DE69838340T2 - Behandlung von neoplasmen mit interferonempfindlichen, klonalen viren - Google Patents

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Description

  • Fachgebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft klonale Viren, die in der Lage sind, sich selbst zu replizieren und den Tod von neoplastischen Zellen verursachen, die eine Defizienz in der Interferon (IFN)-vermittelten antiviralen Reaktion aufweisen. Diese Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung dieser Viren zur Behandlung von neoplastischen Krankheiten einschließlich Krebs und große Tumoren.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Neoplastische Erkrankungen, die Krebs miteinschließen, sind eine der häufigsten Todesursachen beim Menschen. In den USA werden jährlich über 1,3 Millionen neue Krebserkrankungen diagnostiziert und 550000 Todesfälle treten auf. Die Früherkennung von Krebs, bevor sich Metastasen ausgebildet haben, erhöht die Überlebenschancen erheblich. Eine Früherkennung ist jedoch nicht immer möglich und falls doch, sind Behandlungen unbefriedigend, insbesondere in Fällen von hochmalignen Krebsarten. Krebstherapien, einschließlich Chemotherapie und Bestrahlung, sind viel weniger wirksam in späten Stadien, insbesondere wenn die neoplastischen Wucherungen groß sind und/oder eine große Tumorlast darstellen. (Siehe Hillard Stanley, Cancer Treat. Reports, Vol. 61, No. 1, Jan/Feb 1977, S. 29-36, Tannock, Cancer Research, 42, 4921-4926, Dec. 1982).
  • Über Tumorrückbildung in Verbindung mit der Exposition gegenüber verschiedenen Viren wurde bereits berichtet. Die meisten der beschriebenen Viren, einschließlich Mumps und Masern sind pathogen für den Menschen. Die Wirkung von verschiedenen anderen Viren auf bestimmte Typen von Krebszellen wurde ebenfalls beschrieben. Smith et al, (1956) Cancer, 9, 1211 (die Wirkung des Adenovirus auf zervixkarzinome); Holzaepfel et al, (1957) Cancer, 10, 557 (die Wirkung des Adenovirus auf Epithelialtumoren); Taylor et al, (1970) J. Natl. Cancer Inst., 44, 515 (die Wirkung des bovinen Enterovirus-1 auf Sarkoma-1); Shingu et al, (1991) J. General Virology, 72, 2031 (die Wirkung des bovinen Enterovirus MZ-468 auf F-647a Leukämiezellen); Suskind et al, (1957) PSEBM, 94, 309 (Wirkung des Coxsackie B3 Virus auf HeLa Tumorzellen); Rukavishnikova et al, (1976) Acta Virol., 20, 387 (die Wirkung des Influenza A Stammes auf Aszitestumoren).
  • Die frühesten Zitate beschrieben eine teilweise Tumorregression in Patienten, die mit einem abgeschwächten viralen Lebendimpfstoff behandelt wurden, mit dem Ziel, sie gegen Pocken und Tollwut zu impfen. Siehe DePace, N.G. (1912) Ginecologia, 9, 82- 88; Salmon, P. & Baix (1922) Compt. Rend. Soc. Biol., 86, 819-820. Die Teilregression von Tumoren und die Regression von Leukämien wurden auch während natürlich auftretenden Maserninfektionen beobachtet. Siehe Pasquinucci, G. (1971) Lancet, 1, 136; Gross, S. (1971) Lancet, 1, 397-398; Bluming, A.Z. and Ziegler, J.L. (1971) Lancet, 2, 105-106. Während einer Studie, im Laufe dessen 90 Krebspatienten gezielt mit lebendem Mumpsvirus infiziert wurden, wurde eine teilweise Tumorregression in 79 Fällen beobachtet. Siehe Asada (1994) Cancer, 34, 1907-1928. Während die Nebenwirkungen dieser Viren temporär waren, so sind ernsthafte Spätfolgen der Infektion mit diesen Humanpathogenen von großem Interesse.
  • Viren werden wie folgt unterteilt [siehe Murphy A and Kingsbury DW, 1990, In: Virology, 2. Auflage (Herausg. Fields, B.N.), Raven Press, New York, Seiten 9-35]:
    Unterscheidungsmerkmale Name der Virusfamilie
    RNA Viren
    ssRNA, positiv-sense Picornaviridae, Calciviridae
    nichtsegmentiert
    ohne Hülle
    ssRNA, positiv-sense Togaviridae, Flaviviridae,
    nichtsegmentiert Coronaviridae
    mit Hülle
    ssRNA, negativ-sense Rhabdoviridae, Filoviridae,
    nichtsegmentiert Paramyxoviridae
    mit Hülle
    ssRNA, negativ-sense Orthomyxoviridae
    segmentiert
    mit Hülle
    ssRNA, ambisense Bunyaviridae, Arenaviridae
    segmentiert
    mit Hülle
    dsRNA, positiv-sense Reoviridae, Birnaviridae
    segmentiert
    ohne Hülle
    ssRNA, DNA Schritt bei Retroviridae
    Replikation
    Positiv-sense
    nichtsegmentiert
    mit Hülle
    DNA Viren
    ss/ds DNA ohne Hülle Hepadnaviridae
    ssDNA ohne Hülle Parvoviridae
    dsDNA ohne Hülle Papovaviridae, Adenoviridae
    dsDNA, mit Hülle Herpesviridae, Poxviridae,
    Iridoviridae
  • Teil der Familie der Herpesviridae (oder Herpesviren) sind die Subfamilien Alphaherpesvirus (einschließlich Genus Varicellavirus und Genus Simplexvirus), Betaherpesvirus und Gammaherpesvirus.
  • Das Newcastle Disease Virus (NDV) gehört zur Familie der Paramyxoviridae (oder Paramyxoviren). Die natürlichen Wirte des NDV sind Hühner und andere Vögel. NDV bindet an bestimmte Moleküle auf der Oberfläche der tierischen Wirtszellen, verschmilzt mit der Zelloberfläche und injiziert sein genetisches Material in den Wirt.
  • NDV ist ein zellzerstörendes Virus. Einmal innerhalb der Zelle, veranlassen die viralen Gene die Wirtszelle Viruskopien zu produzieren, was zu dem Tod der Wirtszelle führt und NDV Kopien freisetzt, die andere Zellen infizieren. Anders als von anderen Viren ist von NDV nicht bekannt, ernsthafte Krankheiten im Menschen hervorzurufen. Anders als von anderen Virusarten (z.B. HTLV-1, Hepatitis B ist von Paramyxoviren nicht bekannt, karzinogen zu sein.
  • Über eine vorübergehende Tumorregression bei einer kleinen Zahl von Patienten, die NDV ausgesetzt waren, wurde berichtet. Siehe Csatary, L.K. (1971) Lancet, 2, 825. Csatary stellte die Rückbildung von Magen-Darm-Krebs bei einem Hühnerfarmer während einer Newcastle Disease Epidemie unter seinen Hühnern fest. In einem ähnlichen anekdotenhaften Bericht, stellten Cassel, W.A. und Garrett, R.E. (1965) Cancer, 18, 863-868. die Rückbildung von primärem Gebärmutterhalskrebs, der sich auf die Lymphknoten ausgebreitet hatte, fest, nachdem NDV in den Gebärmutterhalstumor injiziert wurde. Da angenommen wurde, dass der Mechanismus der tumoriziden Wirkung immunologischer Natur ist, wurden keine Arbeiten durchgeführt, die direkte Tumortoxizität des Virus direkt zu untersuchen. Stattdessen konzentrierte man sich auf die immunmodulierenden Wirkungen von NDV. Siehe z.B.
  • Murray, D.R., Cassel, W.A., Torbin, A.H., Olowski, Z.L & Moore, M.E. (1977) Cancer, 40, 680; Cassel, W.A., Murray, D.R. & Phillips, H.S. (1983) Cancer, 52, 856; Bohle, W., Schlag, P.J., Liebrich, W., Hohenberger, P., Manasterski, M., Miller, P. and Schirrmacher, V. (1990) Cancer, 66, 1517-1523.
  • Die Auswahl eines bestimmten Virus für die Tumorregression, beruhte in den oben genannten Publikationen auf Zufall oder der Versuch und Irrtum Methode. Erst seit kurzem werden rationale, mechanismusbasierte Herangehensweisen bezüglich der Verwendung von Viren in der Krebstherapie entwickelt, indem DNA-Viren verwendet werden. Beispiele für diese Art von Ansatz finden sich in der Entwicklung von rekombinanten, adenoviralen Vektoren die sich nur in Tumoren, die aus ganz bestimmten Gewebetypen stammen, replizieren (Rodriguez, R. et al, 1997 Cancer Res., 57:2559-2563), oder denen bestimmte regulatorische Schlüsselproteine fehlen (Bischoff, J.R. et al, 1996 Science, 274:373-376). Ein weiterer aktueller Ansatz war die Verwendung eines replikationsinkompetenten, rekombinanten, adenoviralen Vektors, um eine wichtige, in bestimmen Tumorzellen verloren gegangene Proteinfunktion, wiederherzustellen (Zhang, W.W., et al, 1994 Cancer gene therapy, 1:5-13). Schließlich wurde das Herpes Simplex Virus dahingehend modifiziert, um sich bevorzugt in rasch teilenden Zellen, die charakteristisch für Tumoren sind, zu replizieren (Mineta, T., et al, 1994 Cancer Res. 54:3963-3966).
  • WO 94/25627 offenbart die Verwendung von NDV und anderen Paramyxoviren zur Behandlung von Krebs.
  • Virale IFN-Transgenexpression
  • Eine übliche Herangehensweise bei der Behandlung von Krebs mit viraler Therapeutika war die Verwendung von Virusvektoren, um bestimmte Gene in die Tumormasse zu transportieren.
  • Rekombinante Adenoviren, adenoasoziierte Viren, Vacciniaviren und Retroviren wurden allesamt modifiziert, um ein Interferongen allein oder in Kombination mit anderen Cytokingenen zu exprimieren.
  • In Zhang et al. ((1996) Proc. Natl. Acad. Sci., US 93:4513-4518) wurde ein rekombinantes Adenovirus, das in der Lage ist, ein humanes Interferonkonsensusgen (synthetisches Gen) zu exprimieren, verwendet, um humane Brustkrebstranplantate (sowie andere Fremdimplantate) in Nacktmäusen zu behandeln. Die Autoren schlussfolgerten dass „.. eine Kombination von viraler Onkolyse und einem Virus niedriger Pathogenität, das selbst resistent gegenüber IFN und IFN-Gentherapie ist, ein erfolgreicher Ansatz für die Behandlung einer Anzahl von verschiedenen Tumoren, insbesondere Brustkrebs, sein könnte." Im Gegensatz zu der vorliegenden Erfindung, die Interferon-empfindliche Viren betrifft, lehrt Zhang et al. (1996) die Verwendung eines Interferon-resistenten Andenovirus zur Behandlung von Tumoren.
  • In Zhang et al. ((1996) Cancer Gene Ther., 3:31-38) wurden adenoasoziierte Viren (AAV) die Konsensus-IFN exprimierten, verwendet, um humane Tumorzellen in vitro zu transduzieren, und sie anschließend Nackmäusen zu injizieren. Die transduzierten Tumoren formten entweder keine weiteren Tumoren mehr oder wuchsen langsamer als die nichttransduzierten Kontrollen. Ebenso resultierte das Injizieren einer transduzierten humanen Tumorzelle in die Tumormasse eines anderen nichtransduzierten Tumors in einer leichten Größenverringerung.
  • In Peplinski et al. ((1996) Ann. Surg. Oncol., 3:15-23,) wurde IFN gamma (und andere Cytokine, die entweder allein oder in Kombination exprimiert wurden) in einem Brustkrebsmodell an Mäusen getestet. Die Mäuse wurden mit Tumorzellen, die mit einem rekombinanten Vaccinia Virus viral modifiziert wurden, immunisiert. Wurden den immunisierten Mäusen erneut herkömmliche Tumorzellen injiziert, so wiesen die Mäuse mit viral modifizierten Zellen eine statistische Verlängerung der krankheitsfreien Lebensdauer auf.
  • Gast, et al. ((1992) Cancer Res., 52:6229-6236) verwendeten IFN gamma exprimierende retrovirale Vektoren um Nierenkarzinomzellen in vitro zu transduzieren. Diese Zellen zeigten eine gesteigerte Produktion von für die Funktion des Immunsystems wichtigen Proteinen.
  • Restifo et al. ((1992) J. Exp. Med., 175:1423-1431) verwendeten IFN gamma exprimierende retrovirale Vektoren um eine Maussarkomzelllinie zu transduzieren, was der der Tumorzelllinie ermöglichte, CD8+ T Zellen effizienter virale Antigene zu präsentieren.
  • Howard, et al. ((1994) Ann. NY Acad. Sci., 716:167-187) verwendeten IFN gamma exprimierende retrovirale Vektoren, um murine und humane Melanomtumorzellen zu transduzieren. Für diese Zellen wurde eine Zunahme der Expression von Proteinen, die wichtig für die Immunfunktion sind, beobachtet. Diese Zellen waren ebenfalls weniger karzinogen in Mäusen verglichen mit der nichttransduzierten Ausgangszelllinie und führten in vivo zur Aktivierung einer tumorspezifischen CTL Antwort.
  • Die Verwendung von therapeutischen Interferondosen als Hilfsmittel zur viralen Krebstherapie
  • Wegen der bekannten immunverbessernden Eigenschaften von IFN, haben verschiedene Studien die Verwendung des IFN-Proteins in Kombination mit anderen Viralimpfstoffkrebstherapien untersucht.
  • In Kirchner et al ((1995) World J. Urol., 13:171-173) wurden 208 Patienten mit autologen, NDV-modifizierten und letal bestrahlten, aus Nierenkrebszellen stammenden Tumorzellen immunisiert und parallel mit niedrigen Dosen IL-2 oder IFN alpha behandelt. Die Autoren erklärten, dass dieses Behandlungschema zu einer Verbesserung gegenüber dem natürlichen Verlauf bei Patienten mit lokal fortgeschrittenen Nierenzellkarzinomen führte. Die Dosis betrug ungefähr 3,3 × 103 bis 2,2 × 105 PFU/kg. Hierbei handelte es sich, im Gegensatz zu einem systemischen Ansatz, um eine lokale Therapie, mit dem Ziel eine Antitumorimmunantwort zu induzieren.
  • Tanaka et al. ((1994) J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol., 16:283-293), verabreichten IFN alpha zusammen mit einem rekombinanten Vaccinia Virus als ein Krebstherapieimpfmodell in Mäusen. Diese Studie zeigte eine statistische Verbesserung der Überlebensrate in Mäusen die IFN erhalten hatten, verglichen mit denjenigen die es nicht erhalten hatten. Die Autoren schrieben die Effizienz von IFN der Induktion von CD8-positiven T-Zellen in diesen Tieren zu.
  • Arroyo et al. ((1990) Cancer Immunol. Immunother., 31:305-311) verwendeten ein Mausmodell für Dickdarmkrebs, um die Wirkung einer IFN alpha und/oder IL-2 Begleittherapie auf die Wirksamkeit eines Vaccinia Virus und Dickdarmonkolysates (VCO) zur Krebsbehandlung zu testen. Es wurde festgestellt, dass die Dreifachbehandlung von VCO+IL-2+IFN in diesem Mausmodell am effizientesten war. Dieser Ansatz beruht auf Immunisierung als Mechanismus der Antitumoraktivität.
  • IFN wurde in diesen Studien verwendet, um die Erkennbarkeit der Krebszellen durch das Immunsystem zu erhöhen.
  • Intervirology (1993) 36/4 (193-214) stellt eine wissenschaftliche Abhandlung über Virustherapien zur Behandlung von Krebs zur Verfügung.
  • Proceedings of the American Association for Cancer Research Annual, Band. 36, 1995, Seite 439 enthält einen Vergleich der onkolytischen Newcastle Disease Virenstämme.
  • WO 96/26285 beschreibt Verfahren und Zusammensetzungen zur Verabreichung von Gentherapievektoren.
  • Chemical Abstract Service, DN 116:104333, & CN 1054192 A beschreiben ein Verfahren zur Vorbereitung der Induktion von Interferon im menschlichen Körper.
  • Nature, 23 August 1969, Vol 223, Seiten 844-845 beschreibt exogenes Interferon und Interferoninducer zur Behandlung von Balb/c Mäusen inokuliert mit RC19 Tumorzellen.
  • Es ist eine Aufgabe der Erfindung, Viren zur Behandlung von Krankheiten, einschließlich Krebs, bereitzustellen.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, Viren zur Behandlung von neoplastischen Krankheiten, einschließlich Krebs, bereitzustellen.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, Hilfsmittel zur Verfügung zu stellen, die es ermöglichen, geeignete Viren zur Therapie von neoplastischen Krankheiten, auszuwählen und/oder zu screenen.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, eine Anleitung für das gentechnische Bearbeiten von Viren bereitzustellen, um deren therapeutischen Nutzen zur Behandlung von neoplastischen Krankheiten zu verbessern.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, Mittel zur Verfügung zu stellen, um potentielle Zellen als Ziel für die virale Therapie zu screenen, mit dem Ziel die Empfindlichkeit für Abtöten durch Viren, der in Frage kommenden Zielzellen, festzustellen.
  • Es ist ebenso eine weitere Aufgabe der Erfindung, Richtlinien für das Management einer viralen Therapie zur Verfügung zu stellen.
  • Es ist eine Aufgabe der Erfindung, die Behandlung von großen Tumoren zu gewährleisten.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, gereinigtes Virus und Verfahren um selbigen zu erhalten, zur Verfügung zu stellen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung eines Interferon-empfindlichen, replikationskompetenten klonalen RNA Virus zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung eines Neoplasmas in einem Säuger, zur Verfügung.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft demnach die Infektion eines Neoplasmas in einem Säuger mit Virus, umfassend die Verwendung eines Interferon-empfindlichen, replikationskompetenten klonalen Virus, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus RNA Viren und den DNA Virenfamilien des Adenovirus, Parvovirus, Papovavirus und Iridovirus zur Herstellung eines Medikaments.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Behandlung eines Neoplasmas in einem Säuger mit einem Virus, umfassend die systematische Verabreichung eines Interferon-empfindlichen, replikationskompetenten klonalen Virus an den Säuger.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Behandlung eines Neoplasmas einschließlich Krebs in einem Säuger, umfassend die Verwendung einer therapeutisch effektiven Menge an Interferon-empfindlichem, replikationskompetentem klonalem Virus, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus RNA Viren und den DNA Virenfamilien des Adenovirus, Parvovirus, Papovavirus und Iridovirus zur Herstellung eines Medikaments.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Infektion eines Neoplasmas in einem Säuger mit einem Virus, umfassend die Verwendung eines Interferon-empfindlichen, replikationskompetenten klonalen Vaccinia Virus mit einer oder mehreren Mutationen in einem oder mehreren viralen Genen, welche beteiligt sind an der Hemmung der antiviralen Aktivität von Interferon, und aus der Gruppe von Genen, bestehend aus K3L, E3L und B18R ausgewählt sind, zur Herstellung eines Medikaments.
  • Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung einer therapeutischen wirksamen Menge an Interferon-empfindlichem, replikationskompetentem Vaccinia Virus mit einer oder mehreren Mutationen in einem oder mehreren viralen Genen, welche beteiligt sind an der Hemmung der antiviralen Aktivität von Interferon, und aus einer Gruppe von Genen, bestehend aus K3L, E3L und B18R, ausgewählt sind zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Neoplasmas, einschließlich Krebs, in einem Säuger.
  • Die Erfindung betrifft ebenfalls die Infektion eine Neoplasmas von wenigstens 1 cm Größe mit einem Virus in einem Säuger, umfassend die Verwendung eines klonalen, Interferon-empfindlichen Virus, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (1) RNA Viren; (2) Hepadenavirus; (3) Parvovirus; (4) Papovavirus; (5) Pockenvirus; und (6) Iridovirus zur Herstellung eines Medikaments.
  • Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge eines klonalen, Interferon-empfindlichen Virus, ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus 1) RNA Viren; (2) Hepadenavqirus; (3) Parvovirus; (4) Papovavirus; (5) Poxvirus; und (6) Iridovirus zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Neoplasmas in einem Säuger, wobei das Neoplasma mindestens 1 cm groß ist.
  • Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Interferon-empfindlichen klonalen RNA Virus, die zellzerstörend für den Tumor ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Tumors in einem Säuger, wobei der Säuger eine Tumorlast trägt, die mindestens 1,5% des Gesamtköpergewichts ausmacht.
  • Die Erfindung beschreibt ebenfalls ein Screeningverfahren für Tumorzellen oder dem Patienten frisch entnommenen Gewebe, um die Empfindlichkeit der Zellen oder des Gewebes gegenüber des Abtötens durch ein Virus, umfassend die Unterziehung der Zellen oder des Gewebes eines differentiellen Zytotoxizitätsassays unter Verwendung eines Interferon-empfindlichen Virus, zu bestimmen.
  • Die Erfindung beschreibt ebenfalls ein Verfahren zur Identifizierung eines Virus mit antineoplastischer Aktivität in einem Säuger, umfassend a) die Verwendung des Testvirus um i) Zellen die defizient in IFN-vermittelter antiviraler Aktivität sind und ii) Zellen die kompetent in IFN-vermittelter antiviraler Aktivität sind, zu infizieren, und b) um zu bestimmen ob das Testvirus bevorzugt die Zellen, die defizient in IFN-vermittelter antiviralen Aktivität sind, abtötet und nicht die Zellen die kompetent in IFN-vermittelter antiviraler Aktivität sind.
  • Die Erfindung beschreibt ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung von Viren zur Verwendung in der antineoplastischen Therapie umfassend: a) Modifizieren eines existierenden Virus durch Abschwächung oder Entfernung eines viralen Mechanismus zur Inaktivierung der antiviralen Wirkungen des IFN und optional b) Entwerfen einer abschwächenden Mutation, die in einer niedrigeren Virulenz als die des genannten Virus resultiert.
  • Die Erfindung beschreibt ebenfalls ein Verfahren zur Kontrolle der Virusreplikation in Säugern, die mit Viren behandelt wurden, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus RNA Viren, Adenoviren, Pockenviren, Iridoviren, Parvoviren, Hepadnaviren und Varicellaviren, umfassend die Verabreichung eines antiviralen Präparates.
  • Die Erfindung betrifft ebenfalls die Behandlung oder Infektion eines Neoplasmas in einem Säuger umfassend die Unterziehung einer Probe (z.B. Serum, Tumorzellen, Tumorgewebe, Tumorschnitt) eines Säugers einem Immunoassay zur Detektion der Menge an anwesendem Virusrezeptor, um zu bestimmen, ob das Neoplasma es dem Virus ermöglichen wird zu binden und die Zytolyse zu verursachen, und falls der Rezeptor vorhanden ist, ein Interferon-empfindliches, replikationskompetentes klonales Virus zu verwenden, das an den Rezeptor bindet, zur Herstellung eines Medikaments.
  • Die Erfindung betrifft ebenfalls die Infektion eines Neoplasmas in einem Säuger mit einem Virus, umfassend die systemische Verabreichung einer desensibilisierenden Dosis eines Interferon-empfindlichen, replikationskompetenten klonalen Virus an den Säuger.
  • Die Erfindung betrifft ebenfalls die Infektion eines Neoplasmas in einem Säuger mit einem Virus, umfassend die Verabreichung eines Interferon-empfindlichen, replikationskompetenten klonalen Virus über einen Zeitraum von mindestens 4 Minuten.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Infektion eines Neoplasma in einem Säuger mit einem Virus umfassend die Verabreichung eines replikationskompetenten klonalen Virus, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus dem Newcastle Disease Virusstamm MK 107, Newcastle Disease Virusstamm NJ Roakin, Sindbis Virus und Vesicular Stomatitis Virus.
  • Die Erfindung schließt mit ein:
    • i) ein Paramyxovirus aufgereinigt über Ultrazentrifugation ohne Pelletieren;
    • ii) ein Paramyxovirus aufgereinigt bis zu einem Gehalt von mindestens 2 × 109 PFU pro mg Protein;
    • iii) ein Paramyxovirus aufgereinigt bis zu einem Gehalt von mindestens 1 × 1010 PFU pro mg Protein;
    • iv) ein Paramyxovirus aufgereinigt bis zu einem Gehalt von mindestens 6 × 1010 PFU pro mg Protein;
    • v) ein RNA Virus aufgereinigt bis zu einem Gehalt von mindestens 2 × 109 PFU pro mg Protein;
    • vi) ein RNA Virus aufgereinigt bis zu einem Gehalt von mindestens 1 × 1010 PFU pro mg Protein;
    • vii) ein RNA Virus aufgereinigt bis zu einem Gehalt von mindestens 6 × 1010 PFU pro mg Protein;
    • viii) ein zellzerstörendes DNA Virus, das Interferon-empfindlich ist und bis zu einem Gehalt von mindestens 2 × 109 PFU/mg Protein aufgereinigt ist;
    • ix) ein replikationskompetentes Vaccinia Virus mit a) einer oder mehr Mutationen in einem oder mehreren der K3L, E3L und B18R Genen und b) einer abschwächenden Mutation in einem oder mehreren der Gene die für Thymidinkinase, Ribonukleotidreduktase, Vacciniawachstumsfaktor, Thymidylatkinase, DNA-Ligase, dUTPase kodieren;
    • x) ein replikationskompetentes Vaccicinia Virus mit einer oder mehr Mutationen in zwei oder mehr Genen aus der Gruppe bestehend aus K3L, E3L und B18R;
    • xi) ein Herpesvirus mit einer Modifikation in der Expression des (2'-5')A Analogs, wodurch das Herpesvirus eine erhöhte Interferonempfindlichkeit aufweist und
    • xii) ein Reovirus mit einer abschwächenden Mutation in Omega 3, wodurch das genannte Virus Interferon-empfindlich wird.
  • Ebenfalls in die Erfindung miteingeschlossen sind folgende Verfahren:
    • i) ein Verfahren zur Aufreinigung eines RNA Virus, das folgende Schritte umfasst: a) Erzeugen eines klonalen Virus und b) Aufreinigen des klonalen Virus durch Ultrazentrifugation ohne Pelletieren, oder c) Aufreinigen des Virus über tangentiale Flow-Filtration mit oder ohne anschließender Gelpermeationschromatographie und
    • ii) ein Verfahren zur Aufreinigung eines Paramyxovirus, umfassend die Aufreinigung des Virus über Ultrazentrifugation ohne Pelletieren oder über tangentiale Flow-Filtration mit oder ohne anschließender Gelpermeationschromatographie.
  • Die Erfindung betrifft ebenfalls die Behandlung einer Krankheit in einem Säuger, wobei die erkrankten Zellen Defekte in der Interferon-vermittelten antiviralen Antwort aufweisen, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Interferon-empfindlichen, replikationskompetenten klonalen Virus an den Säuger.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt die Wirkung eines Antiinterferon-beta-Antikörpers auf virale Antigenexpression und den infektiösen Titer in NHEK (normale humane Epithelkeratinozyten) Zellen.
  • 2 zeigt die Wirkung von Interferon beta auf die virale Antigenexpression in verschiedenen Zellen (normale humane Hautfibroblasten CCD922-sk) and zwei Typen von Kopf- und Halskarzinomzellen (KB und Hep2 Zellen).
  • 3A zeigt die Wirkung von Interferon auf virale Antigenexpression in CCD922-sk Zellen
  • 3B zeigt die Wirkung von Interferon auf virale Antigenexpression in KB Zellen.
  • 4 zeigt die Kurven der Überlebsensrate für thymuslose Mäuse, die humane ES-2 Eierstockkrebszellen in sich tragen und die entweder mit Kochsalzlösung oder dem NDV Stamm PPMK107 behandelt wurden.
  • 5 zeigt die Interferonempfindlichkeit einer Anzahl humaner Tumor- und normaler Zelllinien.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Auffinden eines neuen Mechanismus, wobei durch virale Replikation selektiv neoplastische Zellen, die eine Defizienz in einer Interferon (IFN) vermittelten antiviralen Antwort aufweisen, abgetötet werden. Diese Erfindung stellt ebenfalls Verfahren für die Selektion, Design, Aufreinigung und die Verwendung von Viren zur Behandlung von neoplastischen Krankheiten, einschließlich Krebs und großen Tumoren, zur Verfügung. Die Viren der Erfindung replizieren sich selektiv in neoplastischen Zellen und töten diese neoplastischen Zellen, basierend auf der selektiven Defizienz einer IFN-vermittelten antiviralen Antwort in diesen Zellen. Die Verabreichung einer geeigneten Virendosis resultiert im Absterben neoplastischer Zellen, während normale Zellen, die eine intakte IFN-vermittelte antivirale Antwort besitzen, die Virusreplikation beschränken und nicht abgetötet werden.
  • Miteingeschlossen in das Gebiet der Erfindung ist die Verwendung von Paramyxoviren wie NDV und anderen Viren zur Behandlung von Krankheiten einschließlich einer neoplastischen Erkrankung wie Krebs. Die Erfindung lehrt das Screening und das gentechnische Bearbeiten von anderen Viren, geeignet, um zur Therapie von neoplastischen Krankheiten verwendet zu werden. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung umfasst eine Verfahren zur Identifikation von Tumorgewebe die als Kandidaten für die virale Therapie in Frage kommen. Schließlich beschreibt die Erfindung die Herstellung von hochreinen Viren.
  • Grundprinzip für die Verwendung von Interferon-empfindlichen Viren, einschließlich NDV, zur Behandlung neoplastischer Erkrankungen.
  • NDV zeigt ein selektives Abtöten von Tumorzellen
  • Das Newcastle Disease Virus verursacht selektive zytotoxische Effekte gegen viele humane Tumorzellen mit deutlich weniger Auswirkungen auf die meisten normalen humanen Zellen. In einem differenziellen Zytotoxizitätsassay wurde festgestellt, dass humane Krebszellen die von Sarkomen, Melanomen, Brustkarzinomen, Eierstockkarzinomen, Blasenkarzinomen, Dickdarmkarzinomen, Prostatakarzinomen, Kleinzell- und Nichtkleinzelllungenkarzinomen und Glioblastomen stammen, um 3 bis 4 Größenordnungen empfindlicher gegenüber NDV waren, als viele normale humane Zellen [Nierenepithelzellen, Fibroblasten, Keratinozyten, Melanozyten, und Endothelzellen (siehe Beispiel 1)]. Das differentielle Zytotoxizitätsassay kann ebenfalls an frischen Isolaten aus Zellen oder Tumorgewebe des Patienten angewendet werden. Ein in vitro Assay, wie in Beispiel 1 beschreiben, wird verwendet um die tumorizide Aktivität von NDV zu bestimmen. Das Assay misst die Menge an Virus die notwendig ist, um 50% der getesteten Zellkultur in einem Zeitraum von 5 Tagen abzutöten. Die Beispiele 2 und 3 zeigen die Ergebnisse von in vivo Experimenten, wo thymuslosen Mäusen, die humane Tumorfremdtransplantate in sich trugen, Viren entweder über den intratumoralen (Beispiel 2) oder intravenösen (Beispiel 3) Weg verabreicht wurden. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass NDV die Regression einer Auswahl humaner Tumortypen in einem Standardtiermodell, geeignet zum Testen von möglichen chemotherapeutischen Wirkstoffen, verursachen kann.
  • Einen Beweis, dass NDV sich spezifisch innerhalb des Tumors repliziert, wurde durch immunhistochemisches Färben von Virusantigen, erbracht (Beispiel 2). Innerhalb von 30 Minuten nach intratumoraler Virusinjektion, war das Tumorgewebe negativ für virales Antigen. Zwei Tage nach Behandlung jedoch, wurde deutliche Immunfärbung für virales Antigen innerhalb des Tumors gesehen, was auf Virusreplikation im Tumor hinweist. Bedeutenderweise war die Virusreplikation spezifisch für das Tumorgewebe, da das benachbarte Bindegewebe und Haut Virusantigen-negativ waren.
  • Bedeutenderweise ist die effiziente Replikation von NDV entscheidend für die Fähigkeit des Virus, infizierte Zellen abzutöten, wie in Studien, unter Verwendung eines UV- inaktivierten, nichtklonalen Virus, demonstriert wurde (Lorence, R., et al, 1994 J Natl Cancer Inst, 86:1228-1233).
  • NDV kann ebenfalls die Regression von großen Tumoren nach intratumoraler und intravenöser Verabreichung verursachen. (Beispiele 4 bis 9). Intratumorale NDV Behandlung von großen intradermalen A375 humanen Melanomfremdtransplantaten (≥ 10 mm maximale Größe; Tumorvolumen ≥ 300 mm3) in thymuslosen Mäusen ergab hohe Tumorregressionsraten (Beispiele 4 bis 8). Intravenöse NDV Behandlung von großen subkutanen HT1080 humanen Fibrosarkomafremdtransplantaten (≥ 10 mm maximale Größe) in thymuslosen Mäusen führte zur kompletten oder teilweisen Tumorregression in fünf von sechs Mäusen (Beispiel 9).
  • Die Klasse I Interferonfamilie der Cytokine sind wichtige negative Modulatoren der viralen Infektion
  • Die Klasse I Interferone bestehen aus IFNα, hauptsächlich in Zellen hämatopoietischen Ursprungs vorkommend und IFNβ, hauptsächlich vorkommend in Fibroblasten und Epithelzellen. [Joklik, W.K. 1990. Interferons. Seiten 383-410. Virology, zweite Auflage, Herausg. B.N. Field, D.M. Knipe et al, Raven Press Ld., New York, and Sreevalsan, T. 1995. Biological Therapy with Interferon-α and β: Preclinical Studies. Seiten 347-364. Biologic Therapy of Cancer, zweite Auflage, Herausg. V.T. DeVita, Jr., S. Hellman und S.A. Rosenber, J.B. Lippincott Company, Philadelphia.] Beide IFN Typen funktionieren anscheinend über einen gemeinsamen Wirkmechanismus, der die Degradierung von doppelsträngigen RNA-Intermediaten der viralen Replikation und die Inhibierung der zellulären Translation durch die Aktivität einer Proteinkinase, die durch doppelsträngige RNA aktiviert ist, einschließt. (Joklik, W.K. 1990. Interferons. Seiten 383-410. Virology. Zweite Auflage, Herausg. B.N. Fields, D.M. Knipe et al., Raven Press Ltd., New York; und darin enthaltene Referenzen). Mehrere Viren (Influenza, EBV, SV40, Adenovirus, Vaccinia) haben Mechanismen entwickelt, durch die einer oder mehrere Pfade des IFN Systems inaktiviert werden, um eine effiziente Replikation des Virus zu ermöglichen (Katze, M.G. 1995. Trends in Microbiol. 3:75-78).
  • Eine breite Auswahl von Tumorzellen ist defizient in der Fähigkeit die virale Infektion durch einen IFN-abhängigen Mechanismus zu begrenzen
  • Humane Zervixkarzinomzellen (HeLa) waren über dreihundertmal weniger empfindlich für die Inhibierung einer Vesicular Stomatitis Virusreplikation, die auf eine Vorbehandlung mit IFN folgte, als eine nichttransformierte Fibroblastenkontrollzelllinie. (Maheshwari R.K., 1983. Biochem, Biophys. Res. Comm. 17:161-168). Die Erfinder fanden heraus, dass die Infektion einer Kokultur von humanen Kopf- und Halskarzinomzellen (KB) aus Tumormaterial und normalen humanen Hautfibroblastenzellen (CCD922-sk zunächst zu viraler Replikation in beiden Zelltypen führt, gefolgt von einer Begrenzung der Infektion in den normalen Zellen gegenüber der fortdauernden Replikation und Abtöten der Tumorzellen (Beispiel 10). Ferner, obwohl bei normalen Zellen IFN in das Kulturmedium sekretiert wurde, waren die Tumorzellen nicht in Lage auf die IFN-Konzentrationen, die produziert wurden, um einen antiviralen Zustand zu etablieren, zu reagieren. Weitere Beweise für die Rolle des IFN in der unterschiedlichen Empfindlichkeit gegenüber dem Abtöten durch NDV von Tumorzellen verglichen mit normalen Zellen, wurde in zwei getrennten Experimenten erhalten, in denen für normale Fibroblastenzellen (CCD922-sk) oder normale Epithelkeratinozytenzellen (NHEK) gezeigt wurde, dass sie in der Anwesenheit eines IFN neutralisierenden Antikörpers empfindlich für eine Infektion mit NDV wurden (Beispiele 11 und 12). Schließlich, zeigte die parallele Infektion von normalen Fibroblasten (CCD922-sk) und humanen Tumorzellen (KB) in der Anwesenheit von IFN, dass die normalen Zellen wenigsten 100-mal empfindlicher gegenüber antiviralen Wirkungen von hinzugefügtem IFN als die Tumorzellen waren (Beispiele 13 und 14). Eine ähnliches Testen einer Anzahl von Tumorzelllinien (insgesamt 9) zeigte ein eindeutige Korrelation in der relativen Empfindlichkeit einer Zellline von NDV abgetötet zu werden und der Unfähigkeit einer Zelllinie eine Interferon-vermittelte antivirale Antwort zu zeigen (Beispiel 26).
  • Interferon und Zellwachstum
  • Es gibt mehrere Spezies von Interferon (IFN), einschließlich natürlicher und rekombinanter Formen von α-IFN, β-IFN, ω-IFN und γ-IFN als auch synthetischer Konsensusformen (z.B. beschrieben in Zhang et al. (1996) Cancer Gene Therapy, 3:31-38). Zusätzlich zu den antiviralen Aktivitäten, die zu seiner Entdeckung führten, ist von IFN mittlerweile bekannt, eine wichtige Rolle in der normalen Regulation von Zellwachstum und -differenzierung zu spielen. IFN wird als negativer Wachstumsregulator betrachtet und für mehrere Schlüsselproteine, die in die Funktion und Regulation der IFN Aktivität involviert sind, wurde gezeigt, dass sie als Tumorsupressorproteine in normalen Zellen wirken. (Tanaka et al, 1994 Cell 77:829-839). Außerdem wurde für mehrere weitere Proteine, von denen bekannt ist, dass sie der antiviralen Aktivität von IFN entgegenwirken, gezeigt, dass sie onkogenes Potential haben, wenn sie nicht korrekt exprimiert werden (siehe unten, Barber, GN, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4278-4282). Für Zellen die von einer Anzahl von humanen Krebsarten stammen, zeigte sich, dass Gene die für IFN kodieren, deletiert waren (James, CD, et al, 1991, Cancer Res., 51:1684-1688) und partieller oder kompletter Verlust der IFN Funktion wurde beobachtet in humanen Gebärmutterhalskarzinomen (Petricoin, E, et al, 1994 Mol, Cell. Bio., 14:1477-1486) bei chronischer lymphozytärer Leukämie (Xu, B., et al, 1994, Blood, 84:1942-1949) und malignen Melanomzellen, (Linge, C., et al, 1995, Cancer Res., 55:4099-4104).
  • Für die IFN-induzierbare Proteinkinase (p68) wurde gezeigt, dass diese ein wichtiger Regulator von zellulärer und viraler Proteinsynthese ist. Eine Korrelation zeichnete sich ab, die die Expression oder Aktivität der p68 Kinase mit dem zellulären Differenzierungszustand verbindet. Daher sind schwach ausdifferenzierte Zellen, wie sie in vielen Krebsarten vorkommen, defizient in ihrer p68 Funktion. (Haines, G.K., et al, 1993 Virchows Arch B Cell Pathol. 63:289-95). Zellen mit fehlender p68 Aktivität sind generell empfindlicher gegenüber viral vermitteltem Abtöten, da die p68 Kinase ein wichtiger Effektor des IFN-induzierbaren viralen Zustandes ist. Die antivirale Aktivität von p68 kann durch eine direkte Interaktion mit einem zellulären Protein, das als p58 identifiziert wurde, antagonisiert werden. Wenn in NIH3T3 Zellen kloniert und überexprimiert, so veranlasst p58 die Zellen, einen transfomierten Phänotyp und fixierungsunabhängiges (anchorage-independent) Wachstum zu zeigen (Barber GN et al., 1994 Proc Natl Acad Sci USA 91:4278-4282) und für eine Anzahl von humanen Leukämiezelllinien wurde gezeigt, dass sie p58 Protein überexprimieren (Korth MJ, et al., 1996 Gene 170:181-188). Die Empfindlichkeit gegenüber viralem Abtöten in nicht ausdifferenzierten Zellen kann durch die Induktion eines differenzierteren Phänotyps umgekehrt werden (Kalvakolanu, DVR und Sen, G.C. 1993 Proc Natl Acad Sci USA 90:3167-3171).
  • Definitionen
  • Zellen die kompetent in einer Interferon-vermittelten antiviralen Antwort sind.
  • Wie hierin verwendet, meint der Begriff „Zellen die kompetent in einer Interferonvermittelten antiviralen Antwort sind" Zellen, die auf niedrige Konzentrationen (z.B. 10 Units pro ml) von exogenem Interferon reagieren, indem sie signifikant die Replikation eines Interferon-empfindlichen Virus reduzieren (wenigstens 10-fach, insbesondere wenigstens 100-fach, bevorzugt wenigstens 1000-fach und besonders bevorzugt wenigstens 10000-fach), verglichen mit der Abwesenheit von Interferon. Der Grad der Virusreplikation wird bestimmt durch Messen der Virusmenge (z.B. infektiöses Virus, virales Antigen, virale Nukleinsäure). Normale CCD922 Fibroblasten sind Zellen, die kompetent für eine Interferon-vermittelte antivirale Antwort sind.
  • Zellen die defizient in einer Interferon-vermittelten antiviralen Antwort sind.
  • Wie hierin verwendet, meint der Begriff „Zellen die defizient in einer Interferon-vermittelten antiviralen Antwort sind" Zellen, die nicht den oben gelisteten Kriterien für eine Zelle, die kompetent in einer Interferon-vermittelten antiviralen Antwort ist, entsprechen, was heißt, sie sind nicht in der Lage auf niedrige Konzentrationen (z.B. 10 Units pro ml) von exogenem Interferon, indem sie die Replikation eines Interferon-empfindlichen Virus signifikant reduzieren, zu reagieren, verglichen mit der Abwesenheit von Interferon. KB Mundhöhlenkarzinomzellen sind Zellen, die defizient sind in einer Interferonvermittelten antiviralen Antwort.
  • Klonal.
  • Die Verwendung des Begriffs „klonales" Virus ist nachstehend definiert als Virus, das von einem einzelnen infektiösen Viruspartikel abgeleitet ist und wofür individuelle molekulare Klone eine signifikante Nukleinsäurensequenzhomologie haben. Die Sequenzhomologie ist z.B. so festgelegt, dass bei wenigstens acht individuellen molekularen Klonen von einer Population von Virionen die Sequenzhomologie größer als 95%, insbesondere größer als 97%, bevorzugt größer als 99% und besonders bevorzugt 100% bei 300 zusammenhängenden Nukleotiden ist.
  • Zellzerstörend.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „zellzerstörendes" Virus auf ein Virus das Zellen infiziert, was deren Tod zur Folge hat.
  • Desensibilisierende Dosis.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „desensibilisierende Dosis" auf die Menge an Virus die benötigt wird, um die Nebenwirkungen von nachfolgenden Virusdosen zu verringern.
  • Differenzielles Zvtotoxizitätsassay.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „differenzielles Zytotoxizitätsassay" zum Screenen von Tumorzellen oder Gewebe unter Verwendung eines Virus auf (a) die Virusinfektion von Tumorzellen und eine oder mehr Kontrollzellen oder Gewebe; (b) eine Bestimmung von Zellviabilität oder -tod für jede Probe (zum Beispiel durch die Verwendung eines Farbindikators für Zellviabilität wie in Beispiel 1) ausgeführt an einem oder mehreren Tagen nach Infektion; und (c) basierend auf den Ergebnissen, auf eine Abschätzung der Empfindlichkeit (zum Beispiel, die IC50 Bestimmung, der Virusprobe verglichen mit der (den) Kontrolle(n) wie in Beispiel 1) ausgeführt).
  • Infektion eines Neoplasmas.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Infektion eines Neoplasmas" auf das Endringen der viralen Nukleinsäure in die neoplastischen Zellen oder Gewebe.
  • Interferon-empfindlich.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet der Ausdruck „Interferonempfindliches" Virus (z.B. NDV) ein Virus, das sich in der Anwesenheit von Interferon signifikant weniger repliziert (wenigstens 10fach weniger, insbesondere wenigstens 100fach weniger, besonders bevorzugt wenigstens 100fach weniger und besonders bevorzugt wenigstens 10000fach weniger), verglichen mit der Abwesenheit von Interferon. Dies wird bestimmt durch das Messen der Virusmenge (z.B. infektiöses Virus, virales Antigen, virale Nukleinsäure) erhalten aus Zellen, die kompetent sind in einer Interfereon-vermittelten antiviralen Antwort in der Anwesenheit oder Abwesenheit von niedrigen Konzentrationen an exogenem Interferon (z.B. 10 Units pro ml).
  • Neoplasma und Neoplastische Krankheit.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet „Neoplasma" das neue Wachstum von Gewebe, einschließlich Tumoren, gutartige Wucherungen (z.B. Kondylome, Papillome) und bösartige Wucherungen (z.B. Krebs). Wie hierin verwendet, bezieht sich „neoplastische Krankheit" auf eine Krankheit, die sich durch die Anwesenheit eines Neoplasmas offenbart.
  • Replikationskompetent.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „replikationskompetent" auf ein Virus, das infektiöse Nachkommen in neoplastischen Zellen produziert.
  • Im Wesentlichen frei von kontaminierenden Eiproteinen.
  • Der Begriff „im Wesentlichen frei von kontaminierenden Eiproteinen" bezieht sich auf einen Virusreinheitsgrad, bei dem Ovalbumin nicht nachweisbar in einem vom Fachmann durchgeführten Westernblot ist durch (1) Verwenden von 1,7 × 109 PFU Virus pro Vertiefung (3,3 cm Durchmesser) gelaufen auf einem SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese) Gel (1 mm dick); (2) Transferieren der viralen Proteine von dem Gel auf eine Nitrocellulosemembran und (3) Immunfärbung für Ovalbumin unter Verwendung eines Kaninchenantiovalbumins [Kaninchen IgG Fraktion bei 1:2000 Verdünnung einer 4mg/ml Antikörperkonzentration (von Cappel, Inc) oder äquivalentem polyklonalem Antikörper].
  • Therapeutisch wirksame Menge.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „therapeutisch wirksame Menge", wenn bezogen auf die Behandlung von neoplastischen Krankheiten, auf die Menge an Virus, das die gewünschte Wirkung hervorruft, z.B. Einstellen des neoplastischen Wachstums, Tumorregression, verbesserte klinische Zustände und gesteigerte Überlebensraten.
  • Bestandteile der Erfindung
  • Eine Gruppe von unterschiedlichen Viren wird verwendet, um selektiv neoplastische Zellen abzutöten. Natürliche oder modifizierte Viren können als antineoplastische Agentien funktionieren. Diese Viren i) infizieren neoplastische Zellen, was zu deren Tod führt; ii) sind replikationskompetent in den neoplastischen Zellen; und iii) töten im normalen Zellen durch die antiviralen Wirkungen von Interferon nur begrenzt ab.
  • In einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung, induzieren die Viren, die die oben genannten drei Merkmale besitzen [(i) sie infizieren neoplastische Zellen, was zu dern Tod führt; (ii) sie sind replikationskompetent in neoplastischen Zellen; und (iii) sie töten normale Zellen durch die antiviralen Wirkungen von Interferon nur begrenzt ab], Interferon.
  • In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung, verursachen die Viren, die die oben genannten drei Merkmale besitzen, die Regression von humanen Neoplasmen; und/oder werden in der humanen Zielpopulation aufgrund der Anwesenheit von bereits existierender Immunität nicht neutralisiert.
  • In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform, sind die Viren, die die oben genannten drei Merkmale besitzen, zellzerstörend für Tumorzellen.
  • Ein Paramyxovirus (wie hierin verwendet, bezieht sich „Paramyxovirus" auf ein Mitglied der Paramyxoviridae) kann gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um ein Neoplasma einschließlich eines großen Tumors oder einen Wirt mit einer hohen Tumorlast zu behandeln. Die Familie der Paramyxoviridae umfasst drei Gattungen: (1) Paramyxoviren; (2) masernartige Viren (Morbilliviren); und (3) Respiratorische Synzytial-Viren (Pneumoviren). Diese Viren enthalten ein RNA Genom. Die Verwendung von Paramyxoviridaeviren die zellzerstörend sind, speziell Paramyxoviren, z.B. Newcastle Disease Virus („NDV") und andere aviäre Paramyxoviren wie der aviäre Paramyxovirus Typ 2 ist ein vorteilhaftes Verfahren um die Erfindung durchzuführen. Abgeschwächte Stämme dieser Viren sind besonders nützlich für die Behandlung von Neoplasmen gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • NDV ist ein besonders vorteilhaftes Virus gemäß der vorliegenden Erfindung. NDV wird in drei verschiedene Klassen eingeteilt, gemäß seiner Auswirkungen auf Hühner und Hühnerembryonen. „Niedrige Virulenz" Stämme werden als lentogen bezeichnet und benötigen 90 bis 150 Stunden um Hühnerembryonen mit der minimalen letalen Dosis (MLD) zu töten; „moderate Virulenz" Stämme werden als mesogen bezeichnet und benötigen 60 bis 90 Stunden um Hühnerembryonen mit der MLD zu töten; „hohe Virulenz" Stämme werden als velogen bezeichnet und benötigen 40 bis 60 Stunden um Hühnerembryonen mit der MLD zu töten. S. auch z. B. Hanson und Brandly, 1955 (Science, 122:156-157), und Daridiri et al., 1961 (Am. J. Vet. Res., 918-920). Alle drei Klassen sind nützlich, vorteilhafterweise mesogene NDV Stämme wie Stamm MK107, Stamm NJ Roakin und Stamm Connecticut-70726. (siehe Beispiele 21-23). Siehe, z.B. Schloer und Hanson, 1968 (J. Virol., 2:40-47) für eine Auflistung weiterer mesogener Stämme.
  • Es ist erstrebenswert ein klonales Virus zu erhalten, um die genetische Homogenität eines bestimmten Virusstammes zu gewährleisten oder zu verbessern und fehlerhafte interferierende Partikel zu entfernen. Das Entfernen von fehlerhaften interferierenden Partikeln durch Klonen ermöglicht eine höhere Reinheit des Endproduktes, was durch die Anzahl sämtlicher Viruspartikel pro infektiösem Partikel (z.B. die Partikelzahl pro PFU) bestimmt werden kann.
  • Klonale Viren können gemäß jeglicher Verfahren, die dem Fachmann zugänglich sind, hergestellt werden. So wird z.B. Plaqueaufreinigung routinemäßig verwendet, um klonale Viren zu erhalten. Siehe z.B. Maassab et al., In: Plotkin und Mortimer, Herausg. Vaccines. Philadelphia: W.B. Saunders Co., 1994, Seiten 78-801. Eine dreifache Plaqueaufreinigung ist besonders wünschenswert, wobei ein Plaque mit den wünschenswerten Merkmalen, wie bevorzugte Größe, Form, Erscheinung oder als Repräsentant des parentalen Virenstammes in jeden Reinigungsgang selektiert wird. Ein weiteres Mittel zur Erzeugung von klonalen Viren ist durch rekombinante DNA-Techniken, anzuwenden von einem Fachmann. Eine weiteres Mittel, um ein klonales Virus zu erhalten, verwendet die Technik der limitierenden Verdünnung (z.B. durch Hinzufügen von Virusprobenverdünnungen, um einen Mittelwert von einer oder weniger infektiösen Viruspartikeln pro Vertiefung, die eine Monoschicht einer suszeptiblen Zelle enthält, zu haben).
  • In einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung, wird aufgereinigtes Virus verwendet um neoplastische Krankheiten zu behandeln. Ein vorteilhaftes Verfahren zur Aufreinigung für aus Eiern gewonnene Viren ist die folgende (das Virus wird während keinem Verfahrensschritt pelletiert):
  • Reinigungserfahren A
    • a) Erzeugen eines klonalen Virus (z.B. durch Plaqueaufreinigung)
    • b) Inokulieren von Eiern mit dem klonalen Virus
    • c) Inkubieren der Eier
    • d) Kühlen der Eier
    • e) Ernten der Allantoisflüssigkeit aus den Eiern
    • f) Entfernen der Zelltrümmer aus der Allantoisflüssigkeit
    • g) Ultrazentrifugation der Allantoisflüssigkeit ohne Pelletieren (z.B. unter Verwendung eines diskontinuierlichen Sucrosegradienten)
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung, beinhalten zusätzliche Schritte, die nach dem Entfernen der Zelltrümmer, hinzugefügt wurden:
    • • Einfrieren und dann Auftauen der Allantoisflüssigkeit
    • • Entfernen von kontaminierendem Material aus der Virussuspension (z.B. mittels Zentrifugation)
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung, wird die Ultrazentrifugation mittels einer continous-flow-Ultrazentrifugation durchgeführt.
  • Eine Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung eines replikationskompetenten DNA Virus, folgende Schritte:
    • a) Erzeugen klonalen Virus und
    • b) Reinigung des Virus durch Ultrazentrifugation ohne Pelletieren
  • Eine andere Anwendungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung eines Paramyxovirus (z.B. NDV) und umfasst die Reinigung des Virus durch Ultrazentrifugation ohne Pelletieren.
  • Optional umfasst der Reinigungschritt vor der Ultrazentrifugation:
    • a) Plaqueaufreinigung, um ein klonales Virus zu generieren
    • b) Inokulieren von Eiern mit dem klonalen Virus
    • c) Inkubieren der Eier
    • d) Kühlen der Eier
    • e) Ernten von Allantoisflüssigkeit aus den Eiern
    • f) Entfernen der Zelltrümmer aus der Allantoisflüssigkeit
  • Eine weitere Anwendungsform der Erfindung betrifft ein Reinigungsverfahren für einen replikationskompetenten klonalen Virus aus Eiern und umfasst den Ultrazentrifugationschritt ohne einen Schritt, bei dem das Virus pelletiert wird.
  • Eine weitere Anwendungsform der Erfindung betrifft ein Reinigungsverfahren für einen Paramyxovirus (z.B. NDV) und umfasst die Reinigung des Virus über sequentielle tangentiale Flow-Filtration (TFF).
  • Optional, kann das Virus zusätzlich über Gelpermeationschromatographie aufgereinigt werden, wobei jeder dieser Schritte in der Anwesenheit eines stabilisierenden Puffers stattfindet (Beispiel 15):
    • a) Plaque-Reinigung um ein klonales Virus zu erzeugen
    • b) Inokulieren von Eiern mit dem klonalen Virus
    • c) Inkubieren der Eier
    • d) Kühlen der Eier
    • e) Ernten von Allantoisflüssigkeit aus den Eiern und Verdünnen der
    • Allantoisflüssigkeit mit Puffer
    • f) Entfernen der Zelltrümmer aus der Allantoisflüssigkeit
    • g) Reinigung des Virus über TFF und
    • h) Reinigung des Virus über Gelpermeationschromatographie
  • Optional kann das nach der Gelpermeationschromatographie erhaltenen Virus durch Verwendung von TFF aufkonzentriert werden.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft die Reinigung eines replikationskompetenten klonalen Virus aus Eiern oder Zellkultur, umfassend den Schritt zur Reinigung des Virus über tangentiale Flow-Filtration (TFF), optional gefolgt von Gelpermeationschromatographie, optional gefolgt von TFF, um das Virus aufzukonzentrieren.
  • Klonaler Virus
  • Die Anwendung dieser Verfahren ermöglicht die Reinigung eines klonalen Virus [einschließlich Paramyxovirus (z.B., NDV)] bis zu wenigstens 2 × 109 PFU/mg Protein, insbesondere bis zu wenigstens 3 × 109 PFU/mg Protein, bevorzugt bis zu wenigstens 5 × 109 PFU/mg Protein, bevorzugt bis zu wenigstens 1,0 × 1010 PFU/mg Protein, bevorzugt bis zu wenigstens 2,0 × 1010 PFU/mg Protein, bevorzugt bis zu wenigsten 3 × 1010 PFU/mg Protein, bevorzugt bis zu wenigstens 4 × 1010 PFU/mg Protein, bevorzugt bis zu wenigstens 5 × 1010 PFU/mg Protein und besonders bevorzugt bis zu wenigstens 6 × 1010 PFU/mg.
  • Die Anwendung dieser Verfahren ermöglicht die Reinigung eines klonalen Virus [einschließlich Paramyxovirus (z.B., NDV)] bis zu einer Konzentration, bei dem die Zahl der Viruspartikel pro PFU kleiner als 10, insbesondere kleiner als 5, bevorzugt kleiner als 3, bevorzugt kleiner als 2 und besonders bevorzugt kleiner als 1,2 ist. (Niedrigere Viruspartikelzahlen pro PFU weisen auf einen höheren Reinheitsgrad hin.)
  • RNA Viren
  • In einer weiteren Ausführungsform ermöglichen diese Verfahren die Aufreinigung (bis auf die oben angeführten Konzentrationen für klonale Viren) eines RNA Virus [einschließend (a) ein zellzerstörendes Virus; (b) ein einzelsträngiges nichtsegmentiertes, unbehülltes RNA Virus; (c) ein einzelsträngiges, segmentiertes, behülltes RNA Virus; (d) ein doppelsträngiges, segmentiertes, unbehülltes RNA Virus; (e) und ein einzelsträngiges nichtsegmentiertes, behülltes RNA Virus (z.B. Paramyxovirus (z.B., NDV) und z.B. Retroviren)].
  • DNA Viren
  • In einer weiteren Ausführungsform ermöglichen diese Verfahren die Reinigung (bis auf die oben angeführten Konzentrationen für klonale Viren) eines Interferonempfindlichen zellzerstörenden Virus ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (a) behüllten, doppelsträngigen DNA Viren (einschließlich Pockenviren); (b) unbehüllten, einzelsträngigen DNA Viren; und (c) unbehüllten, doppelsträngigen DNA Viren.
  • Aus Eiern stammende Viren
  • In einer weiteren Ausführungsform ermöglichen es diese Verfahren die Aufreinigung von aus Eiern stammenden Viren bis zu einem Niveau, das im Wesentlichen frei von kontaminierenden Eiproteinen ist. Vorzugsweise ist die Menge an Eiproteinen in Viruspräparationen zur Verwendung in der Humantherapie zu limitieren, da wichtige Eiproteine wie Ovalbumin Allergene sind.
  • Viren, die nützlich in der Therapie von neoplastischen Krankheiten einschließlich Krebs sind, sind in Tabelle 1 gezeigt. Diese Viren sind optional auf natürlich vorkommende Variationen gescreent (bestimmte Stämme oder Isolate) die einer veränderten IFN Produktion relativ zum parentalen Stamm resultieren. Tabelle 1 Natürlich vorkommende Viren zur Verwendung in der Krebstherapie
    Virusklasse Virusfamilie Virusbeispiel
    RNA, negativ strangorientiert Paramyxoviridae Newcastle Disease Virus
    Aviäres Paramyxovirus Typ 2
    Mumps
    Humane Parainfluenza
    Rhabdoviridae Vesicular Stomatitis Virus
    RNA, positiv strangorientiert Togaviridae Sindbis Virus
    Flaviviridae Gelbfiebervirus (abgeschwächt)
    Picornaviridae Rhinovirus
    Bovines Enterovirus
    Echovirus
    Coronaviridae Aviäres Infektiöses Bronchitisvirus
    Humanes Coronavirus
  • In einer weiteren Ausführungsform dieser Erfindung werden in Betracht kommende Viren, sowohl natürlich vorkommend als auch modifiziert, auf ihre Fähigkeit, von therapeutischem Nutzen zur Behandlung von Neoplasmen zu sein, getestet. In einer Ausführungsform, wird die Menge von in Betracht kommenden Viren, die benötigt werden um 50% einer Menge von Zellen, die defizient in einer Interferon-vermittelten antiviralen Antwort sind, z.B KB Kopf- und Halskarzinomzellen, abzutöten, verglichen mit der Menge an Virus, die benötigt wird um 50% einer ähnlichen Anzahl an Zellen, kompetent in einer Interferon-vermittelten Antwort, zum Beispiel normale Hautfibroblasten, abzutöten. Die Abtötungsrate wird quantifiziert durch eine Reihe von Möglichkeiten, einschließlich Trypanblau-Exklusion oder MTT-Assay (siehe Beispiel 1). Eine signifikante Reduktion (z.B. wenigstens 5fach) der Menge an Virus, benötigt um Zellen zu töten, die defizient in einer Interferon-vermittelten antiviralen Antwort sind, relativ zu der benötigten Menge an Virus um Zeilen zu töten, die kompetent sind in einer Interferon-vermittelten antiviralen Antwort, deutet darauf hin, dass das getestete Virus die Aktivität zeigt, die im Hinblick auf den therapeutischen Nutzen zur Behandlung von Neoplasmen benötigt wird. Andere NDV Viren und das Sindbis Virus sind solche natürlich vorkommende Viren die Tumoren selektiv abtöten (siehe Beispiele 21-23 und 25).
  • Ein Verstehen der Faktoren, die an der Etablierung eines antiviralen Zustandes beteiligt sind, ermöglicht das Ausarbeiten eines Screeningassays für Tumoren, für die wahrscheinlich ist, dass sie auf eine virale Therapie ansprechen. Im Prinzip wird vom Patienten stammendes, durch eine Biopsie erhaltenes Tumorgewebe auf die Expression von p68 Kinase, p58 oder anderen Faktoren, die an der Regulation eines antiviralen Zustandes oder Zelldifferenzierung beteiligt sind, gescreent. Andere Faktoren schließen Interferon-Regulator-Faktor-1 (IRF-1), Interferon-stimulierender-Genfaktor-3 (ISGF-3), c-Myc-, c-Myb- und IFN-Rezeptoren mit ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Im Fall von C-Myc, C-Myb oder p58, weisen hohe Expressionsraten darauf hin, dass das Tumorgewebe oder die -zellen Behandlungskandidaten für eine Virustherapie sind. Im Fall von p68, IRF-1, ISGF-3 und der IFN Rezeptoren zeigen niedrige Expressionsraten, dass das Tumorgewebe und die -zellen Behandlungskandidaten für eine Virustherapie sind.
  • In einer weiteren Ausführungsform dieser Erfindung, werden primäre Tumorgewebe oder -zellen, die über eine Patientenbiopsie erhalten wurden, kultiviert und auf ihre Empfindlichkeit durch eine geeignete virale Therapie abgetötet zu werden, getestet. In einer Anwendungsform dieser Erfindung, wird die Menge an Virus, die benötigt wird 50% der Tumorzellkultur abzutöten, verglichen mit der Menge an Virus die benötigt wird um 50% einer normalen Zellkultur abzutöten, wie oben für das Screening von geeigneten Viren beschrieben. Eine 10fache oder noch stärkere Zunahme der Empfindlichkeit der Tumorzellen relativ zu normalen Zellen, durch das virale Agens abgetötet zu werden, deutet darauf hin, dass die Tumorzellen spezifisch empfindlich gegenüber den zellzerstörenden Wirkungen des viralen Behandlung sind. In einer weiteren Anwendungsform dieser Erfindung, wird die Fähigkeit der Zieltumorzellen auf endogen oder exogen verabreichtes IFN zu reagieren, bestimmt, indem der oben genannte Screen in der Anwesenheit von IFN durchgeführt wird (alpha oder beta Form, unter Verwendung von z.B. 10 Units pro ml, siehe Beispiel 27).
  • Ein Verstehen der zellulären Rezeptoren, die für das Anheften und Eindringen des Virus benötigt werden, ermöglicht zusätzliche Screenings für Tumoren, die eine hohe Rezeptorexpression und somit eine gesteigerte Empfindlichkeit gegenüber dem Interferon-empfindlichen Virus haben. Dies ist eine zusätzliche Screeningstufe für Patienten, für die anzunehmen ist, dass sie auf die Virustherapie reagieren. Vorteilhaft für eine Therapie mit einem Interferon-empfindlichen Virus ist, dass der Tumor des Patienten resistent gegenüber Interferon ist und auch eine hohe Expression des zellulären Virusrezeptors aufweist. Im Prinzip, werden vom Patienten stammendes Serum, Tumorzellen, Gewebe oder Gewebeschnitte, über ein Immunoassay oder Immunfärbung auf die Menge an Virusrezeptor, vorhanden in dem Serum oder auf den Tumorzellen oder Tumorgewebe, gescreent. Zum Beispiel verwendet das Sindbis Virus den Hochaffinitätslamininrezeptor um Säugerzellen zu infizieren (Wang et al., 1992, J. Virol., 66, 4992-5001). Von demselben Rezeptor ist bekannt, dass er in größeren Mengen in vielen verschiedenen Typen von metastasierendem Krebs exprimiert wird. Von der PANC-1 Nierenkrebszelllinie und der Dickdarmadenokarzinomzelllinie SW620 ist bekannt, dass sie auf hohem Niveau mRNA des high affinity Lamininrezeptors exprimieren (Campo et al, 1992, Am J Pathol 141:107301983; Yow et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci, 85, 6394-6398) und hochempfindlich gegenüber dem Sindbis Virus sind (Beispiel 25). Im Gegensatz dazu, ist die Kolorektaladenokarzinomzelllinie dafür bekannt, auf sehr niedrigem Niveau high affinity Lamininrezeptor zu exprimieren (Yow et al., (1988) Proc. Natl Acad Sci, 85, 6394-6398) und sie ist um 4 Größenordnung resistenter gegenüber dem Abtöten durch PPSINDBIS-Ar339 als SW620 Zellen.
  • Existierende Stämme von NDV oder anderen Viren, einschließlich RNA und DNA Viren, werden in normalen Zellen im Hinblick auf veränderte Reaktionen bezüglich IFN (z.B. vorteilhaft gesteigerte IFN-Antworten) gescreent oder gentechnisch bearbeitet. Zusätzlich zu der Fähigkeit eine starke IFN-Antwort auszulösen, wird für andere virale Charakteristika des Virus gescreent oder diese gentechnisch in das Virus hineingearbeitet. Viren mit veränderter Rezeptorspezifität (z.B. Sindbis Virus PPSINDBIS-Ar339, siehe Beispiel 25) oder niedriger Neovirulenz sind eingeschlossen in die vorliegende Erfindung (z.B. NDV Virus PPNJROAKIN, siehe Beispiel 24). Vorteilhafterweise, haben die Viren der Erfindung die Fähigkeit sich durch direkten Kontakt von Zelle zu Zelle auszubreiten.
  • Die hier beschriebene Erfindung umfasst eine breite Gruppen von Viren (s. Tabelle 1), die nützlich sind zur Behandlung von Neoplasmen auf eine Art und Weise die der Indikation für NDV analog ist. Zusätzlich werden Viren, die aufgrund der Anwesenheit von einem oder mehreren Mechanismen zur Inaktivierung der IFN Antwort, in normalen Zellen normalerweise nicht als Kandidaten zur Verwendung in Frage kommen, optional gentechnisch bearbeitet, um die oben genannten Einschränkungen zu umgehen. Würde man sie unmodifiziert belassen, so wären Viren mit Mechanismen zur Inaktivierung der Interferonantwort, toxischer gegenüber normalen Zellen, als Viren denen diese Mechanismen entfernt wurden. Die vorliegende Erfindung stellt (1) die Entwicklung eines Vektors der leicht manipuliert werden kann und (2) die Erschaffung eines Satzes therapeutischer Viren zur Verfügung. Manipulationen schließen das Hinzufügen eines IFN Genes, um die virale Expression eines Transgenes, das IFN exprimiert zu ermöglichen oder anderer Aktivatoren des Antwortpfades mit ein. Zusätzliche Permutationen schließen die gentechnisch bearbeitete Expression von Wirkstoffvorstufen aktivierenden Enzymen wie die Herpesvirus-Thymidinkinase oder die Cytosindeaminase (Blaese RM et al., 1994. Eur J. Cancer 30A:1190-1193) und die Expression von geeignetem Markerantigen um den Angriff des Immunsystem auf die Tumorzellen zu ermöglichen, mit ein. Eine zusätzliche Permutation schließt die gentechnisch bearbeitete Expression von Rezeptorliganden um Zellen mit diesen Rezeptoren anzugreifen, mit ein [z.B. Expression von Rezeptoren für andere Viren um Zellen, die mit diesen Viren infiziert sind, anzugreifen [siehe Mebastsion et al., 1997, Cell 90:841-847 und Schnell MJ et al., 1997 Cell 90:849-857].
  • Mehrere Newcastle Disease Virenstämme sind in der Lage Tumorzellen selektiv abzutöten. In einem differentiellen Zytotoxizitätsassay wurde unter Verwendung eines zweiten Stammes des mesogenen Newcastle Disease Virus, festgestellt, dass Tumorzellen um 3 Größenordnungen empfindlicher als normale Zellen gegenüber dem Abtöten durch das Virus sind (Beispiel 21). Zusätzlich, wenn ein dritter mesogener Newcastle Disease Virusstamm in einem differentiellen Zytotoxizitätsassay verwendet wurde, wurde für Tumorzellen festgestellt, dass sie 80 bis 5000fach empfindlicher als normale Zellen gegenüber dem Abtöten durch das Virus waren (Beispiel 22). Beide dieser mesogenen Newcastle Disease Virenstämme verursachten ebenfalls eine Regression des Tumorwachstums als Folge einer intratumoralen Verabreichung an thymuslose Mäuse, die humane Tumorfremdimplantaten in sich trugen (Beispiel 23).
  • In getrennten Experimenten, wurde die Sicherheit der drei verschiedenen Newcastle Disease Virenstämme studiert, folgend einer intrazerebralen Inokulation in thymuslosen und immunkompetenten Mäusen. Die Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass alle drei Virenstämme gut in Mäusen mit einem intakten Immunsystem toleriert wurden. Eine intrazelrebrale Inokulation in das Gehirn von thymuslosen Mäusen zeigte, dass eines der Viren signifikant besser toleriert wurde als die andern beiden (Beispiel 24). Diese Ergebnisse zeigen, dass innerhalb einer einzigen Virusfamilie wichtige Unterschiede in den viralen Eigenschaften auftreten können, die zur größeren Wirksamkeit oder erhöhten Sicherheit, therapeutisch genutzt werden können.
  • Eine anderes Mittel wodurch eine gesteigerte Wirksamkeit und niedrigere Toxozität, als Folge einer Behandlung mit onkolytischen Viren erreicht werden kann, ist durch die Verwendung von Interferon-empfindlichen Viren, die spezifische Zelloberflächenrezeptoren, die bevorzugt an Tumorzellen exprimiert werden, benötigen. Das Sindbis Virus ist ein Beispiel für diese Art der Einschränkung. Das Sindbis Virus infiziert Säugerzellen unter Verwendung des high affinity Lamininrezeptors (Wang et al., (1992) J. Virol. 66, 4992-5001). Wenn normale Zellen und Tumorzellen in einem differentiellen Zytotoxizitätsassay mit dem Sindbis Virus infiziert wurden, so wurde festgestellt, dass Zellen die sowohl tumorigen waren, als den high affinity Lamininrezeptor exprimierten, empfindicher gegenüber dem Abtöten durch das Virus waren, als andere Zellen (Beispiel 25). Normale Keratinozyten exprimieren den high affinity Lamininrezeptor (Hand et al., (1985) Cancer Res., 45, 2713-2719), aber waren in diesem Assay resistent gegenüber dem Abtöten durch das Sindbis Virus.
  • Das Vesicular Stomatitis Virus (VSV) liefert Hinweise von tumorselektivem Töten durch onkolytische Viren, d.h. eine inhärente Defizienz von Interferonempfindlichkeit in Tumorzellen, macht diese Zellen empfindlich gegenüber dem Abtöten durch Interferonempfindliche replikationskompetente Viren, wenn VSV verwendet wird, um nichttumorigene humane WISH Zellen und tumorigene HT1080 oder KB Zellen in der Anwesenheit von exogenem Interferon, zu infizieren.
  • Nachstehend findet sich eine Liste von Viren, die wenn sie modifiziert werden um natürlich vorkommende Antiinterfereonaktivitäten zu entfernen, nützlich für die virale Krebstherapie sind (siehe Tabelle 2). Modifizierte Viren (die vorteilhaft aber nicht notwendigerweise, zusätzlich zu der anti-Interferon Modifikation abgeschwächt sind, siehe Tabelle 3) deren endogene Antiinterferonaktivitäten zerstört oder reduziert wurden, sind nützlich in der Krebstherapie. Diese Liste schließt die nachstehend beschriebenen Viren mit ein, ist aber nicht darauf beschränkt. Aufgrund der Ähnlichkeit unter den Viren einer gemeinsamen Klasse, sind die identifizierten Mechanismen für jeden der spezifischen, unten aufgeführten Viren, als identische oder funktional analoge Mechanismen ebenso vorhanden in anderen Mitgliedern dieser Virusklasse. Die breitere Gruppe dieser Viren ist in Klammern hinzugefügt. Viren, wie die nachstehend beschriebenen, die einen funktionellen Verlust der Antiinterferonaktivität aufweisen, der auf jedwelche Weise, einschließlich natürlich auftretender Mutationen als auch gentechnisch erzeugten Deletionen oder Punktmutationen erhalten wurde, sind nützlich für die Verfahren der vorliegenden Erfindung.
  • Viren die mehr als einen Mechanismus ausüben, werden optional modifiziert, um Mutationen in einer, einigen oder allen Aktivitäten zu enthalten. Mutationen für einige der beschriebenen Aktivitäten sind in der allgemeinen wissenschaftlichen Gemeinschaft verfügbar.
  • Isolate von natürlich vorkommenden oder gentechnisch berbeiteten Viren die langsamer wachsen, verglichen mit der Wachstumsrate eines Wildtypvirus sind besonders vorteilhaft, da eine langsamere Viruswachstumsrate es einer Zelle oder einer Zellpopulation, die kompetent in einer Interferonantwort ist, es ermöglichen wird, einen effizienten antiviralen Zustand zu etablieren, bevor die virale Replikation die Zelle oder die Zellpopulation abtöten kann.
  • Das Ausschalten von Antiinterferonaktivitäten als eine spezifische Abänderung des viralen Charakters, die in der Zunahme der Interferonantwort in einer infizierten Zelle resultiert, aber immer noch die virale Replikation in neoplastischen Zellen ermöglicht, ist in der vorliegenden Erfindung miteingeschlossen.
  • Tabelle 2 zeigt existierende Viren, die genetisch modifiziert wurden, um die Antiinterferonaktivität zu entfernen.
  • Tabelle 3 listet Viren auf, genetisch modifiziert wurden, um eine abgeschwächte Virulenz zu haben. Tabelle 2 Existente Viren die gentechnisch bearbeitet sind, um die Antiinterferonaktivität zu entfernen
    Virusklasse Virusfamilie Virus Anti-IFN-Aktivität Referenz
    RNA Reoviridae Reovirus σ3 Imani F und Jacobs b (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85:7887-7891
    DNA Poxviridae Vaccinia K3L Beattie E et al. (1991) Virology 183:419
    E3L Beattie E et al. (1996) Virus Genes 12:89-94
    B18R Symons JA et al. (1995) Cell 81:551-560
    Adenoviridae Verschiedene Subtypen VA1 Transkripte Mattews MB und Shenk T 1991 (1991) J Virol 64:5657-5662
    Alphaherpesviridae HSV-1 Gamma 34.5 Gen-Produkt Chou J et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 92:10516-10520
    Tabelle 3 Bekannte abschwächende Mutationen in ausgewählten Viren
    Virusklasse Virusfamilie Virus Abschwächung Referenz
    RNA Reoviridae Reovirus σ1 Spriggs DR und Fields BN (1982) Nature 297:68-70
    Rotavirus Bovine Stämme (WC3) Clark HF (1988) J Infect Dis 158:570-587
    DNA Poxviridae Vaccinia Vacciniawachstumsfaktor Buller RML et al (1988) Virology 164:182
    Thymidinkinase Buller RML et al (1985) Nature 317:813-815
    Thymidylatkinase Hughes SJ et al (1991) J Biol Chem 266:20103-20109
    DNA Ligase Kerr SM et al (1991) EMBO J 10:4343-4350
    Ribonukleotid-reduktase Child SJ et al (1990) Virology 174:625-629
    dUTPase Perkus ME et al (1991) Virology 180:406-410
    Adenoviridae Verschiedene Subtypen Ad-4, Ad-7, Ad-21 Takafugi ET et al (1979) J Infect Dis 140:48-53
    Alphaherpes-viridae HSV-1 Thymidinkinase Field HJ und Wildy P (1978) J Hyg 81:267-277
    Ribonukleotid-reduktase Goldstein DJ und Weller SK (1988) Virology 166:41-51
    Gamma 34.5 Genprodukt Chou J et al (1995) Proc Natl Acad Sci USA 92:10516-10520
    b'a'c invertierte Repeats Meignier B et al (1988) J Infect Dis 162:313-322
  • Behandlung von Neoplasmen
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die virale Therapie von Neoplasmen, speziell in Tieren die Krebs haben. In einer vorteilhaften Ausführungsform bezieht sich die Erfindung auf die Behandlung von Tumoren die 1 Zentimeter (cm) oder größer sind, wenn an der Stelle der größten Ausdehnung gemessen. Wie hierin verwendet, deutet „ein 1 cm Tumor" darauf hin, dass der Tumor wenigstens in einer Richtung 1 cm lang ist. Solche Tumoren sind empfindlicher als erwartet gegenüber der viralen Therapie, oft wenigstens so empfindlich dem Virus gegenüber, wenn nicht noch empfindlicher, als Tumoren, die kleiner sind. In einem etwas vorteilhafteren Aspekt der Erfindung, werden Tumoren die größer als 1 cm behandelt, z.B. Tumoren die 2 cm oder größer sind, zwischen etwa 2 cm und etwa 5 cm und größer als 5 cm.
  • Die vorliegende Erfindung kann ebenso dafür verwendet werden, um Wirte mit einer hohen Tumorlast zu behandeln. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Tumorlast" auf die vollständige, im Körper exprimierte Tumormenge ausgedrückt in Prozent bezogen auf das Körpergewicht. Die virale Therapie von Wirten mit einer Tumorlast, z.B. zwischen etwa 1% bis etwa 2% bezogen auf das Gesamtkörpergewicht, ist überraschend effektiv, z.B. in dem Hervorrufen von Tumorregression und einer Reduktion der Gesamttumorlast. Dies ist besonders unerwartet, denn eine Tumorlast von ungefähr 2% bezogen auf das Gesamtkörpergewicht (z.B. ein 1 kg Tumor in einem 60 kg schweren Menschen) ist ungefähr das Maximum an Krebsmasse die noch vereinbar mit Lebenfähigkeit ist. Siehe z.B. Cotran et al., in Robbins Pathological Basis of Diseases, 4. Auflage, WB Saunders, 1989, Seite 252. In den Beispielen zeigte sich, für Volumina bis zu 397 mm3 eines Melanomkrebses (z.B. A373) in einem Mauswirt eine vollständige Regression als Antwort auf eine Behandlung mit einem Newcastle Disease Virus (z.B. ein dreifach plaqueaufgereinigtes Virus). Davon ausgehend, dass für Gewebe 1000 mm3 1 Gramm entsprechen, so umfasst ein Tumor mit einem Volumen von 397 mm3 ungefähr 2% des Gesamtköpergewichts einer 20 Gramm Maus.
  • Wie in den Beispielen 4 bis 9 untenstehend gezeigt, wurde die Tumorregression bei mindestens 1 cm großen Tumoren erreicht, während unbehandelte Kontrolltiere begannen, aufgrund der Tumorlast innerhalb mehrerer Wochen zu sterben. Demnach, wurden dermaßen erkrankte Tiere erfolgreich behandelt, obwohl sie zwei Wochen vor dem Tod standen. Demnach, in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung, kann ein Tier das aufgrund seiner Tumorlast nahe dem Endstadium ist, effektiv mit einer viralen Therapie behandelt werden. Folglich kann die vorliegende Erfindung dazu verwendet werden, um Patienten zu behandeln, die nicht auf konventionelle Therapie reagiert haben, z.B. Chemotherapie mit Methotrexat, 5-Fluorouracil und Bestrahlungstherapie.
  • Die Wirksamkeit von NDV zur Behandlung von Krebs, nach Verabreichung über die intraperitonealen Route, wurde ebenfalls untersucht. Unter Verwendung eines Eierstockkrebs-Aszitespräventionsmodells, resultierte die intraperitoneale Injektion von NDV in Mäusen, die humane ES-2 Eierstocktumoren in sich trugen, in einer verbesserten Überlebensrate, verglichen mit Mäusen, die mit Kochsalzlösung behandelt wurden (Beispiel 16). Wenn ES-2 Zellen in einem Eierstockkrebstumormodell verwendet wurden, wo die Behandlung initiiert wurde, sobald sich Aszites gebildet hatte, so war die Produktion von Aszitesflüssigkeitsmengen in virusbehandelten Tieren deutlich reduziert, verglichen mit den kochsalzlösungsbehandelten Kontrollen (Beispiel 17).
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung resultiert die Verabreichung von Virus 1) in dem Abschwächen von tumorbezogenen Symptomen, wie – aber nicht darauf beschränkt – einer verminderter Rate von Aszitesflüssigkeitsproduktion, Schmerzlinderung, Erleichterungen bei Obstruktionen und 2) einer Lebensverlängerung.
  • Dreiundzwanzig Patienten bekamen das plaqueaufgereinigte NDV Isolate intravenös verabreicht (Beispiel 20). Das Ansprechen. auf die Behandlung schließen die Regression eines tastbaren Tumors, die Stabilisierung der Krankheit bei 47% der Patienten und eine Reduktion der Schmerzbehandlung mit ein.
  • Verabreichung und Formulierung
  • In einer Ausführungsform der Erfindung werden Tumorzellen oder Gewebe in vitro gescreent, um die Patienten mit virusempfindlichen Tumoren zu ermitteln. Dem Patienten entnommene Tumorzellen (durch Verfahren wie das Absaugen mit einer feinen Nadel bei soliden Tumoren oder einer Punktion von Eierstockaszitestumoren) werden in vitro kultiviert und zusammen mit dem Virus inkubiert. In dieser Ausführungsform der Erfindung, werden Patienten für die Therapie ausgewählt, falls das Virus eine hohe Aktivität gegenüber deren Tumorzellen hat.
  • In einer vorteilhaften Ausführungsform dieser Erfindung, resultiert die Menge an verabreichtem Virus in der Regression des Tumors oder der Tumoren. Soweit der Begriff Verwendung findet, bedeutet der Begriff „Regression", dass der Tumor schrumpft z.B. in Größe, Masse oder Volumen. Das Schrumpfen der Tumorgröße, wird durch verschiedene Verfahren gezeigt, einschließlich physischer Untersuchung, Röntgenbilder des Brustkorbs oder Röntgenaufnahmen anderer Art, Sonographie, CT-Scan, MRI oder einer Radionukleotid-Scan-Prozedur.
  • Verschiedene Neoplasmentypen einschließlich Krebs sind behandelbar in Übereinstimmung mit der Erfindung. Die Viren der vorliegenden Erfindung sind nützlich um eine Anzahl von Krebsarten zu behandeln, einschließend – aber nicht darauf beschränkt – Lungenkarzinom, Brustkarzinom, Prostatakarzinom, Dickdarmkarzinom, Zervixkarzinom, Endometrialkarzinom, Ovarkarzinom, Blasenkarzinom, Wilms-Tumor, Fibrosarkom, Osteosarkom, Melanom, Synovialsarkom, Neuroblastom, Lymphom, Leukämie, Hirnkrebs einschließlich Glioblastom, neuroendokrines Karzinom, Nierenkarzinom, Kopf- und Halskarzinom, Magenkarzinom, Osophaguskarzinom, Vulvakarzinom, Sarkoma, Hautkrebs, thyroider Bauchspeicheldrüsenkrebs und Mesotheliom. Die Viren der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls nützlich um eine Vielzahl von gutartigen Tumoren zu behandeln, einschließlich – aber nicht darauf beschränkt – Kondylomen, Papillomen, Meningiomen und Adenomen.
  • Einem Wirt mit einem Neoplasma wird eine therapeutisch wirksame Menge an Virus verabreicht. Es ist für den Fachmann nachvollziehbar, dass die verabreichte Virusdosis in Abhängigkeit von dem ausgewählten Virus, der Art des Neoplasmas, das Ausmaß des neoplastischen Wachstums oder der Metastasierung, der biologischen Lokalisation oder Körperteil in dem das Neoplasma auftritt, dem Virusstamm, der Weg der Verabreichung, dem Zeitplan der Verabreichung, die Art der Verabreichung und die Identität eines jeden anderen Wirkstoffes oder Behandlung, wie Bestrahlung, Chemotherapie oder operative Behandlung, die dem Säuger verabreicht wird, variieren wird. Diese Parameter sind definiert durch eine maximal tolerierte Dosisermittlung in Tiermodellen und eine Skalierung auf eine Humandosis als eine Funktion der relativen Körperoberfläche oder Körpermasse. Es ist ebenfalls nachvollziehbar, dass unter bestimmten Bedingungen, mehr als eine Virusdosis verabreicht wird. Das optimale Intervall zwischen solchen multiplen Virusdosen kann empirisch bestimmt werden und entspricht dem Stand der Technik. Die verabreichte Menge an NDV liegt generell zwischen etwa 3 × 106 und etwa 5 × 1012 PFU des Virus. For eine lokales Verabreichen (z.B. direkt in den Tumor), werden üblicherweise Gesamtmengen, die zwischen etwa 3 × 106 und etwa 5 × 1010 PFU des Virus liegen, verwendet. Für die systemische Verabreichung, werden Mengen zwischen etwa 1 × 108 und etwa 4 × 1011 PFU des Virus pro Quadratmeter Körperoberfläche verwendet. Für die intravenöse Verabreichung, werden Dosierschemata zur einmaligen, zweimaligen und dreimaligen Verabreichung pro Woche verwendet. Ein erfindungsgemäßes Virus kann gegebenenfalls mit einem chemotherapeutischen Mittel und über verschiedene Wege verabreicht werden, z.B. enteral, parenteral, oral, nasal, rektal, intrathekal, intravenös (z.B. unter Verwendung eines Katheters), subkutan, intratumoral, (z.B. direkt in das Gewebe oder in die Gefäße die es durchbluten), peritumoral, lokal, sublingual, bukkal, topisch, intramuskulär, durch Inhalieren, perkutan, vaginal, intraarteriell, intrakranial, intradermal, epidural, systemisch, topisch, intraperitoneal, intrapleural etc. Für Lungentumoren kann ein bronchialer Weg verwendet werden (z.B. bronchiale Verabreichung). Sowohl endoskopische Injektionen in gastrointestinale Tumoren als auch Zäpfchen zur Behandlung von Rektaltumoren werden falls geeigntet, ebenso verwendet.
  • Maustoxizitätsstudien mit NDV haben gezeigt, dass die akute Toxizität als Folge intravenöser Verabreichung von Virus, wahrscheinlich durch Cytokin-vermittelte Reaktionen verursacht werden. Von Cytokinantworten ist bekannt, das sie auf wiederholte Stimuli hin, unempfindlich gemacht oder herunterreguliert werden, als Folge des initialen Induktionsereignisses (Takahashi et a., (1991) Cancer Res. 51, 2366-2372). Mäuse, denen intravenös eine desensibilisierende Virusdosis injiziert wurde, waren in der Lage 10mal mehr Virus nach einer zweiten Dosis zu tolerieren, als Mäuse die nur die Trägersubstanz als erste Injektion erhalten hatten (Beispiel 18). Die Verabreichungsrate des Virus über den intravenösen Weg kann die Toxizität deutlich beeinflussen. Zwei Gruppen von thymuslosen Mäusen wurden intravenös mit identischen NDV Dosen behandelt, die entweder langsam (0,2 ml über einen Zeitraum von 4 Minuten) oder schnell (0,2 ml über einen Zeitraum von 30 Sekunden) verabreicht wurden. Der Vergleich des maximalen Gewichtverlustes in jeder Gruppe zeigte 50% weniger Gewichtsverlust für die Gruppe, die die langsame Injektion bekommen hatte im Vergleich zu einer schnellen Injektion (Beispiel 19).
  • In einer Gruppe einer klinischen Studie, erhielten Patienten drei Injektionen des plaqueaufgereinigten NDV-Isolates über den Zeitraum von einer Woche (Beispiel 20). Unter diesen Bedingungen, verminderte ein desensiblisierende Wirkung der ursprünglichen Dosis, die mit der zweiten und dritten Dosis verbundene Toxizität. Diese Daten entsprechen denen die anhand von Tierstudien erhalten wurden, welche in Beispiel 18 gezeigt sind. Ein Bedenken, das mit der Verwendung von onkolytischen Viren zur Behandlung von Krebs zusammenhängt, ist der potentiell inhibierende Effekt, den die Humorale Immunantwort auf die Therapie ausüben kann. In klinischen Studien sind Patienten, die nach einem Monat ein stabiles Krankheitsbild aufweisen, geeignet für eine zweite Behandlungsrunde, die dann in der Anwesenheit von neutralisierenden NDV Antikörpern durchgeführt wird. Trotzdem konnte sieben Tage nach einer Dosierung für die zweite Behandlungsrunde infektiöses Virus im Patientenurin gefunden werden, was Hinweise liefert, dass die Verabreichung von hohen Virusdosen die Wirkung von neutralisierenden Antikörpern überwinden und zu einer Infektion im Patienten führen kann.
  • In einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung wird eine desensibilisierende Dosis verabreicht, bevor darauf folgende höhere Dosen verabreicht werden. Für die Desensibilisierung werden Virusdosen von zwischen 1 × 108 und 2,4 × 1010 PFU/m2 verwendet. Der Zeitrahmen zwischen den Dosen, einschließlich der Zeitrahmen zwischen desensibilisierender Dosis und der nächsten Dosis beträgt 1 bis 14 Tage, vorteilhaft 1 bis 7 Tage. Die desensibilisierende Dosis kann über verschiedene Wege verabreicht werden z.B. intravenös, enteral, parenteral, oral, nasal, rektal, intrathekal, intravenös, subkutan, intratumoral, peritumoral, lokal, sublingual, bukkal, topisch, intramuskulär, durch Inhalieren, perkutan, vaginal, intraarteriell, intrakranial, intradermal, epidural, systemisch, topisch, intraperitoneal, intrapleural, endoskopisch, intrabronchial etc. Die darauf folgenden Dosen können über den gleichen Weg wie die desensibilisierende Dosis oder jeden anderen Weg verabreicht werden, z.B. intravenös, enteral, parenteral, oral, nasal, rektal, intrathekal, intravenös, subkutan, intratumoral, peritumoral, lokal, sublingual, bukkal, topisch, intramuskulär, durch Inhalieren, perkutan, vaginal, intraarteriell, intrakranial, intradermal, epidural, systemisch, topisch, intraperitoneal, intrapleural, endoskopisch, intrabronchial etc.
  • Optional kann mehr als ein Verabreichungsweg auf sequentielle oder simultane Art und Weise verwendet werden. Wege für die sequentielle oder simultane Verabreichung schließen – aber sind nicht darauf beschränkt – intravenös, enteral, parenteral, oral, nasal, rektal, intrathekal, intravenös, subkutan, intratumoral, peritumoral, lokal, sublingual, bukkal, topisch, intramuskulär, durch Inhalieren, perkutan, vaginal, intraarteriell, intrakranial, intradermal, epidural, systemisch, topisch, intraperitoneal, intrapleural, endoskopisch, intrabronchial etc. mit ein. Ein Beispiel wäre die Verabreichung einer intravenösen, desensibilisierenden Dosis gefolgt von einer intraperitonealen Dosis.
  • In einer anderen vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung wird das Virus durch eine langsame Infusion verabreicht, einschließend die Verwendung einer intravenösen Pumpe oder einer langsamen Injektion über den Zeitraum von 4 Minuten bis zu 24 Stunden.
  • Ein Virus und optional ein oder mehrere chemotherapeutische Wirkstoffe werden über eine einzige Injektion, mehrere Injektionen oder kontinuierlich verabreicht. Das Virus wird vor, gleichzeitig oder nach der Verabreichung von chemotherapeutischen Wirkstoffen (wie, aber nicht darauf beschränkt: Busulfan, Cyclophosphamid, Methotrexat, Cytarabin, Bleomycin, Cisplatin, Doxorubicin, Melphalan, Mercaptopurin, Vinblastin, 5-Fluorouracil, Taxol und Retinolsäure) verabreicht. Eine virale Therapie in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wird optional kombiniert mit anderen Behandlungen, umfassend Operationen, Bestrahlung, Chemotherapie (siehe, z.B. Current Medical Diagnosis and Treatment, Herausgeber Ed. Tierny et al., Appleton & Lange, 1997, speziell Seiten 78-94) und biologische Therapie. Das Virus wird bevor, gleichzeitig oder nach der Verabreichung von biologischen Agenzien wie (1) anderen onkolytischen Agenzien [wie, aber nicht darauf beschränkt: Adenoviren mit einem ihrer Gene unter Transkriptionskontrolle eines prostatazellspezifischen Antwortelements (siehe Rodriques, R. et al, 1997, Cancer Res, 57:2559-2563; Adenoviren die nicht für ein E1b Polypeptid, das in der Lage ist an p53 zu binden, kodieren (siehe Bischoff, J.R., et al, 1996, Science 274:373-376); ein Herpes Simplex Virus, das nicht in der Lage ist, ein funktionales gamma 34.5 Genprodukt zu exprimieren (siehe Mineta, T. et al, 1995, Nature Medicine, 1:938-943)]; (2) Cytokinen (wie, aber nicht darauf beschränkt: koloniestimulierende Faktoren wie GM-CSF; Tumornekrosisfaktoren und Interleukine wie IL-1, IL-2, IL-6 und II-10; (3) viralen Vektoren (wie – aber nicht darauf beschränkt – Adenoviren, die für p53 kodieren (siehe Zhang, WW et al, 1994, Cancer Gene Therapy, 1:5-13)] und (4) Krebsimpfstoffen, verabreicht. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung, besteht die Therapie aus der fortlaufenden Behandlung mit antigenetisch verschiedenen Viren, die zytotoxisch und tumorselektiv via den IFN Mechanismus sind. Diese Ausführungsform ermöglicht die virale Therapie über eine ausgedehnte Periode ohne immunologische Beeinträchtigung.
  • Eine andere Ausführungsform beinhaltet die Behandlung von Patienten mit IFN (z.B. αIFN, βIFN oder γIFN) vor, gleichzeitig oder nach der Verabreichung von NDV (oder eines anderen Virus). Das IFN wird ausgewählt aus der Gruppe Klasse I (alpha, beta oder Omega) und Klasse II (gamma) und rekombinanten Versionen und Analoga hiervon, was z.B. diskutiert ist in Sreevalsoun, T., 1995 (In: Biologic Therapy of Cancer, Zweite Auflage, herausgegeben von V.T. DeVita, Jr., S. Hellman und S.A Rosenberg, J.B. Lippincott Company, Philadelphia, Seiten 347-364). Normale Zellen reagieren auf die IFN Vorbehandlung mit einer gesteigerten IFN Antwort auf die virale Infektion, was eine noch größere Sicherheit für diese Zellen gewährleistet. Tumorzellen, die defizient bezüglich des IFN Signalwegs sind, bleiben empfindlich gegenüber dem Abtöten durch das Virus. Das IFN wird in Übereinstimmung mit klinischen Standardrichtlinien für Dosen und Kuren, von denen bekannt ist, dass sie wirksam zur Behandlung von viralen Infektionen sind, verabreicht. In einer anderen Ausführungform der Erfindung, werden andere Wirkstoffe, von denen bekannt ist, das sie den IFN-Signalpfad beeinflussen, optional verwendet, um die Empfindlichkeit von Tumorzellen oder die Widerstandsfähigkeit von normalen Zellen gegenüber den zellsterstörenden Wirkungen der viralen Infektion, zu steigern. Diese Klasse von Wirkstoffen schießt – ist aber nicht darauf beschränkt – Tyrosinkinase Inhibitoren, Cimetidin und mitochondriale Inhibitoren mit ein. Von Hypoxie und Hyperthermie ist ebenfall bekannt, die Empfindlichkeit für Interferon zu modulieren.
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden Immunsuppressiva wie Cyclosporin A, Azathioprin und Leflunomid, verschiedene Kortikosteroidpräparate und anti-CD-40 Ligandantikörper (Foy, T.M., et al., 1993, J. Exp. Med 178:1567-1575) zusammen mit dem Virus verabreicht. Alternativ kann eine immunstimulierende Verbindung, z.B. Lipopetide, zusammen mit dem Virus verabreicht werden.
  • Ein unabhängiger Mechanismus, durch den die Menge an Interferon, die als Antwort auf die virale Infektion, produziert wird, gesteigert wird durch die Verwendung von Nukleosiden (Machida, H., 1979. Microbiol, Immunol. 23:643-650), Nukleosidvorläufern oder Wirkstoffen, die die zelluläre Konzentration eines oder mehrerer Nukleoside steigern, wird optional als Ergänzung zur viralen Therapie verwendet.
  • Bestimmte Purinnukleosidanaloga, wie z.B. 2-Chlorodeoxyadenosin und 2'-Deoxycoformycin reduzieren die Interferonproduktion in vivo. Solche Verbindungen werden verwendet, um verglichen mit normalen Zellen, weitere Unterschiede in der Interferonempfindlichkeit von Tumorzellen herbeizuführen und werden optional als Ergänzung zur viralen Therapie benutzt.
  • Unter einem Aspekt kann eine wirksame Virusmenge in kleinere Dosen unterteilt werden und gleichzeitig an verschiedenen Stellen in denselben Tumor injiziert werden. Für eine kontinuierliche Verabreichung, kann das Agens oder die Agenzien über eine implantierte Minipumpe verabreicht werden oder ein gewünschtes, damit imprägniertes Polymer wird dann für eine langsame oder verzögerte Freisetzung an der gewünschten Stelle implantiert (z.B. direkt in den Tumor).
  • Ein Virus der vorliegenden Erfindung wird als ein pharmazeutisches Präparat formuliert, indem es zusammen mit wenigstens einem Arzneiträger und wenn gewünscht mit einem oder mehreren aktiven Präparaten, in eine geeignete Dosisform gebracht wird. Die Präparate werden sowohl in der Human- als auch in der Tiermedizin verwendet. Geeignete Arzneiträger schließen z.B. organische und anorganische Substanzen mit ein, die geeignet sind für die enterale und parenterale Verabreichung, z.B. Wasser, Kochsalzlösung, Zellkulturmedium, Puffer, Lysin, Citrat, Gyzerintriacetat und andere Fettsäureglyzeride, Gelatine, Sojalecithin, Kohlenhydrate wie Mannitol, Sucrose, Laktose oder Stärke, Magnesiumstearat, Talkum, Zellulose oder Proteinträger, oder eine Kombination der vorausgehend genannten Verbindungen, wie Mannitol/Lysin oder Mannitol/Lysin/Sucrose. Die Präparate werden sterilisiert und/oder enthalten Zusätze, wie Konservierungsstoffe oder Stabilisatoren. Für die parenterale Verabreichung, z.B. durch systemische oder lokale Injektion, wird eine Viruspräparation z.B. als wässrige Suspension oder Emulsion formuliert.
  • Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf ein Verfahren zur Behandlung einer Krankheit in einem Säuger, dessen erkrankte Zellen Defekte in einer Interferon-vermittelten antiviralen Antwort haben, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Interferon-empfindlichen, replikationskompetenten, klonalen Virus. So sind z.B. Zellen, die mit vielen Viren, die die Interferonantwort inaktivieren, darunter auch Hepatitis B infiziert sind, anfällig gegenüber den Viren der vorliegenden Erfindung. Es existieren Hiweise, dass das Humane Immundefizienz-Virus (HIV) die Interferonantwort inaktiviert. Die Interferon-empfindlichen Viren dieser Erfindung sind nützlich zur Behandlung solcher chronischen Virusinfektionen wie z.B. jener ausgelöst durch Hepatitis B, Hepatitis C, HIV, Epstein-Barr Virus, Humes Papilloma Virus und Herpes Virus.
  • Die folgenden Beispiele sind illustrativ, aber beschränken nicht die Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung. Andere geeignete Modifikationen und Anpassungen einer Reihe von in der klinischen Therapie vorkommenden Bedingungen und Parametern die für den Fachmann offensichtlich sind, sind im Rahmen dieser Erfindung mitumfasst.
  • Beispiel 1
  • PPMK107, (ein dreifach plaqueaufgereinigtes Isolat des NDV Stammes MK107) zeigt eine selektive zytotoxische Aktivität gegenüber vielen humanen Krebszellen verglichen mit normalen humanen Zellen.
  • Humane Tumorzellen und normale Zellen wurden in 24-Loch-Zellkulturplatten bis zu einer Konfluenz von ungefähr 80% kultiviert. Das Wachstumsmedium wurde entfernt und PPMK wurde 10fach verdünnt in einem Konzentrationsbereich von 106 Plaque forming units (PFU)/Vertiefung bis zu 10–1 PFU/Vertiefung hinzugefügt. Das Virus wurde für 90 Minuten auf einem Schüttler bei 37°C absorbiert. Nach Ablauf der Inkubationsperiode, wurden die viralen Verdünnungen entfernt und durch 1 ml Wachstumsmedium ersetzt. Die Platten wurden anschließend für 5 Tage bei 37°C in einer 5%igen CO2 Atmosphäre inkubiert, um dann qualitativ das Ausmaß der zytophatischen Wirkungen (CPE) festzustellen. Die Zytotoxizität wurde durch die Verwendung eines kolorimetrisches MTT (2-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid) Assays (Cell Titer 96, Katalognummer G4000, Promega Corporation, Madison, WI 53711), womit die mitochondriale Enzymaktivität bestimmt wird, bei 570 nm detektiert und quantifiziert (Mosman, T., 1983, J. Immunol. Methods 65:55). Die Viabilität in den virusbehandelten Vertiefungen wurde als Prozentsatz bezogen auf die Aktivität in unbehandelten Kontrollvertiefungen ausgedrückt. Der IC50 bestimmte sich als die Menge an Virus in PFU/Vertiefung, die eine 50%ige Reduktion der Menge an viablen Zellen zur Folge hat.
  • Die Ergebnisse sind in den Tabellen 4, 5 und 6 gezeigt. PPMMK107 zeigte eine hohes Maß an zytotoxischer Aktivität gegenüber einer verschiedenartigen Gruppe von humanen Krebszellen, wobei 30 von 39 malignen Zelllinien, verglichen mit der relativen Unempfindlichkeit von normalen humanen Zelltypen, einen IC50 Wert kleiner als 1000 hatten. Die Mehrheit der humanen Krebszellen hatte IC50 Werte, die um 2 bis 3 Größenordnungen niedriger waren als die der meisten normalen humanen Zelltypen. Tabelle 4.Zusammnenfassug der Ztotoxizitätserebnisse
    Tumortyp Zelllinie IC50 (PFU/Vertiefung)
    Fibrosarkom HT1080 2
    Melanom SKMEL2 8
    SKMEL3 2
    SKMEL5 4
    A375 37
    MALME-3M 778
    HT144 28
    Brustkarzinom SKBR3 10
    MDA-MB-468 44
    ZR75-1 78
    Eierstockkarzinom SW626 4
    PA-1 4
    ES-2 13
    SKOV-3 24
    OVCAR3 34
    Lungenkarzinom (Große Zelle, niedrige Passage) H-1299 26
    Glioblastom U87MG 25
    U373MG 765
    U138 38
    A172 207
    Blasenkarzinom HT1197 3
    UM-UC-3 54
    HT1376 422
    Neuroblastom IMR32 41
    Zervixkarzinom HeLa 4
    Prostatakarzinom DU-145 31
    PC3 3,1 × 103
    Dickdarmkarzinom SW620 55
    HT29 > 1,0 × 106
    Kopf- und Halskarzinom KB 4
    A253 2,7 × 103
    FaDu 2,9 × 103
    Hep-2 1,5 × 104
    Neuroepitheliom SK-N-MC 20
    Kleinzelllungenkarzinom DMS-114 48
    DMS-153 1,1 × 105
    NCI-H345 1,2 × 106
    Kleinzellprostatakarzinom NCI-H660 1,0 × 105
    Leukämie (AML) K562 5,4 × 104
    Tabelle 5. Zusammenfassung der Zytotoxizitätsergebnisse unter Verwendung von normalen Zellen
    Zelltyp Zelle IC50 (PFU/Vertiefung)
    Keratinozyten NHEK 9,0 × 106
    Fibroblasten CCD-922 1,4 × 105
    NHDF 8,1 × 103
    Endothelzellen HPAEC 5,2 × 104
    Nierenzellen RPTEC 2,7 × 104
    Melanozyten NHEM 5,1 × 104
    Astrozyten NHA 3,8 × 103
    Tabelle 6. Zusammenfassung der Zytotoxizitätsergebnisse unter Verwendung von rasch proliferierenden normalen humanen Zellen
    Proliferationsrate
    Zelltyp IN VIVO IN VITRO IC50
    (PFU/Vertiefung)
    Knochenmarkzellen Mittel bis hoch Hoch 6,2 × 103
    CD34+ angereichert bis 50%
    Brustepithelzellen Sehr niedrig1 Hoch1 30
    1Getestete humane Brustepithelzellen (HMEC)hatten eine hohe Proliferationsrate nach Stimulation mit bovinem Hypophysenextrakt und humanem Epidermalem Wachstumsfaktor. In deutlichem Gegensatz dazu, haben normale Brustepithelzellen fast immer eine sehr niedrige Proliferationsrate in erwachsenen Frauen mit Krebs.
  • Beispiel 2
  • Die Verwendung von PPMK107 zur intratumoralen Behandlung von humanen Tumorfremdtransplantaten (< 10 mm und > 5 mm) in thymuslosen Mäusen.
  • Thymuslosen Mäusen wurden intradermal 10 Millionen humane Tumorzellen injiziert. Nachdem die Tumoren eine Größe zwischen 5 und 10 mm erreicht hatten, wurde eine einzelne Injektion mit PPMK107 (eine Dosis von 3 × 108 PFU) oder Kochsalzlösung verabreicht. Fast alle Tumortypen in mit PPMK107 behandelten Mäusen zeigten eine komplette oder teilweise Regressionsrate, die zwischen 50% und 100% lag. Die einzige Ausnahme ist im Fall des U87MG Experimentes aufgetreten (Experiment I): Obwohl nur einer von 9 mit PPMK107 behandelten Tumoren sich vollständig zurückgebildet hat, zeigten zwei weitere virusbehandelte Tumoren eine Regression von 32% und 20% und zwei weitere virusbehandelte Tumoren zeigten ein langsameres Wachstum als alle 8 Tumoren, die mit der Kontrollkochsalzlösung behandelt wurden. Eine Tumorregression war in dem mit Kontrollkochsalzlösung behandelten Tumoren so gut wie nicht vorhanden: In all diesen Experimenten (A bis I aufgelistet in Tabelle 7) zeigte nur eine von 73 Kontrollen eine Regression. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass verschiedenartige Tumortypen Antworten auf die intratumorale PPMK107 Behandlung zeigen.
  • Um die Virusreplikation innerhalb des Tumors zu untersuchen, wurde unter Verwendung des subkutanen HT1080 Fibrosarkommodells, das immunohistchemische Färbeverfahren zur Detektion eines viralen Antigens (Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gegen das NDV P Protein) angewandt. Dreißig Minuten nach intratumoraler Injektion von 3 × 108 PFU PPMK107, war das Tumorgewebe negativ für virales Antigen. Zwei Tage nach der Behandlung jedoch, wurde eine intensive Immunfärbung für virales Antigen innerhalb des Tumors beobachtet, was auf eine Virusreplikation innerhalb des Tumors hindeutet. Bedeutenderweise war die Virusreplikation spezifisch für das Tumorgewebe, da das benachbarte Bindegewebe und Haut negativ für virales Antigen waren.
  • Beispiel 3
  • Die Verwendung von PPMK107 für die intravenöse Behandlung von humanen Tumorfremdtransplantaten (< 8,5 mm und > 5,5 mm ) in thymuslosen Mäusen.
  • Thymuslosen Mäusen wurde intrademal 10 Millionen HT1080 Firbrosarkomzellen injiziert. Nachdem die Tumoren eine Größe zwischen 5 und 8 mm erreicht hatten, wurde eine oder mehrere intravenöse Injektionen mit PPMK107 oder Kochsalzlösungen verabreicht. Wie in Tabelle 8 gezeigt, wurde für die höchste Virusdosis (1 × 109 PFU) eine komplette Tumorregression in allen sieben Mäusen beobachtet. Einzelne Injektionen von 3 × 108 und 6 × 107 resultierten in Regressionsraten von über 90%. Während eine einzelne IV Injektion von 3 × 108 nur eine 55%ige Regressionsrate zur Folge hatte, so ergab sich für drei IV Injektionen bei dieser Dosis eine 100%ige Antwortrate. Mäuse die mit IV Kochsalzlösung behandelt wurden, zeigten keine Anzeichen für eine Tumorregression. Diese Ergebnisse zeigen, dass subkutane HT1080 Tumoren sehr empfindlich auf die IV Behandlung mit PPMK107 reagieren.
    Tabelle 7. Intratumorale Behandlung von subkutanen humanen Tumorfremdtransplantaten (< 10 mm und > 5 mm) in thymuslosen Mäusen mit PPMK107
    Tumor Tumortyp Exp.Nr Dosis N Vollständige Regression Vollständige + partielle Regression
    HT1080 Fibrosarkom A 3,00E + 08 12 11 11
    B 3,00E + 08 9 8 8
    C 3,00E + 08 8 8 8
    PA-1 Eierstockkarzinom D 3,00E + 08 9 9 9
    KB Munhöhlenkarzinom E 3,00E + 08 12 7 10
    SKMEL5 Melanom F 3,00E + 08 8 5 7
    A375 Melanom G 3,00E + 08 8 5 7
    H 3,00E + 08 8 1 4
    U87MG Glioblastom I 3,00E + 08 9 1 1
    Tabelle 8. Intravenöse Behandlung von subkutanenhumanen HT1080 Firbosakomfremdtransplantaten (< 8,5 mm und > 5,5 mm) in thymuslosen Mäusen mit PPMK107
    Dosis Zeitplan N Vollständige Regression Vollständige + partielle Regression % Regression
    1,00E + 09 Eine Injektion 7 7 7 100%
    3,00E + 08 Eine Injektion 10 9 10 100%
    6,00E + 07 Eine Injektion 11 10 10 91%
    2,00E + 07 Eine Injektion 11 5 6 55%
    2,00E + 07 Drei Injektionen jeweils am anderen Tag 7 5 7 100%
    Kochsalzlösung Eine Injektion 10 0 0 0%
    Kochsalzlösung Drei Injektionen jeweils am anderen Tag 6 0 0 0%
  • Beispiel 4
  • Erstes Experiment, das PPMK107 zur intratumoralen Behandlung von großen A375 Melanomfremdtransplantaten in thymuslosen Mäusen verwendet
  • Thymuslosen Mäusen wurden intradermal 10 Millionen A375 humane Melanomzellen injiziert. Zehn Tage später, wurden Tumoren unterschiedlicher Größe mit einer einzelnen PPMK107-(Dosen von 3 × 108, 9 × 108 und 1,5 × 109 PFU) oder Kochsalzlösunginjektion behandelt. Die neun Tumoren, die an der Stelle der größten Ausdehnung 10 bis 11 mm maßen, bildeten sich als Antwort auf die intratumorale Behandlung mit diesen PPMK107 Dosen alle vollständig zurück, während 12 von 24 Tumoren, die an der Stelle der größten Ausdehnung 8 bis 9,5 mm maßen, sich als Antwort auf die Virustherapie vollständig zurückbildeten (P < 0,008; Tabelle 9, Abschnitt A). In allen Mäusen die mit Kochsalzlösung behandelt wurden, wurde keinerlei Tumorregression beobachtet.
  • Für die gleichen Tumoren zeigte sich, wenn nach Tumorvolumen sortiert, ein hoher Prozentsatz vollständiger Regression für das höhere Volumen. Als Antwort auf diese PPMK107 Dosen, trat eine vollständige Regression für 14 von 17 Tumoren mit einem Volumen > 300 mm3 (im Bereich von 304 bis 397 mm3) und für 7 von 16 Tumoren mit Volumina < 300 mm3 (im Bereich von 144 bis 295 mm3; P < 0.023; Tabelle 9, Abschnitt B) ein.
  • Diese Ergebnisse zeigen, dass Tumoren mit wenigsten 1 cm Länge oder 300 mm3 Volumen wenigstens ebenso, wenn nicht noch empfindlicher, gegenüber der intratumoralen Behandlung mit PPMK107 sind, als kleinere Tumoren.
  • Beispiel 5
  • Zweites Experiment, das PPMK107 zur intratumoralen Behandlung von großen A375 Melanomfremdtransplantaten in thymuslosen Mäusen verwendet
  • Die Tumoren wurden wie in Beispiel 4 zehn Tage nach der Inokulation mit Tumorzellen, etabliert. Die Behandlung bestand aus verschiedenen Dosen PPMK107 (3 × 106 PFU, 3 × 107, 3 × 108 und 1,5 × 109) oder Kochsalzlösung. Für Tumoren, die an der Stelle der größten Ausdehnung 10 bis 11,5 mm maßen, trat eine vollständige oder teilweise (wenigstens 50%) Regression in allen 28 Tumoren auf, die mit PPMK107 unter Verwendung dieser Dosen behandelt wurden, im Gegensatz zu keinerlei Regression in kochsalzlösungsbehandelten Mäusen (Tabelle 10, Abschnitt A).
  • Wenn die gleichen Tumoren nach Tumorvolumen sortiert wurden, so bildeten sich alle 26 Tumoren die größer als 300 mm3 (im Bereich von 309 bis 525 mm3) vollständig oder teilweise (wenigstens 50%) als Antwort auf PPMK107 zurück, im Gegensatz zu keiner der kochsalzlösungsbehandelten Mäuse (Tabelle 10, Abschnitt B).
  • Diese Ergebnisse bestätigen, dass Tumoren mit wenigsten 1 cm Länge oder 300 mm3 Volumen empfindlich für eine intratumorale PPMK107 Behandlung sind.
    Tabelle 9. Intratumorale PPMK107 Behandlung von intradermalen A375 Melanomfremdtransplantaten
    A. Tumoren sortiert basierend auf der einzelnen längsten Ausdehnung
    Tumordimension: 8 bis 9,5 mm Tumordimension: 10 bis 11 mm
    Behandlung Dosierung N Vollständige Regression % N Vollständige Regression %
    PPMK107 1,5 × 109 8 2 25% 3 3 100%
    PPMK107 9,0 × 108 8 7 88% 3 3 100%
    PPMK107 3,0 × 108 8 3 38% 3 3 100%
    Total 24 12 50% 9 9 100% a
    Kochsalzlsng 6 0 0% 3 0 0%
    B. Tumoren sortiert basierendauf dem Tumorvolumen
    Tumorvolumen: < 300 mm3 Tumorvolumen: > 300 mm3
    Behandlung Dosierung N Vollständige Regression % N Vollständige Regression %
    PPMK107 1,5 × 109 6 2 33% 5 3 60%
    PPMK107 9,0 × 108 4 3 75% 7 7 100%
    PPMK107 3,0 × 108 6 2 33% 5 4 80%
    Total 16 7 44% 17 14 82% b
    Kochsalzlsng 8 0 0% 1 0 0%
    a – P < 0,008 für die vollständige Regression in der PPMK107 behandelten 10-11 mm Gruppe im Vergleich zur PPMK107 behandelten 8-9,5 mm Gruppe
    b – P < 0,008 für die vollständige Regression in der PPMK107 behandelten > 300 mm3 Gruppe im Vergleich mit der PPMK107 behandelten < 300 mm3 Gruppe
    Tabelle 10. Intratumorale PPMK107 Behandlung von intradermalen A375 Melanomfremdtransplantaten
    A. Tumoren 10 bis 11,5 mm (sortiert basierendauf der größten Ausdehnung)
    Regressionen
    Behandlung Dosis N Vollständig % Vollständig + partial %
    1,5 × 108 7 7 100% 7 100%
    3,0 × 108 7 6 86% 7 100%
    3,0 × 107 7 5 71% 7 100%
    3,0 × 106 7 5 71% 7 100%
    Alle PPMK107 Gruppen 28 23 82% 28 100%
    Kochsalzlösung 6 0 0% 0 0%
    B. Tumoren > 300 mm3 (sortiert basierend auf dem Tumorvolumen)
    Regressionen
    Behandlung Dosis N Vollständig % Vollständig + partial %
    1,5 × 108 7 7 100% 7 100%
    3,0 × 108 7 6 86% 7 100%
    3,0 × 107 6 4 67% 6 100%
    3,0 × 106 6 4 67% 6 100%
    Alle PPMK107 Gruppen 26 21 81% 26 100%
    Kochsalzlösung 5 0 0% 0 0%
  • Beispiel 6
  • Drittes Experiment, das PPMK107 zur intratumoralen Behandlung von großen A375 Melanomfremdtransplantaten in thymuslosen Mäusen verwendet
  • Die Tumoren wurden wie in Beispiel 4 neunzehn Tage nach der Inokulation mit Tumorzellen, etabliert. Die Behandlung bestand aus verschiedenen Dosen PPMK107 (3 × 108, 3 × 106, 3 × 105, 3 × 104, 3 × 103, 3 × 102 PFU) oder Kochsalzlösung. Für Tumoren, die an der Stelle der größten Ausdehnung 12,5 bis 14 mm maßen (Volumenbereich: 632 bis 787 mm3, durchschnittliches Volumen: 698 mm3), traten mindestens 50%ige Tumorregressionen in zwei von drei Mäusen, die mit 3 × 108 PFU behandelt wurden, auf. Dies stand im Gegensatz zu keinerlei Regression in kochsalzlösungsbehandelten Mäusen (Tabelle 11). Unter Verwendung der gleichen PPMK107 Dosis (3 × 108 PFU) zur Behandlung von Tumoren, die die an der Stelle der größten Ausdehnung 10 bis 12 mm maßen (Volumenbereich: 320 bis 600 mm3, durchschnittliches Volumen: 411 mm3), zeigten sieben von acht Mäusen eine Regression von wenigstens 25% (P < 0,001 für eine Regression von wenigstens 25% verglichen mit den kochsalzlösungbehandelten Mäusen, die keinerlei Regression zeigten, Tabelle 11). Regressionen von mindestens 25% für Tumoren von 10 bis 12 mm Länge wurde ebenfalls bei Mäusen die mit 3 × 106, 3 × 105, 3 × 104, 3 × 103 PFU behandelt wurden, aber nicht bei Mäusen die mit 3 × 102 PFU oder Kochsalzlösung behandelt wurden, festgestellt (Tabelle 11).
  • Die Ergebnisse bestätigen dass Tumoren von wenigsten 1 cm Länge oder 300 mm3 Volumen empfindlich für eine intratumorale PPMK107 Behandlung sind.
  • Beispiel 7
  • Viertes Experiment, das PPMK107 zur intratumoralen Behandlung von großen A375 Melanomfremdtransplantaten in thymuslosen Mäusen verwendet
  • Tumoren, deren größte Ausdehnung 10 bis 12 mm betrug, wurden wie in Beispiel 4 dreizehn Tage nach der Inokulation mit Tumorzellen, etabliert. Die intratumorale Behandlung bestand aus einer einzigen Injektion von 3 × 108 PFU PMMK107 oder Kochsalzlösung. Die Volumina der mit PMMK107 behandelten Tumoren lagen im Bereich von 295 bis 600 mm3 (bei einem durchschnittlichen Tumorvolumen von 437 mm3). Eine Anzahl von Mäusen aus einer jeden Behandlungsgruppe wurde zur Untersuchung der Tumorhistologie, am Tag 0, 2, 3, 4, 7 und 14 eingeschläfert. Für die Mäuse, die mindesten über einen Zeitraum von 4 Tagen beobachtet wurden, zeigte sich bei elf von zwölf Mäusen, die mit PPMK107 behandelt wurden, eine Regression von mindestens 25%, verglichen mit keiner Regression bei 8 Mäusen in der Kochsalzgruppe (P < 0,0001, Tabelle 12). Zwei Tage nach der PPMK107 Behandlung, zeigten zwei Tumoren bereits Anzeichen einer Regression, doch betrug der Grad der Regression weniger als 25%.
    Tabelle 11. Drittes Experiment, das PPMK107 zur intratumoralen Behandlung vo n großen A375 Melanom fremdtransplantaten verwendet (mindestens 10 mm groß)
    Größe: 12,5 bis 14 mm
    Regressionen
    Behandlung N Volumenbereich Durchschnittliches Volumen Vollstän-dig Partiella > 25% & < 50%b Gesamtzahl der Regressionenc % Regressinnc
    3,0E + 8 3 632 bis 787 698 1 1 0 2 67%
    2 717 bis 860 788 0 0 0 0 0%
    Größe: 10 bis 12 mm
    Regressionen
    Behandlung N Volumenbereich Durchschnittliches Volumen Vollstän-dig Partiala > 25% & < 50%b Gesamtzahl der Regressionenc % Regressinnc
    3,0E + 8 8 320 bis 600 411 0 0 4 7 88% a
    3,0E + 6 8 425 bis 662 502 0 0 2 2 25%
    3,0E + 5 8 245 bis 600 421 0 0 1 1 13%
    3,0E + 4 8 336 bis 600 477 0 0 1 1 13%
    3,0E + 3 8 281 bis 542 349 2 0 0 2 25%
    3,0E + 2 8 281 bis 662 372 0 0 0 0 0%
    Kochsalzlösung 8 379 bis 666 518 0 0 0 0 0%
    a – Partielle Regression ist definiert als Regression kleiner als 100% und gleich oder größer als 50%
    b – „Regression > 25% & < 50%" ist definiert als eine Tumorregression größer als 25% und weniger als 50%
    c – Schließt jegliche Tumorregression mit ein, die größer als 25% ist
    d – P < 0,001 für eine Regression, die verglichen mit der Kochsalzgruppe, in der 3E + 08 Gruppe größer als 25% ist,
    Tabelle 12. Viertes Experiment, das PPMK107 zur intratumoralen Behandlung von großen A375 Melanomfremdtransplantaten verwendet (mindestens 10 mm groß)
    Tumorgröße: 10 bis 12 mm
    Regressionen
    Behand-lung Tag der Euthanasierung nach Behandlung N Vollständig Partiella > 25% & < 50%b Gesamtzahl der Regressionenc % Regressinnc
    3,0E + 8 14 Tage 3 0 2 1 3 10%
    3,0E + 8 7 Tage 3 0 2 1 3 100%
    3,0E + 8 4 Tage 3 0 2 1 3 100%
    3,0E + 8 3 Tage 3 0 0 2 3 67%
    3,0E + 8 Alle PPMK107 Gruppen 12 0 6 5 11 92% d, e
    Kochsalzlsng 14 Tage 2 0 0 0 0 0%
    Kochsalzlsng 7 Tage 2 0 0 0 0 0%
    Kochsalzlsng 4 Tage 2 0 0 0 0 0%
    Kochsalzlsng 3 Tage 2 0 0 0 0 0%
    Kochsalzlsng Alle Kochsalzlösungsgruppen 8 0 0 0 0 0%
    a – Partielle Regression ist definiert als Regression kleiner als 100% und gleich oder größer als 50%
    b – „Regression > 25% & < 50%" ist definiert als Tumorregressiongrößer als 25% und weniger als 50%
    c – Schließt eine Tumorregression mit ein, die wenigstens 25% beträgt
    d – P < 0,03 für vollständige oder partielle Regression in der PPMK107 Gruppe bestehend aus 12 Mäusen verglichen mit der Kochsalzgruppe bestehend aus 8 Mäusen
    e – P < 0,001 für eine Regression von wenigstens 25% in der PPMK107 Gruppe bestehend aus 12 Mäusen verglicheqn mit der Kochsalzgruppe bestehend aus 8 Mäusen
  • Beispiel 8
  • Fünftes Experiment, das PPMK107 zur intratumoralen Behandlung von großen A375 Melanomfremdtransplantaten in thymuslosen Mäusen verwendet
  • Tumoren, deren größte Ausdehnung 10 bis 12 mm betrug, wurden wie in Beispiel 4 zwanzig Tage nach der Inokulation mit Tumorzellen, etabliert. Die intratumorale Behandlung bestand aus einer einzigen Injektion von 3 × 108 PFU PMMK107 oder Kochsalzlösung. Die Volumina der mit PMMK107 behandelten Tumoren lagen im Bereich von 361 bis 756 mm3 (bei einem durchschnittlichen Tumorvolumen von 551 mm3). Neun von zehn Mäusen die mit PPMK107 behandelt wurden zeigten eine Regression von mindestens 25% verglichen mit keiner der 10 Mäuse in der Kochsalzgruppe (P < 0,0001, Tabelle 13).
  • Beispiel 9
  • Erstes Experiment, das PPMK107 zur intravenösen Behandlung von großen HT1080 Fibrosakomfremdtransplantaten verwendet
  • Thymuslosen Mäusen wurden subkutan 10 Millionen HT1080 humane Fibrosarkomzellen injiziert. Sechs Tage später, wurden die Tumoren mit einer einzelnen PPMK107-(1,5 × 109 PFU) oder Kochsalzlösunginjektion behandelt. Fünf von sechs Tumoren, die an der Stelle der größten Ausdehnung 10 bis 11 mm maßen, bildeten sich vollständig oder teilweise zurück, als Antwort auf eine einzige intravenöse Injektion von PPMK107, verglichen mit keinem der kochsalzlösungbehandelten Tumoren (Tabelle 14, P < 0,025). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Tumoren von mindestens 1 cm Länge auf die intravenöse PPMK107 Behandlung reagieren.
    Tabelle 13. Fünftes Experiment, das PPMK107 zur intratumoralen Behandlung von großen A375 Melanomfrem dtransplantaten verwendet (mindestens 10 mm groß)
    Größe: 10 bis 12 mm
    Regressionen
    Behandlung N Vollständig Partiella > 25% & < 50%b Gesamtzahl der Regressionenc % Regressionc
    3,0E + 8 10 0 4 5 9 90% d, e
    Kochsalzlösung 10 0 0 0 0 0%
    a – Partielle Regression ist definiert als eine Regression kleiner als 100% und gleich oder größer als 50%
    b – „Regression > 25% & < 50%" ist definiert als Tumorregression größer als 25% und weniger als 50%
    c – Schließt jegliche Tumorregression die wenigstens 25% ist mit ein
    d – P<0,05 für vollständige oder partielle Regression in der PV701 Gruppe verglichen mit der Kochsalzgruppe
    e – P < 0,0001 für alle Tumorregressionen von wenigstens 25% in der PV701 Gruppe verglichen mit der Kochsalzgruppe
    Tabelle 14. Intravenöse Behandlung von subkutanen HT1080 Fibrosakomfremdtransplantaten in thymuslosen Mäusen humanen
    Größe: 10 bis 11 mm
    Regressionen
    Behandlung Dosis N Vollständig % Vollständig + partiell %
    PPMK107 1,5E + 09 6 4 67% 5 83% a
    Kochsalzlösung 4 0 0 0 0
    a – P < 0,025 (nach dem exakten Test von Fisher) für vollständige oder partielle Regression (wenigstens 50% Regression) in der PPMK107 behandelten Gruppe verglichen mit der Kochsalzgruppe
  • Beispiel 10
  • Spezifische Beseitigung einer PPMK107 Infektion aus normalen Zellen aber nicht aus Tumorzellen
  • Um den Mechanismus des tumorspezifischen Abtötens durch den NDV Stamm PPMK107 zu untersuchen, wurden repräsentative Tumorzellen basierend auf den folgenden Kriterien ausgesucht: a) die Fähigkeit Tumoren als Fremdtransplantate in Mäusen auszubilden; b) die Tumorfremdimplantate werden nach Verabreichung von PPMK107 spezifisch in vivo abgetötet; c) die Tumorzellen werden in vitro durch PPMK107 abgetötet, bei Viruskonzentration die mehrere log-Einheiten unter der Konzentration, die notwendig ist, um resistente, normale Zellen abzutöten und d) Tumorzellen müssen, wenn eine Kokultur vorliegt, leicht von den normalen Zellen zu unterscheiden sein. Fremdtransplantierte Tumoren, die KB Hopf- und Halskarzinomzellen umfassten, zeigen zu 83% eine vollständige oder partielle Regression als Antwort auf eine einzige intratumorale Injektion mit PPMK107, sind mehr als vier log-Einheiten empfindlicher gegenüber dem Abtöten mit PPMK107 in vitro, als es normale primäre Haufibroblasten (CCD922-sk) sind und sind leicht zu unterscheiden von CCD922-sk Zellen, wenn als Kokultur vorhanden.
  • Dementsprechend, wurden Kokulturen von KB und CCD922-sk Zellen mit einer Multiplizität der Infektion (moi, multiplicity of infection, das Verhältnis von hinzugefügtem Virus pro Zelle) von 0,0005 infiziert und die Infektion wurde über einen Zeitraum von 5 Tagen mit Hilfe von immunhistochemischem Färben auf virales Antigen (NDV P Protein) hin überprüft. Die Infektion von normalen Zeilen erreichte ihren Höhepunkt nach zwei Tagen mit wenig oder keinem offenkundigem Zellsterben, was anhand einer Sichtprüfung der Zellmonoschicht, festgestellt wurde. Am dritten Tag nach Infektion nahm das Ausmaß der viralen Infektion deutlich ab, während die Infektion der Tumorzellen deutlich vorhanden war. Die Menge an viralem Antigen verschwand in den normalen Zellen an den Tagen 4 und 5, währen die Infektion der Tumorzellen sich rasch in der gesamten Tumorzellenpopulation ausbreitete und in der Zerstörung der Mehrheit der in der Kokultur anwesenden Tumorzellen resultierte.
  • Demnach wurden normale Zellen infiziert doch diese beseitigten die Infektion umstandslos, auf eine Art und Weise die konsistent mit den antiviralen Wirkungen von IFN ist. Die Tumorzellen waren nicht in der Lage einen antiviralen Zustand als Antwort zu etablieren und wurden durch die ungehinderte Virusvermehrung abgetötet, trotz der Anwesenheit von physiologisch wirkungsvollen Konzentrationen von IFN, die von den normalen Zellen in das Medium sekretiert wurden.
  • Beispiel 11
  • Beweisführung, dass Interferon in CCD922-sk Zellen, ein wichtiger Bestandteil zur Beseitigung von Viren ist.
  • Die Hypothese, dass Interferon die Fähigkeit der CCD922-sk Zellen vermittelt, die Infektion mit PPMK107 zu beseitigen, wurde überprüft. Polyklonale, neutralisierende Antikörper für das humane Interferon-α oder Interferon-β, allein oder in Kombination verwendet, wurden täglich zu CCD922-sk Kulturen, die mit PPMK107 mit einer moi von 0,0005 infiziert waren, hinzugefügt und der Verlauf der Infektion wurde über einen Zeitraum von drei Tagen beobachtet. Die Menge an in den Zellen vorhandenem Virusantigen nahm proportional mit der Konzentration des neutralisierenden Antikörpers zu, wobei die Wirkung des Antiinterferon-β-Antikörpers, deutlicher war als der des Antiinterferon-α-Antikörpers; was konsistent ist mit Berichten, dass Fibroblasten hauptsächlich die beta-Form des Interferons produzieren.
  • Die Fähigkeit normal unempfindliche Zellen durch die Zugabe eines neutralisierenden Antikörpers für Interferon suszeptibler für eine Infektion mit PPMK107 zu machen, unterstützt die Hypothese, dass ein Hauptunterscheidungsmerkmal zwischen der Empfindlichkeit von normalen Zellen, aber nicht Tumorzellen gegenüber dem Abtöten durch PPMK107, in der Fähigkeit von normalen Zellen, aber nicht Tumorzellen, eine Interferon-vermittelte antivirale Antwort zu etablieren, liegt.
  • Beispiel 12
  • Beweisführung, dass Interferon-β in anderen normalen Zellen ein wichtiger Bestandteil zur Beseitigung von Viren ist.
  • In diesem Experiment, wurde bestimmt, dass andere normale Zellen (NHEK, normale humane Epithelzellen), von denen bekannt war, das sie durchaus resistent gegenüber dem Abtöten durch PPMK107 sind, durch die Zugabe von polyklonalem Antiinterferon-β-Antikörper zu einer Kultur infizierter Zellen, empfindlicher gemacht wurden. NHEK (normale human Epithelkeratinocyten) Zellen wurden mit einer moi von entweder 0,0005 oder 0,05 infiziert und Antikörper wurde täglich über einen Zeitraum von fünf Tagen hinzugefügt.
  • In Kulturen, die mit einer niedrigen moi (0,0005) infiziert wurden, war eine antiköperabhängige Zunahme der viralen Antigenexpression fünf Tage nach Infektion klar, aber zu einem früheren Zeitpunkt des Experimentes weniger klar. Die Zugabe von Antikörper zu Kulturen, die mit PPMK107 mit einer moi von 0,05 infiziert wurden, resultierte in einer deutlichen Zunahme an viralem Antigen am vierten und fünften Tag nach Infektion. Am Tag zwei und drei nach der Infektion ergab sich nach der Zugabe von neutralisierendem Antiköper eine geringere Akkumulation von viralem Antigen (Figur. 1).
  • Die Kulturüberstände der hohen moi Proben wurden ebenso auf die Menge an infektiösem Virus titiriert, das wie durch ein Plaqueassay bestimmt, auf HT1080 Fibrosakomtumorzellen anwesend war; dem Standardassaysystem in unserem Labor. Die Ergebnisse dieser Analysen zeigten, dass fünf Tage nach der Infektion, eine 19fache Zunahme in der Menge an infektiösem Virus in den antikörperbehandelten Kulturen relativ zu den scheinbehandelten Kontrollen, aufgetreten war (Figur. 1).
  • Diese Ergebnisse suggerieren einen allgemeinen Mechanismus, durch den normale Zellen durch einen Interferon-bezogenen Mechanismus vor dem Abtöten durch PMMK107 geschützt sind.
  • Beispiel 13
  • Vergleich der Wirkung von Interferon-β auf die PPMK107 Infektion von Tumor- und normalen Zellen
  • Es wurde ein Vergleich bezüglich der Wirkung von exogen hinzugefügtem Interferon-β auf die Infektion von normalen (CCD922-sk) und Tumorzellen von hoher (KB) oder mittlerer (HEp2) Empfindlichkeit für PPMK107 durchgeführt. Separate Kulturen dieser drei Zellarten wurden mit Interferon-β bei Konzentrationen von 20, 200 oder 2000 Units/ml einen Tag vor der Infektion und 2 Tage nach einer Infektion mit einer moi von 0,0005, behandelt.
  • Drei Tage nach Infektion war das niedrige Niveau der viralen Antigenexpression, die in normalen Zellen vorhanden ist, bei allen verwendeten Interferondosen, eliminiert. Umgekehrt, senkte die Zugabe von Interferon zu den hochempfindlichen KB Tumorzellen bei Konzentrationen von 2 oder 200 Units/ml die relativen Niveaus der viralen Antigenexpression um das zweifache, mit einer vollständigen Suppression bei 1000 Units/ml Interferon. Die mittelempfindlichen HEp-2 Zellen reagierten auf das exogene Interferon mit dem Verschwinden der viralen Antigenexpression bei sämtlichen verwendeten Interferondosen (Figur. 2).
  • Das Empfindlichkeitsmuster in den KB und CCD922-sk Zellen gegenüber der. antiviralen Wirkung von exogen hinzugefügtem Interferon-β war umgekehrt proportional zur Empfindlichkeit dieser Zellen durch PPMK107 abgetötet zu werden. Die Fähigkeit der HEp-2 Zellen auf die Wirkungen des Interferons zu reagieren, deutet darauf hin, dass diese Zellen in der Lage sind, die in diesem Experiment verwendeten Interferonkonzentrationen effizient zu nutzen. Ähnlich weist die Antwort der KB Zellen auf die hohen Interferondosen darauf hin, dass die Unfähigkeit eine Interferonvermittelte antivirale Antwort zu etablieren, nicht das Ergebnis eines absoluten Defekts im Interferonpfad ist, sondern eher einer relativen Unempfindlichkeit verglichen mit normalen Zellen.
  • Beispiel 14
  • Die Wirkung von niedrigen Interferon-β-Konzentrationen auf die die PPMK107 Infektion von normalen Zellen und Tumorzellen
  • In diesem Experiment wurden normale (CCD922-sk) Zellen und Tumorzellen (KB) mit niedrigen Interferon-β-Konzentrationen (0,2, 2 und 20 Units/ml) einen Tag bevor und 2 Tage nach der Infektion mit PPMK107 mit einer moi von 0,05, behandelt.
  • Unter diesen Bedingungen nahm in normalen Zellen die virale Antigenmenge dosisabhängig ab, wohingegen die relativen Niveaus von viralem Tumorantigen in Tumorzellen nicht von der Zugabe von exogenem Interferon betroffen waren (Figur. 3).
  • Beispiel 15
  • PPMK107 Aufreinigung
  • Verfahren A
  • PPMK107 wurde über eine dreifache Plaqueaufreinigung aus dem mesogenen Newcastle Disease Virusstamm Mass-MK107 erhalten. Ungefähr 1000 PFUs (plaque forming units, infektiöse Einheiten) von lebendem Virus wurden in die Allantoisflüssigkeitshöhle eines jeden zehn Tage alten embryotragenden Hühnereis inokuliert. Nach einer Inkubation bei 36°C für 46 Stunden, wurden die Eier gekühlt und die Allantoisflüssigkeit geerntet. Zellen und Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation bei 1750 × g für 30 Minuten aus der Allantoisflüssigkeit entfernt. Die geklärte Allantoisflüssigkeit (der virusenthaltende Überstand) wurde anschließend auf einen 20%/55%igen Sucrosestufengradienten aufgetragen und bei ungefähr 100000 × g für 30 Minuten zentrifugiert. Das gereinigte Virus wurde der 20%55% Grenzfläche entnommen und um die Sucrose zu entfernen, gegen Kochsalzlösung dialysiert.
  • Verfahren B
  • In einer anderen vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung wurde die geklärte Allantoisflüssigkeit bei –70°C eingefroren. Nach dem Auftauen, wurde die Flüssigkeit bei über Nacht bei 1 bis 4°C aufbewahrt und anschließend wurde das kontaminierende Material mittels Zentrifugation (1750 × g für 30 Minuten) aus der Virussuspension entfernt. Dieses Material wurde unter Verwendung des diskontinierlichen Sucrosegradienten in der Ultrazentrifuge wie oben beschreiben weiter aufbereitet.
  • Verfahren C
  • In einer anderen vorteilhaften Ausführungsform, wird die Ultrazentrifugation des kontinuierlichen Sucrosegradienten mittels einer kontinuierlichen Ultradurchlaufzentrifugation durchgeführt.
  • Verfahren D
  • In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform wurde die geerntete Allantoisflüssigkeit mit einem Puffer, der 5% Mannitol und 1,0% L-Lysin, pH 8.0 (ML Puffer) enthält, verdünnt und über eine tangentiale Flow-Filtration (TFF) durch Filter mit einer nominalen Porengröße von 45 μm, geklärt und vollständig in ML Puffer aufgenommen. Das Permeat, das das geklärte Virus in ML Puffer enthält, wird gesammelt und das Virus wird über TFF durch Filter mit einer nominalen Ausschlussgröße von 300000 Daltons weiter aufgereinigt. Das aufkonzentrierte, gereinigte, in ML Puffer enthaltene Virus wird als das Retentat dieses Schrittes gesammelt und erneut mit ML Puffer verdünnt, bevor aus auf eine Sephacryl S55 (Pharmacia) Gelpermeationssäule, die mit ML Puffer equilibriert ist, aufgetragen wird.
  • Ergebnisse
  • * Klonaler Virus
  • Nach Generierung von PPMK107 über Plaqueaufreinigung, wurden acht individuelle molekulare Klone in der Virionpopulation gefunden, die eine identische Sequenz (z.B. ein Homologie von 100%) über 300 zusammenhängende Nukleotide innerhalb des Fusionsproteingens von NDV aufwiesen. PPMK107 ist ein klonales Virus mit einem hohen Grad genetischer Homogenität.
  • * PFU/mg Protein
  • Ein quantitatives Verfahren, die Reinheit zu messen, ist die Bestimmung der PFU/mg Protein. Höhere Werte deuten auf einen größeren Reinheitsgrad hin. Unter Verwendung des Verfahrens A, wurden PFU/mg Werte von mindestens 4.8 × 1010 erreicht (siehe Tabelle 15). Unter Verwendung von Verfahren C, wurden PFU/mg Protein Werte von mindestens 2,0 × 1010 erreicht. Für einen mesogenen NDV Stamm wurde kein Literaturwert für diese Art von Reinheitsbestimmung gefunden. Die beste Abschätzung für einen mesogenen NDV Stamm ist die Viruspräparation (NDV MassMK107, Charge RU2, hergestellt wie in Faaberg KS und Peeples, ME, 1988, J Virol 62:586; und Bratt, MA und Rubin, H, 1967, Virology 33:598-608). Für die RU2 Charge wurde ein PFU/mg von 1,3 × 109 PFU/mg Protein bestimmt. Die über das Verfahren A erreichten Reinheitswerte sind ungefähr 40mal besser als die, die mit dem Verfahren nach Peeples erhalten wurden (siehe Tabelle 15).
  • * Partikel pro PFU Verhältnis
  • Ein weiteres quantitatives Hilfsmittel, den Reinheitgrad zu bestimmen, ist durch die Bestimmung des Verhältnisses der Partikel pro PFU. Niedrigere Werte weisen auf einen höheren Reinheitsgrad hin. Partikelzählungen wurden anhand eines Elektronenmikroskops unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt. Unter Verwendung von Verfahren A oder Verfahren B, wurden Partikel pro PFU Werte von annähernd eins erreicht (Tabelle 15). Tabelle 15. Virusreinheit
    Viruspräparationsverfahren Virus Chargennummer PFU pro mg Protein Partikel pro PFU
    Bevorzugtes Verfahren A PPMK107 L2 4,8 × 1010 0,80
    L4 6,9 × 1010 NGa
    L5 6,6 × 1010 NG
    L6 7,7 × 1010 0,55
    L7 6,1 × 1010 NG
    Bevorzugtes Verfahren C PPMK107 D004 2,0 × 1010
    D005 4,5 × 1010 0,32
    D010 4,4 × 1010 0,52
    NG
    Bevorzugtes Verfahren D PPMK107 RD2 5,6 × 1010 NG NG
    RD3 5,0 × 1010 NG
    aNG, nicht getestet
  • Viruspräparationen die die Verfahren A und C verwenden, ermöglichten ebenfalls die Aufreinigung von NDV auf ein Niveau, das im Wesentlichen frei war von kontaminierenden Eiproteinen ist. Für die Präparation der PPMK107 Charge 7 über die Verfahren A, war Ovalbumin in einem Westernblot nicht detektierbar unter Verwendung von (1) 1,7 × 109 PFU aufgereinigtes Virus pro Vertiefung (Durchmesser 3,3 cm) gelaufen auf einem SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese) Gel (1 mm dick); (2) einer Nitrocellulosemembran für den Transfer; (3) und anti-Ovalbumin aus Kaninchen (Cappel IgG Fraktion bei 1:200 Verdünnung einer 4 mg/ml Antikörperkonzentration). Für PPMK107 Präparationen wurden unter Verwendung des Verfahrens D und Analyse über SDS-PAGE gefolgt von Silberfärbung, keine Ovalbumin entsprechende Bande beobachtet.
  • Beispiel 16
  • Die Verwendung von PPMK107 zur Verhinderung von Todesfällen aufgrund von ES-2 Eierstockkarzinomaszites in thymuslosen Mäusen In diesem Experiment wurde allen thymuslosen Mäusen (weiblich, NCR nu/nu, 8 Wochen alt) eine intraperitoneale Injektion mit 106 ES-2 Zellen verabreicht. Sieben Tage später, bevor Aszites sich entwickelt hatte, wurden sie intraperitoneal mit Kochsalzlösung oder PPMK107 (bei 1 × 109 PFU) behandelt. Wie in 4 gezeigt, nahm die Überlebensrate der Tiere die mit PPMK107 behandelt wurden, verglichen mit der Behandlung mit Kochsalzlösung deutlich zu. Die Mehrheit der Mäuse der Kochsalzgruppe hatten Aszites ca. 7 Tage nach der Behandlung entwickelt und am Tag 38 nach Behandlung waren alle Tiere verstorben. In deutlichem Gegensatz dazu, waren 92% der Mäuse, die mit pPMK107 behandelt worden waren, am Tag 38 noch am Leben und 25% dieser Tiere waren Langzeitüberlebende (> 120 Tage Überlebensdauer).
  • Beispiel 17
  • PPMK107 Behandlung von ES-2 Eierstockkarzinomen in thymuslosen Mäusen wenn Aszites besteht
  • In diesem Experiment, wurde allen thymuslosen Mäusen (weiblich, NCR nu/nu, 8 Wochen alt) eine intraperitoneale Injektion mit 106 ES-2 Zellen verabreicht. Vierzehn Tage später, als die Mehrheit der Mäuse Aszites entwickelt hatte, wurden die Mäuse ohne Aszites ausgeschlossen und die Mäuse mit Aszites wurden zufällig in sieben intraperitoneale Behandlungsgruppen eingeteilt (PPMK107 – eine Behandlung am Tag 0; PPMK107 – zwei Behandlungen in der ersten Woche; PPMK107 – eine Behandlung jede Woche; PPMK107 – zwei Behandlung jede Woche; Kochsalzlösung – eine Behandlung am Tag 0; Kochsalzlösung – zwei Behandlungen in der ersten Woche; Kochsalzlösung – zwei Behandlungen jede Woche). Eine Dosis von 1 × 109 PFU/Maus wurde für jede Virusbehandlung verwendet. Allen Mäusen wurde vor der ersten Behandlung und allen zusätzlichen Behandlungen die Aszitesflüssigkeit entnommen. Tag 0 bezieht auf den Tag der ersten Behandlung.
  • Der Aszitesgrad einer jeden Maus wurde wie folgt quantifiziert und notiert:
    Asziteswert Aszitesgrad
    1,0 Tiere erscheinen normal, kein oder nur wenig Aszites vorhanden
    2,0 Abdomen leicht vergrößert; Tier ist in der Lage normal zu funktionieren
    3,0 Abdomen vergrößert; Tier bewegt sich langsam, ist gekrümmt und hat einen schwankenden Gang
    4,0 Abdomen stark vergrößert, Tier ist moribund
    5,0 Tod nach Entwicklung von Aszites
  • Wie Tabelle 16 gezeigt, hatten alle mit Kochsalzlösung behandelten Tiere sowohl am Tag sieben als auch am Tag zehn einen weiter fortgeschrittenen Aszites als die PPMK107-behandelten Tiere. Am Tag sieben nach der Erstbehandlung, hatte jede der Kochsalzgruppe einen durchschnittlichen Asziteswert, der über 3,5 lag, während alle PPMK107-behandelten Gruppen einen Asziteswert von 3,0 oder niedriger aufwiesen.
  • Ähnlich hatte am Tag zehn nach der Erstbehandlung, jede der Kochsalzgruppen einen durchschnittlichen Asziteswert über 4,5, während all PPMK einen durchschnittlichen Asziteswert von 4,1 oder niedriger aufwiesen. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Aszitesflüssigkeitsproduktion in virusbehandelten Tieren verglichen mit den Kochsalzkontrollen deutlich verringert war. Tabelle 16. PPMK107 Behandlung von ES-2 Eierstockarzinomen in thymuslosen Mäusen wenn Aszites vorliegt
    Behandlung Anzahl der Mäuse Durchschnittlicher Asziteswert, Tag 7 Durchschnittlicher Asziteswert, Tag 10
    Kochsalzlösung ×1 12 4,3 4,7
    Kochsalzlösung ×2 12 3,7 4,6
    Kochsalzlösung ×2 jede Woche 12 4,3 4,8
    PPMK107 ×1 17 3,0 4,1
    PPMK107 ×2 17 2,3 3,6
    PPMK107 ×1 jede Woche 17 2,6 2,6
    PPMK107 ×2 jede Woche 17 2,2 3,6
  • Beispiel 18
  • Die Verwendung einer desensibilisierenden Dosis PPMK107 um die Letalität einer nachfolgenden Dosis PPMK107 zu reduzieren.
  • C57BL/6 Mäusen (sieben Wochen alt) wurde intravenös am Tag 0 entweder Kochsalzlösung oder eine desensibilisierende Dosis PPMK107 (3 × 108 PFU/Maus) injiziert. Zwei Tage später wurde jede, zur intravenösen Dosierung mit Kochsalzlösung oder PPMK107 vorgesehene Mausgruppe (bei Dosen von 1 × 109, 2,5 × 109, 5 × 109 und 1 × 1010 PFU/Maus) in weitere Gruppen unterteilt. Wie aus Tabelle 17 hervorgeht, wurden, wenn Kochsalzlösung zur Vorbehandlung verwendet wurde, für Mäuse, die mit nachfolgenden Dosen von 2,5 × 109, 5 × 109 und 1 × 1010 PFU behandelt wurden, Sterbefälle registriert. Die 5 × 109 und 1 × 1010 Dosen PFU Dosen waren zu 100% letal für die Mäuse, die mit Kochsalzlösung vorbehandelt wurden. Diese Daten deuten darauf hin, dass PMMK107 verwendet werden kann, um die Letalität von nachfolgenden Dosen des gleichen Agens zu verhindern. Weiterhin, kann die maximal tolerierte PPMK107 Dosis um ungefähr eine Größenordnung gesteigert werden, wenn dieses Virus als ein desensibilisierendes Agens verwendet wird. Tabelle 17. Die Verwendung einer desensibilisierenden Dosis PPMK107 um die Letalität einer nachfolenden PPMK107 Dosis zu reduzieren
    Gruppe Injektion an Tag 0 Dosis an Tag 2 Anzahl der Mäuse Anzahl der Todesfälle % Letalität
    1 Kochsalzlösung Kochsalzlösung 8 0 0
    2 Kochsalzlösung PPMK107, 1,0E + 09 8 0 0
    3 Kochsalzlösung PPMK107, 2,5E + 09 8 3 38
    4 Kochsalzlösung PPMK107, 5,0E + 09 8 8 100
    5 Kochsalzlösung PPMK107, 1,0E + 10 8 8 100
    6 PPMK107, 3E + 08 Kochsalzlösung 8 0 0
    7 PPMK107, 3E + 08 PPMK107, 1,0E + 09 8 0 0
    8 PPMK107, 3E + 08 PPMK107, 2,5E + 09 8 0 0
    9 PPMK107, 3E + 08 PPMK107, 5,0E + 09 8 0 0
    10 PPMK107, 3E + 08 PPMK107, 1,0E + 10 8 0 0
  • Beispiel 19
  • Eine langsamere Injektionsrate reduziert die Toxizität von PPMK107
  • Zweiundzwanzig thymuslose Mäuse (acht Wochen alt) wurden mit einer Ketamin/Xylazin Kombination narkotisiert und um ihre Bewegungen während des Injektionsvorgangs zu hemmen in einer Haltevorrichtung plaziert, um entweder eine langsame oder schnelle Injektion mit PPMK107 zu ermöglichen. Der langsamen Injektionsgruppe wurden 0,2 ml 4 × 109 PFU PPMK107 in Kochsalzlösung intravenös über eine Zeitspanne von 4 Minuten injiziert, wobei 0,01 ml alle 10 bis 15 Sekunden verabreicht wurden. Die schnelle Injektionsgruppe erhielt gleiche Dosis und Volumen, aber innerhalb eines Zeitraums von 30 Sekunden. Wie in Tabelle 18 gezeigt, hatten die Tiere, die ihre PPMK107 Dosis innerhalb von vier Minuten erhalten hatten, nur halb so viel maximalen Gewichtsverlust, als die Tiere die die gleiche IV Dosis innerhalb von 30 Sekunden erhalten hatten. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass PPMK107 weniger Toxizität aufweiset und sicherer für die intravenösen Verabreichung ist, wenn es mit einer geringeren Geschwindigkeit injiziert wird. Tabelle 18. Langsameres IV Injizieren von PPMK107 resultiert in einer geringeren Toxizität
    Gruppe Zeitdauer über die die Dosis verabreicht wurde Anzahl der Mäuse Maximaler Gewichtsverlust in %
    Schnelle Injektion von 4E + 09 30 Sekunden 11 12%
    Langsame Injektion von 4E + 09 4 Minuten 11 6%
  • Beispiel 20
  • Die Verwendung von PPMK107 zur Behandlung von Patienten mit fortgeschrittenem Krebs
  • PPMK107 wurde in einer klinischen Studie Phase I in de USA über die intravenöse Route getestet. Dreiundzwanzig Patienten mit fortgeschrittenen soliden Tumoren, die etablierten Therapien nicht mehr zugänglich waren, wurden mit PPMK107 behandelt.
  • Siebzehn dieser Patienten erhielten eine einzige Dosis als initiales Behandlungsschema. Sechs andere Patienten erhielten eine Woche lang drei Dosen pro Woche als initiales Behandlungsschema. Die Größe eines jeden Patiententumors wurde einmal pro Monat bestimmt. Patienten, deren Erkrankung am wenigsten stabil war (weniger als 25% Zunahme und weniger als 50% Abnahme in der Summe der Produkte aller messbaren Tumoren in der Abwesenheit jeglicher neuer Läsion), waren geeignet für zusätzliche, monatliche Behandlungsrunden.
  • Regression eines tastbaren Tumors
  • Eine 68 Jahre alte Frau mit Dickdarmkarzinom hatte einen tastbaren abdominalen Tumor neben ihren weit verbreiteten Metastasen. Nach einer einzigen IV Behandlung mit PPMK107, trat bei dieser Patientin innerhalb von zwei Wochen eine 91%ige Regression dieses bestimmten abdominalen Wandtumors ein (Tabelle 19).
  • Messungen des Tumors einen Tag nach der Dosierung (3,75 × 3 cm) waren den Basislinienmessungen von 4 × 3 cm ähnlich. Hingegen hatte sich der Tumor am Tag sieben nach der Dosierung bis auf eine Größe von 2 × 2 cm zurückgebildet und schrumpfte weiter bis auf eine Größe von 1,5 × 1,5 cm am Tag 14 nach der PPMK107 Dosierung. Vor der PPMK107 Behandlung, vermehrte sich diese Tumormasse rasch, mit einer Zunahme des Tumorvolumens um 1065% in den zwei Wochen vor der PPMK107 Dosierung. Diese Patientin verließ die Studie, aufgrund von verstärktem Tumorwachstum an anderer Stelle. Tabelle 19. Die Größe eines tastbaren abdominalen Wandtumors in Patient Nr. 123 (68 Jahre alte Frau mit metastasierendem Dickdarmkarzinom) nach einer einzigen IV PPMK107 Dosis von 12 Milliarden PFU/m2.
    Datum Zeit nach Dosierung Tumorausdehnung (L × B, cm3) Tumorvolumen (0,5 × L × B × H, cm3) % Reduktion des Tumorvolumens
    23.07.98 Tag 0 4 × 3 18 -
    24.07.98 Tag 1 3,75 × 3 16,9 6%
    30.07.98 Tag 7 2 × 2 4,0 78%
    06.08.98 Tag 14 1,5 × 1,5 1,7 91%
  • Krebsstabilisierung
  • Acht andere Patienten, für die alle eine Tumorprogression während der konventionellen Krebstherapien zu beobachten war, erfuhren eine Verbesserung in Form von Stabilisierung ihres fortgeschrittenen Krebses nach einer PPMK107 Dosierung. Diese Patienten mit einem stabilen Krankheitsbild repräsentieren solche mit verschiedenen Krebstypen einschließlich Nierenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Brustkrebs und Lungenkrebs. Nach drei Monaten Behandlung mit PPMK107, hatte ein 67 Jahre alter Mann mit fortgeschrittenem und stark metastasierendem Kebs, zu diesem Zeitpunkt eine stabile Krankheit ohne Anzeichen eines neuen Wachstums und ohne Anzeichen einer Zunahme der Tumorgröße. Mit höheren PPMK107 Dosen war Anteil bezüglich einer stabilen Krankheit höher: zwei von sechs Patienten mit einer stabilen Krankheit (33% der Patienten) für die ersten beiden einzelnen Dosisniveaus (5.9 und 12 Milliarden PFU pro m2) und 4 von 5 Patienten (80% der Patienten) mit stabilem Krankheitsbild für das höchste einzelne Dosisniveau (24 Milliarden PFU pro m2, Tabelle 20). Tabelle 20. Behandlung mit PPMK107 von Patienten mit fortgeschrittenem Krebs
    Dosisniveau (Milliarden PFU pro m2) Anzahl der Patienten die mit diesem Dosisniveau behandelt wurden Anzahl der Patienten mit einer stabilen Krankheit % der Patienten mit einer stabilen Krankheit Krebsarten mit einem stabilen Krankheitsbild für mindestens einen Monat & Fortdauer des stabilen Krankheitsbildes
    5.9 6 2 33% Nierenkrebs – anhaltend seit 3 Monaten Lungenkrebs – anhaltend seit 2 Monaten
    12 6 2 33% Bauchspeicheldrüsenkrebs – anhaltend seit 2 Monaten Eierstockkrebs – anhaltend sein 1 Monat
    24 5 4 80% Brustkrebs – anhaltend seit 1 Monat Brustkrebs – anhaltend seit 1 Monat Lungenkrebs – anhaltend seit 1 Monat Bauchspeicheldrüsenkrebs – anhaltend seit 1 Monat
    Total 17 8 47% Siehe oben
  • Reduktion der Schmerzmedikation
  • Ein Patient, behandelt mit einer einzigen Dosis von 5.9 PFU/m2, kam die PPMK107 Behandlung in Form von symptomatischer Entlastung von krebsverursachten Schmerzen, wie aus einer Reduktion der narkotischen Schmerzmedikation ersichtlich wird, zugute.
  • Desensibilisierung
  • Ein deutlicher Desensibilisierungseffekt hervorgerufen durch die erste Dosis (bei 5,9 Milliarden PFU/m2), wird für alle nachfolgenden Dosen beobachtet. Generell, waren die beobachteten Nebenwirkungen der zweiten und dritten Dosis weit geringer. So trat z.B. bei den ersten vier Patienten dieses Multidosis-Behandlungsprotokolls (drei Dosen pro Woche über einen einwöchigen Zeitraum) nach Verabreichung der ersten Dosis Fieber auf, trotz prophylaktischer antipyretischer Behandlung mit Acetaminophen und Ibuprofen. Die Mehrzahl dieser Patienten hatte sogar in Fällen in denen sie keine Antipyretika erhielten, kein Fieber nach Erhalt der zweiten und dritten Dosen. Dies zeigt, dass die Verabreichung der ersten Dosis während des Wochenplans, der drei Verabreichungen pro Woche vorsieht, die Toxizität der zweiten und dritten Dosis reduziert.
  • Dosierung durch neutralisierende Antikörper im Serum
  • Durch die Verwendung des Dosierungsbereichs in dieser Phase I Studie (≥ 5,9 Milliarden PFU/m2), wird auch deutlich, dass das Virus effektiv an den Patienten abgeben werden kann, sogar wenn diese neutralisierende Antikörper gebildet hatten. Eine 72 Jahre alte Frau mit Bauschspeicheldrüsenkrebs hatte mit einem einzelnen 12 Milliarden PFU/m2 Dosisniveau seit zwei Monaten nach Beginn der PPMK107 Behandlung ein stabiles Krankheitsbild. Eine zweiter Behandlungslauf (bestehend aus einer einzigen IV Dosis PPMK107) wurde einen Monat nach der ersten Dosis, als die Patientin neutralisierende Antikörper in ihrem Serum gebildet hatte, verabreicht. Sieben Tage nach dieser zweiten Runde, war ihr Urin positiv für PPMK107 mit einem Titer von wenigstens 40 PFU pro ml. Dieses Ergebnis zeigt, dass die neutralisierenden Antikörper für PPMK107 in diesem Patientenserum nicht in der Lage waren, das Virus mit einer zweiten Behandlungsrunde vollständig zu inhibieren.
  • Beispiel 21
  • Zusammenfassung der Zytotoxitätsassayergebnisse mit dem Newcastle Disease Virus PPNJROAKIN
  • Humane Tumorzellen und normale Zellen wurden bis zu ungefähr 80% Konfluenz in 24-Loch-Zellkulturplatten kultiviert. Das Wachstumsmedium wurde entfernt und PPNJROAKIN, ein plaqueaufgereinigter Klon des mesogenen Newcastle Disease Virus Stammes New Jersey Roakin-1946, wurde in 10facher Verdünnung, in einem Konzentrationsbereich zwischen 10 PFU/Vertiefung (infektiösen Einheiten, Plaque forming units) und 1 PFU/Vertiefung, hinzugefügt. Kontrollvertiefungen, denen kein Virus hinzugefügt wurde, wurden in jede Platte integriert. Das Virus wurde für 90 Minuten auf einer Schüttelplattform bei 37°C absorbiert. Nach Beenden der lnkubationsperiode, wurden die viralen Verdünnungen entfernt und durch 1 ml Wachstumsmedium ersetzt. Die Platten wurden anschließend für 5 Tage bei 37°C in einer 5%igen CO2 Atmosphäre inkubiert. Die Zytotoxizität wurde durch Verwendung eines kolorimetrisches MTT (2-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyletrazoliumbromid) Assays (Cell Titer 96, Katalognummer G4000, Promega Corporation, Madison, WI 53711), womit die mitochondriale Enzymaktivität bestimmt wird, bei 570 nm detektiert und quantifiziert (Mosman, T., 1983, J. Immunol. Methods 65:55). Die Viabilität in den virusbehandelten Vertiefungen wurde als Prozentsatz bezogen auf die Aktivität in unbehandelten Kontrollvertiefungen ausgedrückt. Die Daten wurden graphisch als PFU/Vertiefung gegen die Viabilität, die eine auf die Kontrolle bezogene Prozentzahl ist, aufgetragen.. Der IC50 wurde als die Menge an Virus, die eine 50%ige Reduktion der Menge der viablen Zellen zur Folge hat, in PFU/Vertiefung berechnet. Tabelle 21. Zusammenfassung der Zytotoxitätsassayergebnisse mit PPNJROAKIN
    Zelltyp Zelllinie IC50 (PFU/Vertiefung)
    Fibrosarkom HT1080 13,8
    Kopf- und Halskarzinom KB 2,4
    Normaler Fibroblast CCD922sk 1,2 × 104
  • Diese Ergebnisse (Tabelle 21) zeigen, dass PPNJROAKIN in der Lage ist, mindestens zwei verschiedene humane Tumorzellen (HT1080 und KB) relativ zu normalen Hautfibroblasten selektiv abzutöten. Die IC50 Werte für die zwei Tumorzelllinien liegen zwischen 800 und 5000fach niedriger als die für normale Zellen.
  • Beispiel 22
  • Zusammenfassung der Zytotoxitätsassayergebnisse mit dem Newcastle Disease Virus PPCONN70726
  • Humane Tumorzellen und normale Zellen wurden bis zu ungefähr 80% Konfluenz in 24-Loch-Zellkulturplatten kultiviert. Das Wachstumsmedium wurde entfernt und PPCONN70726, ein plaqueaufgereinigter Klon des mesogenen Newcastle Disease Virus Stammes Connecticut 70726-1946, wurde in 10facher Verdünnung, in einem Konzentrationsbereich zwischen 107 PFU/Vertiefung (infektiösen Einheiten, plaque forming units) und 1 PFU/Vertiefung, hinzugefügt. Kontrollvertiefungen, denen kein Virus hinzugefügt wurde, wurden in jede Platte integriert. Das Virus wurde für 90 Minuten auf einer Schüttelplattform bei 37°C absorbiert. Nach Beenden der Inkubationsperiode, wurden die viralen Verdünnungen entfernt und durch 1 ml Wachstumsmedium ersetzt. Die Platten wurden anschließend für 5 Tage bei 37°C in einer 5%igen CO2 Atmosphäre inkubiert. Die Zytotoxizität wurde durch Verwendung eines kolorimetrisches MTT (2-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-d iphenyletrazoliumbromid) Assays (Cell Titer 96, Katalognummer G4000, Promega Corporation, Madison, WI 53711), womit die mitochondriale Enzymaktivität bestimmt wird, bei 570 nm detektiert und quantifiziert (Mosman, T., 1983, J. Immunol. Methods 65:55). Die Viabilität in den virusbehandelten Vertiefungen wurde als Prozentsatz bezogen auf die Aktivität in unbehandelten Kontrollvertiefungen ausgedrückt. Die Daten wurden graphisch als PFU/Vertiefung gegen die Viabilität, die eine auf die Kontrolle bezogene Prozentzahl ist, aufgetragen. Der IC50 wurde als die Menge an Virus, die eine 50%ige Reduktion der Menge der viablen Zellen zur Folge hat, in PFU/Vertiefung berechnet. Tabelle 22. Zusammenfassung der Zytotoxitätsassayergebnisse mit PPCONN70726
    Zelltyp Zelllinie IC50 (PFU/Vertiefung)
    Kopf- und Halskarzinom KB 18,1
    Glioblastom U87MG 12,7
    Glioblastom U373MG 879
    Normaler Fibroblast CCD922sk 7,3 × 104
  • Diese Ergebnisse (Tabelle 22) zeigen, dass PPNJROAKIN in der Lage ist, mindestens drei verschiedene humane Tumorzellen (KB, U87MG und U373MG) relativ zu normalen Hautfibroblasten selektiv abzutöten. Die IC50 Werte für die zwei Tumorzelllinien liegen zwischen 800 und 5000fach niedriger als die für normale Zellen.
  • Beispiel 23
  • Intratumorale Behandlung von HT1080 Fibrosarkomfremdtransplantaten in thymuslosen Mäusen unter Verwendung von PPMK107, PPNJROAKIN oder PPCONN70726.
  • In diesem Experiment, erhielten thymuslose Mäuse (weiblich, NCR nu/nu, fünf bis sechs Wochen alt) eine subkutane Injektion mit 107 HT1080 Tumorzellen. Vier Tage später, als die Tumoren eine Größe von 6 bis 8,5 mm erreicht hatten, wurden die Mäuse intratumoral mit Kochsalzlösung, PPMK107 (bei 1 × 108 PFU), PPNJROAKIN (bei 1 × 108 PFU) oder PPCONN70726 (bei 1 × 108 PFU) behandelt. Wie aus Tabelle 23 hervorgeht, so wurde Tumorregression in Mäusen, die mit diesen drei Viren (PPMK107, PPNJROAKIN und PPCONN70726) behandelt wurden, beobachtet. Nach der PPMK107 Behandlung von 12 Mäusen, erfuhren vier eine vollständige und sechs eine partielle Tumorregression. Auf die PPNJROAKIN Behandlung hin, erfuhr eine Maus eine vollständige Tumorregression und zwei erfuhren eine partielle Regression.
  • Nach der PPCONN70726 Behandlung von 12 Mäusen, erfuhren drei eine vollständige und zwei eine partielle Tumorregression. Es wurde keine Tumorregression in keinem der mit Kochsalzlösung behandelten Tiere beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen, dass die drei mesogenen NDV Stämme eine Tumorregression verursachen können. Tabelle 23. Regression eines HT1080 Fibrosakomtumors in thymuslosen Mäusen nach der Behandlung mit einem der drei Viren (PPMK107, PPNJROAKIN und PPCONN70726), jedes bei einer Dosis von 1 × 108 PFU.
    Regression
    Behandlung Anzahl der Mäuse Partiell (PR) Vollständig (VR) PR + VR (%)
    PPMK107 12 6 4 10 (83%)
    PPNJROAKIN 12 2 1 3 (25%)
    PPCONN70726 12 2 3 5 (42%)
    Kochsalzlösung 11 0 0 0 (0%)
  • Beispiel 24
  • Wirkungen von PPMK107, PPNJROAKIN und PPCONN70726 nach intracerebraler Injektion in immunodefizienten thymuslosen (nu/nu) und immunokompetenten heterozygotischen (nu/+) Mäusen.
  • Sechsundfünfzig thymuslosen Mäusen (nu/nu) und 56 immunkompetenten, heterozygotischen (nu/+) Mäusen wurden stereotaxische intracerebrale Injektionen entweder mit Kochslazlösung, PPMK107, PPNJROAKIN oder PPCONN70726 verabreicht. Acht zusätzliche Mäuse eines jeden Typs wurden als unbehandelte Kontrollen verwendet. Viren wurden bei einem von zwei Dosisniveaus (2 × 104 oder 3,5 × 106 PFU/Maus) verwendet. Wie in Tabelle 24 gezeigt, überlebten alle heterozygotischen nu/+ Mäuse, die mit jedem der drei Viren mit beiden Dosisniveaus behandelt wurden bis Tag 39, ausgenommen einer Maus bei der niedrigeren PPCONN70726 Dosis, die wegen nichtneurologischer Symptome euthanasiert wurde.
  • Thymuslose nu/nu Tiere, die entweder mit PPMK107 oder PPCONN70726 behandelt wurden, hatte eine deutlich schlechtere Überlebensrate als die Heterozygoten. Dies traf besonders für die höchste PPMK107 oder PPCONN70726 Virendosis von 3,5 × 106 PFU/Maus zu, wo nur 13% (eine von acht) der thymuslosen Mäuse in jeder Virusgruppe bis zum Tag 39 überlebten. Im Gegensatz dazu, überlebten 75% der PPNJROAKIN-behandelten, thymuslosen Mäuse bei diesem Dosisniveau (3,5 × 106 PFU/Maus). Diese Daten zeigen, dass PPNJROAKIN im Gehirn von thymuslosen Mäusen besser toleriert wird, als die anderen beiden Virusstämme. Tabelle 24. Überleben von Mäusen nach intracerebraler Injektion von PPMK107, PPCONN70726 und PPNJROAKIN
    Intrakraniale Injektion Anzahl der Mäuse % Überlebensrate an Tag 39
    nu/+ Unbehandelt 8 100
    nu/+ Kochsalzlösung 8 100
    nu/+ PPMK107, 2E + 04 8 100
    nu/+ PPMK107, 3,5E + 06 8 100
    nu/+ PPCONN70726, 2E + 04 8 88*
    nu/+ PPCONN70726, 3,5E + 06 8 100
    nu/+ PPNJROAKIN, 2E + 04 8 100
    nu/+ PPNJROAKIN, 3,5E + 06 8 100
    nu/nu Unbehandelt 8 100
    nu/nu Kochsalzlösung 8 100
    nu/nu PPMK107, 2E + 04 8 75
    nu/nu PPMK107, 3,5E + 06 8 13
    nu/nu PPCONN70726, 2E + 04 8 75
    nu/nu PPCONN70726, 3,5E + 06 8 13
    nu/nu PPNJROAKIN, 2E + 04 8 100
    nu/nu PPNJROAKIN, 3,5E + 06 8 75
    • * – Die einzige Maus die in dieser Behandlungsgruppe nicht überlebt hatte, wurde wegen nichtneurologischer Symptome euthanasiert.
  • Beispiel 25
  • Zusammenfassung der Zytotoxitätsassayergebnisse mit dem Sindbis Virus PPSINDBIS-Ar339
  • Humane Tumorzellen und normale Zellen wurden bis zu ungefähr 80% Konfluenz in 24-Loch-Zellkulturplatten kultiviert. Das Wachstumsmedium wurde entfernt und PPSINDBIS-Ar339, ein plaqueaufgereinigter Klon des Sindbis Ar-339, wurde in 10facher Verdünnung, in einem Konzentrationsbereich zwischen 10 PFU/Vertiefung (infektiösen Einheiten, Plaque forming units) und 1 PFU/Vertiefung, hinzugefügt. Kontrollvertiefungen, denen kein Virus hinzugefügt wurde, wurden in jede Platte integriert. Das Virus wurde für 90 Minuten auf einer Schüttelplattform bei 37°C absorbiert. Nach Beenden der Inkubationsperiode, wurden die viralen Verdünnungen entfernt und durch 1 ml Wachstumsmedium ersetzt. Die Platten wurden anschließend für 5 Tage bei 37°C in einer 5%igen CO2 Atmosphäre inkubiert. Die Zytotoxizität wurde durch Verwendung eines kolorimetrisches MTT (2-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyletrazoliumbromid) Assays (Cell Titer 96, Katalognummer G4000, Promega Corporation, Madison, WI 53711), womit die mitochondriale Enzymaktivität bestimmt wird, bei 570 nm detektiert und quantifiziert (Mosman, T., 1983, J. Immunol. Methods 65:55). Die Viabilität in den virusbehandelten Vertiefungen wurde als Prozentsatz bezogen auf die Aktivität in unbehandelten Kontrollvertiefungen ausgedrückt. Die Daten wurden graphisch als PFU/Vertiefung gegen die Viabilität, die eine auf die Kontrolle bezogene Prozentzahl ist, aufgetragen. Der IC50 wurde als die Menge an Virus, die eine 50%ige Reduktion der Menge der viablen Zellen zur Folge hat, in PFU/Vertiefung berechnet. Tabelle 25. Zusammenfassung der Zytotoxitätsassayergebnisse mit dem Sindbis Virus PPSINDBIS-Ar339
    Zelltyp Zelllinie IC50 (PFU/Vertiefung)
    Bauchspeicheldrüsenkarzinom Panc-1 69
    Kolorektalkarzinom SW620 13
    Kolorektalkarzinom SW1463 1.8 × 105
    Nichtkleinzelllungenkarzinom A427 > 1 × 106
    Nichtkleinzelllungenkarzinom A549 5,2 × 104
    Nierenkarzinom A498 2,4 × 104
    Nierenkarzinom Caki-1 3,4 × 104
    Fibrosarkom HT1080 7,4 × 105
    Normaler Keratinozyt NHEK 2,0 × 105
    Normaler Fibroblast CCD922sk 1,6 × 105
  • Der zelluläre Rezeptor auf Säugerzellen für das Sindbis Virus ist der high affinity Lamininrezeptor, der hauptsächlich auf Zellen epithelialer Abstammung exprimiert wird, aber oft in vielen metastasierenden Krebszellen wie der Panc-1 Baauchspeicheldrüsenkarzinomzellline und der SW620 Dickdarmadenokarzinomzelllinie (Campo et al., (1992). Am. J. Pathol. 141, 1073-1083; Yow et al., (1988) Proc Natl Acad Sci, 85, 6394-6398) überexprimiert wird. Im Gegensatz dazu, ist von der Kolorektaladenokarzinomzellline SW1423 bekannt, sehr niedrige Niveaus von high affinity Lamininrezeptor mRNA (Yow et al., (1988) Proc Natl Acad Sci, 85, 6394-6398) zu exprimieren und dass sie mehr als 4 Größenordnungen resistenter gegenüber dem Abtöten durch PPSINDBIS-Ar339 als SW620 Zellen ist.
  • Diese Ergebnisse (Tabelle 25) zeigen, dass Zellen, die tumorigen sind und hohe Niveaus des high affinity Lamininrezeptors exprimieren, empfindlicher gegenüber dem Abtöten durch den Sindbis Klon PPSINDBIS-Ar339 sind, als andere Tumorzellen oder normale Zellen.
  • Beispiel 26
  • Abtöten von tumorigenen und nichttumorigenen Zellen in der Anwesenheit von Interfereon durch VSV.
  • In 96-Loch-Zellkulturplatten wurden tumorigene KB und HT1080 Zellen (3 × 104 Zellen pro Vertiefung) und nichttumorgene WISH Zellen (2,5 × 104 Zellen pro Vertiefung) in Anwesenheit von einem Bereich von 2800 bis 22 Units/ml reihenverdünntem Interferon-α angezüchtet und für 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden anschließend mit dem Vesicular Stomatitis Virus (VSV, Indiana Stamm) bei einer moi von 10 infiziert. Es wurden Kontrollen für die Zellen ohne Interferon und Zellen ohne Interferon oder Virus einbezogen. Die Zytotoxizität wurde durch Verwendung eines kolorimetrisches MTT (2-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyletrazoliumbromid) Assays (Cell Titer 96, Katalognummer G4000, Promega Corporation, Madison, WI 53711), womit die mitochondriale Enzymaktivität bestimmt wird, bei 570 nm detektiert und quantifiziert (Mosman, T., 1983, J. Immunol. Methods 65:55). Die Viabilität in den virusbehandelten Vertiefungen wurde als Prozentsatz bezogen auf die Aktivität in Kontrollvertiefungen, die kein Virus erhalten hatten, ausgedrückt. Tabelle 26. Vergleich der Zelltötungsaktivität von VSV in Zellen die mit exogenem Interferon behandelt wurden.
    Prozentsatz viabler Zellen
    WISH HT1080 KB
    100 U/ml IFN 50 6 0
    1000 U/ml IFN 95 20 12
  • Diese Ergebnisse (Tabelle 26) zeigen, dass VSV in der Lage ist, selektiv Tumorzellen abzutöten, die eine Defizienz in ihrer Interferonempfindlichkeit aufweisen (siehe Beispiel 27). WISH Zellen (humane Amnionzellen) sind eine gängige Zeilline um, in einem Interferonbioassay verwendet werden zu werden, da sie die Fähigkeit haben effizient auf Interferone zu reagieren.
  • Beispiel 27
  • Interferonempfindlichkeit in Zellen die empfindlich oder resistent gegenüber dem Abtöten durch PPMK107 sind
  • Individuelle Zelllinien wurden in 96-Loch-Zellkulturplatten kultiviert, bis sie annähernd konfluent waren und für 24 h mit IFNαA Mengen, die zwischen 5 und 5000 U/ml lagen, behandelt. Die Kulturen wurden anschließend mit PPMK107 bei einer moi von 1,0 infiziert und für 24 weitere Stunden kultiviert. Nach chemischer Fixierung wurde das Ausmaß der viralen Expression unter Verwendung einer löslichen Indikatorfarbe durch Immunhistochemie quantifiziert. Das Ausmaß des Viruswachstums wird dargestellt als der Prozentsatz des P Antigens, das relativ zu nicht mit Interferon behandelten Kontrollzellen (5) exprimiert wird. In diesem Assay, zeigten Interferonempfindliche Zellen wenigstens 50% Abnahme bezüglich des viralen Antigens als Antwort auf Interferon. Zellen in 5 die empfindlich für PPMK107 sind, sind mit durchgezogenen Linien dargestellt; Zellen die weniger empfindlich sind, sind mit gestrichelten Linien dargestellt.
  • Die Ergebnisse dieses Experimentes zeigen eine deutliche Korrelation zwischen der Resistenz der Zelllinie gegenüber die antiviralen Wirkungen von exogenem Interferon and der relativen Empfindlichkeit der Zelle gegenüber dem Abtöten durch PPMK107 (hervorgehend aus dem IC50 Wert, in der Bildbeschriftung neben dem Namen der Zelllinie in Klammern stehend, siehe 5). So sind z.B. nach Vorbehandlung mit 5 U/ml Interferon, 6 von 7 (86%) der Zelllinien, die unempfindlich für Interferon sind, empfindlich gegenüber dem Abtöten durch PPMK107; wenn mit 500 U/ml behandelt, so sind alle (4 von 4) der unempfindlichen Zelllinien empfindlich für das Abtöten durch PPMK107 gegenüber. Die obigen Daten stellen ebenfalls ein Beispiel eines Screeningassays zur Indentifikation von geeigneten Zellen dar, von denen anzunehmen ist, dass sie empfindlich gegenüber dem Abtöten durch PPMK107 oder anderen Interferon-empfindlichen Viren sind. So würden z.B. infizierte Zellen, die signifikante Mengen (mehr als 50% als die Kontrollen) an viralem Gen nach Vorbehandlung mit exogenem Interferon exprimieren, als Interferon-defizient und somit als empfindlich der viralen Onkolyse gegenüber, betrachtet werden.
  • Das Vorhergehende ist gedacht als Erläuterung der vorliegenden Erfindung, aber nicht als Einschränkung. Zahlreiche Variationen und Modifikationen können vorgenommen werden, ohne sich von dem tatsächlichen Schutzumfang der Erfindung zu entfernen.

Claims (42)

  1. Verwendung eines Interferon-empfindlichen replikationskompetenten klonalen RNA-Virus zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Neoplasmas in einem Säuger.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei sich das Virus wenigstens 100-fach weniger in Gegenwart von Interferon repliziert, verglichen mit der Abwesenheit von Interferon; vorzugsweise wenigstens 1000-mal weniger in Gegenwart von Interferon, verglichen mit der Abwesenheit von Interferon.
  3. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Medikament eine systemische Formulierung ist.
  4. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Neoplasma ein Krebs ist.
  5. Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Säuger ein Mensch ist.
  6. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das klonale Virus plaquegereinigt ist.
  7. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das klonale Virus einen rekombinanten klonalen Ursprung hat.
  8. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das RNA-Virus ein Paramyxovirus ist.
  9. Verwendung nach Anspruch 8, wobei das Paramyxovirus auf ein Niveau von wenigstens 2 × 109 PFU pro mg Protein gereinigt wird; vorzugsweise auf ein Niveau von wenigstens 1 × 1010 PFU pro mg Protein; besonders bevorzugt auf ein Niveau von wenigstens 6 × 1010 PFU pro mg Protein.
  10. Verwendung nach Anspruch 8, wobei das Paramyxovirus auf ein Niveau gereinigt wird, in welchem das Partikel zu PFU-Verhältnis nicht größer als 5 ist; vorzugsweise auf ein Niveau, in welchem das Partikel zu PFU-Verhältnis nicht größer als 3 ist; besonders bevorzugt auf ein Niveau, in welchem das Partikel kzu PFU-Verhältnis nicht größer als 1,2 ist.
  11. Verwendung nach Anspruch 8, wobei das Paramyxovirus ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus dem aviären Paramyxovirus Typ 2, NDV, Mumpsvirus und humanem Parainfluenzavirus.
  12. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Neoplasma ein Krebs ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lungen-, Colon-, Prostata-, Brust- und Gehirnkrebs.
  13. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Neoplasma ein solider Tumor ist.
  14. Verwendung nach Anspruch 12, wobei der Gehirnkrebs ein Glioblastom ist.
  15. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Virus ein Gel enthält, welches Interferon codiert, um die virale Expression von Interferon zu erlauben, oder ein Gen, welches ein Prodrug-aktivierendes Enzym codiert.
  16. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Medikament geeignet ist zur Verabreichung in Kombination mit IFN, welches vor, während oder nach Verabreichung des Medikaments verabreicht wird.
  17. Verwendung nach Anspruch 16, wobei das Interferon ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus α-IFN, β-IFN, ω-IFN, γ-IFN und synthetischen Consensusformen von IFN.
  18. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Medikament geeignet ist zur Verabreichung in Kombination mit einem Tyrosinkinaseinhibitor, welcher vor, während oder nach Verabreichung des Medikaments verabreicht wird.
  19. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Medikament geeignet ist zur Verabreichung in Kombination mit einer Verbindung, welche ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einem Purinnucleosidanalogon, einem Tyrosinkinaseinhibitor, Cimetidin und einem mitochondrialen Inhibitor.
  20. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Medikament geeignet ist zur Verabreichung in Kombination mit einem chemotherapeutischen Mittel, welches vor, während oder nach Verabreichung des Medikaments verabreicht wird.
  21. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Medikament geeignet ist zur Verabreichung in Kombination mit einem Cytokin oder einem immunsuppressiven Mittel, welches vor, während oder nach Verabreichung des Virus verabreicht wird.
  22. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Medikament geeignet ist zur Verabreichung in Kombination mit einer die virale Replikation steuernden Menge einer Verbindung, welche ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus IFN, Ribavirin, Aciclovir und Ganciclovir.
  23. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Medikament als intravenöse oder intratumorale Formulierung vorliegt.
  24. Verwendung eines Interferon-empfindlichen klonalen Virus, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (1) RNA-Viren; (2) Hepadenavirus; (3) Parvovirus; (4) Papovavirus; (5) Pockenvirus; und (6) Iridovirus, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines in einem Säuger wenigstens 1 cm großen Neoplasmas.
  25. Verwendung nach Anspruch 24, wobei das Neoplasma ein Volumen von wenigstens 300 mm3 aufweist.
  26. Verwendung nach Anspruch 24, wobei das RNA-Virus ein Paramyxovirus ist, vorzugsweise NDV.
  27. Verwendung nach Anspruch 24, wobei der Säuger ein Mensch ist.
  28. Verwendung nach Anspruch 24, wobei das Medikament als intravenöse oder intratumorale Formulierung vorliegt.
  29. Verwendung nach Anspruch 24, wobei das Paramyxovirus auf ein Niveau von wenigstens 2 × 109 PFU pro mg Protein gereinigt ist.
  30. Verwendung nach Anspruch 26, wobei das NDV mesogen ist.
  31. Verwendung nach Anspruch 24, wobei das Neoplasma krebsartig ist.
  32. Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Interferon-empfindlichen klonalen RNA-Virus zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Tumors in einem Säuger, wobei das Virus zellzerstörend für den Tumor ist und wobei der Säuger einer Tumorbelastung unterliegt, welche wenigstens 1,5 % des gesamten Körpergewichts des Säugers beträgt.
  33. Verwendung nach Anspruch 32, wobei der Tumor nicht auf Chemotherapie anspricht.
  34. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Virus ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus dem Newcastle disease-Virusstamm MK107, Newcastle disease-Virusstamm NJ Roakin, Sindbisvirus und vesikulärem Stomatitisvirus.
  35. Verwendung eines Interferon-empfindlichen klonalen Virus, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus dem Newcastle disease-Virusstamm MK 107, Necastle disease-Virusstamm NJ Roakin, Sindbisvirus und vesikulärem Stomatitsvirus zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Neoplasmas in einem Säuger.
  36. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Behandlung die Verabreichung des Medikaments in mehr als einer Dosis umfasst.
  37. Verwendung nach Anspruch 36, wobei die erste Dosis eine desensibilisierende Dosis ist.
  38. Verwendung nach Anspruch 37, wobei die erste Dosis intravenös verabreicht wird und eine Folgedosis intravenös verabreicht wird.
  39. Verwendung nach Anspruch 37, wobei die erste Dosis intravenös verabreicht wird und eine Folgedosis intraperitoneal verabreicht wird.
  40. Verwendung nach Anspruch 37, wobei die erste Dosis intravenös verabreicht wird und eine Folgedosis intraarteriell verabreicht wird.
  41. Verwendung eines Interferon-empfindlichen replikationskompetenten klonalen Virus, welcher an einen Rezeptor bindet, der in einem Säuger vorliegt, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Neoplasmas in einem Säuger, wobei die Behandlung ferner das Untersuchen einer Probe aus dem Säuger mittels eines Immunassays umfasst, um das Vorliegen des Virusrezeptors zu erfassen.
  42. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Behandlung die Verabreichung des Medikaments über den Verlauf von wenigstens 4 Minuten umfasst.
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