CN113144213B - 一种多级pH响应基因-药物共递送的纳米药物、制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种多级pH响应基因‑药物共递送的纳米药物、制备方法及其应用。本发明的多级pH响应基因‑药物共递送的纳米药物包括羧甲基壳聚糖、小干扰RNA、索拉菲尼和聚(β‑氨基酯)‑聚乙二醇。本发明公开内容包括pH响应Carboxymethylchitosan@siRNA&Sorafenib@PAE‑PEG(CC@SR&SF@PP)基因‑药物纳米共递送系统的构建方法；纳米共递送体系各个组分的配比优化；纳米共递送体系的表征；纳米共递送体系中小分子药物的体外缓释；纳米共递送体系体外对肿瘤细胞的抑制作用；纳米共递送体系的活体安全性评估以及纳米共递送体系的动物体内抗肿瘤效果。本发明的有益效果是实现了小干扰RNA和小分子药物在肿瘤酸性组织中的多级响应释放和靶向释放，增加两者递送效率的同时，减弱其对正常组织器官的毒副作用,同时，在细胞水平和动物水平高效抑制肿瘤生长。

Description

一种多级pH响应基因-药物共递送的纳米药物、制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种纳米药物，尤其涉及一种多级pH响应基因-药物共递送的 纳米药物、制备方法及在肝癌中的应用。
背景技术
肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是临床上最常见的恶性肿瘤 之一，是目前全球第三大最致命的癌症。临床上，手术切除术、肝移植及热消 融被认为是治疗早期HCC的有效方案。但是，由于HCC发病隐匿，多数患者被 确诊时已处于病程的中晚期，从而错过了手术治疗的最佳时期。因此，化学治 疗是大多数HCC患者的首选治疗方案。在过去的几十年中，传统的化疗方法虽 然可以在一定程度上杀死肿瘤细胞，却并没有显著延长HCC患者的总体生存期， 反而给患者带来更多的负面作用，其主要原因归结为：(1)大多数化疗药物肿瘤选择性差，存在急性(短期)毒性和慢性(长期)毒性；(2)化疗药物在体 内循环时间短、代谢过快、药物有效浓度维持时间短；(3)HCC对多数化疗药 物具有天然的或获得性的耐药性。与此同时，全球每年有数十万人死于HCC， 且在过去的十年中一直呈增长趋势。因此探索新的治疗HCC的有效方法和策略是目前亟需解决的重大难题之一。
肝细胞癌的发生和转移是一个多基因相关、多因素、多步骤的反应过程。 基因治疗有可能取得良好的治疗效果。T细胞免疫球蛋白和粘蛋白域3(T cell immunoglobulinand mucin domain 3,Tim-3)是一种免疫检查点分子，在HCC 的发生发展中起着至关重要的作用。研究表明，与癌旁组织和正常肝细胞相比，Tim-3在HCC肿瘤组织和细胞系中均过表达，提示Tim-3与HCC的发生有关。 肝癌细胞上的Tim-3也可通过IL-6通路促进肝癌的增殖、迁移和侵袭。在临床 前研究中，靶向Tim-3显示了抗肿瘤的有效性。同时，临床研究也表明，Tim-3 在HCC患者的肿瘤组织中高表达往往提示预后不良。这表明抑制Tim-3的表达 可能是肝癌治疗的新策略。然而，单基因治疗由于靶向性差、特异性差、转染 效率低、缺乏治疗效果等原因，存在局限性。更重要的是，常用的腺病毒和慢 病毒基因载体的潜在毒性可能触发宿主的免疫应答，加速宿主对载体的清除， 这是其临床应用的关键障碍。越来越多的研究证明，基因治疗与化疗联合治疗对HCC具有协同治疗效果，有望成为一种强大的临床应用治疗方法。因此，探 索新的基因和药物传递载体，确保安全性，提高靶向性和传递效率显得尤为重 要。
在HCC的临床治疗中，索拉菲尼(Sorafenib,SF)是唯一被美国FDA(U.S. FoodandDrug Administration,FDA)批准的广泛用于晚期肝细胞癌的多靶向 性药物。不幸的是，在临床III期随机、双盲和安慰剂对照实验中，索拉菲尼 只对大约30％的HCC患者呈现出较好的肿瘤抑制效果，单纯的索拉非尼治疗并 未显著提高患者的总体存活率和生存期。此外，在临床应用中，索拉菲尼还受到水溶性差、代谢快、生物利用率低、副作用强等缺点的限制。因此，寻找一 种新的治疗方案，减小索拉菲尼副作用的同时提高其在体内的递送效率、延长 作用时间等是非常迫切的。
发明内容
为解决背景技术中存在的上述问题，本发明提供了一种多级pH响应基因- 药物共递送的纳米药物、制备方法及在肝癌中的应用。
本发明的技术解决方案是：本发明为一种多级pH响应基因-药物共递送的 纳米药物，其特殊之处在于：所述纳米药物包括羧甲基壳聚糖、小干扰RNA、 靶向药物和聚(β-氨基酯)-聚乙二醇。
进一步的，纳米药物的质量百分比配比为羧甲基壳聚糖1-3份、小干扰 RNA1-3份、靶向药物3-15份和聚(β-氨基酯)-聚乙二醇30-140份。
进一步的，纳米药物的质量百分比配比为羧甲基壳聚糖1份、小干扰RNA1 份、靶向药物4份和聚(β-氨基酯)-聚乙二醇40份。
进一步的，靶向药物为索拉菲尼。
一种制备上述的多级pH响应基因-药物共递送的纳米药物的方法，其特殊 之处在于：该方法包括以下步骤：
1)将索拉菲尼包裹到聚(β-氨基酯)-聚乙二醇(PAE-PEG)的聚合物微球 中；
2)聚(β-氨基酯)-聚乙二醇(PAE-PEG)的聚合物微球的外层静电作用吸 附抑制促癌Tim-3蛋白表达的小干扰RNA；
3)再将具备生物相容性的酸响应聚合物羧甲基壳聚糖以静电作用吸附到小 干扰RNA表面。
一种上述的多级pH响应基因-药物共递送的纳米药物在肝癌中的应用。
本发明成功构建了肿瘤酸性微环境响应基因/药物聚合物纳米载体：Carboxymethylchitosan@siRNA&Sorafenib@PAE-PEG(CC@SR&SF@PP)，将靶向药 物索拉菲尼(Sorafenib)包裹到聚(β-氨基酯)-聚乙二醇(PAE-PEG)聚合物 微球中，外层静电作用吸附抑制促癌Tim-3蛋白表达的小干扰RNA(siRNA)， 再将具备生物相容性的酸响应聚合物羧甲基壳聚糖(Carboxymethylchitosan) 以静电作用吸附到siRNA表面以保护siRNA，同时减少纳米颗粒本身的阳离子 毒性。对构成载体的各个元素之间的比例进行了优化，最终得出CC:SR:SF: PP＝1:1:4:40的最优投料比例。最终材料的粒径为50.49±5.34nm，zeta 电位为-3.39±0.13mV。同时，对该载体的各项性能包括：形貌、粒径、紫外 可见吸收性能及体外缓释性能等加以表征。
本发明的有益效果在于实现了小干扰RNA和小分子药物在肿瘤酸性组织中 的多级响应释放和靶向释放，增加两者递送效率的同时，延长其在或体内的作 用时间，减弱其对正常组织器官的毒副作用。同时，在细胞水平和动物水平高 效抑制肿瘤生长。
附图说明
图1为SF@PP NPs的TEM图片，粒径：46.58±4.37nm；
图2为索拉菲尼和siRNA，siRNA和CMCS的质量比优化实验；
图3为CC@SR&SF@PP的TEM图片，粒径：50.49±5.34nm；
图4为CC@SR&SF@PP、SF@PP、siRNA以及CMCS的紫外可见吸收光谱；
图5为CC@SR&SF@PP基因-药物纳米共递送体系合成过程中的动态光散射 粒径及zeta电位变化情况；
图6为分散在无DNA/RNA酶无菌水中的CC@SR&SF@PP基因-药物纳米共递送 体系在0天和30天时的动态光散射粒径分布情况；
图7为CMCS@SR&SF@PP基因-药物纳米共递送体系在pH7.4和5.5的PBS 中的药物缓释性能研究；
图8为不同组别材料体外杀伤H22细胞的能力研究；
图9为Bel-7404细胞分别采用CC@SR&SF@PP NPs和siRNA，以及lipo2000 进行转染的转染效果对比图；
图10为CC@SR&SF@PP基因-药物纳米共递送体系可以显著抑制H22细胞中 Tim-3的蛋白表达；
图11为PBS和CC@SR&SF@PP基因-药物纳米共递送体系处理后不同时间点 小鼠主要器官的HE染色分析；
图12为不同组别材料对荷H22细胞原位肝癌小鼠的肝癌抑制能力。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述：
本发明的多级pH响应基因-药物共递送的纳米药物，包括羧甲基壳聚糖、 小干扰RNA、索拉菲尼和聚(β-氨基酯)-聚乙二醇。
其中，羧甲基壳聚糖、小干扰RNA、索拉菲尼和聚(β-氨基酯)-聚乙二醇 的最佳配比为1:1:4:40。
本发明还提供了一种多级pH响应基因-药物共递送的纳米药物的制备方 法，该方法包括以下步骤：
1)将索拉菲尼包裹到聚(β-氨基酯)-聚乙二醇(PAE-PEG)的聚合物微球 中；
2)聚(β-氨基酯)-聚乙二醇(PAE-PEG)的聚合物微球的外层静电作用吸 附抑制促癌Tim-3蛋白表达的小干扰RNA；
3)再将具备生物相容性的酸响应聚合物羧甲基壳聚糖以静电作用吸附到小 干扰RNA表面。
本发明还提供了一种多级pH响应基因-药物共递送的纳米药物在肝癌中的 应用。
参见图1，SF@PP NPs的TEM图片如图所示，粒径：46.58±4.37nm。
参见图2，我们对载入索拉菲尼和siRNA的比例进行了研究，将SF@PP载 药纳米颗粒与不用质量的siRNA反应，通过测试琼脂糖电泳以及反应后 SR&SF@PP NPs的粒径及zeta电位的变化情况，最终确定索拉菲尼和siRNA的 质量比为4:1。此外，我们也对CMCS的反应量进行了优化，最终确定当CMCS 与siRNA的质量比为1:1时，最终得到的CC@SR&SF@PP基因/药物共载纳米颗粒 的zeta电位最接近中性，为3.39±0.13mV。可以更好的避免阳离子造成的毒 性，最终确定CC:SR:SF:PP＝1:1:4:40的最优投料比例。并且，可以看出，不管在任何CMCS比例下，原始聚集到的SF@PP NPs上的siRNA均未 再解离出来，说明SR&SF@PP NPs的稳定性也非常好。
我们也对构建好的CC@SR&SF@PP基因/药物共载纳米颗粒进行了各种表征，
参见图3，CC@SR&SF@PP的TEM图片如图所示，粒径：50.49±5.34nm。
参见图4，从图中可以看出索拉菲尼和siRNA的成功共载。
参见图5，CC@SR&SF@PP共载纳米颗粒合成过程中的动态光散射粒径及zeta 电位变化情况。
此外，我们也对CC@SR&SF@PP基因/药物共载纳米颗粒的稳定性进行了表 征，将材料分散在无DNA/RNA酶无菌水中，分别在0天和30天测定材料的动态 光散射粒径分布，参见图6，两个时间点材料的粒径分布没有明显改变，说明 该纳米颗粒的稳定性非常好。
此外，我们也对索拉菲尼从CMCS@SR&SF@PP NPs中的释放过程进行了研究。 参见图7，在37℃,pH为7.4和5.5的PBS中研究索拉非尼从CMCS@SR和SF@PP NPs的释放。将1mLCMCS@SR&SF@PP NPs溶液转移到截止MW为8-14kDa的透 析袋中。用棉线捆扎透析袋，置于13mLpH7.4或5.5的PBS中，37℃下，150 rpm振荡。在规定的时间间隔(0、0.5、1、1.5、2、3、5、7、17、24、41、48、65、72h)吸取500μL溶液进行HPLC分析，同时补充等体积的相应的新鲜PBS。结果如图7所示。可以看出在不管是pH7.4还是5.5，初始时索拉菲尼有一个 突然释放的现象，但是随着孵育时间的增加，pH5.5溶液中的索拉菲尼依然可 以很好地从聚合物纳米颗粒中释放出来，在72小时是释放率可以达到约90％， 而pH5.5溶液中的索拉菲尼释放速率一直减小，在约40小时时已经达到平台期， 最终只有约40％的索拉菲尼从聚合物纳米颗粒中释放出来，说明该纳米颗粒具 有很好的酸响应释放性能，提示该材料可以很好地在肿瘤部位定点释放。
采用小鼠肝癌细胞H22细胞，在细胞水平上对基因/药物共载肿瘤酸性微环 境诱导药物释放的CC@SR&SF@PP NPs各种性能进行了验证。主要研究内容包括 以下几个方面：
1)肿瘤细胞生长抑制实验。参见图8，采用cell counting kit-8(CCK-8) 法测定不同剂量纳米颗粒的对小鼠肝癌细胞H22细胞的杀伤作用。H22细胞提 前一天被接种到96孔细胞培养板中，接种密度是5×103个细胞/孔，隔天用含 有不同浓度的各种纳米颗粒或者索拉非尼进行孵育。索拉非尼孵育浓度是0、 0.5、1.0、2.0、3.0、5.0和10μg/mL，在37℃下5％的二氧化碳孵育72h 后每孔加入10μL CCK-8，再继续孵育2h后，测定在450nm处的吸光度。按 如下公式计算细胞生长活力：
存活率(％)＝(处理组吸光度平均值/对照组吸光度平均值)×100。可以看 出不管是低浓度还是高浓度下，CMCS@SR&SF@PP NPs组对H22细胞的抑制能力 均优于单纯的SR&SF治疗组以及单独基因治疗或者药物治疗组。说明聚合物载 体很好的保护了药物和siRNA，延长了作用时间，同时可以降低药物使用剂量。 此外，单纯的载体本身，即使是高剂量时对H22的杀伤能力也非常弱。说明聚 合物载体本身是非常安全的。
2)增强细胞吞噬实验。将Bel-7404细胞按1X104个/孔的比例接种于96 孔细胞培养板中，用新鲜培养基培养24h，用PBS洗涤细胞，分散于1mL opti-MEM培养基中。分别加入5μL Cy3-anti-Tim-3-siRNA(20μM,lipo2000 按照厂家指南使用)、Cy3-anti-Tim-3-siRNA(20μM)或CC@SR&SF@PP NPs (siRNA等效物，pH6.5孵育)。培养板在4℃下培养4小时，避免非特异性吸 附。PBS冲洗2次，在徕卡荧光倒置显微镜下进行荧光成像。结果如图9所示： 在pH6.5时，CC@SR&SF@PP NPs对于siRNA的转染能力可以和强效转染试剂 lipo2000相媲美，并且呈现出pH依赖性特征。
3)细胞水平上干扰Tim-3表达实验。将H22细胞按5X105细胞/孔接种于 6孔细胞培养板，与新鲜培养基孵育24h。用PBS洗涤细胞，分散于1mL opti-MEM 培养基中。分别加入5μL Cy3-anti-Tim-3-siRNA(20μM,lipo2000，按照 厂家指南使用)，CC@PP NPs或CC@SR和SF@PP NPs(siRNA当量，pH 6.5孵育)。 4小时后，补充1.5mL新鲜培养基。72h收集细胞，分别提取蛋白和RNA，进 行western blot和Q-PCR分析。结果如图10所示：CC@SR&SF@PP NPs可以显著抑制H22细胞中Tim-3的蛋白表达。
采用小鼠肝癌细胞H22细胞，构建小鼠肝癌原位肿瘤模型，在活体动物水 平上对基因/药物共载肿瘤酸性微环境诱导药物释放的CC@SR&SF@PP NPs各种性 能进行了验证。主要研究内容包括以下几个方面：
1)CC@SR&SF@PP NPs的活体毒性研究。雄性BALB/c小鼠重达18-22g 购于西安交通大学的医学动物实验中心。100μL PBS或者CC@SR&SF@PP NPs (siRNA 0.5毫克/毫升,索拉非尼：2.0mg/mL,PP：20mg/mL，CMCS：0.5mg/mL) 通过静脉注射到小鼠体内。在不同的时间点将小鼠采用颈椎分离的方法处死， 取肺、心、肾、肝、脾等主要脏器进行HE染色。如图11所示，在七天范围内CC@SR&SF@PP NPs对小鼠主要器官包括心肝脾肺肾等没产生任何毒副作用。
2)小鼠原位肝癌模型的构建。我们对小鼠肿瘤原位模型的构建进行了研究， 采用不同品系的小鼠，用小型动物麻醉机吸入异氟醚麻醉小鼠后。皮肤准备消 毒后，腹部正中开刀，用棉签拔出肝中叶。将分散在不同体积PBS溶液中的含 有不同数量的Luc-H22细胞用1mL注射器缓慢注入肝中叶。轻轻将肝中叶插入腹腔，逐层缝合腹部，碘伏消毒切口。麻醉清醒后，将小鼠放回原喂养环境约 1周进行小动物生物发光成像，评估肿瘤大小。如图12所示：注射体积过多时 小鼠肝脏容易破裂，且注射时间过久操作难度大，注射体积小时则肿瘤生长很 慢。可以看出，总体注射50μL体积时肿瘤细胞在小鼠肝脏的弥漫性好一些， 所以最终肿瘤细胞注射体积为50μL。从图12下图可看出，同样的造模实验， Balb/c白鼠的肿瘤生长明显比C57黑鼠要好一些，故最后选择Balb/c鼠作为 造模鼠。
3)小鼠肿瘤抑制效果实验。荷瘤小鼠随机分为6组(n＝5)，包括PBS、 CC@PP、SR&SF、CC@SR@PP、CC@NSR&SF@PP和CC@SR&SF@PP NPs(siRNA 0.5mg/mL， 索拉非尼2.0mg/mL,PP:20mg/mL,CMCS:0.5mg/mL)。分别于第1、4、7、 10、13天静脉注射不同物质100μL，剂量为siRNA 2.5mg/kg和索拉非尼10 mg/kg。最后一次注射后三天处死小鼠。取小鼠整个肝脏进行拍照，观察小鼠肿 瘤生长情况，结果如图12所示。
本发明内容及上述实施例中未具体叙述的技术内容同现有技术。
本发明不限于上述实施例，本发明内容所述均可实施并具有所述良好效果。
以上，仅为本发明公开的具体实施方式，但本发明公开的保护范围并不局 限于此，本发明公开的保护范围应以权利要求的保护范围为准。

Claims (3)

1.一种用于治疗肝癌的多级pH响应基因-药物共递送的纳米药物，其特征在于：所述纳米药物包括羧甲基壳聚糖、小干扰RNA、靶向药物和聚(β-氨基酯)-聚乙二醇，所述纳米药物的质量百分比配比为羧甲基壳聚糖1-3份、小干扰RNA1-3份、靶向药物3-15份和聚(β-氨基酯)-聚乙二醇30-140份，
所述靶向药物为索拉菲尼；
所述用于治疗肝癌的多级pH响应基因-药物共递送的纳米药物的制备方法如下：
1)将索拉菲尼包裹到聚(β-氨基酯)-聚乙二醇(PAE-PEG)的聚合物微球中；
2)聚(β-氨基酯)-聚乙二醇(PAE-PEG)的聚合物微球的外层静电作用吸附抑制促癌Tim-3蛋白表达的小干扰RNA；
3)再将具备生物相容性的酸响应聚合物羧甲基壳聚糖以静电作用吸附到小干扰RNA表面。
2.根据权利要求1所述的用于治疗肝癌的多级pH响应基因-药物共递送的纳米药物，其特征在于：所述纳米药物的质量百分比配比为羧甲基壳聚糖1份、小干扰RNA1份、靶向药物4份和聚(β-氨基酯)-聚乙二醇40份。
3.一种权利要求1所述的用于治疗肝癌的多级pH响应基因-药物共递送的纳米药物在制备治疗肝癌药物的应用。
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