CN102085378A - hfgl2抑制剂在制备治疗肝癌的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及重组人hfgl2微小核糖核酸在肝癌中的应用，即构建肝癌相关的人fgl2(Human Fibrinogen-like protein 2，hfgl2)凝血酶原酶基因的微小RNA腺病毒表达颗粒，在肝癌中进行治疗并验证其药学用途。利用腺病毒介导的micro RNA干扰技术即利用重组人hfgl2微小核糖核酸(hfgl2-miRNA腺病毒注射液)靶向治疗肝癌，利用已建立的高侵袭性人肝癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型，瘤内多点注射重组人hfgl2-miRNA腺病毒注射液，通过比较肿瘤大小及免疫组化等方法探索hfgl2-miRNA腺病毒注射液的优化治疗剂量，结果发现疗效显著，表明hfgl2的沉默对肝癌的治疗具有潜在的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及肝癌的基因治疗方法，更特别涉及使用hfgl2抑制剂治疗肝癌，尤其是涉及重组人hfgl2微小核糖核酸在制备治疗肝癌药物中的应用，即构建人fgl2(HumanFibrinogen-like protein 2，hfgl2)凝血酶原酶基因的微小RNA腺病毒表达颗粒，在肝癌中进行治疗并验证其药学用途。
背景技术
恶性肿瘤是严重危害人类生命健康的疾病。我国每年癌症发病人数约160万。恶性肿瘤正超过心血管病成为致死原因的第一位。癌症的防治和研究正成为全世界科学家日益关注的课题。
凝血和血管新生是肿瘤发生、发展的重要途径之一。血栓与肿瘤的关联早在1865年就被法国学者Armand Trousseau观察到了。临床研究表明：血栓形成是目前癌症患者最常见的并发症和第2位死亡原因。其机制的揭示则在近些年，多数学者认为有两条途径：组织因子和凝血酶，它们可通过凝血依赖和凝血非依赖途径导致肿瘤血栓形成，这对于肿瘤生长和转移是必需的。其中，凝血酶可通过凝血依赖途径切割纤维蛋白原，结成交联的纤维蛋白沉积于血管内和细胞外基质。纤维蛋白能增强肿瘤细胞对血小板的黏附及细胞外基质的侵袭并引发体内的转移，还能包裹肿瘤细胞保护其免受宿主免疫系统攻击，或形成一种临时的支架结构促进内皮细胞迁移以及新生血管腔形成；凝血酶作用的凝血非依赖途径主要通过切割细胞表面结合的蛋白酶激活受体(protease activated receptors，PARs)从而激活信号转导途径，促进肿瘤细胞的有丝分裂和对一些细胞因子的增殖反应而实现。血管新生是肿瘤生长和转移的重要条件，而凝血酶是血管形成的有效促进剂。凝血酶在细胞水平上促进血管生成的作用包括：①降低内皮细胞对基底膜蛋白的黏附能力；②增强VEGF引起的内皮细胞增殖，这一过程伴随VEGF受体表达上调；③多种促进血管生成的相关基因上调(VEGF、bFGF、TF、MMP-2等)。这些作用继而引起一系列细胞反应，如可以使内皮细胞形态改变(易于包绕成环)、血管通透性增加、内皮细胞增生及蛋白酶水解作用增强。当肿瘤体积超过12mm3时，维持其继续生长就有赖于新生血管的生成。这些新生血管把肿瘤细胞和循环系统直接连结起来，使得供肿瘤生长的物质交换得以进行。此外新生血管还可作为肿瘤转移的通道，通过新生血管将原发癌细胞输送到转移靶器官。因此，血管生成是肿瘤生长转移的必由之路，与实体瘤的发生、转移具有密切关系。研究血管生成对了解恶性肿瘤发生、发展、侵袭、转移的生物学特性及针对肿瘤血管生成的基因治疗有重要意义，是极具应用前景的新型肿瘤治疗靶点，且抗血管生成治疗不产生耐药性，并已广泛应用于科研和临床。动物研究和临床研究都发现抗血管生成治疗能够部分甚至完全抑制肿瘤转移。抗血管生成治疗和传统细胞毒药物相结合可望在肿瘤治疗上有所突破。
恶性肿瘤患者普遍存在的高凝状态对肿瘤的发生发展及复发转移至关重要。肿瘤细胞自身、宿主炎性细胞和肿瘤相关内皮细胞的促凝活性增加是产生高凝的主要原因之一。上述细胞的促凝活性增加是由于细胞表达促凝物引起，包括肿瘤细胞分泌的癌性促凝物(cancerprocoagulant，CP)及肿瘤细胞、新生血管内皮细胞和浸润的巨噬细胞表达的组织因子(tissuefactor，TF)。近年来发现的人纤维介素(hfgl2，fibroleukin)，属于纤维蛋白原家族成员，在某些病理情况下，表达于活化的巨噬细胞、内皮细胞和淋巴细胞等免疫活性细胞表面。它具有丝氨酸蛋白酶活性，能直接裂解凝血酶原成为凝血酶，被称为“免疫凝血”。用病毒、细菌脂多糖(LPS)等刺激小鼠巨噬细胞表达小鼠纤维介素(mfgl2)后，巨噬细胞表现出明显的促凝活性(PCA)。hfgl2与mfgl2的氨基酸同源性大于70％，尤其羧基端225个氨基酸同源性超过90％。
肝癌为典型的多血管肿瘤，是危害人类健康的重要恶性肿瘤之一。我国是肝病大国，患者高达3000万，每年因各种肝病死亡的人数达30万。流行病学调查显示：病毒性肝炎约有10％发展为慢性活动性肝炎，而慢性活动性肝炎有50％发展为肝硬变，肝硬变癌变率大约10-20％左右。进入20世纪90年代以来，原发性肝癌已成为我国第二位癌症杀手。
目前针对肝癌的治疗主要采用早期手术切除、晚期化疗，同时辅以放疗和免疫制剂注射的传统方案，以及新兴起的基因治疗。在临床上传统的治疗方案尽管能缓解早期患者的病情，但毒副作用大，对中晚期及转移复发性患者疗效较差。基因治疗有望克服传统治疗的弊端，成为肝癌生物治疗新途径。然而肝癌的基因治疗迄今仍未获得突破性进展，目前尚需解决的主要问题是：1)寻找针对肿瘤特异性的理想靶基因：由于肿瘤的发生涉及多基因，针对某一癌基因或抗癌基因的策略难以有效控制肿瘤的恶性生长，对于肝癌的基因治疗而言尤其如此，所以可选用的理想靶基因较少。2)外源基因选择性转运至靶组织：肿瘤基因治疗的另一难点是靶向导入问题，迄今所发现的多数肿瘤相关靶分子其靶向特异性均不高。3)清除肿瘤微小病灶与控制其转移：任何转基因技术，不可能使体内所有肿瘤细胞被转染，单纯的基因治疗亦难以清除体内尚未转染基因的肿瘤细胞。
重组腺病毒载体是当前基因治疗中所用的重要载体之一。以腺病毒为基础构建基因转移载体具有以下优点：(1)人类是腺病毒的天然宿主，所以比较安全；(2)该病毒宿主范围广泛，能将目的基因转移到分裂或静息的细胞中；(3)由于腺病毒感染细胞时其DNA不整合到宿主染色体中，潜在的致癌危险小；(4)外源基因表达水平较高，滴度高，在体外稳定，易于制备与纯化。尽管如此，腺病毒载体的安全性、靶向性及有效性依然是基因治疗中始终关注的内容，目前国内外研究结果表明，腺病毒载体具有较强的免疫原性及一定的细胞毒性，如使用剂量过大，可引起严重的不良反应，但若控制好注射剂量和病人的基础情况，采用局部给药的方式则基本上是安全的，临床常见不良反应为发热、寒战和局部反应等。
腺病毒感染细胞的过程从腺病毒纤毛的头节区粘附到细胞表面的特异性受体开始，该特异性受体即柯萨奇/腺病毒受体CAR(coxsackie/adenovirus receptor)。CAR分布广泛，且不同种属、组织的分布不同，人类CAR在心脏和胰腺中表达最强，脑、小肠、睾丸、前列腺也有较高表达，肝脏、肺次之，而肾、外周血白细胞、胸腺和脾脏则未见表达。CAR介导的腺病毒进入靶细胞是基因转移中的限速步骤，并且转染效率与细胞表面CAR表达水平有关。
发明内容
发明人从研究肿瘤血管形成对肝癌生长和转移作用的角度出发，研究人类肝癌患者组织标本，并以肝癌动物模型为技术平台，探索抑制肿瘤血管新生和血栓形成对防治肝癌的作用，发现抑制或沉默hfgl2，能显著抑制肿瘤细胞，尤其是肝癌细胞生长和转移，对肝癌的治疗效果显著，从而完成了本发明。
发明人研究了人类肝癌患者组织标本，发现在肝癌组织中hfgl2的表达增高，以裸鼠肝癌动物模型为技术平台，利用micro RNA干扰技术沉默hfgl2，发现hfgl2蛋白质水平和mRNA水平受到抑制后，显著影响裸鼠人肝癌荷瘤模型中皮下肿瘤的发生和发展，沉默hfgl2可以抑制肿瘤，尤其是抑制肝癌生长。
另外，发明人前期的研究结果显示：巨噬细胞、NK细胞和CTL细胞中存在hfgl2的表达，这几类细胞与肿瘤免疫密切相关，虽然它们抗肿瘤作用的机制各不相同，但都有一个与肿瘤细胞识别并结合的过程，这一过程中效应细胞与靶细胞通过相应受体(如TCR)或粘附分子(如ICAM-1)的作用，随后产生各自不同的杀瘤效应。发明人推测，在肝癌患者体内，这些细胞内由于高表达跨膜的促凝分子TF及hfgl2，细胞内及细胞膜上会产生大量的凝血酶，继而富集纤维蛋白，从而在血管内、外给免疫细胞与肿瘤细胞间的识别与结合制造障碍，使肿瘤细胞逃避了机体的免疫监视。因此，沉默hfgl2在抑制肿瘤细胞增殖和抑制肿瘤新生血管生成的同时，亦有可能通过前述途径有效地诱导抗肿瘤的免疫应答，这可能是提高肝癌生物治疗效果的另一个重要策略。
本发明的第一个目的是提供一种肝癌治疗的靶基因、其治疗方法和药物。
Hfgl2可以作为肝癌治疗的靶基因和靶分子，hfgl2的抑制剂可用于治疗肝癌，特别是抑制肝癌的生长或转移，或用于制备治疗肝癌、特别是抑制肝癌的生长或转移的药物。
Hfgl2的抑制剂可以是抑制hfgl2蛋白质活性或蛋白质水平的抑制剂、或者抑制hfgl2的mRNA水平的抑制剂。
抑制hfgl2蛋白质活性或蛋白质水平的抑制剂包括但不限于hfgl2的抗体、抑制hfgl2蛋白质活性或蛋白质水平的蛋白质、多肽、酶、天然化合物、合成化合物、有机物、无机物。抑制hfgl2的mRNA水平的抑制剂可以是其反义核酸序列、siRNA、miRNA、shRNA、dsRNA，或者其它能够抑制hfgl2的mRNA水平的蛋白质、多肽、酶、化合物。
本发明的另一个目的是靶向于hfgl2的miRNA在制备治疗肝癌的药物中的应用，所述miRNA通过沉默hfgl2治疗肝癌。具体来说，所述miRNA可以包含如下序列：
5′-TGCTGTTCTTTGAACACCTCCTCGATGTTTTGGCCACTGACTGACATCGAGGATGTTCAAAGAA-3′。
优选所述miRNA由上述序列组成。
本发明的另一个目的是表达靶向于hfgl2的miRNA的载体在制备治疗肝癌的药物中的应用。
所述载体可以是表达载体。表达载体中可以包含与上述miRNA可操作地连接的启动子和转录终止序列。
所述表达载体可以是真核细胞表达载体。
所述真核细胞表达载体可以是质粒表达载体或病毒表达载体。
所述质粒表达载体可以是pcDNA表达载体，优选pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR。
所述病毒表达载体为腺病毒载体，优选pAd/CMV/V5-Dest。
因此，本发明的另一个目的是含有靶向于hfgl2的miRNA的腺病毒载体在制备治疗肝癌的药物中的应用。
本发明的再一个目的是含有上述miRNA的腺病毒在制备治疗肝癌的药物中的应用。
本发明的再一个目的是提供一种重组人hfgl2-miRNA腺病毒注射液用于制备治疗肝癌的药物，所述重组人hfgl2-miRNA腺病毒注射液中的腺病毒含有上述miRNA。
能用于制备上述腺病毒注射液的药用载体可以是本领域中常规使用的注射液载体，如等渗的NaCl溶液，等渗的葡萄糖溶液，或等渗的含有缓冲体系的溶液，如PBS溶液等。也可以根据制剂需要，选择性的添加防止腺病毒发生物理或化学变化而失活的保护剂，例如二价阳离子盐或表面活性剂等。
发明人以裸鼠肝癌模型为研究对象，利用腺病毒介导的micro RNA干扰技术，构建了一种新的hfgl2的miRNA表达质粒，并在此基础上进一步构建重组人hfgl2-miRNA腺病毒表达质粒pAd-hfgl2-miRNA，进而获得重组人hfgl2-miRNA腺病毒Ad-hfgl2-miRNA，利用该腺病毒Ad-hfgl2-miRNA制成重组人hfgl2-miRNA腺病毒注射液，在模型动物体内瘤内多点注射该重组人hfgl2-miRNA腺病毒注射液，应用hfgl2凝血酶原酶的miRNA抑制肝癌细胞中hfgl2的表达，结果发现通过hfgl2凝血酶原酶的miRNA抑制肝癌组织中hfgl2的表达，能抑制肝癌的生长和转移，疗效显著，表明本发明的重组人hfgl2-miRNA腺病毒注射液能通过沉默hfgl2，对肝癌的治疗具有临床应用价值。
此外，发明人在研究中发现，虽然CAR广泛分布导致了腺病毒的宿主范围广，使腺病毒做为肿瘤基因治疗的载体存在用药的安全隐患，但如果将腺病毒注射液在肿瘤局部注射，则腺病毒主要靶向在注射的局部，在其他组织和器官的分布难以检出。因此本发明的重组人hfgl2-miRNA腺病毒注射液用于局部注射治疗肝癌是安全的。
本发明所用相关质粒构建的具体步骤是：
一、miRNA pcDNA表达质粒的构建
构建表达hfgl2凝血酶原酶的miRNA pcDNA表达质粒。
1.利用Invitrogen公司miRNA设计软件获得针对hfgl2凝血酶原酶基因的miRNA模板，合成miRNA模板单链。
产生hfgl2凝血酶原酶miRNA的单链寡核苷酸序列为：
5′-TGCTGTTCTTTGAACACCTCCTCGATGTTTTGGCCACTGACTGACATCGAGGATGTTCAAAGAA-3′。
2.将退火的hfgl2凝血酶原酶基因的miRNA模板双链插入miRNA的表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR。
3.测序筛选未发生突变的hfgl2凝血酶原酶基因的miRNA表达质粒。
二、病毒的构建、包装、扩增
1.利用Gateway技术，将hfgl2的miRNA pcDNA表达质粒和pAd/CMV/V5-DESTTM载体重组成pAd-hfgl2-miRNA腺病毒表达质粒。测序筛选未发生突变的pAd-hfgl2-miRNA腺病毒表达质粒。
2.pAd-hfgl2-miRNA经Pacl酶切成线性，转染293A细胞以包装出腺病毒颗粒，方法参照Invitrogen公司的腺病毒表达系统试剂盒说明书。
3.在293A细胞中扩增腺病毒，采用50％组织培养感染剂量法(TCID50法)，计算病毒滴度。
4.最后根据Clontech公司Adeno-XTM Virus Purification Kits(Cat.Nos.631533)说明书进行病毒纯化并采用TCID50法计算病毒滴度，最终获得重组人hfgl2-miRNA腺病毒Ad-hfgl2-miRNA。
三、通过动物模型验证hfgl2-miRNA腺病毒注射液在肝癌治疗中的应用
制备含有腺病毒Ad-hfgl2-miRNA的重组人hfgl2-miRNA腺病毒注射液，选用人肝癌高转移细胞系(HCCLM6)移植在无胸腺小鼠皮下，待移植肿瘤生长至少达100mm3后，将动物随机分组，包括给药组、阳性对照组和阴性对照组、非相关对照组，每周2-3次测量肿瘤的长径和短径，动态观察腺病毒注射液的抗肿瘤效应。
实验结果表明：经hfgl2-miRNA腺病毒注射液治疗后，Ad-hfgl2-miRNA可显著抑制裸鼠人肝癌皮下移植瘤生长，治疗效果明显，结果证实了Ad-hfgl2-miRNA对凝血酶原酶基因有特异性地抑制作用，对肝癌的治疗具有重要的临床应用价值。
附图说明
图1是hfgl2凝血酶原酶基因的miRNA pcDNA表达质粒构建示意图
图2是Ad-hfgl2-miRNA腺病毒的构建、包装、扩增过程示意图
图3A和3B是重组人hfgl2-miRNA腺病毒注射液在裸鼠肝癌皮下移植瘤模型中的治疗作用
图3C是给药结束后各给药组裸鼠的相对肿瘤体积
图4是Ad-hfgl2-miRNA治疗后肿瘤体积变化检测结果
图5是Ad-hfgl2-miRNA治疗后免疫组化检测肿瘤组织中hfgl2蛋白质的表达结果
图6是Ad-hfgl2-miRNA治疗后Real time PCR检测肿瘤组织hfgl2 mRNA的表达结果
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明做进一步的详细描述。
以下实验方法中所用的pcDNA表达载体和腺病毒表达载体均购自invitrogen公司。
一、pcDNA表达载体的构建
1.利用invitrogen公司的设计软件，针对hfgl2凝血酶原酶基因设计pre-miRNA，产生hfgl2凝血酶原酶miRNA的单链寡核苷酸序列为：
5′-TGCTGTTCTTTGAACACCTCCTCGATGTTTTGGCCACTGACTGACATCGAGGATGTTCAAAGAA-3′。
2、将合成的oligo单链分别退火形成ds-oligo：反应体系如下：
正义链(200μM) 5μl
反义链(200μM) 5μl
10×oilgo退火缓冲液 2μl
DNase/RNase-free纯水 8μl
反应条件：95℃水浴4min，常温下放置10min，离心5min后轻微混合即得到ds oligo。
取1μl ds oligo加入99μl DNase/RNase-free纯水中得到0.5μM的ds-oligo。再取1μl的0.5μM的ds-oligo+5μl 10×oilgo退火缓冲液+44μl DNase/RNase-free纯水，得到10μM的ds-oligo。
3.凝胶电泳鉴定：配4％的凝胶，将ds-oligo和部分ss-oligo电泳。
A.ds oligo与载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR连接和转化：
5×连接缓冲液 4μl
pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR 2μl
miR-ds oligo/miR-lacZ ds oligo(10nM) 4μl
DNase/RNase-free纯水 9μl
T4DNA连接酶(1U/μl) 1μl
室温下连接2h，将连接液取2μl转化入Top10E.coli。
1)2μl连接液加入至100μl Top10E.coli感受态细胞中冰中放置30分钟。
2)42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。
3)加入250μl SOC培养基，37℃振荡培养60分钟。
4)吸取200μl培养液均匀涂L-琼脂平板(含壮观霉素浓度为100μg/ml)。
5)37℃温箱培养过夜，形成单个菌落。
B、鉴定
1)挑选5-6个中等大小菌落，加入1ml含50μg/ml壮观霉素的LB培养基中，37℃250rpm振荡培养6h。
2)取PCR阳性菌液保种(850μl菌液+150μl甘油)。
3)将保存菌种送公司测序，筛选未发生突变的hfgl2凝血酶原酶基因的miRNA表达质粒，构建过程可参见图1的示意图。
二、病毒的构建与包装
2.1Eag I酶切miRNA，使其线性化：
1.酶切体系：
37℃水浴3h。
2.加入2.5体积(250μl)无水乙醇，再加入0.1体积(10μl)3M乙酸钠，-20℃静置约1h。
3.10000rpm，10min。
4.75％乙醇洗涤，13000rpm，10min。
5.20μl TE溶解。
2.2BP反应：
1.DNA(线性化) 2μl
Donor载体 2μl
TE缓冲液PH8.0 4μl
8μl
2.BP酶于冰上2min，快速振荡2次。
3.BP酶2μl加至1中，快速振荡，离心数秒。
4.25℃反应9h后即为入门克隆(Entry clone)。
2.3LR反应：
1.取3μl BP反应物+目的载体(pAd/CMV/V5-Dest)1μl(约150ng)+TE Buffer 4μl混合(余7μlBP反应物可转化TOP10感受态细菌，以保种)。
2.LR酶于冰上2min，快速振荡2次。
3.LR酶2μl加至第1步的混合体系中，快速振荡，离心数秒。
4.25℃反应16h。
5.加入1μl蛋白酶K，37℃，10min终止反应。
6.取5μl上述反应物转化TOP10感受态。
7.测序筛选未发生突变的hfgl2-miRNA腺病毒表达载体，即pAd-hfgl2-miRNA。
2.4腺病毒载体的准备
A.酶切
pAd-hfgl2-miRNA经Pac1酶切成线性，以暴露ITRs，以利于病毒的复制和包装。方法参照Invitrogen公司的腺病毒表达系统试剂盒说明书。酶切体系如下：
37℃水浴4h。
B.纯化质粒经酶切后进行纯化，方法如下：
1.加入0.1体积的乙酸钠，2.5体积的无水乙醇，放置-20℃20min，10000rpm离心15min，
2.加入75％无水乙醇洗涤，13000rpm离心10min。
3.TE溶解。
2.5转染293A细胞，获得原始病毒
pAd-hfgl2-miRNA经Pac1酶切成线性，转染293A细胞以包装出腺病毒颗粒，方法参照Invitrogen公司的腺病毒表达系统试剂盒说明书。
1.转染前24h消化293A细胞，并接种于6孔培养板内，使细胞达到85％以上融合，5％CO2、37℃培养。
2.转染前换液，PBS冲洗一次，加500μl新鲜的无血清DMEM培养基。
3.在无菌EP管内配置以下溶液：
溶液A：1.5μg质粒DNA溶于100μl无血清的DMEM培养基；
溶液B：3μl Lipofectomine 2000+100μl无血清的DMEM培养基，室温5min；
4.合并溶液A和溶液B，混匀，室温20～30min，形成DNA-脂质体复合物。
5.将此复合物加入待转染细胞的培养孔内，轻轻混匀。
6.5％CO2、37℃培养5h，补充新鲜的含10％胎牛血清的完全培养基至2ml，继续培养，直至出现细胞病理效应时(约7天左右)收获，反复冻融3次，离心取上清，分装冻存于-70度。
三、病毒扩增
1.在75cm2培养瓶中加入10ml DMEM5％培养5×106293A细胞。
2.取0.5ml首次扩增的病毒保存液，加入DMEM5％至1ml，混匀，这样稀释得到的MOI值约为5。
3.移去培养液，小心加入病毒混合液，切勿破坏细胞单层，十字形慢慢晃动3次，37℃CO2孵箱中培养90分钟。
4.加入9ml DMEM5％。
5.再培养72小时，这时在10ml溶液中大约有5×109-5×1010个病毒颗粒。收集细胞，600×g离心5分钟沉淀细胞，去上清后加入最小体积(一般为原始体积的1/10即1ml)病毒保存溶液重悬细胞。
6.-20℃/37℃冻融3次。
7.3000rpm离心10min去除细胞碎片，收集上清冻存于-80℃。
8.3个175cm2培养瓶中各加入107个293A细胞进行培养。
9.将3ml细胞裂解液上清加入12ml DMEM5％中，混匀。移去细胞培养液，每瓶小心加入5ml混合液，十字形慢慢晃动混匀3次，37℃CO2孵箱中培养90分钟。此时MOI值约为25。
10.加入DMEM5％至30ml。
11.再培养48-72小时。此时10ml培养液病毒量约为3×1010-3×1011。收集细胞，600×g离心5分钟收集细胞，弃上清，加入1/10原始体积的溶液重悬细胞，-20℃/37℃冻融3次。
12.3000rpm离心10min去除细胞碎片，收集上清冻存于-80℃。
四、病毒滴度测定
采用50％组织培养感染剂量法(TCID50法)，即将病毒从10-4稀释至10-11，接种生长于96孔培养板的293A细胞，每个滴度接种10孔，37℃培养10d，计算病毒滴度。具体如下：
(1)细胞准备：
1.收集一瓶293A细胞，计数。
2.用DMEM 5％准备10ml 105/ml细胞。
3.96孔板中每孔加入100μl细胞悬液。
(2)准备稀释病毒液：
1.第1无菌EP管中加入0.9ml DMEM 5％，其余加入1.8ml。第1管中再加入0.1ml病毒保存液。
2.上下吸打5次混匀。
3.换用新枪头。
4.从第1管中吸取0.2ml加入第2管中。
5.反复稀释至最高稀释度。
6.用同一管病毒保存液进行第2轮稀释。
7.最后8个稀释液加入96孔板，每孔0.1ml，每个稀释度10孔，2孔为阴性对照。阴性对照孔中加入0.1ml DMEM 5％监测细胞存活情况。加样时从最高稀释度开始。
8.37℃培养10天。
9.10天后倒置显微镜下观察，计算每一排中出现CPE的孔数。只要有一小点或是一些细胞出现CPE即为阳性，如果无法确定，可与阴性对照比较。
如果阴性对照中无任何CPE且细胞生长良好，最低稀释度100％阳性而最高稀释度100％阴性，则本测试即为有效。
滴度用KARBER统计法算出：对于100μl的稀释液，滴度为T＝101+d(s-0.5)d＝log10稀释度＝1(对于10倍的稀释度而言)，s＝阳性比率之和(从第1个10倍稀释度开始)，两次重复试验得到的滴度值应相差≤0.7个log10值。
五、病毒纯化
方法根据Clontech公司Adeno-XTM Virus Purification Kits(Cat.Nos.631533)说明书进行。病毒的构建、包装、扩增、滴度测定和纯化流程展示于图2。最终获得重组人hfgl2-miRNA腺病毒Ad-hfgl2-miRNA。
六、动物实验
选用人肝癌高转移细胞系(HCCLM6)移植在无胸腺小鼠皮下，待移植肿瘤生长至少达100mm3后，将动物随机分组，包括给药组、阳性对照组、阴性对照组和非相关对照组，每组10只裸鼠。
给药组给药上述方法获得的Ad-hfgl2-miRNA，用PBS作为药物载体，使用剂量为每只裸鼠2×108PFU，注射途径为瘤内多点注射，每周注射一次；阳性对照组给药索拉非尼(sorafenib)，使用剂量为90mg/Kg.d，灌胃，每日一次；非相关对照组给药无关序列的miRNA腺病毒颗粒(该腺病毒颗粒是用pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-neg对照质粒包装的)，用PBS作为药物载体，使用剂量为每只裸鼠2×108PFU，注射途径为瘤内多点注射，每周注射一次；阴性对照组给药PBS，注射量和给药途径与给药组相同。
用药后每周2-3次测量肿瘤的长径和短径，动态观察各组动物肿瘤体积变化，结果见下表1和附图4。
表1用药后各组实验动物肿瘤的体积(mm3)
给药结束后发现经hfgl2-miRNA腺病毒注射液治疗后，给药组小鼠的体重和整体状态要好于阳性对照组、非相关对照组和阴性对照组的小鼠，给药组小鼠的瘤块和阳性对照组小鼠的瘤块大小接近，而明显小于非相关对照组和阴性对照组小鼠的瘤块。经计算，给药组和阳性对照组的相对肿瘤增殖率T/C(％)分别为29.73％和22.87％(p＝0.716)，两者之间没有显著差异；而给药组和阳性对照组的相对肿瘤增殖率与非相关对照组和阴性对照组相比则有显著性差异(p＜0.01)(图3A，3B和3C)。
实验结果表明，本发明Ad-hfgl2-miRNA的治疗效果和阳性对照药物索拉非尼的相当，可显著抑制裸鼠人肝癌皮下移植瘤生长，治疗效果明显。
同时，也检测到了给药组注射腺病毒注射液后，受体组织肿瘤细胞中hfgl2的蛋白质水平和mRNA水平均出现了抑制(图5和6)，证实了Ad-hfgl2-miRNA对hfgl2凝血酶原酶基因的沉默作用。
上述的动物实验证明，本发明的Ad-hfgl2-miRNA对hfgl2凝血酶原酶基因具有沉默作用，并且对肝癌的生长有抑制作用，即通过沉默hfgl2凝血酶原酶基因抑制了肝癌生长。由此说明hfgl2凝血酶原酶基因可以作为肝癌治疗的靶基因，hfgl2的抑制剂可以用于治疗肝癌，抑制肝癌的生长和转移。
Claims (8)
1.hfgl2凝血酶原酶的抑制剂在制备治疗肝癌的药物中的应用。
2.权利要求1所述的应用，其中hfgl2凝血酶原酶的抑制剂为hfgl2凝血酶原酶的miRNA、包含hfgl2凝血酶原酶的miRNA的表达载体、包含hfgl2凝血酶原酶的miRNA的腺病毒、或含有包含hfgl2凝血酶原酶的miRNA的腺病毒的注射液。
3.权利要求2所述的应用，其特征在于：所述hfgl2凝血酶原酶的miRNA包含如下序列：5′-TGCTGTTCTTTGAACACCTCCTCGATGTTTTGGCCACTGACTGACATCGAGGATGTTCAAAGAA-3′。
4.权利要求3所述的应用，其特征在于：所述hfgl2凝血酶原酶的miRNA由如下序列组成：5′-TGCTGTTCTTTGAACACCTCCTCGATGTTTTGGCCACTGACTGACATCGAGGATGTTCAAAGAA-3′。
5.权利要求2所述的应用，其特征在于：所述表达载体为真核细胞表达载体。
6.权利要求5所述的应用，其特征在于：所述真核细胞表达载体为质粒载体或病毒载体。
7.权利要求6所述的应用，其特征在于：所述质粒载体为pcDNA表达载体，优选pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR。
8.权利要求6所述的应用，其特征在于：所述病毒载体为腺病毒载体，优选pAd/CMV/V5-Dest。
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