DE69633236T2 - Gewebe-oder zellspezifische herpessimplex virus replikation - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von veränderten Herpes-simplex-Viren, die zur Abtötung von Tumorzellen fähig sind. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung replikationskompetentes Herpes-simplex-Virus-1 (HSV-1), das zellspezifische transkriptionsregulatorische Sequenzen enthält, die operativ an ein essentielles Herpes-simplex-Virus-Gen gekoppelt sind. Zusätzlich kann das zellspezifische HSV-1 non-neurovirulent und unfähig zur Replikation in nicht-teilenden Zellen gemacht werden. Außerdem kann zur Herstellung eines Tiermodells für eine spezifische Krankheit ein zell- und gewebespezifisches HSV-1 konstruiert werden, das repliziert und einen spezifischen Zelltypus abtötet, was als zellspezifische Ablation bezeichnet wird. Zellspezifische Ablation durch zell- oder gewebespezifisches HSV-1 kann auch zur Behandlung von Krankheiten, die eine Ätiologie von hyperaktiven Zellen oder ektop exprimierenden Zellen haben, verwendet werden.
  • In der Vergangenheit sind Viren auf ihre Fähigkeit zur Behandlung verschiedener Tumortypen in Tieren oder Menschen getestet worden. Im Stand der Technik vorgeschlagene therapeutische Mechanismen der viralen Krebstherapie schließen ein: (i) das Produzieren neuer Antigene auf der Tumorzellenoberfläche zur Induktion einer immunologischen Abstoßungsreaktion, ein Phänomen, das „Xenogenisation" genannt wird, und (ii) direktes Abtöten von Zellen durch das Virus, die so genannte Onkolyse. Austin et al., Adv. Cancer Res. 30: 301 (1979); Kobayashi et al., Adv. Cancer Res. 30: 279 (1979); Moore, Progr. Exp. Tumor Res. 1: 411 (1960); Russell, Sem. Cancer Biol. 5: 437–443 (1994). Die Behandlungen von Tumoren sowohl in Tieren als auch in Menschen beruhten auf Wildtyp-Virus, gangverdünntem (passage-attenuated virus) Virus oder infizierten Zellzubereitungen. Kobayashi, Adv. Cancer Res. 30: 279 (1979); Cassel et al., Cancer 52: 856 (1983); Moore, Prog. Exp. Tumor Res. 1: 411 (1960).
  • Mehrere Tiermodelle und Tiertumore wurden verwendet, um die Onkolyse mit Wildtyp-Viren zu studieren. Moore, Ann. Rev. Microbiol. 8: 393 (1954); Moore, Progr. Exp. Tumor Res. 1: 411 (1960). Es wurde gezeigt, dass mindestens neun Viren fähig sind, zu einem gewissen Grad eine Tumorregression in einer Vielzahl von Tumoren in Mäusen, Ratten, Kaninchen und Meerschweinchen zu induzieren. Ein großer Nachteil, der in diesen frühen Tierstudien beobachtet wurde, war jedoch die systemische Infektion durch das Virus.
  • Zur Vermeidung systemischer Infektion hat sich die gentechnische Veränderung von Viren zur Verwendung als anti-neoplastische Wirkstoffe auf die Erzeugung von veränderten Viren, die unfähig zur Replikation in nicht-teilenden Zellen sind, konzentriert. Viren, die zur Replikation in teilenden Zellen fähig sind, töten vorzugsweise schnell teilende Tumorzellen ab, weil diese Viren unfähig zur Replikation in nicht-teilenden oder normalen Zellen sind.
  • Die Verwendung von replikationsdefizienten Retroviren zur Behandlung von Tumoren benötigt Erzeugerzellen (producer cells) und erwies sich als begrenzt, weil jedes replikationsdefiziente Retroviruspartikel nur in eine einzelne Zelle eindringen kann, andere Zellen aber anschließend nicht ausreichend infizieren kann. Weil diese replikationsdefizienten Retroviren sich nicht auf andere Tumorzellen verbreiten können, würden sie unfähig sein, in einen tiefen, vielschichtigen Tumor in vivo vollständig einzudringen. Markert et al., Neurosurg. 77: 590 (1992).
  • Klinische Versuche zur Krebsbehandlung mit retroviraler Vektortherapie sind in den Vereinigten Staaten bewilligt worden. Culver, Clin. Chem 40: 510 (1994). Retrovirale Vektor-enthaltende Zellen wurden in Gehirntumoren implantiert, die in menschlichen Patienten wuchsen. Oldfield et al., Hum. Gene Ther. 4: 39 (1993). Diese retroviralen Vektoren trugen das HSV-1-Thymidinkinase-(HSV-tk)-Gen in die umgebenden Gehirntumorzellen und machten die Tumorzellen gegen das antivirale Medikament Ganciclovir empfindlich. Einige der Einschränkungen der aktuellen auf Retroviren beruhenden Krebstherapie sind, wie bei Oldfield beschrieben: (1) der geringe Titer der produzierten Viren, (2) die eingeschränkte Verbreitung der Viren auf die Region, die das Erzeugerzellenimplantat umgibt, (3) eine mögliche Immunantwort auf die Erzeugerzelllinie, (4) eine mögliche Insertionsmutagenese und Transformation der mit dem Retrovirus infizierten Zellen, (5) nur eine einzige Verabreichung bei Verwendung der Prodrug Ganciclovir ist möglich, weil das „Suizid"-Produkt die mit dem Retrovirus infizierten Zellen und die Erzeugerzellen tötet, und (6) der Umgebungseffekt (bystander effect) ist begrenzt auf Zellen, die in direktem Kontakt mit den retroviral transformierten Zellen stehen. Bi. W. L. et al., Human Gene Therapy 4: 725 (1993).
  • Der Ansatz zur selektiven Expression von Toxingenen in Krebszellen wird „molekulare Chemotherapie" genannt, wobei die transkriptionalen regulatorischen Sequenzen (TRS) eines Gens, das in dem Tumor exprimiert wird, eingesetzt werden, um die Expression von Toxin kodierenden Sequenzen auszulösen. Garver et al. (1994) Gene Therapy 1: 46–50; Miller & Vile, FASEB J. 9: 190–199 (1995). Gewebespezifische regulatorische Sequenzen sind verwendet worden, um die Expression von „Suizidgenen" auszulösen, und zwar (a) nach einem durch Retroviren herbeigeführten Gentransfer, (b) nach direkter Injektion von DNA oder (c) nach durch Adenovirus-Polylysin-herbeigeführter Transduktion. Huber, B. E. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8039–8043; Harris, J. D. et al. (1994) Gene Ther. 1: 170–175; Vile, R. et al. (1994) Gene Ther. 1: 307–316; Smith, M. J. et al. (1994) Human Gene Ther. 5: 29–35; Kuriyama, S. et al. (1991) Cell Struct. Funct. 16: 503–510; Vile, R. G. et al. (1993) Cancer Res. 53: 3860–3864; Garver, R. I. J. et al. (1994) Gene Ther. 1: 46–50.
  • Die retroviral vermittelte Gentherapie wird „virus-directed enzyme/prodrug therapy" (VDEPT) genannt. Huber, B. E. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8039–8043; Gutierrez, A. A. et al. (1992) The Lancet 339: 715–721. VDEPT beruht auf einem replikationsdefizienten Vektor, der spezifisch in Tumorzellen, nicht aber in normalen Zellen exprimiert wird. Ein in-vitro-Beispiel von VDEPT unterscheidet zwischen normalen Leber- und Hepatomzellen durch differenzielle Exprimierung eines replikationsdefizienten retroviralen Vektors, der an ein HSV-tk-Gen gekoppelte Promotoren für Albumin oder für α-Fetoprotein enthält. Huber et al., wie oben. In dem VDEPT-System waren normale Leberzellen fähig, Thymidinkinase zu exprimieren, wenn das HSV-tk-Gen an den Albuminpromotor gekoppelt war, nicht jedoch, wenn es an den α-Fetoproteinpromotor gekoppelt war. Umgekehrt waren Hepatomzellen in der Lage, Thymidinkinase zu exprimieren, wenn das HSV-tk-Gen an den α-Fetoproteinpromotor und nicht an den Albuminpromotor gekoppelt war. Thymidinkinase wandelt Nukleosidanaloga oder Prodrugs in wirksame zytotoxische Wirkstoffe in teilenden Zellen um. Thymidinkinase-Exprimierung wurde in verschiedenen Zelltypen erreicht, einschließlich Lymphom, hepatozellulärem Karzinom, Gliom, Fibrosarkom, Adenokarzinom und Melanom. Huber, B. E. et al. (1991), wie oben; Mullen, C. A., et al. (1992), PNAS 89: 33–37; Culver, K. W., et al. (1992) Science 256: 1550–1552; Ram, Z., et al. (1993) Cancer Res. 53: 83–88; Moolten, F. L., et al. (1990) J. Natl. Cancer Inst. 82: 297–300, und Vile, R. G. und Hart, I. R. (1993) Cancer Res. 53: 3860–3864.
  • In Gentherapiestrategien für Krebs wurde auch eine Vielzahl verschiedener Verabreichungsmethoden verwendet, um „Suizidgene" oder Immun-modulatorische Gene in neoplastischen Zellen zu transferieren. Ein Hauptziel dieser Strategien ist es, die Exprimierung von transferiertem Gen in dem entsprechenden Zelltypus zu erzielen, so dass normale Zellen nicht negativ beeinflusst werden. Beispielsweise wurde die TRS eines Proteins, menschliches Surfactant-Protein A, das spezifisch für das differenzierte Atemwegsepithel ist, verwendet, um ein Toxin-produzierendes Gen in eine aus nicht kleinen Zellen bestehende Lungenkrebszelllinie einzubringen. Smith, M. J. et al. (1994) Human Gene Therapy 5: 29–35. In ähnlicher Weise wurde die TRS des Karzinomspezifischen Proteins, sekretorischer Leukoprotease Inhibitor (SLPI), verwendet, um auf die Thymidinkinase-Exprimierung aus einem Plasmid in SLPI-exprimierenden Karzinomen abzuzielen. Garver, et al., wie oben.
  • In den frühen neunziger Jahren wurde die Verwendung von gentechnisch veränderten replikationskompetenten HSV-1-viralen Vektoren zuerst im Zusammenhang mit der Antitumortherapie erforscht. Martuza et al., Science 252: 854 (1991). Ein replikationskompetentes Virus hat den Vorteil, dass es in eine Tumorzelle eindringen kann, mehrere Kopien herstellen kann, die Zelle lysiert und sich auf weitere Tumorzellen verbreitet. Eine Thymidinkinase-defiziente (TK–) Mutante, dlsptk, war fähig, maligne menschliche Gliomzellen in einem Tiermodell für Gehirntumoren zu zerstören. Martuza, wie oben (1991). Leider waren die dlsptk-Mutanten in Bezug auf Neurovirulenz nur mäßig abgeschwächt und erzeugten bei der Dosis, die benötigt wurde, um die Tumorzellen ausreichend abzutöten, Enzephalitis. Markert et al., Neurosurgery 32: 597 (1993). Die restliche Neurovirulenz, die sich durch eine 50%-ige Sterberate von intrakranial verabreichten replikationsdefizienten viralen Vektoren von Herpes-simplex-Virus bei 106 Plaque-bildenden Einheiten (pfu) zeigte, begrenzt die Verwendung derartiger Vektoren für die Tumortherapie. Außerdem sind die bekannten TK– HSV-1-Mutanten unempfindlich gegen Acyclovir und Ganciclovir, die am häufigsten verwendeten und wirksamsten Anti-Herpes-Wirkstoffe.
  • Deswegen bleibt es von höchster Wichtigkeit, einen sicheren und wirksamen viralen Vektor zur Abtötung von Tumorzellen zu entwickeln. Obwohl zahlreiche Versuche unternommen wurden, einen viralen Vektor zu konstruieren, der in der Lage ist, menschliche Tumorzellen in vivo abzutöten, hat die konventionelle Technologie bisher keinen viralen Vektor hervorgebracht, der eine abgeschwächte Neurovirulenz bei der zur Abtötung von Tumorzellen benötigten Dosis aufweist, überempfindlich gegen antivirale Wirkstoffe und unfähig zur Rückentwicklung zum Wildtyp-Virus ist.
  • Die Verfahren der Gentherapie und molekularen Chemotherapie des Standes der Technik hängen von einem exogenen Polynukleotid oder von einem von einem solchen exogenen Polynukleotid translatierten Protein ab, um die Therapie durchzuführen. Bisher wurde noch kein gewebe- oder tumorspezifischer viraler Vektor aufgezeigt, in dem ein replikationskompetentes Virus verwendet wird. Außerdem wurde kein gewebe- oder tumorspezifischer HSV-Vektor gezeigt, der, um das therapeutische Abtöten des Zielgewebes durchführen zu können, von dem viralen Vektor selbst abhängig ist.
  • S. J. Russell diskutiert in zwei Übersichtsartikeln einige der Schwierigkeiten, die angetroffen werden, wenn ein replizierender viraler Vektor auf Tumorzellen angesetzt wird. Russell, Sem. Cancer Biol. 5: 437–443 (1994); Eur. J. Cancer 30A: 1165–1171 (1994). Strategien zur Erhöhung der Präzision von replizierenden Vektoren haben sich auf retrovirale Vektoren konzentriert. Der Russel-Übersichtsartikel beschreibt die Manipulation von kleinen Genomviren als onkolytische Wirkstoffe. Der Hauptnachteil solcher Kleingenomviren ist ihr Sicherheitsmangel, weil sie sich auch auf normales Gewebe ausbreiten.
  • Außerdem wurde die zellspezifische Expression von tk aus einem retroviralen Vektor nicht aufrechterhalten, wenn transgenische Tiere erzeugt wurden. Dieses deutet darauf hin, dass eine von zellspezifischen Retroviren vermittelte Gentherapie als solche nicht funktionieren könnte, weil, sobald die Zellen in situ transformiert werden, die korrekte Exprimierung ausgeschaltet werden könnte. Richards & Huber, Human Gene Therapy 4: 143 (1993).
  • Die konventionelle Technologie hat HSV als potenziellen Vektor zur gezielten Onkolyse nicht in Betracht gezogen, weil das große HSV-Genom schwierig zu regulieren ist. Außerdem scheinen HSV-Gene nicht so reguliert zu werden wie zelluläre Gene. In einer Umgebung von zellulären Genomen fallen HSV-1-Gene in zwei Kategorien der Regulation; entweder werden sie reguliert als Immediate-Early-Gene (bekannt als α-Gene) oder als Early-Gene (bekannt als β-Gene). HSV-1-Gene werden in einer zellulären Umgebung nicht als Late-Gene (bekannt als γ-Gene) reguliert. Deswegen entspricht die Virengenregulation in der Umgebung von Wirtschromosomen nicht der von Virengenen im Virengenom. Dies spricht dafür, dass zelluläre Promotoren, die ins Virengenom platziert werden, ebenfalls anders reguliert werden als in ihrem endogenen zellulären Genom. McKnight et al. in CANCER CELLS 4; DNA TUMOR VIRUSES, Cold Spring Harbor (1986) 163–173. Zusätzlicher Stand der Technik zeigte, dass exogene Promotoren wie virale Promotoren reguliert wurden, wenn sie in die Umgebung des HSV-Genoms platziert wurden. Dies sprach dafür, dass auf HSV nicht in einer zell- oder gewebespezifischen Weise abgezielt werden konnte. Panning, B. und Smiley, J. R. J. Virol. 63: 1929 (1989); Roemer, et al., J. Virol. 65: 6900 (1991). Weitere Hinweise auf die Schwierigkeiten, wenn auf HSV in einer zellspezifischen Weise abgezielt werden soll, kommen aus den Arbeiten von Anderson et al., die zeigen, dass der Neuron-spezifische Enolase-(NSE)-Promotor in HSV ein ineffizienter Promotor für die Lieferung von Genen zu ZNS-Neuronen ist. Anderson et al., Cell. Mol. Neurobiol. 13: 503 (1993); Anderson et al., Human Gene Therapy 3487 (1992).
  • Zusätzliche Hinweise darauf, dass exogene Gene im Zusammenhang mit HSV nicht in einer zellspezifischen Weise reguliert werden, kommen von Versuchen, die zeigen, dass HSV-Produkte zelluläre Promotoren regulieren können. Smiley, et al., Virology 113: 345 (1981). Beispielsweise wenn das Kaninchen-β-Globin-Gen in Fibroblasten als Teil eines HSV-Genoms eingeführt wird, so wird dieses Gen durch HSV-Immediate-Early-Polypeptide aktiviert. Im Hinblick auf die Einschränkungen des Standes der Technik besteht ein lang gefühlter Bedarf an auf Viren beruhenden Therapien, welche Krebszellen zerstören können, aber normale Zellen größtenteils intakt lassen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Deshalb ist es eine Aufgabe dieser Erfindung, ein replikationskompetentes Herpessimplex-Virus (HSV) bereitzustellen, das fähig zur Abtötung eines spezifischen Zielzelltyps oder einer spezifischen Zieltumorzelle in vivo ist, indem HSV, das einen gewebe- oder zellspezifischen Promotor enthält, der operativ an ein essentielles Herpes-simplex-Virus-Gen gekoppelt ist, verwendet wird.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen Herpes-simplex-Virusvektor bereitzustellen, wobei das Genom des viralen Vektors einen gewebe- oder zellspezifischen Promotor umfasst, der operativ an ein essentielles Herpes-simplex-Virus-Gen gekoppelt ist.
  • Zur Erreichung der Aufgaben der vorliegenden Erfindung kann das essentielle Herpes-simplex-Virus-Gen ein Herpes-simplex-Virus-Immediate-Early-Gen sein. Ein bevorzugtes HSV-Immediate-Early-Gen, welches in dem erfindungsgemäßen Vektor verwendet wird, ist das essentielle Herpes-simplex-Virus-Gen ICP-4.
  • Tumorzellen, wie hierin beschrieben, können von einem Nervensystem-Typ sein, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Astrocytom, Oligodendrogliom, Meningiom, Neurofibrom, Glioblastom, Ependymom, Schwannom, Neurofibrosarkom und Medulloblastom. Andere Arten von Tumorzellen, welche gemäß der vorliegenden Erfindung abgetötet werden können, schließen solche ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Melanomzellen, Pankreaskrebszellen, Prostatakrebszellen, Brustkrebszellen, Lungenkrebs zellen, Kolonkrebszellen, Magenkrebszellen, Fibrosarkom, Schuppenzellenkarzinom, Neurektodermalzellen, Schilddrüsentumorzellen, Hypophysentumorzellen, Lymphknotentumorzellen, Lebertumorzellen und Mesotheliom- und Epidermoidkarzinomzellen, ein.
  • Um diese und andere Aufgaben zu erfüllen, wird im Einklang mit einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ein replikationskompetentes Herpes-simplex-Virus bereitgestellt, das unfähig zur Exprimierung von (i) einem funktionalen γ34.5-Genprodukt und/oder von (ii) einer Ribonukleotidreduktase ist. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Vektor Veränderungen in beiden Genen.
  • Ein derartiger Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung kann auch (1) gegenüber antiviralen Wirkstoffen empfindlich gemacht werden und (2) fähig gemacht werden, eine herabgesetzte allgemeine Neurovirulenz zu zeigen. Beispielsweise kann das Herpessimplex-Virus des Vektors HSV-1 oder HSV-2 sein.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung zur Verwendung zur Ablation von spezifischen normalen Zellen in einem Subjekt bereit, welche eine pharmazeutische Zusammensetzung umfasst, die (A) einen Herpes-simplex-Virusvektor, der einen gewebe- oder zellspezifischen Promotor enthält, der operativ an ein essentielles Herpes-simplex-Virus-Gen gekoppelt ist; und (B) einen pharmazeutisch verträglichen Träger für den Vektor enthält, so dass die spezifischen normalen Zellen in situ durch den Vektor verändert werden, wodurch die Zellen abgetötet werden. Eine derartige Zusammensetzung kann zur Ablation von normalen Hirnanhangsdrüsenzellen verwendet werden, wenn der zellspezifische Promotor, der in dem HSV-Vektor verwendet wird, ein Wachstumshormon-Promotor ist. Zusätzlich kann die Zusammensetzung zum Abtöten normaler adrenokortikaler Zellen verwendet werden, wenn der zellspezifische Promotor Proopiomelanocortin ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem eine Zusamnensetzung zur Verwendung zum Schutz eines Subjektes gegen eine Herpes-simplex-Virusinfektion bereit, die eine pharmazeutische Zusammensetzung umfasst, die (A) einen Herpes-simplex-Virusvektor, in dem das Genom des Virus in (i) dem γ34.5-Gen und (ii) dem Ribonukleotidreduktasegen verändert ist; und (B) einen pharmazeutisch verträgliches Träger für diesen Vektor, enthält.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung geeignet zur gemeinsamen Anwendung mit Neurochirurgie, Chemotherapie oder Strahlentherapie.
  • Ein mutierter Virusvektor der vorliegenden Erfindung kann gegenüber Temperaturen, die höher sind als die Grundtemperatur des Wirts, empfindlich sein, was ein weiteres Sicherheitsmerkmal bereitstellt, in dem die Virenreplikation im Falle von Enzephalitis und Fieber weiter beeinträchtigt wird.
  • Andere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung ersichtlich werden. Es sollte jedoch verstanden werden, dass die detaillierte Beschreibung und spezifische Beispiele, obwohl sie bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung zeigen, nur zur Veranschaulichung angegeben werden, da verschiedene Veränderungen und Modifizierungen innerhalb des Wesens und Umfangs der Erfindung für den Fachmann aus der detaillierten Beschreibung ersichtlich sein werden.
  • Kurze Beschreibung der Abbildungen
  • Die vorliegende Erfindung kann unter Bezugnahme auf die folgenden Zeichnungen vollständiger verstanden werden, worin:
  • 1 ein Diagramm ist, welches schematisch die Genanordnung von G92A darstellt. In der Abbildung werden die folgenden Abkürzungen verwendet: E = EcoRI, B = Bam HI, S = SspI, e/p = Enhancer/Promoter-Sequenz.
  • 2 ist ein Balkendiagramm, das die virale Infektivität von G92A1- und G92A2-HSV-Vektoren der vorliegenden Erfindung im Vergleich zu KOS- und d120-HSV-Vektoren in verschiedenen menschlichen Zelltypen illustriert. E5-Zellen enthalten stabil integrierte ICP4-Gene und sind fähig zur Unterstützung des Wachstums von ICP4–-Viren. Hep3B und HuH7 sind Albumin-exprimierende Zellen. Det551, SW480 und MCF7 sind unfähig zur Albuminexprimierung. Die Zellen wurden in 6-Vertiefungsplatten präpariert und die Zellen-Monolayers wurden mit den angegebenen Viren (KOS, G92A1, G92A2, d120) infiziert. Die infizierten Zellen wurden inkubiert, bis Plaque gebildet wurde, und anschließend fixiert und mit Giemsa oder X-gal-Histochemie gefärbt. Die Plaque wurde gezählt und aus der gemittelten Plaquezahl wurden die Pfu/ml bestimmt. Die Werte, die für jeden infizierten Zelltyp in dem Graph aufgeführt wurden, sind die Mittelwerte einer Anzahl verschiedener Experimente, von 2 bis 14.
  • 3 ist ein Graph, der die Einzelschritt-Wachstumskurve darstellt, wobei Zellkulturen mit KOS oder G92A bei einem MOI von 1,5 infiziert wurden und die Viren zu den angegebenen Zeiten der Post-Infektion aus den Vertiefungen geerntet und auf E5-Zellen titriert wurden.
  • 4 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion eines mutierten Herpes-simplex-Virus, der eine 1 kB-Deletion in beiden Kopien des γ34.5-Gens und eine Insertion in dem ICP6-Gen aufweist.
  • 5 zeigt die Sequenzanordnung eines mutierten Herpes-simplex-Virus, G207-1, im Vergleich zu seinem Herkunfts-Wildtyp-Hintergrund (Stamm F). Die Abkürzungen sind B, BamHI; Be, BstEII; G, BglIII; N, NcoI; S, ScaI; St, StuI; und X, XhoI.
  • 6 ist ein Diagramm, welches die Fähigkeit von G207-1 und G207-2 darstellt, alle menschlichen U-87MG-Gliomzellen in Kultur abzutöten, auch bei einer geringen Infektionsmultiplikation (MOI = 0,01).
  • 7 ist ein Diagramm, das die Ganciclovir-(GCV)-Empfindlichkeit von R3616, G207-1 und G207-2 darstellt, was zeigt, dass G207-1 und G207-2 zehn Mal empfindlicher gegenüber Ganciclovir sind als R3616. R3616 (Stamm F) hat dieselbe Empfindlichkeit gegenüber Ganciclovir wie Stamm KOS (Wildtyp).
  • 8 ist ein Diagramm, welches die Fähigkeit von G207-1 und G207-2 zeigt, das Wachstum von menschlichen Gehirntumorzellen (U-87MG) im subkutanen menschlichen Gehirntumormodell in athymischen Mäusen zu hemmen.
  • Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Die vorliegende Erfindung nutzt die Fähigkeit eines replikationskompetenten HSV-1, in eine spezifische Tumorzelle oder einen spezifischen Tumorzelltyp in situ einzudringen, eine Vielzahl von Kopien zu machen, die spezifische Zielzelle zu lysieren und sich, mit relativ geringfügigen Auswirkungen auf die umgebenden normalen Zellen, auf weitere Zellen desselben Typs zu verbreiten. Das Herpes-simplex-Virus der vorliegenden Erfindung hat jedes der folgenden Merkmale: (1) Wirksamkeit im Abtöten einer Tumorzelle oder eines normalen Zelltyps und (2) Spezifität für das Abtöten eines spezifischen Tumorzelltyps oder eines bestimmten normalen Zelltyps. Zusätzlich kann das Herpes simplex-Virus der vorliegenden Erfindung ein beliebiges der folgenden Merkmale einschließen: (a) eine deutliche Abschwächung der allgemeinen Neurovirulenz, um das normale Gehirn zu schützen, (b) vielfache Deletionen, so dass eine einfache Mutation nicht die Rückkehr zum viralen Wildtyp-Phänotyp auslösen kann und (c) Überempfindlichkeit gegenüber Ganciclovir, so dass ein unerwünschtes Ausbreiten des Virus verhindert werden kann.
  • In den Verfahren des Standes der Technik wird eine Gentherapie, das heißt der Transfer von genetischem Material in spezifische Zellen eines Patienten, verwendet. Ex-vivo-Gentherapie ist Gentherapie, die Transduktion der Zellen in vitro und die anschließende Wiedereinführung der modifizierten Zellen in den Patienten umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein rekombinantes HSV für einen spezifischen Zielzelltyp oder ein spezifisches Zielgewebe bereit. Anders als die meisten anderen Verfahren der Gentherapie, die von einem exogenen Polynukleotid oder von dem Protein, das von einem solchen exogenen Polynukleotid translatiert worden ist, zur Durchführung der Therapie abhängen, hängt die vorliegende Erfindung zur Durchführung des therapeutischen Abtötens des Zielgewebes von dem HSV selbst ab.
  • Die vorliegende Erfindung stellt einen alternativen Weg bereit, indem die inhärenten zytotoxischen Fähigkeiten des replikationskompetenten HSV zur Zerstörung von Tumorzellen in vivo und dabei zur Replikation und Verbreitung innerhalb des Tumors verwendet werden. In unseren anfänglichen Studien mit malignen Gehirntumoren wurden Mutanten von HSV, die unfähig zur Replikation in nicht-teilenden Zellen waren und/oder die nicht neurovirulent waren, verwendet. Martuza, R. L. et al. (1991) Science 252: 854–856; Mineta, T. et al. (1994) Cancer Res. 54: 3963–3966.
  • Wegen der inhärenten Neuropathogenizität von HSV wurden nicht-neuropathogene Mutanten isoliert, die fähig waren, in anderen Zelltypen normal zu wachsen. Fawl, R. L. et al. (1994) Sem. Virol. 5: 261–271. Die Unterschiede zwischen schnell wachsenden Tumoren und dem umgebenden normalen Gehirngewebe sind derart, dass das Virus an dem Tumor lokalisiert zu bleiben scheint und keine negativen Wirkungen an dem behandelten Tier hervorruft. Martuza, R. L. et al. (1991) Science, wie oben.
  • Anstatt auf die Exprimierung eines einzelnen Genprodukts abzuzielen, wird in der vorliegenden Erfindung auf ein essentielles virales IE-Gen, das für die Transkription von viralen Early- und Late-Genen und deshalb für den kompletten lytischen Wachstumszyklus des Virus benötigt wird, abgezielt. Immediate-Early-Gene sind Transkriptions-/Translationsregulatoren. Beispiele eines essentiellen HSV-Immediate-Early-Gens schließen ICP4 und ICP27 ein. (ICP27 ist auch bekannt als IE63, Vmw63, IE2, UL54 und α27.) Nur ICP4 ist essentiell zum Anschalten von viralen Early-Genen. Das zytotoxische Potenzial des Vektors wird durch die Synthese von neuen infektiösen viralen Partikeln verstärkt, die sich auf benachbarte Zellen durch den ganzen Tumor verbreiten.
  • Die Herstellung zellspezifischer viraler Vektoren ist auch anwendbar auf viele Systeme, die keine Tumore sind, zum Beispiel zur Ablation von spezifischen Zelltypen in Tieren zur Herstellung von Tiermodellen oder zum Studium der Bedeutung (importance) eines bestimmten Zelltyps während der Entwicklung, indem bestimmte Zellen in verschiedenen Entwicklungsstadien entfernt werden. Deshalb ist das Verfahren der vorliegenden Erfindung auch auf die zellspezifische Ablation von normalen Zellen für die Herstellung experimenteller Tiermodelle zum Studium von Zellfunktion und Krankheitszuständen anwendbar. Zell- oder gewebespezifische Promotoren können in den HSV-Konstrukten der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um ein Tiermodell für eine bestimmte Krankheit bereitzustellen, die eine Ätiologie basierend auf der Fehlfunktion derartiger spezifischer Zellen oder Gewebe aufweist. Beispielsweise können Beta-Inselzellen des Pankreas entfernt werden, indem ein erfindungsgemäßer HSV-Vektor verwendet wird, in dem ein essentielles HSV-Gen durch den Insulinpromotor reguliert wird, um ein Tiermodell zum Insulin-abhängigen Diabetes mellitus herzustellen.
  • Die Krankheitszustände, die unter Verwendung von transgenen Knockout-Mäusen hergestellt wurden, könnten auch in individuellen Tieren erzeugt werden, wenn dasselbe Gen verwendet wird, das zum Abzielen auf Toxine in den transgenen Knockout-Mäusen verwendet wird. Beispielsweise wurden transgene Mäuse, die lacZ unter der Kontrolle verschiedener Nervenzell-spezifischer Promotoren enthalten, hergestellt. Nirenberg, S. und Cepko, C. J. Neurosci. 13: 3238 (1993). In diesen transgenen Mäusen konnte die Expression von lacZ mit photoaktivierbaren Farbstoffen nachgewiesen werden, und anschließend wurden die Farbstoff-markierten Zellen entfernt (photoablated).
  • In der vorliegenden Erfindung wird die Notwendigkeit zur Herstellung von transgenen Knockout-Tieren vermieden, indem die Tiere einem zellspezifischen HSV ausgesetzt werden, um spezifische Zellen in vivo zu entfernen. Jeder der zell- oder gewebespezifischen TRS, aufgeführt in der Tabelle 1, kann in dem beanspruchten HSV-Vektor verwendet werden. Die folgenden sind Beispiele von zell- oder gewebespezifischen HSV-Vektoren: (a) das BglIIth (–2400) bis AluIth (+27) Fragment des Ratten- Tyrosinhydroxylase-Promotors (Kim, L. S., et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 15689–15695) kann zur Herstellung eines Catechol-aminergen Neuronen-spezifischen HSV-Vektors verwendet werden; (b) das BglIIMBP (–1297) bis HindIII (+60) Fragment des pBP-H (Miura, M. et al. (1989) Gene 75: 31–38) kann zur Herstellung eines Oligodendrozyten-spezifischen HSV-Vektors verwendet werden; (c) das BglIINF-L (–2003) bis SmaINF-L (+75) Fragment des leichten Neurofilmentgens in Ratten (Reeben, M., et al. (1995) J. Neurosci. Res. 40: 177–188) kann zur Herstellung eines neuronal-spezifischen HSV-Vektors verwendet werden; (d) das SalITPH (–2117) bis AvaITPH (+29) Fragment des menschlichen Tryptophanhydroxylasegens (Boularand, S., et al. (1995) J. Biol. Chem 270: 3757–3764) kann zur Herstellung eines Serotonin/Zirbeldrüsen-spezifischen HSV-Vektors verwendet werden; (e) das XbaIPcp-2 (–3.5) bis PvuIPcp-2 (ATG) Fragment des Maus-Purkinjezellen-Protein-2(Pcp-2)-Gens (Vandaele, S., et al. (1991) Genes & Dev. 5: 1136–1148) kann verwendet werden zur Herstellung eines Purkinjezellen/zerebellarspezifischen HSV-Vektors; (f) das SstImP1 (–4800) bis NcoImP1 (+95) Fragment des Maus-Protamin-1-Gens (Peschon, J. J., et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5316) kann zur Herstellung eines Spermatid-spezifischen HSV-Vektors verwendet werden; und (g) der Proopiomelanocortin-Promotor (Tremblay et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 85: 8890 (1988)) kann zur Herstellung eines Adrenokortikalzellen-spezifischen HSV verwendet werden. Die folgende Liste gibt Beispiele von tumorspezifischen HSV-Vektoren: (a) das SstIEGFr (–1109) bis SstIEGFr (+1) Fragment des menschlichen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptorgens (Ishii, S. et al., PNAS 82: 4920 (1985)) kann zur Herstellung eines tumorspezifischen HSV-Vektors, der auf squamöse Karzinome, Gliome oder Brusttumore gerichtet ist, verwendet werden; (b) das XmnIDF3 (–1656) bis XmnIDF3 (+31) Fragment des menschlichen Muzin-ähnlichen Glycoproteingens (DF3, MUC1) (Abe, M. und Kufe, D., PNAS 90: 282 (1993)) kann zur Herstellung eines Brustkrebs-spezifischen HSV-Vektors verwendet werden.
  • Zusätzlich können die vorliegenden tumorspezifischen HSV-Vektoren zur Herstellung von Tiermodellen zum Studium der physiologischen Rolle tumorspezifischer Gene verwendet werden. Jeder beliebige tumorspezifische TRS oder Promotor, die in der Tabelle 2 aufgeführt sind, können in dem beanspruchten HSV-Vektor verwendet werden.
  • Eine andere Verwendung der vorliegenden zell- oder gewebespezifischen HSV-Vektoren besteht in der Herstellung von Medikamenten zur Behandlung von verschiedenen Krankheitszuständen. Jeder der zell- oder gewebespezifischen TRS, die in Tabelle 1 aufgeführt sind, kann in dem beanspruchten HSV-Vektor verwendet werden, um Zellen zu entfernen, die an einem bestimmten Krankheitszustand beteiligt sind. Ein potenzieller therapeutischer Ansatz würde darin bestehen, spezifische Neuronen, die an chronischem Schmerz beteiligt sind, zu entfernen. In der Behandlung von neuropathischem Schmerz schließt das HSV ein essentielles HSV-Gen unter der Kontrolle des TRS der Substanz P ein. Ein derartiges HSV ist ausgerichtet auf dorsale Wurzel-Ganglionzellen (dorsal root ganglion cells), die die Substanz P exprimieren. Der HSV-Vektor würde dahingehend gentechnische verändert, dass er nicht-teilende Zellen infiziert und empfindlich gegenüber einem antiviralen Wirkstoff ist.
  • Weitere therapeutische Ansätze schließen ein: (1) die Ablation von Keratinozyten/Epithelzellen, die für Warzen verantwortlich sind; (2) die Ablation von Zellen in hyperaktiven Organen (z. B. Schilddrüse); (3) die Ablation von Fettzellen in fettleibigen Patienten; (4) die Ablation von gutartigen Tumoren (z. B. gutartigen Tumoren der Schilddrüse, gutartige Prostatahypertrophie, tuberöse Sklerose); (5) die Ablation von Wachstumshormon-produzierenden adenohypophysen Zellen zur Behandlung von Akromegalie; (6) die Ablation von Mammotropen zum Abstellen der Produktion von Prolactin; (7) die Ablation von ACTH-produzierenden Zellen zur Behandlung des Cushing Syndroms; (8) die Ablation von Adrenalin-produzierenden chromaffinen Zellen des Nebennierenmarks zur Behandlung von Pheochromozytom; und (9) die Ablation von Insulin-produzierenden beta-Inselzellen zur Behandlung von B-Zell-Tumoren.
  • Als Beispiel erwähnt ist die tuberöse Sklerose, eine vererbbare Krankheit (1 : 10.000 Geburten), die dadurch gekennzeichnet ist, dass gutartige Tumore (Hamartome) mehrere Organe befallen. Tuberöse Sklerose könnte unter Verwendung eines erfindungsgemäßen HSV-Vektors, der auf den Tumor abgezielt ist und bei dem die αβ-kristalline transkriptionale regulatorische Sequenz verwendet wird, behandelt werden. Iwaki & Tateishi, Am. J. Pathol. 139: 1303 (1991).
  • In einem anderen Beispiel wird Adipozyten-TRS (Graves, R. A., et al., J. Cell Biochem. 49: 219 (1992)) verwendet, um den erfindungsgemäßen HSV-Vektor darauf auszurichten, spezifisch in Adipozyten zu replizieren und Adipozyten zu lysieren. Für die Behandlung von nicht-krebsartigen Zellen, die sich nicht teilen, könnte der Vektor zum Wachstum in nicht-teilenden Zellen nicht abgeschwächt werden. Außerdem sollte das Konstrukt gegenüber einem antiviralen Wirkstoff empfindlich sein (z. B. tk+).
  • Die Viren der vorliegenden Erfindung sind so geändert worden, dass sie Änderungen in der Expression von mindestens einem essentiellen Herpes-simplex-Virus-Gen enthalten. Ein „essentielles Herpes-simplex-Virus-Gen" ist ein HSV-Gen, das ein Protein kodiert, das für die Virusreplikation essentiell ist. Vergleiche Ward & Roizman, Trends in Genetics 10: 267 (1994). Beispiele für HSV-Gene, die für die virale Replikation essentiell sind, schließen die Immediate-Early-Gene ICP4 und ICP27, die Gene, die für die DNA-Replikation notwendig sind (VL9, VL5, VL42, DNA pol und ICP8) und einige HSV-Strukturgene ein. Wie oben. Allerdings sind die HSV-Immediate-Early-Gene die HSV-Gene, die im erfindungsgemäßen HSV bevorzugt unter die Kontrolle des zell- oder gewebespezifischen Promotors gestellt werden. Die HSV-Immediate-Early-Gene ICP4 und ICP27 sind bevorzugt, weil sie transkriptionsregulatorische Gene sind. So muss beispielsweise ICP4 vor den anderen für die HSV-Replikation essentiellen Genen angeschaltet werden. Obwohl die HSV-Gene, die für die DNA-Replikation notwendig sind (z. B. VL9, VL5, VL42, DNA pol und ICP8), essentiell für die Virusreplikation sind, kann sich das Stellen unter die Kontrolle eines zell- oder gewebespezifischen Promotors als nicht-spezifisch für einen bestimmten Promotor oder einen bestimmten Zelltyp erweisen.
  • Erfindungsgemäße Viren sind sokonstruiert, dass sie auch weitere Änderungen in der Exprimierung von einem oder mehreren spezifischen HSV-1-Genen umfassen. Spezifische HSV-1-Gene, die zusätzlich geändert sein können, sind: (1) das γ34.5-Gen und (2) das Ribonukleotidreduktase-Gen. Änderungen in dieser Hinsicht umfassen jede beliebige Änderung, die die Exprimierung des Produkts des γ34.5-Gens als auch des Ribonukleotidreduktase-Gens unterbricht. Das Vorhandensein derartiger mehrfacher Mutationen reduziert die Möglichkeit der Rückumwandlung zur Wildtyp-Pathogenizität noch weiter.
  • Das Erzielen von Gewebe- oder Zell- oder Tumorspezifität
  • Weil das Herpes-simplex-Virus einen sehr weiten Wirtsbereich hat und fähig zu sein scheint, die meisten Zelltypen zu infizieren, können mutierte Herpes-simplex-Viren der vorliegenden Erfindung auf spezifische Tumortypen unter Verwendung Tumorzell-spezifischer Promotoren ausgerichtet werden. Der Ausdruck „Tumorzell-spezifischer Promotor" oder „Tumorzell-spezifische transkriptionale regulatorische Sequenz" oder „tumorspezifischer Promotor" oder „tumorspezifische transkriptionale regulatorische Sequenz" bedeutet eine(n) transkriptionale regulatorische Sequenz, -Promotor und/oder -Enhancer, die/der selektiv oder in einem höheren Ausmaß in der Zieltumorzelle als in einer normalen Zelle induziert wird. Tumorspezifische Promotoren schließen Promotoren ein, die selektiv oder in einem höheren Ausmaß in einem bestimmten Zelltyp oder einer bestimmten Tumorzelle induziert werden. Tumorzell-spezifische TRS sind in der Tabelle 2 aufgeführt. Der Ausdruck „gewebespezifischer Promotor" oder „zellspezifischer Promotor" oder „gewebespezifische transkriptionale regulatorische Sequenz" bedeutet eine transkriptionale regulatorische Sequenz, die selektiv oder in einem höheren Ausmaß in der Zielzelle oder im Zielgewebetyp induziert wird.
  • Die erfindungsgemäßen Vektoren können auch so entworfen werden, dass sie selektiv in einer Tumorzelle, die von einem anderen als einem Nervengewebe abstammt, replizieren und diese töten. Der Herpes-simplex-Virusvektor der Erfindung ist gentechnisch so verändert, dass zumindest ein virales Protein, das zur Virenreplikation notwendig ist, unter die Kontrolle eines zellspezifischen oder tumorspezifischen Promotors gestellt wird. Der tumorspezifische Promotor wird selektiv oder in höherem Ausmaß in 'Tumorzellen als in normalen Zellen induziert.
  • Derartige tumorspezifische HSV-1-Mutanten verwenden Promotoren aus Genen, die in dem Zieltumor stark exprimiert werden, wie der Epidermales-Wachstumsfaktor-Rezeptorgen-Promotor (EGFr) oder der basic-Fibroblasten-Wachstumsfaktor-(bFGF)-Gen-Promotor oder der NESTIN- oder andere Tumor-assoziierte Promotoren oder Enhancer-Elemente, um die Exprimierung eines essentiellen Herpes-simplex-Virus-Gens (z. B. ICP4) unter Umständen anzutreiben, in denen das essentielle Wildtyp-Herpes-simplex-Virus-Gen nicht exprimiert werden würde. Das Herstellen der Nicht-Funktionalität des essentiellen Herpes-simplex-Virus-Gens kann durch genetische Inaktivierung oder Austausch der transkriptionalen regulatorischen Sequenz durch eine tumorspezifische transkriptionale regulatorische Sequenz erzielt werden.
  • Die vorliegende Erfindung beschreibt ebenfalls einen Wirtsbereich-bedingten mutierten Herpes-simplex-Virus, in dem ein essentielles Virengenprodukt unter der Kontrolle eines tumorspezifischen Promotors anstelle des eigenen Virenpromotors steht. Das essentielle Virengenprodukt wird in permissiven Zellen, die die korrekten Regulationsproteine für diesen spezifischen Promotor enthalten, exprimiert, und das Virus kann sich replizieren und auf anliegende Zellen verbreiten, bis eine nicht-permissive Zelle infiziert wird. Auf diese Studien kann das erfindungsgemäße replikationskompetente Herpes-simplex-Virus angewendet werden. Allerdings sind diese Konstrukte nur in den richtigen Zelltypen replikationskompetent (d. h. Tumorzellen oder Zielzelltypen), in anderen Zellen (d. h. dem umliegenden Gewebe) sind sie replikationsdefizient.
  • Viele Tumorzelltypen exprimieren phänotypische Markierungsmoleküle, die in der normalen ausdifferenzierten Zelle abgeschaltet sind. Dieses geänderte Expressionsmuster kann genutzt werden, um Tumorzell-spezifische Viren zu konstruieren. Beispiele derartiger in Abhängigkeit vom Differenzierungszustand regulierter Gene in Nerven tumoren schließen ein: (i) Nestin, ein intermediäres Filamentprotein, das normalerweise in neuroepithelialen Stammzellen exprimiert wird, aber nicht in reifen ZNS-Zellen, und das ubiquitär in menschlichen Gehirntumoren, hauptsächlich in Gliomen, exprimiert wird, (ii) basic-Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), einem Differentiationsfaktor und Mitogen für das Neuroektoderm, der in menschlichen Gliomen und Meningiomen stark, nicht jedoch in metastatischen Gehirntumoren oder normalem Gehirngewebe exprimiert wird, und (iii) der epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGEFr), eine Membran-gebundener Tyrosin-spezifische Proteinkinase, die durch EGF angeregt wird und die sehr oft in hochgradigem menschlichem Gliom, aber nur selten im normalen Gehirn überexprimiert, verändert und genamplifiziert ist. Ein Beispiel für ein in Abhängigkeit vom Differentiationszustand reguliertes Gen, das in Lungen-, Brust-, oropharyngealen, Blasen-endometrialen, ovarialen und colorektalen Karzinomen exprimiert wird, ist der sekretorische Leukoproteaseinhibitor (SLPI). Tabelle 1 gibt eine Liste von Beispielen für gewebespezifische Promotoren, die in dem erfindungsgemäßen Vektor verwendet werden können, wider, während Tabelle 2 eine Liste von Beispielen für tumorspezifische Promotoren angibt.
  • TABELLE 1 Gewebespezifische Promotoren
    Figure 00160001
  • Figure 00170001
  • Figure 00180001
  • Abkürzungen: br, Gehirn; B, Lymphozyten; mu, Skelettmuskel; he, Herzmuskel; te, Hoden; beta, beta-Zellen; th, Thymus; lu, Lunge; Pa, exokriner Pankreas; ys, Dottersack; li, Leber; ery, erythroide Zellen; pit, Hirnanhangsdrüse und lens, Sehlinse.
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  • TABELLE 2 Tumorspezifische transkriptionsregulatorische Sequenzen
    Figure 00200001
  • Figure 00210001
  • Ein spezifisches essentielles HSV-Gen, das unter die Kontrolle der gewebespezifischen transkriptionalen regulatorischen Sequenz gestellt wird, ist das ICP4-Gen, das auch unter dem Namen Vmw175 oder IE-3 oder IE175-Gen oder α4 bekannt ist. ICP4 kodiert ein 175 kD Protein, welches der Haupttransaktivator der HSV-Transkription ist und essentiell für das lytische Wachstum des Virus ist. Mutanten, denen ICP4 fehlt, können keine early oder late virale Polypeptide synthetisieren. Preston, C. M. (1979) J. Virol. 29: 275–284. DeLuca, N. A. et al. (1985) wie oben.
  • Ein mögliches HSV-Rückgrat (backbone), das für den rekombinanten Vektor der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, ist G92A, welches aus d120 stammte, einer von HSV-1 KOS abgeleiteten Deletionsmutante des ICP4-Gens. d120 kann nur auf ICP4 komplementierenden Zelllinien, wie z. B. E5, wachsen. DeLuca, N. A. et al. (1985) J. Virol. 56: 558–570.
  • Um auf Rückmutanten (revertants) zu kontrollieren, werden Virenstammlösungen aus der anfänglichen Isolierung der Rekombinanten auf der Zielzelle hergestellt. Es gäbe keine Möglichkeit der Reversion der ICP4-Deletion, wenn der Vektor auf den Zielzellen wächst. Reversionen kommen jedoch, mit geringer Häufigkeit, in den E5-Zellen vor, weil E5-Zellen ein integriertes ICP4-Gen enthalten. Diese Strategie wird für verschiedene Zielzellen verwendet, sobald festgestellt worden ist, dass der Promotor die ICP4-Expression in einer zellspezifischen Weise steuert und die Rekombinante isoliert worden ist. Dies könnte gemacht werden, indem man die Rekombinanten auf den E5-Zellen zuerst isoliert und dann auf Spezifität prüft.
  • Nicht alle Vektoren müssen non-neurovirulent sein, weil es bei der Abzielung auf bestimmte Tumortypen unwahrscheinlich ist, dass das Virus in das ZNS gelangt. Allerdings können die Vektoren der vorliegenden Erfindung auch die Sicherheitsmerkmale enthalten, die in der US 08/264,581 offenbart sind. Die Unfähigkeit des rekombinanten HSV, sich zum Wildtyp zurück zu wandeln, ist ein wichtiges Merkmal der vorliegenden Erfindung. Andere Gene, die die Virulenz des Virus oder die Fähigkeit, der Wirtsimmunantwort zu entgehen, betreffen, können deletiert werden. Zur Zellablation wird der Vektor so kontruiert, dass er zur Replikation in nicht-teilenden Zellen fähig ist.
  • Die Wirkungen eines jeden Konstrukts, in dem eine tumor- oder gewebespezifische transkriptionsregulatorische Sequenz ein essentielles HSV-Gen kontrolliert, wird sowohl in spezifischen Säugetierzielzellen als auch in Kontrollzellen, die unfähig sind, die bestimmte TRS zu bewirken, beurteilt.
  • Die Konstruktion von HSV-1-Vektoren wird beispielsweise in US-Patent Nr. 5,288,641; Roizman und Jenkins, J. Science 229: 1208 (1985); Johnson et al., J. Virol. 66: 2952 (1992); Gage et al., J. Virol. 66: 5509 (1992); Spaete und Frenkel, Cell 30: 295 (1982); Goldstein und Weiler, J. Virol. 62: 196 (1988); Coen, Kapitel 7, Virology, Raven Press, 1990; Breakefield und DeLuca, The New Biologist, 3: 203 (1991); Leib und Olivo, BioEssays 15: 547 (1993); Glorioso et al., Seminars in Virology 3: 265 (1992); Chou und Roizman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 3266 (1992); Breakfield et al., Molec. Neurobiol. 1: 339 (1987); Shih et al., in: VACCINES 85, Cold Spring Harbor Press (1985) 177–180; Palella et al., Molec. Cell. Biol. 8: 457 (1988); Matz et al., J. Gen. Virol. 64: 2261 (1983); Mocarski et al., Cell 22: 243 (1980); und Coen et al., Science 234: 53 (1986) beschrieben.
  • Zusätzliche Verfahren für die genetische Manipulation von DNA-Sequenzen sind im Stand der Technik bekannt. Im Allgemeinen schließen diese Ausubel et al., Kapitel 16 in CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (John Wiley and Sons, Inc.); Paoletti et al., US-Patent 4,603,112 (Juli 1986), ein. Virologische Aspekte sind auch in Coen, D. M., „Molecular Genetics of Animal Viruses" in VIROLOGY 123–150 (2. Aufl.) (Raven Press, 1990) überblicksmäßig beschrieben.
  • PtkΔL-ALI4, das rekombinante Plasmid, das zur Erzeugung von G92A verwendet wurde, wurde wie folgt konstruiert. Das 0,5 kb BgIII-KpnI-Fragment aus der HSV tk-kodierenden Region in pHSV105 (enthaltend das HSV-BamHI Q-Fragment, GIBCO/BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD) wurde ersetzt durch einen BglII-BamHI-Polylinker von pSL301 (Invitrogen), um ptkΔ zu erzeugen. Das 4,3 kb Hind-III-Sal I-Fragment aus pHCL (siehe Kaplitt, M. G. et al. (1991) Molecular and Cellular Neurosciences 2: 320–330), welches das Escherichia coli lacZ-Gen und das SV40-Polyadenylierungssignal (poly A) enthält, wurde mit DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) stumpfendig gemacht und in die stumpfendig gemachte BglII-Stelle (+53 von tk) des ptkΔ subkloniert, um ptkΔL zu erzeugen. In ptkΔL wird die lacZ-Expression vom HSV-tk-Promotor, einem HSV early Promotor, angetrieben. Das 4,1 kb SalI-Mse-I-Fragment aus pGH108 (siehe Roberts, M. S. et al. (1988). J. Virol. 62: 4307–4320), das die ICP4-kodierende Sequenz, von +178 (123 bp stromaufwärts vom ATG) und die Polyadenylierungsstelle enthält, wurde durch das Klenow-Fragment aufgefüllt und in die stumpfendig gemachte BamHI-Stelle des p2335A-1 (siehe Huber, B. E. et al. (1991) wie oben), 22 Basen unterhalb der Albumin-Cap Site (siehe Pinkert, C. A. et al. (1987)) subkloniert, um pALI4 zu erzeugen. Ein 6.4 kb Fragment von pALI4 (stumpfendig gemachtes BstXI- und EcoRV-Fragment), das den Albumin-Enhancer/Promotor und ICP4-kodierende Sequenzen enthält, wurde in ptkΔL an der XbaI-Stelle (stumpfendig gemacht) in den Polylinker direkt nach der SV40-Polyadenylierungsstelle einkloniert, um ptkΔL-ALI4 zu erzeugen.
  • Southern-Blot-Hybridisierungsanalyse der G92A DNA-Struktur
  • (A) Das Vorhandensein von lacZ- und SV40-Polyadenylierungssequenzen wurde durch Hybridisierung von durch BamHI und SspI verdauten viralen DNAs mit markiertem pHCL (der lacZ- und SV40-Polyadenylierungsstellen enthält) bestätigt. G92A enthält die erwarteten 3,5- und 2,2 kb-Fragmente, die nicht in d120 vorhanden sind. (B) Das Vorhandensein der Albumin-Enhancer-/Promotorsequenz wurde durch Hybridisierung von mit EcoRI verdauten viralen DNAs mit markiertem p2335A-1 bestätigt. G92A enthält die erwarteten 2,8- und 1,8 kb-Fragmente, die nicht in d120 vorhanden sind. (C) Das Vorhandensein der korrekten ICP4-Fragmente, einschließlich des ICP4-Gens, wurde durch Hybridisierung von mit EcoRI verdauten viralen DNAs mit markierten pXhoI-C (welche das 9,5 kb XhoI-C-Fragment – siehe O'Hare, P. et al. (1985). J. Virol. 53: 751–760 – enthält), bestätigt; die ursprünglichen ICP4-Fragmente werden mit Wildtyp-HSV-KOS-DNA gesehen. Die 4,1-kb-Deletion von ICP4 in d120 und G92A ist anstelle des 4,5-kb-Fragments, das in KOS vorhanden ist, innerhalb des 1,2-kb-Fragments enthalten. Außerdem wurde das vom 4,7-kb-Plasmid (ptkΔL-ALI4) abgeleitete ICP4-Fragment nur in G92A gesehen. (D) Die lacZ, Albumin-Enhancer/Promotor und ICP4-Geninsertion in die tk-kodierende Sequenz wurde durch die Hybridisierung von mit BamHI und SspI verdauten viralen DNAs mit markierten pHSV106 (einschließlich des tk-Gens) bestätigt. Die zwei vom Plasmid ptkΔL-ALI4 abgeleiteten Fragmente (4,5 und 2,4 kb) waren in G92A vorhanden, wohingegen das ursprüngliche BamHI-Q-Fragment (3,4 kb) in d120 vorhanden war.
  • Expression von IC4-Protein in Virus-infizierten Zellen
  • E5 (ICP4-komplementierend) (siehe DeLuca, N. A. et al. (1987) wie oben) HepG2, Hep3B-(Albumin-produzierende) und MCF7-(nicht-Albumin-produzierende) Zellen, die in Lab-Tek-Kammerscheiben (NUNC, Inc., Naperville, IL) kultiviert worden waren, wurden mit Virus, 20–100 pfu/Vertiefung mit G92A1, G92A2, d120 oder hrR3 (ICP6-Deletionsmutante HSV), infiziert. Goldstein, D. J. et al. (1988) J. Virol. 62: 196–205. 48 Stunden nach der Infektion wurden die Zellen fixiert und mit anti-ICP4-monoklonalem Antikörper (Advanced Biotechnologies Inc., Columbia, MD 21046, USA) reagiert und daraufhin mit ImmunoPure® Rhodamin-konjugierten Ziege-Anti-Maus-IgG (Pierce, Rockford, IL 61105) reagiert. Die Anzahl der ICP4-positiven Cluster ist wie folgt: (hrR3-Infektion von MCF7, E5, Hep3B und HepG2) = (6, 15, 20, 9) und (d120-Infektion von MCF7, E5, Hep3B und HepG2) = (0, 88, 0, 0), (G92A1-Infektion von MCF7, E5, Hep3B und HepG2) = (0, 128, 28, 36) und (G92A2-Infektion von MCF7, E5, Hep3B und HepG2) = (0, 132, 42, 70). Wenige einzelne immunopositive Zellen wurden nach der Infektion von MCF7-Zellen mit d120 und G92A beobachtet. Obwohl das lacZ-Gen als Reporter in diesen Konstrukten benutzt worden ist, können auch andere Reporter benutzt werden (z. B. menschliche alkalische Phosphatase aus der Placenta oder andere HSV-Gene oder neoR).
  • β-Galactosidase-Expression in G92A-Plaque.
  • Die Zellen wurden mit den Konstrukten gemäß der Erfindung infiziert. Wenn Plaque unter dem Mikroskop sichtbar wurde, wurden die Zellen mit Formaldehyd/Glutaraldehyd fixiert und mit X-gal (0,5 mg/ml X-gal, 5 mM Kaliumhexacyanoferrat-2, 5 mM Kaliumhexacyanoferrat-3, 2 mM MgCl2 in mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung) gefärbt. β-Galactosidase-exprimierende Zellen erscheinen als dunkle Färbung.
  • Herpex-simplex-Virusvektor-vermittelte Zerstörung von Lebertumorzellen
  • Ein Beispiel für die vorliegende Erfindung umfasst eine Lebertumorzellen-spezifische Herpes-simplex-Virusmutante, in der ein essentielles Virus-Genprodukt unter der Kontrolle der Albumin-transkriptionsregulatorischen Sequenz anstelle seines eigenen viralen Promotors steht. Genauer gesagt kann die Mausalbumin-Enhancer/Promotor-Sequenz als die Zelltypen-spezifische Regulationsregion verwendet werden. Pinkert, C. A. et al. (1987) Genes Dev. 1: 268–276; Herbst, R. S. et al. (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86: 1553–1557. Eine Region von 8,5 bis 10,4 kb stromaufwärts des Albumin-Promotors wirkt als Enhancer. Der zusammen mit dem Albumin-Promotor (300 bp) für eine starke (High-Level) Exprimierung in der Leber von erwachsenen transgenen Mäusen und in menschlichen Lebertumorzellen nach Infektion mit rekombinantem Adenovirus oder rekombinanten Retroviren sorgt. Herbst, R. S. et al. (1990). Mol. Cell. Biol. 10: 3896–3905; Huber, B. E. et al. (1991) wie oben; Kuriyama, S. et al. (1991) wie oben; Pinkert, C. A. et al. (1987) wie oben. Albumin wird nur in der Leber exprimiert und wird auf der Ebene der Transkriptionsinitiation geregelt. Tilghman, S. M. et al. (1982). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5254–5257.
  • Um eine HSV-Mutante zu konstruieren, in der ICP4 durch eine Leber-spezifische transkriptionsregulatorische Sequenz reguliert wird, wurde ein Plasmid, ptkΔ-ALI4, erzeugt, das zwei chimäre Gene enthält (1). Die E. coli-lacZ-kodierende Sequenz und die SV40-Polyadenylierungsstelle wurden in das HSV-tk-Gen genau stromabwärts des tk-Promotors eingefügt, so dass die β-Galactosidase-Exprimierung durch den HSV-tk-Promotor reguliert wurde. Die Maus-Albumin-Enhancer/Promotor-Sequenzen wurden stromaufwärts der ICP4-kodierenden Sequenz (bei +178, ICP4-Transkription beginnt bei +301) und poly-A-Additionsstelle kloniert. Pinkert, C. A. et al. (1987) wie oben.
  • Gewebespezifische Promotoren können in das HSV-ICP4-Gen an jeder beliebigen Stelle zwischen der SalI-Stelle (+178) und der Translations-Initiierungsstelle (ATG bei 0) eingefügt werden. Es ist wahrscheinlich, dass Stellen oberhalb von +178 bis zu der Transkriptions-Initiierungsstelle bei +301 auch in einer zell-, gewebe- oder tumor spezifischen Weise funktionsfähig sind. Durch Benutzen von allgemein üblichen molekularbiologischen Verfahren wäre es möglich, einen Polylinker an der SalI-Stelle einzufügen, um die Insertion von anderen Promotoren zu vereinfachen (indem eine Reihe von möglichen Restriktionsstellen bereitgestellt wird). Die Sequenz von ICP4 mit seinem Promotor hat die Genbank-Zugangsnummer X06461 oder EMBL Locus Id HEHSV1G3.
  • PtkΔ-ALI4 wurde linearisiert (an der einzigen SalI-Stelle im Plasmidrückgrat) und mit d120-DNA in E5-Zellen cotransfiziert (Vero-Zellen stabil transformiert mit dem ICP4-Gen (von –330 bis ungefähr 400 bp stromabwärts vom 3'-Ende der mRNA)). DeLuca, N. A. et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 4491–4511. Rekombinante Virusvektoren wurden dreimal in E5-Zellen Plaque-gereinigt. Rekombinante Plaques färbten im Beisein von X-gal (wegen des lacZ-Gens) blau und wuchsen im Beisein von Ganciclovir (1 mg/ml, weil sie tk- waren).
  • Virusstammlösungen wurden dann auf HepG2-Zellen hergestellt, um die Möglichkeit der Kontaminierung der Stammlösung mit ICP4+-Revertanten, die durch Rekombination mit dem ICP4-Gen, das in den E5-Zellen vorliegt, zu minimieren. Zwei unabhängig isolierte rekombinante Stammlösungen, G92A1 und G92A2 wurden hergestellt. Die DNA-Struktur dieser Rekombinanten wurde durch Restriktions-Endonuklease-Verdauung und Southern-Blot-Analyse bestätigt, indem Proben von ICP4, lacZ, Albumin-Enhancer/Promotor und HSV-tk-Genen verwendet wurden. Die Rekombinante hatte weiterhin die ICP4-Deletionen von d120 und enthielt zusätzlich die ICP4-Insertion in dem HSV-tk-Gen.
  • Um die Gewebespezifität der gereinigten isolierten rekombinanten HSVs zu testen, wurden die Virenstammlösungen auf ihre Fähigkeit zur Replikation in verschiedenen menschlichen Zelllinien untersucht. Menschliche Hep-3B (mit integriertem Hepatitis-B-Virus (HBV)) und HBV–-HepG2- und HuH7-Lebertumorzellen exprimieren Albumin. Nakabayashi, H. et al. (1982) Cancer Res. 42: 3858–3863; Aden, D. P. et al. (1979) Nature 282: 615–616; Huber, B. E. et al. (1991), wie oben. Lebertumorzellen haben nur 5–10% der Albumin-Expression im Vergleich zu erwachsenen Hepatozyten. Clayton, D. F. et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 2633–2641. Menschliche MCF-7-Brust-Adenokarzinomzellen, SW480-Kolon-Adenokarzinomzellen und Detroit-551 diploide Fibroblastenzellen exprimieren keine nachweisbaren Mengen an Albumin. Huber, B. E. et al. (1991), wie oben.
  • Die Fähigkeit des rekombinanten Virus G92A zur Synthese von ICP4-Protein in verschiedenen Zelltypen wurde durch Immunofluoreszenz bestimmt. Die Zellen wurden mit einer Viruskonzentration von 20–100 pfu's infiziert und dann 48 Stunden später fixiert.
  • Ein Anti-ICP4-monoklonaler Antikörper wurde verwendet, um ICP4-exprimierende Zellen nachzuweisen. ICP4-Expression kann in E5-Zellen nur nach Infektion mit HSV nachgewiesen werden. Cluster von ICP4+-Zellen werden nach Infektion mit G92A1 und G92A2 nur in Albumin-exprimierenden Zellen (HepG2, Hep3B und HuH7) beobachtet, wohingegen eine Infektion mit hrR3 (ICP6-Deletionsmutante) zu ICP4+-Zellen-Cluster in allen getesteten Zelltypen führt. Die Infektion von Nicht-Lebertumorzellen mit rekombinanten Viren führte zu keiner nachweisbaren ICP4-Immunoreaktivität über der in Kontrollzellen beobachteten. Wenn die Plasmide in Zellen transfiziert wurden, war die Zahl exprimierender Zellen in Vero- und HepG2-Zellen ähnlich. Wenn Plasmide, die Albumin-Promotor-ICP4-Konstrukte enthielten, in verschiedenen Zelltypen auf transiente Expriemierung getestet wurden, wurde keine Spezifität beobachtet. Immunpositivität für ICP4 identifiziert ein Genprodukt eines Gens, das sowohl (a) durch den gewebe- oder zellspezifischen Promotor reguliert wird, als auch (b) für die Replikation des Virus essentiell ist. Wenn das HSV-Konstrukt unfähig zur Expression von ICP4 in dem bestimmten Zielzelltyp ist, wären die infizierten Zellen nicht nur immunonegativ für ICP4, sondern es sollte auch keine Plaquebildung entstehen.
  • LacZ wird in den vorliegenden Vektoren als Reporter verwendet, wenn es durch einen HSV-Early-Promotor (beispielsweise den tk-Promotor) reguliert wird, was eine Exprimierung von Immediate-Early-Genen erfordern sollte (beispielsweise ICP4) vor der Exprimierung. Andere dem Fachmann bekannte Reporter können verwendet werden. Beispiele von anderen potenziellen Reportern schließen die menschliche-Placenta-alkaline Phosphatase-Gene oder jede beliebigen anderen HSV-Early- oder -Late-Gene ein, für die es spezifische Antikörper gibt.
  • Die Plaque-Wirksamkeit der rekombinanten Viren wurde in verschiedenen Zelllinien bestimmt. Der elterliche Wildtyp-KOS-Stamm formt Plaque auf allen getesteten Zellen, wohingegen d120 nur auf E5-Zellen effektiv Plaque bildet (Tabelle 5). Wenig Plaque wurde auch auf einigen anderen Zelltypen gebildet mit einer Häufigkeit von 10–5 der Häufigkeit in E5-Zellen, was wahrscheinlich an Revertanten in der Virusstammlösung liegt. DeLuca, N. A. et al. (1985). J. Virol. 56: 558–570. G92A formte sehr effizient Plaque auf Albumin-exprimierenden Lebertumorzellen und mit stark herabgesetzter Effizienz auf nicht-exprimierenden Zellen (Tabelle 5). Zusätzlich wurden keine echten Plaques auf den nicht-exprimierenden Zellen beobachtet, sondern stattdessen Cluster von Zellen, die eine CPE zeigten oder mit X-gal färbten. Die Intensität der X-gal-Färbung war im Vergleich zu der bei Albumin-exprimierenden Zellen beobachteten stärker reduziert. Durch Normalisieren der Plaque-Effizienz auf den verschiedenen Zelltypen mit der des Wildtyp- KOS wird ein Suszeptibilitätsindex erhalten, der von 0,0018 für G92A auf SW480 bis zu 1,1 auf HepG2-Zellen oder über einen 600-fachen Unterschied an Suszeptibilität reicht.
  • Rekombinante virale Vektoren, die nur das Albumin-Enhancer/Promotor-ICP4-Transgen, nicht jedoch das lacZ-Reportergen enthalten, wurden ebenfalls durch Wachstum im Beisein von Ganciclovir isoliert. Diese Rekombinanten waren ebenfalls in der Lage, Plaque auf Hepatom-Zellen zu bilden und exprimierten ICP4-Protein, das mit Immunfluoreszenz detektiert wurde.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Konstruieren eines Virus bereit, dessen lytischer Wachstumszyklus von einem zellspezifischen Regulationselement abhängig ist. Dieses wird anhand eines Einzelschritt-Wachstumsexperiments, wie in 3 dargestellt, gezeigt, wo lytisches Wachstum von G92A auf Albumin-exprimierenden Zellen, nicht jedoch auf Kontrollzellen beobachtet wurde. G92A-Infektion von MCF7-Zellen resultierte in weniger als 1 pfu/Zelle, wohingegen bei einer Wildtyp-KOS-Virusinfektion derselben MCF7-Zellen jede Zelle in der Größenordnung von 103 pfu produzierte. Wenn G92A Hep3B-Zellen infiziert, resultiert eine Ausbeute von ungefähr 80 pfu pro Zelle, was daraufhin deutet, dass lytisches Wachstum in der Hepatom-Zelllinie nicht aber in den Kontroll-MCF7-Zellen vorkommt. Wildtyp-Virus zeigte keinen Unterschied zwischen dem lytischen Wachstum in den beiden Zelltypen. Daher kann HSV so konstruiert werden, dass er zell- oder tumorspezifisch ist.
  • Die vorliegende Erfindung zeigt, dass die Albumin-Enhancer/Promotorregion in einer zellspezifischen Weise wirkt, wenn sie innerhalb des HSV-Genom-Kontextes vorhanden ist. Einige Promotor-Elemente, werden, wenn sie in das HSV-Genom insertiert werden, durch die regulatorischen Eigenschaften der umgebenden HSV-Sequenzen beeinflusst. Roemer, K. et al. (1991) J. Virol. 65: 6900–6912; Panning, B. et al. (1989). J. Virol. 63: 1929–1937. Die zellspezifische Aktivität des Albumin-Enhancer/Promotor-Konstrukts innerhalb des HSV-Genoms deutet daraufhin, dass replikationsdefiziente HSV-Vektoren, die ein durch den Albumin-Enhancer/Promotor reguliertes Transgen enthalten, für die gezielte Gentherapie in Leberzellen, wo eine zellspezifische Genexprimierung ohne Zellzerstörung benötigt wird, nützlich sein könnten.
  • Zusätzlich können die tumor- oder gewebespezifischen rekombinanten HSV-Vektoren der vorliegenden Erfindung weiterhin andere kodierende Sequenzen einschließen, z. B. für immunmodulierende Produkte, die unter die Kontrolle von viralen Early- und Late-Promotoren gestellt werden können. Die Verfahren zum Herstellen von HSV, welches ein Fremdgenprodukt unter der Kontrolle der viralen Early- und Late-Promotoren hat, werden oben für lacZ illustriert. Wenn solche Konstrukte ein geeignetes Ziel infizieren, wird das Fremdgen nur in solchen Zellen exprimiert, in denen sich das Virus repliziert. HSV ist wegen seiner großen Größe (mit vielen nicht-essentiellen Genen) und seiner Fähigkeit, die meisten Zelltypen zu infizieren, ein besonders wichtiger Vektor für diese Zwecke. Roizman, B. et al. (1990). Fundamental Virology, S. 849–896.
  • Plaquebildungsexperimente
  • Die Zellen wurden in 12-Vertiefungsplatten präpariert und eine Virusstammlösung (wie angegeben) wurde in einem Volumen von 0,5 ml (abgesehen von KOS-infizierten Hep3B-, HepG2- und MCF7-Zellen, welche in 6-Vertiefungsplatten mit 0,7 ml infiziert wurden) verabreicht. Duplikatsvertiefungen wurden für jede Virusverdünnung vorbereitet und für jeden infizierten Zelltyp wurden zwei Verdünnungen durchgeführt. Die infizierten Zellen wurden bei 34,5°C für die folgenden Zeitspannen inkubiert; Hep3B für zwei Tage, HepG2 für 6 Tage und HuH7, Det551, SW480, MCF7 und E5 für 3. Plaque-bildende Einheiten (plaque forming units, pfu) wurden aus der durchschnittlichen Zahl der gebildeten Plaque berechnet. Rekombinante Plaque wurde mit X-gal-Färbung nachgewiesen. Echte Plaque wurde auf Albumin-Zelllinien (MCF7, SW480 und Detroit 551) nicht beobachtet, stattdessen wurden Cluster von einigen wenigen Zellen, die CPE zeigten oder mit X-gal positiv färbten, beobachtet. ND: nicht durchgeführt. S. I.: Suszeptibilitätsindex = (Verhältnis von E5)/(Verhältnis von E5 für KOS). TABELLE 3: Titer auf verschiedenen Zelltypen
    Figure 00290001
    Figure 00300001
    Titer = pfu × 103
    • S. I.
    Suszeptibilitätsindex
  • Andere gewebe-, zell- oder tumorspezifische HSV-Vektoren
  • Ein anderes Beispiel eines rekombinanten HSV-Vektors der vorliegenden Erfindung kann auf Melanomzellen abgerichtet werden. Der Tyrosinase-Promotor kann aus dem Plasmid pTyr-βgal1 (erhalten von R. Vile, St. Thomas Hospital) unter Verwendung von EcoR1 und Xho1 (EcoR1, –2540 bis XhoI, –46) ausgeschnitten werden. Das Tyrosinase-Promotor enthaltende Fragment wurde dann aufwärts von ICP4 bei SalI (wie für G92A) durch stumpfendige Ligation insertiert, und dann wurde das tyr-ICP4-Fragment in das HSV-tk-Gen (pHSV106 bei den BGlII/Acc651-Stellen) insertiert, um das Plasmid-pT14tkΔ-1 zu bilden. Dieses wurde dann durch homologe Rekombination in HSV d120 an der tk-Stelle rekombiniert, und das rekombinante Virus, rhT14, wurde auf E5-Zellen durch GCV-Resistenz oder durch die Bildung von Plaque auf RPMI7941-Zellen (menschliche maligne Melanomzellen, ATCC HTB 66) oder SK-MEL-3-Zellen (menschliche maligne Melanomzellen, ATCC HTB 69) isoliert.
  • In-vivo-Beurteilung von HSV-vermittelter Abtötung von tumor- oder gewebe- oder zellspezifischer Abtötung von Zielzellen
  • Die Auswirkung der Infektion mit rekombinantem HSV auf menschliche Tumore in vivo kann anhand athymischer Mäuse, in denen man menschliche Tumore wachsen lässt, festgestellt werden. Die Auswirkung auf Tiertumore kann anhand von Tumorzellen von syngenen Tieren bestimmt werden. Um die Wirksamkeit des HSV-Vektors G92A, der einen Albumin-Promotor/Enhancer enthält, zu testen, können beispielsweise menschliche Hämatomzellen als subkutane Fremdtransplantate (Xenografts) eingefügt werden. Nach einer Weile, ungefähr zwei bis sechs Wochen, wenn die Tumore in den Tieren wachsen, werden die Tiere in zwei Gruppen eingeteilt. Einer Gruppe werden 50 μl eines Blindextrakts (Kontrolle) intraneoplastisch injiziert, und die zweite Gruppe erhält eine identische Injektion, die jedoch den HSV-Vektor enthält. Die Tumore werden zwei Mal wöchentlich mit Schublehren gemessen. Die Wachstumsraten werden verglichen, um zu bestimmen, ob die mit dem Vektor behandelte Gruppe signifikant herabgesetzte Wachstumsraten hat. Sobald die Tumormasse eine Last für das Tier wird, werden die Tiere zur Pathologie getötet. Das Vorhandensein des HSV-Vektors (G92A) in der Tumormasse wird durch X-gal-Histochemie, durch Messen der Expression des insertierten LacZ-Gens oder mit Antikörpern gegen virale Antigene bestimmt. Andere Organe können in gleicher Weise untersucht werden. Insbesondere wird die Leber untersucht, um zu bestimmen, ob das Virus sich auf empfängliche Zelltypen (Hepatozyten) ausgebreitet hat. Die Tiere werden getötet, aber nicht fixiert, so dass die Gewebe auf die Anwesenheit von HSV untersucht werden können. Isoliertes Gewebe wird homogenisiert und auf E5-Zellen platziert, um die Zahl der Plaque-bildenden Einheiten in der Probe zu quantifizieren. Proben, die HSV enthalten, werden weiterhin auf ihr Wachstum auf Hepatomzellen und das Vorhandensein von lacZ untersucht, um anzuzeigen, ob das isolierte Virus der injizierte Vektor ist. DNA kann ebenfalls aus solchen Proben isoliert werden, und das Vorhandensein von Vektor-DNA kann durch PCR unter Verwendung von Primer für das lacZ-Gen oder die Verbindung zwischen HSV-tk und dem Albumin-Promotor-Insert verwendet werden.
  • Zur Bestimmung der Sicherheit der HSV-Vektoren der vorliegenden Erfindung und ihrer möglichen Verbreitung in vivo kann der rekombinante Vektor (G92A) in Tiere, die keinen Tumor enthalten (z. B. athymische Mäuse, Balb/c-Mäuse und Sprague-Dawley-Ratten) injiziert werden. Das Virus wird durch intravenöse Injektion, durch subkutane Injektion oder durch intraperitoneale Injektion verabreicht. Die Tiere werden zu verschiedenen Zeiten nach Verabreichung des Virus (3, 7, 11, 14 Tage; 3, 4 und 5 Wochen) getötet und ihr Gewebe wird, wie oben diskutiert, untersucht.
  • Herpes-simplex-Virusvektoren mit einzelnen Veränderungen in dem Ribonukleotid-Reduktase- oder γ34.5-Gen
  • Anfängliche Arbeiten zur Verwendung von abgeschwächten Herpes-simplex-Virusvektoren zur Anwendung in der Antitumortherapie benutzten HSV-1, das in einem Gen mutiert war, so dass der Vektor in teilenden Zellen, nicht jedoch in nicht-teilenden Zellen replizieren konnte. Zwei solcher 1-Gen-mutanten Herpes-simplex-Virusvektoren sind (1) hrR3, dem Ribonukleotid-Reduktase fehlt und der eine Escherichia-coli-lacZ-Geninsertion in dem ICP6-Gen, das die Untereinheit von RR kodiert, enthält (Mineta, T. et al., Gene Therapy 1: S78 (1994) und Mineta et al., J. Neurosurg. 80: 381 (1994)]; und (2) R3616, der Mutationen in beiden Kopien des γ34.5-Gens enthält. Markert et al., Neurosurgery 32: 597 (1993).
  • Mutanten der Ribonukleotid-Reduktase wurden in zahlreichen Verfahren hergestellt. Die hrR3-Mutante enthält eine Escherichia-coli-lacZ-Geninsertion in dem ICP6-Gen, das die große Untereinheit von Ribonukleotid-Reduktase kodiert. Andere mutierte Ribonukleotid-Reduktase-Herpex-simplex-Viren sind geeignet, erfindungsgemäße mutante virale Vektoren zu konstruieren. Goldstein und Weiler, wie oben; Goldstein und Weiler, wie oben; Preston et al., Virol. 167: 458 (1988).
  • Ribonukleotid-Reduktase (RR) ist ein Schlüsselenzym in der De-novo-Synthese von DNA-Vorläufern und katalysiert die Reduktion von Ribonukleotiden zu Desoxyribonukleotiden. HSV-1 kodiert seine eigene RR (UL39 und UL40-Gene), die aus zwei nicht-identischen Untereinheiten zusammengesetzt ist. Duita, J. Gen. Virol. 64: 513 (1983). Die große Untereinheit (140 k Molekulargewicht), bezeichnet als ICP6, ist eng assoziiert mit der kleinen Untereinheit (38 k Molekulargewicht). Herpes-simplex-Virus RR wird für effizientes Virenwachstum in nicht-teilenden Zellen, nicht jedoch in vielen teilenden Zellen benötigt. Goldstein und Weiler, J. Virol. 62: 196 (1988); Goldstein und Weiler, Virol. 166: 41 (1988); Jacobson et al., Virol. 173: 276 (1989). Beide RR-Untereinheiten sind in HSV-2 enthalten. Es ist zu beachten, dass HSV-1 ICP6 dasselbe ist wie HSV-2 ICP10. Nikas et al., Proteins 1: 376 (1986); McLaughlan und Clements EMBO J. 2: 1953 (1983); Swain und Halloway, J. Virol. 57: 802 (1986)] und dass Mutationen in der kleinen Untereinheit von RR auch zu Verlust von RR-Aktivität und Neuropathogenizität führen [Cameron et al., J. Gen. Virol. 69: 2607 (1988)]: Das Vorhandensein des lacZ-Gens in hrR3 ermöglicht die Identifizierung von virusinfizierten Tumorzellen mit β-Galactosidase-Histochemie.
  • Der zytopathische Effekt von hrR3 (0,1 pfu/Zelle) auf die U-87MG-menschliche Glioblastom-Zelllinie in vitro war signifikant; nur 0,2% der U-87MG-Zellen waren 67 Stunden nach der Infektion am Leben. Für In-vivo-Studien wurden zehn Tiere, welche U-87MG-Tumore enthielten, nach dem Zufallsprinzip geteilt und intraneoplastisch mit entweder 5 × 105 Plaque-bildenden Einheiten von hrR3 oder nur mit Medium behandelt. Die mit den Viren behandelte Gruppe zeigte eine signifikante Hemmung des Tumorwachstums (p < 0,01, einseitiger Wilcoxon-Ranktest).
  • Ein wichtiger Unterschied zwischen Ribonukleotid-Reduktase-defizienten (RR–) und anderen mutierten Herpes-simplex-Viren ist die hrR3-Hypersensitivität gegenüber Acyclovir und Ganciclovir. Weil TK–-HSV-1-Mutanten des Standes der Technik gegenüber diesen antiviralen Wirkstoffen resistent sind, könnte es schwierig sein, solche Mutanten im Falle einer systemischen Infektion oder Enzephalitis zu eliminieren. Deshalb ist im Fall einer viralen Enzephalitis hrR3 empfänglich für antivirale Therapie.
  • Auch sind Herpes-simplex-Virus-RR–-Mutanten in ihrer Fähigkeit, Infektionen hervorzurufen und virale DNA bei 39,5°C in vitro zu synthetisieren, stark eingeschränkt. Goldstein und Weller, Virology 166: 41 (1988). Deshalb sind diese Mutanten im Hinblick auf Neurovirulenz abgeschwächt und es ist daher weniger wahrscheinlich, dass sie im Falle von Fieber im infizierten Wirt propagieren. Solche Charakteristika sind für einen therapeutischen Vektor, der eine abgeschwächte Neurovirulenz haben und im Falle einer viralen Enzephalitis für antivirale Therapie empfänglich sein muss, essentiell.
  • Mutierte Herpes-simplex-Viren, denen nur das γ34.5-Gen fehlt, wie zum Beispiel R3616, sind im Hinblick auf Neurovirulenz abgeschwächt, was die mögliche Schädigung normaler Gehirnzellen reduziert. Goldman et al., J. Virol. 63: 1153 (1989); Chou et al., Science 250: 1262 (1990). Die abgeschwächte Neurovirulenz von R3616 ist assoziiert mit dem Einstellen der neuronalen Proteinsynthese, die so vermutet man, in Wildtyp-Herpes-simplex-Virusinfektionen zuerst stattfindet. Chou und Roizman, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89: 3266 (1992). Das γ34.5-Genprodukt kann mit Western-Blotting- oder ELISA-Analyse-infizierter Zellproteinen mit Antikörpern oder durch Mangel an Replikation in konfluenten Primärzellen nachgewiesen werden. Siehe Bolovan et al., J. Virol. 68: 48 (1994). Das γ34.5-Gen ist auch in HSV-2 vorhanden. McGeoch et al., J. Gen. Virol. 72: 3057 (1991). Das γ34.5-Gen wurde in vier HSV-1-Stämmen sequenziert, nämlich F, 17, MGH-10 und CVG-2. Chou und Roizman, J. Virol. 64: 1014 (1990). Die γ34.5-Gen-mutierten HSV-Vektoren behalten eine Wildtyp-übliche Empfindlichkeit gegenüber Acyclovir. Markert et al., wie oben (1993).
  • Mutanten von γ34.5 wurden von verschiedenen Forschern mit verschiedenen Techniken und in verschiedenen Stämmen, wie z. B. Mutante 1771 [McKie et al., J. Gen. Virol. 75: 733 (1994)] und 17termA [Bolovan et al., J. Virol. 68: 48 (1994)] in HSV-1-Stamm 17 konstruiert.
  • Konstruktion der Herpes-simplex-Virusvektoren
  • HSV-1 ist ein menschlicher neurotroper Virus, der zur Infektion praktisch aller Wirbeltierzellen fähig ist. Natürliche Infektionen folgen entweder einem lytischen Replikationszyklus oder erzielen Latenz, gewöhnlicherweise in peripheren Ganglien, wo die DNA unbegrenzt in einem episomalen Zustand aufrecht erhalten wird.
  • Replikationskompetente rekombinante Herpes-simplex-Virusvektoren der vorliegenden Erfindung enthalten Änderungen in der Expression mindestens eines essentiellen Herpes-simplex-Virus-Gens. Viren der vorliegenden Erfindung werden gentechnisch so verändert, dass sie zusätzliche Änderungen in der Expression von mindestens einem oder mehreren spezifischen HSV-1-Genen enthalten. Die spezifischen HSV-1-Gene, die zusätzlich geändert werden können, sind: (1) das γ34.5-Gen und (2) das Ribonukleotid-Reduktase-Gen. Änderungen in den spezifischen HSV-1-Genen machen das Produkt beider Gene non-funktional oder reduzieren die Expression so, dass der mutierte Herpes-simplex-Virusvektor die Eigenschaften der vorliegenden Erfindung aufweist. Solche Änderungen können erzielt werden, indem man (a) jede beliebige Methode zur Störung der Exprimierung des Produkts beider Gene oder (b) jedes beliebige Verfahren, welches das exprimierte γ34.5-Genprodukt und die Ribonukleotid-Reduktase non-funktional macht, verwendet.
  • Verschiedene Verfahren zur Störung der Exprimierung von Genen sind bekannt, einschließlich der Änderung dieser Gene oder ihrer Promotorsequenzen in dem HSV-1-Genom durch Insertionen, Deletionen und/oder durch Basenaustausch. Roizman und Jenkins, Science 229: 1208 (1985). Der mutierte Herpes-simplex-Virusvektor der vorliegenden Erfindung ist ein replikationskompetentes Herpes-simplex-Virus, dessen Genom in der Expression von mindestens einem essentiellen Herpes-simplex-Virus-Gen geändert worden ist. Genauer gesagt ist der mutierte Herpes-simplex-Virusvektor der vorliegenden Erfindung ein replikationskompetentes Herpes-simplex-Virus, dessen Genom in der Expression von mindestens einem essentiellen Herpes-simplex-Virus-Gen geändert worden ist, so dass das essentielle HSV-Gen durch eine gewebe- oder zellspezifische transkriptionale regulatorische Sequenz reguliert wird. Der rekombinante Herpes-simplex-Virusvektor der vorliegenden Erfindung kann weiterhin gentechnisch so verändert sein, dass er zusätzliche Änderungen in der Expression von entweder dem γ34.5-Gen oder dem Ribonukleotid-Reduktase-Gen oder beiden dieser Gene enthält.
  • Änderungen in einem essentiellen HSV-Gen schließen Modifizierungen in den transkriptionalen regulatorischen Sequenzen dieser Gene ein. McKnight et al. in CANCER CELLS 4, DNA TUMOR VIRUSES, Cold Spring Harbor (1986) 163–173; Post, L. E. et al., Cell 24: 555 (1981). Veränderungen in dem γ34.5-Gen und dem Ribonukleotid-Reduktase-Gen schließen Modifikationen sowohl der strukturellen Sequenzen als auch der regulatorischen Sequenzen dieser Gene ein. Genetische Veränderungen können durch Standardverfahren, wie z. B. Southern-Blot-Hybridisierung von mit Restriktionsendonuklease verdauter viraler DNA, Sequenzierungen mutierter Regionen der viralen DNA, das Vorhandensein von Reportergenen (für Insertionen), neue Restriktions-Endonukleasestellen, enzymatische Untersuchung auf Ribonukleotid-Reduktase-Aktivität [Huszar und Bacchetti, J. Virol. 37: 580 (1981)], Western-Blot- oder ELISA-Analyse von infizierten Zellproteinen mit Antikörpern gegen RR oder γ34.5, und/oder Mangel an Replikation in konfluenten primären Zellen für γ34.5 bestimmt werden [siehe Bolovan et al., J. Virol. 68: 48 (1994)] oder Mäusezellen für RR– [Jacobson et al., Virology 173: 276 (1989)].
  • Die folgenden genetischen Manipulationen des Herpes-simplex-Virus sind Beispiele, die die Herstellung von mutanten Herpes-simplex-Virusvektoren darstellen. Die gentechnische Veränderung der Herpes-simplex-Virusvektoren der vorliegenden Erfindung umfasst gut charakterisierte Gene, die essentiellen Immediate-Early-(IE)-ICP4-, γ34.5- und Ribonukleotid-Reduktase-Gene in einem biologisch gut charakterisierten Virus.
  • Ein Herpes-simplex-Virusvektor, der in seinen γ34.5- und Ribonukleotid-Reduktase-Genen mutiert worden ist, kann nach Mutagenese isoliert werden oder durch Rekombination zwischen dem viralen Genom und gentechnisch veränderten Sequenzen hergestellt werden. Die hohe Rekombinationsrate im Herpes-simplex-Virus und die Tatsache, dass transfizierte virale DNA infektiös ist, macht die genetische Manipulation sehr einfach. Diese genetisch veränderten, replikationskompetenten Viren können in den Sicherheits- und Wirksamkeitsversuchen, wie unten beschrieben, verwendet werden.
  • HSV-1 enthält ein doppelsträngiges, lineares DNA-Genom, das 135 Kilobasen lang ist und das von McGeoch vollständig sequenziert worden ist. McGeoch et al., J. Gen. Virol. 69: 1531 (1988). McGeoch et al., Nucleic Acids Res 14: 1727 (1986); McGeoch et al., J. Mol. Biol. 181: 1 (1985); Perry und McGeoch, J. Gen. Virol. 69: 2831 (1988). DNA-Replikation und Virionvermehrung findet im Kern der infizierten Zellen statt. Spät in der Infektionsphase wird konkatemere Viren-DNA auf Genomlängen-Moleküle abgespalten, welche in Virenpartikel gepackt werden (Virionen). Im ZNS verbreitet sich das Herpessimplex-Virus transneuronal, gefolgt von einem intraaxonalen Transport zum Kern, entweder retrograd oder anterograd, je nachdem, wo die Replikation stattfindet.
  • DNA-Konstrukte, in denen HSV-2 verwendet wird, die auf jenen basieren, die hierin dargestellt sind, wobei das HSV-1-Genom verwendet wird, sind von der vorliegenden Erfindung umfasst. HSV-2 enthält beide RR-Untereinheiten; HSV-1-ICP6 ist analog zu HSV-2-ICP10. Nikas et al., Proteins 1: 376 (1986); McLaughlan und Clements, EMBO J. 2: 1953 (1983); Swain und Halloway, J. Virol. 57: 802 (1986). γ34.5 ist ebenfalls in HSV-2 vorhanden. McGeoch et al., J. Gen. Virol. 72: 3057 (1991).
  • Beeinflussung der Gen-Exprimierung über Modifizierung von γ34.5- oder Ribonukleotid-Reduktase-Regulationssequenzen
  • Ein anderer Weg zur Erzeugung von Herpes-simplex-Viren, die unfähig zur Exprimierung funktionaler γ34.5-Genprodukte und Ribonukleotid-Reduktase sind, ist es, deren Exprimierung zu beeinflussen. Die Exprimierung dieser zwei Gene kann durch Änderung der regulatorischen Sequenzen der γ34.5- und Ribonukleotid-Reduktase-Gene eingestellt werden.
  • Die regulatorischen Regionen für γ34.5 und/oder Ribonukleotid-Reduktase können durch Standardverfahren der Exprimieurngsunterbrechung des γ34.5- und Ribonukleotid-Reduktase-Gens geändert werden. Beispielsweise können die regulatorischen Sequenzen innerhalb des Virengenoms durch wie oben beschriebene Techniken zur Änderung von kodierenden Sequenzen geändert werden.
  • Die Promotorregion von γ34.5 und Ribonukleotid-Reduktase ICP6 wurden entschlüsselt. Der Promotor für γ34.5 wurde in einer Region innerhalb der „a"-Sequenz lokalisiert. Die „a"-Sequenz enthält ebenfalls Sequenzen zum Schneiden von Einheitslängen-DNA aus HSV-1-Konkatameren, Verpacken von HSV-1-DNA in Kapsiden und Inversion von L- und S-Komponenten. Chou und Roizman, J. Virol. 57: 629 (1986). Die Promotorregion von ICP6 wurde in den 5'-Stromaufwärts-Sequenzen des ICP6-Strukturgens lokalisiert. Goldstein und Weller, J. Virol. 62: 196 (1988); Sze und Herman, Virus Res. 26: 141 (1992). Die Transkriptionsstartstelle für die kleine Untereinheit von RR, nämlich UL40, ist innerhalb der kodierenden Region von ICP6. McLauchlan und Clements, J. Gen. Virol. 64: 997 (1983); McGeoch et al., J. Gen. Virol. 69: 1531 (1988).
  • Die Auswirkung dieser Veränderungen auf die Regulationskapazität von γ34.5- und RR-Genen kann durch Insertion von Reportergenen stromabwärts des Promotors, wie für die ICP6/lacZ-Fusion beschrieben, nachgewiesen werden. Goldstein und Weller, J. Virol. 62: 196 (1988); Sze und Herman, Virus Res. 26: 141 (1992). Weil die Herpes-simplex-Viren-Gene unterschiedlich reguliert werden, wenn sie sich in einem zellulären Genom befinden, könnten die Effekte jeder Veränderung in HSV-essentiellen Genen, einschließlich ICP4, ICP27, γ34.5 oder der Ribonukleotid-Reduktase-regulatorischen Komponente in verschiedenen Säugetier-Zielzellen bestimmt werden. McKnight et al., in CANCER CELLS 4; DNA TUMOR VIRUSES, Cold Spring Harbor (1986) 163–173.
  • Erzielen von Überempfindlichkeit gegenüber antiviralen Wirkstoffen
  • Eine Vorsichtsmaßnahme in der therapeutischen Verwendung von Herpes-simplex-Viren gegen Gliome bezieht ein, ein Mittel bereitzustellen, das jegliche potenzielle Infektion von anderen teilenden Zellen stoppt. Klinische Studien zeigen, dass sogar Wildtyp-HSV-1- Viren im Allgemeinen sich nicht weit von der Stelle der anfänglichen Infektion ausbreiten oder ernsthafte systemische Krankheiten in immunkompetenten Individuen hervorrufen. Sacks et al., Ann. Int'l Med. 111: 893 (1989).
  • Es wird festgestellt, dass TK–-Viren manchmal mit progressiven Krankheiten in bestimmten immunbeschränkten Patienten in Verbindung gebracht worden sind, und dass die HSV-1-Mutante dlsptk resistent gegenüber Acyclovir ist. Erlich et al., New Engl. J. Med. 320: 293 (1989); Coen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86: 4736 (1989). Jeder mutante replikationskompetente virale Vektor, der empfindlicher gegenüber einem antiviralen Wirkstoff als sein Wildtyp ist, wird als überempfindlich gegenüber dem antiviralen Wirkstoff angesehen, was potenziell ein Mittel zum Abbruch eines unerwünschten Verbreitens der Virusmutante darstellt.
  • Wenn mutierte Herpes-simplex-Viren für In-vivo-Zwecke konstruiert werden, werden die Mutanten auf ihre Empfindlichkeit gegenüber geläufigen Anti-Herpes-Medikamententherapien getestet, um unvorhergesehene Virusinfektionen zu kontrollieren. Eine Anzahl von Medikamenten ist zurzeit zur Behandlung von Herpesinfektionen beim Menschen erhältlich; die effizientesten sind Nukleosid-Analoga, die die Herpes-simplex-Virus-DNA-Replikation blockieren. Drei Herpes-simplex-Virus-Gene sind bekannt, die mit der Sensitivität gegen Nukleosid-Analoga zu tun haben: Herpes-simplex-Virus-DNA-Polymerase (UL30, pol), Herpes-simplex-Virus-Thymidin-Kinase (UL23, tk), und CMV UL97, das eine Homologie mit Proteinkinasen und bakteriellen Phosphotransferasen teilt. Furman et al., J. Virol. 32: 77 (1979); Littler et al., Nature 358: 160 (1992); Sullivan et al., Nature 358: 162 (1992).
  • Es gibt eine Vielzahl von Herpes-simplex-Virus-DNA-Polymerase-Mutanten, die eine Überempfindlichkeit gegenüber Gancylcovir, einschließlich PAAr5 und Arar9 zeigen. Coen et al., J. Virol. 53: 477 (1985). Leider führten intrakraniale Injektionen von AraAr9 zum vorzeitigen Tod und hatten keine Auswirkung auf subkutanes Tumorwachstum. Markert et al., wie oben. Eine andere Herpes-simplex-Virus-Mutante, das dlsptk-Virus, ist nicht mehr medikamentenempfindlich, zumindest nicht empfindlich gegenüber Nukleosidanalogen Medikamenten, und deshalb potenziell in vivo unkontrollierbar.
  • Abschwächung der Neurovirulenz
  • Abgeschwächte oder verringerte allgemeine Neurovirulenz bedeutet, dass eine lebensbedrohliche Enzephalitis nach Infektion mit dem doppelt mutierten Herpes-simplex-Virus der vorliegenden Erfindung nicht stattfindet. Weil durch Herpes-simplex-Virus hervorgerufene Encephalitis beim Menschen sehr schwer zu behandeln ist und auch tödlich sein kann, selbst wenn entsprechende pharmakologische Maßnahmen getroffen werden, ist eine herabgesetzte allgemeine Neurovirulenz ein wichtiges Merkmal der vorliegenden Erfindung. HSV-Konstrukte der Erfindung, die tk– sind, brauchen nicht überempfindlich gegenüber GCV zu sein, weil sie GCV-resistent sind. Allerdings könnte ein Fachmann im Hinblick auf diese Beschreibung das Insert, das den gewebe- oder zellspezifischen Promotor, der an das essentielle HSV-Gen gekoppelt ist, enthält, an einer anderen Stelle als das tk-Gen in dem Genom platzieren. Ein derartiger Vektor wäre GCV-überempfindlich, wie z. B. G207.
  • Für Zellablationsstudien, in denen die Replikation der rekombinanten HSV in nicht-teilenden Zellen erwünscht ist, ist es wahrscheinlich, dass tk– oder rr– nicht funktionieren würden, weil sie in Bezug auf das Wachstum in nicht-teilenden Zellen abgeschwächt sind. Für eine derartige Ablation in dem ZNS kann eine abgeschwächte Neurovirulenz auch ein Problem darstellen, weil der Vektor sich in den Zielzellen nicht replizieren könnte.
  • Das Risiko, dass ein Neuron-spezifischer HSV-Vektor zur zellspezifischen Ablation sich auf normale Gehirnzellen oder andere unerwünschte Zellen im Gehirn verbreitet, kann, um auf die gewünschte Abschwächung der Neurovirulenz zurückzukommen, dadurch verringert werden, dass ein HSV konstruiert wird, in dem ein zweites essentielles Gen zerstört worden ist, z. B. eine Deletion in einem Early-Gen oder Late-Gen. Alternativ könnte das neurovirulente Gen zerstört oder unter die Kontrolle eines zweiten zellspezifischen Promotors gestellt werden. Zum Beispiel könnten tk, rr oder γ34.5 unter die Kontrolle eines Neuron-spezifischen Promotors gestellt werden (beispielsweise Synapsen [Phiel, G. et al., PNAS USA 88: 3431 (1991)], leichtes Neurofilament) und ICP4 könnte unter die Kontrolle eines zweiten Promotors gestellt werden, der für das Subset der Zielneuronen spezifisch ist (beispielsweise Tyrosinhydroxylase (TH) für catecholaminerge Zellen, Dopamin-β-Hydroxylase (DBH) für noradrenerge und adrenerge Neuronen oder Purkinje-Zellen-Protein-2 (PCP-2) für Purkinje-Zellen). Deshalb würde der erfindungsgemäße Vektor in anderen Zellen als solchen, die den zweiten zellspezifischen Promotor exprimieren, eine abgeschwächte Neurovirulenz haben.
  • Verschiedene Herpes-simplex-Virenstämme variieren in der Neurovirulenz und stärker abgeschwächte Stämme können zur Konstruktion der Doppelmutante verwendet werden, um die Neurovirulenz weiter zu senken. Andere HSV-1-Stämme, die von ATCC erhältlich sind, schließen HF (ATCC VR.260), MacIntyre (ATCC VR-539), MP (ATCC VR-735) und die HSV-2-Stämme G (ATCC Vr-734) und MS (ATCC VR-540) ein.
  • Alternativ kann jede beliebige Herpes-simplex-Virus-Genmutation, die zu einer herabgesenkten Virenreplikation in vivo und/oder in spezifischen Zellpopulationen führt, in dem mutierten Herpes-simplex-Virusvektor der Erfindung verwendet werden. Andere Neurovirulenz-Gene schließen ein: (i) dUTPase [Pyles et al., J. Virol. 66: 6706, (1992)], (ii) UL53 [Moyal et al., Virus Res. 26: 99 (1992)], (iii) α22 [Sears et al., J. Virol. 55: 338 (1985)] und (iv) US3 [Meignier et al., Virology 162: 251 (1988)].
  • Von einem klinischen Standpunkt aus betrachtet ist Herpes-simplex-Virus-Enzephalitis die üblicherweise am häufigsten berichtete Vireninfektion des zentralen Nervensystems (ZNS) in den Vereinigten Staaten, mit einem geschätzten Vorkommen von 2,3 Fällen pro Million Bevölkerung. Herpes-simplex-Virus-Enzephalitis tritt üblicherweise im temporalen Lobus und im limbischen System auf, und eine histologische Untersuchung von Autopsiefällen zeigte eine Präsenz von viralen Antigenen an diesen Stellen. Eine Anzahl von Medikamenten steht zur Infektionskontrolle zur Verfügung, einschließlich Acyclovir (9–92-Hydroxyethoxy-methyl)guanin, Zovirax®, Adeninarabinosid (Vidarabine®), Foscarnet (Phosphonoameisensäure, PFA) und Ganciclovir 9(1,3-Dehydroxy-2-propoxy)methylguanin, DHPG, 2'NDG, Cytovene®. Siehe Whitley et al., in Lopez et al., (Hrsg.) IMMUNOBIOLOGY AND PROPHYLAXIS OF HUMAN HERPES VIRUS INFECTIONS, Seite 243 (1990, Plenum Press, N. Y.); Whitley et al., N. Engl. J. Med. 297: 289 (1977); Oberg, Pharmacol. Ther. 19: 387 (1983); DeArmond, Transplant. Proc. 23: 171 (1991).
  • Für die Xenogenisierung wirksame Herpes-simplex-Virusvektoren
  • In der vorliegenden Erfindung wird der replikationskompetenten Herpes-simples-Virusvektor, der eine herabgesetzte Neurovirulenz hat, als ein Tumorzellmodulator oder Induzierer einer Immunantwort gegen die Tumorzellen verwendet. Der mutante Herpes-simplex-Virusvektor der Erfindung kann weiterhin so geändert werden, dass er Zytokine in der Tumorzielzelle exprimiert, um eine Immunantwort gegen die Tumorzellen auszulösen. Beispielsweise kann der mutierte Herpes-simplex-Virusvektor ein durch das Virus vermitteltes Abtöten von Tumorzellen induzieren, das dann durch eine Zytokin-verstärkte Immunantwort amplifiziert wird, wobei das Zytokin durch den Vektor selbst exprimiert worden ist. Die Exprimierung von Zytokinen oder anderen Genprodukten durch den mutierten Herpes-simplex-Virusvektor würde innerhalb von Stunden nach der Infektion auftreten, so dass genügend Genprodukte vor dem Abtöten der Zellen synthetisiert würden. Das Abtöten von Zellen könnte sogar die Wirksamkeit der Antitumor-Immunantwort erhöhen. Barba et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 91: 4348 (1994).
  • Durch Herpes-simplex-Virusvektor vermittelte Zerstörung von Nervengewebetumorzellen
  • Beispielhafte Kandidaten für eine Behandlung gemäß der vorliegenden Erfindung schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf (i) Behandlung von Menschen und anderen Tieren, die an Tumoren und Neoplasmen leiden, (ii) Nervensystemtumore und (iii) bösartige Gehirntumore einschließlich Astrocytom, Oligodendrogliom, Meningiom, Neurofibrom, Glioblastom, Ependymom, Schwannom, Neurofibrosarcom und Medulloblastom.
  • Vorzugsweise wird die Behandlung mit direkter intraneoplastischer Impfung begonnen. Bei Tumoren im Gehirn wird MRI, CT oder eine andere bildgeleitete stereotaktische Methode zur direkten Virenimpfung angewendet oder der Virus wird durch Craniotomie eingeimpft.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung würden vorteilhafterweise in der Form injizierbarer Zusammensetzungen verabreicht. Eine typische Zusammensetzung für diesen Zweck würde einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfassen. Beispielsweise könnte die Zusammensetzung menschliches Serumalbumin in einem Phosphatpuffer, der NaCl enthält, umfassen. Andere pharmazeutisch verträgliche Trägerstoffe schließen wässrige Lösungen, nicht-toxische Arzneistoffträger, einschließlich Salzen, Konservierungsstoffen, Puffern und ähnliches, ein. Siehe REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (15. Ausgabe) 1405–1412 & 1461–1487, Mack Publishing Co. (1975), und THE NATIONAL FORMULARY XIV (14. Ausgabe), American Pharmaceutical Association (1975). Beispiele für nicht-wässrige Lösungsmittel sind Propylenglycol, Polyethylenglycol, Pflanzenöl und injizierbare organische Ester wie z. B. Ethyloleat. Wässrige Trägerstoffe schließen Wasser, wässrige Lösungen, Kochsalzlösungen, parenterale Träger, wie z. B. Natriumchlorid, Ringer's Dextrose, usw. ein. Intravenöse Träger schließen Flüssigkeits- und Nahrungsauffüllmittel ein. Der pH und die exakte Konzentration der verschiedenen Komponenten der pharmazeutischen Zusammensetzung werden gemäß den Routinefähigkeiten des Fachmanns angepasst. Goodman und Gilman, THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICS (7. Auflage).
  • Typischerweise würde der Herpes-simplex-Virusvektor als Injektion zubereitet werden, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen; feste Formen, die zur Auflösung oder Suspension in einer Flüssigkeit kurz vor der Injektion geeignet sind, können ebenfalls hergestellt werden. Die Zubereitungen können auch emulgiert werden. Der aktive immunogene Bestandteil wird oft mit einem Arzneiträgerstoff gemischt, welcher pharmazeutisch verträglich und kompatibel mit dem aktiven Bestandteil ist. Geeignete Arzneimittelträgerstoffe sind z. B. Wasser, Kochsalzlösung, Dextrose, Glycerin, Ethanol, usw. sowie Kombinationen davon. Wenn gewünscht, kann der Vektor zusätzlich geringere Mengen von Hilfssubstanzen, wie z. B. Benetzungsmittel oder Emulgatoren, pH-Puffer, Hilfsstoffe oder Immunopotentatoren, welche die Wirksamkeit des Vektor-Vakzins erhöhen, umfassen.
  • Weitere Formulierungen, die für andere Verabreichungsarten geeignet sind, schließen orale Formulierungen ein. Orale Formulierungen enthalten typischerweise Arzneimittelträgerstoffe, wie z. B. Mannitol, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Zellulose, Magnesiumcarbonat, usw. in pharmazeutischem Reinheitsgrad. Diese Zusammensetzungen kommen in der Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Formulierungen mit verzögerter Freisetzung oder Pulvern vor und enthalten 10 bis 95% des aktiven Wirkstoffs, vorzugsweise 25 bis 70%.
  • Der Begriff „Dosierungseinheit" bezieht sich auf physikalisch diskrete Einheiten, die für die Anwendung beim Menschen geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge eines aktiven Materials enthält, die berechnet wurde, um den erwünschten therapeutischen Effekt in Zusammenhang mit dem benötigten Verdünnungsmittel, d. h. dem Trägerstoff oder dem Träger, und einer bestimmten Verabreichungsmethode zu erzielen. Die Menge, die verabreicht wird, sowohl in Bezug auf die Zahl der Behandlungen als auch auf die Menge der Behandlungen, hängt von dem Subjekt, das behandelt werden soll, der Fähigkeit des Immunsystems dieses Subjekts zur Herstellung von Antikörpern und dem Ausmaß an Schutz, der gewünscht wird, ab. Präzise Mengen aktiver Bestandteile, die zur Verabreichung benötigt werden, hängen von dem Urteil des Arztes ab und sind unterschiedlich für jedes Individuum. Geeignete Dosierungen sind in der Größenordnung von einigen hundert Mikrogramm des aktiven Bestandteils pro Individuum. Geeignete Programme zur anfänglichen Verabreichung und für Wiederholungsverabreichungen variieren ebenfalls, sind aber typischerweise durch eine anfängliche Verabreichung, auf die in Ein- oder Zwei-Wochen-Intervallen eine oder mehrere nachfolgende Injektionen oder andere Verabreichungen folgen, gekennzeichnet.
  • Tierstudien der Transfektion in vivo
  • Die Dosierungsmengen der pharmazeutischen Zusammensetzungen, die gemäß dieser Erfindung verabreicht werden, können einfach bestimmt werden. Im Allgemeinen sollten die Zubereitungen dieser Erfindung in Dosiereinheiten verabreicht werden, die zwischen 107 und 1010 pfu/ml des HSV-Vektors in einem pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoff pro Dosiereinheit (vorzugsweise ungefähr 105 bis 5 × 109 pfu/ml) des replikations kompetenten Herpes-simplex-Virus, das einen gewebespezifischen Promotor enthält, der operativ an ein essentielles Herpes-simplex-Virus-Gen gekoppelt ist. Die gewünschten pfu sind in einem Gesamtvolumen von zwischen 0,3 und 2,0 ml einer Phosphat-gepufferten Kochsalzlösung (PBS) enthalten und werden durch eine Vielzahl von Techniken verabreicht.
  • Der HSV-Vektor kann durch intratumorale, intravenöse, intraperitoneale, intramuskuläre, intratracheale, intravesikuläre, intraintestinale, intrarektale, intraorale, intraokulare oder intraarterielle Injektionen in die Tiere eingeführt werden. Zur Einführung in die Blase kann der Vektor durch intravesikuläre Infusion in die Blase eingeimpft werden. Zur Einführung in das Rektum kann der Vektor unter Verwendung eines lokalen Klistiers eingeimpft werden. Zur Einführung in die Lunge kann der Vektor durch Einimpfung mit einem Röhrchen, durch Infusion, Inhalation in die Trachea oder durch Injektion in die Trachea eingeführt werden.
  • BEISPIEL 1: KONSTRUKTION VON STARK ABGESCHWÄCHTEN DOPPEL-HSV-MUTANTEN
  • Viren und Zelllinien
  • HSV-1-Wildtyp-Stamm (KOS oder Stamm F) und HSV-Mutanten (R3616, hrR3) wurden freundlicherweise von D. M. Coen, B. Roizman, J. Chou und S. K. Weller bereitgestellt. HSV-1-Stamm F ist erhältlich als ATCC VR-733; Vero-Zellen sind erhältlich als ATCC CRL 1587. R3616, das vom HSV-1-Stamm F abstammt, enthält eine 1-Kilobasen-Paar-Deletion in beiden Kopien des γ34.5-Gens. R3616 wurde konstruiert wie durch Chou et al., Science 250: 1262 (1990) beschrieben.
  • Stammlösungen von Viren wurden in Nierenzell-(Vero)-Kulturen afrikanischer grüner Affen wie beschrieben generiert. Virusstammlösungen wurden hergestellt wie von Coen et al., J. Virol. 53: 477 (1985) beschrieben. Die menschlichen Glioblastomzellen U-87MG, T98G, U-138MG und A172 wurden von der American Type Culture Collection (Rockville, MD) erhalten und in Dulbecco's Minimal Essential Medium (DMEM) kultiviert, dem 10% inaktiviertes fötales Kälberserum (IFCS) und Antibiotika zugegeben wurden.
  • Viren-DNA wird von infizierten Zellen, die mit NP40 sanft lysiert, mit RNase, SDS und Proteinase K behandelt und anschießend mit Phenol, Chloroform/Isoamylalkohol und Ether extrahiert wurden, isoliert. Die Viren-DNA ist nach der Niederschlagsbildung mit Ethanol und Resuspension zur Transfektion in Wasser geeignet. Für die Erzeugung rekombinanter Viren wird das Stück der DNA, das in das Viren-Genom rekombiniert werden soll, aus einem Plasmid ausgeschnitten. Die lineare DNA wird mit viraler DNA in Zellen cotransfiziert, die fähig sind, die Propagierung der rekombinanten Viren-Nachkommen zu unterstützen. Wenn extensive zytopathische Effekte beobachtet werden, werden die Nachkommen-Viren geerntet. Die rekombinanten Viren werden dann auf permissive Zellen unter selektierbaren oder screenbaren Bedingungen gegeben. Beispielsweise wird rekombinante LacZ+-Plaque durch Zugabe von X-gal gefärbt und die blaue Plaque (LacZ+) wird ausgewählt. Weitere Plaque-Reinigung (drei Mal) wird zur Herstellung einer Stammlösung durchgeführt.
  • Konstruktion von Herpes-simplex-Viren, die nicht in der Lage sind, sowohl γ34.5-Genprodukte als auch Ribonukleotid-Reduktase zu exprimieren
  • Herpes-simplex-Virenstämme, die sowohl in dem γ34.5 als auch in den Ribonukleotid-Reduktase-Gen mutiert sind, werden mit Hilfe von Standardverfahren zur Erzeugung von Viren-Rekombinanten, wie durch Goldstein und Weller beschrieben, hergestellt. Diese beiden Gene sind nicht essentiell für das Virenwachstum in Kulturen, und deswegen sind auch Null-Mutanten in Kultur lebensfähig. Derartige Doppelmutanten enthalten eine Insertion des E.-coli-LacZ-Gens in einem der beiden Gene, so dass die Replikation in situ einfach nachgewiesen werden kann.
  • Ein beispielhafter mutierter Herpes-simplex-Virusvektor der vorliegenden Erfindung kann durch homologe Rekombination unter Benutzung von DNA, die aus R3616-Virus und einem 5.3-kb-HindIII-XbaI-Fragment von pKX2-βG3 isoliert worden ist, hergestellt werden. Ein Beispiel einer derartigen Mutante der vorliegenden Erfindung wird als „G207" bezeichnet. 4 zeigt die Konstruktion von G207. Fünf isolierte Formen wurden gereinigt und als G207-1, -2, -3, -4, -5 bezeichnet.
  • Die HSV-1-Mutante R3616, abgeleitet aus HSV-1-Wildtyp-Stamm F, enthält eine 1-kb-Deletion in beiden Kopien des γ34.5-Gens. Um eine ICP6-lacZ-Insertion in R3616-Viren-DNA zu konstruieren, wurde das 5.3-kb-HindIII-XbaI-Fragment von pKX2-βG3, das eine lacZ-Insertion in dem 2.3-kb-XhoI-Fragment des ICP6-Gens enthält, mit R3616 infektiöser Viren-DNA in Kaninchen-Hautzellen (RS) cotransfiziert und durch homologe Rekombination in die Viren-DNA eingeführt. Das Plasmid pKX2-βG3, das eine lacZ-Gen-Insertion in dem 2.3-kb-XhoI-Fragment des ICP6-Gens (KOS) enthält, wurde freundlicherweise von Dr. S. K. Weller (Universität von Connecticut) zur Verfügung gestellt. Goldstein und Weller, J. Virol. 62: 196 (1988). Plasmid pKpX2' wurde durch Teilverdauung von pKX2-βG3 mit BamHI, Entfernen des lacZ-Gens und Religation konstruiert. Das Plasmid pRB4081, das das NcoI-SphI-Fragment des γ34.5-Gens enthält, wurde freundlicherweise von B. Roizman zur Verfügung gestellt. Chou et al., Science 25: 1262 (1990). Alle rekombinanten Plasmide wurden durch Standardverfahren vermehrt. Alle Plasmide und Viren können mit geeigneten Materialien im Hinblick auf die vorliegende Anwendung konstruiert werden.
  • Zweihundert bis tausend infektiöse Einheiten der R3616-Viren-DNA (ungefähr 1 μg) werden in RS-Zellen mit einem 10-fachen molaren Überschuss an 5.3-kB-Insert von pKX2-βG3, das durch Ausschneiden mit XbaI und HindIII abgetrennt worden ist cotransfiziert. Sobald weit verbreitete zytopathische Effekte beobachtet werden, werden die Nachkommen geerntet und die Titer auf Vero-Zellen bestimmt.
  • An Tag 2 oder 3 nach der Infektion wurde die Plaque mit X-gal-Lösung gefärbt. Rekombinante Viren wurden durch positive Plaque-Färbung mit X-gal identifiziert. Rekombinante Viren-Plaque (γ34.5-/ICP-6- und LacZ+) färbt in Anwesenheit von X-gal blau. Das rekombinante Virus aus der blauen Plaque wird gereinigt und die DNA mit Restriktions-Endonuklease-Mapping analysiert, um die DNA-Struktur der Virusmutanten zu bestätigen. Blaue Plaque wurde dreimal durch Überführung in Vero-Zellen in einer begrenzten (limiting) Verdünnungsmethode gereinigt, bevor die Stammlösungen angesetzt wurden.
  • Die Plaque-Morphologie von G207-1 und G207-2 wurde analysiert ebenso wie die Wirkung von verschiedenen Konzentrationen IFCS-enthaltenden Mediums auf die Plaque-Morphologie. Infizierte Monolayer von Vero-Zellen wurden bei 37°C in einem Medium, das 0,5, 1, 2,5 und 5% IFCS enthält, kultiviert; 36 bis 48 Stunden nach Infektion fixiert und zum Nachweis von β-gal-Aktivität mit X-gal gefärbt und dann mit Neutralrot gegengefärbt.
  • G207-1-Mutanten produzierten nicht-synzytiale Plaque, wohingegen G207-2-Mutanten synzytiale Plaque produzierten, die durch extensive Zell-Zell-Fusion charakterisiert ist.
  • Tabelle 4 dokumentiert die ansteigenden Plaque-Durchmesser unter Bedingungen erhöhten Zellwachstums für G207-1 und G207-2. Die Durchmesser der Plaques wurden mit Hilfe eines Mikrometers unter einem Umkehrphasen-Kontrastmikroskop bei 40-facher Vergrößerung gemessen. Jeder Wert stellt einen Durchschnittsdurchmesser aus 15 Plaques dar.
  • TABELLE 4
    Figure 00450001
  • Die Sequenz und die Genanordnung von G207-Viren im Vergleich zu ihrem Stamm-F-Wildtyp-Hintergrund sind in 5 dargestellt. Die Kästen in der oberen Linie von 5 stellen die inverse Wiederholungssequenz dar, die die langen (UL) und kurzen (US) Komponenten des Herpes-simplex-Virus-Genoms flankieren, das durch dünne Linien dargestellt ist. Die expandierten Domänen der langen Unique-Region zeigen die Lage des ICP6-Gens. Die dicke Linie zeigt die transkribierten Sequenzen des ICP6-Gens. Mutante G207 enthält das Strukturgen von lacZ, das in die BamHI-Stelle im ICP6-Gen insertiert ist. Die expandierten Domänen der Repeatregion zeigen die Position des γ34.5-Gens. Mutante G207 enthält eine 1 kB-Deletion in beiden Kopien des γ34.5-Gens.
  • Analyse der mutierten Viren-DNA
  • Um die korrekt geänderte Struktur der Herpes-simplex-Virusvektoren zu bestätigen, wurde eine Southern-Blot-Analyse mit den Mutanten der Erfindung durchgeführt. Viren-DNA wurde aus teilweise gereinigten Virionen hergestellt. Die gesamten Viren-DNAs (KOS, hrR3, Stamm F, R3616 und G207) wurden mit Restriktions-Endonuklease verdaut, durch Agarose-Gelelektrophorese in einem Tris-Borat-EDTA-Puffer getrennt und durch das Verfahren von Southern transferiert. Rekombinante DNAs, die als Hybridisierungssonden verwendet wurden, wurden durch ein ECL-Label-Kit (Amersham), wie vom Hersteller empfohlen, gelabelt. Um zu bestätigen, dass die Virenmutanten das LacZ-Gen an der entsprechenden Stelle haben, wurde die Gesamt-DNA mit XhoI verdaut und in Duplikation einer Southern-Blot-Hybridisierung unterworfen. Filter wurden mit gelabeltem pkpX2', das Wildtyp-Sequenzen des ICP6-Gens enthielt, hybridisiert. HSV-1-Wildtyp-KOS enthält ein Wildtyp-2.3-kB-Xho-I-Fragment, wohingegen hrR3 (abgeleitet von KOS und lacZ-Insertionsmutante im ICP6-Gen) das 5.3-kB-Fragment wie erwartet enthält, wenn das lacZ-Gen inseriert worden war. HSV-1-Stamm-F enthält ein ungefähr 6.0 kB-Xho-I-Fragment wegen eines Polymorphismus zwischen Herpes-simplex-Virus-Wildtyp-Stämmen. G207 enthält, wie erwartet, ein 9.0 kB-Fragment, wenn das LacZ-Gen in das 6.0-kB-Fragment von Stamm F insertiert worden war. Wenn der Filter mit einer LacZ-Gen-Sonde alleine hybridisiert wurde, wurde nur das 5.3-kB-Fragment von hrR3 und das 9.0-kB-Fragment von G207 nachgewiesen. Diese Ergebnisse zeigen, dass das LacZ-Genfragment in die geeignete Stelle im Genom eingeführt worden ist.
  • Um zu bestätigen, dass G207 Deletionen in dem γ34.5-Gen enthält, wurden virale DNAs von Stamm F, R3616, G207 mit BamHI verdaut und einer Southern-Blot-Hybridisierung unterworfen. Plasmid pRB4081, das Wildtyp-Sequenzen des γ34.5-Gens enthält, wurde als Sonde verwendet. Das γ34.5-Gen befindet sich zwischen den BamHI-SP- und S-Fragmenten. Stamm F enthält Wildtyp-BamHI-SP- und S-Versionen dieser Fragmente, wohingegen R3616 und G207 die Deletionsversionen dieser Fragmente enthalten. Diese Ergebnisse zeigen, dass beide γ34.5-Gene in R3616- und G207-Viren-DNA deletiert sind.
  • Auf spezifische Zelltypen ausgerichtete Herpes-simplex-Virus-Mutanten
  • Plasmide, die das 2.2-kB-EGFR-Promotor-Fragment von pERCAT2, siehe Johnson et al., J. Biol. Chem. 263: 5693 (1988), und ein 2.1-kB-BFGF-Promotor-Fragment aus pF2.ICAT, siehe Shibata et al., Growth Factor 4: 277 (1991), enthalten, werden verwendet, um die transiente Expression eines Marker-Proteins (β-Galactosidase) zu charakterisieren. Die Zellspezifität dieser Konstrukte wird in menschlichen U-87MG-Glioblastomzellen für BFGF [Takahashi et al., FEBS Letters 288: 65 (1991)] und in A431-menschlichenepidermoiden Karzinomzellen für EGFR bestätigt. Liberman et al., Nature 313: 144 (1985). A431-Zellen sind erhältlich als ATCC: CRL 1555; U-87MG-MG-Zellen sind erhältlich als ATCC: HTB 14.
  • Der Tumorzellen-spezifische Promotor ist beispielsweise in ein ICP4-Plasmid stromaufwärts der ICP4-kodierenden Region kloniert. Beispiele von ICP4-Plasmiden schließen pGH108 oder pXhoI-C ein. Roberts et al., J. Virol. 62: 4307 (1988). Dieses Plasmid wird dann zu Herpes-simplex-Virus-ICP4– rekombiniert. Herpes-simplex-Virus-ICP– kann durch Deletionen oder Insertionen in die ICP4-kodierende Region konstruiert werden. DeLuca et al., J. Virol. 56: 558 (1985); DeLuca und Schaffer, Nucleic Acids Res. 15: 4491 (1987); Paterson und Everett, J. Gen. Virol. 71: 1775 (1990). Der Vektor der Erfindung kann ebenfalls durch eine Deletion oder Insertion in der ICP4-kodierenden Region ICP4– gemacht werden. Solche ICP4–-Vektoren werden auf ICP4-exprimierenden Zellen isoliert. DeLuca et al., wie oben; DeLuca und Schaffer, wie oben; Paterson und Everett, wie oben. Alternativ wird die ICP4-regulatorische Region des Herpes-simplex-Virusvektors durch den tumorspezifischen Promotor ersetzt, so dass ICP4 nur in Zellen produziert wird, die zur Exprimierung des ersetzten Promotors fähig sind. Die Herpes-simplex-Virus-Mutante, deren ICP4-Gen unter der Kontrolle eines tumorspezifischen Promotors steht, wird auf ihre Fähigkeit zur Infektion und Abtötung spezifischer Tumorzellen getestet.
  • BEISPIEL 2: SICHERHEITS- UND WIRKSAMKEITSSTUDIEN
  • Die In-vitro-Wirksamkeit der Mutanten als Antigliom-Wirkstoffe kann festgestellt werden, indem man die Gliom-Cytotoxizität auf Kulturen einer langfristigen menschlichen Gliom-Zelllinie, U-87MG, oder menschlichen Early-passage-Glioblastomen untersucht. Um die In-vivo-Tumorinhibierung zu beurteilen, wurden subkutane U-87MG-Transplantate (xenografts) in nackten Mäusen separat mit jeder Virenmutante oder mit dem Träger beimpft und die Tumor-Wachstumsraten analysiert. Um die potenziellen Auswirkungen der Behandlung mit mutierten Herpes-simplex-Viren auf die Überlebensfähigkeit zu untersuchen, wurden nackte Mäuse mit intrakranialen U-87MG-Transplantaten (xenografts) mit Virus- oder Träger-Impfungen behandelt und deren Überleben wurde verglichen.
  • Um das Ausmaß an Tumorzerstörung sowie die beibehaltene Neurovirulenz der Viren, wenn sie in Dosen eingesetzt wurden, die nötig sind, um ein verlängertes Überleben zu erzielen, abzuschätzen, wurden die Gehirne der Langzeit-Überlebenden mit den intrakranialen Transplantaten sektioniert, gefärbt und mikroskopisch untersucht. Für die wirksame In-vivo-Tumorinhibierung und Überlebensverlängerung ist eine sorgfältige Auswahl der Mutante in den hierin beschriebenen Versuchen essentiell. Die folgenden Methoden geben dem Fachmann eine klare Anleitung, wie für mutierte Virusvektoren, die in der In-vivo-Inhibierung von Tumorwachstum und für ein verlängerndes Überleben wirksam sind, gescreent werden kann. Um die relative Sicherheit dieser Viren als potenzielle Antigliom-Wirkstoffe festzustellen, wurde ihre Empfindlichkeit gegenüber dem herkömmlichen Antiherpes-Mittel Ganciclovir untersucht. Schließlich, um die Sicherheit der intrazerebralen Impfung mit mutanten Virusvektoren zu testen, erhalten die Tiere eine intrazerebrale Impfung mit dem mutierten Virus und werden anschließend auf Enzephalitis untersucht.
  • Zytopathisches Abtöten in vitro
  • Die Fähigkeit der Herpes-simplex-Virusvektoren der Erfindung zum Abtöten von Tumorzellen wurde zunächst in Zellkultur getestet. Arbeiten mit Viren wurde in besonders gekennzeichneten anerkannten Virusvektor-Räumen durchgeführt. Viren wurden zunächst auf Vero-Zellen, wie in Martuza et al., Science 252: 854 (1991) beschrieben, wachsen gelassen. Um den Titer der Viren-Mutante zu maximieren, wurde die anfängliche Viren-Suspension bei 34.500 g für 2 h bei 4°C zentrifugiert und der resultierende Festkörper anschließend in Medium suspendiert und wieder auf den Titer untersucht. Viren wurden in verschiedenen Infektionsmultiplizitäten (MOIs) zwischen 101 und 10–4 eingesetzt. Die MOI-Werte wurden aus der Zellzahl berechnet. Die geeignete Anzahl an Viren-pfu wurde eingesetzt und gleichmäßig verteilt. Coen et al., J. Virol. 53: 477 (1985). Alle Vireninfizierten Zellkulturen wurden mit Kontrollkulturen (DMEM+, keine Viren) verglichen. Zellen wurden beibehalten und mikroskopisch untersucht. Zellen, die eine runde Form einnahmen und ihre normale Morphologie verloren haben, und solche, die sich von der Platte ablösten, wurden als tot betrachtet. Monolayer wurden als komplett zerstört angesehen, wenn 99 oder mehr Prozent der Zellen derartige zytopathische Effekte zeigten.
  • Entweder die Mutante oder ihr elterlicher Wildtyp wurden zu einer menschlichen Gliom-Linie (U-87MG) und Nierenzellen von afrikanischen Grünaffen (Vero-Zellen) in Infektionsmultiplizitäten (MOIs) von 10–4 bis 101 in DME+ (Dulbecco's-Modified-Eagle's-Medium mit 1–5% Hitze-inaktiviertem fötalem Kälberserum ((IFCS) und Antibiotika) gegeben. Die maligne menschliche Gliom-Linie U-87MG wurde von der American Tissue Cell Collection, Rockville, MD erhalten. Zusätzlich wurden zwei primäre menschliche maligne Gliome als chirurgische Tumorproben erhalten. Martuza et al., wie oben (1991). Alle Zellen wurden in Dulbecco's-Modified-Eagle's-Medium mit 10% fötalem Rinderserum und Antibiotika (DMEM+) wachsen gelassen.
  • Subkonfluente Monolayer von U-87MG und Vero-Zellen wurden mit dem erfindungsgemäß mutierten Virusvektor bei unterschiedlichen MOIs infiziert. Die infizierten Zellen wurden in einem 1–5% IFCS-enthaltenden Medium bei 34,5°C kultiviert. Die lebensfähigen Zellen wurden mit Hilfe der Trypanblau-Ausschließungsmethode identifiziert. Die Mutante, die nach 24 Stunden zytopathische Effekte, die proportional zu dem MOI sind und mehr als 99% zytopathische Effekte nach 10 Tagen in U-87MG zeigt, wird als fähig, Gliom-Zellen in vitro abzutöten, angesehen. Die geringste Impfmenge an Virus-Mutanten, mit der eine Infektionsausbreitung zur Zerstörung des gesamten Monolayers der U-87MG-Zellen aufrecht erhalten werden kann, ist eine der Dosen, mit denen die Mutante in vivo evaluiert wird. Der mutierte Virusvektor wird auch in verschiedenen menschlichen Gliom- Linien (T98G) bei verschiedenen MOIs getestet und auf seine Fähigkeit zur Monolayer-Zerstörung innerhalb von 10 Tagen beurteilt.
  • Kurzlebige Gliom-Kulturen wurden etabliert, indem drei maligne menschliche Gliome (ein anaplastisches Astrozytom und zwei Glioblastome), die durch einen chirurgischen Eingriff erhalten wurden, in DME+ ausgesetzt und nach dem zweiten Passagieren untersucht wurden. Die Mutanten werden bei verschiedenen MOIs auf ihre zytopathischen Effekte getestet. Die Herpes-simplex-Virus-Mutante und -Dosis, die in allen drei primären malignen Gliomen zytopathisch ist, wird als fähig angesehen, eine Vielzahl von menschlichen Gehirntumorzellen in vitro abzutöten.
  • Zusätzlich zu den Gliom-Kulturen werden die Viren-Mutanten auf ihre Fähigkeit hin, drei menschliche maligne Meningiome, 1 atypisches Meningiom, 5 Neurofibrosarkome und 2 Medulloblastome in Zellkultur und auch in den In-vivo-Modellen abzutöten, untersucht. Die Viren-Mutanten werden bei MOIs von 101 bis 10–4 getestet. Eine signifikante Tumorinhibierung durch die Viren-Mutanten zeigt eine Vielzahl von Nervensystem-Tumoren an, in denen die Viren-Mutanten wirksam für die Abtötung menschlicher Gehirntumorzellen sind.
  • 6 zeigt die in-vitro-zytopathische Wirksamkeit von G207-1 und G207-2 auf U-87MG-Zellen. Subkonfluente Monolayer der U-87MG-Zellen wurden mit G207-1 oder G207-2 (MOI = 0,01 oder 1) infiziert, wohingegen die Kontrollen mit Blindproben infiziert wurden und in einem 10%-igen IFCS enthaltenden Medium bei 34,5°C kultiviert wurden. Die lebensfähigen Zellen wurden durch das Trypanblau-Ausschlussverfahren identifiziert. Die Zahl der überlebenden Zellen bezogen auf die Zahl der Zellen der mit den Blindproben infizierten Kontrollkulturen (100%) wurde festgestellt. Jeder Messwert repräsentiert einen Mittelwert aus drei Proben. Die vertikalen Striche zeigen die Standardabweichung der drei Proben. Jede der Virenmutanten tötete alle Tumorzellen innerhalb von sechs Tagen nach der Infektion. Zytopathische Effekte tauchten einen Tag nach der Infektion bei einem MOI von 1,0 auf, wobei eine > 99%-ige Zytotoxizität ab Tag 3 bei einem MOI von 1,0 und ab Tag 6 bei einem MOI von 0,01 sichtbar war. Die zytopathische Wirksamkeit dieser Mutanten kann auch an den menschlichen Gliom-Zelllinien T98G, U-138MG und A172 getestet werden.
  • Der Herpes-simplex-Virusvektor der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um die Zerstörung anderer menschlicher Tumore herbeizuführen. Beispiele anderer menschlicher Tumore, auf die diese Erfindung anwendbar ist, schließen ein Melanom, Prostatakarzinom, Brustkrebs, Pankreaskrebs, Lungenkrebs, Kolonkrebs, Lymphom, Hepatom und Mesotheliom. Menschliche Tumorzellen können aus Tumoren wie beschrieben kultiviert werden. Fogh und Trempe, HUMAN TUMOR CELLS IN VITRO, Plenum Press, N. Y. (1975), S. 115; Wilson, Kapitel 8, ANIMAL CELL CULTURE, A PRACTICAL APPROACH. IRL Press (1986). Menschliche Melanom-Zelllinie, SK-MEL-31 (ATCC: HTB 73): menschliche Prostatakarzinom-Zelllinie, Du145 (ATCC: HTB 81) und PC3 (ATCC: CRL 1435); menschliche epidermoide Karzinomzellen, A431 (ATCC: CRL 1555); und menschliche Lungenkarzinomzellen, Calu-1 (ATCC: HTB 54) sind empfänglich für die Infektion mit abgeschwächten HSV-1-Mutanten.
  • Empfindlichkeit gegenüber Antiviren-Wirkstoffen
  • Um die Unempfindlichkeit einiger Herpes-simplex-Virus-Mutanten aus dem Stand der Technik gegenüber Antiviren-Wirkstoffen zu überwinden, wird ein weiteres Wirkstoff-Target (z. B. Suizid-Gen) in das Virus eingefügt. Beispielsweise wird das CMV UL97-Gen (ganS; pGMT7-UL97) in TK–-HSV-1-Mutanten eingefügt und auf seine Fähigkeit, die Unfähigkeit von TK–-HSV-1 zur Replikation in Serum-mangelnden (starved) Zellen zu komplementieren und Ganciclovir-Empfindlichkeit auf diese Rekombinante zu übertragen, getestet. Nachdem der Virusvektor, der das Suizid-Gen enthält, auf Ganciclovir-Empfindlichkeit getestet worden ist, werden der ED50 (in vitro) und die durchschnittliche Überlebenszeit des Suizid-Gen-enthaltenden Virusvektors im Beisein von Ganciclovir mit dem das Suizid-Gen nicht enthaltenden Vektor verglichen (beispielsweise HSV-1-Mutanten TK–/UL97 und dlsptk).
  • Ganciclovir-Empfindlichkeitstests
  • Konfluente Monolayer von Vero-Zellen in 12-Vertiefungsplatten werden mit 100 pfu von R3616 oder G207 infiziert, wobei der MOI unter 0,005 bleibt. Nach Entfernung der Virus-Impfung wird DMEM plus 1% inaktiviertes fötales Kälberserum und 1000-fach verdünntes menschliches Immunoglobulin (Armour Pharmaceutical Company; Kankakee, IL), das verschiedene Konzentrationen von Ganciclovir enthält, zu Triplikats-Kulturen zugegeben und die Zellen werden bei 37°C inkubiert. Plaque wird durch Giemsa-Färbung sichtbar gemacht und am Tag 3 nach der Infektion gezählt. Die Ganciclovir (GCV)-Empfindlichkeit von R3616, G207-1 und G207-2 wird in 7 dargestellt, die zeigt, dass G207-1 und G207-2 zehn Mal mehr empfindlich für Ganciclovir sind als R3616. Die Ganciclovir-Empfindlichkeit von R3616 ist ähnlich der des Wildtyps. Jeder Wert stellt den Mittelwert aus drei Versuchen dar. Die Plaque-Zahl in Abwesenheit von Ganciclovir bedeutet 100% Plaque. Die gepunktete Linie gibt den ED50 an.
  • Temperaturempfindlichkeit des Virus-Mutanten-Vektors
  • Um ein weiteres Sicherheitsmerkmal bereitzustellen, das die Viren-Replikation beim Vorhandensein von Encephalitis und Fieber weiter beschränkt, wird die Empfindlichkeit der mutierten Virusvektoren gegenüber Temperaturen, die größer als die Grundtemperatur des Wirts sind, festgestellt. Tabelle 5 zeigt eine herabgesetzte Effizienz in der Plaque-Bildung von G207-1 und G207-2 bei erhöhten Temperaturen. Die Effizienz zur Plaque-Bildung wurde bestimmt, indem Virusstammlösungen in Vero-Zellen-Monolayern titriert wurden. Die infizierten Vero-Zellen-Monolayer werden in einem 1%-igen IFCS-Medium bei 37 oder 39,5°C kultiviert und 48 Stunden nach der Infektion fixiert. Nach Giemsa-Färbung werden die Plaques gezählt. Die Titer sind als pfu/ml ausgedrückt. Die hrR3-Mutante zeigte eine Temperaturempfindlichkeit im Vergleich zu dem elterlichen KOS-Stamm, wie vorhergehend berichtet. Goldstein und Weller, Virology 166: 41 (1988). Der HSV-1-Wildtyp-Stamm-F, der der elterliche Stamm von R3616, G207-1 und G207-2 ist, ist ebenfalls temperaturempfindlich. Die R3616-, G207-1- und G207-2-Mutanten bleiben temperaturempfindlich wie ihre elterlichen Stämme.
  • TABELLE 5
    Figure 00510001
  • BEISPIEL 3: EXTRAKRANIALE IN-VIVO-MODELLE
  • Subkutane Gliom Fremdimplantat-(Xenograft)-Transplantation und Therapie
  • Die Auswirkungen einer Infektion mit einem mutierten Herpes-simplex-Virus auf menschliche Gehirntumore in vivo wurden in athymischen Mäusen, in denen menschliche Tumore wachsen gelassen wurden, bestimmt. Subkutane Fremdimplantat-Einführung (xenograft implantation) wurde wie vorhergehend beschrieben durchgeführt. Martuza et al., Science 252: 854 (1991) und Markert et al., Neurosurg. 32: 597 (1993). Um die Auswirkung der Herpes-simplex-Virus-Mutanten auf menschliches Gliom in vivo zu testen, wurden 1 mm3 zerkleinerte Gliom-Stücke (erhalten von Nacktmäusen, denen zuvor subkutan kultivierte U-87MG-Zellen injiziert worden waren) subkutan in die Nacktmäuse implantiert. Nacktmäuse wurden mit 0,25 ml einer Lösung enthaltend 84% bakteriostatische Kochsalzlösung, 10% Natriumpentabarbitol (1 mg/ml) und 6% Ethylalkohol betäubt. Tiere, die innerhalb von 48 Stunden nach einer beliebigen Prozedur sterben, werden als periooperative Tode betrachtet und werden von der Analyse ausgeschlossen. Todesfälle in den subkutanen Tumorexperimenten werden von der Analyse ausgeschlossen (kein signifikanter Unterschied in Todesfällen trat zwischen Virus-behandelten Gruppen und ihren entsprechenden Kontrollen auf).
  • Zwischen Woche 4 und 5 wurden die Tiere, in denen die Tumore wuchsen (≥ 8 mm in Durchmesser) in zwei Gruppen von jeweils 7 bis 10 Tieren pro Gruppe geteilt. Die Kontrollen erhielten intraneoplastische Injektionen von 50 oder 60 μl DMEM+; behandelte Tiere erhielten ähnliche intraneoplastische Injektionen von Viren, die in DMEM+ suspendiert waren. Die Dosen, die für jedes Virus verabreicht wurden, variieren zwischen 106 und 108 Plaque-bildenden Einheiten. Es wird darauf geachtet, dass der Virus über den ganzen Tumor verteilt wird. In Zwei-Dosen-Experimenten, werden nachfolgende Injektionen von DMEM+ oder Virus an Tag 14 durchgeführt. Ähnliche Experimente werden für jede Virus-Mutante bei verschiedenen Dosierungen durchgeführt.
  • Tumore werden wöchentlich oder zwei Mal wöchentlich mit Schublehren gemessen. Das Wachstum der subkutanen Fremdimplantate (xenografts) wurde als Tumorwachstumsrate gemäß der Formel ([1 × w × h]/2)/([1 × w × h]Tag 0/2), wie in Martuza et al., wie oben (1991) beschrieben, aufgezeichnet. Wachstumsraten-Vergleiche wurden an Tag 28 nach der anfänglichen Behandlung durchgeführt. Potenzielle Unterschiede in den Wachstumsraten wurden mit Hilfe des One-Sided-Wilcoxon-Rank-Tests bestimmt.
  • Subkutane Gliom-Fremdimplantat-(Xenograft)-Therapie unter Verwendung von G207
  • Mäuse mit subkutanen Tumoren (ungefähr 6 mm Durchmesser) wurden nach dem Zufallsprinzip aufgeteilt (n = 6 pro Gruppe) und intraneoplastisch mit entweder 107 pfu G207-Virus, suspendiert in 0,05 ml Viruspuffer oder mit Puffer allein behandelt. Der Tumordurchmesser wurde durch externe Zirkelmessungen bestimmt. Für pathologische Studien wurden Mäuse mit Tumoren (> 10 mm im Durchmesser) mit 1 × 107 pfu G207 behandelt und an Tag 8 oder 15 nach der Injektion getötet. Die Tumore wurden entfernt, in eine Fixationslösung überführt und für eine Stunde in kalter, mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung eingetaucht. Die Tumore wurden dann über Nacht in eine X-gal-Lösung überführt.
  • 8 ist ein Diagramm, die die Wachstumsrate von subkutanen U-87MG-Tumoren in Balb/c-(nu/nu)-Mäusen, die mit 5 × 107 pfu G207-1 (geschlossener Kreis) oder G207-2 (geschlossenes Quadrat) an Tag 0, oder nur mit dem Kontrollmedium (offener Kreis) zeigt. Die Tumore wurden zwei Mal wöchentlich mit Zirkeln gemessen und die Wachstumsrate wurde berechnet, indem das Tumorvolumen durch das Tumorvolumen am Tag der anfänglichen Impfung geteilt wird. Die Balken stellen die Mittelwerte plus Standardabweichungen für jede Gruppe dar. Die mittlere Tumorwachstumsrate war in Tumoren, die mit G207 behandelt wurden, im Vergleich zu Kontrolltumoren, die nur mit dem Medium allein behandelt wurden, signifikant inhibiert.
  • Subrenales Kapselmodell
  • Die Auswirkung von G207 auf U-87MG-Zellen, die in der subrenalen Kapsel von Nacktmäusen wuchsen, würde auch getestet werden, weil die subrenale Kapsel eine Stelle ist, die für das Beobachten von anderen Nervensystem-Tumoren verwendet worden ist. Lee et al., Neurosurg. 26: 598 (1990); Medhkour et al., J. Neurosurg. 71: 545 (1989). U-87MG-Zellen (1,5 × 106) würden in die subrenale Kapsel von Nacktmäusen implantiert werden. Zehn Tage später werden die Tumore gemessen und mit verschiedenen pfus von G207 in 1 μl DME+ oder mit 1 μl DME+ allein geimpft werden. Alle Mäuse wurden 14 Tage und 26 Tage folgend auf die Impfung nochmals überprüft, um die Tumorgröße zu messen. Virus-behandelte Tumore, die kleiner sind als Kontrolltumore, zeigen, dass die Virus-Mutante in der Lage ist, Tumorzellen in vivo abzutöten.
  • BEISPIEL 4: IN-VIVO-INTRAKRANIALE TUMORABTÖTUNG
  • Um die In-vivo-Wirksamkeit der replikationskompetenten Herpes-simplex-Virusvektoren in der Behandlung von intrazerebralen Gliomen zu bestimmen, würden Nacktmäuse stereotaktisch in dem rechten frontalen Lobus mit 1,6 × 105 U-87MG-Zellen beimpft werden. In einer Pilotstudie hat eine ähnliche Zellimpfung eine 100%-ige Mortalität innerhalb von 1,5 Monaten hervorgerufen.
  • Zehn Tage nach der Tumorimplantation würden die Tiere nach dem Zufallsprinzip in Behandlungsgruppen eingeteilt werden, um die folgenden Therapien bei denselben stereotaktischen Koordinaten, die für die Tumorimplantate verwendet wurden, zu erhalten: (1) Die Kontrollgruppe würde intrakraniale Impfungen von 6 μl DME+ wie oben erhalten, (2) die zweite Gruppe würde intrakraniale Impfungen von 103 pfu (geringe Dosis) des mutierten, replikationskompetenten Virusvektors erhalten, (3) die dritte Gruppe würde intrakraniale Impfungen von 105 pfu (mittlere Dosis) des Testvirus erhalten und (4) die vierte Gruppe würde intrakraniale Impfungen von 107 pfu (hohe Dosis des Testvirus) erhalten, jeweils in 6 μl DME+ suspendiert. Die Impfungen würden in 2 μl DME+ bei den stereotaktischen Koordinaten, wie sie anfangs zur Injektion der U-87MG-Zellen verwendet wurden. Nach 7 Wochen würden alle Kontrolltiere tot sein, wie in vorherigen Versuchen auch. Ein mutierter Virusvektor der vorliegenden Erfindung ist ein Vektor, der intrazerebrale Gehirntumore abtötet und dabei eine signifikante Anzahl von Mäusen nach 7 Wochen Behandlung am Leben erhält. Die Signifikanz wird durch Auftragen der experimentellen gegenüber den Kontrolldaten in einem exakten, One-Tailed-Fischer-Test bestimmt.
  • In-vivo-Neuropathologie
  • Tiere, die nach 19 Wochen gesund und neurologisch normal geblieben sind, wurden getötet. Das gesamte Gehirn wird fixiert, in 7 μm Intervallschritten seriell sektioniert, mit Hematoxylin und Eosin gefärbt und mikroskopisch für den Nachweis auf Enzephalitis und/oder Tumore untersucht werden. Die Abwesenheit eines Nachweises von Enzephalitis würde zeigen, dass der Virusvektor die Charakteristika einer abgeschwächten oder gesenkten allgemeinen Neurovirulenz besitzt. Die Abwesenheit eines Tumornachweises würde zeigen, dass der virale Vektor wirksam zur Abtötung menschlicher Gehirntumorzellen in vivo ist.
  • In-vivo-Behandlung wäre effektiver mit solchen mutierten Herpes-simplex-Viren, die eine herabgesetzte Neurovirulenz zeigen, jedoch die zytopathischen Auswirkungen in Gliom- Zellen beibehalten, weil solche Vektoren eine Tumorbehandlung in höheren Virendosen erlauben würden.
  • Studien von mutierten Herpes-simplex-Viren in immunkompetenten Tiermodellen
  • Um die Wirksamkeit von mutierten Herpes-simplex-Viren zur Abtötung von menschlichen Tumorzellen in Anwesenheit eines kompetenten Immunsystems zu testen, würde das GL261-Maus-Ependymoblastom-Modell in seinem syngenen Wirt, der C57BL/6-Maus, verwendet werden. Die GL261-Zelllinie würde subkutan oder intrakranial in C57BL/6-Mäuse implantiert werden. Tiere, die subkutane GL261-Tumore tragen, würden nach dem Zufallsprinzip eingeteilt und intraneoplastisch, wie oben für das Nacktmaus-Modell beschrieben, behandelt. Die Virus-behandelte Gruppe, die eine signifikante Wachstumsinhibierung, ermittelt durch den Wilcoxon-Reihensummen-Test, zeigt, würde dann in intrakranialen Studien getestet.
  • In intrakranialen Studien würden 104 GL261-Zellen in dem rechten vorderen Lobus der Mäuse injiziert werden. Nach 7 Tagen würden die Tiere intraneoplastisch entweder mit der Virusmutante oder mit dem Medium allein geimpft werden. Alle mit dem Medium behandelten Mäuse würden wahrscheinlich sterben, wie in vorherigen Studien auch. Die Viren-Mutanten, die in der Lage wären, das Überleben der Mäuse für 40 Tage oder mehr nach der Tumorzell-Implantation zu verlängern, würden als wirksam zur Abtötung menschlicher Gehirnzellentumore in vivo betrachtet werden.
  • Neuropathologie und Tumorabtötung in Herpes-simplex-Virus-immunisierten Tieren
  • Da das Herpes-simplex-Virus in der Gesellschaft endemisch ist, müsste eine wirksame Therapie an Patienten, die HSV-1 ausgesetzt waren, angepasst sein. Demgemäß ist es wichtig zu bestimmen, ob die mutierten Herpes-simplex-Virusvektoren der vorliegenden Erfindung Tumorzellen in situ in solchen Tieren zerstören können, die vorher schon gegen das Herpes-simplex-Virus immunisiert worden sind. Die Auswirkung der Herpes-simplex-Virus-Immunisierung auf die Fähigkeit der mutierten Virusvektoren zur Abtötung von Tumorzellen in vivo würde in dem GL261-intrakranialen Modell in C57BL/6-Mäusen getestet werden.
  • C57BL/6-Mäuse würden gegen den KOS-Stamm des Herpes-simplex-Virus immunisiert werden; eine andere Gruppe von Mäusen würde mit dem Wildtyp-Stamm, aus dem der Vektor abgeleitet worden ist, immunisiert werden; eine andere Gruppe würde mit einer Kochsalzlösung schein-immunisiert werden. Diejenigen Mäuse, die hohe Serumtiter an Antikörpern in einem Plaquereduktionsexperiment 2 Wochen nach der Impfung zeigen, würden als Herpes-simplex-Virus-immunisierte Tiere verwendet werden. Tumorzellen würden intrazerebral, wie oben beschrieben, vier Wochen nach der Immunisation injiziert. Eine Woche später würde der Tumor unter denselben stereotaktischen Koordinaten mit dem Vektor geimpft werden, wobei in der negativen Kontrollgruppe nur das Medium verwendet wird. Die Auswirkung der Präimmunisierung auf das Tumorzellwachstum, anschließenden Tiertod und die Fähigkeit des Herpes-simplex-Virus zur Abtötung der Tumorzellen würde, wie für das intrazerebrale Modell bereits beschrieben, bestimmt werden.
  • Zusätzlich würden mehrere Tiere jeder Gruppe für neuropathologische Studien jeweils während der akuten Phase (2 Tage), subakuten Phase (1 Woche) und der chronischen Phase (1 Monat und 3 Monate) getötet werden. Die folgenden histologischen Pathologien würden bestimmt werden: Tumorgröße, Immunzelleninfiltration, Gehirnödem, Nekrose, Veränderung der Neuronen, Glia, Myelinierung, Blutung, Vermehrung oder Zerstörung von Blutgefäßen, reaktive Sternzellen, normale Neuronen und Glia, Ischämie, Gliose und Ausbreitung des Virus (PCR für Viren-DNA oder β-Galactosidase). Diese Studien würden bestimmen, ob die Präimmunisierung gegen Herpes-simplex-Virus eine Auswirkung auf die Fähigkeit des mutierten Virusvektors zur Abtötung von Tumorzellen oder zum Auslösen von Neuropathogenese hat.
  • Bestimmung der Viruslokalisation
  • Ein Herpes-simplex-Virus, welches das E.-coli-LacZ-Gen enthält und β-Galactosidase nach der Vireninfektion exprimiert, ist ein nützlicher Marker für die histologische Bestimmung der Dynamik und Ausbreitung des markierten Virus. Die infizierten Zellen können mit X-gal gefärbt werden, weil die hrR3-Mutante das E.-coli-LacZ-Gen umfasst, das in das ICP6-Gen insertiert worden ist, so dass das Virus während der Virenreplikation β-Galactosidase exprimiert. Goldstein und Weller, wie oben (1988).
  • Dieser Marker ermöglicht es, das Ausbreiten des Virus in vivo zu verfolgen, indem die Gehirnproben von Mäusen zu bestimmten Zeitpunkten nach der Infektion mit hrR3 durch Färbung mit X-gal untersucht werden. Kaplitt et al., Mol. & Cell. Neurosci. 2: 320 (1991). Das Vorhandensein von mit Viren infizierten Zellen in fixierten Gehirnabschnitten wird durch PCR bestimmt und mit dem Anteil der X-gal-gefärbten Zellen verglichen. Der Tumor ist nach Gegenfärbung mit H&E oder immunhistochemisch mit Tumorzellen- oder Spezies-spezifischen Markern sichtbar. Auf diese Weise würden replikationskompetente Virusvektoren verfolgt und auf ihre Fähigkeit hin beurteilt werden, sich auf Tumorzellanlagerungen in einer Entfernung von der Haupttumormasse zu verbreiten. Histologische Studien würden die maximale Entfernung bestimmen, auf die sich ein Virus ausbreiten kann, um eine entfernte Tumoranlagerung zu erreichen.
  • In einer anderen empfindlichen Technik zur Identifizierung des Vorhandenseins von Herpes-simplex-Virus oder defizientem Herpes-simplex-Virusvektor in Gehirnsektionen würde PCR verwendet werden. Um Viren-DNA zu lokalisieren, würde die DNA für die PCR aus Zellen nach der Fixierung und histochemischen Behandlung isoliert werden, so dass selbst einzelne positive Zellen ein spezifisches PCR-Signal erzeugen würden. Unter Verwendung von spezifischen Oligonukleotid-Primern würden eindeutige PCR-Produkte von der Virusvektor-DNA, die in diesen Zellen vorhanden ist, erzeugt werden. Die Schutzhüllen würden vom Objektträger entfernt werden und kleine Stücke von Gewebe würden seziert werden. Das Gewebe würde mit Proteinase K, Tween-20, Oligonukleotiden und PCR-Puffer bei 65°C für 90 Min. inkubiert werden, woraufhin dann die Temperatur auf 95°C erhöht wird, um die Proteinase K zu inaktivieren. Die behandelten Proben würden mit dNTPs, PCR-Puffer und Taq-DNA-Polymerase verdünnt werden und dann Thermozyklen unterworfen werden. Die PCR-Produkte würden dann auf ihre Größe hin durch Agarosegel-Elektrophorese untersucht. Zusätzlich können zur Verfügung stehende in-situ-PCR-Techniken zur Lokalisierung der Viren-DNA während neuropathologischer Studien verwendet werden. Embretson et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90: 357 (1993).
  • Sicherheit der replikationskompetenten mutierten Herpes-simplex-Viren in Mäusen und nicht-menschlichen Primaten
  • Um sicherzustellen, dass der Herpes-simplex-Virusvektor in den benötigten Dosen, die zur Tumorzellabtötung erforderlich sind, keine Neurovirulenz hervorruft, erhalten die Tiere Impfungen von Tumor-abtötenden Dosen des mutierten Herpes-simplex-Virusvektors, um zu bestimmen, ob der Vektor in vivo Herpes-simplex-Virus-Encephalitis hervorrufen würde. Jeweils 10 μl von G-207-1, G-207-2 und Stamm F wurden in die rechte zerebrale Hemisphäre von drei Wochen alten Mäusen eingeimpft; die Todesraten wurden bis zu 21 Tagen nach der Infektion aufgezeichnet. Tabelle 6 zeigt, dass die intrazerebrale Beimpfung von Balb/c-Mäusen mit dem Ursprungs-Wildtyp-Virus (Stamm F) bei 103 pfu dazu führte, dass die Hälfte der Tiere an Enczphalitis starb. Chou et al., Science 250: 1262 (1990). Die bekannte LD50 für den Stamm 17 ist ebenfalls 103 pfu McKie et al., J. Gen. Virol., 75: 733 (1994). Im Gegensatz dazu wurde keinerlei Sterblichkeit oder Krankheit nach der intrazerebralen Beimpfung der höchsten Titer von G207-1 oder G207-2, die wir herstellen konnten (107 pfu in 10 μl) beobachtet. Es wurde gezeigt, dass eine Dosis von 107 pfu Tumorzellen in vivo im subkutanen U-87MG-Tumorwachstumsmodell, wie in 8 gezeigt, abtötet.
  • TABELLE 6
    Figure 00580001
  • Die Primatenspezies Aotus trivigatus, die extrem empfindlich gegenüber Herpes-simplex-Virus-Enzephalitis ist, wurde verwendet, um die Sicherheit der erfindungsgemäßen mutierten Herpes-simplex-Virusvektoren zu testen. Katzin et al., Proc. Soc. Exp Biol. Med. 125: 391 (1967); Melendez et al., Lab. Anim. Care 19: 38 (1969).
  • Magnetresonanz-Imaging-(MRI)-Scanning oder andere Bildanalysen würden zur Beurteilung von Enzephalitis verwendet werden. Die Affen würden vor dem Beginn des Versuches ein Gehirn-MRI mit und ohne Gadolinium erhalten.
  • Anfängliche Tests würden mit der höchsten Dosis, die für eine bestimmte Mutante erzeugt werden kann und die in Mäusen als sicher bestimmt worden ist (LD10 oder weniger), durchgeführt werden. Beispielsweise würden für die zu testende G207-Deletionsmutante 107 pfu intrazerebral verabreicht werden. Die Dosis, die von einer Spezies, die dafür bekannt ist, sehr empfindlich gegenüber Herpes-simplex-Viren zu sein, gut vertragen wird, liefert den überzeugendsten Beweis dafür, dass diese Behandlung in Menschen angemessen sicher sein würde. Wenn keine klinische oder MRI-Anzeichen für Enzephalitis innerhalb eines Monats beobachtet werden, würde ein anderes Tier bei derselben Dosis oder einen log höher getestet werden. Das Tier würde täglich auf Zeichen für neurologische und systemische Krankheit beobachtet werden.
  • Dieses Verfahren kann die Maximaldosis bestimmen, die auf sichere Weise intrakranial verabreicht werden kann, ohne Tod, fortdauernde neurologische Anzeichen oder fortschreitende Krankheit herbeizuführen. Nach 12 Monaten würden die Tiere getötet und die Gehirne auf Verlust oder Veränderung von Neuronen, gliale Reaktion, Myelinierung, Blutung, Blutgefäßvermehrung oder -zerstörung, virale DNA (durch PCR) oder Viren induzierte β-Galactosidase in Blutgefäßen, Ischämie, Nekrose, Gliose und Entzündungsreaktionen geprüft. Diese Studien würden die neuropathologischen Läsionen (so vorhanden) aufzeigen, deren Auftreten man in einem normalen Primatengehirn als Ergebnis der Infektion mit diesem Vektor erwarten könnte.
  • Die Gattung Aotus wurde lange Zeit als eine monotypische Gattung mit Aotus trivigatus als einzigem Vertreter betrachtet. Allerdings haben Studien bewiesen, dass Aotus eine multispezifische Gattung mit Arten und Unterarten ist, die eine Chromosomenzahl im Bereich von 2n = 46 bis 2n = 56 (Aotus nancymai, Karyotyp 1 Eulenaffe, 2n = 54) aufweist. Als die Empfindlichkeit von Eulenaffen gegenüber Herpes-simplex-Virus in den 1960er Jahren berichtet wurde, konnte man nicht zwischen Aotus trivigatus und Aotus nancymai unterscheiden. Malaga et al., Lab. Anim. Sci. 41: 143–45 (1991). Unter der üblichen taxonomischen Klassifizierung war Aotus nancymai früher als ein Vertreter des Aotus trivigatus aufgefasst worden. Hershkovitz, Amer. J. Primatol. 4: 209 (1983).
  • Replikationskompetente Virusvektoren der vorliegenden Erfindung würden auf ihre Fähigkeit zur Produktion von Herpes-simplex-Virus-Enzephalitis in Primaten, die empfindlich gegenüber Herpes-simplex-Virus-induzierte Enzephalitits sind, nämlich Aotus nancymai und/oder Aotus trivigatus, getestet werden. Ein Aotus nancymai lebt noch nach drei Wochen, nachdem er mit 107 pfu der G207-Mutante beimpft worden ist.
  • BEISPIEL 5. BEHANDLUNG VON MENSCHLICHEN GEHIRNTUMOREN MIT REPLIKATIONSKOMPETENTEN VIRUSVEKTOREN
  • Patienten mit wiederkehrendem Glioblastom, das resistent gegen Standardchirurgie, Radiotherapie und Chemotherapie war, würden mit der Herpes-simplex-Virus-Therapie behandelt werden. Der Patient würde mit MRI oder CT oder anderen Techniken gescannt werden und der Tumor und das normale Gehirn würden im stereotaktischen Raum aufgezeichnet werden. Das Virus würde mit stereotaktisch geleiteten neurochirurgischen Techniken verabreicht werden. Ein Computertomographie-(CT)-Scan oder ein Magnetresonanz-Imaging-(MRI)-Scan berechnet den stereotaktischen Rahmen, der zur korrekten Einimpfung des Virus in einen Tumor an einen oder mehreren Stellen benutzt werden würde. Das Virus würde in einer Dosis von 101 bis 107 pfu pro Einimpfung unter Verwendung einer Kanüle von < 2 mm eingeimpft werden. Die Zahl der Stellen, an denen eingeimpft wird, würde von der Größe des Tumors abhängen. Die Patienten würden mit periodischen MRI-Scans und mit neurologischen Untersuchungen, Blutzählung und Leberfunktionstests beobachtet werden.
  • In einer alternativen Strategie werden Patienten operiert werden, um viel von dem rezidierenden Tumor zu entfernen, und das Virus wird auf dem herausgeschnittenen Tumorbett in einer der oben beschriebenen ähnlichen Weise eingeimpft.
  • BEISPIEL 6. REPLIKATIONSKOMPETENTE HERPES-SIMPLEX-VIRUSVEKTOR-IMPFSTOFFE
  • Der Herpes-simplex-Virusvektor der Erfindung kann als Impfstoff zum Schutz eines Tieres gegen Herpes-simplex-Virusinfektion verwendet werden. In dem vorliegenden Zusammenhang, schließt „Schutz" eines Subjekts gegen Herpes-simplex-Virus ein sowohl (1) einen prophylaktischen Impfstoff, d. h. einen Impfstoff, der dazu verwendet wird, eine zukünftige Herpes-simplex-Virusinfektion zu verhindern, und (2) einen therapeutischen Impfstoff zur Behandlung einer bereits bestehenden Herpes-simplex-Virusinfektion.
  • Die Herpes-simplex-Virusprobe würde unter Verwendung von Standardverfahren hergestellt werden. Mit Herpes-simplex-Virus infizierte Vero-Zellen würden bis zu ihrer Verwendung bei –70°C gefroren werden. Das Material würde aufgetaut und die Zelltrümmer würden durch Zentrifugation pelletiert werden. Die überstehende Flüssigkeit würde verworfen und der pelletierte Feststoff würde auf sein ursprüngliches Volumen resuspendiert werden. Dieses Material würde dem Material, das zur Vakzinherstellung verwendet wird, sehr ähnlich sein. Die Suspension würde zwei Mal für 20 Sekunden mit Ultraschall behandelt werden.
  • Herpes-simplex-Virus-Plaquetiter würden durch Standardverfahren bestimmt werden. Beispielsweise würde das Virus drei Mal auf Monolayern von Vero-Zellen in 6-Vertiefungsplatten titriert werden. Nach Adsorption der Proben für 2 Stunden würden die Zellen mit einem Medium, welches 0,6% Agarose enthält, überschichtet werden und bei 37°C in einer CO2-reichen Umgebung für 48 h inkubiert werden. Eine zweite Überschichtung, die Gleiche wie oben beschrieben, abgesehen davon, dass sie Neutralrot enthält, würde zugefügt werden und die Zellen würden für weitere 24 Stunden inkubiert werden.
  • Die Herpes-simplex-Virus-Pools würden vor der Filtration titriert werden. Die Pools würden dann durch einen 0,45 μm-Nalgene-Filter filtriert werden, die Proben würden dann anschließend gesammelt und durch einen zweiten Filter filtriert und wieder gesammelt werden.
  • BEISPIEL 7. TESTEN DES HERPES-SIMPLEX-VIRUS-IMPFSTOFFS AUF PATHOGENIZITÄT IN EINEM MAUSMODELL UND EINEM AFFENMODELL
  • Die Lethalität des Herpes-simplex-Virusimpfstoffs würde mit der Lethalität anderer Herpes-simplex-Virusimpfstoffe in < 24 h alten Mäusesäuglingen, CD-1-Stamm (Charles River, Raleigh, North Carolina) verglichen werden. Meignier et al., J. Infect. Diseases 158: 602 (1988); Burke, Curr. Topics in Microbiology and Immunology 179: 137 (1992). Vergleichende Titration von Herpes-simplex-Virusvektor-Vakzin und Wildtyp-Vakzinen würde in einem einzelnen Test unter Verwendung der Endmenge an Herpes-simplex-Virus-Impfstoff durchgeführt werden.
  • Logarithmische Verdünnungen des Impfstoffs würden hergestellt werden. Zwei Würfe von jeweils 5 Mäusen würden für jede Verdünnung verwendet werden. Die Mäuse würden intrazerebral mit 0,03 ml der angemessenen Verdünnung geimpft und für 21 Tage beobachtet werden. Die Mäusesterblichkeit würde als Dosis in pfu, die 50% der Mäuse tötete, berechnet werden (z. B. pfu/0,03 ml Impfstoff geteilt durch LD50 des Impfstoffs).
  • Der Herpes-simplex-Virusvektor würde außerdem 4 Affen in der Studie gegeben werden. Weitere sechs Affen würden den Vektor ein Jahr nach Immunisierung mit dem Herpes-simplex-Virusvektor der Erfindung erhalten. Wenn intradermale und subkutane Verabreichung des Impfstoff-Kandidaten gut vertragen wird, wird der Herpes-simplex-Virusvektor-Impfstoff als sicher zur Verwendung als immunprotektiver Wirkstoff gegen Herpes-simplex-Virus betrachtet.
  • Zusätzlich würden alle Affen auf Serumantikörpertiter spezifisch für das Herpes-simplex-Virus getestet werden. Affenserokonversion würde nach der Primärimmunisierung mit ELISA gemessen werden. Wenn alle Affen eine Serokonversion zeigen, wird der Herpes-simplex-Virusvektor-Impfstoff als ein wirksamer immunprotektiver Wirkstoff gegen Herpes-simplex-Virus angesehen.
  • BEISPIEL 8. MENSCHLICHE KLINISCHE STUDIEN MIT HERPES-SIMPLEX-VIRUSVEKTOR-IMPFSTOFFEN
  • Zur Verwendung als Impfstoff würde der mutierte Herpes-simplex-Virusvektor der Erfindung subkutan eingeimpft werden. Danach würden Herpes-simplex-Virus-spezifische Antikörpertiter und durch Herpes-simplex-Virus-spezifische Zellen vermittelte Antwortspiegel bestimmt werden. Meignier et al., J. Infect. Diseases 162: 313 (1990); Burke, Curr. Topics in Microbiology and Immunology 179: 137 (1992). Die Vorläuferphase der Studie würde aus einer Impfung von vier Individuen mit dokumentierten HSV-1-Infektionen (Gruppe 1) bestehen, gefolgt von einer Impfung von vier HSV-1-naiven Individuen (Gruppe 2) 21 Tage, nachdem die erste Gruppe geimpft worden ist. Vorherige HSV-1-Exposition würde durch medizinische Aufzeichnungen oder eindeutigen HSV-1-Ausbruch dokumentiert, wie bestimmt durch HSV-1-Immunfluoreszenz-Tests, die in klinischen Laboratorien zur Verfügung stehen. Darauf würde eine randomisierte Studie an 24 Herpessimplex-Virus-naiven Freiwilligen (Gruppe 3) folgen. Anti-HSV-1-Immunglobulin und Anti-Herpes-Wirkstoffe stehen vor Ort zur Verfügung im Falle ernsthafter negativer Reaktionen.
  • Mitglieder der Gruppen 1, 2, 3 und 4 würden drei Tage vor der Impfung ins Krankenhaus eingeliefert werden und würden bis zu vier Tage nach der Impfung stationär bleiben. Die Probanden würden dann entlassen und ambulant 21 Tage lang klinisch auf mögliche Reaktionen und Komplikationen untersucht. Probanden, die Fieber, Hautausschlag, Lethargie, nekrotische Hautwunden oder neurologische Anzeichen aufweisen, würden in aufeinanderfolgenden täglichen klinischen Untersuchungen beobachtet und wenn nötig ins Krankenhaus aufgenommen werden.
  • Freiwillige der Gruppe 5, welche alle HSV-1-naiv sind, würden je nachdem, wie sie zur Verfügung stehen, als ambulante Subjekte verwendet. Die Freiwilligen der Gruppe 5 würden nach dem Zufallsprinzip einer oder zwei Untergruppen zugeteilt werden: Die einen würden eine einzige Injektion und die anderen eine Auffrischung erhalten.
  • Gemäß Protokoll der an den Teilnehmern durchzuführenden Studien würden die folgenden periodischen Untersuchungen einschließen: vollständiges Blutbild mit Differenzial- und Plättchenzählung, Urinanalyse, Serumchemie, SerumVirämie, Serum-Herpes-simplex-Virus-Antikörper und Lymphozyten-Immunantwort auf Herpes-simplex-Virus-Antigen. Verbliebene Serumproben würden bei –80°C bis –120°C gefroren gelagert und stünden für weitere Studien und/oder Wiederholungen von ausgewählten Studien falls nötig zur Verfügung. Flüssigkeit in vesikulären oder nässenden Wunden an der Stelle der Einimpfung oder an entfernten Stellen würde als Probe gesammelt und in ein Virenisolationstransportmedium platziert, mit dem versucht werden würde, das Virus wieder rückzugewinnen. Serumantikörper-Bestimmungen würden ELISA-Reaktivität mit Herpes-simplex-Virusvektor-infizierten Zellen, HSV-1-Antigen und Plaquereduktionsneutralisation des HSV-1-Virusvektors einschließen.
  • Klinische Studien mit dem Herpes-simplex-Virusvektor sollten zeigen, dass der Impfstoff für Menschen sicher und wirksam ist. Von Subjekten, die den Impfstoff erhalten haben, würde man erwarten, dass sie eine signifikante humorale Antwort entwickeln, die durch ELISA gemessen wird. Eine positive Antwort würde durch die Produktion von sowohl neutralisierenden als auch nicht-neutralisierenden Antikörpern charakterisiert werden, letztere würden durch Plaquereduktion und Neutralisationsversuche gemessen. Zusätzlich würde man erwarten, dass positive Lymphozytenblastogenese-Untersuchungen zeigen, dass Lymphozyten von Subjekten, die die Vakzine empfangen haben, sich vermehren und nach Exposition mit Herpes-simplex-Virus-Antigen in vitro Zytokine produzieren.
  • Es wird verstanden, dass die Beschreibung, spezifische Beispiele und Daten, obwohl sie bevorzugte Ausführungsformen anzeigen, nur zur Veranschaulichung und Verdeutlichung dienen und nicht beabsichtigt sind, die vorliegende Erfindung einzuschränken. Verschiedene Änderungen und Modifizierungen innerhalb der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann aus der Diskussion und der Offenbarung, die hierin erfolgte, offensichtlich sein.

Claims (7)

  1. Ein Replikations-kompetentes Herpes simplex Virus, umfassend einen gewebespezifischen oder einen zellspezifischen Promotor, der operativ an ein essentielles Herpes-simplex-Virus-Gen gekoppelt ist.
  2. Ein Herpes-simplex-Virus-Vektor, wobei das Genom des viralen Vektors einen gewebespezifischen oder zellspezifischen Promotor enthält, der operativ an ein essentielles Herpes-simplex-Virus-Gen gekoppelt ist.
  3. Der Vektor oder das Virus nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Herpes simplex Virus HSV-1 ist.
  4. Das Virus oder der Vektor nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Herpes simplex Virus HSV-2 ist.
  5. Der Vektor oder das Virus nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 4, wobei das essentielle Herpes-simplex-Virus-Gen ein HSV-Immediate-early-Gen ist.
  6. Das Virus oder der Vektor nach Anspruch 5, wobei das HSV-Immediate-early-Gen das ICP4-Gen ist.
  7. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend (A1) das Herpes simplex Virus nach den Ansprüchen 1 oder 3 bis 6, oder (A2) den Herpes-simplex-Virus-Vektor nach den Ansprüchen 2 bis 6; und (B) einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
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