DE69926251T2

DE69926251T2 - Verfahren zum vernichten von tumoren und tumor-assoziierten endothelialzellen mit adenoviralen mutanten

Info

Publication number: DE69926251T2
Application number: DE69926251T
Authority: DE
Inventors: Angelica Williams; Carla Heise; Meisa Propst; Adam Sampson-Johannes; David Kirn
Original assignee: Onyx Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Onyx Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1998-10-26
Filing date: 1999-10-15
Publication date: 2006-05-24
Anticipated expiration: 2019-10-16
Also published as: EP1121137B1; JP2004517798A; ATE299708T1; EP1121137A1; AU6518799A; WO2000024408A1; CN1333689A; CA2348634A1; AU775611B2; ES2245831T3; US20020037274A1; DK1121137T3; DE69926251D1

Description

Gebiet der Erfindung
Die hierin beschriebene Erfindung betrifft die Behandlung oder Prävention von Erkrankungen, die hyperproliferatives oder unkontrolliertes Zellwachstum umfasst, vorzugsweise Krebs, unter Verwendung kompetenter Adenovirusmutanten, die sich in solchen Zellen im Vergleich zu ruhenden Zellen selektiv replizieren.
Hintergrund der Erfindung
Die vorrangigen Eigenschaften menschlicher Krebserkrankungen sind unkontrolliertes Zellwachstum und vom Primärtumor ausgehende Metastasenbildung. Arbeiten aus der jüngeren Vergangenheit zeigten, dass unkontrolliertes Zellwachstum eine Funktion des Verlusts von Zellzyklus-Kontrollpunktregulation darstellt. Siehe L.H. Hartwell & M.B. Kastan, Science 266, 1821–1828 (1994). Beispielsweise spielen das Retinoblastomgenprodukt (RB) und verwandte Proteine zentrale Rollen in der Unterbindung des Fortschreitens normaler Zellen aus der G1- in die S-Phase, bis die geeigneten Proliferationssignale erhalten werden. Dahingegen scheint die RB-Funktion in beinahe allen Krebszellen verloren gegangen zu sein, was ein Resultat von RB- oder p16-Gen-Mutation/Deletion, Cyclin-D-Amplifikation/Überexpression oder cdk4-Amplifikation/Überexpression ist. Siehe C.J. Sherr, Science 274, 1672–1677 (1996). Folglich führt ein Defekt im RB-Stoffwechselweg zur Unfähigkeit, Zellwachstum einzuschränken, und die einst normale Zelle nimmt einen malignen Phänotyp an. Häufig ist mit dem malignen Zustand die Fähigkeit einer Krebszelle verbunden, Metastasen zu bilden.
Das Adenovirus-5E1A-Gen kodiert für zwei mRNAs, die Sedimentationswerte von 13S und 12S aufweisen, die infolge von differenziellem Spleißen eines gemeinsamen Vorläufers auftreten und für Proteine kodieren, die 289 bzw. 243 Aminosäuren aufweisen. Der Unterschied von 46 Aminosäuren zwischen den zwei Proteinen ist der 13S-Spezies zuzuschreiben. Es wird angenommen, dass E1A Zellen durch Binden von zellulärem RB transformiert und dadurch ihre Tumorsuppressorfunktion aufheben.
Vom E1A-Gen wurde gezeigt, dass es für mehrere verschiedene biologische Aktivitäten kodiert. In einem Fall und in Kombination mit entweder dem Middle-T-Antigen von SV40-Virus oder dem aktivierten H-ras-Genprodukt ist es in der Lage, Zellen zu transformieren. Im Gegensatz dazu zeigten jüngere Arbeiten, dass es den onkogenen Phänotyp, der mit bestimmten Onkogenen assoziiert ist, unterdrücken kann. Siehe das US-Patent Nr. 5.651.964. Für Mutationen im E1A-Gen wurde gezeigt, dass sie seine anti-onkogene Aktivität beeinflussen, und manche von diesen erwiesen sich in Kombination mit chemotherapeutischen Wirkstoffen wirksam. Siehe WO 98/17806.
Frisch zeigte eine anti-onkogene Wirkung von Adenovirus-E1A in menschlichen Tumorzellen. Siehe S. Frisch, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9077–9081 (1991).
Das US-Patent Nr. 5.516.631 beschreibt Verfahren zur Inhibition von Replikation hyperproliferativer Zellen unter Verwendung von Nucleinsäure, die für ein Polypeptid mit Adenovirus-E1A-Aktivität kodiert.
WO 96/07322 beschreibt ein Verfahren zum Sensibilisieren von Tumorzellen mit Adenovirus-E1A gegenüber chemotherapeutischen Mitteln.
Die US-Patente Nr. 5.651.964; 5.643.567; 5.641.484; und WO 97/35012 beschreiben Verfahren zur Suppression von Tumoren, die das neu-Onkogen exprimieren, durch das Adenovirus-E1A-Gen entweder alleine oder in Kombination mit SV40-Large-T-Antigen.
Andere zeigten, dass Adenovirus-E1A eine Antitumor-Rolle in vivo hat. Siehe R. Sanchez-Prieto et al., Oncogene 13, 1083–92 (1996); und R. Sanchez-Prieto et al., Cancer Gene Therapy 5(4), 215–225 (1998).
Das US-Patent Nr. 5.801.029 und WO 94/18992 beschreiben Verfahren zum Töten neoplastischer Zellen durch ein replikationsfähiges Adenovirus, das eine inaktivierende Mutation in den Aminosäuren 120–139 der E1A-CR2-Domäne aufweist.
Maßgeblich für Tumorwachstum und Metastasenbildung ist Angiogenese. Angiogenese ist für Wachstum und Metastasenbildung des Primärtumors sowie für nachfolgende Metastasen von Sekundärtumoren erforderlich. Das heißt, dass ein Tumor ohne Blutversorgung zur Bereitstellung von Nährstoffen und zum Abführen von Stoffwechselabfällen kein nachhaltiges Wachstum aufrechterhalten kann. Somit fördert die Bildung neuer Blutgefäße, auch als Angiogenese bezeichnet, Tumorzellenwachstum, ermöglicht es, dass Tumorzellen in den Blutkreislauf eintreten und so durch den Körper zirkulieren können. Somit wird angenommen, dass das Unterbinden oder die Prävention von Angiogenese ein wirksames Verfahren zur Prävention von Tumorwachstum und Metastasenbildung ist.
Es gilt anzumerken, dass sich als Teil des Angiogeneseprozesses tumorassoziierte Endothelzellen vermehren, während Endothelzellen, die mit normalen Geweben assoziiert sind, im Wesentlichen ruhende Zellen sind. Daher würden im Vergleich zu Mitteln, die auf jeden Zelltyp einzeln gerichtet sind, therapeutische Mittel, die auf sich teilende Zellen, das heißt Krebszellen, und deren assoziierte Mikrogefäß-Endothelzellen gerichtet sind, gesteigerte antitumorale Wirksamkeit aufweisen. Natürlich würde ein virales Mittel, das diese Eigenschaft aufweist, also eines, das sich in der Targetzelle repliziert und diese dadurch tötet und in diesem Prozess neue virale Teilchen freisetzt, die in der Lage sind, sich auszubreiten und weitere Targetzellen anzugreifen, einen breiten medizinischen Anwendungsbereich finden.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß den obigen Ausführungen stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung von replikationsfähigen Adenovirusmutanten zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung oder Prävention von Erkrankungen unkontrollierten hyperproliferativen Zellwachstums, vorzugsweise von jenen Erkrankungen, die Angiogenese erfordern oder dadurch gefördert werden, einschließlich Krebs, bereit.
In einem anderen Aspekt der Erfindung sind replikationsfähige Adenovirusmutanten im Vergleich zu Wildtyp-Adenovirus zu gesteigerter Replikation in sich teilenden normalen Zellen oder Krebszellen fähig, worin die Mutanten eine Mutation in einer RB-Familienmitgliedbindungsregion von E1A aufweisen.
In wiederum einem anderen Aspekt der Erfindung sind replikationsfähige Adenovirusmutanten im Vergleich zu Wildtyp-Adenovirus zu gesteigerter Zytopathogenität in sich teilenden normalen Zellen oder Krebszellen in der Lage, worin die Mutanten eine Mutation in einer RB-Familienmitgliedbindungsregion von E1A aufweisen.
In einem anderen Aspekt der Erfindung sind replikationsfähige Adenovirusmutanten, die eine Mutation in der RB-Familienmitgliedbindungsregion von E1A, vorzugsweise in der E1A-CR2-Region, aufweisen, im Vergleich zu Wildtyp-Adenovirus zu gesteigerter Replikation in sich teilenden normalen Zellen oder Krebszellen in der Lage.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung sind replikationsfähige Adenovirusmutanten, die eine Mutation in der RB-Familienmitgliedbindungsregion von E1A, vorzugsweise in der E1A-CR2-Region, aufweisen, im Vergleich zu Wildtyp-Adenovirus zu gesteigerter Zytopathogenität in sich teilenden normalen Zellen oder Krebszellen in der Lage.
Diese und andere Ziele der vorliegenden Erfindung werden Fachleuten anhand der Lektüre der Beschreibung der verschiedenen Aspekte der Erfindung in der folgenden ausführlichen Beschreibung verständlich sein. Die vorangehenden und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung sind in den Zeichnungen, der detaillierten Beschreibung und den nachstehend angeführten Beispielen näher erläutert.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1. Adenovirus-E1A-Genregion. Gezeigt sind die konservierten Regionen (CR) von E1A, die für Bindung von pRB (und p107, p130) verantwortlich sind. Die spezifischen CR2-Gendeletionen, die in dl922/947 und dl1107 vorhanden sind, und Punktmutation in pm 928 sind gezeigt.
2. Replikationswirksamkeit einer E1A-CR2-Mutante (dl922/947) als ein Prozentsatz von Wildtyp-Adenovirusreplikation. dl922/947 und Wildtyp-Adenovirus wurden auf Replikation in ruhenden oder proliferierenden, sich nicht unbegrenzt vermehrenden, menschlichen Mikrogefäß-Endothelzellen (Q-MVEC bzw. P-MVEC), C33A-Zervixkarzinomzellen und HLaC-Kehlkopfkarzinomzellen getestet. Zellen wurden bei einer MOI von 10 pfu pro Zelle infiziert, und Virustiter wurden 48 Stunden später durch Plaquetest an HEK-293-Zellen bestimmt. Die Daten sind Mittelwerte (± SEM) von Tests, die zweimal in dreifacher Ausführung durchgeführt wurden.
3. Gesteigerte zytopathische Wirkungen von E1A-CR2-Mutanten (dl922/947 oder dl1107) auf Tumorzellen im Vergleich zu Wildtyp-Adenovirus. Zellen wurden bei den gezeigten Infektionsmultiplizitäten (MOI) infiziert, und 5 Tage später wurden Zell-Monolayer fixiert und gefärbt. H2009-Karzinomzellen von nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom (Panel A) und HLaC-Kehlkopfkarzinomzellen (Panel B) wurden mit Kristallviolett gefärbt. A549-Karzinomzellen von nicht-kleinzelligem Zellkarzinom (Panel C) und U2OS-Osteosarkomzellen (Panel D) wurden mit Sulforhodamin B gefärbt; die Färbung wird als ein Prozentsatz der nicht infizierten Kontrollzell-Monolayer (leere Kästchen = Wildtyp-Adenovirus; volle Kreise = dl1107) ausgedrückt. Die Tests wurden zumindest zweimal durchgeführt.
4. Verbessertes Überleben nach intratumoraler Injektion mit E1A-CR2-Mutante (dl922/947) in Nacktmaus-Mensch-Tumor-Xenotransplantatmodellen. Menschliche Kolontumorzellen RKO.RC 7.14 (Panel A) oder menschliche HLaC-Kehlkopftumorzellen (Panel B) wurden subkutan in die Flanken von nu/nu-Mäusen injiziert, und als Tumoren 5 bis 7 mm Maximaldurchmesser erreicht hatten, wurde ihnen ein Vehikel (leeres Dreieck) oder 10⁸ pfu entweder von dl9221947 (voller Kreis) oder von Wildtyp-Adenovirus (leeres Quadrat) täglich fünf Tage hintereinander injiziert (n = 6–13 pro Gruppe). Die Tumoren wurden bis zur Tötung zweimal wöchentlich gemessen; die Tiere wurden nach 90 Tagen oder wenn ihr Tumor zu einem Durchmesser von 1 cm herangewachsen war getötet. Beim Kolontumor-Xenotransplantatmodell (Panel A) war das Überleben der Gruppe, der dl922/947 injiziert worden war, signifikant höher als das Überleben der Vehikel-injizierten Gruppe einerseits (p = 0,02) und der Wildtyp-Adenovirus-injizierten Gruppe andererseits (p = 0,04). Beim Kehlkopftumor-Xenotransplantatmodell (Panel B) war das Überleben sowohl in der mit dl922/947 als auch in der mit Wildtyp-Adenovirus behandelten Gruppe signifikant höher als in der Vehikel-injizierten Gruppe. (p ≤ 0,001).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Definitionen
Außer wenn eine andere Definition bereitgestellt ist, haben alle hierin verwendeten fachlichen und wissenschaftlichen Begriffe dieselbe Bedeutung, die üblicherweise Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung geläufig sind. Im Allgemeinen sind die hierin verwendete Nomenklatur und unten beschriebene Laborverfahren jene, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind und üblicherweise verwendet werden. Für Nucleinsäure-Rekombinationsverfahren, Polynucleotidsynthese und mikrobielle Kultur und Transformation (z.B. Elektroporation, Lipofektion) werden herkömmliche Verfahren verwendet. Im Allgemeinen werden enzymatische Reaktionen und Reinigungsschritte gemäß den Vorschriften der Hersteller durchgeführt. Die Verfahren und Techniken werden im Allgemeinen nach auf dem Gebiet der Erfindung herkömmlichen Verfahren und verschiedenen allgemeinen Referenzen, die in diesem Dokument genannt werden, durchgeführt. Siehe Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). Die hierin verwendete Nomenklatur und Laborverfahren der analytischen Chemie, organischen synthetischen Chemie und pharmazeutischen Formulierung, die nachstehend beschrieben sind, sind jene, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind und üblicherweise verwendet werden. Standardverfahren werden für chemische Synthesen, chemische Analysen, pharmazeutische Formulierung und Abgabe sowie zur Behandlung von Patienten verwendet.
Im Rahmen dieser Offenbarung sind den folgenden Bezeichnungen, außer anders angegeben, die folgenden Bedeutungen zugeschrieben:
Die Bezeichnung "Adenovirus" bezieht sich auf über 40 Adenovirus-Subtypen, die aus Menschen isoliert werden, sowie auf ebenso viele aus anderen Säugetieren und Vögeln. Siehe Strauss, "Adenovirus infections in humans", in: The Adenoviruses, Ginsberg (Hrsg.), 451–596, Plenum Press, New York, NY (1984). Die Bezeichnung bezieht sich vorzugsweise auf zwei menschliche Serotypen, Ad2 und Ad5.
"Neoplastische Zellen" oder "Neoplasie" bezieht sich auf Zellen, die relativ autonomes Wachstum aufweisen, sodass sie einen anormalen Wachstumsphänotyp aufweisen, der durch signifikanten Verlust an Zellproliferation charakterisiert ist. Neoplastische Zellen umfassen Zellen, die sich aktiv replizieren oder sich in einem vorübergehenden, nicht-replikativen Ruhezustand (G₁ oder G₀) befinden können; demähnlich können neoplastische Zellen Zellen umfassen, die einen gut differenzierten Phänotyp, einen schlecht differenzierten Phänotyp oder ein Gemisch aus beiden Zelltypen aufweisen. Somit sind zu einem bestimmten Zeitpunkt nicht alle neoplastischen Zellen notwendigerweise replizierende Zellen. Die Reihe, die als neoplastische Zellen definiert ist, besteht aus Zellen in gutartigen Neoplasmen und Zellen in malignen (oder offenen) Neoplasmen. Hierin werden offen neoplastische Zellen häufig als Krebs oder Krebszellen, Tumor oder Tumorzellen bezeichnet, die typischerweise als Karzinom bezeichnet werden, sofern sie von Zellen endodermalen oder ektodermalen histologischen Ursprungs sind, oder als Sarkom, sofern sie von Zellen aus dem Mesoderm ausgehen. In die Definition von neoplastischen Zellen umfasst sind Zellen, denen p53-Funktion fehlt, die jedoch nicht offen neoplastisch sind. Siehe das US-Patent Nr. 5.677.178. Beispiele für Zellen der letztgenannten Kategorie wären Zellen, die mit Barret-Syndrom oder Leukoplaki assoziiert sind.
"Replikationsfähiges Adenovirus" oder "replikationsfähige Adenovirusmutante" bezieht sich auf ein Adenovirus, das eine Mutation in einem RB-Familienmitgliedbindungsregion von E1A, vorzugsweise der E1A-CR2-Region, aufweist. Sich teilende Zellen, zu einem größeren Ausmaß als ruhende Zellen, die mit solch einem Virus infiziert sind, weisen eine oder mehrere der folgenden phänotypischen Eigenschaften auf: (1) wesentliche Expression von späten Genprodukten wie beispielsweise Capsidproteinen (z.B. Adenovirus-Pentonbasen-Polypeptid) oder RNA-Transkripten, initiiert durch virale(n) Spätgenpromotor(en), (2) Replikation von viralen Genomen oder Bildung von replikativen Zwischenprodukten, (3) Anordnung von viralen Capsiden oder gepackten Virionpartikeln oder (4) Auftreten des zytopathischen Effekts (CPE) in der infizierten Zelle, (5) Abschluss eines viralen lytischen Zyklus.
"Physiologische Bedingungen" oder "physiologische Lösung" bezieht sich auf eine wässrige Umgebung mit einer Ionenstärke, einem pH und einer Temperatur, die im Wesentlichen Bedingungen in einer intakten Säugetierzelle oder in einem Geweberaum oder einem Organ eines lebenden Säugetiers ähnlich sind. Typischerweise umfassen physiologische Bedingungen eine wässrige Lösung mit etwa 150 mM NaCl, pH 6,5–7,6 und einer Temperatur von etwa 22–37°C. Im Allgemeinen sind physiologische Bedingungen geeignete Bindungsbedingungen für intermolekulare Assoziation biologischer Makromoleküle. Beispielsweise sind physiologische Bedingungen von 150 mM NaCl, pH 7,4, bei 37°C im Allgemeinen geeignet.
Unter Erkrankungen einschließlich "hyperproliferativen" Zellwachstums werden pathologische Leiden verstanden, die nicht kanzerös und durch unerwünschtes Zeltwachstum wie beispielsweise Endothelzellwachstum in Verbindung mit Angiogenese oder Restenose charakterisiert sind. Erkrankungen einschließlich "unkontrollierten Zellwachstums" beziehen sich typischerweise auf gutartigen bzw. metastasenbildenden Krebs.
Unter "negativen Selektionsgenen oder -mittel" wird ein Gen verstanden, dessen Proteinprodukt die Fähigkeit eines Wirts steigert, neoplastische Zellen zu töten. Dies würde immunpotenzierende Mittel oder Enzyme einschließen, die die Umsetzung eines Prodrugs zu seinem toxischen Metaboliten fördert.
Chemische Bezeichnungen hierin werden gemäß dem allgemeinen Gebrauch auf dem Gebiet der Erfindung, wie z.B. in The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Hrsg.: S. Parker), McGraw-Hill, San Francisco (1985), dargestellt, verwendet.
DNA-Regionen sind operabel gebunden, wenn sie funktionell miteinander in Verbindung stehen. Beispielsweise ist ein Promotor operabel an eine Kodiersequenz gebunden, wenn er die Transkription der Sequenz steuert; eine Ribosombindungsstelle ist operabel an eine Kodiersequenz gebunden, wenn sie so positioniert ist, dass sie Translation ermöglicht. Im Allgemeinen bedeutet operabel gebunden zusammenhängend und, im Fall von Leadersequenzen, zusammenhängend und in Leseraster.
Als replizierender Adenovirusvektor wird ein Adenovirus oder eine Mutante davon bezeichnet, das/die in der Lage ist, sich in Krebszellen zu replizieren. Solche können Wildtyp-Adenovirus oder, wie nachstehend noch näher erläutert wird, Mutanten von Adenovirus umfassen, die in der Lage sind, sich in bestimmten Typen von Krebszellen selektiv zu replizieren, vorzugsweise in jenen, denen funktionell ein oder mehrere Tumorsuppressorproteine fehlen.
Unter "E1A-RB-Familienmitgliedbindungsregionen", "RB-Bindungsstellenmutanten" oder "RB-Mutanten" in Adenovirus werden jene Regionen in der konservierten Region 2 (CR2) von E1A verstanden, die für Bindung von RB (p105) oder zwei anderen E1A-Bindungsproteinen, p107 und p130, verantwortlich sind. 1 zeigt die spezifischen CR2-Gendeletionen, die in den Adenovirusmutanten dl922/947, dl1107 und der Punktmutation in pm 928 vorhanden sind.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann ein Adenovirus, das in einer E1A-RB-Familienmitgliedbindungsregion mutiert ist, auch ein heterologes Genprodukt oder ein negatives Selektionsmittel exprimieren, das für die infizierten Zellen toxisch sein kann. Eine große Auswahl an solchen Mitteln kann verwendet werden. Beispielsweise können negative Selektionsgene in ein ausgewähltes Adenovirus-E1A-RB-Familienmitgliedbindungsregion-Konstrukt eingebaut werden. Eine bevorzugte Ausführungsform ist eine HSV-tk-Genkassette, die operabel an den E2-Promotor von Ad5-NTdl1110 gebunden ist, oder ein alternativer Promotor und/oder Enhancer (z.B. später Hauptpromotor, E1a-Promotor/Enhancer, E1b-Promotor/Enhancer) mit einer Polyadenylierungsstelle, um eine tk-Expressionskassette zu bilden. Siehe Zjilstra et al., Nature 342, 435 (1989); Mansour et al., Nature 336, 348 (1988); Johnson et al., Science 245, 1234 (1989); Adair et al., Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 86, 4574 (1989); M. Capecchi, Science 244, 1288 (1989). Die tk-Expressionskassette (oder andere negative Selektions-Expressionskassetten) wird in das Adenovirusgenom, beispielsweise als ein Ersatz für eine wesentliche Deletion des E3-Gens, insertiert. Andere negative Selektionsgene, einschließlich Cytosindeaminase, werden Fachleuten bekannt sein. Siehe das US-Patent Nr. 5.358.866. Es wird angenommen, dass ein negatives Selektionsgen, das operabel an den E2-Promotor gebunden ist, eine besonders bevorzugte Ausführungsform zur Inkorporation in hierin offenbarte E1A-RB-Bindungsmutanten, und vorzugsweise die E1A-CR2-Mutanten, ist.
In einer anderen Ausführungsform würden andere negative Selektionsmittel Cytokine, vorzugsweise ein Interleukin 1–15, noch bevorzugter IL-2 (US-Patente Nr. 4.738.927 oder 5.641.665), Interleukin 7 (US-Patente Nr. 5.965.195 oder 5.328.988) und IL-12 (siehe das US-Patent Nr. 5.457.038), oder ein Interferon, einschließlich Interferon gamma (US-Patente Nr. 4.727.138 oder 4.762.791), umfassen. Auch umfasst würde Tumornekrosefaktor alpha (US-Patente Nr. 4.677.063 oder 5.773.582) oder GM-CSF (US-Patente Nr. 5.393.870 oder 5.391.485) sein. Darüber hinaus könnten immunmodulierende Proteine verwendet werden, die Makrophagen-Entzündungsproteine einschließlich MIP-3 (siehe T.N. Well und MC.J. Peitsch, Leukoc. Biol 61(5), 545–550 (1997)) und Zellsuizid oder Apoptose induzierende Proteine einschließlich BAD und BAX umfassen. Siehe E. Yang et al., Cell 80, 285–291 (1995); und R. Sandeep et al., Cell 91, 231–241 (1997).
Obwohl die Wirkung der vorliegenden Zusammensetzungen zur Behandlung von Krebs durch eine oder mehrere Theorien beschrieben werden kann, wird verstanden werden, dass der/die Mechanismus/Mechanismen, durch den/die die Adenovirusmutanten der Erfindung, alleine oder in Kombination mit Chemotherapie, zur Behandlung von hyperproliferativen Erkrankungen, einschließlich Krebs, wirken, bis heute noch nicht bekannt ist/sind. Werden also solche Theorien hierin diskutiert oder erwähnt, so gilt zu verstehen, dass die Erfinder nicht beabsichtigen, sich durch diese Theorien binden zu lassen, da dies eine Einschränkung der Ansprüche darstellen würde. Es ist daher wichtig anzumerken, dass die E1A-RB-Familienmitgliedbindungsmutanten-Adenoviren der Erfindung, obgleich sie durch Mutationen in einer RB-Familienmitgliedbindungsregion von E1A charakterisiert sind, ihre biologische Aktivität mittels Mechanismen ausüben, die bis heute noch nicht bekannt sind.
Adenovirus
Es ist wichtig anzumerken, dass, während die vorliegende Erfindung auf Grundlage von Adenovirus Typ 5 beschrieben wird, sie ebenso mit anderen ähnlichen Adenovirus-Serotypen ausgeführt werden kann. Die allgemeine Organisation des Adenovirusgenoms ist unter Serotypen konserviert, und spezifische Funktionen sind ähnlich angeordnet. Weiters ist das Adenovirus-5-Genom als Genbank Zugriffsnummer M73260 registriert, und das Virus ist bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, unter der Zugriffsnummer VR-5 erhältlich. Verfahren zur Konstruktion von Adenovirusmutanten sind im Allgemeinen auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Siehe S. K. Mittal, Virus Res. 28, 67–90 (1993). Bestimmte Materialien und Verfahren, die zur Konstruktion von Adenovirusmutanten verwendet werden, werden von T. Hanke et al., Virology 177, 436–444 (1990), und A.J. Bett et al., J. Virol. 67, 5911–5921 (1993), sowie in WO 96/40955 beschrieben. Microbix Biosystems, Inc., mit Sitz in 341 Bering Avenue, Toronto, Ontario, Kanada, verkauft zahlreiche der zur Konstruktion von Adenovirusmutanten verwendeten Materialien und stellt Produktinformationsblätter bereit, die das Vorgehen zur Herstellung Letzterer beschreiben. Mutationen in der E1A-RB-Familienmitgliedbindungsregion sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und können leicht unter Verwendung herkömmlicher Mutageneseverfahren, einschließlich PCR, gebildet werden.
Eigenschaften von E1A-Adenovirusmutante - Replikation und Zytopathogenität
DNA-Tumorviren wie z.B. Adenovirus sind in der Lage, ruhende Zellen zu infizieren und sich in ihnen zu replizieren, da Eintritt in die S-Phase induziert wird. Dieser Schritt von G1- in S-Phase folgt dem hemmenden Binden von RB und verwandten zellulären Proteinen durch frühe virale Genprodukte. Siehe P. Whyte, N. Williamson & E. Harlow, Cell 56, 67–75 (1989); E. Moran, B. Zerler, T. Harison & M. Mathews, Molecular and Cellular Biology 6, 3470–3480 (1986).
Bindung und Inaktivierung von RB (sowie von p107, p130, wie nachstehend noch näher erläutert) durch Adenovirus wird durch Aminosäuren 121 bis 127 der konservierten Region 2 des E1A-Proteins gefördert. Siehe E. Moran, B. Zerler, T. Harison & M. Mathews, Molecular and Cellular Biology 6, 3470–3480 (1986); P. Whyte, H. Ruley & E. Harlow, J. Virology 62, 257–265 (1988). Mutationen innerhalb dieser Domäne resultieren in einem Transformationsverlust durch E1A ohne Inhibition ihrer Transaktivierungsfunktion. Siehe E. Moran, B. Zerler, T. Harison & M. Mathews, Molecular and Cellular Biology 6, 3470–3480 (1986); P. Whyte, N. Ruley & E. Harlow, J. Virology 62, 257–265 (1988); T. Jelsma et al., Virology 171, 120–130 (1989).
In einer Ausführungsform der Erfindung werden Adenovirus-E1A-RB-Bindungsstellenmutanten beschrieben, die reduziertes Replikationsvermögen in ruhenden normalen Zellen aufweisen, jedoch gesteigerte Replikation sowohl in Krebszellen als auch in proliferierenden normalen Zellen, einschließlich vor allem Mikrogefäß-Endothelzellen, zeigen. Somit tötet virale Replikation in einer gemischten Population aus sich teilenden und ruhenden Zellen im Wesentlichen sich teilende Zellen, während sie auf ruhende Zellen eine wesentlich geringere Wirkung zeigt. Aus den in den Beispielen beschriebenen Versuchen geht hervor, dass Viren mit Mutationen in der RB-Familienmitgliedbindungsregion von E1A im Vergleich zu Wildtyp-Adenovirus signifikant reduzierte Replikation und Zytopathogenität in ruhenden Zellen zeigen. Im Gegensatz dazu und überraschenderweise sind Replikation und Zytopathogenität der Virusmutanten von der E1A-RB-Familienmitgliedbindungsstelle höher als jene bei Wildtyp-Adenovirus in Krebszellen und in proliferierenden normalen Zellen, einschließlich Mikrogefäß-Endothelzellen. Die folgende Diskussion liefert eine detailliertere Beschreibung jeder dieser Eigenschaften, Replikation und Zytopathogenität, der Adenovirusmutanten der Erfindung in verschiedenen Zelltypen, entweder in sich teilenden oder in ruhenden Zellen.
Die vorliegende Erfindung, die nachstehend im Detail, und insbesondere in den Beispielen, dargestellt ist, basiert auf den Ergebnissen aus Versuchen mit drei Adenovirusmutanten mit gut charakterisierten Mutationen in der E1A-RB-Familienmitgliedbindungsregion, der konservierten Region 2 (CR2) des Virus. Die Viren sind bezeichnet als: dl1107, dl922/947 und pm 928.
Die CR2-Region von Wildtyp-Adenovirus bindet drei zelluläre Proteine: p130, p107 und p105. p105 entspricht RB. Frühere Arbeiten von anderen (siehe D. Barbeau et al., Oncogene 9, 359–373 (1994)) und die Beobachtungen der Erfinder, die nicht veröffentlicht wurden, warfen Licht auf die Wirkung von Mutationen in der E1A-CR2-Region der Adenovirusmutanten, dl1107, dl922/947 und pm 928, auf Bindung an diese zellulären Proteine. E1A, für das dl1007 kodiert, bindet sich im Wesentlichen nur an p107, während E1A, für das dl922/947 und pm 928 kodieren, nur geringe oder gar keine Bindung an eines dieser drei zellulären Proteine zeigt. So scheint es, dass die nachstehend präsentierten Ergebnisse für Adenovirusmutanten gelten, die zumindest eine Mutation in der hierin als E1A-RB-Bindungsstellenregion bezeichneten Region aufweisen.
Replikation von E1A-CR2-Adenovirusmutanten in vitro im Vergleich zu Wildtyp
In einer Ausführungsform der Erfindung wird für Adenovirusmutanten mit gut charakterisierten Mutationen in der E1A-RB-Familienmitgliedbindungsregion, und vorzugsweise in der konservierten E1A-RB-Bindungsregion 2 (CR2) des Virus, gezeigt, dass sie sich in einer Gruppe normaler Zellen und Krebszellen replizieren (2). Noch bevorzugter war eine solche Adenovirus-E1A-CR2-RB-Bindungsstellenmutante, dl922/947, nicht in der Lage, sich zu einem Titer über dem Eingangstiter in ruhenden, sich nicht unbegrenzt vermehrenden, menschlichen Mikrogefäß-Endothelzellen (MVEC) zu replizieren. Dahingegen, und wie auch in den Beispielen noch näher erläutert wird, replizieren sich solche E1A-RB-Bindungsstellenvirusmutanten signifikant besser als Wildtyp-Adenovirus in aktiv proliferierenden MVECs.
Weiters wurde die Replikation dieser E1A-RB-Familienmitgliedbindungs-Adenovirusmutanten in menschlichen Tumorzellen mit mutiertet RB- (C33A, zervikal) oder normaler RB-Expression (HLaC, laryngeal) bestimmt. Die E1A-RB-Bindungsstellenvirusmutanten replizierten in beiden Tumorzelllinien besser als Wildtyp-Adenovirus. Ähnliche Resultate wurden in A549-Karzinomzellen erhalten, die normale RB-Expression aufweisen.
Zytopathische Wirkung in RB-(+)-Zelllinien
In einer zweiten Ausführungsform der Erfindung wird für Adenovirusmutanten mit gut charakterisierten Mutationen in der E1A-RB-Familienmitgliedbindungsregion, und vorzugsweise in der konservierten E1A-RB-Bindungsstellen-Region 2 (CR2) des Virus, gezeigt, dass sie im Vergleich zu Wildtyp-Adenovirus auf alle getesteten Tumorzelllinien, einschließlich Zellen mit normaler RB-Expression (HLaC, RKO, H1299, U2OS und A549) und jener mit abnormaler RB-Expression (C33A, N2009) gesteigerte Zytopathogenität aufweisen (3). Die vitale Dosis, die erforderlich ist, um 50% eines Zellmonolayers zu zerstören, war beim Wildtyp-Adenovirus bis zu zehnmal höher als bei den E1A-CR2-RB-Bindungsstellenmutanten dl1107 oder dl922/947. Demähnlich wurde für proliferierende MVECs, kleinen Atemweg-Epithelzellen (SAECs) und Säugetier-Epithelzellen gezeigt, dass sie auf CPE mit den E1A-CR2-Mutanten empfindlicher sind als auf Wildtyp-Virus. Die Gegenwart von Wildtyp-RB-Protein schien CPE-Ergebnisse zu beeinflussen. Beispielsweise war die höhere Zytopathogenität von E1A-CR2-RB-Familienmitgliedbindungsmutanten im Vergleich zu Wildtyp-Adenovirus in Zellen mit normaler RB-Expression am höchsten. Dahingegen waren ruhende MVECs und Säugetierepithelzellen (MECs) auf die E1A-RB-Bindungsvirusmutanten weniger empfindlich als auf Wildtyp-Adenovirus.
E1A-Mutanten zeigen gesteigerte Wirksamkeit gegen Tumoren in vivo
In wiederum einer anderen Ausführungsform der Erfindung wurde für die E1A-RB-Familienmitgliedbindungsstellen-Virusmutanten, und vorzugsweise für die E1A-CR2- RB-Mutanten, gezeigt, dass sie höhere oder gleiche antitumorale Aktivität in vivo aufwiesen als für Wildtyp-Adenovirus beobachtet wurde (4).
Die antitumorale Wirksamkeit wurde unter Verwendung von menschlichen Tumorxenotransplantaten in athymischen Mäusen wie in den Beispielen beschrieben bestimmt. Beispielsweise hatten Tiere mit Kolontumoren, denen eine E1A-CR2-RB-Familienmitgliedbindungsstellen-Virusmutante injiziert wurde, eine mittlere Überlebensdauer von 80 Tagen im Vergleich zu 35 Tagen in der Gruppe, die mit Wildtyp-Adenovirus behandelt wurde, und zu 25 Tagen in der Vehikel-Kontrollgruppe. Weitere Ergebnisse sind in den Beispielen dargestellt.
E1A-Mutanten zeigen im Vergleich zu Wildtypvirus herabgesetzte Replikation und Toxizität in ruhenden normalen Zellen in vivo
Die Baumwollratte ist ein permissiver Wirt für menschliches Adenovirus (siehe H.S. Ginsberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 3823–3827 (1989)), und ihre Lunge ist ein anerkanntes Modell zur Studie von adenoviraler Replikation und Pathologie in vivo. Siehe G.A. Prince et al., J. Virol. 67, 101–111 (1993); H.S. Ginsberg & G.A. Prince, Infect Agents Dis 3, 1–8 (1994). Somit wurden Versuche an Baumwollratten durchgeführt, die die wesentliche Resistenz von ruhenden normalen Zellen gegenüber der E1A-RB-Familienmitgliedbindungsstellen-Virusmutanten im Vergleich zu Wildtyp-Adenovirus bestätigten. In-situ-Hybridisierung der Lungen, die mit E1A-RB-Bindungsstellenvirusmutante infiziert waren, zeigte keine Replikation in einem Fall und einen geringen Grad an Replikation in den anderen Fällen. Dahingegen zeigte In-situ-Hybridisierung der Lungen, die mit Wildtyp-Adenovirus infiziert waren, einen höheren Grad an Replikation in alten Tieren. Wildtyp-Adenovirus infizierte diffus Zellen im gesamten Bronchiolenepithel und innerhalb des Lungenparenchyms, während die Replikation von E1A-RB-Familienmitgliedvirusmutanten auf isolierte Bronchiolenepithelzellen eingeschränkt war. Diese Ergebnisse sind im Detail in den Beispielen präsentiert.
Somit sind insgesamt gesehen Adenovirus-E1A-RB-Familienmitgliedbindungsmutanten die bevorzugte Ausführungsform der Erfindung, und noch bevorzugter sind Adenovirus-E1A-CR2-RB-Familienmitgliedmutanten, die in der RB-Familienmitgliedbindungsregion von E1A mutiert sind. Diese Viren zeigen reduzierte Replikation in ruhenden normalen Zellen, während Replikation und Zytopathogenität in Krebszellen und proliferierenden Endothelzellen stärker sind als im Wildtyp-Adenovirus.
Die im Vergleich zu Wildtyp-Adenovirus erhöhte Replikation und Zytopathogenität von E1A-CR2-RB-Bindungsstellenmutanten in proliferierenden Zellen war unerwartet. Tatsächlich sind mehrere Adenovirus- und Herpesvirusmutanten bekannt, die genetisch attenuiert wurden, um selektive Replikation in Tumorzellen zu erreichen. Siehe C. Heise et al., Nat. Med. 3, 639–645 (1997); J.R. Bischoff et al., Science 274, 373–376 (1996); R.L. Martuza et al., Science 252, 854–856 (1991); T. Mineta, Nat. Med. 1, 938–943 (1995). Jedes dieser attenuierten Viren repliziert weniger effizient als sein verwandtes Wildtypvirus, sogar in Tumorzellen. Siehe J.R. Bischoff et al., Science 274, 373–376 (1996); R.L. Martuza et al., Science 252, 854–856 (1991); D.H. Kirn, Expert Opinion on Investigational Drugs 5, 753–762 (1996). In manchen Fällen kann Replikation im Vergleich zum Wildtypvirus um das 10- bis 100fache reduziert werden. Siehe R.L. Martuza et al., Science 252, 854–856 (1991). Dies ist vermutlich auf den Verlust wichtiger viraler Funktionen zurückzuführen, die Replikation fördern. Der Grund für die gesteigerte Replikation von E1A-CR2-RB-Bindungsmutanten im Vergleich zu Wildtyp-Adenovirus ist unbekannt.
Für Fachleute wird ersichtlich sein, dass die hierin offenbarten E1A-RB-Bindungsstellenmutanten, und vorzugsweise die E1A-CR2-RB-Bindungsstellenmutanten, einen großen therapeutischen Index zwischen sich teilenden und ruhenden Zellen, oder insbesondere zwischen Tumor- und proliferierenden Mikrogefäß-Endothelzellen einerseits und ruhenden Mikrogefäß-Endothelzellen andererseits, aufweisen.
Somit wird weiters erkannt werden, dass diese bevorzugte Ausführungsform der Erfindung günstigerweise auf das wesentliche und selektive Töten von sich teilenden Tumorzellen direkt durch Adenovirusreplikation und darin liegende zytopathogene Wirkung angewandt werden kann. Diese Wirkung wird durch die Elimination von sich entwickelnden Blutgefäßen durch die Adenovirus-E1A-RB-Bindungsstellenmutanten verstärkt. Beide Antitumorwirkungen treten mit minimalem Töten normaler ruhender Zellen auf.
Formulierungen/Verabreichung
Die hierin beschriebenen Adenovirusmutanten können für therapeutische und diagnostische Verabreichung an einen Patienten formuliert werden. Für therapeutische oder prophylaktische Verwendungen wird eine sterile Zusammensetzung, die eine pharmakologisch wirksame Dosierung an Adenovirus enthält, einem menschlichen Patienten oder einem nicht menschlichen Tierpatienten zur Behandlung von beispielsweise einem neoplastischen Leiden verabreicht. Im Allgemeinen umfasst die Zusammensetzung etwa 10³ bis 10¹⁵ oder mehr Adenoviruspartikel in einer wässrigen Suspension. Ein pharmazeutisch annehmbarer Träger oder Exzipient, z.B. Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4%ige Salzlösung, 0,3%iges Glycin und dergleichen, kann verwendet werden. Diese Lösungen sind steril und im Allgemeinen frei von partikulärer Substanz, die nicht der erwünschte Adenovirusvektor ist. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch annehmbare Hilfssubstanzen, die für annähernd physiologische Bedingungen erforderlich sind, enthalten, wie pH-Modifikator und Puffer, Toxizitätsmodifikator und dergleichen, z.B. Natriumacetat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Natriumlactat usw. Exzipienten, die Infektion von Zellen durch Adenovirus steigern, können eingebunden werden, vorzugsweise Polykationen.
Adenoviren der Erfindung oder die darin enthaltene DNA kann auch neoplastischen Zellen durch Liposomen- oder Immunoliposomenzufuhr zugeführt werden; solche Zufuhr kann auf Grundlage einer Zelloberflächeneigenschaft, die die neoplastische Zellpopulation aufweist (z.B. die Gegenwart eines Zelloberflächenproteins, das sich an Immunglobulin in einem Immunoliposom bindet), selektiv auf neoplastische Zellen gerichtet sein. Typischerweise wird eine wässrige Suspension, die die Viruspartikel enthält, in Liposomen oder Immunoliposomen verkapselt. Beispielsweise kann eine Suspension von Adenovirusvirionen in Mizellen mittels herkömmlicher Verfahren verkapselt werden, um Immunoliposomen zu bilden (US-Patent Nr. 5.043.164, US-Patent Nr. 4.957.735, US-Patent Nr. 4.925.661; Connor & Huang, J. Cell Biol. 101, 582 (1985); Lasic DD, Nature 355, 279 (1992); Novel Drug Delivery (Hrsg.: LF Prescott & WS Nimmo): Wiley, New York (1989); Reddy et al., J. Immunol. 148, 1585 (1992)). Immunoliposomen, umfassend einen Antikörper, der sich spezifisch an ein Krebszellenantigen (z.B. CALLA, CEA) bindet, das an den Krebszellen der Person vorhanden ist, können verwendet werden, um Virionen oder Virionen-DNA auf jene Zellen zu richten.
Die Zusammensetzungen, die die vorliegenden Adenoviren oder Mischungen davon enthalten, können für prophylaktische und/oder therapeutische Behandlungen neoplastischer Erkrankungen verabreicht werden. Bei therapeutischen Anwendungen werden Zusammensetzungen einem Patienten, der bereits von der bestimmten neoplastischen Erkrankung betroffen ist, in einer Menge verabreicht, die ausreichend ist, um das Leiden und die damit einhergehenden Komplikationen zu heilen oder zumindest teilweise zu stoppen. Eine Menge, die ausreichend ist, um dies zu erreichen, ist als eine "therapeutisch wirksame Dosis" oder "wirksame Dosis" definiert. Mengen, die für diese Verwendung wirksam sind, hängen vom Ausmaß des Leidens, dem allgemeinen Zustand des Patienten und der Art der Verabreichung ab. Einzelne oder mehrere Verabreichungen der Zusammensetzungen können unter Einhaltung von Dosierungshöhen und -zusammenstellungen erfolgen, die vom behandelnden Arzt festgelegt werden. In jedem Fall sollten die pharmazeutischen Formulierungen eine Menge an E1A-RB-Familienmitgliedbindungs-Adenovirusmutanten dieser Erfindung bereitstellen, die ausreichend ist, um den Patienten wirksam zu behandeln.
Bei prophylaktischen Anwendungen werden Zusammensetzungen, die Adenoviren der Erfindung oder Mischung davon enthalten, einem Patienten verabreicht, der sich zum Zeitpunkt der Verabreichung in keinem neoplastischen Erkrankungszustand befindet, um die Resistenz des Patienten gegen das Auftreten von Krebs zu steigern oder um die Remissionsdauer zu verlängern. Solch eine Menge ist als eine "prophylaktisch wirksame Dosis" definiert. In dieser Verwendung hängen die präzisen Men gen wiederum von dem Gesundheitszustand des Patienten und vom allgemeinen Immunitätsgrad ab.
Adenovirustherapie der vorliegenden Erfindung kann mit anderen antineoplastischen Verfahren, wie z.B. mit herkömmlicher Chemotherapie, oder mit anderen Viren kombiniert werden. Siehe das US-Patent Nr. 5.677.178, ausgegeben am 14. Oktober 1997. Chemotherapie kann mittels Verfahren verabreicht werden, die Ärzten bekannt sind, einschließlich systemischer, direkter Injektion in den Krebs oder durch Lokalisierung an der Stelle der Krebserkrankung durch Assoziieren des erwünschten chemotherapeutischen Mittels mit einem geeigneten Retardmittel oder durch intraarterielle Perfusion des Tumors. Das bevorzugte chemotherapeutische Mittel ist Cisplatin, und die bevorzugte Dosis kann vom Arzt auf Grundlage der Beschaffenheit des zu behandelnden Krebses sowie anderer Faktoren, die routinemäßig bei der Verabreichung von Cisplatin berücksichtigt werden, festgelegt werden. Vorzugsweise wird Cisplatin intravenös in einer Dosis von 50–120 mg/m² über eine Zeitspanne von 3–6 Stunden verabreicht. Noch bevorzugter wird es intravenös in einer Dosis von 80 mg/m² über eine Zeitspanne von 4 Stunden verabreicht. Ein zweites chemotherapeutisches Mittel, das vorzugsweise in Kombination mit Cisplatin verabreicht wird, ist 5-Fluoruracil. Die bevorzugte Dosis von 5-Fluoruracil beträgt 800–1.200 mg/m² pro Tag 5 Tage hintereinander.
Adenovirustherapie unter Verwendung der Adenoviren der vorliegenden Erfindung kann mit anderen antineoplastischen Verfahren wie z.B. Gentherapie kombiniert werden. Siehe das US-Patent Nr. 5.648.478. Wie zuvor erwähnt weisen Adenoviruskonstrukte zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung spezifisches Krebszelltöten auf, vorzugsweise durch die Expression von Prodrug-Aktivatorgenen, die aus einem gewebespezifischen Promotor gewonnen wurden. Siehe das US-Patent Nr. 5.631.236.
In dem Fall, dass die Adenovirusmutanten der vorliegenden Erfindung eine Immunantwort hervorrufen, die ihre Wirkung in einem Wirtstier dämpft, können sie mit einem geeigneten immunsuppressiven Wirkstoff verabreicht werden, um ihre Wirkung zu maximieren. Alternativ dazu gibt es zahlreiche verschiedene Verfahren, durch die die äußere Proteinhülle des Adenovirus modifiziert werden kann, um weniger immunogenes Virus herzustellen. Siehe WO 98/40509. Darin wird gezeigt, dass eine zentrale immunogene Komponente der äußeren Hülle des Adenovirus, das Hexonprotein, genetisch bearbeitet werden kann, um weniger immunogen zu sein. Dies erfolgt durch Schaffen eines Hybridhexonproteins durch Substituieren der normalen viralen Hexonproteinepitope durch eine Sequenz von Aminosäuren, die normalerweise im Hexonprotein nicht zu finden sind. Solche Adenoviruskonstrukte sind weniger immunogen als das Wildtypvirus.
Um die Wirksamkeit von Adenovirus-E1A-Mutationskonstrukten der Erfindung zu steigern, können sie modifiziert werden, sodass sie gesteigerten Tropismus für bestimmte Tumorzelltypen aufweisen. Beispielsweise kann, wie in WO 98/40508 gezeigt, ein Protein an der äußeren Adenovirushülle so modifiziert werden, dass es ein chemisches Mittel, vorzugsweise ein Polypeptid, aufweist, das sich an einen Rezeptor bindet, der an Tumorzellen in größerem Ausmaß vorhanden ist als an normalen Zellen. Siehe auch das US-Patent Nr. 5.770.442 und US-Patent Nr. 5.712.136. Das Polypeptid kann Antikörper sein und ist vorzugsweise ein einkettiger Antikörper.
Reinigung von Adenovirusmutanten
Adenovirus wird gewöhnlicherweise mittels zahlreicher Verfahren gereinigt, einschließlich Cäsiumchlorid-Banding unter Verwendung einer Ultrazentrifuge. Zur großtechnischen Herstellung von Adenovirus jedoch sind Verfahren wünschenswert, die größere Ausbeuten ergeben als jene, die mittels Cäsiumchlorid-Ultrazentrifugation leicht erhältlich sind, und umfassen einen oder mehrere chromatographische Schritte. Das bevorzugte Verfahren verwendet Ionenaustauschchromatographie. Siehe z.B. WO 98/22588; und Huyghe et al., Human Gene Therapy 6, 1403–1416 (1996).
Die nachstehenden Beispiele der Erfindung haben ausschließlich beispielhaften Charakter, und Fachleuten wird bekannt sein, dass zahlreiche Modifikationen und Ände rungen an diesen Ausführungsformen vorgenommen werden können, ohne vom Schutzumfang der Erfindung abzuweichen.
Beispiel 1
Zytopathogenität von Adenovirus-E1A-CR2-RB-Familienmitgliedbindungsmutanten
Die Zytopathogenität von Adenovirus-E1A-CR2-RB-Familienmitgliedbindungsmutanten wurde unter Verwendung von drei Mutanten getestet. dl922/947 weist eine Deletion von Aminosäuren 122 bis 129 auf (siehe P. Whyte, H. Ruley & E. Harlow, J. Virology 62, 257-265 (1988)), während dl1107 eine Deletion von Aminosäuren 111 bis 123 aufweist (siehe T. Jelsma et al., Virology 171, 120–130 (1989)). pm 928 weist eine Punktmutation auf, die zur Umsetzung von Aminosäure 124 von Cystein zu Glycin führt. Siehe E. Moran et al., Molecular and Cellular Biology 6, 3470–3480 (1986). Sowohl für dl922/947 als auch für pm 928 wurde gezeigt, dass sie trotz normaler E1A-Expressionsniveaus defekte Transformation aufweisen. Ad5 und Wildtyp D wurden als Wildtyp-Adenoviruskontrollen verwendet; diese Viren sind abgesehen von Deletionen in der E3-Region in Wildtyp D beinahe identisch. Siehe D.D. Banker et al., Virology 156, 107–121 (1987).
Für Tests unter Verwendung von proliferierenden Zellen wurden Zellen bis zu 70 Konfluenz (2% FBS) gezüchtet, und zu diesem Zeitpunkt wurden die Zellen dann mit Infektionsmultiplizitäten (MOI) von 0,001 bis 10 infiziert. Die Tests wurden fünf Tage lang fortgesetzt. Dann wurden die Platten entweder a) mit Kristallviolett gefärbt und photographiert oder b) mit Sulforhodamin B (SRB) gefärbt und mittels kolorimetrischen Tests getestet. Der SRB-Test wurde früher bereits beschrieben. Siehe P. Skehan et al., Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 30, 2436 (1989). Kurz zusammengefasst wurden die Zellen in 96-Well-Platten in vierfacher Ausführung ausplattiert und 6 Stunden lang anhaften gelassen. Seriell verdünntes Virus wurde zu den Testwells zugesetzt, und die Platten wurden bei 37°C in einem angefeuchteten Inkubator mit 5% CO₂ inkubiert. Der Test wurde am geeigneten Tag nach der Infektion durch den Zusatz von Trichloressigsäure zu einer Endkonzentration von 10% für mindestens eine Stunde bei 4°C gestoppt. Die Platten wurden dann mit entionisiertem Wasser gewaschen und an der Luft trocknen gelassen. Zellen, die an den Platten zurückblieben, wurden mit einer 0,2%igen SRB-Lösung in 1%iger Essigsäure 20 Minuten lang bei Raumtemperatur gefärbt, mit 1%iger Essigsäure gewaschen und an der Luft getrocknet. Gebundener Farbstoff wurde mit 10 mM ungepufferter Tris-Base 5–10 Minuten lang an einem Schüttler löslich gemacht. Absorption wurde bei 515 mm mit einem Plattenleser gelesen. Die Prozent der Kontrollwerte wurden als die optische Dichte (O.D.) der Testwells/O.D. der Kontrollen berechnet und im Diagramm über virale Infektionsmultiplizität (MOI) dargestellt. Normale Zellen wurden nach dem Wachstum ruhend gestellt, um die Konfluenz und darauf folgendes Wachstum in 0,2% FBS zu vervollständigen. Der Ruhezustand wurde durch Zellzyklusanalyse und Zellzählungen vor jedem Test bestätigt.
Die folgenden Tumorzelltypen wurden in den Zytopathogenitättests verwendet und wurden aus der ATCC erhalten: nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom (A549, H2009, N1299), Kolonkarzinom (RKO), Zervixkarzinom (C33A) und Kehlkopfkarzinom (HLaC). Zellen wurden wie zuvor beschrieben gezüchtet. Siehe J.R. Bischoff et al., Science 274, 373–376 (1996). Menschliche RKO-Kolontumorzellen, die das menschliche Papillomavirus-E7-Gen exprimieren (RKO-RC 7.14), wurden von Dr. Kathy Cho, John's Hopkins University, erhalten.
Die Resultate zeigten, dass sowohl dl922/947 als auch dl1107 gegenüber Wildtyp-Adenovirus gesteigerte Zytopathogenität an allen getesteten Tumorzelllinien, einschließlich Zellen mit normaler RB-Expression (HLaC, RKO, H1299, U2OS und A549) und jener mit abnormaler RB-Expression (C33A, H2009), verursachten (3). Unter Verwendung quantitativer Sulforhodamin-B-Tests (SRB) war die virale Dosis, die erforderlich war, um 50% des Monolayers zu zerstören, für Wildtyp-Adenovirus bis zu zehnmal höher als für dl1107. Dem ähnlich waren proliferierende MVECs, kleine Atemweg-Epithelzellen (SAECs) und MECs (erhältlich bei Clonetics, San Diego, CA) auf CPE mit der E1A-CR2-RB-Bindungsstellenmutante empfindlicher als auf Wildtypvirus. Die Geschwindigkeit von CPE-Induktion mit der Punktmutante pm 928 lag in der Mitte zwischen jenen, die für die zwei E1A-CR2-RB-Bindungs stellendeletionsmutanten und für Wildtyp-Adenovirus beobachtet wurden. Interessanterweise schien die Gegenwart von Wildtyp-RB-Protein CPE-Resultate zu beeinflussen; die bessere Zytopathogenität der E1A-CR2-RB-Bindungsstellenmutanten in Bezug auf Wildtyp-Adenovirus war in Zellen mit normaler RB-Expression am höchsten. Im Gegensatz dazu waren ruhende MVECs und MECs weniger empfindlich auf die E1A-Virusmutanten als auf Wildtyp-Adenovirus.
Diese Daten untermauern somit eindeutig die Nützlichkeit der Adenovirus-E1A-CR2-RB-Familienmitgliedbindungsstellenmutanten, Tumorzellen direkt oder durch Eliminieren ihrer ihnen zugrundeliegenden Blutgefäß-Nährstoff-Endothelzellen-Trägerstruktur zu töten.
Beispiel 2
Replikation von Adenovirus-E1A-CR2-RB-Familienmitgliedbindungsstellenmutanten
Virus-Replikationstests wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt. Siehe J.R. Bischoff et al., Science 274, 373–376 (1996). Kurz zusammengefasst wurden Zellen wie für die Tests zur zytopathischen Wirkung in Beispiel 1 beschrieben gezüchtet und wurden bei einer MOI von 10 mit jedem Virus infiziert. 48 Stunden später wurden sowohl Zellen als auch Überstand zur Virustitrationsanalyse geerntet. Zelllysate wurden drei Gefrier- und Auftauzyklen unterzogen, denen ein 30-s-Impuls in einem Beschallungswasserbad folgte. Reihenverdünnungen von Überständen und Lysaten wurden an HEK293-Zellen (menschliche embryonale Nierenzellen, die die E1-Region von Ad2 exprimieren) titriert.
dl922/947 war nicht in der Lage, sich zu einen Titer über dem Eingangstiter in ruhenden, sich nicht unbegrenzt vermehrenden menschlichen Mikrogefäß-Endothelzellen (MVEC) zu replizieren (2). Im Gegensatz dazu replizierten sich beide E1A-Virusmutanten, dl1107 und pm 928, signifikant besser als Wildtyp-Adenovirus in aktiv proliferierenden MVECs. Ähnliche Ergebnisse wurden für ruhende und proliferierende menschliche Brustepithelzellen erhalten (Daten nicht dargestellt). Die Replikation von dl922/947 wurde in proliferierenden Endothelzellen gegenüber nichtproliferierenden Endothelzellen um etwa das 25fache gesteigert (7 × 10⁷ gegenüber 2,6 × 10⁶ pfu/ml), und dies gegenüber einem 2fachen Unterschied für Wildtyp-Adenovirus (4 × 10⁷ gegenüber 2 × 10⁷ pfu/ml).
Die Erfinder bewerteten als Nächstes die Replikation dieser Viren in menschlichen Tumorzellen mit mutierter RB-Expression (C33A, Zervix) oder normaler RB-Expression (HLaC, Kehlkopf). Die drei E1A-RB-Bindungsvirusmutanten replizierten in beiden Tumorzelllinien besser als Wildtyp-Adenovirus. Ähnliche Ergebnisse wurden in A549-Karzinomzellen (normale RB-Expression) erhalten.
Beispiel 3
Adenovirus-E1A-CR2-RB-Familienmitgliedbindungsstellenmutanten zeigen gesteigerte Wirksamkeit in Nacktmaus-Mensch-Tumorxenotransplantatmodellen
sDie Erfinder bewerteten die antitumorale Wirksamkeit von dl922/947, pm 928 und Wildtyp-Adenovirus gegen menschliche Tumorxenotransplantate in athymischen Mäusen. Weibliche athymische Mäuse (Hsd: Athymic Nude-nu) wurden in einem Alter von 4 bis 6 Wochen von der Harlan Sprague Dawley Company erhalten und mindestens zwei Wochen lang vor der Studie in Quarantäne gehalten. RKO-RC 7.14 oder menschliche HLaC-Karzinomzellen (2 × 10⁶ Zellen) wurden subkutan in die Flanken von 6 bis 8 Wochen alten Mäusen injiziert. Wuchsen die Tumoren zu einem Maximaldurchmesser von 5 bis 7 mm an, so wurde direkte intratumorale Verabreichung wie folgt durchgeführt.
Den Tumoren wurden jeden Tag an fünf aufeinander folgenden Tagen direkt 10⁸ pfu Virus, suspendiert in 60 μl PBS, injiziert (n = 6–13 pro Gruppe). Vehikel-behandelte Kontrolltumoren erhielten PBS alleine auf identische Weise. Tumorgrößen wurden bis zur Tötung der Tiere (Tumorvolumen > 1 cm³ oder 90 Tage nach Behandlung) zweimal wöchentlich bestimmt. Tumorzellen wurde entweder eine E1A-CR2-RB-Bindungsstellenmutante (pm 928 oder dl922/947), Wildtyp-Adenovirus oder Vehikel injiziert. Tiere, die Kolontumoren in sich trugen, in die dl922/947 injiziert wurde, wie sen eine mittlere Überlebensdauer von 80 Tagen auf, im Vergleich zu 35 Tagen in der Gruppe, die mit Wildtyp-Adenovirus behandelt wurde, und zu 25 Tagen in der mit Vehikel behandelten Kontrollgruppe (p = 0,04 für dl922/947 gegenüber Wildtyp) (4, Panel A). Die mittlere Überlebensdauer von Tieren mit HLaC-Tumor, die entweder mit dl922/947 oder mit Wildtyp-Adenovirus behandelt worden waren, konnte im Laufe von 90 Tagen nach der Behandlung nicht ermittelt werden (80% bzw. 70% waren immer noch am Leben); die mittlere Überlebensdauer der Vehikel-Kontrollgruppe betrug 30 Tage (4, Panel B). Vollständige Tumorregressionen traten bei 8 von 12 HLaC-Tumoren auf, die mit dl922/947 behandelt worden waren, bei 5 von 13, die mit pm 928 behandelt worden waren, bei 3 von 7, die mit Wildtyp-Adenovirus behandelt worden waren, und bei 0 von 8, denen das Vehikel injiziert worden war. Keine der Mäuse mit vollständiger Tumorregression zeigte am Ende der Studie (90 Tage) Anzeichen von neuerlichem Tumorauftreten. Tumoren, die bis zu 70 Tagen nach der Behandlung mit E1A-CR2-RB-Familienmitgliedbindungsstellenmutanten entnommen wurden, enthielten Zellen mit aktiv replizierendem Virus, das durch In-situ-Hybridisierung auf Adenovirus-DNA nachgewiesen werden konnte. Ähnliche Überlebens- und Reaktionsdaten wurden auch in C33A-Tumorenxenotransplantaten beobachtet (Daten nicht dargestellt).
In-situ-Hybridisierung wurde an Formalin-fixiertem, in Paraffin eingebettetem Gewebe, das in 5-μm-Schnitte geschnitten wurde, durchgeführt. Objektträger wurden in Xylolen entparaffinisiert, durch Ethanole hydratisiert, mit Proteinase K verdaut und in 4% Paraformaldehyd danach fixiert. Hybridisierung erfolgte über Nacht bei 37°C mit 0,5 μg/ml biotinylierter Adenovirus-DNA-Sonde (Enzo Diagnostics, Inc., Farmingdale, NY). Nach 3 aufeinander folgenden Waschschritten in 1x SSC bei 55°C wurde ein mit alkalischer Phosphatase konjugierter Anti-Biotin-Antikörper (Vector Laboratories) aufgebracht. NBT/BCIP wurde als das Chromagen verwendet, und die Objektträger wurden mit Kernechtrot gegengefärbt.
Beispiel 4
E1A-CR2-RB-Familienmitgliedmutanten zeigen reduzierte Replikation und Toxizität in ruhenden Baumwollratten-Lungenzellen im Vergleich zu Wildtypvirus
Die Baumwollratte ist ein permissiver Wirt für menschliches Adenovirus. Siehe H.S. Ginsberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 3823–3827 (1989). Ihre Lunge ist ein anerkanntes Modell für Studien von Adenovirusreplikation und -pathologie in vivo. Siehe G.A. Prince et al., J. Virol. 67, 101–111 (1993); H.S. Ginsberg & G.A. Prince, Infect Agents Dis 3, 1–8 (1994). Baumwollratten wurden intranasale Impfungen entweder von dl922/947 oder von Wildtyp-Adenovirus verabreicht, und sie wurden 14 Tage später getötet (n = 5 pro Gruppe/Zeitpunkt). Die relative Resistenz von ruhenden normalen Zellen gegen dl922/947 gegenüber Wildtyp-Adenovirus wurde in diesem Modell bestätigt.
In-situ-Hybridisierung (durchgeführt gemäß der Beschreibung in Beispiel 3) der Lungen, die mit dl922/947 infiziert waren, zeigte keine Replikation in einem Fall und geringes Replikationsniveau in den anderen Fällen an Tag 3 nach Infektion. Im Gegensatz dazu zeigte In-situ-Hybridisierung der Lungen, die mit Wildtyp-Adenovirus infiziert waren, ein höheres Replikationsniveau in allen Tieren. Wildtyp-Adenovirus infizierte Zellen diffus im gesamten Bronchiolenepithel und innerhalb des Lungenparenchyms, während dl922/947-Replikation auf isolierte Bronchiolenepithelzellen limitiert war. Die alveolare Histopathologie war im Vergleich mit Wildtyp-infizierten Lungen sowohl 3 Tage als auch 14 Tage nach Infektion in den mit dl922/947 infizierten Lungen ebenfalls reduziert.
Baumwollratten (Sigmodon hispidus) wurden mit Adenoviren durch intranasale Impfung wie zuvor beschrieben infiziert. Siehe H.S. Ginsberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 3823–3827 (1989); G.A. Prince et al., J. Virol. 67, 101–111 (1993); H.S. Ginsberg & G.A. Prince, Infect Agents Dis 3, 1–8 (1994). Kurz zusammengefasst wurden den Tieren 10⁹ pfu intranasal eingeimpft (n = 5 pro Behandlungsgruppe), und sie wurden drei Tage später getötet; davor durchgeführte Experimente hatten gezeigt, das dies der Höhepunkt für Adenovirusreplikation in diesem Tiermodell ist. Die Lungen wurden verarbeitet und wie zuvor beschrieben für In-situ-Hybridisierung geschnitten.
Beispiel 5
S-Phasen-Induktion und Virus-DNA-Synthese von RB-Bindungsstellenmutanten sind in ruhenden normalen Zellen im Vergleich zu Wildtyp-Adenovirus reduziert
Die Fähigkeit der RB-Bindungsstellen-Adenovirusmutante, dl922/947 und dl1107, S-Phase in nicht-proliferierenden normalen Zellen zu induzieren, wurde mit jener von Wildtyp-Adenovirus verglichen. An der Basislinie befanden sich nur 10% der sich nicht unbegrenzt vermehrenden kleinen Atemweg-Epithelzellen in S-Phase. 24 Stunden nach Infektion mit Wildtyp-Adenovirus (MOI von 10) befanden sich 61% in S-Phase; dl1107-Infektion führte in 40% dieser Zellen zur S-Phase. dl922/947 war jedoch signifikant weniger wirksam bei der Induktion von S-Phase; nur 26% der Zellen befanden sich nach 24 Stunden in S-Phase. Virus-DNA-Replikation wurde durch Dot-Blot-Analyse im selben Test nach 24 Stunden bewertet. Obwohl Virus-DNA-Produktion bei Wildtyp-Adenovirus und dl1107 etwa gleichwertig war, lag die Virus-DNA-Replikation, die für dl922/947 festgehalten werden konnte, auf einem signifikant niedrigeren Niveau (etwa 30% von Wildtyp-Niveaus; p < 0,05).
Aufgrund der obigen Beschreibung können Fachleute einfach die grundlegenden Charakteristika der vorliegenden Erfindung erkennen und können, ohne vom Schutzumfang dieser Erfindung abzuweichen, verschiedene Änderungen und Modifikationen an der Erfindung vornehmen, um sie an verschiedene Verwendungen und Bedingungen anzupassen.

Claims

In-vitro-Verfahren zum selektiven Töten eines Großteils von sich teilenden Zellen in einer Zellpopulation, die sich teilende und ruhende Zellen umfasst, worin dieses Verfahren das Kontaktieren der Zellpopulation unter infektiösen Bedingungen mit einem replikationsfähigen Adenovirus, das eine Mutation in der E1A-RB-Familienmit gliedbindungsregion dieses Adenovirus umfasst, und das ausreichend lange Warten umfasst, sodass dieses Adenovirus die Zellpopulation infizieren kann, worin sich die Mutation in der E1A-CR2-Region befindet und eine Deletion oder Substitution einer oder mehrerer (a) der Aminosäuren 122 bis 129; oder (b) der Aminosäuren 111 bis 123 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die sich teilenden Zellen Krebszellen sind.
Verfahren nach Anspruch 2, worin die sich teilenden Zellen Endothelzellen sind.
Verfahren nach Anspruch 3, worin die ruhenden Zellen Endothelzellen sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Adenovirus dl922/947 ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Adenovirus dl1107 ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Adenovirus pm 928 ist.
In-vitro-Verfahren zum Töten von sich teilenden Endothelzellen mit wesentlich geringerem Töten von ruhenden Endothelzellen in einer Zellpopulation, die sich teilende und ruhende Endothelzellen umfasst, worin das Verfahren das Kontaktieren der Zellpopulation unter infektiösen Bedingungen mit einem replikationsfähigen Adenovirus, worin dieses Adenovirus eine Mutation in einer E1A-CR2-RB-Familien mitgliedbindungsregion von diesem Adenovirus umfasst, und das ausreichend lange Warten umfasst, sodass das mutierte Adenovirus die Zellpopulation infizieren kann, worin das mutierte Adenovirus in den sich teilenden Zellen zu höheren Titern als Wildtyp-Adenovirus repliziert.
In-vitro-Verfahren zum selektiven Töten eines Großteils von sich teilenden Endothelzellen und Krebszellen im Vergleich zu ruhenden Endothelzellen in einer Zellpopulation, die diese drei Zelltypen umfasst, worin das Verfahren das Kontaktieren dieser Zellpopulation unter infektiösen Bedingungen mit einem replikationsfähigen Adenovirus, das eine Mutation in einer E1A-CR2-RB-Familienmitgliedbindungsregion von diesem Adenovirus umfasst, und das ausreichend lange Warten umfasst, sodass das mutierte Adenovirus die Zellpopulation infizieren kann.
Verfahren nach Anspruch 9, worin die sich teilenden Endothelzellen Mikrogefäßendothelzellen sind.
Verfahren nach Anspruch 10, worin die Adenovirusmutation eine Mutation in der E1A-CR2-Region umfasst.
Verwendung eines replikationsfähigen Adenovirus, das eine Mutation in der E1A-CR2-Region von diesem Adenovirus umfasst, worin die Mutation eine Deletion oder Substitution einer oder mehrerer (a) der Aminosäuren 122 bis 129; oder (b) der Aminosäuren 111 bis 123 umfasst; zur Herstellung eines Medikamentes zur Verwendung in der Behandlung oder Prävention einer Erkrankung unkontrollierten oder hyperproliferativen Zellwachstums.
Verwendung nach Anspruch 12, worin das Adenovirus dl922/947 ist.
Verwendung nach Anspruch 12, worin das Adenovirus dl1107 ist.
Verwendung nach Anspruch 12, worin das Adenovirus pm 928 ist.
Verwendung eines replikationsfähigen Adenovirus, das eine Mutation in der E1A-RB-Familienmitgliedbindungsregion umfasst, zur Herstellung eines Medikamentes zur Kontrolle von Angiogenese in einem Tier durch Töten von sich teilenden Mikrogefäßendothelzellen.
Verwendung nach Anspruch 16, worin die E1A-RB-Familienmitgliedbindungsregion dieses Adenovirus in der E1A-CR2-Region liegt.
Verwendung nach Anspruch 17, worin die Mutation in der E1A-CR2-Region eine Deletion oder Substitution einer oder mehrerer der Aminosäuren 122 bis 129 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 18, worin die Mutation in der E1A-CR2-Region eine Deletion oder Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren 111 bis 123 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 16, worin das Adenovirus dl922/947 ist.
Verfahren nach Anspruch 16, worin das Adenovirus dl107 ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Rb-Bindungsstellen-Adenovirusmutante, worin die Mutation in der E1A-CR2-Region liegt und eine Deletion oder Substitution einer oder mehrerer (a) der Aminosäuren 122 bis 129, oder (b) der Aminosäuren 111 bis 123 umfasst, in einer physiologischen Lösung.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 22, worin die Adenovirusmutante dl922/947 ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 22, worin die Adenovirusmutante d1107 ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 22, worin die Adenovirusmutante pm 928 ist.