DE69527204T2

DE69527204T2 - Behandlung von krebs durch verwendung von hsv-mutanten

Info

Publication number: DE69527204T2
Application number: DE69527204T
Authority: DE
Inventors: Moira Brown; William Fraser; Roderick Maclean; Paul Randazzo
Original assignee: University of Glasgow; Wistar Institute of Anatomy and Biology
Current assignee: University of Glasgow; Wistar Institute of Anatomy and Biology
Priority date: 1994-07-29
Filing date: 1995-07-28
Publication date: 2003-02-20
Anticipated expiration: 2015-07-29
Also published as: PT773785E; WO1996003997A3; ATE219681T1; JP2008037869A; CA2196315C; US7674468B2; AU3119995A; EP1192948A2; DE69527204D1; US8067012B2; US20050260169A1; EP0773785A2; ES2179880T3; WO1996003997A2; JPH10503766A; DK0773785T3; EP1192948A3; EP0773785B1; US20100172872A1; JP4321723B2

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung eines mutierten Herpes simplex-Virus (HSV) zur Behandlung von Krebstumoren, insbesondere von Tumoren im Gehirn oder im Nervensystem, ungeachtet dessen, ob die Tumoren metastatisch oder primär sind.

Hintergrund

Die DNA-Sequenz des Herpes simplex-Virus vom Typ 1 (HSV-1) ist bekannt (Quellen 13, 25) und linear mit einer Länge von etwa 152k-Resten. Sie besteht aus zwei kovalent verbundenen Segmenten, die als lang (L) und kurz (S) bezeichnet werden. Jedes Segment enthält eine einzelne Sequenz, die von einem Paar invertierter terminaler Wiederholungssequenzen flankiert ist. Die fange Wiederholung (RL) und die kurze Wiederholung (RS) sind unterschiedlich. Die einzigartige lange Region (UL) umfasst die Gene UL1 bis UL56, während die US-Region die Gene US1 bis US12 umfasst.
Eine relativ große Zahl von Patienten mit Krebs im fortgeschrittenen Stadium entwickeln metastatische Läsionen im Gehirn und im Rückenmark. Dies führt oftmals zu schweren und schwächenden neurologischen Komplikationen, wozu Kopfschmerzen, Lähmungserscheinungen, Krämpfe und beeinträchtigtes Bewusstsein gehören. Schätzungen zufolge sterben jedes Jahr 70.000 Menschen an Krebs mit metastatischen Läsionen im Zentralnervensystem (ZNS). Bestrahlung sowie Stereoide stellen gegenwärtig die wichtigsten Therapien dar, wenngleich sie nur palliativ sind und häufig beträchtliche neuropsychologische und endokrinologische Erkrankungsziffern zur Folge haben.
Die Viraltherapie zur Zerstörung von Tumoren ist keine neue Entwicklung. Effekte in verschiedenen experimentellen Tumorsystemen wurden nachgewiesen, wofür der Parvovirus H-1, der Newcastle-Krankheit-Virus, retrovirale Vektoren, die medikamentenanfällige Gene enthalten, und der Herpes simplex-Virus vom Typ I (HSV-1) verwendet wurden (2-7). Die Mechanismen, wodurch Viren das Ergebnis in experimentellen Tumorsystemen verbessern, sind komplex und sind noch immer nicht völlig geklärt. Gehirntumoren zeigen eine sich teilende Zellpopulation, die in einer im Wesentlichen sich nicht teilenden Zellpopulation von Trägerzellen auftritt, sowie terminal differenzierte Neuronen. Somit besteht im Zusammenhang mit der Therapie von Gehirntumoren ein Grundprinzip darin, ein Virus auszuwählen, das sich exklusiv oder vorzugsweise in sich teilenden Zellen repliziert. Ein solches Virus kann eine lytische Infektion ausschließlich in Tumorzellen im ZNS auslösen, was schließlich zur Zerstörung der Tumoren führt, ohne dass dabei umgebendes Gehirnmaterial infiziert wird und ohne dass dadurch schädliche Auswirkungen auf den Wirt die Folge sind.
Erste Versuche mit HSV zeigten eine dosisabhängige Verbesserung im Überleben von Nacktmäusen, die in Folge einer intratumoralen Therapie mit mutiertem HSV-1 dlspTK intracraniale menschliche Gliomen trugen (3). Dieser Virus hatte eine Deletion im viralen Thymidinkinase-Gen (TK) (8) und zeigte einen relativ neuro-geschwächten Phenotyp in Mäusen (9). dlspTK-Infektion von tumortragenden Tieren löst histologisch evidente Enzephalitis aus (3). Die Verwendung von TK-Mutanten des HSV-1 für eine Viraltherapie ist jedoch mit einem großen eigenen Nachteil behaftet, da diese Viren gegen die klinisch effektiven antiviralen Mittel Acyclovir und Ganciclovir resistent sind (10).
Die terminalen 1 kb der langen Wiederholungsregion (RL) von HSV-1- und HSV-2-Genomen enthalten ein Gen (11-13), das Neurovirulenz überträgt. Deletion oder Mutation dieses Gens (γ34,5) führt zu Varianten, die sich - wie auch Viren vom Wildtyp - auf sich teilenden Zellen vieler etablierter Zelllinien vermehren, aber eine beeinträchtigte Replikation auf sich nicht teilenden Zellen zeigen (12-14). Bei Mäusen können die γ34,5- Null-Mutanten sich nicht im Zentralnervensystem replizieren und verursachen auch keine Enzephalitis (12, 15-16).
Es wurde gezeigt, dass ein mutiertes HSV-1 mit dem Namen R3616, das eine 1000-Basenpaar-Deletion (bp) in γ34,5 mit einer LD&sub5;&sub0; (minimale Dosis eines Virus, die 50% der infizierten Tiere tötet) enthält, das zumindest um das 3 · 10³fache größer als der Wildtyp- Virus-Stamm F ist, von dem es abstammt (12), das Ergebnis bei Nacktmäusen mit intracranialen menschlichen Gliomen verbessert (17). In der vorliegenden Arbeit verwendeten die Erfinder einen mutierten HSV-1-Virus-Stamm 17 mit der Bezeichnung 1716, der eine 759 bp-Deletion in γ34,5 aufweist (16).
Die Konstruktion des mutierten Virus 1716 ist in der veröffentlichen Patentanmeldung Nr. WO92/13943 (PCT/GB92/00179) beschrieben, deren Inhalt durch Verweis hierin aufgenommen wurde. Diese Patentveröffentlichung bezieht sich jedoch nur auf die Verwendung der Mutante 1716 als Vakzine, entweder als solche oder als Vektor-Vakzine, die eine heterologe Genkodierung für ein Antigen umfasst.
Das Melanom ist eine weit verbreitete Malignität. Zerebrale Metastasen treten bei bis zu 75% der Patienten mit einer metastatischen Erkrankung auf und gehören zu den häufigsten Todesursachen (18-22). Gegenwärtig ist die Lebenserwartung von Patienten mit ZNS-Melanomen kurz, d. h. etwa 2 bis 7 Monate (23).
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine verbesserte Viraltherapie von Krebstumoren auf HSV-Basis bereitzustellen.

Offenbarung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung eines mutierten Herpes simplex-Virus, das im γ34,5-Gen der langen Wiederholungsregion (RL) so modifiziert wurde, dass das Gen nichtfunktionell ist, als Antikrebsmittel.
Spezifisch stellt die Erfindung die Verwendung eines mutierten Herpes simplex-Virus bereit, das ein nichtfunktionelles γ34,5-Gen in jeder langen Wiederholungsregion (RL) aufweist, zur Herstellung eines Medikaments bereit, das zur Behandlung eines metastatischen Tumors verwendet wird, der im Zentralnervensystem eines Säugetiers auftritt, aber nicht dort seinen Ursprung hat.
Weiters stellt die Erfindung die Verwendung eines mutierten Herpes simplex-Virus vom Typ 1 bereit, das ein nichtfunktionelles γ34,5-Gen in jeder langen Wiederholungsregion (RL) aufweist, was auf eine Deletion von 759bp im γ34,5-Gen zurückgeht, wobei dieses Virus bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Melanomkrebs in einem Säugetier seinen Einsatz findet.

Detaillierte Beschreibung

Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bedeutet "nicht-funktionell", dass das Gen mittels Deletion, Insertion oder Substitution (oder einer anderen Änderung in der DNA- Sequenz, wie z. B. einer Umordnung) so modifiziert wurde, dass nicht das normale Produkt oder ein funktionell äquivalentes Produkt exprimiert wird. Die Auswirkung dieser Nicht-Funktionalität des Gens besteht darin, dass die Neurovirulenz des Virus auf den Patienten im Wesentlichen entfernt ist.
Somit basiert die Erfindung auf dem Ergebnis, dass dadurch, dass das γ34,5-Gen nichtfunktionell gemacht wird, ein mutiertes HSV bereitgestellt wird, das insbesondere in der Zerstörung von sich teilenden Tumorzellen effektiv ist, während gleichzeitig das mutierte HSV sich nicht in normalen Zellen, die nicht von Krebs befallen sind, repliziert. Somit verfügt es über das Potential, eine sichere Behandlung von Krebs bereitzustellen.
Vom Herpes simplex-Virus sind zwei Typen bekannt: HSV-1 und HSV-2. Beide können gemäß vorliegender Erfindung zur Bereitstellung eines mutierten HSV dienen. Rekombinante Typen, die DNA von beiden Typen enthalten, können ebenfalls verwendet werden.
Die Modifikationen können an jedem beliebigen Punkt im γ34,5-Gen erfolgen, und ein solcher Punkt entspricht im Allgemeinen einer Enzym-Restriktionsstelle. Die Modifikation kann innerhalb des Bam-H1-s-Restriktionsfragment der RL-terminalen Wiederholung erfolgen (entsprechend 0-0,02 und 0,81-0,83 mu). Die Modifikation ist gewöhnlich eine Deletion von 0,1 bis 3 kb, insbesondere 0,7 bis 2,5 kb. In der vorliegenden Arbeit wurde eine 759 bp-Deletion im γ34,5 in der HSV-1-Mutante durchgeführt, die als 1716 bezeichnet wird.
Das HSV-Genom umfasst auch eine Anzahl anderer Gene, die für die erfolgreiche Kultivierung des Virus nichtessentiell sind. Natürlich ist es wichtig, in der HSV-Mutante die Fähigkeit zu erhalten, die Mutante so zu kultivieren, dass die Mutante selbstreplizierend ist und Stämme der Mutante in Gewebekultur gezüchtet werden können. Letale Modifikationen des Genoms, welche die Kultivierbarkeit der HSV-Mutante beseitigen, sind nicht akzeptabel.
Zusätzlich zur primären Modifikation am γ34,5-Gen der RL-Region ist es von Vorteil, eine oder mehrere, sekundäre, nichtletale Modifikationen innerhalb nichtessentieller Gene in der HSV-Mutante vorzunehmen.
Die vorliegende Erfindung umfasst als neues Produkt auch eine HSV-Mutante, die zusätzlich zur primärem Modifikation auch noch eine sekundäre, nichtletale Modifikation umfasst (z. B. im Vmw65). Die Mutante kann von HSV-1 oder HSV-2 abstammen.
Auf ähnliche Weise können andere sekundäre Modifikationen eine Modifikation des Latenz-assoziierten Transkript- (LAT-) Promotors umfassen, um auf diese Weise den Promotor nichtfunktionell zu machen und seine Transkription zu verhindern.
Das Herpes simplex-Virus infiziert das Gehirn und das Nervensystem. Die HSV-Mutante wirkt gegen primäre Tumoren, die im Gehirn und Nervensystem entstehen, ist aber besonders gegen metastatische Tumoren zweckdienlich, falls sich Krebszellen, die anderswo entstehen, im Gehirn oder Nervensystem (insbesondere im Zentralnervensystem (ZNS)) angesiedelt haben. Gehirnmetastasen treten allgemein häufig in einer Vielzahl von menschlichen Krebsformen (z. B. Melanomen) auf, und zur Zeit enden diese Fälle noch tödlich. Die Wirksamkeit einer Behandlung gemäß der Erfindung, die die HSV- Mutante anwendet, hängt von der Zeitspanne nach dem Ausbrechen des Tumors ab, nach welcher die Behandlung ihren Anfang genommen hat, wobei die Effizienz aber durch eine frühe Behandlung innerhalb von beispielsweise 1 bis 20 Tagen verbessert wird.
Die LD&sub5;&sub0; (minimale Virusdosis, die 50% der infizierten Tiere tötet) der 1716-Mutante ist in Bezug auf Mäuse um das 10&sup6;fache höher als jene des Virus vom Wildtyp 17&spplus;, von dem sie abstammt. Somit ist die Neurovirulenz von 1716 in Bezug auf das Wildtyp- Virus im Wesentlichen entfernt.
Die effektive, nicht-toxische Dosis der HSV-Mutante kann mittels einer routinemäßigen Untersuchung durch den Fachmann bestimmt werden und ist von einer Anzahl von Faktoren abhängig, einschließlich der jeweiligen Spezies des Säugetiers und dem Entwicklungsausmaß des Tumors. Aus den hierin angeführten Beispielen kann eine Leitlinie erhalten werden.
Die Erfindung kann in einem Verfahren zur Krebsbehandlung bei Säugetieren verwendet werden, insbesondere bei Menschen, wobei den Säugetieren, insbesondere Menschen, eine pharmazeutische Formulierung verabreicht wird, die die HSV-Mutante umfasst. Somit kann das Behandlungsverfahren die Verabreichung einer pharmazeutischen, die HSV-Mutante umfassenden Formulierung umfassen, indem diese direkt in den Tumor oder parenteral in den Blutstrom, der zum Tumor führt, injiziert wird.
Sie wird üblicherweise als pharmazeutische Formulierung dargeboten, die für gewöhnlich einen Träger oder Arzneimittelträger umfasst, wie z. B. einen injizierbaren Träger wie etwa Kochsalzlösung oder apyrogenetisches Wasser. Die Formulierung kann durch herkömmliche Mittel hergestellt werden.
Ausführungsformen der Erfindung werden nachfolgend nur beispielhaft beschrieben.
Die Fig. 1 und 2 zeigen die Ergebnisse von Versuchen, die in den Beispielen 3 bzw. 5 vollständig beschrieben werden.

Fig. 1: Überlebenskurven

Tumor-tragende Mäuse, denen nach 10 (Fig. 1a) und nach 5 Tagen (Fig. 1b) eine Post- Tumor-Injektion mit der HSV-1-Mutante 1716 injiziert wurde.

Fig. 2 Relative Replikationskurven der HSV-1-Mutante

Relative Replikationskurven der HSV-1-Mutante 1716 im Gehirntumor (volle Quadrate); und von 1716 und vom Wildtyp 17&spplus; im Gehirn ohne Tumor (leere Quadrate bzw. volle Dreiecke).

Fig. 3: HSV-1-Genomkarte

HSV-1-Genom, das die ungefähre Position von γ34,5, 2kb Latenz-assoziiertem Transkript- (LAT-) und benachbarten Genen zeigt. A. Das 152kb-HSV-1-Stamm-17&spplus;-Genom, das die einzigartig langen und kurzen Segmente des Genoms veranschaulicht, UL und US (Linien), und durch interne (IR) und terminale (TR) Wiederholungsregionen (leere Kästchen) gebunden ist. Schraffierte Markierungen zeigen die Stelle von VP16-, Thymidinkinase- (TK) und Glykoprotein C-Genen (gC). B. Vergrößerte Ansicht der UL/US-Region des Genoms, dessen Position von γ34,5, ICPO und ICP4-mRNAs und dessen Position des 2,0kb-LAT während akuter und latenter Infektion exprimiert wird. C. Position der 759 bp-Deletion in Stamm 1716. D. Die Position der LAT-spezifischen BstEII-BstEII- Sonde, die für die In-situ-Detektion der HSV-spezifischen Genexpression verwendet wird. Nukleotidpositionen basieren auf der DNA-Sequenz-Analyse nach Perry und McGeoch (45).

Fig. 4: Quantifizierung des infektiösen Virus im Gehirn von Nacktmäusen nach Beimpfung.

Um das Ausmaß der Stamm 1716-Replikation in Gehirntumoren zu untersuchen, wurden Nacktmäusen NT2-Zellen injiziert. 12 Tage später wurde jede Maus mit 5 · 10&sup5; PFU von Stamm 1716 an denselben stereotaktischen Koordinaten infiziert (leere Kreise). Zu den angezeigten Zeitpunkten wurden die Mäuse getötet, die Gehirne wurden in flüssigem N&sub2; gefroren und bei -70ºC gelagert. Proben wurden rasch aufgetaut, homogenisiert, und es erfolgte eine dreifache virale Titration auf BHK-Zellen. Um die Wachstumscharakteristiken von Stamm 1716 und parenteralem 17&spplus; in einem Gehirn ohne Tumor festzulegen, wurde den Mäusen intracranial entweder 5 · 10&sup4; PFU 1716 (volle Kreise) oder 1 · 10&sup6; PFU 17&spplus; (volle Dreiecke) injiziert. Die Mäuse wurden zu den angezeigten Zeitpunkten getötet und wie in den Verfahren beschrieben weiter bearbeitet. Jeder Punkt ist das Mittel aus 2 Mäusen mit SEM-Balken.

Fig. 5: Detektion eines sich replizierenden Virus mittels Immunhistochemie und In-situ- Hybridisierung

Nacktmäusen wurde IC 3 · 10&sup4; NT2-Zellen injiziert. 14 Tage später wurden sie mit 5 · 105 PFU 1716 beimpft. A. Kontrollmäuse mit Tumor nach 14 Tagen. B. Tumor ist histologisch gesehen sehr unterschiedlich, Pfeile: tubulare Strukturen. C. MOC-1-Antikörper identifiziert spezifisch die NT2-Tumorzellen. D. Antikörper MIB-1 identifiziert Zykluszellen. Die niedrige Anzahl an markierten Zellen in den tubularen Strukturen (Sternchen) ist beachtenswert. E. 14 Tage Tumor nach drei Tagen der Infektion mit Stamm 1716. Der Pfeil zeigt eine Region von extensiver Tumorlyse und Nekrose an. F. Infizierte Zellen zeigen charakteristische Eigenschaften herpesinfizierter Zellen, so z. B. Bildung intranuklearer Einschlusskörper, Cytomegalie und Nekrose. G. Herpes-Antigen ist auf Tumorzellen beschränkt. H. Virus repliziert in Tumorzellen an der Grenzfläche zwischen Tumor und Gehirn des Wirtes, was unter Verwendung von Anti-HSV-Antikörpern gezeigt wird. I. Die Kinetik der viralen Replikation ist 3 Tage nach Infektion in den tubularen Strukturen im Vergleich zu den umgebenden nicht-tubularen Zellen verzögert, wie dies mittels Anti-HSV-Antikörper gezeigt ist. Der Pfeil zeigt eine seltene HSV-Antigenpositive tubulare Zelle an. Diese tubularen Strukturen werden Tage später nach der Infektion lysiert. J. Die Herpes-Gen-Expression ist auch durch In-situ-Hybridisierung (schwarze Körnchen) auf den Tumor beschränkt. K. und L. Das Virus vom Wildtyp (17&spplus;) repliziert in Gehirn und Tumor und breitet sich über das gesamte Gehirn aus. M. H&E eines 14 Tage alten Tumors 18 Tage nach der Infektion mit Stamm 1716. Die geringe Größe des Tumors ist beachtenswert. N. virales Antigen und O. virale Genexpression sind bemerkenswerterweise auf die Restmasse des Tumors beschränkt. Abkürzungen: T = Tumor, B = Gehirn des Wirts (Maße: Balken: = 1,2 mm in A; = 62,5 um in B, C, D; = 2,0 mm in E&G; = 12 um in F; = 450 um in H, M, N, O; = 90 um in I; = 200 um in J; = 900 um in K und L).

Fig. 6: MRI-Analyse behandelter und unbehandelter NT2-Tumoren.

Nacktmäusen wurde stereotaktisch 3 · 10&sup4; NT2-Zellen injiziert und 11 Tage später (d11 Posttumor-Zellenimplantation) T1 gewogen, wobei mit Gadolinium verbesserte MRIs (A, E) durchgeführt wurden. Das Vorhandensein eines Tumors (T) wird durch die weiße, sich verstärkende Läsion bestätigt, die in der oberen rechten Hälfte in diesen Mäusen auftrat. Diese Schnitte zeigen den Bereich der maximalen Tumormasse im Querschnitt. Am darauffolgenden Tag wurden diese Mäuse entweder mit 5 · 10&sup5; PFU Stamm 1716 oder mit Kulturmedium beimpft. In den Kontrollmäusen wuchs der Tumor mit der Zeit weiter, und das IC-Volumen erhöhte sich in einer dramatischen Weise (B: Tag 31 posttumor; C & D: Tag 41 post-tumor). In Mäusen, die mit Stamm 1716 behandelt worden waren, bildete sich der Tumor zurück und war in lebendigen Tumorzellen oder im Virus im Gehirn nicht feststellbar (F & G: Tag 36 post-tumor), (Messbalken: = 2,77 mm in D & G).

Fig. 7: Elektronenmikroskopie

Tumoren von Nacktmäusen, die mit Stamm 1716 beimpft oder Mock-beimpft wurden, wurden geerntet und zum Zweck einer Elektronenmikroskopie verarbeitet. A. Elektronenmikrofotografie oder nicht-infizierte Tumorzellen. B: EM von NT2-Tumorzellen im Frühstadium der Infektions-DNA-Kondensation und virale Domänen (leerer Pfeil) können beobachtet werden; C: NT2-Tumorzellen in einem späten Stadium der Infektion, begrenzte Chromatin- (*) und virale Teilchen (Pfeilspitze) können beobachtet werde; D: Eine sich teilende Zelle, die infiziert ist, Pfeil: Nuklearmembran, c. Cytoplasma, N: Nukleus (Originalvergrößerungen 2500fach).

Fig. 8: Verlängertes Überleben von Mäusen mit NT2-Tumoren, die mit Stamm 1716 behandelt wurden

A: Überlebensexperiment (Tabelle 1, Studie V) - 30 Nacktmäusen wurde stereotaktisch 5 · 10&sup5; NT2-Zellen injiziert. 12 Tage später wurde 10 Nacktmäusen stereotaktisch 5 · 10&sup5; PFU 7 5 uk Stamm 1716 (behandelt, durchgezogener Kreis) injiziert, während 10 Mäuse mit 5 ul eines viralen Kulturmediums (Mock, durchgezogenes Dreieck) beimpft wurden. B: Überlebensexperiment (Tabelle 1, Studie VI) - 17 Nacktmäusen wurde stereotaktisch 3 · 10&sup4; NT2-Zellen injiziert. 10 Tage danach wurden 9 Mäusen stereotaktisch 5 · 10&sup5; PFU/5 ul Stamm 1716 (behandelt, durchgezogener Kreis) injiziert, während 8 Mäusen 5 ul eines viralen Kulturmediums (Mock, durchgezogenes Dreieck) injiziert wurde. C: Gewichtsdiagramm - Gewichte der Kontroll- (durchgezogenes Dreieck) und der behandelten Mäuse (durchgezogene Kreise) von Studie VI (Tabelle 1; Fig. 6B). D: Gewicht der behandelten Gruppe, die in Langzeit-Überlebende (HR, durchgezogener Kreis) und Tote (LR, durchgezogenes Quadrat) im Vergleich zu nur mit Stamm 1716 behandelten Mäusen getrennt wurde (Studie 1, Tabelle 1; durchgezogenes Dreieck). Balken der mittleren Standardfehler (SEM) sind inkludiert.

Fig. 9: Detektion des Virus in Langzeit-Überlebenden mittels Immunhistochemie und In- situ-Hybridisierung

Langzeit-Überlebende wurden getötet, und Gehirne und andere Organe wurden fixiert, Schnitte und zur immunhistochemischen Detektion von NT2-Zellen und HSV sowie zur In-situ-Hybridisierung von HSV verwendet. A: Der Pfeil identifiziert Restnarben an der Stelle der Tumorimplantation. B: Histologisch sind am Gehirn keine Tumorzellen (Pfeile) oder ein replizierendes Virus nachweisbar. C: Die Stelle der Restnarbe besteht aus dystrophischen Kalkablagerungen. Dies ist eine kräftigere Ansicht einer Region, die in B mittels Pfeil identifiziert wurde. D: Es wurde ein latenter Virus im Hippocampus (Sternchen) dieser Überlebenden (4 Monate nach der Infektion) beobachtet, und der Einsatz zeigt das nuklear lokalisierte Signal von LAT-positiven Zellen. E: MBP-Färbung zeigte keine Demyelierung im gesamten Gehirn dieser Mäuse. F: Dunkelfeld-Mikrofotografie von in situ durchgeführter Hybridisierung unter Verwendung einer radiomarkierten Poly(dt)-Sonde, um die gesamte Poly (A)&spplus;RNA in Zellen als Maß der metabolischen Gesundheit der LAT-positiven Zellen (Sternchen) nachzuweisen. Das Versuchsgewebe (A Serienschnitt von 1 D) wurde mit nicht-infiziertem, Mock-infiziertem und PNAse-behandeltem Gewebe verglichen. Es gab keinen nachweisbaren Unterschied im Signal im LAT-positiven Bereich in angrenzenden seriellen Abschnitt (Messbalken: = 1,2 mm in A, B, E; = 113 um in D und -90 um im Einsatz; = 113 um in F; = 45 mm in C).

Beispiele - Abschnitt 1

Materialien und Verfahren

Tiere:

Weibliche C57B1/6-Mäuse (4-6 Wochen alt, Gewicht etwa 20 g) wurden vom Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) erhalten.

Tumorzellen:

S91-Cloudman-Melanomzellen wurden von der ATCC (Rockville, MD) erhalten. B 16- und Harding-Passey-Melanomzellen wurden als großzügiges Geschenk von Dorothee Herlyn (Wistar Institute, Phila, PA) erhalten. Die Zeilen wurden in Kunststoffkolben in AUTO-POW-Medien, die Penicillin, Streptomycin und 5% Kälberserum enthalten, gezüchtet. Zum Zeitpunkt, zu dem sie ursprünglich erhalten wurden, waren alle Zelllinien gezüchtet und danach in 95% Kälberserum/5% DMSO gefroren, damit alle Experimente mit den Zellen einer ähnlichen Durchgangsnummer initiiert werden konnten. Am Tag der intracranialen Injektion wurden Zellen in subkonfluenter Monolayer-Kultur mit 0,25 % Trypsinlösung in EDTA durchgeschickt, danach wurden sie · 1 in einem Zellkulturmedium gewaschen, in einer passenden Konzentration im Medium ohne Serum resuspendiert und schließlich auf Wasser gehalten.

Intracraniale Tumorproduktion:

Die Mäuse wurden mit I. M. Ketamin/Xylazin (87 mg/kg Ketamin/13 mg/kg Xylazin) anästhesiert. Der Kopf wurde mit 70% EtOH gereinigt. Ein kleiner Schnitt an der Mittellinie wurde in der Kopfhaut ausgeführt, wodurch der Schädel freigelegt wurde. Es erfolgte eine stereotaktische Injektion einer Tumorzellensuspension, wobei eine kleine stereotaktische Vorrichtung, die für Tiere geeignet ist, verwendet wurde (Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA). Injektionen wurden mit einer Hamilton-Spritze durch eine Einweg-Nadel für 28 g durchgeführt. Die Nadel wurde an einem Punkt 2 mm kaudal vom Scheitel und 1 mm links der Mittellinie angesetzt. Es wurde eine getrennte 27 g-Nadel mit einem Schutz verwendet, der die Länge der exponierten Nadel auf 0,5 mm begrenzt, um den Schädel an den geeigneten Koordinaten zu durchstoßen. Die Injektionsnadel wurde durch das Loch im Schädel bis in eine Tiefe von 2 mm von der Schädeloberfläche vorgeschoben und danach 0,5 mm zurückgezogen, um einen möglichen Raum zu erzeugen. 1 · 10&sup5; Zellen in einem Gesamtvolumen von 2 ul wurden während 1 Minute injiziert. Nach der Injektion wurde die Nadel 3 Minuten lang an Ort und Stelle belassen und anschließend langsam zurückgezogen. Die Haut wurde daraufhin wieder zugenäht.

Virus:

Um Virenstämme zu erzeugen, wurden subkonfluente Monoschichten einer Babyhamsternieren 21-Klons 13 (BHK-Zellen) mit den HSV-Stämmen in 1814, 1716, dlspTK oder Wildtyp 17&spplus; injiziert. Das Virus wurde aus der Kultur konzentriert und mittels Plaquetest, wie dies bereits zuvor beschrieben wurde, titriert (28). Alle viralen Stämme wurden im gefrorenen Zustand in einem viralen Kulturmedium (AUTO-POW-Medium, das Penicillin und Streptomycin enthielt) bei -70ºC gelagert und erst kurz vor ihrer Verwendung rasch aufgetaut.

Viren-Beimpfung:

Die Mäuse wurde mit I. M. Ketamin/Xylazin anästhesiert, und der Kopf wurde mit 70% EtOH gereinigt. Es wurde eine Hamilton-Spritze mit einer Einweg-Nadel von 30 Gauge verwendet, um die geeignete Menge des Virus (10&sup4;-10&sup6; PFU in 2 ul) durch einen Mittellinienschnitt an denselben stereotaktischen Koordinaten zu injizieren, die für die Injektion der Tumorzellen verwendet worden war. Die Injektion erfolgte über eine Zeitspanne von 1 Minute, wonach die Nadel 3 Minuten an Ort und Stelle verblieb und im Anschluss daran langsam zurückgezogen wurde.

Magnetresonanzabbildung (MRI):

Die Mäuse wurden abgebildet, wobei ein 1,9 Tesla-MRI-System für Tiere mit einer 30 cm Bohrung verwendet wurde, das zur MRI-Einrichtung des Spitals der University of Pennsylvania gehört. Die Tiere wurden mit I.M. Ketamin/Xylazin (87 mg/kg Ketamin/13 mg/kg Xylazin) anästhesiert. Danach wurden jedem Tier 10 Einheiten Gd(DTPA) über eine Schwanzvene injiziert. Das Tier wurde in einer Gradientspule festgebunden und abgebildet.

Immunhistochemie:

HSV-infizierte Zellen wurden durch ein indirektes Avidin-Biotin-Immunperoxidase-Verfahren (Vectastain ABC Kit, Vector Labs, Burlingam, CA, USA), wie vom Hersteller angegeben, mit leichten Modifikationen detektiert. Kurz gesagt wurden Gewebeschnitte entparaffiniert, rehydriert, in Peroxid (H&sub2;O&sub2;) gequencht und in 3,5% Ziegenserum (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO, USA) blockiert. Gewebeschnitte wurden über Nacht bei 4 ºC mit dem primären Antikörper, einem Kaninchen-Antiserum gegen HSV-1 (Dako Corp., Carpinteria, CA, USA), das in einer Verdünnung von 1 : 1.000 verwendet wurde, inkubiert. Danach wurde das Gewebe bei Raumtemperatur mit biotinyliertem Ziege- Anti-Kaninchen-IgG, dem Avidin-Biotin-Meerrettich-Peroxidasekomplex und schließlich einem AEC-Substrat inkubiert. Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin gegengefärbt und unter dem Lichtmikroskop untersucht. Als Kontrolle für die Spezifität der Immunfärbung wurden Gewebe wie oben bearbeitet, nur dass nicht-immunes Kaninchenserum gegen das primäre HSV-1-Antiserium ausgetauscht wurde.

Titration des Virus aus Tumor und Gehirn:

Die Mäuse wurden mit einer tödlichen Anästhesierungsinjektion getötet. Gehirn mit oder ohne In-situ-Tumore wurden aseptisch entfernt, schnell in flüssigem Stickstoff gefroren und bei -70ºC gelagert. Jede Gewebeprobe wurde rasch in einem Wasserbad mit einer Temperatur von 37ºC aufgetaut, und das Gewebe wurde in einem Viren-Kulturmedium in einem Verhältnis von 10% Gewicht/Volumen homogenisiert, wobei eine Pyrex Ten-Broeck-Gewebemühle verwendet wurde. Die Homogenate wurden bei 3.000 g und 4ºC 10 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand jedes Gewebehomogenats wurde logarithmisch im Medium verdünnt, und der virale Titer jedes Überstandes wurde mittels Plaquetest auf BHK-Zellen bestimmt (28).

Statistik:

Standardabweichung und t-Test: zwei Proben, von denen ungleiche Varianzen angenommen wurden, wurden unter Verwendung von Microsoft Excel (Redmond, WA, USA) auf einem Apple-McIntosh-Computer (Cupertino, CA, USA) berechnet.

Beispiel 1 (Lyse von Melanomzellen)

In den Anfängen ihrer Studien wollten die Erfinder der vorliegenden Erfindung eine direkte in vitro-Bestimmung der relativen Fähigkeiten von HSV-1 vom Wildtyp und von mutierten Viren, verschiedene Murinmelanomzellen zu lysieren, erhalten. Sie wollten auch vergleichen, wie effizient diese Melanomzellen lysiert wurden, indem sie mit HSV-1-BHK-Zellen (Babyhamsternieren-Zellen) lysiert wurden, die eine Standardzelllinie sind und dazu verwendet werden, HSV-1 zu propagieren und titrieren. Die Zellen wurden in Gewebekulturplatten mit 24 Näpfen in einer Dichte von 5 · 10&sup4; Zellen/Napf ausplattiert. Die Viren wurden logarithmisch verdünnt, und die Zellmonoschichten wurden dreifach infiziert. Nach 72-stündiger Kultivierung wurde die höchste Verdünnung des Virus, bei welcher eine vollständige Zerstörung der Monoschicht immer noch erfolgte, für jede Virus-Zellen-Kombination aufgezeichnet. Die Daten sind als Anzahl von Virus-PFU ausgedrückt und wurden für jede Virus-Zellen-Kombination erhalten.
Wie in Tabelle 1 veranschaulicht lysieren die verschiedenen mutierten Viren Melanomzellen und BHK mit einer Effizienz, die der vom Wildtyp 17&spplus; ähnelt. Cloudman S-91- und H-P-Melanomzellen wurden effizient mit Bezug auf BHK lysiert.

Beispiel 2 (Tumorproduktion)

Die Fähigkeit jeder Melanomzelllinie zur Erzeugung von intracranialen Tumoren wurde daraufhin bewertet. Für jede Zelllinie wurden 10 C57B1/6-Mäusen stereotaktisch 5 · 10&sup4; Zellen in die rechte Gehirnhälfte injiziert. Die Mäuse wurden täglich beobachtet und schließlich getötet, wenn sie einen sterbenden Eindruck machten oder nach 6 Wochen, wenn sie asymptomatisch blieben. Jedes Gehirn wurde fixiert, geschnitten, gefärbt und histologisch auf einen Tumor untersucht. Sowohl H-P als auch B-1b bildeten intracraniale Tumoren in 10 von 10 C57B1/6-Mäusen, während Cloudman S-91 nur 1 Tumor in 10 Mäusen bildete.
Die Erfinder haben sich daraufhin entschlossen, mit dem H-P-Modell weiterzumachen, da dieses Zellen nicht nur für eine Lyse durch die relevanten HSV-1-Mutanten anfällig waren sondern auch in effizienter Weise Gehirntumoren bildeten.
Nachfolgende Versuche bestätigten, dass die stereotaktische Injektion von H-P-Zellen in das Gehirn von C57B1/6-Mäusen bei 100% der Tiere Tumoren auslöste. Ein technischer Vorteil dieses Systems besteht darin, dass das Vorhandensein eines Gehirntumors mittels Magnetresonanzabbildung (MRI) vor der Behandlung oder einfach durch Beobachtung eines pigmentierten Bereichs auf dem Schädel, der über der Tumorstelle liegt, im Allgemeinen 5 Tage noch der Zelleninjektion bestätigt werden kann. Die Tumoren vergrößerten sich so sehr, dass die Mäuse nach etwa 2 Wochen aufgrund neurologischer Symptome im Sterben lagen.

Beispiel 3 (Behandlung von Gehirntumoren mit der HSV-1-Mutante 1716)

C57B1/6-Mäusen wurde stereotaktisch in die rechte Gehirnhälfte 5 · 10&sup4; Harding-Passey'sche Melanomzellen injiziert. Nach 10 Tagen (Fig. 1a) oder nach 5 Tagen (Fig. 1b) wurden 5 · 10&sup5; PFU HSV 1716 an denselben stereotaktischen Koordinaten injiziert. Die Anzahl an Tagen zwischen der Injektion der Tumorzellen und dem Zeitpunkt, an dem die Mäuse zu sterben begannen, ist auf der X-Achse dargestellt. Kontrollmäusen wurde ein gleiches Volumen eines viralen Kulturmediums zu geeigneten Zeitpunkt injiziert.
Wie in Fig. 1a abgebildet ist, führte die stereotaktische Injektion der HSV-1-Mutante 1716 in Gehirntumoren 10 Tage nach deren Bildung dazu, dass sich die Zeitspanne bis zum Tod der Mäuse statistisch gesehen beträchtlich verlängerte (P(T < = t) one-tail: 1,016 · 10&supmin;&sup4;).
Es konnten jedoch keine Langzeit-Überlebenden erhalten werden. Erfolgte 5 Tage nach Tumorbildung eine Viraltherapie (Fig. 1b), so wurde erneut beträchtliche Verbesserung im Ergebnis der Behandlungsgruppe nachgewiesen (P(T < = t), one-tail: 7,707 · 10&supmin;³) und 2/10 der behandelten Mäuse konnten geheilt werden. Ein Langzeit-Überlebender wurde am Tag 39 nach der viralen Infektion getötet. Eine mikroskopische Untersuchung serieller Schnitte des Gehirns zeigte keine Tumorrückstände (Daten nicht dargestellt). Das zweite Tier lebt noch immer und ist mehr als 150 Tage nach der Behandlung immer noch asymptomatisch. Behandelte Tiere, die dennoch starben, zeigten nach Untersuchung der Gewebeschnitte ein fortschreitendes Tumorwachstum im Gehirn.

Beispiel 4 (1716 Replikation in Tumor- und Nicht-Tumorzellen)

Die Immunhistochemie zeigt, dass die Replikation von 1716 tatsächlich auf Tumorzellen beschränkt ist und nicht im umgebenden Gehirn auftritt. Eine beträchtliche Anzahl an Melanomzellen im Tumor wurde mittels polyklonalem Antiserum gegen HSV-1 an den Tagen 3 und 5 nach Infektion gefärbt. Darüber hinaus wurde in Mäusen mit Tumoren, die mit 1716 behandelt wurden, keine HSV-1-Antigen-Färbung im Gehirngewebe, das an den Tumor angrenzt, oder in anderen Bereichen des Gehirns in allen untersuchten Schnitten nachgewiesen. Zusätzlich dazu gab es zu keinem Zeitpunkt einen histologischen Nachweis von Enzephalitis in den mit 1716 behandelten Mäusen. Im Gegensatz dazu zeigten Mäuse mit Tumor, die mit dem Virus vom Wildtyp 17&spplus; infiziert worden waren, zahlreiche fokale Bereiche einer HSV-1-immunhistochemischen Färbung sowohl im Tumor als auch in umgebenden wie auch entfernten Bereichen des Gehirns. Eine bedeutsame Enzephalitis, die durch polymorphonukleare Leukozyten, Nuklearstaub und Extravasation von roten Blutkörperchen gekennzeichnet ist, ist in Bereichen dieser und anderer untersuchter Schnitte zu sehen. In Kontrollversuchen wurde keine immunhistochemische Färbung mit Anti-HSV-1 im Tumor oder im Gehirn von Mäusen nachgewiesen, die das Virus nicht aufgenommen hatten, oder in viral infizierten Gehirntumorschnitten, die einem vollständigen immunhistochemischen Verfahren mit normalen Kaninchenserum unterzogen wurden, das für den primären Anti-HSV-1-Antikörper substituiert wurde (Daten nicht dargestellt).

Beispiel 5 (Replikationskinetik in Tumor- und Nicht-Tumorzellen)

Nachdem beeindruckende Einschränkungen auf die 1716-Replikation auf Tumoren mittels Immunhistochemie nachgewiesen worden waren, versuchten die Erfinder als nächstes, Kinetik und Ausmaß der Replikation von 1716 im Tumor mittels Titration des infektiösen Tumors zu quantifizieren und dies mit den Titrationsdaten von Mäusen ohne Tumor, die mit 1716 oder 17&spplus; infiziert wurden, zu vergleichen.
Um das Ausmaß der 1716-Replikation in Gehirntumoren zu untersuchen, wurde C57B1 /6-Mäusen Harding-Passey'sche Melanomzellen rechts der Mittellinie injiziert. Sieben Tage später wurde jeder Maus 5 · 10&sup5; PFU 12716 an denselben Koordinaten injiziert. Zu den angezeigten Zeitpunkten wurden die Mäuse getötet, die Gehirn wurde in flüssigem N&sub2; gefroren und bei -70ºC gelagert. Proben wurden rasch aufgetaut, homogenisiert, und es erfolgte eine dreifache virale Titration auf BHK-Zellen (volle Quadrate). Diese Daten stellen das Mittel von 4 Mäusen zu jedem Zeitpunkt dar.
Um die Wachstumscharakteristiken von 1716 und dem Wildtyp 17&spplus; im Gehirn ohne Tumor festzuhalten, wurde den Mäusen intracranial entweder 5 · 10&sup5; PFU 1716 (leere Quadrate) oder 1 · 10³ PFU 17&spplus; (volle Dreiecke) injiziert. Die Mäuse wurden zu den angegebenen Zeitpunkten getötet und, wie zuvor beschrieben, bearbeitet. Jeder Punkt ist das Mittel von 2 Mäusen.
Wie in Fig. 2 dargestellt replizierte das Virus vom Wildtyp 17&spplus; effizient in Mäusen, die keinen Tumor aufwiesen. Im Gegensatz dazu gab es keine Replikation von 1716 im Gehirn von Mäusen ohne Tumor. Der Titer des Virus verschlechterte sich mit der Zeit, und infektiöses 1716 konnte nur 3 Tage lang nach der Beimpfung isoliert werden. Wurde jedoch 1716 in Gehirntumoren injiziert, erfolgte beträchtliche Replikation, wie dies durch Gewinnung einer Menge an infektiösem 1716 am Tag 1 nach der Beimpfung nachgewiesen wurde, die wesentlich größer als die Eingangsmenge dessen ist. Unter diesen Umständen konnte infektiöses 1716 von Mäusen mit Tumor 5 Tage lang nach der Beimpfung isoliert werden, nicht hingegen an Tag 7. Diese Ergebnisse zeigen sehr deutlich, dass die HSV-1-Mutante 1716 frei in Tumorzellen repliziert (was letztendlich zu ihrer Zerstörung führt), aber nicht in Nicht-Tumorzellen repliziert (und diese somit nicht angreift). Tabelle 1: Relative Anfälligkeit von Melanomzellen auf Lyse durch HSV-1

Beispiele - Abschnitt 2

Materialien und Verfahren

Virenmaterial

Um Virenmaterial zu erzeugen, wurden subkonfluente Monoschichten aus Klon 13-Zellen einer Babyhamsterniere (BHK) mit HSV-Stämmen 1716, in 1814 oder parenteralem 17&spplus; infiziert. Stamm in1814 weist eine Mutation (Insertion) im VP16-Gen (in der Ut-Region; Fig. 3A) und Stamm 1716 eine Mutation (Deletion) im γ34,5-Gen (Mutante; Fig. 3C) auf. Das Virus wurde aus der Kultur konzentriert, auf BHK-Zellen mittels Plaquetest titriert und bei -70ºC in 0,5 ml Aliquoten einem Viren-Kulturmedium (AUTO-POW- Medium, das Penicillin und Streptomycin enthielt) gelagert und rasch unmittelbar vor seiner Verwendung aufgetaut, wie dies beschrieben wurde (30, 34).

Kultivierung von Tumorzellen und Differenzierung von NT2

Ntera-2- (Klon D1-) Zellen (hierin nachfolgend als NT2-Zellen bezeichnet) wurden wie beschrieben kultiviert (28, 29). Kurz gesagt wurden diese Zellen zwei Mal pro Woche 1 : 3 OptiMEM mit 5% Rinderfötenserum (FBS) und Penicillin/Streptomycin (P/S) ausgesetzt. Die Medulloblastom-Zelllinien D283 MED und DAOY wurden in RPMI 1640 mit 10% FBS, 1% P/S und 1% Glutamin kultiviert. BHK-Zellen wurden in AUTO-POW mit 5% FBS, 1% P/S und 1% Glutamin kultiviert. NT2-Zellen wurden in einer Dichte von 2,0 · 10&sup6; in T75-Kolben ausplattiert und zwei Mal wöchentlich mit DMEM-HG, das mit 10% FBS, 1% P/S und 10-5 M Retinolsäure ergänzt wurde, 5 Wochen lang ernährt. Die differenzierten NT2N-Zellen wurden von den nicht-neuronalen Zellen wie beschrieben (29, 35) getrennt. Am Tag der intracranialen Injektion wurden NT2-Zellen in subkonfluenter Monoschichtkultur geerntet, drei Mal in einem Puffer gewaschen und auf einem Eisbett angeordnet, bis sie in das Gehirn von Nacktmäusen injiziert wurden.

Plaquetest

NT2-, BHK-, DAOY- und D283-MED-Zellen wurden in Gewebekulturplatten mit 24 Näpfen in einer Dichte von 105 Zellen/Napf ausplattiert. Die Viren von Interesse wurden logarithmisch verdünnt und Zellmonoschichten wurden dreifach mit einer Multiplizität der Infektionen (MOI) von 10 bis 0,01 infiziert. Die Kulturen wurden regelmäßig auf den Grad der cytopathischen Effekte (CPE) der Viren für jede MOI untersucht und dieser festgehalten.

Titration des Virus aus Zellkulturen

Die Zellen wurden mit MOI = 1 infiziert, 4, 24 und 48 Stunden nach der Infektion geerntet und bei -70ºC gelagert. Die Proben wurden zwei Mal bei -70ºC eingefroren und bei 37ºC wieder aufgetaut, bei 3.000 · g und 40ºC 10 Minuten lang zentrifugiert, danach wurde der Überstand logarithmisch in einem Medium verdünnt, und der Virentiter jeder Probe wurde mittels Plaquetest auf BHK-Zellen bestimmt (34).

Titration des Virus aus Tumor und Gehirn

Um virales Impfmaterial in Tumor und Gehirn zu titrieren, wurden Nacktmäuse intracranial mit 1 · 10&sup6; PFU von Stamm 17&spplus; oder 6,25 · 10&sup4; PFU von Stamm 1716 beimpft, und die Mäuse wurde durch eine tödliche Anästhesiespritze (Ketamin/Xylazin) getötet.
Die Gehirne und Tumoren von Mäusen, die an verschiedenen Tagen nach der viralen Beimpfung (Tag 0, 1, 3, 5 und 7) getötet wurden, wurden seziert, in flüssigem Stickstoff rasch eingefroren und bei -70ºC gelagert. Die Gehirn- und Tumorproben dieser verschiedener Zeitpunkte wurden rasch in einem Wasserbad mit einer Temperatur von 37 ºC aufgetaut, danach wurde das Gewebe in einem Viren-Kulturmedium mit einem Verhältnis zwischen Gewicht und Volumen von 10% unter Verwendung einer Gewebemühle von Pyrex Ten Broeck homogenisiert. Die Homogenate wurde bei 3.000 · g und 4ºC 10 Minuten lang zentrifugiert, danach wurde der Überstand logarithmisch in Medium verdünnt, und der Virentiter jeder Probe wurde mittels Plaquetest auf BHK-Zellen bestimmt (34).

Intracerebrale Implantation

Weibliche homozygote Nacktmäuse (4 bis 6 Wochen alt) wurden von Harlan Sprague Dawlex (Indianapolis, IN, USA) erhalten, die Mäuse wurden mit intramuskulärem (IM) Ketamin/Xylazin (87 mg/kg Ketamin/13 mg/kg Xylazin) anästhesiert, und den Mäusen wurden stereotaktisch Injektionen von Tumorzellensuspensionen unter Verwendung einer kleinen stereotaktischen Tiervorrichtung (Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA), einer 10 ul-Hamilton-Spritze und einer Einwegnadel mit 30 Gauge verabreicht, wie dies bereits zuvor beschrieben wurde (35). Um Kortextumoren zu erzeugen, wurde die Spritzennadel an einem Punkt 2 mm rostral des Bregmas und 1 mm zur Rechten der Mittellinie positioniert. Der Schädel wurde mit 70% Ethanol gereinigt und mit einer Nadel mit 27 Gauge durchstochen, die Hamilton-Spritze mit der darauf befestigten Nadel wurde durch das Loch im Schädel bis zu einer Tiefe von 1,5 mm unterhalb der Dira vorgeschoben, daraufhin wurden 3 · 10&sup4; NT2-Zellen in einem Gesamtvolumen von 2 ul in einem Zeitraum von 5 Minuten injiziert. Vor der Übertragung wurden NT2N-Zellen in DMEM/HG suspendiert und bei 40ºC in einem Eisbad gehalten. Genau 5 ul der NT2N- Zellensuspension, die etwa 5 · 10&sup5; Zellen enthielten, wurden an derselben Stelle wie zuvor injiziert. Nach der Injektion wurde die Nadel 5 Minuten lang an Ort und Stelle belassen und danach langsam innerhalb von 2 Minuten herausgezogen; die Wunde an der Oberflächenhaut wurde zusammengenäht. Die Mäuse durften sich erholen und wurden täglich auf Anzeichen einer Erkrankung untersucht. Körpergewicht und Kopfabmessungen wurden wöchentlich mittels Mikrometerschraube abgenommen. Alle Mäuse, die Anzeichen einer Erkrankung in extremis zeigten, wurden getötet, und die Gehirne wurden für eine immunhistochemische Untersuchung präpariert. Gewebe von einigen Tieren, die unbeobachtet in ihren Käfigen starben, wurden ebenfalls entnommen und für eine histochemische Analyse fixiert. Die Experimente mit Nacktmäusen sind in Tabelle 2 zusammengefasst.

Virenbeimpfung

Kontrollmäuse und Mäuse, die zuvor mit Tumorzellen beimpft worden waren, wurden, wie zuvor beschrieben, anästhesiert, und der Kopf wurde mit 70% Ethanol gereinigt. Es wurde eine Hamilton-Spritze mit einer Einwegnadel mit 30 Gauge verwendet, um die geeignete Menge des Virus (10&sup4;-10&sup6; PFU in 5 ul) durch einen Mittellinienschnitt an denselben stereotaktischen Koordinaten, die zuvor für die Injektion von Tumorzellen verwendet wurden, injiziert. Die Injektion wurde 3 Minuten lang nach der Injektion durchgeführt und danach langsam in einem Zeitrahmen von 1 Minute herausgezogen. Kontrollmäuse erhielten das äquivalente Volumen an Beimpfung mit einem Viren-Medium.

Magnetresonanzabbildung

Die Gehirne von ausgewählten Mäusen wurden unter Verwendung eines Tesla Magnetresonanzabbildungssystem (MR1) für Tiere von General Electric mit einer 30 cm Bohrung abgebildet. Dafür wurden die Mäuse anästhesiert, wie dies zuvor beschrieben wurde, und zwar zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Implantation von Tumorzellen und der Beimpfung jeder Tumorstelle mit dem Virus. Im Anschluss daran wurden jedem Tier 10 Einheiten eines Enhancer-Mittels über eine Schwanzvene injiziert, nämlich Gadolinium, das an einen DTPA-Träger (Magnevist) komplexiert worden war. Das Tier wurde daraufhin in einer RF-Spule aus Plexiglas immobilisiert und abgebildet.

Immunhistochemische Verfahren

Mäuse wurden transcardial perfundiert und mit 70% Ethanol in isotonischer Kochsalzlösung (150 nM NaCl, pH 7,4) oder 4% Paraformaldehyd (0,1 M PBS, pH 7,4) fixiert, und das Gehirn sowie die Proben zahlreicher anderer Gewebe (z. B. trigeminale Ganglien, Herz, Proximaljejunum, Leber, Milz, linke Niere, Oberschenkelknochen und Wirbelkörper) wurden für eine histologische und immunhistochemische Analyse seziert. Die Verfahren zur Gewebeverarbeitung und lichtmikroskopischen immunhistochemischen Untersuchung ähneln jenen Verfahren, die an anderen Stellen beschrieben wurden (35, 36). Sowohl monoklonale als auch polyklonale Antikörper gegen neuronale und gliale Zytoskelett-Proteine und andere Polypeptide, von denen man weiß, dass sie als Molekularsignaturen des neuronalen oder glialen Phenotyps fungieren, wurden für die immunhistochemische Charakterisierung der intracranialen homologen Transplantate verwendet (35, 37). Polyklonale Kaninchen-Antiseren gegen HSV-1, das die Hauptglykoproteine nachweist, die in der Virenhülle vorhanden sind, und zumindest 1 Kernprotein (Dako Corp., Carpinteria, CA, USA) wurden in einer Verdünnung von 1 : 1000 verwendet, um replizierende Viren zu detektieren (38). Ein monoklonaler Mäuse-Antikörper (MOC-1) gegen ein neurales Zelladhäsionsmolekül (MCAMs), das spezifisch für menschliche NCAMs ist, wurde in einer Verdünnung von 1 : 100 verwendet, um NT2- und NT2N-Zellen zu detektieren und sie von Gehirnzellen von Mäusen zu unterscheiden (35). Ein anderer monoklonaler Antikörper, RMO93 (1 : 10), der spezifische Nager- Epitope des Neurofilamentproteins (NF-M) von mittlerem Molekulargewicht erkennt und nicht mit menschlichem NF-M kreuzreagiert, wurde verwendet, um die Identität von NT2N-Transplantaten zu bestätigen (35). RMO301 (1 : 100) ist ein monoklonaler Antikörper, der humanspezifisches NF-M erkennt und verwendet wurde, um NT2N-Transplantate zu bestätigen. M13, ein monoklonaler Maus-Antikörper, der menschliches Mikrotubuli-assoziiertes Protein-2 (MAP2) erkennt, wurde in einer Verdünnung von 1 : 500 verwendet. Ein polyklonaler Kaninchen-Antikörper, der spezifisch für ein Mäuse-Myelinbasisprotein (MBP) ist, wurde in einer Verdünnung von 1 : 1.000 verwendet (Geschenk von A. McMorris). Gewebeschnitte zur Färbung mit M1B-1 (ein monoklonaler Mäuse- Antikörper, der ein Zellzyklus-spezifisches Antigen (Ki-67) erkennt, wurde in einer Verdünnung von 1 : 20 verwendet; AMAC, Westbrook, ME, USA) wurden mittels Mikroweile auf 10 mM Natriumcitrat vorbehandelt, wie bereits beschrieben (39). Vor der Tötung wurde einigen Kontrollmäusen intraperitoneal Bromdesoxyuridin (BrdU) in 5 mg/g (in 150 mM NaCl, 7 mM NaOH) Körpergewicht injiziert, um NT2-Zellen, die in den Transplantaten eine Zellteilung durchlaufen, zu markieren, wie bereits beschrieben (37). Segmente des proximalen Darms wurden von derselben Maus entnommen wie Positivkontrollen für zyklierende Zellen. BrdU-positive Zellen wurde identifiziert, indem ein BrdU- Antikörper BU-33 verwendet wurde (1 : 250). Zellen, die Antigene exprimieren, wurden durch indirekte Avidin-Biotin-Immunperoxidase (Vectastain ABC Kit, Vector Labs, Burlingarn, CA, USA) oder durch Peroxidase-Anti-Peroxidase-Detektionssysteme mit 3,3'- Diaminobenzadin (DAB) als Chromogen detektiert. Transplantation und Verbreitung des Virus in allen Tieren wurde beobachtet, indem jeder zehnte Schnitt durch das gesamte Gehirn mit MOC-1-, MIB-1- und HSV-Antikörpern gescreent wurde.

In-situ-Hybridisierung für HSV-1-spezifische Genexpression

Schnitte von perfundiertem und fixiertem Gewebe wurden auf Objektträgern aufgebracht, und es erfolgte eine In-situ-Hybridisierung, wie dies zuvor beschrieben wurde, um virale Genexpression zu detektieren (26, 33, 40). Serielle Gewebeschnitte wurden mit einer ³&sup5;S-markierten HSV-LAT-spezifischen Sonde (BstEII-BstEII) hybridisiert, mit einer ³&sup5;S-markierten HSV-spezifischen Thymidinkinase-Sonde (tk; ein frühes Genprodukt) oder mit einer biotinylierten HSV-spezifischen gG-Sonde (einem späten Genprodukt).

Herstellung einer ³&sup5;S-markierten Nick-translatierten Sonde

Das BstEII-BstEII-Subfragment der Latenz-assoziierten Transkriptsonden (LAT) (0,9 kb) aus BamHI B wurde mittels Gelelektrophorese von Restriktionsdigesten isoliert und Gene- Clean (Bio 101 Inc.; La Jolla, CA, USA; siehe Fig. 3) gereinigt (30). Das 3,4 kb BamHI- Fragment, das für das tk-Gen kodiert, wurde isoliert, wie dies beschrieben wurde (41). DNA-Sonden wurden Nick-translatiert und von nichtinkorporierten Nukleotiden getrennt, indem sie durch Sephadex G50-Spinsäulen (Pharamacia) hindurchgeschickt wurden (33). Die spezifischen Aktivitäten der Sonden betrugen etwa 1-5 · 10&sup8; cpm/pg DNA.

Herstellung einer ³&sup5;S-markierten Poly(dT)-Sonde

Ein 21-mer von Poly(dT) wurde synthetisiert und als Substrat zum Markieren mittels terminaler Desoxynukleotidyl-Transferase (TdT) verwendet. Das Reaktionsgemisch bestand aus 2 ul TdT, 1 ul Poly(dT) (6 ug/ul), 5 ul 5X TdT-Puffer, 6 ul CoCl&sub2; (2,5 mM), 10 ul ³&sup5;S- dTTP (1 ug) und 1 ul ddH&sub2;O. Das Gemisch wurde 30 Minuten lang bei 37ºC inkubiert und danach von nichtinkorporierten Nukleotiden getrennt, indem es durch Sephadex G- 25 Spinsäulen hindurchgeschickt wurde. In-situ-Hybridisierung erfolgte genau wie oben, nur dass Hybridisierung und das Waschen bei 37ºC in 25% Formamid durchgeführt wurden (42). Exposition erfolgt auf nicht infizierten, Mock-infizierten, infizierten Viren vom Wildtyp und RNase-behandelten Gewebeschnitten und wurden als Positiv- und Negativkontrollen für experimentelle Gewebeschnitte verwendet (siehe 43).

Biotinylierte gC-Sonde zur Detektion einer aktiven viralen Replikation

Eine nicht-isotopische In-situ-Hybridisierung wurde ausgeführt, wobei eine 21 bp-Antisense-gC-Sonde (Nukleinsäuren 199-219 des gC-Transkripts; CGGGGCGGGGGTGG- CCGGGGG; Geschenk von K. Montone; Fig. 3F), die mit dem 3'-Ende über einen biotinylierten Schwanz [5'-(TAG)&sub2;-BBB-3'] verbunden ist. Das Verfahren war im Wesentlichen dasselbe wie bei Wang und Montone, wobei es nur geringe Modifikationen für das Gehirngewebe der Mäuse gab.

DNA-Nick-Endmarkierung mittels TUNEL-Verfahren

Die dUTP-Biotin-Nick-Endmarkierungstechnik für die terminale Desoxynukleotidyl- Transferase (TdT) (TUNEL) wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (37). Kurz gesagt wurden entparaffinierte und rehydrierte Objektträger mit 20 ug/ml der Proteinase K in 0,1 M Tris (pH = 8) bei Raumtemperatur 15 Minuten lang digeriert. Nach dem Waschen wurden die Schnitte mit einem Gemisch inkubiert, das 20 mM biotinyliertes dUTP, 0,3 U/ul terminale Desoxynukleotidyl-Transferase, 1,5 mM Kobaltchlorid, 200 mM Natriumcacodylat, 25 mM Tris, 0,25 mg/ml Rinderserumalbumin (pH = 6,6) bei 37ºC 45 Minuten lang enthielt. Die Reaktionen wurden gestoppt, indem in 2X SSC 15 Minuten lang gewaschen wurde, und die Resultate dessen wurden mit alkalischer Phosphatase, die mit Streptavidin konjugiert und mit Echtrot-Substrat entwickelt wurde, sichtbar gemacht. Koronale Schnitte an Rattengehirn 8 Tage nach der Geburt wurden als Positivkontrollen für dieses TUNEL-Protokoll verwendet, da dies der Entwicklungsstufe entsprach, an welcher eine Peak-Apoptosisaktivität erkannt wird (44).

Elektronenmikroskopie an dünnen Schnitten

Teile von Tumorgewebe aus perfundierten Mäusegehirnen wurden in 1% Glutaraldehyd, 4% Paraformaldehyd in 0,1 M Natriumcacodylat (pH = 7,4) über Nacht bei 4ºC fixiert und in einem Natriumcacodylat-Puffer gewaschen und für eine elektronenmikroskopische Untersuchung - wie beschrieben - vorbereitet (37).

Statistik

Statistiken über das Überleben sowie das Gewicht wurden mittels BMDP Statistics Software (Hrsg. WJ Dixon; Ausgabe 7,0; 1993) gewonnen. Das unterschiedliche Überlebensverhalten in der Kontroll- und der behandelten Gruppe wurde verglichen, wobei die Generalised Wilcoxon (Breslow) Analysis angewendet wurde. Unterschiedliche Gewichte wurden unter Einsatz des t-Tests sowie des Mann-Whitney-Tests verglichen. Tiere, die tödlich erkrankt waren, wurden getötet und für die statistische Analyse wie Tiere behandelt, die in ihren Käfigen tot aufgefunden worden waren.

Beispiel 6:

HSV-1-Stamm 1716 lysiert und verbreitet sich in vitro auf Monoschichten von vom Tumor abstammenden menschlichen Neuralzelllinien

Um festzustellen, wie effizient der HSV-1-Stamm 1716 sich schnell teilende NT2 im Vergleich zum parentalen Stamm 17&spplus; lysiert, wurden NT2-Zellen auf Platten mit 24 Näpfen 1 Tag vor der Infektion durch diese zwei Stämme bei Multiplizitäten der Infektion (MOI) von 10,1 und bis zu 0,1 ausplattiert. Beiden Viren lysierten bei einer MOI von 10 NT2-Zellen innerhalb eines Tages, und dies wurde mit den charakteristischen morphologischen Änderungen (Aufrundung, Phasenhelligkeit, Cytomegalie, Plaquebildung und Adhäsionsverlust), die mit HSV-Infektion assoziiert werden, in Zusammenhang gebracht. Da das Verhalten eines Virus bei einer geringen MOl (0,1) in vitro die Fähigkeit eines Virus voraussagen kann, sich in vivo in einem Tumor zu verbreiten, haben die Erfinder die Infektion bei MOl -0,1 studiert. Stamm 1716 verbreitete und zerstörte Monoschichten aus NT2-Zellen weniger effizient als Stamm 17&spplus; (1716 lysierte die Monoschicht in 3 Tagen, 17&spplus; in 2 Tagen). Das Verhalten dieser Viren war in zwei verschiedenen menschlichen Medulloblastom-Zelllinien (D283 MED und DAOY) ähnlich, was vermuten lässt, dass Stamm 1716 viele verschiedene Zelllinien eines Gehirntumors lysieren kann.
Danach wurden NT2N-Zellen (die neuronartigen Retinolsäure-differenzierten Derivate der NT2-Zellen) mit diesen Viren infiziert. Stamm 1716 wurde bezüglich Cytopathie in diesen Zellen relativ zu Stamm 17&spplus; abgeschwächt, und Lactatdehydrogenase-Tests (LDH) auf Zytotoxizität, die an mit den obigen Viren infizierten NT2N-Zellen durchgeführt wurden, zeigten, dass beide Viren eine nichtspezifische Toxizität innerhalb von 12 Stunden nach der Infektion auslösten (Daten nicht dargestellt). Interessanterweise zeigt die Titration des Virus aus infizierten Zellkulturen, dass der Stamm 1716 für eine Replikation in den NT2N-Zellen unzureichend war (Daten nicht dargestellt). Da Stamm 1716 in Mäusen stärker neural abgeschwächt ist als die anderen Stämme (26, 30), führten die Erfinder In-vivo-Studien des Stamms 1716 im Vergleich zu Stamm17&spplus;-Virus durch, wobei sie in das ZNS der Nacktmäuse mit oder ohne Transplantate von in vitro erhaltenen NT2N-Zellen oder mit Tumoren, die von transplantierten NT2-Zellen gebildet wurden, eingeimpft wurden.
Es wird auf Tabelle 2 verwiesen.

Beispiel 7:

Replikation des HSV-1-Stamms 1716 kann im Mäuse-ZNS nach intracerebraler Beimpfung nicht nachgewiesen werden

In Einklang mit vorausgehenden Ergebnissen unter Verwendung von SCID-Mäusen (26) induzierte eine intracerebrale (IC) Beimpfung mit 5 · 10&sup6; Plaque-bildenden Einheiten (PFU) des Stamms 1716 von Nacktmäusen keine klinischen Symptome für mehr als 4 Monate nach der Beimpfung, und es gab keinen Beweis für eine Enzephalitis auf Grundlage der histologischen Analyse der Gehirne, noch für eine Replikation in den wichtigen Organen (z. B. Leber, Milz, Rückenmark, etc.) dieser Mäuse (Tabelle 2, Studie I). Im Gegensatz zu Stamm 1716 tötete Beimpfung mit weniger als 100 PFU von Stamm 17&spplus; Nacktmäuse innerhalb von 5-10 Tagen, und die histopathologische Analyse zeigte extensive zytopathische Läsionen (z. B. intranukleare Einschlusskörper, Zelltod, etc.) bei diesen Mäusen (nicht gezeigt).
Um die virale Replikation im Gehirn nach IC Beimpfung von Stamm 1716 im Vergleich zu Stamm 17&spplus; zu überwachen, wurde eine Virentitration durchgeführt (Tabelle 2, Studie II). Die Wiederfindung beider Viren an Tag 0 war mit Bezug auf die Virusmenge im injizierten Impfstoff nur gering. Dies ist wahrscheinlich auf die Adsorption oder Fusion der viralen Teilchen an die Membranen in den Gehirnhomogenaten und auf Inaktivierung des Virus während der Gewinnung zurückzuführen. Fig. 4 zeigt, dass der Titer des Stamms 17&spplus; mit der Zeit exponentiell anstieg und zu Erkrankung und Tod der beimpften Mäuse führte. Im Gegensatz dazu fiel der Titer des Stamms 1716 in den Gehirnen von Nacktmäusen stark ab, und 3 Tage nach der Beimpfung damit war der Virus nicht mehr nachweisbar. Es gab jedoch keinen immunhistochemischen Beweis einer Enzephalitis bei Mäusen, die mit Stamm 1716 infiziert worden waren, und es gab keine nachweisbare Verbreitung des Stamm 1716-Virus außerhalb des ZNS, wie dies durch das Fehlen den Virus in Proben von Leber, Milz, Niere, Jejunum und Knochenmark mittels immunhistochemischer Tests und mittels In-situ-Hybridisierung für HSV-spezifische Transkripte bestätigt wurde (Daten nicht dargestellt). Ebenso lösten direkte Beimpfung von Leber oder intravenöse Injektion des Stamms 1716 nicht Erkrankung und Tod in Nacktmäusen aus. Im Gegensatz zu Stamm 1716 zeigten sich bei mit Stamm 17&spplus; infizierten Mäusen Enzephalitis und Tumorlyse (siehe Fig. 4).

Beispiel 8:

HSV-1-Stamm 1716 repliziert lytisch in NT2-Tumoren, nicht aber in transplantierten NT2N-Zellen im ZNS von Mäusen

Wurde Stamm 1716 in NT2-Tumoren injiziert, so erfolgte 7 Tage lang eine beträchtliche Replikation, was dadurch nachgewiesen wurde, dass bis zu Tag 3 der Virentiter über den Eingangs-Impfstoff anstieg (Fig. 4). Dies stimmt mit den immunhistochemischen und In-situ-Hybridisierungsdaten überein, die in den Gehirnen dieser Mäuse, abgesehen von den NT2-Tumorzellen, keinen nachweisbaren Stamm 1716 zeigten, solange diese vorhanden waren, um die virale Replikation zu unterstützen (siehe unten).
Da die Quantifizierung mittels Titrationstest in Mäusen zeigte, dass der Stamm 1716 in NT2-Zelltumoren replizierte, testeten die Erfinder die Fähigkeit des Stamms 1716, eine Regression dieser Tumoren zu induzieren (Tabelle 2, Studie IV). Dafür injizierten sie 5 ul Stamm 1716, der 5 · 10&sup5; PFU enthielt, in Tumoren, die sich in den Gehirnen von Nacktmäusen nach einer IC Implantation von 3 · 10&sup6; NT2-Zellen bildeten. Um das Schicksal dieser transplantierten NT2-Zellen zu überwachen, wurden die Mäuse zu verschiedenen Zeitpunkten nach der viralen Beimpfung getötet, und ihre Gehirne und Organe wurden mittels immunhistochemischer Untersuchung und In-situ-Hybridisierung analysiert. NT2-Zellen bildeten Tumoren mit neuraler und epithelialer Geschichte bei 100% der Mäuse, und diese Tumoren waren innerhalb von 5 Wochen nach der Transplantation tödlich (Fig. 5A, 5B). Diese Tumoren enthielten eine Fülle an sich stark vermehrenden Zellen, was mittels BrdU-Markierung, der immunhistochemischen Detektion der Zellzyklus-Antigene und ihres raschen Wachstums nachgewiesen wurde (Fig. 5C, 5D). Die Fig. 5E, F, G und H zeigen, dass die Infektion der NT2-Tumoren mit Stamm 1716 an Tag 3 nach der Infektion (pi) nicht einheitlich ist. Dies kann die lokalisierte Natur der Injektionsstelle widerspiegeln oder Zelltyp-spezifische Unterschiede in der Anfälligkeit der Zellen für Infektion und Lyse durch Stamm 1716. Nichtsdestotrotz beinhalteten die meisten Tumorzelltypen nahe der Injektionsstelle das immunreaktive Virus bis zum Tag 5. Zu einem späteren Zeitpunkt nach der Infektion waren mehr Zellen infiziert, aber die Immunreaktivität für das Virus im Tumor war schwächer, was wahrscheinlich auf eine Clearance des Virus nach Lyse der infizierten Tumorzellen zurückgeht (Fig. 5).
Wie in Fig. 5H erkennbar ist, ist das virale Antigen auf Tumoren beschränkt. Bei starker Vergrößerung zeigten die infizierten Tumorzellen charakteristische Eigenschaften einer HSV-1-Infektion, d. h. intranukleare Einschlusskörper und multinukleare Riesenzellenbildung (Fig. 5F). Im umgebenden Gehirn dieser Mäuse oder in den Gehirnen der unbehandelten Kontrollmäuse war keine virale Antigen-Färbung erkennbar. Dies wurde durch eine nicht-isotopische In-situ-Hybridisierung unter Verwendung einer biotinylierten Sonde für Glykoprotein C (gC) und einer radiomarkierten Thymidinkinase- (TK-) Sonde (ein spätes und ein frühes Genprodukt, das nur bei akuter Infektion exprimiert wird) bestätigt, um aktive Virusreplikation in seriellen Schnitten zu detektieren (Fig. 5J). Somit ist virale Replikation, wie mittels Genexpression nachgewiesen, ebenfalls auf Tumorzellen beschränkt. Im Gegensatz dazu zeigten Mäuse mit Tumor, die mit Stamm 17&spplus; beimpft wurden, virale Replikation sowohl im Tumor als auch im Gehirn (Fig. 5K, 5L). Mäusegehirne, die 18 Tage nach der viralen Behandlung ihrer Tumorimplantate mit 1716 entfernt wurden, zeigten eine ausgesprochene Verringerung der Tumorgröße. So war bei einigen Mäusen tatsächlich nur noch der Rest ein fibrotischen Narbe zu sehen, und das virale Antigen war strikt auf die in der Narbe verbliebenen Zellen beschränkt (Fig. 5M, N, O).
Um die Fähigkeit von Stamm 1716 zu untersuchen, die Regression von Gehirntumoren zu induzieren, wurde NT2-Tumoren in den Gehirnen von Nacktmäusen stereotaktisch Stamm 1716 12 Tage nach Implantation der NT2-Zellen injiziert. Behandelte Mäuse wurden mit 5 · 10&sup5; PFU (in 5 ul) Stamm 1716 an der Tumorimplantationsstelle beimpft, und Kontrollmäuse erhielten nur 5 ul eines Mediums. MRI-Scans zeigten, dass an Tag 11 nach der Implantation diese Mäuse nachweisbar Tumoren entwickelt hatten. In allen Mock-behandelten Mäusen mit Tumor wuchs der Tumor rasch und wurde schließlich tödlich (Fig. 6A-D). In allen behandelten Mäusen induzierte die Infektion mit Stamm 1716 eine nachweisbare Regression des Tumors an der ursprünglichen Stelle der Beimpfung (Fig. 6E-G).
Um festzustellen, ob die transplantierten NT2N-Zellen HSV-Replikation zuließen, wurden 2,5 · 10&sup5; Zellen in das Organgewebe des Gehirns oder in Ventrikel der Nacktmäuse transplantiert (Tabelle 2, Studie III). Diese Zellen integrieren sich und überleben länger als 1 Jahr und nehmen eine völlig reifen, post-natalen, neuronalen Phenotyp des menschlichen ZNS an (27). Stamm 1716 wurde daraufhin an derselben stereotaktischen Stelle 6 Wochen nach der Implantation eingeimpft. Die Transplantate wurden identifiziert und von Mäusezellen unterschieden, indem ein humanspezifisches (MOC1 und RMO301) und ein mäusespezifischer (RM093) Antikörper gegen das neurale Zelladhäsionsmolekül (MOC1) oder die Neurofilamentproteine (RM0301, EM093) verwendet wurde. Im Gegensatz zu NT2-Tumoren ließen diese Langzeit-NT2-Transplantate keine Replikation von Stamm 1716 zu, was anhand des Fehlens von immunhistochemischer Färbung auf virale Antigene an den Tagen 1, 3, 5, 7, 9, 21 und 50 nach der Viren- Beimpfung nachgewiesen wurde.

Beispiel 9:

HSV-Stamm 1716 induziert nicht-apoptotischen Tod in NT2-Tumorzellen

Tumorschnitte einer ausgewählten Gruppe von mit Stamm 1716 infizierten Mäusen und von nicht infizierten Tumor-Kontrollmäusen wurde für eine EM-Analyse präpariert, um die Art des Zelltods in den NT2-Zelltumoren zu charakterisieren. Die infizierten Zellen auf der H&E-Färbung zeigten Eigenschaften, die für HSV-infizierte Zellen typisch sind (Fig. 5F). Virale Assemblierungsdomänen können im Kern der infizierten Zellen erkannt werden. Es gab aber keinen Beweis für einen apoptotischen Mechanismus des Zelltods in viral infizierten Tumorzellen mittels EM (Fig. 7). Tumorzellen mit viralen Teilchen zeigten die Fragmentierung und Auflösung der Kerne und Organellen wie auch der kondensierten und begrenzten DNA. Studien zur dUTP-Biotin-Nick-Endmarkierung (TUNEL) terminaler Desoxynukleotidyl-Transferase (TdT) und DNA-Gelelektrophorese lieferten keinen Beweis für eine DNA-Fragmentierung, die für eine Apoptose indikativ ist (Daten nicht dargestellt). Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass Stamm 1716 die charakteristisch lytische Infektion in den NT2-Zellen in vitro und in vivo induziert.

Beispiel 10:

Langzeit-Überleben von mit HSV-Stamm 1716 behandelten Mäusen mit Tumor

Basierend auf den Ergebnissen der oben beschriebenen Studien analysierten die Erfinder das Überleben einer Kohorte Tumor-tragender Mäuse, die mit dem Virus behandelt worden waren oder auch nicht (Tabelle 2, Studien V und VI). Die ermöglichte den Erfindern auch, die langfristigen Auswirkungen der Behandlung mit Stamm 1716 zu bewerten (siehe unten). 20 Mäuse wurden mit 3 · 10&sup6; NT2-Zellen beimpft, und einige Tage später wurden diese Mäuse in zwei Gruppen aufgeteilt. Die Kontrollmäuse erhielten Kulturmedium, und die behandelten Mäuse erhielten 5 · 10&sup6; PFU Stamm 1716. Im ersten Überlebensexperiment (Tabelle 2, Studie V) erfolgte die Virusbehandlung 12 Tage nach der posttumoralen Zellbeimpfung. Es gab nur 1 (10%) Langzeit-Überlebenden in dieser Gruppe, und es zeigte sich kein bemerkenswerter Unterschied im Überleben zwischen Tieren der Kontroll- (Studie VA) und der behandelten Gruppe (Studie VB) (p = .63, Fig. 8A). Eine histologische Untersuchung einiger Tiere der Kontroll- und der behandelten Gruppe zeigte, dass das Virus im Tumor replizierte. In den behandelten Tieren schien es, dass der Tumor bereits zu einer solchen Größe angewachsen war und sich vergrößert hatte, dass eine Virusbehandlung nicht ausreichend war, um eine Regression des Tumors zu induzieren (Daten nicht gezeigt). Erfolgte am Tag 7 der posttumoralen Zellbeimpfung eine Virusbehandlung, so überlebten langfristig 44% der Mäuse und 100% der Kontrollmäuse starben innerhalb von 10 Wochen (Tabelle 2, Studie VI; Fig. 6B). Dies resultierte in einer statistisch bedeutsamen Verbesserung im Überleben (p < ,03; mittlere Überlebenszeit (Kontrollgruppen) = 44,75 +/-5,24: mittlere Überlebenszeit (behandelte Gruppe) = 101,78 +/- 22,69).
In diesen Überlebensexperimenten wurde ein beträchtlicher Gewichtsverlust in einer Unterpopulation sowohl der Mock-behandelten Mäuse mit Tumor (Tabelle 2, Studie VIA) als auch der mit Stamm 1716 behandelten Mäuse mit Tumor (Tabelle 2, Studie VIB) beobachtet. Da es keinen Unterschied im Durchschnittsgewicht dieser beiden Gruppe gab (Fig. 8C), teilten die Erfinder die behandelte Gruppe (Studie VIB) in zwei Untergruppen (die hochgradig Respondierenden (HR) - die Langzeit-Überlebenden (4 Mäuse) und die gering Respondierenden (LR) - Mäuse, die starben (5 Mäuse); Fig. 8C). Die Erfinder stießen auf einen bedeutenden Unterschied im Gewichtsverlust nach 6 Wochen (p < 0,01) zwischen den Gruppen HR und LR und zwischen den Gruppen LR und den mit 1716 behandelten Mäusen (Studie 1), wobei ein standardisierter t-Test verwendet wurde (Fig. 8D). Diese Daten bestätigten frühere Beobachtungen eines Gewichtsverlusts in Studie V, und dies lässt vermuten, dass der Gewichtsverlust auf die toxischen physiologischen Auswirkungen des Tumorwachstums, die Regression oder Lyse und nicht direkt auf einen Effekt der viralen Infektion des Gehirns zurückgeht. Bemerkenswerterweise zeigten einige der behandelten Mäuse, die starben, ein Austreten der Tumorzellen aus der Implantationsstelle in die Ventrikel und Leptomeninges. Da dies zu einer Behinderung des Flusses der Rückenmarksflüssigkeit führt, ist es nicht überraschend, dass einige dieser behandelten Mäuse Überlebenskinetiken aufwiesen, die jenen der Kontrollmäuse glichen (Fig. 8A). Schließlich stieg das intracraniale Volumen der Kontrollmäuse mit Gehirntumoren um mehr als 25% an (dies indiziert Tumorwachstum), während in behandelten Mäusen das intracraniale Volumen sich nicht merklich vergrößerte (siehe Fig. 6). In den Langzeit-Überlebenden stieg auch das intracraniale Volumen nicht in beträchtlicher Weise an (Daten nicht dargestellt). Diese Interpretationen stützen sich auf die Tatsache, dass Mäuse, die nur mit Stamm 1716 beimpft wurden, zu keinem Zeitpunkt im Verlauf der Studie klinische oder histologische Eigenschaften einer Enzephalitis zeigten.
Langzeit-Überlebende der Studien V und VI (Tabelle 2) zeigten keine klinischen Symptome, kein atypisches Ansteigen des intracranialen Volumens und keinen Gewichtsverlust an (Fig. 8C). Diese Mäuse sowie Mäuse, die nur mit Stamm 1716 beimpft wurden, wurden getötet und auf ihre Pathologie sowie virale Replikation mittels immunhistochemischen Tests und In-situ-Hybridisierung untersucht. In den Überlebenden gab es nur Beweis für fibrotisches Narbengewebe und dystrophische Verkalkungen, aber keinen Beweis für lebendige Tumorzellenreste (Figur A, B, C). Immunhistochemische Färbung für Zellzyklus-Antigene (z. B. unter Verwendung von MIB-1) war ebenfalls negativ, was die Vermutung zulässt, dass zyklierende NT2-Zellen im Gehirn fehlen. Weiters waren die Gehirne dieser Mäuse negativ auf Herpes-Antigene, was das Fehlen des replizierenden Virus anzeigt, obgleich in manchen Mäusen die In-situ-Hybridisierung die Gegenwart von latentem HSV im Hippocampus offenbarte (Fig. 9D). Überraschenderweise wurde das latente Virus auch im Hippocampus von allein mit Stamm 1716 infizierten Mäusen gefunden. Die Untersuchung des repräsentativen Rostrals auf kaudale Gehirnlevel aller Überlebender, wobei in diesem Zusammenhang Antikörper verwendet wurden, die auf HSV und menschliche NT2-Zellen (MOC-1, RMO301) spezifisch sind, lieferte keinen Beweis für eine aktive Virusreplikation noch für lebende Tumorzellenreste. Um das mögliche Auftreten anderer potentiell toxischer Sequelae der HSV-Stämme auszuschließen, so z. B. Demyelinierung, sondierten die Erfinder Schnitte vom Gehirn der Mäuse unter Verwendung von Antikörpern gegen Myelinbasisprotein. Die Untersuchung von Mäusen, die allein mit Stamm 1716 infiziert waren, sowie von Langzeit-Überlebenden lieferte keinen Beweis für eine Demyelinierung (Fig. 9E). Schließlich überwachten die Erfinder noch die Level der poly(A)-&spplus;RNA mittels In-situ-Hybridisierung unter Verwendung einer radiomarkierten Poly(dT)-Sonde, um den metabolischen Gesundheitszustand insgesamt der Neuronen zu bewerten (31, 32), und die Erfinder fanden in diesem Zusammenhang keinen quantifizierbaren Unterschied im Level der poly(A)-&spplus;RNA zwischen den LAT-positiven Zellen der Langzeit-Überlebenden versus die kontralateral nicht-LAT-positiven Zellen in denselben Mäusen sowie in den nicht infizierten Kontrollmäusen (Fig. 9F). Tabelle 2: Zusammenfassung der Tierexperimente
a p.i. = nach der Zellimplantation, wenn das Virus oder der Mock-Impfstoff verabreicht wurde. n.a. = nicht anwendbar.
b Die Mäuse wurden an verschiedenen Tagen nach der viralen Beimpfung getötet, um der Kinetik der Tumorprogression sowie der Verbreitung des Virus zu folgen (für Details siehe Text).
c Diese Mäuse zeigten ebenfalls keine Symptome, aber die Mäuse, die starben, zeigten dieselben Symptome wie die Mock-behandelten Mäuse.
d Langzeit-Überlebende zeigten keine Symptome, aber die Mäuse, die starben, zeigten dieselben Symptome wie die Mock-behandelten Mäuse.
e p = 0,63, kein statistisch bemerkenswerter Unterschied im Überleben zwischen behandelten und Mock-behandelten Mäusen.
f p < 0,03, statistisch bemerkenswerter Unterschied im Überleben zwischen behandelten und Mock-behandelten Mäusen.

Schlussfolgerungen

Der Stamm 1716 vom HSV-1-Typ weist eine Deletion im γ34,5-Neurovirulenz-Gen auf, was ihn im ZNS von Mäusen avirulent macht. Dabei haben die Erfinder angenommen, dass er über das Potential verfügt, selektive Lyse von Tumorzellen versus Neuronen in vitro und in vivo zu induzieren. Parentaler HSV-1-Stamm 17&spplus; sowie der genmanipulierte Stamm 1716 wurden studiert, wobei menschliches Teratokarzinom, das von embryonalen Karzinomzellen abstammt (NT2-Zellen), verwendet wurde. Diese Zellen ähneln neuronalen Stammzellen und können so induziert werden, dass sie in Neuronen (NT2N-Zellen) mit Retinolsäure differenzieren. Intracerebrale Transplantate von NT2- Zellen in das Gehirn von Nacktmäusen führte zu tödlichen Gehirntumoren, während Transplantate von NT2N-Zellen zur Integration und Reifung von NT2-Zellen ohne neoplastische Reversion führte. In vitro-Studien zeigten, das Stamm 1716 in Monoschichten von NT2-Zellen repliziert und sich auf diesen verbreitet, was zu einer Lyse dieser Zellen führt. Stamm 1716 replizierte in vitro jedoch nicht in NT2-Zellen. In vivo replizierte Stamm 1716 vorzugsweise in NT2-Tumoren, wie dies mittels immunhistochemischer Färbung für virale Antigene, In-situ-Hybridisierung für HSV-spezifische Transkripte und Titration des Virus von Gehirnen mit Tumor nach einer intracranialen Injektion des Virus in diese Mäuse nachgewiesen wurde. Im Gegensatz zu NT2-Tumorzellen ließen transplantierte NT2N-Zellen eine Stamm 1716-Replikation nicht zu. Die temporale Regression der NT2-Tumore in Mäusen, die mit Stamm 1716 behandelt wurden, wurde in vivo mittels Magnetresonanzabbildung gezeigt. Elektronenmikroskopie sowie Studien der DNA-Fragmentierung schlugen vor, dass die Regression von NT2-Gehirntumore in Mäusen, die mit Stamm 1716 behandelt wurden, hauptsächlich auf eine apoptotische, lytische Art des Zelltods zurückzuführen ist. Mäuse mit einem NT2-Tumor, die mit Stamm 1716 behandelt wurden, überlebten mehr als zwei Mal so lange wie Mäuse mit Tumor, die Mock-behandelt wurden, und diese Unterschiede im Überleben (25 zu 9 Wochen) waren statistisch signifikant (p < 0,03). Die Erfinder haben daraus geschlossen, dass Stamm 1716, eine replikationskompetente, nicht-neurovirulente Mutante von HSV-1, eine Regression von menschlichen neuralen Tumoren induziert, die sich im Gehirn von Nacktmäusen ausgebildet haben, was in einem längeren Überleben derselben resultiert. Diese Ergebnisse zeigen, dass HSV-2-γ34,5-Mutanten Kandidaten für die In- vivo-Behandlung von Gehirntumoren bei Menschen sind.

Literaturverzeichnis

1. Feun, L. G., et al. The natural history of resectable metastatic melanoma (Stage IVA melanoaa)., Cancer, 50: 1656-1663, 1982.
2. Markert, J. M., Coen, D. M., Malick, A., Mineta, T., and Martuza, R. L. Expanded spectrum of viral. therapy in the treatment of nervous system tumors, J. Neurosurg, 77: 590-594, 1992.
3. Martuza, R. L., Malick, A., Markert, J. M., Ruffner, K. I., and Coen, D. M. Experimental therapy of human glioma by means of a genetically engineered virus mutant, Science, 252: 854-856, 1991.
4. Ram, Z., Culver, K. W., Wallbridge, S., Blaese, R. M., and Oldfield, E. H. In situ retroviral-mediated gene transfer for the treatment of brain tumors in rats, Cancer Res, 53: 83-88, 1993.
5. Takamiya, Y., Short, M. P., Moolten, F. L., Fleet, C., Mineta, R., Breakefield, X. O., and Martuza, R. L. An experimental model of retrovirus gene therapy for malignant brain tumors, J. Neurosurg, 79: 104-110, 1993.
6. Reichard, K. W., Lorence, R. M., Cascino, C. J., Peeples, M. E., Walter, R. J., Fernando, M. B., Reyes, H. M., and Greager, J. A. Newcastle Disease Virus Selectively Kills Human Tumor Cells, J. Surg. Res., 52: 448-453, 1992.
7. Dupressoir, T., Vanacker, J.-M., Cornelis, J. J., Duponchel, N., and Rommelacre, J. Inhibition by parvovirus H-1 of the formation of tumors in nude mice and colonies in vitro by transformed human mammary epithelial cells, Cancer Res, 49: 3203-3208, 1989.
8. Coen, D. M., Kosz-Vnenchak, M., Jacobson, J. G., Leib, D. A., Bogard, C. L., Schaffer, P. A., Tyler, K. L., and Knipe, K. M. Thymidine kinase-negative herpes simplex virus mutants establish latency in mouse trigeminal ganglia but do not reactivate., Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 86: 4736-4740., 1989.
9. Tenser, RB. Role of herpes simplex virus thymidine kinase expression in viral pathogenesis and latency, Intervirology, 32: 76-92, 1991.
10. Coen, D. M., JR., H. E. F. Leslie, L. K., and Retondo, M. J. Sensitivity of arabinosyladenineresistant mutants of herpes simplex virus to other antiviral drugs and mapping of drug hypersensitivity mutations to the DNA polymerase locus, J. Virol., 53: 477-488, 1985.
11. Ackermann, M., Longnecker, R., Roizman, B., and Pereira, L. Identification, properties, and gene location of a novel glycoprotein specified by herpes simplex virus 1, Virology, 150: 207-220, 1986.
12. Chou, J., Kern, E. R., Whitley, R. J., and Roizman, B. Mapping of herpes simplex virus neurovirulence to gamma 1 34.5, a gene nonessential for growth in culture, Science, 250: 1262-1266, 1990.
13. McGeoch, D. J., Cunningham, C., McIntyre, G., and Dolan, A. Coaparative sequence analysis of the long repeat regions and adjoining parts of the long unique regions in the genomes of herpes simplex viruses types 1 and 2, J. Gen. Virol, 69: 1531-1574, 1991.
14. Bolovan, C. A., Sawtell, N. M., and Thompson, R. L. ICP 34.5 mutants of herpes simplex virus type 1 strain 17syn+ are attenuated for neurovirulence in mice and for replication in confluent primary mouse embryo cell cultures, J. Virol, 68: 48, 1994.
15. Javier, R. T., Thompson, R. L., and Stevens, J. G. Genetic and biological analyses of a herpes simplex virus intertypic recombinant reduced specifically for neurovirulence, J. Virol., 61: 1978-1984, 1987.
16. MacLean, A. R., U1-Fareed, M., Robertson, L., Harland, J., and Brown, S. M. Herpes Simplex virus type 1 deletion variants 1714 and 1716 pinpoint neurovirulence-related sequences in Glasgow strain 17+ between immediate early gene 1 and the 'a' sequence, J. Gen. Virol, 72: 631-639, 1991.
17. Markert, J. M., Malick, A., Coen, D. M., and Martuza, R. L. reduction and elimination of encephalitis in an experimental glioma therapy model with attenuated herpes simplex mutants that retain susceptibility to acyclovir, Neurosurgery, 32: 597- 603, 1993.
18. Einhorn, L. H., Burgess, M. A., Vallejos, C., G. P. Bodey, S., Gutterman, J., and Mayligit, G. Prognostic correlations and response to treatment in advanced metastatic malignant melanoma, Cancer Res, 34: 1995- 2011, 1974.
19. Amer, 1441., Al-Sarraf, M., Baker, L. H., and Vaitkevicius, V. K. Malignant melanoma and central nervous system metastases: incidence, diagnosis, treatment and survival, Cancer, 42: 660-668, 1978.
20. Budman, D. R., Camacho, E., and Wittes, R. E. The current causes of death in patients with malignant melanoma, Eur. J. Cancer, 14: 327-330, 1978.
22. Patel, J. K., Didolkar, M. S., Pickren, J. W., and Moore, R. H. Metastatic pattern of malignant melanoma. A study of 216 autopsy cases, Am. J. Surg, 135: 807- 810, 1978.
22. delaMonte, S. M., Moore, G. W., and Hutchins, G. M. Patterned distribution of metastases from malignant melanoma in humans, Cancer Res, 43: 3427-3433, 1983.
23. Balch, C. M., Soong, S.-j., Murad, T. M., Smith, J. W., Maddox, W. A., and Durant, J. R. A multifactorial analysis of melanoma: IV. Prognostic factors in 200 melanoma patients with distant metastases (stage III), J. Clin. Oncol, 1: 126-132, 1983.
24. Spivack, J. G. and Fraser, N. W. Detection of herpes simplex type 1 transcripts during latent infection in mice, J. Virol., 61: 3841-3847, 1987.
25. McGeoch, D. J. et al. The complete DNA sequence of the long Unique Region in the Genome of Herpes Simplex Virus Type 1, J. Gen. Virol. 69, 1531-1574 (1988).
26. Valyi-Nagy, T, MU Fareed, JS O'Keefe, RM Gesser, AR MacLean, SM Brown, et al., The HSV-1 strain 17+ gamma 34.5 deletion mutant 1716 is avirulent in SCID mice, J, Gen. Virol, 1994; 75; 2059-2063.
27. Kleppner, SR, JQ Trojanowski, and WM-Y Lee, Longtern survival and maturation of neurons derived from the human ell line N-Tera-2 after transplantation into nude mouse. Soc. Neurosci. Abst, 1992; 18: 782.
28. Pleasure, SJ and VM-Y Lee, NTera 2 cells: A human cell line which displays characteristics expected of a human committed neuronal progenitor cell. J. Neurosci. Res., 1993: 35(6): 585-602.
29. Pleasure, 5 J, C Page, and VM-Y Lee, Pure postmitotic, polarised human neurons derived from NTera 2 cells provide a system for expressing exogenous proteins in terminally differentiated neurons. J. Neurosci., 1992; 12(5): 1802-1815.
30. Valyi-Nagy, T, SL Deshmane, B Raengasakulrach, M Nicosia, RM Gesser, M Wysocka, et al., Herpes simplex virus type 1 mutant strain in 1814 establishes a unique, slowly progressing infection in SCID mice. J. Virol., 1992; 66: 7336-7345.
31. Deckwerth, TL and J E. M. Johnson, Temporal analysis of events associated with programmed cell death (apoptosis) of sympathetic neurons deprived of nerve growth factor. J. Cell Biol., 1993; 123(5): 1207-1222.
32. Freeman, RS, S Estus, and J E. M. Johnson, Analysis of cell cycle-related gene expression in postmitotic neurons: selective induction of Cyclin D1 during programmed cell death, Neuron, 1994; 12(2): 343-355.
33. Deatly, AM, JG Spivack, E Lavi, DR O'Boyle II, and NW Fraser, Latent herpes simplex virus type 1 transcripts in peripheral and central nervour system tissues of mice map to similar regions of the viral genome. J. Virol., 1988; 62: 749-756.
34. Spivack, JG and NW Fraser, Detection of herpes simplex type 1 transcripts during latent infection in mice. J. Virol., 1987; 61: 3841-3847.
35. Trojanowski, J, R. Mantione, J Lee, D Seid, T You, L Inge, et al., Neurons Derived from a Human Teratocariconma Cell Line Establishes Molecular and Structural Polarity Following Transplantation into the Roden Brain. Experimental Neurology, 1993; 122: 283- 294.
36. Trojanowski, JQ, K-M Fung, LH Rorke, T Tohyama, AT Yachnis, and V-Y Lee, In vivo and in vitro models of medulloblastomas and other primitive neuroectodermal brain tumors of childhood. Mol. Chem. Neuropath, 1994; 21(2-3): 219-239.
37. Fung, KM, DM Chikaraishi, C Suri, F Theuring, A Messing, DM Albert, et al., Molecular phenotype of simian virus 40 large T antigen-induced primitive neuroectodermal tumors in four different lines of transgenic mice. Lab Invest., 1994; 70: 114-124.
38. Adams, Rt, DR Springall, mm Levene, and TE Bushell, The immunocytochemical detection of herpes simplex virus in cervical smears - a valuable technigue for routine use. J. Pathol, 1984; 143(4): 241-247.
39. Yachnis, AT, LB Rorke, and VM Lee, Expression of neuronal and glial polypeptides during histogenesis of the human cerebellar cortex including observations on the dentate nucleus. J. Comp. Neurol., 1993; 334: 356-369.
40. Wang, JY and KT Montone, A rapid simple in situ hybridization method for herpes simplex virus employing a synthetic biotin-labeled oligonucleotide probe; a comparison with immunohistochemical methods for HSV detection. J. Clin. Lab Anal., 1994; 8: 105- 115.
41. Valy-Nagy, T, SL Deshmane, JG Spivack, I Steiner, CI Ace, cm Preston, et al., Investigation of herpes simplex virus type 1 (HSV-1) gene expression and DNA synthesis during the establishment of latent infection by an HSV-1 variant, in 1814, that does not replicate in mouse trigeminal ganglia. J. Gen. Virol, 1991; 72: 641-649.
42. Huang, S, TJ Deernick, MH Ellisman, and DL Spector, In vivo analysis of the stability and transport of nuclear poly(A)+RNA. J. Cell Biol., 1994; 126: 887-899.
43. Baserga, R and D Malamud, Autoradioqraphy: Techniques and Applications. 1969, New York: Harper and Row. p. 129-144.
44. Ferrer, I, T Serrano, and E Soriano, Naturally occurring cell death in the subicular complex and hippocampus in the rat during development. Neurosci. Res., 1990; 8(1): 60-66.
45. Perry, LJ and DJ McGeoch, The DNA sequences of the long repeat region and adjoining parts of the long unique region in the genome of herpes simplex virus type 1. J. Gen. Virol., 1988; 69: 2831-2846.

Claims

1. Verwendung eines mutierten Herpes simplex-Virus, das ein nichtfunktionelles γ34.5-Gen in jeder langen Wiederholungsregion (RL) aufweist, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines metastatischen Tumors, der im Zentralnervensystem eines Säugetiers auftritt, aber einen anderen Ursprung hat.

2. Verwendung nach Anspruch 1, worin das Säugetier ein Mensch ist.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin der metastatische Tumor im Gehirn auftritt.

4. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der metastatische Tumor ein metastasiertes Melanom ist.

5. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das mutierte Virus ein Herpes simplex-Virus vom Typ 1 ist.

6. Verwendung nach Anspruch 5, worin eine Deletion von 0,1 bis 3 kb innerhalb des BamHI s-Restriktionsfragments jeder RL-Wiederholung vorkommt.

7. Verwendung nach Anspruch 6, worin die Deletion 0,7 bis 2,5 kb ausmacht.

8. Verwendung nach Anspruch 7, worin die Deletion eine 759 bp-Deletion im γ34.5-Gen ist.

9. Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 8, worin das mutierte Virus ein Virus des mutierten Stamms 17 ist.

10. Verwendung nach Anspruch 5, worin das mutierte Virus Stamm 1716 ist.

11. Verwendung eines mutierten Herpes simplex Virus vom Typ 1, das aufgrund einer Deletion von 759 bp im γ34.5-Gen ein nichtfunktionelles γ34.5-Gen in jeder langen Wiederholungsregion (RL) aufweist, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Melanom-Krebs bei einem Säugetier.

12. Verwendung nach Anspruch 11, worin das mutierte Virus ein Virus des mutierten Stamms 17 ist.

13. Verwendung nach Anspruch 11 oder 12, worin das mutierte Virus Stamm 1716 ist.