CN102065873A - 在溶瘤呼肠孤病毒治疗中消除促炎细胞因子的产生 - Google Patents

Abstract

本文提供了用于治疗受治疗者的增殖性疾患的方法，所述方法包括将一种或多种呼肠孤病毒以及调节促炎细胞因子的表达或活性的一种或多种药剂施用于受治疗者。例如，所述药剂可抑制促炎细胞因子的表达或活性。

Description

在溶瘤呼肠孤病毒治疗中消除促炎细胞因子的产生 

发明背景 

呼肠孤病毒是一种向性于具有活化Ras通路的癌细胞的dsRNA病毒。已证实，将呼肠孤病毒施用于带有肿瘤的动物导致产生显著的抗病毒响应，该响应是由免疫系统中的体液免疫臂(humoral arm)和细胞免疫臂(cellular arm)介导的。该抗病毒响应可拮抗治疗性病毒的溶瘤效力。同样，已开发了免疫抑制剂的联合使用以克服这种呼肠孤病毒溶瘤作用的免疫拮抗作用。已证实，消除中和性抗-呼肠孤病毒抗体(NARA)的产生的药剂的共施用可导致试验用动物的发病。试验用动物的响应已由在靶肿瘤组织之外的呼肠孤病毒的复制来表征，提示体液免疫在阻止宿主的呼肠孤病毒感染中具有保护作用(Qiao等人，Clin.Cancer Res.14(1)：259-69(2008))。 

发明概述 

本文提供了用于治疗受治疗者的增殖性疾患的方法，所述方法包括将一种或多种呼肠孤病毒以及调节促炎细胞因子的表达或活生的一种或多种药剂施用于受治疗者。例如，所述药剂可抑制促炎细胞因子的表达或活性。 

一个或多个方面的细节在以下的附图和说明书中提出。其他特征、目的和优势从说明书和附图以及从权利要求书中将会明显。 

附图简述 

图1A、1B、1C和1D示出了在呼肠孤病毒/顺铂联合治疗后减少的肿瘤生长和增加的存活率。用单独的呼肠孤病毒经瘤内(i.t.)注射(正方形)、单独的顺铂经腹膜内(i.p.)施用(三角形)、或呼肠孤病毒与顺铂联合(圆 形)在第1天和第4天治疗分别带有皮下B16.F10肿瘤的C57B1/6小鼠(图1A和1C)和带有K1735肿瘤的C3H小鼠(图1B和1D)。对照治疗的小鼠(菱形)接受PBS。在所指示的天测量肿瘤，并且肿瘤体积表示为相对于治疗开始时的体积的肿瘤体积(图1A和1B)。当肿瘤在任一方向上超过15mm时使小鼠安乐死。存活率表示为Kaplan-Myer图(图1C和1D)。 

图2是示出在没有治疗(对照)或用呼肠孤病毒、顺铂或呼肠孤病毒与顺铂联合治疗之后中和性抗-呼肠孤病毒抗体(NARA)响应的图。 

图3A、3B、3C、3D、3E、3F和3G是示出促炎细胞因子响应被顺铂消除的图。在没有治疗(对照)或用呼肠孤病毒、顺铂或呼肠孤病毒与顺铂联合治疗之后测量IL-1I的响应(图3A)、IL-3的响应(图3B)、IL-6的响应(图3C)、IL-12的响应(图3D)、IL-17的响应(图3E)、MIP-1I的响应(图3F)和RANTES的响应(图3G)。 

发明详述 

如前所述(参见，例如，美国专利第6,110,461；6,136,307；6,261,555；6,344,195；6,576,234；和6,811,775号)，呼肠孤病毒使用宿主细胞的Ras通路机制来下调双链RNA-活化的蛋白激酶(PKR)并因此在细胞中复制。基于这些发现，已开发了用于使用呼肠孤病毒来治疗增殖性疾患的方法。已证实，呼肠孤病毒治疗导致促炎细胞因子的释放。促炎细胞因子拮抗呼肠孤病毒感染并且呼肠孤病毒散布至肿瘤组织中。通过尽管无胸腺小鼠对呼肠孤病毒感染未显示发病，而SC1D小鼠和B-细胞敲除的动物(B-cellknock-out animal)总是死于呼肠孤病毒感染的观察结果，已进一步提示了免疫系统的体液免疫臂在阻止呼肠孤病毒毒性中的保护功能。 

可通过在体外使用细胞毒素剂而增强呼肠孤病毒溶瘤作用。令人惊奇地，如本文所述，联合使用铂化合物不影响NARA的产生但对包括以下的促炎细胞因子的产生具有深刻影响：IL-1I、IL-3、IL-6、IL-12p70、IL-17、MIP-1I和RANTES。顺铂对促炎细胞因子的抑制作用阻止了呼肠孤病毒感染的细胞的T-细胞识别，并允许病毒复制以保证没有细胞免疫拮抗。然而，顺铂允许保护性的中和性抗-呼肠孤病毒抗体(NARA)NARA的产生及其 伴随的益处(例如，阻止患者中的呼肠孤病毒毒性)。先前未描述使用铂化合物来选择性地阻断先天性和适应性T-细胞响应而对B-细胞活性没有影响。 

本文提供了治疗受治疗者的增殖性疾患的方法，包括将呼肠孤病毒施用于受治疗者并将调节促炎细胞因子的药剂施用于受治疗者。 

例如，所述的药剂抑制促炎细胞因子的表达或活性。如本文使用的术语调节是指相较于对照水平改变了(正或负)百分之10、20、30、40、50、60、70、80、90或更多。如本文使用的，对照是指来自未处理的样品或受治疗者的参考标准。作为实例，对照水平是在不存在刺激下的对照样品中的表达或活性水平。对照可以是在刺激之前、从刺激恢复后或没有刺激。 

任选地，细胞因子调节剂阻断T-细胞响应而对B-细胞活性几乎没有影响至没有影响。因此，药剂抑制促炎细胞因子但不抑制或最低限度地抑制NARA的产生。任选地，药剂是铂化合物。合适的铂化合物包括但不限于，顺铂、卡铂、metaplatin和奥沙利铂。 

抑制促炎细胞因子的其他药剂包括但不限于，TNF-I抗体如英夫利昔单抗、CDP571、CDP870和阿达木单抗；重组的、人类可溶性p55TNF受体如奥那西普；可溶性TNF受体和Fc片段融合蛋白如依那西普；针对TNF的人源化抗体的聚乙二醇化Fab片段如塞妥珠单抗(certolizumab pegol)；针对IL-2受体的抗-I链的嵌合抗体如巴利昔单抗或达克珠单抗；IL-12p40抗体如ABT-874；IL-6受体抗体如MRA或托珠单抗(tocilizumab)；IFN-K抗体如芳妥珠单抗(fontolizumab)；抑制IL-1结合至IL-1受体的抗体如AMG108；抑制细胞因子释放的半胱天冬酶-1抑制剂如二芳基磺酰脲(diarylsulphonylurene)；IL-15抗体如美泊利单抗；IL-8抗体如ABX-IL-8；IL-9抗体包括IL-9单克隆抗体；还称为494C10的重组人类IL-21；抑制TNF-I、 、IL-6和粒细胞单核细胞-集落刺激因子表达的抑制剂如感应草(biophylum sensitivum)；抑制促炎细胞因子表达的NF-PB信号转导阻断剂如辛伐他汀；和IL-6表达和NF-PB活化的抑制剂如(-)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)。 

其他药剂包括人类重组乳铁蛋白，其抑制促炎细胞因子和促转移细胞 因子(prometastatic cytokine)(包括IL-6、IL-8、粒细胞巨噬细胞集落-刺激因子和TNF-α)的细胞释放。树突细胞衍生的IL-12和IL-18的抑制剂如雷帕霉素和sanglifehrin也适用于提供的方法。雷帕霉素是抑制T细胞mTOR激酶活化的免疫抑制剂，而Sanglifehrin A是还抑制IL-2依赖性T细胞增殖的亲环蛋白-结合的免疫抑制剂。也适用于提供方法的是食用芦丁大肠炎(dietary rutin colitis)，其减低诸如IL-1β、IL-6和GM-CS等促炎细胞因子的诱导。 

任选地，所述方法还包括选择患有增殖性疾患的受治疗者，其中受治疗者需要促炎细胞因子响应的抑制。例如，这样的受治疗者可包括对单独呼肠孤病毒具有很少的响应的受治疗者，或对呼肠孤病毒治疗具有进行性拮抗的受治疗者。 

如本文使用的术语增殖性疾患是指其中细胞增殖比正常组织生长更快的任何细胞疾患。增殖性疾患包括但不限于，还被称为肿瘤的新生物。新生物可包括但不限于，胰腺癌、乳癌、脑癌(例如，成胶质细胞瘤)、肺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、甲状腺癌、肾癌、肾上腺癌、肝癌、神经纤维瘤病1和白血病。新生物可以是实体新生物(例如，肉瘤或癌)，或影响造血系统的癌性生长(cancerous growth)(例如，淋巴瘤或白血病)。其他增殖性疾患包括但不限于，神经纤维瘤病。 

通常，在使用呼肠孤病毒治疗的增殖性疾患中，与该疾患相关联的至少一些增殖细胞可具有突变，其中Ras基因(或Ras信号通路的元件)被直接地(例如，通过Ras中的活化性突变)或间接地(例如，通过对Ras通路中上游或下游元件的活化)活化。对Ras通路中上游元件的活化包括，例如，以表皮生长因子受体(EGFR)或Sos转化。参见，例如，Wiessmuller和Wittinghofer，1994，Cellular Signaling 6(3)：247-267；和Barbacid，1987，Ann.Rev.Biochem.56，779-827。对Ras通路中下游元件的活化包括，例如，在B-Raf内的突变。参见，例如，Brose等人，2002，Cancer Res.62：6997-7000。至少部分地通过ras、ras的上游元件或ras信号通路中的元件的活化而导致的增殖性疾患在本文中被称为ras-介导的增殖性疾患。此外，呼肠孤病毒可用于治疗由PKR突变或失调造成的增殖性疾患。参见，例如，Strong 等人，1998，EMBO J.17：3351-62。 

任选地，提供的方法还包括选择患有ras-介导的增殖性疾患的受治疗者的步骤。任选地，提供的方法包括确定增殖性疾患是否是ras-介导的增殖性疾患的步骤。这样的用于确定增殖性疾患是否具有某些表型的方法是公知的。参见，例如，美国专利第7,306,902号，其整体通过引用并入本文。 

如本文使用的，呼肠孤病毒是指归类于呼肠孤病毒属的任何病毒，不管是天然存在的、修饰的还是重组的。呼肠孤病毒是具有双链的、分段的RNA基因组的病毒。病毒粒子测量为60-80nm的直径并具有两个同中心的衣壳(capsid shell)，每一个均为二十面体。基因组由10-12个分离的节段的双链RNA组成，总的基因组大小为16-27kbp。单独的RNA节段大小不同。已从很多物种中回收了三种不同但相关类型的呼肠孤病毒。所有三种类型享有共同的补体-结合抗原。 

人类呼肠孤病毒包括三种血清型：1型(菌株Lang或T1L)、2型(菌株Jones，T2J)和3型(菌株Dearing或菌株Abney，T3D)。基于中和和血凝素-抑制试验，这三种血清型可容易地鉴定。根据本公开内容的呼肠孤病毒可以是3型哺乳动物正呼肠孤病毒。3型哺乳动物正呼肠孤病毒包括但不限于，Dearing和Abney菌株(分别为T3D或T3A)。参见，例如，ATCC登记号VR-232和VR-824。 

呼肠孤病毒可以是天然存在的或是修饰的。当呼肠孤病毒可从自然界中的源分离并且未被人类在实验室中有意修饰时，该呼肠孤病毒是天然存在的。例如，呼肠孤病毒可来自田野来源(field source)，即，来自已感染呼肠孤病毒的人。还可选择或诱变呼肠孤病毒用于增强溶瘤活性。 

呼肠孤病毒可以是被修饰的，但仍能够溶胞地(lytically)感染具有活性ras通路的哺乳动物细胞。呼肠孤病毒可在施用于增殖细胞之前被化学地或生物化学地预处理(例如，通过用诸如胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶等蛋白酶处理)。采用蛋白酶的预处理移除了病毒的外层(outer coat)或衣壳并可增强病毒的侵染性。呼肠孤病毒可被包覆在脂质体或微团中(Chandran和Nibert，J.of Virology 72(1)：467-751998)。例如，病毒粒子可以在微团形 成浓度的烷基硫酸盐洗涤剂存在下用胰凝乳蛋白酶处理以产生新的感染性亚病毒颗粒(ISVP)。 

呼肠孤病毒可以是重组的呼肠孤病毒。例如，重组的呼肠孤病毒可以是重配株呼肠孤病毒，其包括来自两种或更多种遗传上不同的呼肠孤病毒的基因组节段。呼肠孤病毒基因组节段的重配可发生在宿主生物体感染至少两种遗传上不同的呼肠孤病毒之后。病毒的重配可以发生在细胞培养物中，例如，通过与遗传上不同的呼肠孤病毒共感染许可性宿主细胞。因此，提供的方法包括使用由来自两种或更多种遗传上不同的呼肠孤病毒的基因组节段的重配产生的重组呼肠孤病毒，包括但不限于，人类呼肠孤病毒，例如1型(例如，菌株Lang)、2型(例如，菌株Jones)和3型(例如，菌株Dearing或菌株Abney)；非人类哺乳动物呼肠孤病毒；或鸟呼肠孤病毒。重组呼肠孤病毒还可通过遗传工程、化学合成或用化学诱变剂或物理诱变剂处理而获得。任选地，提供的方法包括使用由来自两种或更多种遗传上不同的呼肠孤病毒的基因组节段的重配产生的重组呼肠孤病毒，其中至少一种亲代病毒是遗传工程化的，包括一种或多种化学合成的基因组节段，已用化学诱变剂或物理诱变剂处理的，或自身是重组事件的结果。任选地，提供的方法包括使用已在化学诱变剂或物理诱变剂存在下经历重组的重组呼肠孤病毒，所述化学诱变剂包括但不限于，硫酸二甲酯和溴化乙锭，所述物理诱变剂包括但不限于，紫外线和其他形式的辐射。 

任选地，提供的方法包括使用在一个或多个基因组节段中具有突变(包括插入、取代、缺失或重复)的呼肠孤病毒。这样的突变可包括由于与宿主细胞基因组重组产生的其他遗传信息或可包括合成基因。例如，本文所述的突变体呼肠孤病毒可包含减少或基本上消除σ3多肽的表达的突变或导致功能性σ3多肽不存在的突变，如美国专利申请序列号12/124,522中所述，其整体通过引用并入本文。消除σ3多肽表达的突变或导致功能性σ3多肽不存在的突变可以在编码σ3多肽的核酸(即，S4基因)中，或在编码调节σ3多肽的表达或功能的多肽的核酸中。 

如本文使用的，减少σ3多肽的表达的突变是指，相较于表达野生型σ3多肽水平的呼肠孤病毒，导致σ3多肽的量减少至少30％(例如，至少40％、 50％、60％、70％、80％、90％或95％)的突变。如本文使用的，基本上消除σ3多肽的表达的突变是指，相对于由野生型呼肠孤病毒产生的σ3多肽的量，导致σ3多肽的量减少至少95％(例如，96％、97％、98％、99％或100％)的突变。如本文使用的，导致功能性σ3多肽减少或不存在的突变是指允许σ3多肽的表达但产生不能装配或并入病毒衣壳中的σ3多肽的突变。应当理解，σ3多肽保留其他功能性(例如，结合RNA的能力)以便突变体呼肠孤病毒保留繁殖能力可能是所期望的或必要的。 

如本文所述的σ3多肽中的突变可导致相对于不包含突变的σ3多肽(例如，野生型σ3多肽)以减少的水平并入衣壳的σ3多肽。如本文所述的σ3多肽中的突变还可导致不能并入病毒衣壳的σ3多肽。不受限于任何特定机制，例如由于σ3多肽与μ1多肽适当结合的无能力，或由于减少或阻止σ3多肽并入衣壳的构象变化，σ3多肽可具有减少的功能或缺乏功能。 

除了消除或减少σ3多肽的表达的突变或导致无功能的或减少的功能的σ3多肽的突变，如本文所述的突变体呼肠孤病毒还可包含在其他呼肠孤病毒衣壳多肽(例如，μ1、λ2和/或σ1)之一中的一种或多种进一步的突变(例如，第二、第三或第四突变)。包含影响σ3多肽的突变和任选地包含在任意或全部其他外部衣壳蛋白中的进一步突变的呼肠孤病毒，可筛选这样的突变体呼肠孤病毒感染并造成细胞溶解的能力。例如，可使用对野生型呼肠孤病毒的细胞溶解具有抗性的肿瘤细胞来筛选本文所述的有效的突变体呼肠孤病毒。 

例如，进一步的突变可减少或基本上消除μ1多肽的表达或导致功能性μ1多肽不存在。被M2基因编码的μ1多肽可能牵涉在细胞穿透中并可在转录酶活化中起作用。每个病毒粒子包含以与σ3多肽1∶1的复合物形式的约600个拷贝的μ1多肽。μ1多肽在其N端被十四烷酰化，然后十四烷酰化的N端42残基被裂解开，产生C端片段(μ1C)。另外或可选择地，进一步的突变可减少或基本上消除λ2多肽的表达或导致功能性λ2多肽不存在，和/或进一步的突变可减少或基本上消除σ1多肽的表达或导致功能性σ1多肽不存在。λ2多肽由L2基因编码并且牵涉在粒子装配中，并且显示鸟苷酰基转移酶和甲基转移酶活性。σ1多肽由S1基因编码并且牵涉在 细胞附着中，作为病毒血凝素。 

例如，呼肠孤病毒具有带有一个或多个氨基酸修饰的λ-3多肽；带有一个或多个氨基酸修饰的σ-3多肽；带有一个或多个氨基酸修饰的μ-1多肽；和/或带有一个或多个氨基酸修饰的μ-2多肽，如美国专利申请序列号12/046,095中所述，其整体通过引用并入本文。作为实例，在λ-3多肽中的一个或多个氨基酸修饰是在残基214处的Val、在残基267处的Ala、在残基557处的Thr、在残基755处的Lys、在残基756处的Met、在残基926处的Pro、在残基963处的Pro、在残基979处的Leu、在残基1045处的Arg、在残基1071处的Val、或其任意组合(相对于GenBank登记号M24734.1编号)。应当注意，当氨基酸序列在残基214处是Val或在残基1071处是Val时，该氨基酸序列还包括氨基酸序列中至少一种另外的变化。任选地，λ-3多肽包括显示在SEQ ID NO：18的序列。还作为实例，在σ-3多肽中的一个或多个氨基酸修饰是在残基14处的Leu、在残基198处的Lys、或其任意组合(相对于GenBank登记号K02739编号)。应当注意，当氨基酸序列在残基14处是Leu时，该氨基酸序列还包括氨基酸序列中至少一种另外的变化。任选地，σ-3多肽包括显示在SEQ ID NO：14的序列。还作为实例，在μ-1多肽中的一个或多个氨基酸修饰是在残基73处的Asp(相对于GenBank登记号M20161.1编号)。任选地，μ-1多肽包括显示在SEQ ID NO：16的序列。还是作为实例，氨基酸修饰μ-2多肽是在残基528处的Ser(相对于GenBank登记号AF461684.1编号)。任选地，μ-1多肽包括显示在SEQ ID NO：15的序列。具有一个或多个修饰的如本文所述的呼肠孤病毒还可包括呼肠孤病毒σ-2多肽。这样的σ-2多肽在位置70、127、195、241、255、294、296或340的一处或多处具有Cys(相对于GenBank登记号NP_694684.1编号)。任选地，σ-2多肽包括显示在SEQ ID NO：12的序列。 

任选地，呼肠孤病毒具有带有一个或多个核酸修饰的L1基因组节段；带有一个或多个核酸修饰的S4基因组节段；带有一个或多个核酸修饰的M1基因组节段；和/或带有一个或多个核酸修饰的M2基因组节段，如美国专利申请序列号12/046,095中所述，其整体通过引用并入本文。作为实 例，在L1基因组节段中的一个或多个核酸修饰是在位置660的T、在位置817的G、在位置1687的A、在位置2283的G、在位置2284-2286的ATG、在位置2794的C、在位置2905的C、在位置2953的C、在位置3153的A、或在位置3231的G(相对于GenBank登记号M24734.1编号)。任选地，L1基因组节段包括显示在SEQ ID NO：8的序列。还作为实例，在S4基因组节段中的一个或多个核酸修饰是在位置74的A和在位置624的A(相对于GenBank登记号K02739编号)。任选地，S4基因组节段包括显示在SEQ ID NO：4的序列。还作为实例，在M2基因组节段中的核酸修饰可以是在位置248的C(相对于GenBank登记号M20161.1编号)。在一个实施方案中，M2基因组节段包括显示在SEQ ID NO：6的序列。同样作为实例，在M1基因组节段中的核酸修饰是在位置1595的T(相对于GenBank登记号AF461684.1编号)。任选地，M1基因组节段包括显示在SEQ IDNO：5的序列。如本文所述的呼肠孤病毒可包括本文公开的任何修饰或修饰的组合。任选地，如本文所述的呼肠孤病毒包括具有显示在SEQ IDNO：1-10的序列的基因组节段或显示在SEQ ID NO：11、12和16-21或SEQID NO：13或14中任一个或两者的多肽。任选地，本文公开的呼肠孤病毒被确定为IDAC登记号190907-01，保藏日期为2007年9月19日，保藏单位为加拿大国际微生物保藏中心(IDAC)，保藏单位地址为R3E 3R2加拿大马尼托巴省温尼伯市阿灵顿街1015号。 

如本文所称的突变或修饰可以是一种或多种核苷酸的取代、插入或缺失。点突变包括，例如，单个核苷酸转换(嘌呤到嘌呤或嘧啶到嘧啶)或颠换(嘌呤到嘧啶或反过来)以及单个核苷酸或多个核苷酸的缺失或插入。核酸中的突变可导致在编码的多肽中的保守的或非保守的氨基酸取代，这可导致构象变化或功能丧失或部分功能丧失，翻译读码框中的迁移(移码)导致从那个点开始编码的完全不同的多肽，提前的终止密码子导致截短的多肽(截短)，或者呼肠孤病毒核酸中的突变可完全不改变编码的多肽(沉默或无义)。参见，例如，Johnson和Overington，1993，J.Mol.Biol.233：716-38；Henikoff和Henikoff，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915-19；和美国专利第4,554,101号对于保守的和非保守的氨基酸取代的公开内容。 

使用本领域公知的大量方法的任何方法可在呼肠孤病毒的核酸中产 生突变。例如，可使用定向诱变来修饰呼肠孤病毒核酸序列。定向诱变最常用的方法之一是寡核苷酸定向诱变。在寡核苷酸定向诱变中，编码所期望的序列变化的寡核苷酸被退火至感兴趣的DNA的一条链并作为用于开始DNA合成的引物。照这样，包含序列变化的寡核苷酸被合并到新合成的链中。参见，例如，Kunkel，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488；Kunkel等人，1987，Meth.Enzymol.154：367；Lewis和Thompson，1990，Nucl.AcidsRes.18：3439；Bohnsack，1996，Meth.Mol.Biol.57：1；Deng和Nickoloff，1992，Anal.Biochem.200：81；以及Shimada，1996，Meth.Mol.Biol.57：157。在本领域中常规地使用其他方法来修饰蛋白或多肽的序列。例如，包含突变的核酸可使用PCR或化学合成产生，或者具有所期望的氨基酸序列变化的多肽可被化学合成。参见，例如，Bang和Kent，2005，Proc.Natl.Acad.Sci.USA102：5014-9及其中的参考文献。 

来自呼肠孤病毒粒子的核酸可使用标准的市售核酸方法而被分离。还参见，例如，Schiff等人，“Orthoreoviruses and Their Replication(正呼肠孤病毒及其复制)，”第52章，在Fields Virology(费氏病毒学)，Knipe和Howley编著，2006，Lippincott Williams and Wilkins中。如本文使用的，分离的核酸是指从它们通常所结合的其他核酸中分离出的核酸。因此，分离的核酸包括但不限于，基本上不含非-呼肠孤病毒(例如，宿主细胞)核酸的呼肠孤病毒核酸；或基本上不含与其他基因组节段对应的核酸的呼肠孤病毒基因组节段。此外，分离的核酸可包括工程化的核酸如重组的或合成的核酸。 

如本文所述的突变体呼肠孤病毒可通过使用本领域公知的方法将含有至少一种突变或修饰的基因组节段重构而产生。参见，例如，Schiff等人，“Orthoreoviruses and Their Replication(正呼肠孤病毒及其复制)，”第52章，在Fields Virology(费氏病毒学)，Knipe和Howley编著，2006，Lippincott Williams and Wilkins中；Smith等人，1969，Virology39(4)：791-810；和美国专利第7,186,542、7,049,127、6,808,916以及6,528,305号。突变体呼肠孤病毒还可通过使用基于质粒的反向遗传学系统表达呼肠孤病毒基因组节段来产生ISVP而产生。参见，例如，Kobayashi等人，2007， Cell Host and Microbe 1：147-57。如本文使用的，遗传工程化的或突变体ISVP是一种突变体呼肠孤病毒，并且是指由携带至少影响σ3多肽的、遗传工程化的或自发产生的突变的呼肠孤病毒产生的ISVP。本文所述的ISVP是稳定的并可繁殖为用于多代(例如，多于1代，如，2、3、4、5、10、20、50或更多代)的ISVP。 

经遗传工程化的ISVP或经基于质粒的反向遗传学系统产生的本文所述的突变体呼肠孤病毒，可以在例如人类肿瘤细胞或L929小鼠成纤维细胞中培养。本文公开的突变体呼肠孤病毒可以在仅许可缺乏σ3多肽的呼肠孤病毒菌株的细胞中培养。使用这样的细胞系以传代本文所述的突变体呼肠孤病毒可允许选择突变体，且还可用于减少或防止突变的回复。 

任选地，本文所述的突变体呼肠孤病毒显示比非突变体呼肠孤病毒(例如，对照呼肠孤病毒)增加的感染性和/或降低的免疫原性，并可基于这样的性状来选择。增加的感染性可通过相对于被表达功能性σ3多肽的呼肠孤病毒(例如，完整病毒粒子；例如，野生型呼肠孤病毒)感染，被突变体呼肠孤病毒感染的肿瘤细胞的范围和/或细胞数量的增加而证实。突变体呼肠孤病毒的降低的免疫原性可通过这样的突变体呼肠孤病毒在受治疗者中诱导显著的免疫响应的无能力而证实。本文所述的突变体呼肠孤病毒还可对于其他期望的性状而筛选和选择，所述性状包括但不限于，更快的复制速度；更快的包装速度；诱导细胞凋亡的能力；在人类肿瘤细胞系中实现溶胞并有效杀死人类肿瘤细胞系的能力；释放有效的肿瘤表位的能力；与标准化学疗法的相互作用；和增加的病毒后代数量。此外，突变体呼肠孤病毒还可对于溶胞地感染肿瘤细胞(例如，具有活性Ras通路的哺乳动物细胞)的能力而选择。参见，例如，美国专利第7,052,832号。 

呼肠孤病毒任选地是被修饰以减少或消除对呼肠孤病毒的免疫反应的呼肠孤病毒。这样修饰的呼肠孤病毒在本文称为免疫保护的呼肠孤病毒。这样的修饰包括但不限于，在脂质体、微团或其他媒介物中包装呼肠孤病毒以将该呼肠孤病毒掩蔽而不接触免疫系统。可选择地，可除去呼肠孤病毒病毒粒子的外部衣壳，因为存在于外部衣壳中的蛋白是宿主体液和细胞免疫响应的主要决定簇。 

可使用标准方法纯化呼肠孤病毒。参见，例如，Schiff等人，“Orthoreoviruses and Their Replication(正呼肠孤病毒及其复制)，”第52章，在Fields Virology(费氏病毒学)，Knipe和Howley，编辑，2006，Lippincott Williams and Wilkins中；Smith等人，1969，Virology39(4)：791-810；和美国专利第7,186,542、7,049,127、6,808,916和6,528,305号。如本文使用的，纯化的突变体呼肠孤病毒是指已被从天然伴随它们的细胞组件中分离的呼肠孤病毒。通常，当呼肠孤病毒干重的至少70％(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％或99％)不含它们天然伴随的蛋白与其他细胞组件时，该呼肠孤病毒被视为纯化的。 

本文提供的呼肠孤病毒和药剂可在药学上可接受的载体中在体外或体内施用。因此提供了包含呼肠孤病毒和/或抑制如本文所述的促炎细胞因子的药剂的药物组合物。参见，例如，关于呼肠孤病毒的美国专利第6,576,234号。除了一种或多种呼肠孤病毒和/或抑制促炎细胞因子的药剂，药物组合物通常还包含药学上可接受的载体。药学上可接受的载体可以是能够作为呼肠孤病毒的媒介物、载体或介质的固态、半固态或液态物质。因此，含有呼肠孤病毒和/或提供的药剂的组合物可以是以下形式：片剂、丸剂、粉末、锭剂、小袋(sachet)、酏剂、悬浮液、乳液、溶液、糖浆剂、气溶胶(作为固体或在液体介质中)、含有例如高达按重量计10％的活性化合物的软膏剂、软明胶胶囊和硬明胶胶囊、栓剂、无菌注射液和无菌包装的粉末。 

任选地，含有呼肠孤病毒的组合物适于输注。对于静脉输液，通常使用两种流体，类晶体和胶体。类晶体是矿物盐或其他水溶性分子的水溶液。胶体包含较大的不溶性分子，例如明胶；血液自身是胶体。最常用的类晶体流体是生理盐水，一种0.9％浓度的氯化钠溶液，该浓度接近于血液的浓度(等渗的)。林格氏乳酸盐或林格氏乙酸盐是常用于大体积补液的另一种等渗溶液。如果患者处于低血糖或高钠的危险中，则经常替代地使用5％右旋糖于水中的溶液，有时被称为D5W。 

合适的载体的一些实例包括磷酸盐缓冲盐水或另一种生理学上可接受的缓冲液、乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树 胶、磷酸钙、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、无菌水、糖浆和甲基纤维素。另外，药物组合物可包括但不限于，润滑剂如滑石、硬脂酸镁和矿物油；湿润剂；乳化剂和悬浮剂；防腐剂如苯甲酸甲酯和羟苯丙酯；甜味剂；和调味剂。可将药物组合物制剂以在通过使用本领域公知的程序施用后提供突变体呼肠孤病毒的快速、持续或延迟的释放。除了以下所述的典型制剂，可在Remington：TheScience and Practice of Pharmacy(雷明顿药学原理与实践)(第21版)DavidB.Troy编著，Lippincott Williams & Wilkins，2005中发现其他适用于药物组合物的制剂。为了制备诸如片剂的固体组合物，可将突变体呼肠孤病毒与药物载体混合以形成固体组合物。任选地，片剂或丸剂可被包衣或以别的方式复合以提供给予长效优势的剂型。例如，片剂或丸剂可包含内部剂量组分和外部剂量组分，外部剂量组分是以包着内部剂量组分的包层的形式。两种组分可被肠溶层间隔，所述肠溶层用于抵抗在胃中的崩解并允许内部组分完整地通过至十二指肠或被延迟释放。多种材料可用于这样的肠溶层或包衣，这样的材料包括许多高分子酸和高分子酸与诸如虫胶、十六醇和乙酸纤维素等材料的混合物。 

用于口服施用或用于注射的包含呼肠孤病毒和/或其他药剂的液态制剂通常包括水溶液、适当调味的糖浆、水性或油性的悬浮液和含有诸如玉米油、棉籽油、芝麻油、椰子油或花生油等食用油的调味的乳液，以及酏剂和类似的药用媒介物。 

用于吸入或吹入的组合物包括在药学上可接受的水溶剂或有机溶剂或其混合物中的溶液和悬浮液、以及粉末。这些液态或固态的组合物可包含如本文所述的合适的药学上可接受的赋形剂。这样的组合物可通过口或鼻的呼吸途径施用用于局部效应或全身效应。在药学上可接受的溶剂中的组合物可通过使用惰性气体而被雾化。雾化的溶液可从雾化装置直接吸入，或雾化装置可连接至面罩帐篷(face mask tent)或间歇式正压呼吸机。溶液、悬浮液或粉末的组合物可通过口或鼻从以适当方式递送该制剂的装置施用。 

任选地用于本公开内容的方法中的另一制剂包括透皮递送装置(例 如，贴片)。这样的透皮贴片可用于提供如本文所述的突变体呼肠孤病毒的连续注入或不连续注入。透皮贴片用于递送药剂的构建和使用是本领域众所周知的。参见，例如，美国专利第5,023,252号。这样的贴片可被构建用于连续、脉动或请求式地递送突变体呼肠孤病毒。 

如上所述，如果必要，呼肠孤病毒和/或其他药剂被包覆在脂质体或微团中以减少或阻止在已对呼肠孤病毒产生免疫性的哺乳动物中的免疫响应。这样的组合物被称为免疫保护的呼肠孤病毒和/或药剂。参见，例如，美国专利第6,565,831和7,014,847号。此外，本文公开的突变体呼肠孤病毒(例如，σ3多肽或功能不存在或不足的突变体呼肠孤病毒)可以用酶蛋白水解处理以除去或部分除去存在的任何其他外部衣壳蛋白。 

在提供的方法中，呼肠孤病毒以使得它能够最终接触靶肿瘤或肿瘤细胞的方式施用，例如系统施用。呼肠孤病毒以及制剂、载体或媒介物所施用的途径取决于靶细胞的位置以及类型。可采用宽范围的施用途径。例如，对于可接近的实体瘤，呼肠孤病毒可通过直接注射到该肿瘤而施用。例如，对于造血肿瘤，呼肠孤病毒可静脉内或血管内施用。对于在体内不容易接近的肿瘤，例如转移瘤，呼肠孤病毒以使得它可被系统运输穿过哺乳动物的身体并从而到达该肿瘤的方式施用(例如，静脉内或肌肉内)。可选择地，呼肠孤病毒可被直接施用于单个实体瘤，然后它在那里被系统携带穿过身体至转移瘤。呼肠孤病毒还可通过如下施用：皮下、腹膜内、鞘内(例如，用于脑瘤)、局部(例如，用于黑素瘤)、口服(例如，用于口腔癌或食管癌)、直肠(例如，用于结肠直肠癌)、阴道(例如，用于宫颈癌或阴道癌)、经鼻、通过吸入喷射或通过气溶胶制剂(例如，用于肺癌)。 

任选地，在连续的天数至少每天1次或达整天地将病毒连续施用于受治疗者，持续一段时间。因此，例如，通过在任意药理学上可接受的溶液中的静脉内施用，或作为输注液，经一段时间将病毒施用于受治疗者。例如，物质可通过注射(例如，IM或皮下)而系统施用，或至少每天1次地每天口服，或通过输注以导致每天递送至受治疗者的组织或血流中的方式施用。当经一段时间通过输注施用病毒时，所述一段时间为，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12或24小时，或在1小时和24小时(含) 之间的任意时间，或更长时间。任选地，所述一段时间为5、15、30、60、90、120、150或180分钟，或在5分钟和180分钟(含)之间的任意时间，或更长时间。因此，例如，病毒通过输注施用60分钟或约60分钟。施用可每天重复，进行2、3、4、5、6、7、8、9、10、14、21、28天或在2和28天(含)之间的任意天数，或更长时间。 

提供的方法的治疗剂，例如抑制促炎细胞因子的产生的药剂，也通过多种施用途径来施用。因此，药剂通过多种施用途径的任意施用途径来施用，包括，局部、口、肠胃外、静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、腔内、透皮、肝内、颅内、喷雾/吸入、或通过经支气管镜检查的滴注。任选地，以在以上关于溶瘤病毒的描述中提出的方式连续施用治疗剂。因此，例如，通过在任意药理学上可接受的溶液中的静脉内施用，或作为输注液，经一段时间将所述药剂施用于例如受治疗者。任选地，在肿瘤位点或其附近局部施用所述药剂。可选择地，系统施用所述药剂。抑制促炎细胞因子的药剂以足够抑制一种或多种促炎细胞因子的量(即，有效量)施用。作为实例，铂化合物的有效量包括从约5mg/m²至1000mg/m²肿瘤体积，或在5mg/m²和1000mg/m²(含)之间的任意量，或更多。因此，例如，顺铂的有效量包括从约175-200mg/m²，并且对于卡铂的有效量包括从约100-600mg/m²。其他药剂的有效量从0.001-10,000mg/kg体重变化，或在0.001和10,000mg/kg体重(含)之间的任意量。任选地，铂化合物的有效量包括约2mg/mL分钟(AUC)至7mg/mL分钟，如通过Calvert公式所计算。任选地，铂化合物的有效量包括约5mg/mL分钟(AUC)或6mg/mL分钟，如通过Calvert公式所计算。任选地，铂化合物作为静脉内输注液经30分钟时间施用。 

呼肠孤病毒以足够治疗增殖性疾患的量(例如，有效量)施用。当施用于增殖细胞的呼肠孤病毒实现受感染细胞的细胞溶解(例如，溶瘤作用)，导致了异常增殖细胞数量的减少、新生物大小的减少和/或与增殖性疾患相关的症状(例如，疼痛)的减少或消除时，则增殖性疾患被治疗了。如本文使用的术语溶瘤作用是指至少10％的增殖细胞被溶解(例如，至少约20％、30％、40％、50％或75％的细胞被溶解)。例如，可通过在哺乳动 物中测量新生物大小或增殖细胞数量的减少或通过在体外(例如，来自增殖细胞的活组织检查)测量细胞溶解的量而确定细胞溶解的百分比。病毒的有效量将基于个体而确定，并且可基于(至少部分地)使用的特定病毒；个体的大小、年龄、性别；和异常增殖细胞的尺寸和其他特征。例如，对于治疗人类，取决于存在的增殖细胞或者新生物的类型、尺寸和数量，使用约10³至10¹²蚀斑形成单位(PFU)的病毒。有效量可以是，例如，从约1.0PFU/kg体重至约10¹⁵PFU/kg体重(例如，从约10²PFU/kg体重至约10¹³PFU/kg体重)。任选地，有效量为约1×10⁸至约1×10¹²TCID₅₀。任选地，有效量为约1×10¹⁰TCID₅₀。 

作为实例，5-6mg/ml分钟(如通过Calvert公式计算的AUC)抑制促炎细胞因子的药剂，例如卡铂，被施用于受治疗者，并且1×10¹⁰TCID₅₀至3×10¹⁰TCID₅₀的呼肠孤病毒被施用于该受治疗者。任选地，抑制促炎细胞因子的药剂以30分钟至1小时静脉内输注而施用。任选地，呼肠孤病毒以1小时静脉内输注施用。 

病毒和治疗剂以及含有病毒和药剂的组合物的最佳剂量取决于多种因素。所需的准确量将取决于受治疗者的物种、年龄、体重和一般健康、所治疗的疾病的严重性、使用的特定病毒或载体及其施用模式而从受治疗者至受治疗者变化。因此，对于每一种组合物指定准确量是不可能的。然而，合适的量可由本领域普通技术人员在本文提供的指导下仅使用常规试验而确定。 

施用组合物的有效剂量和时间表可凭经验确定。例如，对于多种增殖性疾患的动物模型可得自The Jackson Laboratory，600 Main Street，BarHarbor，Maine 04609 USA。可使用直接的测量(例如，肿瘤组织学)和功能性测量(例如，受治疗者的存活率或肿瘤尺寸)来监测对治疗的响应。这些方法包括处死典型的动物以评价种群，这增加了试验所需的动物数量。对肿瘤中萤光素酶活性的测量提供了评价肿瘤体积的替代方法而不处死动物且允许对治疗基于纵向种群的分析(longitudinal population-basedanalysis)。 

用于组合物施用的剂量范围是足够大以产生所期望的效果的剂量范 围，其中疾病的症状被影响。剂量不应当过大以至于造成不良副作用，例如不希望的交叉反应和过敏性反应。如果发生任何禁忌，单独的医师可调整剂量。 

剂量是变化的并且以每天1次或多次给药来施用，进行1天或若干天。提供的病毒和治疗剂以单剂量或以多剂量(例如，2、3、4、6或更多剂量)施用。例如，当通过输注施用时，该输注可以是单次缓释剂量或者可以通过多次输注来递送。治疗可持续从若干天到若干月或直到获得疾病的减少。 

提供的病毒与治疗剂的联合相伴地(例如，作为掺混物)、分别但同时地(例如，经分别的静脉内通道(intravenous line)进入相同的受治疗者)、或顺次地(例如，首先将化合物或药剂之一给药然后将第二个给药)施用。因此，术语联合用于指相伴地、同时地或顺次地施用两种或更多种药剂。作为实例，抑制促炎细胞因子的药剂在溶瘤病毒之前或与其同时施用。当一种化合物在另一种化合物之前施用时，第一种化合物在第二种化合物施用前几分钟、几小时、几天或几周施用。例如，第一种化合物可在施用第二种化合物之前1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、24、36、48、60或72小时或1和72小时(含)之间的任意时间施用。任选地，第一种化合物在第二种化合物之前超过72小时施用。作为另一实例，第一种化合物可在施用第二种化合物之前1、5、15、30、60、90或120分钟或1和120分钟(含)之间的任意时间施用。任选地，第一种化合物在施用第二种化合物之前1、2、3、4、5、6、7、14、21或28天或1和28天(含)之间的任意量施用。任选地，第一种化合物在第二种化合物之前超过28天施用。例如，抑制促炎细胞因子的药剂在施用溶瘤病毒之前约1小时至8小时施用。作为另一实例，抑制促炎细胞因子的药剂在施用溶瘤病毒之前约1小时的时间施用。 

作为实例，一个治疗周期包括将抑制促炎细胞因子的药剂和溶瘤病毒在第1天施用。在第2、3、4和5天，仅将溶瘤病毒施用于受治疗者。任选地，受治疗者接受多个治疗周期，例如，2、3、4、5或更多个治疗周期。 

呼肠孤病毒或含有这样的呼肠孤病毒的药物组合物任选地被包装为 药盒。该药盒还包含一种或多种药剂或含有这种抑制促炎细胞因子的药剂的药物组合物。任选地，预期药盒还包含一种或多种化疗剂、一种或多种免疫抑制剂、和/或一种或多种抗-抗呼肠孤病毒抗体。药物组合物可配制为单位剂型。术语“单位剂型”是指适于作为单一剂量用于人类受治疗者和其他哺乳动物的物理上分离的单位，每个单位含有经计算以产生所期望疗效的预定量的突变体呼肠孤病毒连同合适的药学上可接受的载体。 

预期提供的方法可与其他肿瘤疗法联合，例如化学疗法、放射疗法、外科手术、激素疗法和/或免疫疗法。因此，溶瘤病毒可联合外科手术或新生物的去除而施用。因此，在此提供的是用于治疗实体新生物的方法，该方法包括用外科手术除去新生物并在该新生物部位处或附近施用溶瘤病毒。 

任选地，还预期在提供的方法中的组合物联合已知的抗癌化合物或化疗剂而施用，或除了已知的抗癌化合物或化疗剂以外而另外施用。化疗剂是可抑制肿瘤生长的化合物。这样的药剂包括但不限于，5-氟尿嘧啶、丝裂霉素C、甲氨蝶呤、羟基脲、环磷酰胺、达卡巴嗪、米托蒽醌、蒽环霉素类(表柔比星和多柔比星(Doxurubicin))、受体的抗体例如赫赛汀、依托泊苷、pregnasome、激素疗法例如它莫西芬和抗-雌激素、干扰素、芳香酶抑制剂、促孕剂和LHRH类似物。 

如本文使用的术语治疗(treatment)、治疗(treat)、治疗(treating)或改善是指减少疾病或病症的影响或疾病或病症的症状的方法。因此，在公开的方法中，治疗可以指对确定的疾病或病症的严重性或该疾病或病症的症状10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的减少或改善。例如，如果癌症的一个或多个症状在受治疗者中相对于对照存在10％的减少，则用于治疗该疾病的方法被视为治疗。因此，所述的减少可以是相对于天然水平或对照水平10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或在10％和100％之间的任意百分比的减少。应当理解，治疗不必指疾病、病症或疾病或病症的症状的治愈或完全消除。 

如本文使用的，所提及的降低、减少或抑制包括相对于对照水平百分之10、20、30、40、50、60、70、80、90或更多的改变。这样的术语包 括但不必包括完全消除。 

如本文使用的术语受治疗者可以是脊椎动物，更特别地是哺乳动物(例如，人类、马、猪、兔、狗、绵羊、山羊、非人类的灵长类、牛、猫、豚鼠或啮齿动物)；鱼；鸟或爬行动物或两栖动物。该术语未指明特定的年龄或性别。因此，意图涵盖成年的和新生的受治疗者，不管是雄性的还是雌性的。如本文使用的，患者或受治疗者可互换使用并可指患有疾病或疾患的受治疗者。术语患者或受治疗者包括人类和兽医的受治疗者。 

公开了可用于公开的方法和组合物、可与公开的方法和组合物联合使用、可用于公开的方法和组合物的制备中、或是公开的方法和组合物的产物的物质、组合物和组分。这些和其他的物质在本文公开，并且应当理解，当这些物质的组合、子集、相互作用、组等被公开时，虽然每个各种单体的具体参考以及这些化合物的集合的组合与排列可能未明确地公开，但本文特别地预期和描述了每一个。例如，如果公开并讨论了抑制剂并且讨论了可对包括该抑制剂的许多分子进行的许多修饰，则该抑制剂的每一个和所有的组合与排列以及可能的修饰是特别地预期的，除非相反地明确指明。类似地，这些的任何子集或组合也是特别地预期和公开的。此原则应用于本公开内容的所有方面，包括但不限于，使用公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果存在可进行的多种另外的步骤，则应当理解，这些另外的步骤中的每一个可采用公开的方法中的任何具体的方法步骤或方法步骤的组合来进行，并且每个这样的组合或组合的子集是特别地预期的并应当视为被公开了。 

贯穿本申请，提及了各种出版物。这些出版物的公开内容以其整体通过引用并入本申请。 

已描述了许多方面。但是，应当理解可作出各种修改。此外，当描述一个特征或步骤时，其可与本文中的任何其他特征或步骤组合，即使这种组合未明确说明。因此，其他的方面在权利要求书的范围内。 

实施例

实施例1.呼肠孤病毒和顺铂在小鼠黑素瘤模型中的抗肿瘤活性 

呼肠孤病毒3型Dearing(RV)已在许多体外系统、体内鼠科动物模型和早期临床试验中证实了溶瘤活性。为了促进这些研究，研究了RV连同顺铂(CP)在体外和在体内中的溶瘤活性，所述的顺铂是造成DNA交联并且在宽范围的癌症中有活性的假烷基化化疗剂(pseudoalkylatingchemotherapeutic)。在体外评价了RV和CP用于协同肿瘤杀死和肿瘤死亡机理的作用。在B16.F10细胞上观察到了RV和CP之间(CIV：ED50，0.42±0.03；ED75，0.30±0.02；ED90，0.24±0.01)的协同相互作用(协同指数值(combination index value，CIV)小于1)。在组合暴露(exposure)后，相对于单药剂暴露，流式细胞检测分析显示出凋亡细胞的显著增加。 

对于体内评价，用瘤内(i.t.)RV和腹膜内(i.p.)CP单独地或联合地治疗C57B1/6小鼠中的皮下B16.F10肿瘤或C3H小鼠中的K1735肿瘤。肿瘤体积每周评估3次。治疗后收集肿瘤和器官用于病毒回收(retrieval)和组织学研究；测试血清样品的细胞因子产生和对中和性抗-呼肠孤病毒抗体(NARA)的诱导。图1A、1B、1C和1D示出在呼肠孤病毒/顺铂联合治疗后减少的肿瘤生长和增加的存活率。用单独的呼肠孤病毒瘤内治疗(正方形)、单独的顺铂腹膜内(三角形)、或呼肠孤病毒与顺铂联合(圆形)在第1天和第4天治疗分别带有皮下B16.F10肿瘤的C57B1/6小鼠(图1A和1C)和带有K1735肿瘤的C3H小鼠(图1B和1D)。对照治疗的小鼠(菱形)接受PBS。在所指示的天测量肿瘤，并且肿瘤体积表示为相对于治疗开始时的体积的肿瘤体积(图1A和1B)。当肿瘤在任一方向上超过15mm时使小鼠安乐死。存活率表示为Kaplan-Myer图(图1C和1D)。这些数据示出减少的肿瘤生长，并且在用RV/CP联合治疗的小鼠中观察到相对于用单药剂治疗延长的中值存活时间(图1A、1B、1C和1D)。在第12天的平均相对肿瘤体积±SD为，对照：全部达到终点；单独的RV：8.92±6.94；单独的CP：9.87±2.80；RV加CP：3.86±2.24。中值存活(天)为，对照：6；RV：12；CP：8；RV和CP联合：17。从仅为RV治疗的全部动物的肿瘤和从1/6小鼠的肝脏和心脏回收到活的病毒。作为对照，仅在50％来自联合治疗的小鼠的肿瘤中但在4/6小鼠的肝脏中检测到活的病毒。在联合使用时，CP不影响中和性抗-呼肠孤病毒抗体(NARA)对RV的响应(图2)，但造成响应于RV的促炎细胞因子产生的显著的削弱 (图3A、3B、3C、3D、3E、3F和3G)。 

总之，这些结果表明，化疗剂的加入可显著增强RV疗法的抗肿瘤功效。此外，通过相伴的化疗，在重要器官中病毒炎症反应的减少可允许更密集的给药时间表以增强呼肠孤病毒的总功效。实施例2.用于人类的呼肠孤病毒和卡铂方案 

这是呼肠孤病毒与卡铂每3周静脉内给药的研究设计。 

卡铂作为30分钟静脉内输注液以通过Calvert公式计算的剂量施用(AUC 5mg/mL分钟或6mg/mL分钟，GFR通过51Cr EDTA测定)。然后，呼肠孤病毒作为1小时静脉内输注液以1×10¹⁰或3×10¹⁰TCID₅₀的剂量施用。 

在第2至5天，使用与在第1天使用的相同的剂量和方法，仅施用呼肠孤病毒。 

表2-给药方法 

Claims (25)

1.一种用于治疗受治疗者的增殖性疾患的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)将一种或多种呼肠孤病毒施用于受治疗者；并

(b)将抑制促炎细胞因子的表达或活性的一种或多种药剂施用于受治疗者。

2.如权利要求1所述的方法，其中约10³至10¹²蚀斑形成单位(PFU)的溶瘤病毒被施用于受治疗者。

3.如权利要求2所述的方法，其中约10⁸至10¹²蚀斑形成单位(PFU)的所述溶瘤病毒被施用于受治疗者。

4.如权利要求1所述的方法，其中约10⁸至10¹²TCID₅₀的溶瘤病毒被施用于受治疗者。

5.如权利要求1所述的方法，其中约5mg/m²至1000mg/m²的抑制促炎细胞因子的所述药剂被施用于受治疗者。

6.如权利要求1所述的方法，其中约0.001-10,000mg/kg体重的抑制促炎细胞因子的所述药剂被施用于受治疗者。

7.如权利要求1所述的方法，其中2mg/mL分钟(AUC)至7mg/mL分钟的抑制促炎细胞因子的所述药剂被施用于受治疗者。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述药剂抑制促炎细胞因子但不抑制中和性抗-呼肠孤病毒抗体(NARA)的产生。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述药剂是铂化合物。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述铂化合物选自由顺铂、卡铂和奥沙利铂组成的组。

11.如权利要求10所述的方法，其中约175-200mg/m²顺铂被施用于受治疗者。

12.如权利要求10所述的方法，其中约200-600mg/m²卡铂被施用于受治疗者。

13.如权利要求10所述的方法，其中5mg/mL分钟(AUC)或6mg/mL分钟的卡铂被施用于受治疗者。

14.如权利要求1-13任一项所述的方法，其中所述呼肠孤病毒是哺乳动物呼肠孤病毒或人类呼肠孤病毒。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述人类呼肠孤病毒选自由血清型1呼肠孤病毒、血清型2呼肠孤病毒和血清型3呼肠孤病毒组成的组。

16.如权利要求14所述的方法，其中所述人类呼肠孤病毒是血清型3呼肠孤病毒。

17.如权利要求14所述的方法，其中所述人类呼肠孤病毒具有IDAC登记号190907-01。

18.如权利要求1-13任一项所述的方法，其中抑制促炎细胞因子的所述药剂在施用所述呼肠孤病毒的同时、之前或之后施用。

19.如权利要求18所述的方法，其中抑制促炎细胞因子的所述药剂与所述呼肠孤病毒同时施用。

20.如权利要求18所述的方法，其中抑制促炎细胞因子的所述药剂在施用所述呼肠孤病毒之前施用。

21.如权利要求20所述的方法，其中所述药剂在施用所述溶瘤病毒之前1小时至12小时施用。

22.如权利要求20所述的方法，其中所述药剂在施用所述溶瘤病毒之前1分钟至60分钟施用。

23.如权利要求1所述的方法，其中所述呼肠孤病毒以多剂量施用。

24.如权利要求23所述的方法，其中抑制促炎细胞因子的所述药剂被施用1次。

25.如权利要求23所述的方法，其中抑制促炎细胞因子的所述药剂以多剂量施用。

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