MX2010012857A - Supresion de produccion de citoquina proinflamatoria durante la terapia de reovirus oncolitico. - Google Patents

Abstract

En la presente se proporcionan métodos para tratar un trastorno proliferativo en un sujeto que comprende administrar al sujeto uno o más reovirus y uno o más agentes que modulan la expresión o actividad de las citoquinas proinflamatorias. Por ejemplo, los agentes pueden inhibir la expresión o actividad de las citoquinas proinflamatorias.

Description

SUPRESION DE PRODUCCION DE CITOQUINA PROINFLAMATORIA DURANTE LA TERAPIA DE REOVIRUS ONCOLITICO Antecedentes de la Invención Reovirus es un virus AR ds con tropismo de las células cancerígenas que poseen una vía Ras activada. Se ha demostrado que la administración del reovirus en animales portadores de tumores da como resultado la generación de una respuesta antiviral fuerte mediada por los brazos humoral y celular del sistema inmune. Esta respuesta antiviral puede 10 antagonizar la efectividad oncolítica del virus terapéutico. Como tal, se ha investigado el uso combinatorio de agentes supresores inmunes para superar este antagonismo inmune de oncólisis de reovirus. Se ha demostrado que la co- ^ administración de agentes que cortan la generación de anticuerpos de reovirus neutralizantes (NARA) puede dar como resultado morbilidad en los animales de ensayo. La respuesta en los animales de ensayo se ha caracterizado por la réplica del reovirus fuera de los tejidos tumorales blanco, 2Q sugiriendo que la inmunidad humoral tiene un rol protector en la prevención de la infección por reovirus del hospedero (Qiao et al., Clin. Cáncer Res . 14(l):259-69 (2008)).

Sumario de la Invención En la presente se proporcionan métodos para tratar un 22 trastorno proliferativo en un sujeto que comprende Ref.214318 administrar al sujeto uno o más reovirus y uno o más agentes que modulan la expresión o actividad de citoquinas proinflamatorias . Por ejemplo, los agentes pueden inhibir la expresión o actividad de citoquinas proinflamatorias .

Los detalles de uno o más aspectos se exponen en las figuras y descripción anexados más abajo. Otras características, objetos, y ventajas serán evidentes a partir de la descripción y figuras, y a partir de las reivindicaciones .

Breve Descripción de las Figuras Las Figuras 1A, IB, 1C y ID muestran crecimiento tumoral reducido y supervivencia después de la terapia de combinación de reovirus/cisplatino. Los ratones C57B1/6 (Figuras 1A y 1C) y C3H (Figuras IB y ID) portadores de tumores subcutáneos B16.F10 y K1735, respectivamente, fueron tratados los días 1 y 4 con reovirus como único reactivo a través de inyección intratumoral (i.t.) (cuadrados), cisplatino como único reactivo a través de administración intraperitoneal (i.p.) (triángulos), o reovirus y cisplatino en combinación (círculos) . Los ratones tratados de control (rombos) recibieron PBS. Se midieron los tumores en los días indicados y el volumen tumoral expresado como volumen tumoral respecto del volumen al comienzo del tratamiento (Figuras 1A y IB) . Los ratones fueron eutanizados cuando los tumores excedían los 15mm en cualquier dimensión. La supervivencia se expresa como diagramas de Kaplan-Myer (Figuras 1C y ID) .

La Figura 2 es un gráfico que muestra la respuesta del anticuerpo anti-reovirus neutralizante (NARA) después de ningún tratamiento (control) o del tratamiento con reovirus, cisplatino o la combinación de reovirus y cisplatino.

Las Figuras 3A, 3B, 3C, 3D, 3E, 3F, y 3G son gráficos que muestran que la respuesta de la citoquina proinflamatoria es anulada por el cisplatino. La respuesta de IL-lI (Figura 3A) , IL-3 (Figura 3B) , IL-6 (Figura 3C) , IL-12 (Figura 3D) , IL-17 (Figura 3E) , MIP-lI (Figura 3F) y RA TES (Figura 3G) se midieron después de ningún tratamiento (control) o del tratamiento con reovirus, cisplatino o la combinación de reovirus y cisplatino.

Descripción Detallada de la Invención Según lo descrito previamente (véanse, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses N° 6.110.461; 6.136.307; 6.261.555; 6.344.195; 6.576.234; y 6.811.775), los reovirus utilizan una maquinaria dé vía de célula hospedera para reducir la proteína quinasa activada con AR de doble hebra (PKR) y de ese modo la réplica en la célula. En base a estos descubrimientos, se han desarrollado métodos para utilizar reovirus para tratar trastornos proliferativos . Se ha demostrado que la terapia de reovirus da como resultado la liberación de citoquinas proinflamatorias . Las citoquinas proinflamatorias antagonizan la infección del reovirus y el reovirus se disemina en el tejido tumoral . Además se ha sugerido la función protectora del brazo humoral del sistema inmune en la prevención de la toxicidad del reovirus mediante la observación de que si bien, los ratones atímicos no manifiestan ninguna morbilidad a la infección del reovirus, los ratones SClD y animales agónicos de células B mueren invariablemente de infección por reovirus.

La oncólisis del roeovirus puede potenciarse in vitro mediante el uso de agentes citotóxicos. Sorprendentemente, según lo descrito en la presente, el uso combinatorio de compuestos de platino no afecta la producción de NARA pero tiene un efecto profundo en la producción de citoquinas proinflamatorias incluyendo: IL-1I, IL-3, IL-6, IL-12 p70, IL-17, MIP-1I, y RANTES . La inhibición de citoquinas proinflamatorias por cisplatino previene el reconocimiento de las células T de las células infectadas por reovirus y permite que la réplica del virus siga sin antagonismos de inmunidad celular. Sin embargo, el cisplatino permite la producción de anticuerpos anti-reovirus neutralizantes (NARA) NARA protectores y sus beneficios concomitantes (por ejemplo, prevención de toxicidad de reovirus en pacientes) . No se ha descrito previamente el uso de compuestos de platino para bloquear selectivamente ambas respuestas de células T innatas y adaptativas T, no teniendo al mismo tiempo ningún efecto sobre la actividad de células B.

En la presente se proporciona un método para tratar un trastorno proliferativo en un sujeto que comprende administrar un reovirus al sujeto y administrar al sujeto un agente que modula las citoquinas proinflamatorias .

Por ejemplo, el agente inhibe la expresión o actividad de las citoquinas proinflamatorias . Según lo utilizado en la presente, el término modular se refiere a un cambio (positivo o negativo) de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 por ciento o más en comparación con un nivel de control. Según lo utilizado en la presente, control se refiere a un estándar de referencia de una muestra o sujeto no tratados. A modo de ejemplo, un nivel de control es el nivel de la expresión o actividad en una muestra de control en ausencia de un estímulo. El control puede ser previo a, después de la recuperación, o sin el estímulo.

Opcionalmente , el agente modulador de la citoquina bloquea las respuestas de células T teniendo al mismo tiempo poco a ningún efecto en la actividad de las células B. De ese modo, el agente inhibe las citoquinas proinflamatorias pero no inhibe o inhibe la producción de NARA. Opcionalmente, el agente es un compuesto de platino. Los compuestos de platino apropiados incluyen, pero no se limitan a, cisplatino, carboplatino, metaplatino y oxaliplatino .

Otros agentes que inhiben las citoquinas proinflamatorias incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos TNF-I tales como infliximab, CDP571, CDP870, y adalimumab; receptores p55 solubles humanos, recombinantes tales como onercept; receptor TNF soluble y proteínas de fusión del fragmento Fe tales como etanercept; fragmentos Fab pegilados de anticuerpo humanizado contra TNF tales como certolizumab pegol; anticuerpos quiméricos contra la cadena anti-I del receptor de IL-2 tales como basiliximab o daclizumab; anticuerpos IL-12p40 tales como ABT-874; anticuerpos del receptor IL-6 tales como MRA o tocilizumab ; anticuerpo IFN-K tal como fontolizumab; anticuerpos que inhiben la unión de IL-1 al receptor IL-1 tales como AMG108; inhibidores de caspase-1 que inhiben la liberación de citoquinas tales como diarilsulfonilurene ; anticuerpos IL-15 tales como mepolizumab; anticuerpos IL-8 tales como ABX-IL-8; anticuerpos IL-9 incluyendo anticuerpos monoclonales IL-9; IL-21 humano recombinante también denominado 494C10; inhibidores de TNF-I, IL-li3, IL-6 y expresión del factor estimulante de colonias de monocitos y granulocitos tales como biophylum sensitivum; bloqueadores de la señalización de NF-PB que inhiben expresión de la citoquina proinflamatoria tales como simvastatina; e inhibidores de la expresión de IL-6 y activación de NF-PB tales como ( - ) -epigalocatequin-3 -galato (EGCG) .

Otros agentes incluyen lactoferrina recombinante humana, que inhibe la liberación celular de citoquinas proinflamatorias y citoquinas prometastásicas (incluyendo IL-6, IL-8, factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos y TNF-OÍ) . Los inhibidores de IL-12 y IL-18 obtenidos de células dendríticas tales como rapamicina y sangliferina también son apropiados para le uso en los métodos proporcionados. Rapamicina es un inmunosupresor que inhibe la activación de mTOR quinasa de células T, y Sangliferina A es un inmunosupresor de unión a la ciclofilina que también inhibe la proliferación de células T dependiente de IL-2. También es apropiado para el uso en los métodos proporcionados el dietary rutin colitis, que suprime la inducción de las citoquinas proinflamatorias tales como IL-1ß, IL-6, y GM-CS.

Opcionalmente , el método además incluye seleccionar un sujeto con un trastorno proliferativo, en donde el sujeto necesita la inhibición de una respuesta de citoquina proinflamatoria . Por ejemplo, el sujeto puede incluir un sujeto con poca respuesta al reovirus como único reactivo o con una resistencia progresiva a la terapia de reovirus.

Según lo utilizado en la presente, el término trastorno proliferativo se refiere a cualquier trastorno celular en el que las células proliferan más rápidamente que el crecimiento de tejido normal. Un trastorno proliferativo incluye, pero no se limita a, neoplasmas, que son también denominados tumores. un neoplasma puede incluir, pero no se limita a, cáncer pancreático, cáncer de mama, cáncer cerebral (por ejemplo, glioblastoma) , cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer colorectal, cáncer de tiroides, cáncer renal, cáncer adrenal, cáncer de hígado, neurofibromatosis 1, y leucemia. Un neoplasma puede ser un neoplasma sólido (por ejemplo, sarcoma o carcinoma) o un crecimiento canceroso que afecta el sistema hematopoiético (por ejemplo, linfoma o leucemia) . Otros trastornos proliferativos incluyen, pero no se limitan a, neurofibromatosis .

Generalmente, en los trastornos proliferantes para los que se utiliza reovirus como tratamiento, al menos algunas de las células proliferantes asociadas con el trastorno pueden tener una mutación en la que se activa el gen Ras (o un elemento de la vía de señalización Ras) , directamente (por ejemplo, mediante una mutación de activación en Ras) o indirectamente (por ejemplo, mediante la activación de un elemento corriente arriba o corriente abajo en la vía Ras) . La activación de un elemento corriente arriba en la vía Ras incluye, por ejemplo, la transformación con el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) o Sos. Véase, por ejemplo, Wiessmuller y Wittinghofer, 1994, Cellular Signaling 6 (3) : 247-267 ; y Barbacid, 1987, Ann. Rev. Biochem. 56, 779-827. La activación de un elemento corriente abajo en la vía Ras incluye, por ejemplo, mutación dentro de B-Raf. Véase, por ejemplo, Brose et al., 2002, Cáncer Res. 62:6997-7000.

Un trastorno proliferativo que resulta, al menos en parte, por la activación de ras, un elemento corriente arriba de ras, o un elemento en la vía de señalización ras se denomina en la presente un trastorno proliferativo mediado por ras. Además, el reovirus es útil para tratar trastornos proliferativos causados por las mutaciones o desregulación de PKR. Véase, por ejemplo, Strong et al., 1998, EMBO J. 17 :3351-62.

Opcionalmente, los métodos proporcionados además comprenden el paso de seleccionar un sujeto con un trastorno proliferativo mediado por ras. Opcionalmente, los métodos proporcionados comprenden el paso de determinar si el trastorno proliferativo es un trastorno proliferativo mediado por ras. Los métodos para determinar si un trastorno proliferativo posee un cierto fenotipo son conocidos. Véase, por ejemplo, la Patente Estadounidense N° 7.306.902, que se incorpora a la presente por referencia en su totalidad .

Según lo utilizado en la presente, el reovirus se refiere a cualquier virus clasificado en el género reovirus, si es de origen natural, modificado o recombinante . Los reovirus son virus con un genoma de ARN segmentado, de doble hebra. Los viriones miden 60-80 nm en diámetro y poseen dos cubiertas de cápside concéntricas, cada una de las cuales es icosaedral . El genoma consiste en ARN doble hebra en 10-12 segmentos discretos con un tamaño de genoma total de 16-27 kbp. Los segmentos individuales de ARN varían en tamaño. Se han recuperado tres tipos de reovirus diferentes pero relacionados de muchas especies. Todos los tres tipos comparten un antígeno de fijación del complemento.

El reovirus humano incluye tres serotipos: tipo 1 (cepa Lang o TIL) , tipo 2 (cepa Jones, T2J) , y tipo 3 (cepa Dearing o cepa Abney, T3D) . Los tres serotipos son fácilmente identificables en base a ensayos de neutralización e inhibición de hemaglutinina . Un reovirus conforme a la presente divulgación puede ser un ortoreovirus de mamífero tipo 3. El ortoreovirus de mamífero tipo 3 incluye, sin limitación, las cepas Dearing y Abney (T3D o T3A, respectivamente) . Véase, por ejemplo, N° de Acceso al ATCC VR-232 y VR-824.

El reovirus puede ser de origen natural o modificado. El reovirus es de origen natural cuando puede aislarse de una fuente en la naturaleza y no ha sido modificado intencionalmente por seres humanos en el laboratorio. Por ejemplo, el reovirus puede ser de una fuente de campo, es decir, de un ser humano que ha sido infectado con el reovirus. El reovirus. también puede seleccionarse o mutagenizarse para la actividad incolítica potenciada.

El reovirus puede ser modificado pero aún puede ser capaz de infectar líticamente una célula de mamífero que posee una vía ras activa. El reovirus puede ser pretratado químicamente o bioquímicamente (por ejemplo, mediante el tratamiento con una proteasa, tal como quimotripsina o tripsina) previo a la administración a las células proliferantes. El pretratamiento con una proteasa elimina la cubierta externa o cápside del virus y puede incrementar la infectividad del virus. El reovirus puede estar recubierto en una liposoma o micela (Chandran y Nibert, J. of Virology 72(l):467-75 1998). Por ejemplo, el virión puede tratarse con quimotripsina en presencia de concentraciones de detergentes de sulfato de alquilo formadoras de micela para generar una nueva partícula subviral infecciosa (ISVP) .

El reovirus puede ser un reovirus recombinante . Por ejemplo, el reovirus recombinante puede ser un reovirus reordenante, que incluye segmentos genómicos de dos o más reovirus genéticamente diferentes. El reordenamiento de los segmentos genómicos de reovirus puede producirse después de la infección de un organismo hospedero con al menos dos reovirus genéticamente diferentes. El reordenamiento del virus puede generarse en el cultivo celular, por ejemplo, por co- infección de células hospedero permisivas con reovirus genéticamente diferentes. Por consiguiente, los métodos proporcionados incluyen el uso de un reovirus recombinante resultante del reordenamiento de segmentos genómicos de dos o más reovirus genéticamente diferentes, incluyendo pero sin limitarse a, reovirus humano, tal como reovirus tipo 1 (por ejemplo, cepa Lang) , tipo 2 (por ejemplo, cepa Jones), y tipo 3 (por ejemplo, cepa Dearing o cepa Abney) ; reovirus de mamífero no humano; o reovirus aviar. El reovirus recombinante también puede realizarse mediante manipulación genética, sintetizarse químicamente, o tratamiento con mutágenos físicos o químicos mutágenos. Opcionalmente , los métodos proporcionados incluyen el uso de reovirus recombinante resultante del reordenamiento de los segmentos genómicos de dos o más reovirus genéticamente diferentes en donde al menos un virus parental está manipulado genéticamente, comprende uno o más segmentos genómicos químicamente sintetizados, ha sido tratado con mutágenos físicos o químicos, o es él mismo el resultado de un evento de recombinación. Opcionalmente, los métodos proporcionados incluyen el uso del reovirus recombinante que ha sufrido la recombinación en presencia de mutágenos químicos, incluyendo pero sin limitarse a, sulfato de dimetilo y bromuro de etidio, o mutágenos físicos, incluyendo pero sin limitarse a, luz ultravioleta y otras formas de radiación.

Opcionalmente, los métodos proporcionados incluyen el uso de reovirus con mutaciones (incluyendo inserciones, sustituciones, eliminaciones o duplicaciones) en uno o más segmentos genómicos. Las mutaciones pueden comprender información genética adicional como resultado de la recombinación con un genoma celular del hospedero o pueden comprender genes sintéticos. Por ejemplo, los reovirus mutantes según lo descrito en la presente pueden contener una mutación que reduce o esencialmente elimina la expresión de un polipéptido sigma3 o que da como resultado la ausencia de un polipéptido sigma3 funcional según lo descrito en el N° de serie Estadounidense 12/124,522, que se incorpora por referencia en la presente en su totalidad. Una mutación que elimina la expresión de un polipéptido sigma3 o que da como resultado la ausencia de un polipéptido sigma3 funcional puede estar en el ácido nucleico que codifica el polipéptido sigma3 (es decir, el gen S4) o en un ácido nucleico que codifica un polipéptido que regula la expresión o función del polipéptido sigma3.

Según lo utilizado en la presente, una mutación que reduce la expresión de un polipéptido sigma3 se refiere a una mutación que da como resultado una reducción en la cantidad de polipéptidos sigma3, en comparación con un reovirus que expresa niveles de tipo salvaje de polipéptido sigma3, de al menos 30% (por ejemplo, al menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 95%) . Según lo utilizado en la presente, una mutación que esencialmente elimina la expresión de un polipéptido sigma3 se refiere a una mutación que da como resultado una reducción en la cantidad de polipéptidos sigma3, respecto de la cantidad de polipéptidos sigma3 producidos por un reovirus de tipo salvaje, de al menos 95% (por ejemplo, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100%) . Según lo utilizado en la presente, una mutación que da como resultado una reducción en o ausencia de un polipéptido sigma3 funcional se refiere a una mutación que permite la expresión del polipéptido sigma3 pero que da como resultado un polipéptido sigma3 que no es capaz de ensamblarse o incorporarse en la cápside vírica. Se entendería que puede ser deseable o necesario que los polipéptidos sigma3 retengan otras funcionalidades (por ejemplo, la capacidad de unirse al ARN) para que el reovirus mutante retenga la capacidad de propagarse.

Una mutación en un polipéptido sigma3 según lo descrito en la presente puede dar como resultado un polipéptido sigma3 que es incorporado a la cápside en niveles que son reducidos respecto de un polipéptido sigma3 que no contiene la mutación (por ejemplo, un polipéptido sigma3 de tipo salvaje) . Una mutación en un polipéptido sigma3 según lo descrito en la presente también puede dar como resultado un polipéptido sigma3 que no puede ser incorporado en una cápside vírica. Sin ceñirnos a ningún mecanismo particular, un polipéptido sigma3 puede tener función reducida o puede carecer de función debido, por ejemplo, a una incapacidad del polipéptido sigma3 y el polipéptido muí de unirse apropiadamente, o debido a un cambio conformacional que reduce o prohibe la incorporación del polipéptido sigma3 en la cápside.

Además de una mutación que anula o reduce la expresión del polipéptido sigma3 o que da como resultado un polipéptido sigma3 no funcional o con función reducida, un reovirus mutante según lo descrito en la presente también puede contener una u otras mutaciones más (por ejemplo, una segunda, tercera, o cuarta mutación) en uno de los otros polipéptidos de la cápside del reovirus (por ejemplo, muí, lambda2, y/o sigmal) . El reovirus que contiene una mutación que afecta el polipéptido sigma3 y, opcionalmente, otra mutación en cualquiera o todas las otras proteínas de la cápside externa puede detectarse en cuanto a la capacidad del reovirus mutante de infectar y causar lisis de células. Por ejemplo, pueden utilizarse células neoplásicas que son resistentes a la lisis por el reovirus de tipo salvaje para detectar el reovirus mutante efectivo descrito en la presente .

Por ejemplo, otra mutación puede reducir o esencialmente eliminar la expresión de un polipéptido muí o dar como resultado la ausencia de un polipéptido muí funcional. El polipéptido muí, que es codificado por el gen M2, posiblemente está involucrado en la penetración celular y puede tener un rol en la activación de la transcriptasa . Cada virión contiene aproximadamente 600 copias de polipéptidos muí, que están presentes en forma de complejos 1:1 con polipéptidos sigma3. El polipéptido muí es miristilado en su extremo terminal N, y después los 42 residuos del extremo terminal N miristilado son escindidos, dando como resultado un fragmento del extremo terminal C (mulC) . Adicionalmente o alternativamente, otra mutación puede reducir o esencialmente eliminar la expresión de un polipéptido lambda2 o dar como resultado la ausencia de un polipéptido lambda2 funcional, y/o otra mutación puede reducir o esencialmente eliminar la expresión de un polipéptido sigmal o dar como resultado la ausencia de un polipéptido sigmal funcional. El polipéptido lambda2 es codificado por el gen L2 y está involucrado en el ensamblaje de partículas, y exhibe actividad guanililtransferasa y metiltransferasa . El polipéptido sigmal es codificado por el gen SI y esta involucrado en la unión celular y es útil como hemaglutinina viral.

Por ejemplo, el reovirus posee un polipéptido lambda3 que posee una o más modificaciones de aminoácidos; un polipéptido sigma3 que posee una o más modificaciones de aminoácidos; un polipéptido mu-1 que posee una o más modificaciones de aminoácidos; y/o un polipéptido mu-2 que posee una o más modificaciones de aminoácidos, según lo descrito en el N° de Serie Estadounidense 12/046,095, que se incorpora por referencia en la presente en su totalidad. A modo de ejemplo, una o más modificaciones de aminoácidos en el polipéptido lambda3 son un Val en el residuo 214, un Ala en el residuo 267, un Thr en el residuo 557, un Lys en el residuo 755, un Met en el residuo 756, un Pro en el residuo 926, un Pro en el residuo 963, un Leu en el residuo 979, un Arg en el residuo 1045, un Val en el residuo 1071, o cualquier combinación de los mismos, numerados en relación con el N° de Acceso al GenBank M24734.1. Se observa que, cuando la secuencia de aminoácidos es un Val en el residuo 214 o un Val en el residuo 1071, la secuencia de aminoácidos además incluye al menos un cambio adicional en la secuencia de aminoácidos. Opcionalmente , el polipéptido lambda3 incluye la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 18. Además a modo de ejemplo, una o más modificaciones de aminoácidos en el polipéptido sigma3 son un Leu en el residuo 14, un Lys en el residuo 198, o cualquier combinación de los mismos, numerados en relación con el N° de Acceso al GenBank 02739. Se observa que, cuando la secuencia de aminoácidos es un Leu en el residuo 14, la secuencia de aminoácidos además incluye al menos un cambio adicional en la secuencia de aminoácidos. Opcionalmente, el polipéptido sigma3 incluye la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 14. Además a modo de ejemplo, una o más modificaciones de aminoácidos en el polipéptido mu-1 es un Asp en el residuo 73 numerado en relación con el N° de Acceso al GenBank M20161.1. Opcionalmente, el polipéptido mu-1 incluye la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 16. También a modo de ejemplo, el polipéptido mu-2 de la modificación de aminoácidos es un Ser en el residuo 528 numerado en relación con el N° de Acceso al GenBank AF461684.1. Opcionalmente , el polipéptido mu-1 incluye la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 15. Un reovirus según lo descrito en la presente que posee una o más modificaciones además puede incluir un polipéptidos sigma-2 del reovirus. El polipéptido sigma-2 posee un Cys en una o más de las posiciones 70, 127, 195, 241, 255, 294, 296, o 340, numeradas en relación con el N° de Acceso al GenBank NP_694684.1. Opcionalmente, el polipéptido sigma-2 incluye la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 12.

Opcionalmente, el reovirus posee un segmento genómico Ll que posee una o más modificaciones de ácido nucleico; un segmento genómico S4 que posee una o más modificaciones de ácido nucleico; un segmento genómico MI que posee una o más modificaciones de ácido nucleico; y/o un segmento genómico M2 que posee una o más modificaciones de ácido nucleico, según lo descrito en N° de Serie Estadounidense 12/046,095, que se incorpora por referencia en la presente en su totalidad. A modo de ejemplo, una o más modificaciones de ácido nucleico en el segmento genómico Ll son un T en la posición 660, un G en la posición 817, un A en la posición 1687, un G en la posición 2283, un ATG en las posiciones 2284-2286, un C en la posición 2794, un C en la posición 2905, un C en la posición 2953, un A en la posición 3153, o un G en la posición 3231, numeradas en relación con el N° de Acceso al GenBank M24734.1. Opcionalmente , el segmento genómico Ll incluye la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO : 8. Además a modo de ejemplo, una o más modificaciones de ácido nucleico en el segmento genómico S4 es un A en la posición 74 y un A en la posición 624, numeradas en relación con el N° de Acceso al GenBank K02739. Opcionalmente, el segmento genómico S4 incluye la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO : 4. Además a modo de ejemplo, la modificación de ácido nucleico en el segmento genómico M2 puede ser un C en la posición 248, numerada en relación con el N° de Acceso al GenBank M20161.1. En una modalidad, el segmento genómico M2 incluye la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO : 6. También a modo de ejemplo, la modificación de ácido nucleico en el segmento genómico MI es un T en la posición 1595, numerada en relación con el N° de Acceso al GenBank AF461684.1. Opcionalmente, el segmento genómico MI incluye la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO : 5. Un reovirus según lo .descrito en la presente puede incluir cualquier modificación o combinación de modificaciones desveladas en la presente. Opcionalmente, un reovirus según lo descrito en la presente incluye segmentos genómicos que poseen las secuencias que se muestran en la SEQ ID NOs:l-10 o los polipéptidos que se muestran en la SEQ ID NOs:ll, 12, y 16-21, y cualquiera o ambas SEQ ID NO: 13 o 14. Opcionalmente, un reovirus según lo desvelado en la presente es identificado como N° de Acceso al IDAC 190907-01.

Una mutación o modificación según lo referido en la presente puede ser una sustitución, inserción o eliminación de uno o más nucleótidos. Las mutaciones puntuales incluyen, por ejemplo, transiciones de nucleótido único (purina a purina o pirimidina a pirimidina) o transversiones (purina a pirimidina o vice versa) y eliminaciones o inserciones de nucleótidos únicos o múltiples. Una mutación en un ácido nucleico puede dar como resultado una o más sustituciones de aminoácidos conservadoras o no conservadoras en el polipéptido codificado, que puede dar como resultado cambios conformacionales o pérdida o pérdida parcial de la función, un cambio en el marco de lectura de la traducción (cambio de marco) que da como resultado un polipéptido completamente diferente codificado a partir de ese punto, un codón de interrupción prematura que da como resultado un polipéptido truncado (truncamiento) , o una mutación en un ácido nucleico del reovirus puede no cambiar nada del polipéptido codificado (silenciosa o terminadora) . Véase, por ejemplo, Johnson y Overington, 1993, J. Mol. Biol . 233:716-38; Henikoff y Henikoff, 1992, Proc . Nati. Acad. Sci . EEUU 89:10915-19; y la Patente Estadounidense N° 4.554.101 para la divulgación sobre las sustituciones de aminoácidos conservadoras o no conservadoras .

Las mutaciones pueden generarse en el ácido nucleico de un reovirus utilizando cualquier número de métodos conocidos en el arte. Por ejemplo, puede utilizarse la mutagénesis dirigida al sitio para modificar una secuencia de ácidos nucleicos del reovirus. Uno de los métodos más comunes de mutagénesis dirigida al sitio es la mutagénesis dirigida al oligonucleótido . En la mutagénesis dirigida al oligonucleótido, un oligonucleótido que codifica el/los cambio/s deseado/s en la secuencia es alineado a una hebra del ADN de interés y es útil como cebador para la iniciación de la síntesis de ADN. De esta manera, el oligonucleótido que contiene el cambio de secuencia se incorpora en la hebra recientemente sintetizada. Véase, por ejemplo, Kunkel, 1985, Proc. Nati. Acad. Sci. EEUU 82:488; Kunkel et al., 1987, Meth. Enzymol. 154:367; Lewis y Thompson, 1990, Nucí. Acids Res. 18:3439; Bohnsack, 1996, Meth. Mol. Biol . 57:1; Deng y Nickoloff, 1992, Anal. Biochem. 200:81; y Shimada, 1996, Meth. Mol. Biol. 57:157. Habitualmente se utilizan otros métodos en el arte para modificar la secuencia de una proteína o polipéptido. Por ejemplo, los ácidos nucleicos que contienen una mutación pueden generarse utilizando PCR o síntesis química, o los polipéptidos que poseen el cambio deseado en la secuencia de aminoácidos pueden sintetizarse químicamente. Véase, por ejemplo, Bang y Kent, 2005, Proc. Nati. Acad. Sci. EEUU 102:5014-9 y las referencias en el mismo.

Los ácido nucleicos de las partículas del reovirus pueden aislarse utilizando metodología estándar de ácidos nucleicos comercialmente disponible. Véase también, por ejemplo, Schiff et al., "Orthoreovirus and Their Replication, " Ch 52, in Fields Virology, Knipe y Howley, eds . , 2006, Lippincott Williams y Wilkins. Según lo utilizado en la presente, los ácido nucleicos aislados se refieren a ácido nucleicos que son separados de otros ácidos nucleicos a los que están usualmente asociados. De ese modo, un ácido nucleico aislado incluye, sin límite, el ácido nucleico reoviral que está esencialmente libre del ácido nucleico no reoviral (por ejemplo, célula hospedera), o un segmento genómico reoviral que está esencialmente libre del ácido nucleico correspondiente a otros segmentos genómicos. Además, un ácido nucleico aislado puede incluir un ácido nucleico manipulado tal como un ácido nucleico sintético o recombinante .

Un reovirus mutante según lo descrito en la presente puede generarse reconstituyendo segmentos genómicos que contienen al menos una mutación o modificación utilizando métodos conocidos en el arte. Véase, por ejemplo, Schiff et al., "Orthoreovirus and Their Replication," Ch 52, in Fields Virology, Knipe y Howley, eds., 2006, Lippincott Williams y Wilkins; Smith et al., 1969,- Virology 39 (4) : 791-810 ; y las Patentes Estadounidenses N° 7.186.542; 7.049.127; 6.808.916; y 6.528.305. Un reovirus mutante también puede generarse expresando los segmentos genómicos di reovirus utilizando un sistema genético inverso basado en plásmidos para producir una ISVP. Véase, por ejemplo, Kobayashi et al., 2007, Cell Host and Microbe 1:147-57. Según lo utilizado en la presente, una ISVP mutante o manipulada genéticamente es un reovirus mutante y se refiere a una ISVP generada a partir de un reovirus portador de una mutación manipulada genéticamente o generada espontáneamente que afecta al menos el polipéptido sigma3. Las ISVPs descritas en la presente son estables y pueden propagarse como ISVPs para múltiples pasos (por ejemplo, más de uno, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, o más) .

El reovirus mutante descrito en la presente, producido a través de una ISVP manipulada genéticamente o a través de un sistema genético inverso basado en plásmidos, puede cultivarse en, por ejemplo, células neoplásicas humanas o Células de fibroblastos de ratón L929. El reovirus mutante desvelado en la presente puede cultivarse en células que son solamente permisivas a las cepas del reovirus que carecen de polipéptido sigma3. Utilizar las líneas celulares para pasar el reovirus mutante descrito en la presente puede permitir la selección de los mutantes y también puede utilizarse para reducir o prevenir reversiones de la/s mutación (es) .

El reovirus mutante descrito en la presente, opcionalmente, exhibe infectividad incrementada y/o inmunogenicidad reducida en comparación con un reovirus no mutante (por ejemplo, un reovirus de control) y puede seleccionarse en base a los rasgos. La infectividad incrementada puede evidenciarse mediante un incremento en el intervalo de células neoplásicas y/o el número de células que son infectadas por un reovirus mutante en comparación con un reovirus que expresa un polipéptido sigma3 funcional (por ejemplo, un virión intacto; por ejemplo, un reovirus de tipo salvaje) . La inmunogenicidad reducida del reovirus mutante puede evidenciarse por la incapacidad del reovirus mutante de inducir una respuesta inmune considerable en el sujeto. El reovirus mutante descrito en la presente also también puede detectarse y seleccionarse en cuanto a otros rasgos deseables incluyendo, pero sin limitarse a, una velocidad más rápida de réplica; una velocidad más rápida de empaquetado; la capacidad de inducir apóptosis; la capacidad de afectar la lisis en y efectivamente matar líneas celulares neoplásicas humanas; la capacidad de liberar epítopos tumorales efectivos; interacción con quimioterapias estándar; y un número incrementado de progenie viral. Adicionalmente, el reovirus mutante puede seleccionarse en cuanto a la capacidad de infectar líticamente una célula neoplásica (por ejemplo, una células de mamífero que posee una vía ras activa) . Véase, por ejemplo, la Patente Estadounidense N° 7.052.832.

El reovirus es opcionalmente un reovirus modificado para reducir o eliminar una reacción inmune al reovirus. El reovirus modificado es denominado en la presente como un reovirus inmunoprotegido . Las modificaciones incluyen, pero no se limitan a, empaquetamiento del reovirus en un liposoma, una micela, u otro vehículo para cubrir el reovirus del sistema inmune. Alternativamente, la cápside externa de la partícula del virión del reovirus puede eliminarse ya que las proteínas presentes en la cápside externa son el principal determinantes de las respuestas celulares y humorales del hospedero .

El reovirus puede purificarse utilizando metodología estándar. Véase, por ejemplo, Schiff et al., "Orthoreovirus and Their Replication, " Ch 52, en Fields Virology, Knipe y Howley, eds . , 2006, Lippincott Williams y Wilkins; Smith et al., 1969, Virology 39 (4) : 791-810 ; y las Patentes Estadounidenses N° 7.186.542; 7.049.127; 6.808.916; y 6.528.305. Según lo utilizado en la presente, el reovirus mutante purificado se refiere a 1 reovirus que ha sido separado de los componentes celulares que naturalmente lo acompañan. Típicamente, los reovirus son considerados purificados cuando están al menos 70% (por ejemplo', al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o 99%) en peso seco, libres de las proteínas y otros componentes celulares a los que naturalmente están asociados.

El reovirus y agentes proporcionados en la presente pueden administrarse in vitro o in vivo en un vehículo aceptable para uso farmacéutico. De ese modo, se proporcionan composiciones farmacéuticas que incluyen un reovirus y/o agente que inhibe las citoquinas proinflamatorias según lo descrito en la presente. Véase, por ejemplo, la Patente Estadounidense N° 6.576.234 con respecto al reovirus. Además de uno o más reovirus y/o agentes que . inhiben las citoquinas proinflamatorias , una composición farmacéutica típicamente incluye un vehículo aceptable para uso farmacéutico. Un vehículo aceptable para uso farmacéutico puede ser un material sólido, semisólido, o líquido que puede actuar como vehículo, transportador o medio para el reovirus. De ese modo, las composiciones que contienen un reovirus y/o los agentes proporcionados pueden estar en forma de comprimidos, pildoras, polvos, pastillas, sachets, elixires, suspensiones, emulsiones, soluciones, jarabes, aerosoles (como sólido o en un medio líquido), ungüentos que contienen, por ejemplo, hasta 10% en peso del compuesto activo, cápsulas de gelatina dura y blanda, supositorios, soluciones inyectables estériles, y polvos envasados estériles.

Opcionalmente , las composiciones que contienen un reovirus son apropiadas para infusión. Para las infusiones intravenosas, existen dos tipos de fluidos que son comúnmente utilizados, cristaloides y coloides. Los cristaloides son soluciones acuosas de sales minerales u otras moléculas solubles en agua. Los coloides contienen moléculas insolubles más grandes, tales como gelatina; la sangre misma es un coloide. El fluido cristaloide utilizado más comúnmente es la solución salina normal, una solución de cloruro de sodio en una concentración de 0,9%, que es cercana a la concentración en la sangre (isotónica) . El lactato de Ringer o acetato de Ringer es otra solución isotónica utilizada a menudo para el reemplazo de fluidos de gran volumen. En vez a menudo se utiliza una solución de dextrosa al 5% en agua, a veces denominada D5W, si el paciente está en riesgo por poseer azúcar baja en sangre o alto sodio.

Algunos ejemplos de vehículos apropiados incluyen solución salina amortiguada con fosfato u otro amortiguador aceptable para uso fisiológico, lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidones, goma acacia, fosfato de calcio, alginatos, tragacanto, gelatina, silicato de calcio, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, celulosa, agua estéril, jarabe, y metil celulosa. Una composición farmacéutica adicionalmente puede incluir, sin límite, agentes lubricantes tales como talco, estearato de magnesio, y aceite mineral; agentes humectantes; agentes emulsionantes y de suspensión; agentes conservantes tales como metil y propilhidroxi benzoatos; agentes edulcorantes; y agentes saborizantes . Las composiciones farmacéuticas pueden formularse para proporcionar la liberación rápida, sostenida o retardada de un reovirus mutante después de la administración empleando procedimientos conocidos en el arte. Además de las formulaciones representativas descritas más abajo, pueden encontrarse otras formulaciones apropiadas para el uso en una composición farmacéutica en Remington: The Science and Practice of Pharmacy (21° edición) ed. David B. Troy, Lippincott Williams & Wilkins, 2005. Para preparar las composiciones sólidas tales como comprimidos, un reovirus mutante puede mezclarse con un vehículo farmacéutico para formar una composición sólida. Opcionalmente, los comprimidos o pildoras puede recubrirse o de otra manera combinarse para proporcionar una forma de dosificación que proporcione la ventaja de acción prolongada. Por ejemplo, un comprimido o pildora puede comprender un componente de dosificación interno y un componente de dosificación externo, estando el último en forma de un una envoltura sobre el primero. Los dos componentes pueden separarse mediante una capa entérica que es útil para resistir la desintegración en el estómago y permitir que el componente interno pase intacto al duodeno o sea retardado en la liberación. Puede utilizarse una variedad de materiales para las capas o recubrimientos entéricos, los materiales incluyendo un número de ácidos poliméricos y mezclas de ácidos poliméricos con los materiales como laca, alcohol cetílico, y acetato de celulosa.

Las formulaciones líquidas que incluyen un reovirus y/u otros agentes para la administración oral o para inyección generalmente incluyen soluciones acuosas, jarabes apropiadamente saborizados, suspensiones aceitosas o acuosas, y emulsiones saborizadas con aceites comestibles tales como aceite de maíz, aceite de semilla de algodón, aceite de sésamo, aceite de coco, o aceite de maní, así como elixires y vehículos farmacéuticos similares.

Las composiciones para inhalación o insuflación incluyen soluciones y suspensiones en disolventes orgánicos o acuosos aceptables para uso farmacéutico, o mezclas de los mismos, y polvos. Estas composiciones líquidas o sólidas pueden contener excipientes apropiados aceptables para uso farmacéutico según lo descrito en la presente. Las composiciones pueden administrarse por la vía respiratoria oral o nasal para efecto local o sistémico. Las composiciones en disolventes aceptables para uso farmacéutico pueden nebulizarse mediante el uso de gases inertes. Las soluciones nebulizadas pueden inhalarse directamente del dispositivo de nebulización o el dispositivo de nebulización puede estar conectado a cámara de máscara facial o respirador de presión positiva intermitente. La solución, suspensión, o composiciones en polvo pueden administrarse, por vía oral o nasal, desde dispositivos que suministran la formulación en una manera apropiada.

Otra formulación que se emplea opcionalmente en los métodos de la presente divulgación incluye dispositivos de suministro transdérmico (por ejemplo, parches) . Los parches transdérmicos pueden utilizarse para proporcionar infusión continua o discontinua de un reovirus mutante según lo descrito en la presente. La construcción y uso de parches transdérmicos para el suministro de agentes farmacéuticos es bien conocido en el arte. Véase, por ejemplo, la Patente Estadounidense N° 5.023.252. Los parches pueden fabricarse para el suministro continuo, pulsátil, o a demanda del reovirus mutante.

Según lo descrito más arriba, el reovirus y/u otros agentes son recubiertos, si es necesario, en un liposoma o micela para reducir o prevenir una respuesta inmune en un mamífero que ha desarrollado inmunidad hacia un reovirus. Las composiciones son denominadas reovirus y/o agentes inmunoprotegidos . Véase, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses N° 6.565.831 y 7.014.847. Además, un reovirus mutante según lo desvelado en la presente (por ejemplo, uno que carezca o esté falto de polipéptido o función sigma3) puede ser tratado proteolíticamente con una enzima para eliminar o parcialmente eliminar cualquiera de las otras proteínas de la cápside externa presentes.

En los métodos proporcionados, el reovirus se administra de una manera que puede entrar en contacto finalmente con el tumor blanco o células blanco, por ejemplo, sistemáticamente. La vía por la cual el reovirus se administra, así como la formulación, transportador o vehículo, depende de la ubicación así como el tipo de células blanco. Puede emplearse una amplia variedad de vías de administración. Por ejemplo, para un tumor sólido qué es accesible, el reovirus puede administrarse por inyección directamente al tumor. Para un tumor hematopoiético, por ejemplo, el reovirus puede administrarse por vía intravenosa o intravascular . Para los tumores que no son fácilmente accesibles dentro del cuerpo, tales como metástasis, el reovirus se administra de manera tal que puede ser transportado sistemáticamente a través del cuerpo del mamífero y alcanzar de ese modo el tumor (por ejemplo, por vía intravenosa o intramuscular). Alternativamente, el reovirus puede administrarse directamente a un único tumor sólido, donde entonces es transportado sistemáticamente a través del cuerpo a la metástasis. El reovirus también puede administrarse por vía subcutánea, intraperitoneal , intratecal (por ejemplo, para tumor cerebral) , tópica (por ejemplo, para melanoma) , oral (por ejemplo, para cáncer oral o esofágico) , rectal (por ejemplo, para cáncer colorectal) , vaginal (por ejemplo, para cáncer cervical o vaginal), nasal, por pulverizador de inhalación o por formulación en aerosol (por ejemplo, para cáncer de pulmón) .

Opcionalmente , el virus se administra continuamente a un sujeto al menos una vez por día o hasta durante todo el día en días consecutivos, durante un período de tiempo. De ese modo, el virus se administra, por ejemplo, a sujetos por medio de administración intravenosa en cualquier solución aceptable para uso farmacológico, o como una infusión durante un período de tiempo. Por ejemplo, la sustancia puede administrarse sistémicamente por inyección (por ejemplo, IM o por vía subcutánea) o ingerirse por vía oral diariamente al menos una vez por día, o administrarse por infusión de manera que de como resultado el suministro diario en el tejido o torrente sanguíneo del sujeto. Cuando el virus se administra por infusión durante un período de tiempo, el período de tiempo es, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, o 24 horas, o cualquier tiempo entre 1 y 24 horas, inclusive, o más. Opcionalmente, el período de tiempo es 5, 15, 30, 60, 90, 120, 150 o 180 minutos, o cualquier tiempo entre 5 y 180 minutos, inclusive, o más. De ese modo, por ejemplo, el virus se administra por infusión durante 60 minutos o aproximadamente 60 minutos. Las administraciones pueden repetirse diariamente durante 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 14, 21, 28 días o cualquier número de días entre 2 y 28 días, inclusive, o más.

Los agentes terapéuticos, tales como los agentes que inhiben la producción de citoquinas proinflamatorias , de los métodos proporcionados también se administran a través de una amplia variedad de vías de administración. De ese modo, los agentes se administran a través de cualquier de las diversas vías de administración, incluyendo, por vía tópica, oral, parenteral, intravenosa, intraperitoneal , intramuscular, subcutánea, intracavidad, transdérmica , intrahepática , intracraneal, nebulización/inhalación, o por instilación a través de broncoscopía . Opcionalmente , los agentes terapéuticos se administran continuamente de una manera expuesta en la descripción anterior con respecto a los virus oncolítico. De ese modo, por ejemplo, el agente se administra, por ejemplo, a sujetos por medio de administración intravenosa en cualquier solución aceptable para uso farmacológico, o como una infusión durante un período de tiempo. Opcionalmente, los agentes se administran localmente en o cerca del sitio del tumor. Alternativamente, los agentes se administran sistémicamente . Los agentes que inhiben las citoquinas proinflamatorias se administran en una cantidad suficiente (es decir, una cantidad efectiva) para inhibir una o más citoquinas proinflamatorias . A modo de ejemplo, las cantidades efectivas de los compuestos de platino incluyen de aproximadamente 5 a 1000 mg/m2 del volumen tumoral, o cualquier cantidad entre 5 y 1000 mg/m2, inclusive, o más. De ese modo, por ejemplo las cantidades efectivas de cisplatino incluyen desde aproximadamente 175-200 mg/m2 y las cantidades efectivas para el carboplatino incluyen desde aproximadamente 100-600 mg/m2. Las cantidades efectivas de otros agentes varían de 0,001-10.000 mg/kg de peso corporal o cualquier cantidad entre 0,001 y 10.000 mg/kg de peso corporal, inclusive. Opcionalmente , las cantidades efectivas de los compuestos de platino incluyen aproximadamente 2 a 7 mg/ml minuto (AUC) según lo calculado por la fórmula de Calvert . Opcionalmente, las cantidades efectivas de los compuestos de platino incluyen aproximadamente 5 o 6 mg/ml minuto (AUC) según lo calculado por la fórmula de Calvert. Opcionalmente, los compuestos de platino se administran como una infusión intravenosa durante un período de 30 minutos.

El reovirus se administra en una cantidad que es suficiente para tratar el trastorno proliferativo (por ejemplo, una cantidad efectiva) . Un trastorno proliferativo es tratado cuando la administración de un reovirus a las células proliferantes afecta la lisis (por ejemplo, oncólisis) de las células afectadas, dando como resultado una reducción en el número de células anormalmente proliferantes, una reducción en el tamaño de un neoplasma, y/o una reducción en o eliminación de los síntomas (por ejemplo, dolor) asociados al trastorno proliferante. Según lo utilizado en la presente, el término oncólisis significa que al menos el 10% de las células proliferantes son lisadas (por ejemplo, al menos aproximadamente el 20%, 30%, 40%, 50%, o 75% de las células son lisadas) . El porcentaje de lisis puede determinarse, por ejemplo, midiendo la reducción en el tamaño de un neoplasma o en el número de células proliferantes en un mamífero, o midiendo la cantidad de lisis de células in vitro (por ejemplo, desde una biopsia de las células proliferantes) . Una cantidad efectiva de un virus se determinará en forma individual y puede basarse, al menos en parte, en el virus particular utilizado; el tamaño del individuo, edad, género; y el tamaño y otras características de las células anormalmente proliferantes. Por ejemplo, para el tratamiento de un ser humano, se utilizan aproximadamente 103 a 1012 unidades formadoras de placas (PFU) de un virus, dependiendo del tipo, tamaño y número de células proliferantes o neoplasmas presentes. La cantidad efectiva puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 1,0 PFU/kg de peso corporal a aproximadamente 1015 PFU/kg de peso corporal (por ejemplo, de aproximadamente 102 PFU/kg de peso corporal a aproximadamente 1013 PFU/kg de peso corporal) . Opcionalmente , la cantidad efectiva es aproximadamente lxlO8 a aproximadamente lxlO12 TCID50. Opcionalmente, la cantidad efectiva es aproximadamente lxlO10 TCID50.

A modo de ejemplo, se administra al sujeto 5-6 mg/ml minuto (AUC según lo calculado por la fórmula de Calvert) de un agente que inhibe las citoquinas proinflamatorias , tales como carboplatino, y se administra al sujeto lxlO10 TCID50 a 3xl010 TCID50 de un reovirus. Opcionalmente , el agente que inhibe las citoquinas proinflamatorias se administra como una infusión intravenosa de treinta minutos a una hora. Opcionalmente, el reovirus se administra como una infusión intravenosa de una hora.

Las dosificaciones óptimas de virus y agentes terapéuticos y composiciones que comprenden el virus y agentes dependen de una variedad de factores. La cantidad exacta requerida variará de sujeto a sujeto, dependiendo de las especies, edad, peso y condición general del sujeto, la gravedad de la enfermedad que está siendo tratada, el virus particular o vector utilizado y su modo de administración. De ese modo, no es posible especificar una cantidad exacta para toda composición. Sin embargo, una cantidad apropiada puede ser determinada por aquel con experiencia común en el arte utilizando solamente experimento de rutina dada la guía proporcionada en la presente.

Las dosificaciones efectivas y cronogramas para administrar las composiciones puede determinarse empíricamente. Por ejemplo, los modelos animales para una variedad de trastornos proliferativos pueden obtenerse de The Jackson Laboratory, 600 Main Street, Bar Harbor, Maine 04609 EEUU. Ambas ediciones directa (por ejemplo, histología de tumores) y funcional (por ejemplo, supervivencia de un sujeto o tamaño de un tumor) puede utilizarse para monitorear la respuesta a las terapias. Estos métodos incluyen el sacrificio de animales representativos para evaluar la población, incrementar los números de animales necesarios para los experimentos . La medición de la actividad luciferasa en el tumor proporciona un método alternativo para evaluar el volumen tumoral sin el sacrificio del animal y permitiendo el análisis de terapia en base a la población longitudinal .

Los intervalos - de dosificación para la administración de las composiciones son aquellos lo suficientemente grandes para producir el efecto deseado en el que los síntomas de la enfermedad son afectados. La dosificación no debe ser tan grande como para causar efectos adversos colaterales, tales como reacciones cruzadas no deseadas y reacciones anafilácticas . La dosificación puede ser ajustada por el médico del individuo en el caso de cualquier contraindicación.

Las dosificaciones varían y se administran en una o más administraciones de dosis diariamente, durante uno o varios días. Los virus y agentes terapéuticos proporcionados se administran en una única dosis o en múltiples dosis (por ejemplo, dos, tres, cuatro, seis, o más dosis). Por ejemplo, cuando la administración es por infusión, la infusión puede ser una única dosis sostenida o puede administrarse mediante múltiples infusiones. El tratamiento puede durar de varios días a varios meses o hasta que se logre la disminución de la enfermedad. Las combinaciones de los virus y agentes terapéuticos proporcionados se administran en forma concomitante (por ejemplo, como una mezcla) , en forma separada pero simultánea (por ejemplo, a través de líneas intravenosas separadas en el mismo sujeto) , o en forma secuencial (por ejemplo, uno de los compuestos o agentes se da primero seguido por el segundo) . De ese modo, el término combinación se utiliza para referirse a la administración concomitante, simultánea, o secuencial de dos o más agentes. A modo de ejemplo, el agente que inhibe las citoquinas proinflamatorias se administra previo a o al mismo tiempo que el virus oncolítico. Cuando un compuesto se administra previo a otro compuesto, el primer compuesto se administra minutos, horas, días, o semanas previas a la administración del segundo compuesto. Por ejemplo, el primer compuesto puede administrarse 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 24, 36, _ 48, 60, o 72 horas, o cualquier tiempo entre 1 y 72 horas, inclusive, previo a la administración de un segundo compuesto. Opcionalmente, el primer compuesto se administra más de 72 horas previo al segundo compuesto. A modo de otro ejemplo, el primer compuesto puede administrarse 1, 5, 15, 30, 60, 90, o 120 minutos, o cualquier tiempo entre 1 y 120 minutos, inclusive, previo a la administración de un segundo compuesto. Opcionalmente, el primer compuesto se administra 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21, o 28 días, o cualquier cantidad entre 1 y 28, inclusive, días previo a la administración del segundo compuesto. Opcionalmente, el primer compuesto se administra más de 28 días previo al segundo compuesto. Por ejemplo, el agente que inhibe las citoquinas proinflamatorias se administra de aproximadamente 1 a 8 horas previo a la administración del virus oncolítico. A modo de otro ejemplo, el agente que inhibe las citoquinas proinflamatorias se administra en un tiempo de aproximadamente una hora previo a la administración del virus oncolítico.

A modo de ejemplo, un ciclo de tratamiento incluye administrar el agente que inhibe las citoquinas proinflamatorias y el virus oncolítico incluye el día 1. En los días 2, 3, 4 y 5, solamente se administra el virus oncolítico al sujeto. Opcionalmente, el sujeto recibe múltiples ciclos de tratamiento, por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco o más ciclos de tratamiento.

El reovirus o una composición farmacéutica que comprende el reovirus son opcionalmente envasados en un kit. El kit también incluye uno o más agentes o composiciones farmacéuticas que comprenden los agentes que inhiben las citoquinas proinflamatorias . Se contempla que un kit, opcionalmente, también incluye uno o más agentes quimioterapéuticos , uno o más agentes inmunosupresores , y/o uno o más anticuerpos anti-antireovirus . Puede formularse una composición farmacéutica en una forma de dosificación unitaria. El término "formas de dosificación unitarias" se refiere a unidades físicamente discretas apropiadas como dosificaciones unitarias para sujetos humanos y otros mamíferos, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de un reovirus mutante calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con un vehículo apropiado aceptable para uso farmacéutico.

Se contempla que los métodos proporcionados pueden combinarse con otras terapias tumorales tales como quimioterapia, radioterapia, cirugía, terapia hormonal y/o inmunoterapia . De ese modo, el virus oncolítico puede administrarse en conjunción con cirugía o extracción del neoplasma. Por ello, con la presente se proporcionan métodos para el tratamiento de un neoplasma sólido que comprende la extracción quirúrgica del neoplasma y administración de un virus oncolítico en o ceca del sitio del neoplasma.

Además se contempla que las composiciones en los métodos proporcionados, opcionalmente, son administradas en conjunción con o además de compuestos anticáncer conocidos o agentes quimioterapéuticos. Los agentes quimioterapéuticos son compuestos que pueden inhibir el crecimiento de tumores. Los agentes, incluyen, pero no se limitan a 5-fluorouracil , mitomicina C, metotrexato, hidroxiurea, ciclofosfamida , dacarbazina, mitoxantrona, antraciclinas (Epirubicina y Doxurubicina) , anticuerpos de receptores, tales como herceptina, etopsida, pregnasome, terapias hormonales tales como tamoxifeno y anti-estrogenos , interferones , inhibidores de aromatasa, agentes progestacionales y análogos de LHRH.

Según lo utilizado en la presente los términos tratamiento, tratar, o mejorar se refiere a un método para reducir los efectos de una enfermedad o afección o síntoma de la enfermedad o afección. De ese modo en el método desvelado, el tratamiento puede referirse a una reducción o mejora del 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% en la gravedad de una enfermedad establecida o condición o síntoma de la enfermedad o afección. Por ejemplo, el método para tratar cáncer es considerado un tratamiento si existe una reducción del 10% en uno o más síntomas de la enfermedad en un sujeto en comparación con el control. De ese modo la reducción puede ser un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% o cualquier reducción porcentual entre 10 y 100 en comparación con niveles naturales o de control. Se entiende que el tratamiento no se refiere necesariamente a la cura o ablación de la enfermedad, afección o síntomas de la enfermedad o afección.

Según lo utilizado en la presente, las referencias a la disminución, reducción, o inhibición incluyen un cambio de 10, 20, 30, 40, 50 ,60, 70 ,80, 90 por ciento o más en comparación con un nivel de control . Los términos pueden incluir pero no necesariamente incluyen la eliminación completa.

Según lo utilizado en la presente, el término sujeto puede ser un vertebrado, más específicamente un mamífero (por ejemplo, un ser humano, caballo, cerdo, conejo, perro, oveja, cabra, primate no humano, vaca, gato, conejillo de Indias o roedor), un pez, un pájaro o un reptil o un anfibio. El término no denota una edad o sexo particular. De ese modo, se quiere que los sujetos adultos y recién nacido, macho o hembra estén cubiertos. Según lo utilizado en la presente, puede utilizarse paciente o sujeto en forma intercambiable y puede referirse a un sujeto con una enfermedad o trastorno. El término paciente o sujeto incluye sujetos humanos y veterinarios .

Se desvelan materiales, composiciones, y componentes que pueden utilizarse para, pueden utilizarse en conjunción con, pueden utilizarse en la preparación para, o son productos de los métodos y composiciones desveladas. Estos y otros materiales se desvelan en la presente, y se entiende que cuando se desvelan las combinaciones, subgrupos, interacciones, grupos, etc. de estos materiales si bien la referencia específica de cada una' de las diversas combinaciones colectivas e individuales y la variante de estos compuestos puede no estar explícitamente desvelada, cada una se contempla y se describe específicamente en la presente. Por ejemplo, si se desvela y se debate un inhibidor y se debate un número de modificaciones que pueden realizarse a un número de moléculas incluyendo el inhibidor, se contemplan específicamente toda y cada combinación y variante del inhibidor, y las modificaciones que son posibles a menos que se indique específicamente lo contrario. De la misma manera, cualquier subgrupo o combinación de los mismos también se contempla y se desvela específicamente. Este concepto se aplica a todos los aspectos de esta divulgación incluyendo, pero sin limitarse a, pasos en los métodos para utilizar las composiciones desveladas. De ese modo, si existe una variedad de pasos adicionales que pueden realizarse se entiende que cada uno de estos pasos adicionales puede realizarse con cualquier paso del método específico o combinación de pasos del método de los métodos desvelados, y que cada combinación o subgrupo de combinaciones está específicamente contemplado y debe considerarse divulgado.

A lo largo de la presente solicitud, se hace referencia a diversas publicaciones. Las divulgaciones de estas publicaciones en su totalidad son incorporadas por el presente por referencia en la presente solicitud.

Se ha descrito un número de aspectos. No obstante, se entenderá que pueden realizarse diversas modificaciones. Además, cuando se describe una característica o paso, este puede combinarse con cualquier característica o paso de la presente aún si la combinación no está explíci amente establecida.

Por consiguiente, otros aspectos están dentro del alcance de las reivindicaciones.

E emplos Ejemplo 1- Actividad ant i - tumoral del reovirus y cisplatino en el modelo de melanoma de ratón.

El reovirus tipo 3 Dearing (RV) ha demostrado actividad oncolítica en numerosos sistemas in vitro, modelos murinos in vivo y ensayos clínicos tempranos. Para fomentar estos estudios, la actividad oncolítica in vitro e in vivo del RV en combinación con cisplatino (CP) , se examinó un quimiot erapéut ico pseudoalqui lante que produce la reticulación del ADN y esta activo en un amplio intervalo de cánceres. Se ensayó el efecto del RV y CP in vitro en cuanto a la mortalidad tumoral sinergística y mecanismo de muerte tumoral. Se observó una interacción sinergística (valor del índice de combinación (CIV) menor que uno) entre RV y CP (CIV: ED50, 0,42±0,03; ED75, 0,30±0,02; ED90, 0,24±0,01) en las células B16.F10. El análisis sitométrico de flujo mostró un incremento marcado en las células apoptóticas después de la exposición combinada, en comparación con la exposición de agente úni co .

Para la evaluación ín vivo, los tumores subcutáneos B16.F10 en ratones C57B1/6 o tumores K1735 en ratones C3H fueron tratados con RV intratumoral (i.t.) y CP intraper i toneal (i.p.) como único reactivo o en combinación. Se estimó el volumen tumoral tres veces por semana. Los tumores y órganos se cosecharon después del tratamiento para la recuperación viral e histología; las muestras séricas se ensayaron en cuanto a la producción de citoquinas e inducción de anticuerpo ant i - reov rus neutralizante (NARA) . Las Figuras 1A, IB, 1C y ID muestran el crecimiento tumoral reducido y la supervivencia incrementada después de la terapia de combinación de reovirus/cisplat ino . Los ratones C57B1/6 (Figuras 1A y 1C) y C3H (Figuras IB y ID) portadores de tumores subcutáneos B16.F10 y K1735 respectivamente fueron tratados los días 1 y 4 con reovirus . como único reactivo i.t. (cuadrados) , cisplatino como único reactivo i.p. (triángulos) , o reovirus y cisplatino en combinación (círculos) . Los .ratones tratados de control (rombos) recibieron PBS . Se midieron los tumores en los días indicados y el volumen tumoral expresado como volumen tumoral respecto del volumen tumoral al comienzo del tratamiento (Figuras 1A y IB) . Los ratones se eutanizaron cuando los tumores excedieron 15mm en cualquier dimensión. Se expresó la supervivencia como diagramas de Kaplan-Myer (Figuras 1C y ID) . Estos datos muestran el crecimiento tumoral reducido y se observó el tiempo de supervivencia medio extendido en los ratones tratados con terapia de combinación de RV/CP en comparación con los tratamientos de agentes únicos (Figuras 1A, IB, 1C y ID) . Los volúmenes tumorales medios relativos +SD en día 12 fueron, control : todos alcanzaron el criterio de valoración, RV como único reactivo: 8,92+6,94, CP como único reactivo: 9,87±2,80, RV más CP: 3,86+2,24. La supervivencia media (días) fueron, control: 6, RV ·. 12, CP: 8, combinación de RV y CP: 17. El virus vivo se recuperó de los tumores de todos los animales tratados con RV solamente y del hígado y corazón de 1/6 ratones. E oposición el virus vivo se detectó en solamente el 50% de los tumores de los ratones tratados con combinación pero en el hígado de 4/6 ratones. CP no afectó la respuesta del anticuerpo anti-reovirus neutralizante (NARA) al RV (Figura 2) , pero causó ' una atenuación marcada de la producción de las citoquinas proinflamatorias al RV cuando se utilizó en combinación (Figuras 3A, 3B, 3C, 3D, 3E, 3F, y 3G) .

En resumen, estos resultados muestran que el agregado de agentes quimioterapéuticos puede potenciar significativamente la eficacia anti-tumoral de la terapia de RV. Además, una reducción en las respuestas inflamatorias virales en los órganos vitales por la quimioterapia concomitante puede permitir programas de dosificación más intensiva para incrementar la eficacia general del reovirus.

Ejemplo 2. Protocolos del reovirus y carboplatino para seres humanos .

Este es un diseño de estudio de reovirus administrado por vía intravenosa con carboplatino cada 3 semanas.

El carboplatino se administra como una infusión intravenosa de 30 minutos en una dosis calculada pro la fórmula de Calvert (AUC 5 mg/ml minuto o 6 mg/ml minuto con GFR medido por 51Cr EDTA) . El reovirus después se administra cono una infusión intravenosa de 1 hora en una dosis de lxlO10 o 3xl010 TCID50.

Los días 2 a 5, sólo se administrará el reovirus, utilizando la misma dosis y método según lo utilizado el día 1.

Tabla 2 - Métodos de dosificación Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (25)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un método para tratar un trastorno proliferativo en un sujeto, caracterizado porque comprende los pasos de: (a) administrar al sujeto uno o más reovirus; y (b) administrar al sujeto uno o más agentes que inhiben la expresión o actividad de una citoquina proinflamatoria.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se administra al sujeto aproximadamente 103 a 1012 unidades formadoras de placas (PFU) del virus oncolítico.

3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque se administra al sujeto aproximadamente 108 a 1012 unidades formadoras de placas (PFU) del virus oncolítico.

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se administra al sujeto aproximadamente 108 a 1012 TCID50 del virus oncolítico.

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se administra al sujeto aproximadamente 5 a 1000 mg/m2 del agente que inhibe las citoquinas proinflamatorias .

6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se administra al sujeto aproximadamente 0,001-10.000 mg/kg de peso corporal del agente que inhibe las citoquinas proinflamatorias .

7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se administra al sujeto 2 a 7 mg/ml minuto (AUC) del agente que inhibe las citoquinas proinflamatorias . g

8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente inhibe las citoquinas proinf lamatorias pero no inhibe la producción de anticuerpos ant i - reovirus neutralizantes (NARA) .

9. El método de conformidad con la reivindicación 10 1, caracterizado porque el agente es un compuesto de plat ino .

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el compuesto de platino se selecciona del grupo que consiste en cisplatino, 15 carboplatino y oxal iplatino .

11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque se administra al sujeto aproximadamente 175-200 mg/m2 del cisplatino.

12. El método de conformidad con la 20 reivindicación 10, caracterizado porque se administra al sujeto aproximadamente 200-600 mg/m2 del carboplatino .

13. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque se administra 25 al sujeto 5 o 6 mg/ml minuto (AUC) del carboplatino.

14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, caracterizado porque el reovirus es un reovirus de mamífero o un reovirus humano .

15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el reovirus humano se selecciona del grupo que consiste en reovirus serotipo 1, reovirus serotipo 2 y reovirus serotipo 3.

16. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el reovirus humano es reovirus serotipo 3.

17. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el reovirus humano posee N° de Acceso al IDAC 190907-01.

18. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, caracterizado porque el agente que inhibe las citoquinas proinflamatorias se administra al mismo tiempo, antes o después del reovirus.

19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el agente que inhibe las citoquinas proinflamatorias se administra al mismo tiempo que el reovirus .

20. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el agente que inhibe las citoquinas proinflamatorias se administra antes del reovirus.

21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el agente se administra de 1 a 12 horas antes del virus oncolítico.

22. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el agente se administra de 1 a 60 minutos antes del virus oncolítico.

23. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el reovirus se administra en múltiples dosis .

24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el agente que inhibe las citoquinas proinflamatorias se administra una vez.

25. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el agente que inhibe las citoquinas proinflamatorias se administra en múltiples dosis.