CN1958801A - 人纤维介素hfgl2 shRNA干扰质粒的构建方法及其药学用途 - Google Patents
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Abstract
人纤维介素hfgl2 shRNA干扰质粒的构建方法及其药学用途，本发明涉及生物工程领域，具体地说是构建一种新的生物制剂：hfgl2shRNA干扰质粒，实现本发明具体技术方案是发明人构建了一种新的生物制剂－hfgl2 shRNA干扰质粒，根据hfgl2凝血酶原酶cDNA序列及设计原则筛选出靶序列，根据靶序列设计hfgl2 shRNA模板，再将模板设计于下游引物中，PCR扩增U6启动子，两端分别引入酶切位点BamH I和Hind III，将下游带有hfgl2 shRNA模板的U6启动子插入pMSCVneo载体相应酶切位点BamH I和Hind III，我们通过细胞水平实验，证实hfgl2 shRNA干扰质粒可以有效抑制hfgl2基因的表达。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体地说是构建一种新的生物制剂：hfgl2 shRNA干扰质粒，及用于治疗病毒诱导的重型肝炎和其它以微循环障碍损伤为主要病理生理特征疾病的药学用途。
背景技术
众所周知，由于病毒性肝炎发病率高、危害性大，已成为严重影响人民健康与生活水平、制约经济发展的重要疾病。迄今为止，国际上对于重型肝炎尚无确定有效的治疗方法，探索重型肝炎的发病机制和防治方法是应用基础和临床研究领域的重要课题。
用鼠3型肝炎病毒(mouse hepatitis virus-3，MHV-3)感染不同种系近亲繁殖小鼠，已成功建立了类似人类各种不同临床类型的肝炎，包括暴发型肝炎、慢性肝炎及临床健康病毒携带者(专利授权号：02115980.7)，这一成果为我们研究病毒性肝炎的发病机制及防治方法提供了很好的动物模型。MHV-3诱导产生的鼠纤维介素(MouseFibrinogen-like protein 2，mfgl2)在鼠病变肝组织中选择性高度表达，其基因表达水平与肝组织纤维蛋白沉积及广泛肝细胞坏死密切相关；MHV-3感染小鼠接受mfgl2凝血酶原酶中和抗体注射后可减轻肝脏疾病严重程度并显著降低死亡率。以上结果表明，mfgl2凝血酶原酶在鼠暴发型肝炎的发病过程中起重要作用(参见：Li C.等人，实验医学杂志，176：689(1992)；宁琴等人，生物化学杂志，274：9930(1999)。)
在上述研究的基础上，发明人进一步研究发现暴发型乙型肝炎或重症乙型肝炎病人肝脏组织的枯否氏细胞、血管内皮细胞和坏死、纤维化区域发现hfgl2的高度表达，说明hfgl2在人病毒性肝炎的恶化进展中起着关键性的作用。因此发明人提出：fgl2在病毒性肝炎中引发肝脏纤维蛋白沉淀和微血管内微循环障碍，导致肝细胞坏死。该理论在国际上首次提出，并对重型肝炎的分子机制发表了全新的见解(参见：陈悦等人，中华医学杂志，83：446(2003)；Marsden PA等人，临床调查学杂志，112：58(2003)。)
反义技术是根据核酸杂交原理设计的，它能选择性地与靶基因特定功能位置结合(杂交)，抑制该基因表达，而不影响宿主正常功能。本发明之前已构建了mfgl2反义质粒，并对其进行了大量细胞和动物水平的实验，结果证明了mfgl2反义质粒转入细胞后表达反义RNA，并对mfgl2凝血酶原酶基因进行特异性的抑制。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是指，导入特异性针对目标基因的同源双链RNA(double-strain RNA，dsRNA)，诱导产生的沉默复合体将目标mRNA降解，从而引起目标基因不表达或减效表达。小干扰RNA作为一种新的基因干预工具，具有高效、特异，快速等优点，国际上大量研究表明其基因表达干预效果优于反义技术，更具临床应用价值。对比，发明人构建了hfgl2 shRNA干扰质粒，并对其进行了体外细胞水平的实验，结果证明了hfgl2 shRNA干扰质粒转入细胞后表达小发夹状RNA(small hairpin RNA，shRNA)，并对hfgl2凝血酶原酶基因进行特异性的抑制，从而对病毒诱导的重型肝炎和其它以微循环障碍损伤为主要病理生理特征疾病的治疗具有潜在的临床应用价值。
发明内容
所以，本发明的第一个目的是提供获得hfgl2凝血酶原酶基因的shRNA模板的方法。
本发明的第二个目的是提供将hfgl2凝血酶原酶基因的shRNA模板插入真核表达载体构建hfgl2 shRNA干扰质粒的过程。
本发明的第三个目的是提供利用hfgl2 shRNA干扰质粒特异性地抑制细胞系中hfgl2表达的方法。
实现本发明具体技术方案是发明人构建了一种新的生物制剂-hfgl2 shRNA干扰质粒，用以抑制hfgl2凝血酶原酶的表达，缓解微循环障碍，减少局部纤维素沉积和细胞坏死，可望在临床上提高重型肝炎患者的存活率和生存质量。我们通过细胞水平实验，证实hfgl2shRNA干扰质粒可以有效抑制hfgl2基因的表达。
本发明方法包括以下步骤：
一、载体的构建部分
构建hfgl2 shRNA干扰质粒的方法：
1.PCR法扩增U6启动子，通过下游引物将hfgl2 shRNA的模板DNA序列连接到U6启动子的下游；
2.将目的片段插入载体相应酶切位点BamH I和Hind III。
具体步骤如下：
根据hfgl2凝血酶原酶cDNA序列及设计原则筛选出靶序列，根据靶序列设计hfgl2 shRNA模板，再将模板设计于下游引物中，PCR扩增U6启动子，两端分别引入酶切位点BamH I和Hind III，将下游带有hfgl2 shRNA模板的U6启动子插入pMSCVneo载体相应酶切位点BamH I和Hind III；
本发明产生hfgl2凝血酶原酶的shRNA的dsDNA模板序列为：
序列1：
5’-AGAGGAGATCAATGTACTT TTCAAGAGA
AAGTACATTGATCTCCTCTTTTTT-3’
序列2：
5’-ATACAGAGGTGTCCGTAAT TTCAAGAGA
ATTACGGACACCTCTGTATATTTTT-3；
构建的产生hfgl2 shRNA模板需要通过插入某种载体构成一表达体系。
本发明的药学用途在于它包括本发明所述的构建针对nfgl2shRNA干扰质粒和药学上所接受的载体或赋形剂。
本发明提供请求保藏的培养物名称：大肠杆菌JM109/p-mfgl2-shRNA1，/大肠杆菌JM109/p-mfgl2-shRNA2，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M206054/CCTCC NO：M206055
二、载体的细胞水平试验
hfgl2 shRNA干扰质粒对hfgl2基因表达的抑制作用
倒置荧光显微镜下直接观察，shRNA干扰质粒特异有效抑制hfgl2-EGFP融合蛋白的表达；
本发明的实验证明，发明人构建了针对hfgl2凝血酶原酶的shRNA，将其用于病毒性肝炎或移植急性排斥反应等的治疗，以提高重症型病毒性肝炎患者的存活率、延长移植物存活时间；上述的shRNA对用于以微循环障碍损伤为病理生理特征的疾病的治疗，具有普遍的药学价值。
附图说明
本发明提供下列附图：
图1hfgl2的2个靶序列及U6启动子的上、下游引物
图2将下游带有hfgl2 shRNA模板的U6启动子插入pMSCVneo载体
图3pMD18-U6P-hfgl2shRNA1和pMD18-U6P-hfgl2shRNA2，双酶切(BamH I和Hind III)鉴定
1：DL2000；2：pMD18-U6P-hffgl2shRNA1；
3：pMD18-U6P-hfgl2shRNA2
图4p-hfgl2shRNA1和p-hfgl2shRNA2双酶切(BamH I和HindIII)鉴定
1：DL2000；2：p-hfgl2shRNA1；3：p-hfgl2shRNA2
图5 hfgl2-EGFP融合蛋白的表达干预
a：Transfection of plasmid pEGFP-N2-hfgl2；b：Cotransfection ofirrelative shRNA plasmid and pEGFP-N2-hfgl2；c：Cotransfection ofp-hfgl2shRNA1 and pEGFP-N2-hfgl2；
d：Cotransfection of p-hfgl2shRNA2 and pEGFP-N2-hfgl2
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述：
本发明提出构建hfgl2 shRNA干扰质粒的方法并在细胞水平证实其干扰效应包括以下步骤：
一、载体的构建部分
构建hfgl2 shRNA干扰质粒的方法：
1.根据hfgl2凝血酶原酶cDNA序列及设计原则筛选出靶序列，根据靶序列设计hfgl2 shRNA模板，再将模板设计于下游引物中，PCR扩增U6启动子，两端分别引入酶切位点BamH I和Hind III(hfgl2的2个靶序列及U6启动子的上游引物见图1)。
2.将下游带有hfgl2 shRNA模板的U6启动子插入pMSCVneo载体(图2)相应酶切位点BamH I和Hind III(酶切鉴定见图3、4)，该重组载体在U6启动子的启动下可在转染细胞内转录出hfgl2shRNA。
二、载体的细胞水平试验研究
对于发夹状shRNA表达体系在导入人体细胞后是否能特异性结合到靶基因并有效表达的问题，目前国际上尚无能够提供直接证据的相关实验方法，只能通过最终干预效果来间接反映上述生物制剂结合和表达的效率。发明人构建了hfgl2 shRNA干扰质粒，并对其进行细胞水平的实验，现报告如下：
hfgl2 shRNA对hfgl2基因表达的抑制作用
材料：p-hfgl2shRNA1和p-hfgl2shRNA2：插入了hfgl2 dsDNA模板和U6启动子的pMSCVneo载体，能够表达hfgl2 shRNA，用于抑制mfgl2凝血酶原酶。
p-mfgl2shRNA：插入了mfgl2 dsDNA模板和U6启动子的pMSCVneo载体，能够表达mfgl2 shRNA，作为非相关对照。
pEGFP-N2-hfgl2：GFP(绿色荧光蛋白)与hfgl2的融合基因表达载体，可通过GFP表达所产生的荧光强弱来直接反映mfgl2表达的多少。
CHO细胞：中国仓鼠卵巢细胞。
方法：p-hfgl2shRNA1和p-hfgl2shRNA2分别与pEGFP-N2-hfgl2共转染CHO细胞，作为试验组，另仅转染pEGFP-N2-hfgl2或共转染p-mfgl2shRNA和pEGFP-N2-hfgl2作为对照组。转染后48h倒置荧光显微镜下观察hfgl2-EGFP融合蛋白在CHO细胞中的表达情况。
结果：荧光显微镜下观察到CHO细胞内hfgl2shRNAl和hfgl2shRNA2对hfgl2-EGFP融合蛋白表达的特异性抑制作用(图5)。
综上所述，系列体外试验均表明本发明涉及的新的生物制剂hfgl2 shRNA干扰质粒可有效地干预hfgl2凝血酶原酶的表达。我们研究发现，在血窦微血栓周围和局部纤维素沉积区域的巨噬细胞和血管内皮细胞高表达凝血酶原酶，推测fgl2凝血酶原酶不仅在病毒诱导的重型肝炎的发生发展中发挥关键作用，而且在移植急性排斥反应、系统性红斑狼疮等以微循环障碍为主要病理生理特征的疾病的发生中也起着重要作用。因此，本发明对于探讨这些以微循环障碍损伤为病理生理特征的病症的发病机理及治疗，尤其是在提高重型肝炎患者的存活率、延长移植物存活时间等方面具有实际的药学用途。
Claims (2)
1.人纤维介素hfgl2 shRNA干扰质粒的构建方法，其步骤如下：
根据hfgl2凝血酶原酶cDNA序列及设计原则筛选出靶序列，根据靶序列设计hfgl2 shRNA模板，再将模板设计于下游引物中，PCR扩增U6启动子，两端分别引入酶切位点BamH I和Hind III，将下游带有hfgl2 shRNA模板的U6启动子插入pMSCVneo载体相应酶切位点BamH I和Hind III，产生hfgl2凝血酶原酶的shRNA的dsDNA模板序列为：
序列1：
5’-AGAGGAGATCAATGTACTT TTCAAGAGA
AAGTACATTGATCTCCTCTTTTTT-3’
序列2：
5’-ATACAGAGGTGTCCGTAAT TTCAAGAGA
ATTACGGACACCTCTGTATATTTTT-3’
2.按权利要求1所述的人纤维介素hfgl2 shRNA干扰质粒药物组合物，它包括本发明所述的构建针对hfgl2 shRNA干扰质粒和药学上所接受的载体或赋形剂。
按权利要求1所述的人纤维介素hfgl2 shRNA干扰质粒保藏的培养物名称：大肠杆菌JM109/p-mfgl2-shRNA1/大肠杆菌JM109/p-mfgl2-shRNA2，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M206054/CCTCC NO：M206055。
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| CN113307835A (zh) * | 2021-04-21 | 2021-08-27 | 南通大学 | 一种siRNA及其在制备慢性疼痛治疗药物中的应用 |
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2006
- 2006-06-29 CN CN 200610019489 patent/CN1958801A/zh active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110831622A (zh) * | 2017-05-05 | 2020-02-21 | 德克萨斯大学系统董事会 | Fgl2单克隆抗体及其在治疗恶性肿瘤中的用途 |
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