构域序列)的来自非人供体的抗原结合序列的抗体。已经开发出用人起源的类似结构域替换单克隆抗体的轻链和重链恒定结构域而使外源抗体的可变区保持完整的方法。或者，在针对人免疫球蛋白基因进行基因改造的小鼠中产生“完全人”单克隆抗体。还已经开发出通过重组构建具有啮齿动物(例如小鼠)和人氨基酸序列的抗体可变结构域来将单克隆抗体的可变结构域转化为更具人形式的方法。在“人源化”单克隆抗体中，仅高变CDR衍生自小鼠单克隆抗体，构架和恒定区则衍生自人氨基酸序列(参见美国专利号5,091,513和6,881,557)。据认为，用在人抗体的相应位置上发现的氨基酸序列替换啮齿动物特有的抗体中的氨基酸序列，将降低治疗使用期间发生不利的免疫反应的可能性。产生抗体的杂交瘤或其他细胞还可以经历遗传突变或其他改变，这可能改变或不改变由杂交瘤产生的抗体的结合特异性。

用于产生各种动物种类的多克隆抗体以及用于产生包括人源化、嵌合和完全人在内的各种类型的单克隆抗体的方法在本领域中是众所周知的并且是高度可预测的。例如，以下美国专利和专利申请提供了这种方法的可行描述：美国专利申请号2004/0126828和2002/0172677号；以及美国专利号3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,196,265；4,275,149；4,277,437；4,366,241；4,469,797；4,472,509；4,606,855；4,703,003；4,742,159；4,767,720；4,816,567；4,867,973；4,938,948；4,946,778；5,021,236；5,164,296；5,196,066；5,223,409；5,403,484；5,420,253；5,565,332；5,571,698；5,627,052；5,656,434；5,770,376；5,789,208；5,821,337；5,844,091；5,858,657；5,861,155；5,871,907；5,969,108；6,054,297；6,165,464；6,365,157；6,406,867；6,709,659；6,709,873；6,753,407；6,814,965；6,849,259；6,861,572；6,875,434；和6,891,024。本文及其中引用的所有专利、专利申请公布和其他公布均特此以引用方式并入本申请。

抗体可以从任何动物来源产生，包括鸟类和哺乳动物。优选地，抗体是绵羊、鼠类(例如小鼠和大鼠)、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡。另外，较新的技术允许从人组合抗体文库开发和筛选人抗体。例如，如美国专利号6,946,546中所述的，噬菌体抗体表达技术允许在没有动物免疫的情况下产生特异性抗体，所述专利以引用方式并入本文。这些技术进一步描述于：Marks(1992)；Stemmer(1994)；Gram等人(1992)；Barbas等人(1994)；和Schier等人(1996)。

充分预期针对FGL2的抗体将具有中和或抵消FGL2效应的能力，而与动物的种类、单克隆细胞系或抗体的其他来源无关。对于产生治疗性抗体，某些动物种类可能不太理想，因为它们更有可能因抗体的“Fc”部分激活补体系统而引起过敏反应。然而，整个抗体可以被酶消化成“Fc”(补体结合)片段，以及具有结合结构域或CDR的抗体片段。去除Fc部分降低了抗原抗体片段引起不期望的免疫应答的可能性，因此，不含Fc的抗体可以优先用于预防性或治疗性治疗。如上所述，抗体还可以被构建为嵌合的或部分或完全人的，以减少或消除由于向动物施用已在其他物种中产生或具有来自其他物种的序列的抗体而导致的不利免疫后果。

取代的变体通常在蛋白质内的一个或多个位点处包含一个氨基酸与另一个氨基酸的交换，并且可以被设计为在损失或不损失其他功能或特性的情况下调控多肽的一个或多个特性。取代可以是保守的，即，一个氨基酸被形状和电荷相似的一个氨基酸替换。保守取代在本领域中是众所周知的，并且包括例如以下改变：丙氨酸变为丝氨酸；精氨酸变为赖氨酸；天冬酰胺变为谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸变为谷氨酸；半胱氨酸变为丝氨酸；谷氨酰胺变为天冬酰胺；谷氨酸变为天冬氨酸；甘氨酸变为脯氨酸；组氨酸变为天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸变为亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸变为缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸变为精氨酸；甲硫氨酸变为亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸变为酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸变为苏氨酸；苏氨酸变为丝氨酸；色氨酸变为酪氨酸；酪氨酸变为色氨酸或苯丙氨酸；缬氨酸变为异亮氨酸或亮氨酸。或者，取代可以是非保守的，使得多肽的功能或活性受到影响。非保守改变通常涉及用化学上不同的残基取代残基，如用极性或带电荷的氨基酸取代非极性或不带电荷的氨基酸，反之亦然。

蛋白质可以是重组的，或者是体外合成的。或者，可以从细菌中分离出非重组或重组蛋白。还预期在组合物和方法中实现含有这种变体的细菌。因此，不需要分离蛋白质。

预期在组合物中每毫升有约0.001mg与约10mg之间的总多肽、肽和/或蛋白质。因此，在组合物中蛋白质的浓度可以为约、至少约或至多约0.001、0.010、0.050、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0mg/ml或更高(或其中可衍生的任何范围)。其中，约、至少约或至多约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％可能是结合FGL2的抗体。

抗体或优选抗体的免疫部分可以与其他蛋白质化学缀合或表达为融合蛋白。为了本说明书和所附权利要求的目的，所有这样的融合蛋白都包括在抗体或抗体的免疫部分的定义中。

实施方案提供了与至少一种剂连接以形成抗体缀合物或有效载荷的针对FGL2的抗体和抗体样分子、多肽和肽。为了提高抗体分子作为诊断剂或治疗剂的功效，习惯上是连接或共价结合或复合至少一种所需的分子或部分。这样的分子或部分可以是但不限于至少一种效应子或报告分子。效应分子包括具有所需活性(例如细胞毒性活性)的分子。已经附接至抗体的效应分子的非限制性实例包括毒素、治疗性酶、抗生素、放射性标记的核苷酸等。相比之下，报告分子被定义为可使用测定检测到的任何部分。已经与抗体缀合的报告分子的非限制性实例包括酶、放射性标记、半抗原、荧光标记、磷光分子、化学发光分子、发色团、发光分子、光亲和力分子、有色颗粒或配体诸如生物素。

用于将抗体附接或缀合至其缀合部分的几种方法在本领域中是已知的。一些附接方法涉及使用附接至抗体的金属螯合复合物，其采用例如有机螯合剂诸如二亚乙基三胺五乙酸酐(DTPA)；二亚乙基三胺四乙酸；N-氯-对甲苯磺酰胺；和/或四氯-3-6-二苯基甘脲-3。单克隆抗体还可以在偶联剂诸如戊二醛或高碘酸盐的存在下与酶反应。在这些偶联剂的存在下或通过与异硫氰酸酯反应来制备具有荧光素标记的缀合物。

III.使用方法

本发明实施方案的某些方面可用于预防或治疗与FGL2信号转导相关联的疾病或病症。可以通过任何合适的药物来减少FGL2的信号传导，从而防止癌细胞增殖。优选地，此类物质将是用以逆转抑制免疫系统的机制的抗FGL2抗体。

在某些实施方案中，本发明实施方案的组合物和方法涉及针对FGL2以抑制其在癌细胞增殖中的活性的抗体或抗体片段与第二或另外的疗法的组合。这种疗法可用于治疗与FGL2介导的细胞增殖相关联的任何疾病。例如，所述疾病可以是癌症。

因此，在一些实施方案中，本文提供了用于治疗或延缓个体癌症发展的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的抗FGL2抗体。预期进行治疗的癌症的实例包括肺癌、头颈癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、子宫颈癌、胃肠癌、淋巴瘤、肺中的瘤前病变(pre-neoplastic lesions)、结肠癌、黑素瘤和膀胱癌。

在一些实施方案中，个体患有对一种或多种抗癌疗法具有抗性(已展现出抗性)的癌症。在一些实施方案中，对抗癌疗法的抗性包括癌症或难治性癌症的复发。复发可能是指治疗后在原始部位或新部位再次出现癌症。在一些实施方案中，对抗癌疗法的抗性包括在用抗癌疗法进行治疗期间癌症的进展。在一些实施方案中，癌症处于早期或晚期。

A.药物制剂

在进行含有抑制性抗体的治疗组合物的临床应用的情况下，制备适合于预期应用的药物或治疗性组合物通常将是有益的。在某些实施方案中，药物组合物可包含例如至少约0.1％的活性化合物。在其他实施方案中，活性化合物可占单元重量的约2％至约75％之间，或例如约25％至约60％之间，以及在其中可衍生的任何范围。

本发明实施方案的治疗性组合物有利地以可注射组合物的形式以液体溶液或悬浮液形式施用；还可以制备适于在注射之前溶解或悬浮于液体中的固体形式。这些制备物还可以被乳化。

可以将活性化合物配制用于肠胃外施用，例如配制用于经由静脉内、肌内、皮下或甚至腹膜内途径注射。通常，此类组合物可以被制备成液体溶液或悬浮液；还可以制备适于在注射前加入液体来制备溶液或悬浮液的固体形式；并且，所述制备物还可以被乳化。

适于注射用途的药物形式包括无菌水溶液或分散液；包含麻油、花生油或丙二醇水溶液的制剂；以及用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉剂。在所有情况下，所述形式必须是无菌的并且必须可流动，以达到易于注射的程度。所述形式还应在制造和储存条件下稳定，并且必须进行防腐以防止诸如细菌和真菌的微生物的污染作用。

可以将蛋白质性组合物配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括酸加成盐(由蛋白质的游离氨基形成)，并且其由无机酸(诸如盐酸或磷酸)或有机酸(诸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成。由游离羧基形成的盐还可以衍生自诸如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物的无机碱，以及诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等的有机碱。

药物组合物可包含含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物以及植物油的溶剂或分散介质。可例如通过使用诸如卵磷脂的包衣、通过在分散液的情况下维持所需粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。对微生物作用的防止可通过各种抗菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)来实现。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以使可注射组合物的吸收延长。

可通过将具有所需纯度的活性成分(诸如抗体或多肽)与一种或多种任选的药学上可接受的载剂(Remington's Pharmaceutical Sciences第22版，2012)混合以冻干制剂或水溶液的形式制备本文所述的药物组合物和制剂。药学上可接受的载剂在所采用的剂量和浓度下通常对接受者是无毒的，并且包括但不限于：缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化六甲双铵(hexamethonium chloride)、苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟苯甲酸烷酯，诸如对羟苯甲酸甲酯或丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、凝胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯基吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷酰氨酸、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖以及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐平衡离子，诸如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性药学上可接受的载剂还包括间质药物分散剂，诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20(

Baxter International,Inc.)。某些示例性sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20，描述于美国专利公布号2005/0260186和2006/0104968中。在一方面，将一种sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶(诸如软骨素酶)组合。

B.组合治疗

在一些实施方案中，本公开的方法包括抗FGL2抗体和另外的抗癌治疗剂的组合。

所述方法和组合物，包括组合疗法，增强了另一种抗癌或抗过度增殖疗法的治疗或保护作用，和/或提高了治疗作用。可以采用有效地实现所需作用，诸如杀死癌细胞和/或抑制细胞过度增殖的组合量提供治疗性和预防性方法和组合物。所述过程可能涉及使细胞与抗体或抗体片段和第二疗法接触。可以使组织、肿瘤或细胞与包含一种或多种剂(即抗体或抗体片段或抗癌剂)的一种或多种组合物或药物制剂接触，或通过使组织、肿瘤和/或细胞与两种或更多种不同的组合物或制剂接触，其中一种组合物提供1)抗体或抗体片段、2)抗癌剂，或3)抗体或抗体片段和抗癌剂两者。另外，预期这种组合疗法可以与化学疗法、放射疗法、手术疗法或免疫疗法结合使用。

相对于抗癌治疗，抑制性抗体可以在之前、期间、之后或以各种组合施用。施用间隔可以从同时发生至数分钟至数天至数周。在将抗体或抗体片段与抗癌剂分开提供给患者的实施方案中，通常将确保在每次递送之间没有明显的时间间隔，使得两种化合物仍然能够对患者发挥有利的组合作用。在这样的情况下，预期可以在彼此间隔约12至24或72小时内，更具体地在彼此间隔约6-12小时内向患者提供抗体疗法和抗癌疗法。在一些情况下，可能希望将治疗时间段显著延长，每次施用之间经过几天(2天、3天、4天、5天、6天或7天)至几周(1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周)。

在某些实施方案中，一个治疗过程将持续1-90天或更长时间(此范围包括中间天数)。预期可以在第1天至第90天的任何一天(此范围包括中间天)或它们的任何组合给予一种剂，并且在第1天至第90天的任何一天(该范围包括中间天)或它们的任意组合施用另一种剂。在一天(24小时时期内)内，可以向患者一次或多次施用这一种或多种剂。此外，在一个治疗过程之后，预期在一个时间段内不施用抗癌治疗。取决于患者的状况，诸如患者的预后、体力、健康等，此时间段可能持续1-7天，和/或1-5周，和/或1-12个月或更长时间(此范围包括中间天数)。期望将在必要时重复治疗周期。

可以采用各种组合。对于以下实例，抗体疗法为“A”，抗癌疗法为“B”：

将本发明实施方案的任何化合物或疗法施用于患者将遵循用于施用此类化合物的一般方案，将这些剂的毒性(如果有的话)考虑在内。因此，在一些实施方案中，存在监测由组合疗法所引起的毒性的步骤。

1.化学疗法

根据本发明的实施方案，可以使用多种化学治疗剂。术语“化学疗法”是指使用药物来治疗癌症。“化学治疗剂”用于表示在癌症治疗中施用的化合物或组合物。按照这些剂或药物在细胞内的活动方式，例如其是否影响细胞周期以及在什么阶段影响细胞周期，对它们进行分类。或者，可以基于剂直接交联DNA，嵌入DNA或通过影响核酸合成来诱导染色体和有丝分裂畸变的能力对其进行表征。

化学治疗剂的实例包括烷基化剂，诸如噻替哌(thiotepa)和环磷酰胺；烷基磺酸盐，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，诸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredope)；乙撑亚胺(ethylenimine)和甲基蜜胺(methylamelamine)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成的类似物拓扑替康)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；隐藻素(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他丁(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥，诸如氯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异磷酰胺、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥、美法仑、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲洛磷胺(trofosfamide)和尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；硝基脲(nitrosurea)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲霉素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，诸如烯二炔抗生素(例如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γlI和加利车霉素ωI1)；达尼米星(dynemicin)，包括达尼米星A；双膦酸盐，诸如氯膦酸盐；埃司帕米星(esperamicin)；以及新抑癌菌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔抗生素发色团、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authrarnycin)、氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、更生霉素(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧-L-正亮氨酸、阿霉素(doxorubicin)(包括吗啉代阿霉素、氰吗啉代阿霉素、2-吡咯啉阿霉素和脱氧阿霉素)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、依达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)(诸如丝裂霉素C)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalarnycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培来霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)和佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，诸如甲氨蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、蝶罗呤(pteropterin)和曲麦克特(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)和硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、氮杂胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)和氟尿苷(floxuridine)；雄激素，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、羟甲雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)和睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如曼托坦(mitotane)和曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基酮戊酸；蒽尿嘧啶(eniluracil)；氨苯吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elformithine；醋酸羟哔咔唑(elliptiniumacetate)；epothilone；环氧甘醚(etoglucid)；硝酸镓；羟脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登木素生物碱(maytansinoid)，诸如美登素(maytansine)和美坦西醇(ansamitocin)；丙米腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫匹达谋(mopidanmol)；nitraerine；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；足叶草酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；甲基苄肼(procarbazine)；PSK多糖复合物；丙亚胺(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西作非兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细格孢氮杂酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢菌素(trichothecene)(尤其是T-2毒素、verracurin A、杆孢菌素(roridin)A和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；类紫杉醇(taxoid)，例如紫杉醇和多西他赛吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；铂配位复合物，诸如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide，VP-16)；异磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)；诺安托(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤；希罗达(xeloda)；伊本膦酸盐(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(例如CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇(retinoid)，诸如视黄酸；卡培他滨(capecitabine)；卡铂、丙卡巴肼(procarbazine)、plicomycin、吉西他滨(gemcitabien)、纳韦尔滨(navelbine)、法呢基-蛋白转移酶抑制剂、反式铂以及上述任何药剂的药学上可接受的盐、酸或衍生物。

2.放射疗法

引起DNA损害并且已被广泛使用的其他因素包括通常称为γ射线、X射线，和/或直接递送放射性同位素至肿瘤细胞的那些。还考虑了DNA损害因素的其他形式，诸如微波、质子束照射(美国专利号5760395和4870287)，和UV照射。所有这些因素最有可能引起对DNA、DNA前体、DNA复制和修复以及染色体组装和维持的广泛损害。X射线的剂量范围为从日剂量50至200伦琴持续长时间(3至4周)至单次剂量2000至6000伦琴。放射性同位素的剂量范围差别很大，并且取决于同位素的半衰期、所发射辐射的强度和类型以及赘生性细胞的吸收。

3.免疫疗法

本领域技术人员将理解，可以将另外的免疫疗法与实施方案的方法组合或结合使用。在癌症治疗的背景下，免疫疗法通常依赖于使用免疫效应细胞和分子来靶向和破坏癌细胞。利妥昔单抗

就是这样的实例。免疫效应子可以是例如对肿瘤细胞表面上的某些标记物具有特异性的抗体。单独的抗体可以充当疗法的效应子，或者可以募集其他细胞来实际影响细胞杀伤。抗体还可以与药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、蓖麻毒蛋白A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)缀合，并且充当靶向剂。或者，效应子可以是携带表面分子的淋巴细胞，所述表面分子与肿瘤细胞靶标直接或间接地相互作用。各种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。

抗体-药物缀合物已成为癌症治疗剂开发的突破性方法。癌症是世界上主要的死亡原因之一。抗体-药物缀合物(ADC)包含与杀细胞药物共价连接的单克隆抗体(MAb)。这种方法将MAb针对其抗原靶标的高特异性与高度有效的细胞毒性药物组合在一起，从而产生了“武装”的MAb，它们可将有效载荷(药物)递送至具有丰富抗原水平的肿瘤细胞。药物的靶向递送还使药物在正常组织中的暴露量降至最低，从而降低了毒性并提高了治疗指数。FDA在2011年和2013年分别批准了两种ADC药物：

(本妥昔单抗(brentuximabvedotin)和

(美坦新曲妥珠单抗(trastuzumab emtansine)或T-DM1)，此举验证了该方法。目前针对癌症治疗，有多于30种处于临床试验各个阶段的ADC药物候选物(Leal et al.,2014)。随着抗体工程改造和接头-有效载荷优化的日趋成熟，新ADC的发现和发展越来越依赖于对适于此方法的新靶标的鉴定和验证以及靶向MAb的产生。ADC靶标的两个标准是肿瘤细胞中上调/高水平的表达和强大的内在化。

在免疫疗法的一方面，肿瘤细胞必须带有某种标记物，该标记物可以被靶向，即在大多数其他细胞上不存在。存在许多肿瘤标记物，并且在本发明实施方案的背景下，这些肿瘤标记物中的任何一种都可能适于靶向。常见的肿瘤标记物包括CD20、癌胚抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸化的路易斯抗原(Sialyl Lewis Antigen)、MucA、MucB、PLAP、层粘连蛋白受体、erb B和p155。免疫疗法的替代方面是将抗癌作用与免疫刺激作用组合起来。还存在免疫刺激分子，包括：细胞因子(诸如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN)、趋化因子(诸如MIP-1、MCP-1、IL-8)和生长因子(诸如FLT3配体)。

免疫疗法的实例包括例如牛分枝杆菌、恶性疟原虫、二硝基氯苯和芳族化合物(美国专利5,801,005和5,739,169；Hui和Hashimoto,1998；Christodoulides等人,1998)；细胞因子疗法，例如干扰素α、β和γ、IL-1、GM-CSF和TNF(Bukowski等人,1998；Davidson等人,1998；Hellstrand等人,1998)；基因疗法，例如TNF、IL-1、IL-2和p53(Qin等人,1998；Austin-Ward和Villaseca,1998；美国专利5,830,880和5,846,945)；以及单克隆抗体，例如抗CD20、抗神经节苷脂GM2和抗p185(Hollander,2012；Hanibuchi等人,1998；美国专利5,824,311)。预期可将一种或多种抗癌疗法与本文所述的抗体疗法一起使用。

在一些实施方案中，免疫疗法可以是免疫检查点抑制剂。免疫检查点是免疫系统中打开信号的分子(例如共刺激分子)或关闭信号的分子。可能被免疫检查点阻断靶向的抑制性检查点分子包括腺苷A2A受体(A2AR)、B7-H3(也称为CD276)、B和T淋巴细胞衰减剂(BTLA)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4，也称为CD152)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、杀伤细胞免疫球蛋白(KIR)、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、程序性死亡1(PD-1)、T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM-3)以及T细胞活化的V结构域Ig抑制剂(VISTA)。特别地，免疫检查点抑制剂靶向PD-1轴和/或CTLA-4。

免疫检查点抑制剂可以是诸如小分子、配体或受体的重组形式的药物，或者特别地是诸如人抗体的抗体(例如，国际专利公布WO2015016718；Pardoll,2012；两者均以引用方式并入本文)。可以使用免疫检查点蛋白或其类似物的已知抑制剂，特别地可以使用嵌合、人源化或人形式的抗体。如技术人员将知道的，替代和/或等效名称可以用于本公开中提及的某些抗体。在本发明的上下文中，这样的替代和/或等效名称是可互换的。例如，已知lambrolizumab还以替代和等效名称MK-3475和派姆单抗为人所知。

在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1与其配体结合配偶体结合的分子。在具体方面，PD-1配体结合配偶体是PDL1和/或PDL2。在另一个实施方案中，PDL1结合拮抗剂是抑制PDL1与其结合配偶体结合的分子。在具体方面，PDL1结合配偶体为PD-1和/或B7-1。在另一个实施方案中，PDL2结合拮抗剂是抑制PDL2与其结合配偶体结合的分子。在具体方面，PDL2结合配偶体是PD-1。拮抗剂可为抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。示例性抗体描述于美国专利号US8735553、US8354509和US8008449，所述专利全部以引用方式并入本文。在本文提供的方法中使用的其他PD-1轴拮抗剂在本领域中是已知的，如描述于美国专利申请号US20140294898、US2014022021和US20110008369，所述专利全部以引用方式并入本文。

在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂为抗PD-1抗体(例如人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)。在一些实施方案中，抗PD-1抗体选自由以下组成的组：纳武单抗、派姆单抗和CT-011。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂为免疫粘附素(例如，包含与恒定区(例如免疫球蛋白序列的Fc区)融合的PDL1或PDL2的胞外或PD-1结合部分的免疫粘附素)。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂为AMP-224。纳武单抗(也称为MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558和

)是WO2006/121168中所述的抗PD-1抗体。派姆单抗(也称为MK-3475、Merck 3475、lambrolizumab、

和SCH-900475)是WO2009/114335中所述的抗PD-1抗体。CT-011(也称为hBAT或hBAT-1)是WO2009/101611中所述的抗PD-1抗体。AMP-224(也称为B7-DCIg)是WO2010/027827和WO2011/066342中所述的PDL2-Fc融合可溶性受体。

在本文提供的方法中可以靶向的另一种免疫检查点是细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4，也称为CD152)。人CTLA-4的完整cDNA序列的Genbank登录号为L15006。CTLA-4存在于T细胞表面，当与抗原呈递细胞表面上的CD80或CD86结合时，其充当“关闭”开关。CTLA4是免疫球蛋白超家族的成员，该家族在辅助T细胞的表面上表达并且向T细胞传输抑制信号。CTLA4与T细胞共刺激蛋白CD28相似，这两个分子均与抗原呈递细胞上的CD80和CD86(分别又称为B7-1和B7-2)结合。CTLA4向T细胞传输抑制信号，而CD28则传输刺激信号。胞内CTLA4也存在于调节性T细胞中，并且可能对其功能很重要。通过T细胞受体和CD28的T细胞活化导致CTLA-4(B7分子的抑制性受体)表达增加。

在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗CTLA-4抗体(例如人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。

适于本发明方法的抗人CTLA-4抗体(或衍生自其的VH和/或VL结构域)可以使用本领域众所周知的方法产生。或者，可以使用本领域公认的抗CTLA-4抗体。例如，在本文公开的方法中可以使用公开于以下的抗CTLA-4抗体：US 8,119,129；WO 01/14424；WO 98/42752；WO 00/37504(CP675,206，也称为曲美木单抗(tremelimumab)；以前称为替西木单抗(ticilimumab))；美国专利号6,207,156；Hurwitz等人(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95(17):10067-10071；Camacho等人(2004)J Clin Oncology 22(145):Abstract No.2505(抗体CP-675206)；以及Mokyr等人(1998)Cancer Res 58:5301-5304。前述每个出版物的教义均以引用方式并入本文。还可以使用与任何这些本领域公认的抗体竞争结合CTLA-4的抗体。例如，人源化CTLA-4抗体描述于国际专利申请号WO2001014424、WO2000037504和美国专利号US8017114，所述专利全部以引用方式并入本文。

示例性抗CTLA-4抗体是易普利姆玛(ipilimumab)(也称为10D1、MDX-010、MDX-101和

)或其抗原结合片段和变体(参见例如WOO 1/14424)。在其他实施方案中，抗体包含易普利姆玛的重链和轻链CDR或VR。因此，在一个实施方案中，抗体包含易普利姆玛的VH区的CDR1、CDR2和CDR3结构域，以及易普利姆玛的VL区的CDR1、CDR2和CDR3结构域。在另一个实施方案中，抗体竞争结合CTLA-4上与上述抗体相同的表位。在另一个实施方案中，抗体与上述抗体具有至少约90％的可变区氨基酸序列同一性(例如，与易普利姆玛具有至少约90％、95％或99％的可变区同一性)。

用于调控CTLA-4的其他分子包括如描述于美国专利号US5844905、US5885796和国际专利申请号WO1995001994和WO1998042752(全部以引用方式并入本文)的CTLA-4配体和受体；以及如描述于美国专利号US8329867(以引用方式并入本文)的免疫粘附素。

4.手术

大约60％的癌症患者将接受某种类型的手术，包括预防性、诊断性或分期、治愈性和姑息性手术。治愈性手术包括切除术，在切除术中全部或部分癌组织被物理去除、切除和/或破坏，并且切除术可以与诸如本发明实施方案的治疗、化学疗法、放射疗法、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或替代疗法的其他疗法结合使用。肿瘤切除术是指物理去除至少部分肿瘤。除肿瘤切除术之外，手术治疗还包括激光手术、冷冻手术、电外科手术和显微镜控制手术(莫氏手术(Mohs’surgery))。

切除部分或全部癌细胞、组织或肿瘤后，在体内可能会形成空腔。可以通过对该区域进行灌注、直接注射或局部应用其他抗癌疗法来完成治疗。可以例如每1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天，或每1周、2周、3周、4周和5周，或每1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月重复这种治疗。这些治疗同样可以具有不同的剂量。

5.其他剂

预期可以将其他剂与本发明实施方案的某些方面组合使用以改善治疗的治疗功效。这些另外的剂包括影响细胞表面受体和GAP连接的上调的剂、细胞抑制剂和分化剂、细胞粘附抑制剂、增加过度增殖细胞对凋亡诱导剂敏感性的剂或其他生物剂。通过提高GAP连接数增加细胞间信号传导，将增加对邻近的过度增殖细胞群体的抗过度增殖作用。在其他实施方案中，可以将细胞抑制剂或分化剂与本发明实施方案的某些方面组合使用以改善治疗的抗过度增殖功效。预期细胞粘附抑制剂可改善本发明实施方案的功效。细胞粘附抑制剂的实例是粘着斑激酶(FAK)抑制剂和洛伐他汀(Lovastatin)。进一步预期可以将增加过度增殖细胞对凋亡的敏感性的其他剂(诸如抗体c225)与本发明实施方案的某些方面组合使用以改善治疗功效。

IV.实施例

包括以下实施例以说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解，以下实施例中公开的技术代表发明人所发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术，因此可以认为其构成本发明实践的优选方式。然而，根据本公开，本领域技术人员应当理解，可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下在所公开的具体实施方案中进行许多改变，并且仍可获得类似或相似的结果。

实施例1-抗FGL2抗体的表征

本研究开发并表征了两种抗FGL2单克隆抗体，即F48和F59。这两种抗体均能够阻断CD39和CD73调节性T细胞的表达。评估了单独的抗FGL2抗体及其与其他抗癌疗法(诸如抗PDL1抗体)和化学疗法的组合对几种小鼠肿瘤模型(包括胶质母细胞瘤、黑素瘤和肺癌)的作用。特别地，正常脑组织和胶质母细胞瘤组织的免疫组织化学显示，FGL2在胶质母细胞瘤中的表达增加(图1A)。

为了针对小鼠中的抗FGL2抗体F48功能进行筛选，通过皮下注射将GL261胶质母细胞瘤细胞(30μL中1x10⁵个)注入小鼠背部。首次抗体治疗包括从肿瘤接种后约5-7天开始通过静脉内注射100μg抗体。每3天重复一次抗体治疗，并在约14-21天处死小鼠。观察到F48抗体治疗可抑制肿瘤中M2细胞群体的百分比(图1B)。

设计一项研究以评估PD-L1抗体和FGL2抗体对胶质母细胞瘤生长的作用(表1)。给小鼠接种CT2A肿瘤细胞，并以每只小鼠200μg的浓度用对照物1gG、抗PDL1抗体或F59-1+抗PDL1抗体进行治疗。在第21天处死小鼠。发现抗PDL1抗体和FGL2抗体的组合可抑制CT2A的生长(图2)。

表1：胶质母细胞瘤肿瘤模型的治疗组.

接下来，在体内确定替莫唑胺(TMZ)和抗PDL1+抗FGL2抗体的组合对小鼠胶质瘤GL261肿瘤模型进展的作用。

表2：胶质母细胞瘤的组合治疗组.

组	GL261
		A.	盐水
B.	20mg/kg TMZ+200μg IgG
		C.	20mg/kg TMZ+200μg F59
D.	20mg/kg TMZ+200μg αPD-L1
		E.	20mg/kg TMZ+200μg F48

用替莫唑胺(TMZ)与IgG、F59、抗PDL1或F48的组合治疗的胶质瘤GL261肿瘤的存活百分比(图3)。在单独用IgG治疗的小鼠中观察到最低的存活百分比，接着是TMZ+抗PDL1抗体，和TMZ+IgG。在用TMZ+F59抗体治疗的小鼠中观察到最高的存活百分比，接着是用TMZ+F48抗体治疗的小鼠。因此，F48和F59均可显著提高胶质瘤存活率。

还在路易斯氏肺癌(LLC)鼠模型中评估了抗FGL2抗体的作用(表3)。据观察，F59抗体和抗PDL1抗体的组合略微抑制了LLC的进展，如存活百分率的增加所示的(图4A)。观察到这两种抗体的组合使得肺和肝中的肿瘤结节数量都减少(图4B)。

表3：肺癌肿瘤模型的治疗组.

此外，测试了FGL2抗体对黑素瘤B16F10肿瘤模型的作用(表4)。F48和F59抗FGL2抗体两者与图巴他汀的组合使肿瘤体积最大程度地减小(图6A-6B)。

表4：黑素瘤模型的治疗组.

此外，实验显示，脑肿瘤细胞中的CRISPR/Cas9介导的FGL2敲除废止了鼠模型中的肿瘤进展(图7)。在包括LLC和星形细胞瘤在内的所有测试小鼠模型中，植入FGL2KO肿瘤细胞的小鼠的存活百分比高于植入WT肿瘤细胞的小鼠。

因此，在几种癌症模型中，抗FGL2抗体显示出在减少肿瘤生长和转移方面有效。

* * *

根据本公开，本文所公开和要求保护的所有方法可以在没有过度实验的情况下进行和执行。尽管已经依据优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下，可以所述方法进行改变或在本文所述的方法的步骤或步骤顺序中进行改变。更具体地，显而易见的是，可以用化学和生理上皆相关的某些剂取代本文所述的剂，同时仍将获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员显而易见的所有此类相似的取代和修改都被认为落入所附权利要求所限定的本发明的精神、范围和概念之内。

参考文献

以下参考文献在某种程度上提供了对本文所阐述的那些进行补充的示例性程序或其他细节，这些参考文献明确地以引用方式并入本文。

Antonioli et al.，Trend Mol Med.，19(6)：355-367，2013.

Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，NationalInstitutes of Health，

Bethesda，Md.，1987.

Leal et al.，2014

Mellman et al.，Nature 480∶480-489，2011.

Pardoll，Nature Rev Cancer 12：252-264,2012.

Selzner et al.，Rambam Maimonides Med J.，1(1)：e0004，2010.

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序列表

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<120> FGL2单克隆抗体及其在治疗恶性肿瘤中的用途

<130> UTFC.P1322WO

<140> 未知

<141> 2018-05-07

<150> US 62/501,870

<151> 2017-05-05

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 417

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成寡核苷酸(Synthetic oligonucleotide)

<400> 1

atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactctcag 60

gtccaactgc agcagcctgg ggctgagctt gtgaagcctg gggcttcagt gaagctgtcc 120

tgcaaggctt ctggctacac cttcgccagc tactggatgc agtgggtaaa acagaggcct 180

ggacagggcc ttgagtggat cggagagatt gatccttctg atagctatac taactacaat 240

caaaagttca agggcaaggc cacattgact gtagacacat cctccaacac agcctacatg 300

cagctcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag aaatgggaat 360

tactacggta gtacctacga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctca 417

<210> 2

<211> 139

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成多肽(Synthetic polypeptide)

<400> 2

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Ala Ser Tyr Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn

65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Asn

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Gly Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asp Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

130 135

<210> 3

<211> 384

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成寡核苷酸(Synthetic oligonucleotide)

<400> 3

atgatgtcct ctgctcagtt ccttggtctc ctgttgctct gttttcaagg taccagatgt 60

gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 120

atcagttgca gggcaagtca ggacgttagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 180

gatggatctg ttaaactcct gatctactac acttcaagat tacactcagg agtcccatca 240

aggttcagtg gcagtgggtc tggagcacat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 300

gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttcctccgtg gacgttcggt 360

ggaggcacca agctggaaat caag 384

<210> 4

<211> 128

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成多肽(Synthetic polypeptide)

<400> 4

Met Met Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln

1 5 10 15

Gly Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser

20 25 30

Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp

35 40 45

Val Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Ser Val

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Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser

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Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala His Tyr Ser Leu Thr Ile Ser

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Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn

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Thr Leu Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

115 120 125

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成肽(Synthetic peptide)

<400> 5

Ser Tyr Trp Met Gln

1 5

<210> 6

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成肽(Synthetic peptide)

<400> 6

Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成肽(Synthetic peptide)

<400> 7

Asn Gly Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asp Tyr

1 5 10

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

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<220>

<223> 合成肽(Synthetic peptide)

<400> 8

Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Asn Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成肽(Synthetic peptide)

<400> 9

Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser

1 5

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成肽(Synthetic peptide)

<400> 10

Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Pro Trp Thr

1 5 10

Claims (38)

1.一种分离的单克隆抗体，其中所述抗体特异性地结合FGL2并且包含：

(a)与SEQ ID NO:5相同的第一V_H CDR；

(b)与SEQ ID NO:6相同的第二V_H CDR；

(c)与SEQ ID NO:7相同的第三V_H CDR；

(d)与SEQ ID NO:8相同的第一V_L CDR；

(e)与SEQ ID NO:9相同的第二V_L CDR；以及

(f)与SEQ ID NO:10相同的第三V_L CDR。

2.如权利要求2所述的抗体，其中所述抗体包含与F48的V_H结构域(SEQ ID NO:2)至少约80％相同的V_H结构域和与F48的V_L结构域(SEQ ID NO:4)至少约80％相同的V_L结构域。

3.如权利要求2所述的抗体，其中所述抗体包含与F48的V_H结构域(SEQ ID NO:2)相同的V_H结构域和与F48的V_L结构域(SEQ ID NO:4)相同的V_L结构域。

4.如权利要求1-7中任一项所述的抗体，其中所述抗体是重组抗体。

5.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体是IgG、IgM、IgA或其抗原结合片段。

6.如权利要求1-7中任一项所述的抗体，其中所述抗体是Fab'、F(ab')2、F(ab')3、单价scFv、二价scFv或单结构域抗体。

7.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体是人抗体、人源化抗体或去免疫化抗体。

8.如权利要求1-7中任一项所述的抗体，其中所述抗体与成像剂、化学治疗剂、毒素或放射性核素缀合。

9.一种组合物，所述组合物包含在药学上可接受的载剂中的权利要求1-8中任一项的抗体。

10.一种分离的多核苷酸分子，所述分离的多核苷酸分子包含编码权利要求1-7中任一项的抗体的核酸序列。

11.一种重组多肽，所述重组多肽包含抗体V_H结构域，所述抗体V_H结构域包含F48的V_H结构域的CDR 1-3(SEQ ID NO:5、6和7)。

12.一种重组多肽，所述重组多肽包含抗体V_L结构域，所述抗体V_L结构域包含F48的V_L结构域的CDR 1-3(SEQ ID NO:8、9和10)。

13.一种分离的多核苷酸分子，所述分离的多核苷酸分子包含编码权利要求11或12的多肽的核酸序列。

14.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含一种或多种多核苷酸分子，所述一种或多种多核苷酸分子编码权利要求1-7中任一项的抗体或权利要求11或12的重组多肽。

15.如权利要求14所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞、酵母细胞、细菌细胞、纤毛虫细胞或昆虫细胞。

16.一种制造抗体的方法，所述方法包括：

(a)在细胞中表达编码权利要求1-7中任一项的抗体的V_L和V_H链的一种或多种多核苷酸分子；以及

(b)从所述细胞中纯化所述抗体。

17.一种包含有效量的权利要求1-8中任一项的抗体的组合物，所述组合物用于治疗受试者的癌症。

18.包含有效量的权利要求1-8中任一项的抗体的组合物用于治疗受试者的癌症的用途。

19.一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-6中任一项的抗体。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌、肺癌、头颈癌、前列腺癌、食管癌、气管癌、皮肤癌脑癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、子宫颈癌、睾丸癌、结肠癌、直肠癌或皮肤癌。

21.如权利要求19所述的方法，其中所述癌症是胶质母细胞瘤、肺癌或黑素瘤。

22.如权利要求19所述的方法，其中所述抗体处于药学上可接受的组合物中。

23.如权利要求19所述的方法，其中所述抗体以全身性方式施用。

24.如权利要求19所述的方法，其中所述抗体以静脉内、皮内、肿瘤内、肌内、腹膜内、皮下或局部方式施用。

25.如权利要求19所述的方法，其还包括向所述受试者施用至少第二抗癌疗法。

26.如权利要求25所述的方法，其中所述第二抗癌疗法是手术疗法、化学疗法、放射疗法、冷冻疗法、激素疗法、免疫疗法或细胞因子疗法。

27.如权利要求25所述的方法，其中所述第二抗癌疗法是化学疗法。

28.如权利要求27所述的方法，其中所述化学疗法是替莫唑胺或阿扎胞苷。

29.如权利要求26所述的方法，其中所述第二抗癌疗法是HDAC抑制剂。

30.如权利要求29所述的方法，其中所述HDAC抑制剂是ACY-1215(罗西诺他)或图巴他汀。

31.如权利要求25所述的方法，其中所述第二抗癌疗法包括免疫疗法。

32.如权利要求31所述的方法，其中所述免疫疗法是免疫检查点抑制剂。

33.如权利要求32所述的方法，其中所述至少一种免疫检查点抑制剂是抗CTLA-4抗体、抗PD-L1抗体和/或抗PD1抗体。

34.如权利要求28.1所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是人程序性细胞死亡1(PD-1)结合拮抗剂、PDL1结合拮抗剂或PDL2结合拮抗剂。

35.如权利要求34的方法，其中所述PD-1结合拮抗剂是单克隆抗体或其抗原结合片段。

36.如权利要求34所述的方法，其中所述PD-1结合拮抗剂是纳武单抗、派姆单抗、CT-011、BMS 936559、MPDL328OA或AMP-224。

37.一种用于检测受试者中的癌症的方法，所述方法包括测试来自所述受试者的样品中相对于对照物FGL2升高的存在，其中所述测试包括使所述样品与权利要求1-7中任一项的抗体接触。

38.如权利要求37所述的方法，其被进一步定义为体外方法。

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