CN103710359A

CN103710359A - 具有修饰的序列的呼肠孤病毒

Info

Publication number: CN103710359A
Application number: CN201310353609.2A
Authority: CN
Inventors: M.C.科菲
Original assignee: Oncolytics Biotech Inc
Current assignee: Oncolytics Biotech Inc
Priority date: 2007-03-12
Filing date: 2008-03-11
Publication date: 2014-04-09
Also published as: EP2132315A4; TW200904979A; HK1132761A1; AR066395A1; CA2678721C; IL221701A0; EP2952583A1; AU2008226291A2; US10596260B2; AU2008226291B2; US20180344853A1; US20090035278A2; US7803385B2; JP5577103B2; IL221702A0; KR101647843B1; MX346950B; US20200237917A1; US20140186301A1; US20110020288A1

Abstract

本发明提供修饰的呼肠孤病毒核酸序列和修饰的呼肠孤病毒多肽序列以及含有这种修饰的核酸序列或多肽序列的呼肠孤病毒。本发明还提供包括具有修饰的序列的呼肠孤病毒的药物组合物以及制备和使用这种呼肠孤病毒的方法。

Description

具有修饰的序列的呼肠孤病毒

本申请为分案申请，原申请的申请日为2008年3月11日，申请号为200880007670.9(PCT/CA2008/000483)，发明名称为“具有修饰的序列的呼肠孤病毒”。

相关申请的交叉引用

根据35U.S.C.119(e)，本申请要求2007年3月12日提交的美国申请第60/894,425号和2007年11月21日提交的美国申请第60/989,568号的优先权，这两者通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及病毒，更具体地涉及具有修饰的序列的呼肠孤病毒。

背景

呼肠孤病毒的名称来自呼吸和肠孤儿病毒的首字母缩写，代表来自人类呼吸和肠道但不与严重疾病关联的最初分离株(isolate)。呼肠孤病毒具有双链、节段的RNA基因组。病毒体的直径经测量为60-80nm并具有两层各自为二十面体的同心的衣壳。哺乳动物呼肠孤病毒基因组由10个不连续区段的双链RNA组成，总基因组大小为～23.5kbp。单独RNA区段的大小不同。

已经从哺乳动物物种回收三种血清学上不同但相关类型的呼肠孤病毒：1型(代表性毒株包括例如，Lang(T1L))、2型(代表性毒株包括例如，Jones(T2J))和3型(代表性毒株包括例如，Dearing或Abney(分别是T3D或T3A))。这三种血清型基于中和和血凝素抑制测定是易于鉴定的(参见例如，Sabin，1959，Science，130：966；Fields等人，1996，Fundamental Virology，第3版，Lippincott-Raven；Rosen，1960，Am.J.Hyg.，71：242；和Stanley，1967，Br：Med.Bull.，23：150)。

概述

本文提供了具有修饰的核酸和多肽序列的呼肠孤病毒。序列修饰包括，例如在呼肠孤病毒一种或多种基因组区段中的修饰。还提供了包括具有修饰的序列的呼肠孤病毒的药物组合物以及使用这种呼肠孤病毒的方法。

一方面，本发明提供具有如下多肽的呼肠孤病毒：具有一种或多种氨基酸修饰的λ-3多肽；具有一种或多种氨基酸修饰的σ-3多肽；具有一种或多种氨基酸修饰的μ-1多肽；和/或具有一种或多种氨基酸修饰的μ-2多肽。这种呼肠孤病毒可为例如，非天然产生的。另一方面，本发明提供具有一种或多种氨基酸修饰的呼肠孤病毒λ-3多肽；具有一种或多种氨基酸修饰的呼肠孤病毒σ-3多肽；具有一种或多种氨基酸修饰的呼肠孤病毒μ-1多肽；和/或具有一种或多种氨基酸修饰的呼肠孤病毒μ-2多肽。

以示例的方式，λ-3多肽中的一种或多种氨基酸修饰可为相对于GenBank登记号M24734.1编号的残基214处的Val、残基267处的Ala、残基557处的Thr、残基755处的Lys、残基756处的Met、残基926处的Pro、残基963处的Pro、残基979处的Leu、残基1045处的Arg、残基1071处的Val或其任何组合。注意到，当氨基酸序列在残基214处是Val或在残基1071处是Val时，氨基酸序列进一步包括氨基酸序列中的至少一种另外的改变。在一实施方案中，λ-3多肽包括SEQ ID NO：19中所示的序列。

进一步以示例的方式，σ-3多肽中的一种或多种氨基酸修饰可为相对于GenBank登记号K02739编号的残基14处的Leu、残基198处的Lys或其任何组合。注意到，当氨基酸序列在残基14处是Leu时，氨基酸序列进一步包括氨基酸序列中的至少一种另外的改变。在一实施方案中，σ-3多肽包括SEQ ID NO：15中所示的序列。

进一步以示例的方式，μ-1多肽中的一种或多种氨基酸修饰可为相对于GenBank登记号M20161.1编号的残基73处的Asp。在一实施方案中，μ-1多肽包括SEQ ID NO：17中所示的序列。

还以示例的方式，μ-2多肽中的氨基酸修饰可为相对于GenBank登记号AF461684.1编号的残基528处的Ser。在一实施方案中，μ-2多肽包括SEQ ID NO：16中所示的序列。

本文描述的具有一种或多种修饰的呼肠孤病毒可进一步包括呼肠孤病毒σ-2多肽。这种σ-2多肽可具有在相对于GenBank登记号NP_694684.1编号的位置70、127、195、241、255、294、296或340中的一个或多个位置处的Cys。在一实施方案中，σ-2多肽包括SEQ ID NO：12中所示的序列。

另一方面，本发明提供具有如下基因组区段的呼肠孤病毒：具有一种或多种核酸修饰的L1基因组区段；具有一种或多种核酸修饰的S4基因组区段；具有一种或多种核酸修饰的M1基因组区段；和/或具有一种或多种核酸修饰的M2基因组区段。这种呼肠孤病毒可为例如，非天然产生的。另一方面，本发明提供具有一种或多种核酸修饰的L1基因组区段；具有一种或多种核酸修饰的S4基因组区段；具有一种或多种核酸修饰的M1基因组区段；和/或具有一种或多种核酸修饰的M2基因组区段。

以示例的方式，L1基因组区段中一种或多种核酸修饰可为相对于GenBank登记号M24734.1编号的位置660处的T、位置817处的G、位置1687处的A、位置2283处的G、位置2284-2286处的ATG、位置2794处的C、位置2905处的C、位置2953处的C、位置3153处的A或位置3231处的G。在一实施方案中，L1基因组区段包括SEQ ID NO：8中所示的序列。

进一步以示例的方式，S4基因组区段中的一种或多种核酸修饰可为相对于GenBank登记号K02739编号的位置74处的A和位置624处的A。在一实施方案中，S4基因组区段包括SEQ ID NO：4中所示的序列。

进一步以示例的方式，M2基因组区段中的核酸修饰可为相对于GenBank登记号M20161.1编号的位置248处的C。在一实施方案中，M2基因组区段包括SEQ ID NO：6中所示的序列。

还以示例的方式，M1基因组区段中的核酸修饰可为相对于GenBank登记号AF461684.1编号的位置1595处的T。在一实施方案中，M1基因组区段包括SEQ ID NO：5中所示的序列。

本文描述的呼肠孤病毒可包括本文公开的任何修饰或修饰的组合。在一些实施方案中，本文描述的呼肠孤病毒是重配株(reassortant)。在某些实施方案中，本文描述的呼肠孤病毒包括具有SEQ ID NO：1-10中所示的序列的基因组区段或SEQ ID NO：11、12和16-21中所示的多肽以及SEQID NO：13或14中任一或两者所示的多肽。在一实施方案中，本文公开的呼肠孤病毒鉴定为IDAC登记号190907-01。

本文公开的呼肠孤病毒通常表现出超过不含有相应修饰的呼肠孤病毒的生长益处。代表性生长益处包括但不限于：溶解率增加；蚀斑形成的大小增加；RNA复制速率提高；RNA转录速率提高；翻译速率提高；病毒组装和/或包装速率提高；病毒后代数目增加；呼肠孤病毒被宿主细胞获取的能力提高；脱被(uncoat)的能力提高或增强；细胞溶解增强或诱导包括凋亡、坏死或自体吞噬的细胞死亡；感染、溶解和杀死人类瘤细胞系的能力增强；哺乳动物细胞中免疫原性降低；对干扰素敏感性的易感性不同；对宿主的毒性降低；药物相互作用增强；放疗相互作用增强；或释放有效肿瘤表位的能力。

本文描述的呼肠孤病毒可连同药学上可接受的载体被包括在药物组合物中。这种药物组合物可包括，例如一种或多种化疗剂和/或一种或多种免疫抑制剂。

在又另一方面，本发明提供制备改良的呼肠孤病毒的方法。这种方法通常包括修饰呼肠孤病毒的核酸序列和选择一种或多种改良的呼肠孤病毒的步骤。在一些实施方案中，修饰步骤包括例如，诱变呼肠孤病毒。代表性诱变类型包括但不限于位点定向诱变和化学诱变。在其它实施方案中，修饰步骤包括在人类细胞系中培养呼肠孤病毒。

根据本文公开的方法制备的改良的呼肠孤病毒可根据以下选择：溶解率增加；蚀斑形成的大小增加；RNA复制速率提高；RNA转录速率提高；翻译速率提高；病毒组装和/或包装速率提高；病毒后代数目增加；呼肠孤病毒被宿主细胞获取的能力提高；脱被的能力提高或增强；细胞溶解增强或诱导包括凋亡、坏死或自体吞噬的细胞死亡；感染、溶解和杀死人类瘤细胞系的能力增强；哺乳动物细胞中免疫原性降低；对干扰素敏感性的易感性不同；对宿主的毒性降低；药物相互作用增强；放疗相互作用增强；或释放有效肿瘤表位的能力。

在又另一方面，本发明提供治疗患者增生性病症的方法。这种方法通常包括向患者施用如本文所述的修饰的呼肠孤病毒或含有这种修饰的呼肠孤病毒的药物组合物。通常，呼肠孤病毒以有效导致溶瘤作用的量施用，并可施用多于一次。代表性施用途径包括例如，直接注射、静脉内、血管内、鞘内、肌内、皮下、腹膜内、局部地、口服地、直肠地、阴道地、鼻地或通过吸入。本文所述的治疗增生性病症的方法可伴有诸如手术、化疗、放疗和免疫抑制疗法的一种或(of)多种程序。

另一方面，本发明提供一种药盒(或制品)，其包括如本文所公开的具有修饰的序列或具有含修饰的序列的基因组区段的任何组合的呼肠孤病毒。药盒还可包括如本文公开的一种或多种剂。

除非另外限定，否则本文所用的所有技术术语和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的具有相同含义。下文描述了适合的方法和材料，尽管与本文描述的方法和材料相似或等价的方法和材料可用于实践或测试本发明。此外，材料、方法和实例仅仅是示例性的并不意为限制。本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用以其全部内容并入本文。

本发明一种或多种实施方案的详细说明列于附图和以下说明书。根据附图、详述和权利要求书，本发明的其它特征、目标和益处将变得明显。

附图说明

图1是代表性S1区段(SEQ ID NO：1)、S2区段(SEQ ID NO：2)、S3区段(SEQ ID NO：3)和S4区段(SEQ ID NO：4)的核苷酸序列。

图2是代表性M1区段(SEQ ID NO：5)、M2区段(SEQ ID NO：6)和M3区段(SEQ ID NO：7)的核苷酸序列。

图3是代表性L1区段(SEQ ID NO：8)、L2区段(SEQ ID NO：9)和L3区段(SEQ ID NO：10)的核苷酸序列。

图4是代表性σ-1多肽(SEQ ID NO：11)、σ-2多肽(SEQ ID NO：12)、σ-NS多肽(推定编码序列1、SEQ ED NO：13；推定编码序列2、SEQ ID NO：14)和σ-3多肽(SEQ ID NO：15)的氨基酸序列。

图5是代表性μ-2多肽(SEQ ID NO：16)、μ-1多肽(SEQ ID NO：17)和μ-NS多肽(SEQ ID NO：18)的氨基酸序列。

图6是代表性λ-3多肽(SEQ ID NO：19)、λ-2多肽(SEQ ID NO：20)和λ-1多肽(SEQ ID NO：21)的氨基酸序列。

各图中同样的参考符号指示同样的元件。

详述

本公开内容描述了呼肠孤病毒的核苷酸和氨基酸序列中的修饰。任选地选择这种修饰以影响病毒复制和/或包装自身的能力，并从而改变呼肠孤病毒的感染性和/或复制率。

具有修饰的序列的呼肠孤病毒和制备方法

来自任何3型哺乳动物正呼肠孤病毒(本文简称为“呼肠孤病毒”)的任何基因组区段可如本文公开的进行修饰。代表性3型哺乳动物正呼肠孤病毒包括但不限于Dearing和Abney毒株。参见例如，ATCC登记号VR-232和VR-824。可如本文公开的修饰的呼肠孤病毒包括天然产生的呼肠孤病毒(如分离自天然来源，如从患者分离)和重配的呼肠孤病毒(参见如美国专利第7,163,678号)。

对呼肠孤病毒不同基因组区段的代表性修饰和该修饰在编码的多肽中的表现形式(manifestation)示于表1。表1中所示的修饰显示编码与RNA-依赖性RNA聚合酶、转录活性和/或RNA结合相关的多肽的区段序列中的修饰(修饰数目和许多修饰的非保守性质)。例如，本文公开的许多新型修饰位于L1基因组区段。野生型L1基因组区段编码称为λ-3的1,267个氨基酸(142kDa)的蛋白。λ-3代表呼肠孤病毒的RNA-依赖性RNA聚合酶的催化亚基，该酶介导呼肠孤病毒粒子中加链和减链RNA合成。在M2基因组区段中观察到进一步修饰。野生型M2基因组区段编码称为μ-1的708个氨基酸(76kDa)的蛋白，其牵涉在与粒子结合的转录的调节中。此外，还在S4和M1基因组区段中观察到修饰，所述区段分别编码σ-3和μ-2，并在转录或单链或双链RNA结合中起作用。

因此，本公开内容提供在相应基因组区段中含有一种或多种核酸修饰的L1、S4、M1、M2或这种基因组区段的任何组合。本文提供具有一种或多种核酸修饰的呼肠孤病毒L1基因组区段；具有一种或多种核酸修饰的呼肠孤病毒S4基因组区段；具有一种或多种核酸修饰的呼肠孤病毒M1基因组区段；和/或具有一种或多种核酸修饰的M2基因组区段。

呼肠孤病毒L1基因组区段具有例如以下核苷酸中的一种或多种的任何组合：位置660处的T、位置817处的G、位置1687处的A、位置2283处的G、位置2284-2286处的ATG、位置2794处的C、位置2905处的C、位置2953处的C、位置3153处的A或位置3231处的G(相对于GenBank登记号M24734.1编号)。呼肠孤病毒S4基因组区段具有例如以下核苷酸中的一种或多种的任何组合：位置74处的A或位置624处的A(相对于GenBank登记号K02739编号)。呼肠孤病毒M1基因组区段具有例如在位置1595处的T核苷酸(相对于GenBank登记号AF461684.1编号)。呼肠孤病毒M2基因组区段具有例如在位置248处的C核苷酸(相对于GenBank登记号M20161.1编号)。在指示位置的指示核苷酸表示与公共数据库中可得的其它相应序列(如GenBank登记号M24734.1、K02739、AF461684.1和M20161.1)相比时的修饰。

呼肠孤病毒λ-3多肽具有例如一种或多种氨基酸残基的任何组合：残基214处的Val、残基267处的Ala、残基557处的Thr、残基755处的Lys、残基756处的Met、残基926处的Pro、残基963处的Pro、残基979处的Leu、残基1045处的Arg或残基1071处的Val(相对于GenBank登记号M24734.1编号)。应注意，当多肽序列包括残基214处的Val或残基1071处的Val时，该多肽序列进一步包括氨基酸序列中至少一种另外的改变。呼肠孤病毒σ-3多肽具有例如一种或多种氨基酸残基的任何组合：残基14处的Leu或残基198处的Lys(相对于GenBank登记号K02739编号)。应注意，当多肽序列包括残基14处的Leu时，该多肽序列进一步包括氨基酸序列中至少一种另外的改变。呼肠孤病毒μ-1多肽具有例如在残基73处的Asp(相对于GenBank登记号AF461684.1编号)。呼肠孤病毒μ-2多肽具有例如在残基528处的Ser(相对于GenBank登记号M20161.1编号)。在指示位置的指示氨基酸表示与公共数据库中的其它相应序列(如GenBank登记号M24734.1、K02739、AF461684.1和M20161.1)相比时的修饰。

本文所用的“非天然产生的”呼肠孤病毒是与来自例如天然分离株(field isolate)(如患者)的野生型序列相比具有至少一种核酸或氨基酸修饰的呼肠孤病毒。“非天然产生的”呼肠孤病毒是指已经在实验室中操纵或修饰的病毒。这种操纵的或修饰的呼肠孤病毒包括实验室毒株或诱变形式。这些形式的核酸和/或氨基酸序列与例如Dearing和Abney毒株(分别如ATCC VR-824和VF-232)是可区别的。本文公开了对一种或多种基因组区段、编码的多肽或两者的代表性修饰。除了含有一种或多种本文描述的修饰的基因组区段或多肽，呼肠孤病毒任选地含有编码σ-2多肽的S2基因组区段。σ-2多肽例如在以下位置中的一个或多个或所有位置处具有Cys：70、127、195、241、255、294、296或340(相对于GenBank登记号NP_694684.1编号)。

修饰通常在核酸水平发生，该修饰可在或可不在编码的多肽中表现自身。对核酸的修饰包括但不限于，单个或多个核苷酸转变(嘌呤到嘌呤或嘧啶到嘧啶)或颠换(嘌呤到嘧啶或反之亦然)和单个或多个核苷酸缺失或插入。核酸中的修饰可导致编码的多肽中一种或多种保守性或非保守性氨基酸取代，翻译读码框中位移(“移码)导致从该位点起开始编码的完全不同的多肽，提前终止密码子导致平截的多肽(“平截”)，或呼肠孤病毒核酸中的修饰完全不改变编码的多肽(“沉默”或“无义”)。参见例如，Johnson&Overington，1993，J.Mol.Biol.，233：716-38；Henikoff&Henikoff，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：10915-19；和美国专利第4,554,101号公开的保守性和非保守性氨基酸取代。

例如，使用可购得的标准方法从呼肠孤病毒粒子分离核酸。还参见例如，Schiff等人，“Orthoreoviruses and Their Replication(正呼肠孤病毒和其复制)，”第52章，Fields Virology(费氏病毒学)，Knipe&Howley编辑，2006，Lippincott Williams&Wilkins。本文所用的“分离的”核酸是指与通常伴随它们的其它核酸实质上分开的核酸。因此，“分离的”核酸包括但不限于基本上没有非-呼肠孤病毒(如宿主细胞)核酸的呼肠孤病毒核酸，或基本上没有对应其它基因组区段的核酸的呼肠孤病毒基因组区段。此外，分离的核酸包括工程化核酸诸如重组或合成核酸。

使用本领域已知的任何多种方法在呼肠孤病毒的核酸中产生修饰。例如，位点定向诱变可用于修饰呼肠孤病毒的核酸序列。位点定向诱变的一种最常用方法是针对寡核苷酸的诱变。在针对寡核苷酸的诱变中，将编码序列中期望改变的寡核苷酸退火到目标DNA的一条链，并作为开始DNA合成的引物。以这种方式，将含有序列改变的寡核苷酸并入新合成的链。参见例如，Kunkel，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：488；Kunkel等人，1987，Meth.Enzymol.，154：367；Lewis&Thompson，1990，Nucl.AcidsRes.，18：3439；Bohnsack，1996，Meth.Mol.Biol.，57：1；Deng&Nickoloff，1992，Anal.Biochem.，200：81；和Shimada，1996，Meth.Mol.Biol.，57：157。

本领域中例行使用其它方法来将修饰引入序列。例如，使用PCR或化学合成来产生修饰的核酸，或可化学合成氨基酸序列中具有期望改变的多肽。参见例如，Bang&Kent，2005，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，102：5014-9和其中的参考文献。在呼肠孤病毒通常不在其上生长的细胞类型(如人类细胞)上选择和/或化学诱变(参见例如，Rudd&Lemay，2005，J.Gen.Virology，86：1489-97)也可用于产生呼肠孤病毒的核酸中的修饰。例如，通过在人类细胞(如人类胚胎肾(HEK)293细胞)上培养呼肠孤病毒产生表1中所示的修饰，该细胞在本领域中通常不用于培养呼肠孤病毒。相反，通常用于培养呼肠孤病毒的细胞描述于例如，Tyler，“Mammalian Reoviruses(哺乳动物呼肠孤病毒)，”第53章，第1731-2页，Fields Virology(费氏病毒学)，Knipe&Howley编辑，2006，Lippincott Williams&Wilkins。本文描述的修饰代表呼肠孤病毒对人类细胞的适应。在各个蚀斑纯化步骤还有通过选择最大蚀斑(三重蚀斑纯化)的选择步骤，从而选择这些细胞中的生长或毒力益处。

在已将一种或多种修饰引入呼肠孤病毒核酸或多肽后，使用本领域已知方法重新构成病毒粒子。参见例如，Schiff等人，“Orthoreoviruses andTheir Replication(正呼肠孤病毒和其复制)，”第52章，Fields Virology(费氏病毒学)，Knipe&Howley编辑，2006，Lippincott Williams&Wilkins；Smith等人，1969，Virology，39(4)：791-810；和美国专利第7,186,542；7,049,127；6,808,916和6,528,305号。序列中具有一种或多种修饰的呼肠孤病毒培养于例如小鼠L929细胞或瘤细胞(如MCF7(ATCC登记号HTB-22)、SKBR3(ATCC登记号HTB-30)或MDAMB468(ATCC登记号HTB132)细胞)，并基于任何多种可能指示例如，超过不含有一种或多种修饰的呼肠孤病毒的生长益处的特征来选择。在细胞系(瘤或其它)中培养后和/或感染动物模型系统后选择呼肠孤病毒。

这种特征包括但不限于，溶解率增加；蚀斑形成的大小增加；RNA复制速率提高；RNA转录速率提高；翻译速率提高；病毒组装和/或包装速率提高；病毒后代数目增加；呼肠孤病毒被宿主细胞获取的能力提高；脱被的能力提高或增强；细胞溶解增强或诱导包括凋亡、坏死或自体吞噬的细胞死亡；感染、溶解和杀死人类瘤细胞系的能力增强；哺乳动物细胞中免疫原性降低；对干扰素敏感性的易感性不同；对宿主的毒性降低；药物相互作用增强；放疗相互作用增强；或释放有效肿瘤表位的能力。另外，根据例如溶解地感染具有活性Ras途径的哺乳动物细胞的能力选择具有修饰的序列的呼肠孤病毒。参见例如，美国专利第7,052,832号。

使用本领域已知的任何多种方法获得呼肠孤病毒粒子。例如，将呼肠孤病毒培养于L929小鼠成纤维细胞或人类细胞(如HEK293)，并使用标准方法纯化病毒粒子。参见例如，Schiff等人，“Orthoreoviruses and TheirReplication(正呼肠孤病毒和其复制)，”第52章，Fields Virology(费氏病毒学)，Knipe&Howley编辑，2006，Lippincott Williams&Wilkins；Smith等人，1969，Virology，39(4)：791-810；和美国专利第7,186,542；7,049,127；6,808,916和6,528,305号。本文所用的“纯化的”病毒粒子是指已经实质上从天然伴随其的细胞组分分离的病毒粒子。通常，当至少70％(如至少75％、80％、85％、90％、95％或99％)干重的病毒粒子不含天然伴随该病毒的蛋白和其它细胞组分时，认为病毒粒子是“纯化的”。

具有图1、2和3(SEQ ID NO：1-10)所示的核酸序列和图4、5和6(SEQID NO：11-21)所示的氨基酸序列，并含有表1所示的核苷酸和氨基酸修饰的呼肠孤病毒，在2007年9月19日保藏于加拿大国际保藏管理局(IDAC，加拿大公共卫生部国家微生物学实验室，1015Arlington St.，Winnipeg，Manitoba Canada R3E3R2)，并指定登记号190907-01。该保藏物将根据国际承认用于专利程序目的的微生物保藏布达佩斯条约的条款进行保存。该保藏是示范性的并仅用于方便本领域技术人员，并不承认保藏物是专利性所需的(如根据35U.S.C.§112)。

使用具有修饰的序列的呼肠孤病毒的方法

如以前所述(参见例如，美国专利第6,110,461；6,136,307；6,261,555；6,344,195；6,576,234和6,811,775号)，呼肠孤病毒使用宿主细胞的Ras途径机制来下调双链RNA-活化的蛋白激酶(PKR)并因此在细胞中复制。基于这些发现，已经开发了使用呼肠孤病毒来治疗哺乳动物增生性病症的方法。代表性哺乳动物包括小鼠、犬、猫、绵羊、山羊、牛、马、猪、非-人类灵长类和人类。本文所用的“患者”包括患有增生性病症的任何哺乳动物。

“增生性病症”是任何细胞病症，其中细胞增殖比正常组织生长更快。因此“增殖细胞”是比正常细胞增殖更快的细胞。增生性病症包括但不限于瘤，也称为肿瘤。瘤包括但不限于胰腺癌、乳腺癌、脑癌(如成胶质细胞瘤)、肺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、甲状腺癌、肾癌、肾上腺癌、肝癌、神经纤维瘤病和白血病。瘤包括实体瘤(如肉瘤或癌瘤)或影响造血系统的癌性生长(如淋巴瘤或白血病)。其它增生性病症包括但不限于神经纤维瘤病。

通常，在呼肠孤病毒用作疗法的增生性病症中，至少一些增殖细胞具有突变，其中Ras基因(或Ras信号转导途径的元件)被直接地(如通过活化Ras中的突变)或间接地(如通过活化Ras途径中的上游或下游元件)活化。活化Ras途径中的上游元件包括，例如藉由表皮生长因子受体(EGFR)或Sos的转化。参见例如，Wiessmuller&Wittinghofer，1994，Cellular Signaling，6(3)：247-267；和Barbacid，1987，Ann.Rev.Biochem.，56，779-827。活化Ras途径中的下游元件包括，例如B-Raf内的突变。参见例如，Brose等人，2002，CancerRes.，62：6997-7000。此外，呼肠孤病毒可用于治疗PKR突变或失调引起的增生性病症。参见例如，Strong等人，1998，EMBO J.，17：3351-662。

具有本文公开的修饰的序列的呼肠孤病毒施用于患有增生性病症的哺乳动物。本文所用的施用是指递送呼肠孤病毒以使呼肠孤病毒接触增殖细胞。施用呼肠孤病毒的途径取决于病症类型和增殖细胞的位置。可采用多种施用途径。例如，对于可接近的实体瘤，通过直接注射施用呼肠孤病毒。对于造血的瘤，例如，静脉内或血管内施用呼肠孤病毒。对于某些瘤，如在体内不易接近的瘤诸如转移或脑瘤，呼肠孤病毒以经由哺乳动物身体系统转运从而到达瘤的方式施用(如鞘内、静脉内、肌内、皮下或腹膜内)。还区域地施用呼肠孤病毒，包括例如，局部地(如对于黑素瘤)、口地(如对于口瘤或食管瘤)、直肠地(如对于结肠直肠瘤)、阴道地(如对于子宫颈或阴道瘤)、鼻地或通过吸入(如对于肺瘤)。任选地由多于一种途径施用呼肠孤病毒和/或施用呼肠孤病毒到个体中多于一处位置。

靶向施用可用于施用呼肠孤病毒。例如，可向受治疗者施用含有呼肠孤病毒的树突细胞。参见例如，美国专利公布第2008/0014183号。在靶向递送的另一实例中，递送细胞可用于靶向增生性病症的细胞并防止免疫识别它们所携带的呼肠孤病毒。参见例如，Qiao等人，2008，Nature Med.，14：37-44；和WO2008/009115。

具有本文公开的修饰的序列的呼肠孤病毒以足以治疗增生性病症的量施用(如“有效量”)。当与不存在治疗的症状或临床体征相比，向增殖细胞施用具有修饰的序列的呼肠孤病毒影响增生性病症的一种或多种症状或临床体征时，认为“治疗”了该病症，所述症状或临床体征包括如细胞溶解(如“溶瘤作用”)增加、增殖细胞数目减少、瘤大小减小或进展减少、瘤相关的疼痛减少。本文所用的术语“溶瘤作用”是指溶解至少10％的增殖细胞(如溶解至少20％、30％、40％、50％或75％的细胞)。可确定溶解百分比，例如，通过测量哺乳动物中瘤大小的减小或增殖细胞数目的减少，或通过体外测量溶解的细胞的量(如根据增殖细胞的活组织检查)。

在个体基础上确定具有修饰的序列的呼肠孤病毒的有效量，至少部分地基于所用的具体呼肠孤病毒；个体的尺寸、年龄、性别；和增殖细胞的大小和其它特征。例如，对于治疗人类，使用大约10³至10¹²个蚀斑形成单位(PFU)的呼肠孤病毒，这取决于增殖细胞或存在的瘤的类型、大小和数目。有效量可为从约1.0PFU/kg体重至约10¹⁵PFU/kg体重(如从约10²PFU/kg体重至约10¹³PFU/kg体重)。以单剂量或多剂量(如二、三、四、六或更多剂量)施用呼肠孤病毒。同时或连续地(如经过数天或数周时间)施用多剂量。具有修饰的序列的呼肠孤病毒的治疗持续数天至数月，或直到实现减少疾病。

预期具有本文公开的修饰的序列的呼肠孤病毒任选地联合手术或除去增殖细胞(如瘤)施用。还预期具有修饰的序列的呼肠孤病毒任选地联合放疗施用或除放疗以外施用。进一步预期具有修饰的序列的呼肠孤病毒任选地联合已知抗癌化合物、化疗剂和/或免疫抑制剂施用或除已知抗癌化合物、化疗剂和/或免疫抑制剂以外施用。这种剂包括但不限于5-氟尿嘧啶、丝裂霉素C、甲氨蝶呤、羟基脲、吉西他滨、环磷酰胺、达卡巴嗪、米托蒽醌、蒽环类(表柔比星、伊立替康和多柔比星(Doxurubicin))；针对受体的抗体诸如赫赛汀、拓扑异构酶抑制剂诸如依托泊苷或喜树碱、pregnasome、铂化合物诸如碳铂和顺铂、紫杉烷类诸如紫杉醇(taxol)和多西紫杉醇(taxotere)、激素治疗剂诸如他莫昔芬和抗雌激素、白介素、干扰素、芳香酶抑制剂、促孕剂、LHRH类似物、mTOR抑制剂(如雷帕霉素和其衍生物；参见例如，Homicsko等人，2005，CancerRes.，65：6882-90；和Rao等人，2004，Curr.Cancer Drug Targets，4：621-35)和其组合。

进一步预期具有修饰的序列的呼肠孤病毒联合可增加内皮通透性和/或减少间质液压的剂施用。这种剂包括例如TNF-α。参见例如，Sacchi等人，2006，Clin.Cancer Res.，12：175-182。预期具有修饰的序列的呼肠孤病毒可联合本文描述的疗法和剂的任何组合施用。

药物组合物

提供包括一种或多种呼肠孤病毒的药物组合物，其中至少一种呼肠孤病毒具有如本文描述的修饰的序列。参见例如，美国专利第6,576,234号。除了其中至少一种具有修饰的序列的一种或多种呼肠孤病毒，药物组合物通常包括药学上可接受的载体。药学上可接受的载体包括作为呼肠孤病毒的运载体、载体或介质的固态、半固态或液态材料。因此，例如，含有具有修饰的序列的呼肠孤病毒的组合物为以下形式：片剂、丸剂、粉末剂、锭剂、囊剂、扁囊剂、酏剂、悬浮剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、气溶胶(作为固体或在液态介质中)、含有例如达10％的重量的活性化合物的软膏剂、软和硬明胶胶囊、栓剂、无菌注射溶液和无菌包装粉末。

适合载体的一些实例包括磷酸盐缓冲盐水或另一种生理上可接受的缓冲剂、乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、黄芪胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、无菌水、糖浆和甲基纤维素。药物组合物另外可包括但不限于，润滑剂诸如滑石、硬脂酸镁和矿物油；润湿剂；乳化剂和悬浮剂；防腐剂诸如苯甲酸甲酯和苯甲酸丙基羟基酯；甜味剂和调味剂。本发明的药物组合物可配制为在通过采用本领域已知程序施用后，提供具有修饰的序列的呼肠孤病毒的快速、持续或延迟的释放。除了下述的代表性制剂，用于药物组合物的其它适合制剂见于Remington：The Science and Practice ofPharmacy(雷氏药学理论和实践)(2003，Gennaro&Gennaro编辑，LippincottWilliams&Wilkens)。

对于制备固态组合物诸如片剂，将具有修饰的序列的呼肠孤病毒与药物载体混合以形成固态组合物。任选地，片剂或丸剂被包衣或以其它方式复合以提供给予延长作用的益处的剂型。例如，片剂或丸剂包括内剂量组分和外剂量组分，后者为包封前者的形式。这两种组分，例如，被肠衣层分开，肠衣层用于抵抗胃中的崩解并允许内组分完整地进入十二指肠或延迟释放。多种材料用于这种肠衣层或包衣，这种材料包括多种聚合物酸(polymeric acid)和聚合物酸与诸如虫胶、十六醇和醋酸纤维素等材料的混合物。

用于口服施用或用于注射的包括具有修饰的序列的呼肠孤病毒的液态制剂通常包括水性溶液、适当调味的糖浆剂、水性或油性悬浮液和带有可食用油诸如玉米油、棉籽油、芝麻油、椰子油或花生油的调味乳剂、以及酏剂和类似药物运载体。

用于吸入或吹入的组合物包括药学上可接受的水性溶剂或有机溶剂或其混合物中的溶液和悬浮液，和粉末。这些液态或固态组合物任选地包含如本文所述的合适的药学上可接受的赋形剂。为了区域或系统作用，这种组合物例如通过口或鼻呼吸途径施用。药学上可接受的溶剂中的组合物通过使用惰性气体雾化。例如直接从雾化装置、从附带的面罩幕(face masktent)、或从间歇性正压呼吸机吸入雾化溶液。例如，从以合适方式递送制剂的装置口地或鼻地施用溶液、悬浮液或粉末组合物。

用于本文教导方法的另一种制剂采用经皮递送装置(“贴片”)。这种经皮贴片用于提供连续或不连续的具有修饰的序列的呼肠孤病毒的输入。根据本领域已知方法进行递送药物剂的经皮贴片的构造和使用。参见例如，美国专利第5,023,252号。这种贴片构造为连续、脉动性或按需地递送具有修饰的序列的呼肠孤病毒。

在施用之前(如在包含到药物组合物中之前)，具有修饰的序列的呼肠孤病毒任选地被化学或生物化学预处理(如由蛋白酶诸如糜蛋白酶或胰蛋白酶处理)。蛋白酶预处理除去病毒的外部包被或衣壳并可用于增加病毒感染性。另外或替代性地，将具有修饰的序列的呼肠孤病毒包被在脂质体或胶束中以减少或防止在对呼肠孤病毒有建成的免疫的哺乳动物中的免疫应答。这种呼肠孤病毒称为“免疫保护的呼肠孤病毒”。参见例如，美国专利第6,565,831和7,014,847号。

具有修饰的序列的呼肠孤病毒或包含这种呼肠孤病毒的药物组合物可包装到药盒中。预期任选地包含一种或多种化疗剂和/或免疫抑制剂(如抗-抗呼肠孤病毒抗体)的药盒。药物组合物，例如配制为单位剂型。术语“单位剂型”是指适合作为用于人类受治疗者和其它哺乳动物的单一剂量的物理上离散的单位，各单位含有预先确定量的具有修饰的序列的呼肠孤病毒连同适合的药学上可接受的载体，该量是计算以产生期望治疗效果的量。

根据本发明，可采用本领域技术人员能力范围内的常规分子生物学、微生物学、生物化学和重组DNA技术。这种技术在文献中充分阐释。在以下实施例进一步描述本发明，以下实施例不限制本发明范围，本发明范围描述于权利要求书。

实施例

实施例1-测序和分析

从适应悬浮的HEK293S Master Cell Bank(MCB)开始用于产生呼肠孤病毒的培养。HEK293细胞维持在补充L-谷氨酰胺的无血清培养基(HEK293SFM II)中。扩增(expand)HEK293细胞并接种到三个15L转瓶(spinnerflask)，进一步扩增直到三个瓶中各有12L。呼肠孤病毒感染HEK293细胞通过直接接种病毒到细胞培养物中而进行。当HEK293S细胞的存活力在感染后降低20-50％时收获病毒。将来自所有三个转瓶的病毒物质汇集到单个无菌容器中并搅动以产生均匀混合物。移出三升汇集的细胞悬浮液，转移到锥形管，并在～3000rpm离心15分钟。随后以100mL澄清条件培养基重悬细胞，在醇-干冰浴中快速冷冻三次，并随后装入无菌带标签的冷冻管以用作接种母液(seed stock)。

通过进行三次蚀斑纯化制备病毒母液。将粘附的HEK293S细胞铺板到6-孔组织培养板上，以上述接种母液感染，并挑出两个最大蚀斑。分别扩增这两个蚀斑并收获，再次挑出两个最大蚀斑。再次重复该程序，共三次。两个蚀斑中的一个选为接种母液用于随后的扩增。

从上述的相同的适应悬浮的HEK293S MCB开始培养并维持在补充L-谷氨酰胺的相同HEK293无血清培养基(HEK293SFM II)中。细胞从方瓶扩增到多个3L转瓶中。通过首先在HEK293SFM培养基稀释蚀斑-纯化的病毒并随后加入8至12mL的稀释病毒到细胞培养物中而进行感染。当HEK293S细胞的存活力在感染后降低20-50％时收获病毒，并且显微镜检查每个转瓶证实不存在微生物污染且细胞中存在细胞病变效应(CPE)。细胞具有肿胀和粒状外观指示CPE。将来自转瓶的物质汇集到单个无菌容器中并搅动以产生均匀混合物，移出大量收集样品。将剩余的汇集的细胞悬浮液转移到锥形管，并在～3000rpm离心15分钟。随后以400mL澄清条件培养基重悬细胞，在醇-干冰浴中快速冷冻浓的细胞悬浮液三次以溶解细胞，并随后装入无菌带标签的冷冻管以用于测序反应。

从两个方向对两条RNA链测序，并从重叠毗连序列群(overlappingcontig)组装各10个基因组区段的序列。各基因组区段的组装序列用于BLAST搜索NCBI数据库(万维网上ncbi.nlm.nih.gov)。检查与见于NCBI数据库的三种或四种不同呼肠孤病毒序列的比对且将具有最高量同源性的比对用于进一步分析。与其它报道序列比较的多态性或修饰示于表1。对所选呼肠孤病毒毒株独特的那些修饰在表1中标以星号。

表1.鉴定的修饰

*表示独特修饰；斜体残基表示沉默修饰；位置号是相对于所示的GenBank登记号

应理解的是，尽管已经结合其详细的说明书描述了本发明，但是如上的说明书意为阐释而不是限制本发明范围，本发明由所附权利要求书的范围限定。其它方面、益处和修饰在如下权利要求书的范围内。

公开了这样的材料、组合物和组分——其可用于公开的方法和组合物，可联合公开的方法和组合物使用，可用于制备公开的组合物，或是公开的方法和组合物的产物。本文公开了这些和其它材料，应理解当公开这些材料的组合、子集、相互作用、组等时，尽管可能没有明确地公开所具体提到的这些化合物中的每一种不同的个体和集合的组合和排列，但是本文具体地预期和描述了每一个。例如，如果公开和讨论了呼肠孤病毒的具体修饰或治疗方案，且讨论了可对呼肠孤病毒或治疗方案进行多种修饰，那么除非明确地另外指出，否则明确地包含呼肠孤病毒和治疗方案的每种和所有组合和排列。类似地，还明确地包含和公开这些的任何子集或组合。

Claims

1. 一种包含具有一种或多种氨基酸修饰的λ-3多肽的呼肠孤病毒，其中所述一种或多种氨基酸修饰选自相对于GenBank登记号M24734.1编号的残基214处的Val、残基267处的Ala、残基557处的Thr、残基755处的Lys、残基756处的Met、残基926处的Pro、残基963处的Pro、残基979处的Leu、残基1045处的Arg、残基1071处的Val或其任何组合所组成的组，其中当所述氨基酸序列包括残基214处的Val或残基1071处的Val时，所述氨基酸序列进一步包括在所述氨基酸序列中的至少一种另外的修饰。

2. 根据权利要求1所述的呼肠孤病毒，其中所述λ-3多肽包括SEQ ID NO：19。

3. 一种包含具有一种或多种氨基酸修饰的σ-3多肽的呼肠孤病毒，其中所述一种或多种氨基酸修饰选自相对于GenBank登记号K02739编号的残基14处的Leu、残基198处的Lys或其任何组合所组成的组，其中当所述氨基酸序列包括残基14处的Leu时，所述氨基酸序列进一步包括在所述氨基酸序列中的至少一种另外的修饰。

4. 根据权利要求3所述的呼肠孤病毒，其中所述σ-3多肽包括SEQ ID NO：15。

5. 一种包含具有至少一种氨基酸修饰的μ-1多肽的呼肠孤病毒，其中所述至少一种氨基酸修饰包括相对于GenBank登记号M20161.1编号的残基73处的Asp。

6. 根据权利要求5所述的呼肠孤病毒，其中所述μ-1多肽包括SEQ ID NO：17。

7. 一种包含具有至少一种氨基酸修饰的μ-2多肽的呼肠孤病毒，其中所述至少一种氨基酸修饰包括相对于GenBank登记号AF461684.1编号的残基528处的Ser。

8. 根据权利要求7所述的呼肠孤病毒，其中所述μ-2多肽包括SEQ ID NO：16。

9. 根据权利要求1、3、5或7所述的呼肠孤病毒，其中所述呼肠孤病毒进一步包括呼肠孤病毒σ-2多肽。

10. 根据权利要求9所述的呼肠孤病毒，其中所述σ-2多肽包括在相对于SEQ ID NO：30 (GenBank登记号NP_694684.1)编号的位置70、127、195、241、255、294、296或340中的一个或多个位置处的Cys。

11. 根据权利要求10所述的呼肠孤病毒，其中所述σ-2多肽包括SEQ ID NO：12。

12. 根据权利要求1-11中任一项所述的呼肠孤病毒，其中所述呼肠孤病毒是重配株。

13. 一种包含具有一种或多种核酸修饰的L1基因组区段的呼肠孤病毒，其中所述一种或多种核酸修饰选自相对于SEQ ID NO：22 (GenBank登记号M24734.1)编号的位置660处的T、位置817处的G、位置1687处的A、位置2283处的G、位置2284-2286处的ATG、位置2794处的C、位置2905处的C、位置2953处的C、位置3153处的A、位置3231处的G所组成的组。

14. 根据权利要求13所述的呼肠孤病毒，其中所述L1基因组区段包括SEQ ID NO：8。

15. 一种包含具有一种或多种核酸修饰的S4基因组区段的呼肠孤病毒，其中所述S4基因组区段中的所述一种或多种核酸修饰选自相对于SEQ ID NO：24 (GenBank登记号K02739)编号的位置74处的A和位置624处的A所组成的组。

16. 根据权利要求15所述的呼肠孤病毒，其中所述S4基因组区段包括SEQ ID NO：4。

17. 一种包含具有至少一种核酸修饰的M2基因组区段的呼肠孤病毒，其中所述至少一种核酸修饰包括相对于(SEQ ID NO：26 (GenBank登记号M20161.1)编号的位置248处的C。

18. 根据权利要求17所述的呼肠孤病毒，其中所述M2基因组区段包括SEQ ID NO：6。

19. 一种包含具有至少一种核酸修饰的M1基因组区段的呼肠孤病毒，其中所述至少一种核酸修饰包括相对于SEQ ID NO：28 (GenBank登记号AF461684.1)编号的位置1595处的T。

20. 根据权利要求19所述的呼肠孤病毒，其中所述M1基因组区段包括SEQ ID NO：5。

21. 根据权利要求13-20中任一项所述的呼肠孤病毒，其中所述呼肠孤病毒是重配株。

22. 一种包含呼肠孤病毒λ-3多肽的氨基酸序列的多肽，其中所述呼肠孤病毒λ-3多肽的序列包括一种或多种氨基酸修饰，其中所述一种或多种氨基酸修饰选自相对于GenBank登记号M24734.1编号的残基214处的Val、残基267处的Ala、残基557处的Thr、残基755处的Lys、残基756处的Met、残基926处的Pro、残基963处的Pro、残基979处的Leu、残基1045处的Arg、残基1071处的Val或其任何组合所组成的组，其中当所述氨基酸序列包括残基214处的Val或残基1071处的Val时，所述氨基酸序列进一步包括在所述氨基酸序列中的至少一种另外的改变。

23. 根据权利要求22所述的多肽，其中所述λ-3多肽包括SEQ ID NO：19。

24. 一种包含呼肠孤病毒σ-3多肽的氨基酸序列的多肽，其中所述呼肠孤病毒σ-3多肽的序列包括一种或多种氨基酸修饰，其中所述一种或多种氨基酸修饰选自相对于GenBank登记号K02739编号的残基14处的Leu、残基198处的Lys或其任何组合所组成的组，其中当所述氨基酸序列包括残基14处的Leu时，所述氨基酸序列进一步包括在所述氨基酸序列中的至少一种另外的改变。

25. 根据权利要求24所述的多肽，其中所述σ-3多肽包括SEQ ID NO：15。

26. 一种包含呼肠孤病毒μ-1多肽的氨基酸序列的多肽，其中所述呼肠孤病毒μ-1多肽的序列包括至少一种氨基酸修饰，其中所述至少一种氨基酸修饰包括相对于GenBank登记号M20161.1编号的残基73处的Asp。

27. 根据权利要求26所述的多肽，其中所述μ-1多肽包括SEQ ID NO：17。

28. 一种包含呼肠孤病毒μ-2多肽的氨基酸序列的多肽，其中所述呼肠孤病毒μ-2多肽的序列包括至少一种氨基酸修饰，其中所述至少一种氨基酸修饰包括相对于GenBank登记号AF461684.1编号的残基528处的Ser。

29. 根据权利要求28所述的多肽，其中所述μ-2多肽包括SEQ ID NO：16。

30. 一种呼肠孤病毒，其包含权利要求22-29所述的多肽中的一种或多种。

31. 根据权利要求30所述的呼肠孤病毒，其中所述呼肠孤病毒进一步包括σ-2多肽，所述σ-2多肽包含在相对于GenBank登记号NP_694684.1编号的位置70、127、195、241、255、294、296或340中的一个或多个位置处的Cys。

32. 根据权利要求31所述的呼肠孤病毒，其中所述σ-2多肽包括SEQ ID NO：12。

33. 根据权利要求30-32中任一项所述的呼肠孤病毒，其中所述呼肠孤病毒是重配株。

34. 一种包含呼肠孤病毒L1基因组区段的核酸序列的核酸分子，其中所述呼肠孤病毒L1基因组区段的所述核酸序列包括一种或多种核酸修饰，其中所述一种或多种核酸修饰选自相对于GenBank登记号M24734.1编号的位置660处的T、位置817处的G、位置1687处的A、位置2283处的G、位置2284-2286处的ATG、位置2794处的C、位置2905处的C、位置2953处的C、位置3153处的A、位置3231处的G所组成的组。

35. 根据权利要求34所述的核酸分子，其中所述L1基因组区段包括SEQ ID NO：8。

36. 一种包含呼肠孤病毒S4基因组区段的核酸序列的核酸分子，其中所述呼肠孤病毒S4基因组区段的所述核酸序列包括一种或多种核酸修饰，其中所述一种或多种核酸修饰选自相对于SEQ ID NO：24 (GenBank登记号K02739)编号的位置74处的A和位置624处的A所组成的组。

37. 根据权利要求36所述的核酸分子，其中所述S4基因组区段包括SEQ ID NO：4。

38. 一种包含呼肠孤病毒M1基因组区段的核酸序列的核酸分子，其中所述呼肠孤病毒M1基因组区段的所述核酸序列包括至少一种核酸修饰，其中所述至少一种核酸修饰包括相对于SEQ ID NO：26 (GenBank登记号AF461684.1)编号的位置1595处的T。

39. 根据权利要求38所述的核酸分子，其中所述M1基因组区段包括SEQ ID NO：5。

40. 一种包含呼肠孤病毒M2基因组区段的核酸序列的核酸分子，其中所述呼肠孤病毒M2基因组区段的所述核酸序列包括至少一种核酸修饰，其中所述至少一种核酸修饰包括相对于SEQ ID NO：28 (GenBank登记号M20161.1)编号的位置248处的C。

41. 根据权利要求40所述的核酸，其中所述M2基因组区段包括SEQ ID NO：6。

42. 一种呼肠孤病毒，其包含权利要求34-41所述的核酸分子中的一种或多种。

43. 根据权利要求42所述的呼肠孤病毒，其中所述呼肠孤病毒是重配株。

44. 一种呼肠孤病毒，其中所述呼肠孤病毒包括具有如SEQ ID NO：1-10所列的序列的基因组区段。

45. 一种呼肠孤病毒，其中所述呼肠孤病毒包括如SEQ ID NO：11、12和16-21所列的多肽以及SEQ ID NO：13或14中至少一个所列的多肽。

46. 根据权利要求44或45所述的呼肠孤病毒，其具有IDAC登记号190907-01。

47. 根据权利要求1-21、30-33、42-46中任一项所述的呼肠孤病毒，其中所述呼肠孤病毒表现出超过不包含修饰的呼肠孤病毒的生长益处。

48. 根据权利要求47所述的呼肠孤病毒，其中所述生长益处选自以下所组成的组：溶解率增加；蚀斑形成的大小增加；RNA复制速率提高；RNA转录速率提高；翻译速率提高；病毒组装和/或包装速率提高；病毒后代数目增加；呼肠孤病毒被宿主细胞获取的能力提高；脱被的能力提高或增强；细胞溶解增强或诱导包括凋亡、坏死或自体吞噬的细胞死亡；感染、溶解和杀死人类瘤细胞系的能力增强；哺乳动物细胞中免疫原性降低；对干扰素敏感性的易感性不同；对宿主的毒性降低；药物相互作用增强；放疗相互作用增强；或释放有效肿瘤表位的能力。

49. 一种药物组合物，其包含权利要求1-21、30-33或42-48中任一项所述的呼肠孤病毒和药学上可接受的载体。

50. 根据权利要求49所述的药物组合物，其进一步包含一种或多种化疗剂和/或一种或多种免疫抑制剂。

51. 一种制备改良的呼肠孤病毒的方法，其包括如下步骤：

修饰所述呼肠孤病毒的核酸序列，和

选择一种或多种改良的呼肠孤病毒。

52. 根据权利要求51所述的方法，其中所述修饰包括诱变所述呼肠孤病毒。

53. 根据权利要求52所述的方法，其中所述诱变包括位点定向诱变。

54. 根据权利要求52所述的方法，其中所述诱变包括化学诱变。

55. 根据权利要求51所述的方法，其中所述修饰包括在人类细胞系中培养所述呼肠孤病毒。

56. 根据权利要求51所述的方法，其中所述改良的呼肠孤病毒根据以下选择：溶解率增加；蚀斑形成的大小增加；RNA复制速率提高；RNA转录速率提高；翻译速率提高；病毒组装和/或包装速率提高；病毒后代数目增加；呼肠孤病毒被宿主细胞获取的能力提高；脱被的能力提高或增强；细胞溶解增强或诱导包括凋亡、坏死或自体吞噬的细胞死亡；感染、溶解和杀死人类瘤细胞系的能力增强；哺乳动物细胞中免疫原性降低；对干扰素敏感性的易感性不同；对宿主的毒性降低；药物相互作用增强；放疗相互作用增强；或释放有效肿瘤表位的能力。

57. 一种治疗患者增生性病症的方法，其包括：

向所述患者施用权利要求1-21、30-33或42-48中任一项所述的呼肠孤病毒或权利要求49或50所述的药物组合物。

58. 根据权利要求57所述的方法，其中所述呼肠孤病毒以有效导致溶瘤作用的量施用。

59. 根据权利要求57所述的方法，其进一步包括至少一种选自手术、化疗、放疗和免疫抑制疗法所组成的组的程序。

60. 根据权利要求57所述的方法，其中所述呼肠孤病毒或药物组合物施用多于一次。

61. 根据权利要求57所述的方法，其中所述呼肠孤病毒或药物组合物静脉内、血管内、鞘内、肌内、皮下、腹膜内、局部地、口服地、直肠地、阴道地、鼻地、通过直接注射或通过吸入而施用。

62. 一种药盒，其包含权利要求1-21、30-33或42-48中任一项所述的呼肠孤病毒。

63. 根据权利要求62所述的药盒，其进一步包含一种或多种剂。