DE60106222T2

DE60106222T2 - Herpesviren für die modulation einer immunantwort

Info

Publication number: DE60106222T2
Application number: DE60106222T
Authority: DE
Inventors: Stuart Robert COFFIN
Original assignee: Biovex Ltd
Current assignee: Biovex Ltd
Priority date: 2000-04-12
Filing date: 2001-04-12
Publication date: 2005-10-13
Anticipated expiration: 2021-04-13
Also published as: GB0009079D0; IL152055A; JP2003530369A; IL152055A0; EP1272652B1; AU4672801A; JP2012188440A; KR100805771B1; GB2376687B; GB2376687A; CN100351385C; ATE278795T1; ES2230291T3; WO2001077358A3; KR20030047883A; CA2405458C; JP5543528B2; HK1048136B; MXPA02010074A; CN1439056A

Description

FACHGEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft abgeschwächte Herpes-simplex-Viren, die zum effizienten Infizieren von dendritischen Zellen fähig sind. Sie betrifft außerdem die Verwendung solcher Viren bei immuntherapeutischen Ansätzen zur Behandlung von Krankheiten.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Dendritische Zellen (DCs) stellen die potentesten Antigen-präsentierenden Zellen dar und sind beim Induzieren von Antworten selbst auf Antigene wirksam, denen gegenüber das Immunsystem tolerant geworden ist. Daher kann für die Tumorimmuntherapie, bei der eine Immunantwort gegen einen Tumor hervorgerufen wird, die Verwendung von DCs ideal sein, wenn sie zum Präsentieren von Tumor-spezifischen Antigene gebracht wurden. DCs könnten auch zum Präsentieren von Antigenen, die von infektiösen Einheiten wie Bakterien, Viren oder Parasiten stammen, verwendet werden, indem sie schutzbringende oder therapeutische Impfstoffe für solche Krankheiten liefern. Allerdings hat sich der wirksame Transfer von Antigenen in DCs für eines dieser Ziele als das größte Problem bei diesem Ansatz erwiesen.
Um eine realistische Chance der Generierung einer therapeutischen Immunantwort gegen ein Tumorantigen oder ein anderes krankheitsbezogenes Antigen zu bieten, müssen verschiedene Bedingungen erfüllt sein. Zunächst ist die Identifizierung von Molekülen erforderlich, deren Expression tumor- oder krankheitsspezifsch (oder zumindest -selektiv) ist und die daher als das Ziel für eine Immunantwort dienen können. Diese Aufgabe hat sich für die Mehrzahl der verbreiteten Tumoren als schwierig erwiesen, wird aber zum Beispiel im Falle von Zervikalkrebs durch das Vorhandensein, in dem meisten Fällen, der viralen Onkogene E6 und E7 gelöst, wobei für andere Tumoren gute Kandidat-Antigene allmählich identifiziert werden. Zum Beispiel wird das MUC-1-Genprodukt in einer Reihe von Tumoren überexprimiert, einschließlich bei 90% der Eierstockkrebsarten. Verschiedene andere Tumor-assoziierte Antigene sind ebenfalls identifiziert worden, wobei jedes davon bei einer immuntherapeutischen Behandlung von Krebs verwendet werden könnte. Weitere Tumor-assoziierte Antigene werden zweifellos im Laufe der Zeit weiterhin entdeckt werden. Zweitens ist nach der Identifizierung des/der Antigens/e der Transport der Antigene in einer immunogenen Form zum Immunsystem erforderlich. Um die für die Tumorabstoßung entscheidende zelluläre Immunreaktion zu erzeugen, bedeutet dies, dass die Proteine entweder in das Innere des Zytoplasmas einer Wirtszelle transportiert werden müssen (eine schwierige Aufgabe bei hochmolekularen Proteinantigenen) oder nach dem Gentransport oder der DNA-Immunisation durch die Wirtszellen selbst synthetisiert werden müssen. Zu viralen Vektoren, die zu diesem Zweck erwogen wurden, zählen Vaccinia, Adenoviren oder Retroviren.
Der Zelltyp, der nun weithin als den optimalen Immunstimulus bereitstellend anerkannt ist, ist die dendritische Zelle (DC; siehe zum Beispiel Girolomoni und Ricciardi-Castagnoli, 1997). In der Tat erscheint die DC als der einzige Zelltyp, der zum Stimulieren einer primären Immunantwort in vivo fähig ist, und von dem darüber hinaus sogar gezeigt wurde, dass der zum Durchbrechen einer bestehenden Toleranz unter bestimmten Umständen fähig ist. Eine Reihe von Gruppen untersucht die Verwendung der DCs in autologen adoptiven Immuntherapie-Protokollen zur Stimulierung von Immunantworten gegen Tumoren in der Hoffnung, dass diese eine therapeutische Wirkung zeigen können. Diese Protokolle beziehen die Kultivierung und/oder Anreicherung von DCs aus peripherem Blut, die in vitro-Beladung von DCs mit Antigen und die Wiedereinführung der DCs in den Patienten oder die direkte in vivo-Beladung der DCs mit Antigen ein. Allerdings wurde dieser Ansatz durch das Nichtvorhandensein effizienter Methoden behindert, mittels derer diese Zellen mit Antigenen beladen werden sollen. Eine Arbeit der letzten Zeit hat jedoch gezeigt, dass die Präsentierung von Antigenen durch Peptid-gepulste DCs Anti-Tumorreaktionen in vivo erzeugt hat (Celluzzi et al. 1996; Zitvogel et al., 1996). Von den viralen Vektoren ergeben Retroviren keinen hocheffizienten Gentransport an dendritische Zellen (Reeves et al., 1996; Aicher et al., 1997), wobei bei unseren Untersuchungen, anders als bei einer von anderen berichteten Arbeit (Arthur et al., 1997), Adenoviren einen lediglich wenig effizienten Gentransport erbrachten.
Wir haben zuvor getestet und berichtet, dass Herpes-simplex-Viren (HSV) wirksam Gene infizieren und zu dendritischen Zellen transportieren können (Coffin et al., 1998; WO 00/08191). HSV weist eine Anzahl von Vorteilen gegenüber anderen Vektorsystemen für diesen Zweck auf, da es eine breite Vielfalt von Zelltypen wirksam infizieren kann (einschließlich einiger mit anderen Vektorsystemen sehr schwer infizierbaren Zelltypen, siehe z. B. Dilloo et al., 1997; Coffin et al., 1998), leicht manipulierbar ist und große DNA-Insertionen zulassen kann, was die Expression multipler Gene ermöglicht (im Überblick gezeigt bei Coffin und Latchman, 1996). Der Transport multipler Antigene zu dendritischen Zellen ex vivo, gefolgt von der Wiedereinführung in den Körper, oder die direkte Verabreichung der Antigene an dendritische Zellen in vivo können besonders vielversprechende Ansätze für die Behandlung einiger Krebsarten und Infektionserkrankungen darstellen.
WO 00/08191 lehrt, dass Wildtyp-Herpes-simplex-Viren die in infizierten dendritischen Zellen erfolgende Antigen-Prozessierung verhindern und dass Herpes-Viren, denen sowohl die funktionellen UL43- als auch die vhs-Gene fehlen oder die Mutationen enthalten, die eine immediate-early-Genexpression minimieren, zum wirksamen Infizieren von dendritischen Zellen fähig sind, ohne dabei die in den infizierten Zellen erfolgende Antigen-Prozessierung zu verhindern.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Wir haben nun überraschenderweise festgestellt, dass die Unterbrechung des Gens, dass das Virion-host-shut-off-Protein (vhs) in HSV-Vektoren codiert, das Erfolgen einer effizienten Aktivierung dendritischer Zellen in HSV-infizierten Zellen ermöglicht. Die Unterbrechung des UL43-Gens ist nicht ebenfalls erforderlich. Es wurde zuvor gezeigt, dass HSV-infizierte dendritische Zellen gewöhnlich weder durch die Infektion selbst noch durch andere Stimuli aktiviert werden (Salio et al. 1999, Kruse et al. 2000).
Wir haben eine bisher unbekannte Funktion des vhs-Proteins beim Verhindern der Aktivierung der dendritischen Zellen identifiziert. Die Aktivierung dendritischer Zellen ist als eine Heraufregulierung bestimmter Zelloberflächen-Marker relativ zum nicht-aktivierten Zustand definiert. Zu diesen Markern zählen CD83 und CD86. Die dendritische Zellaktivierung kann durch Behandlung mit Lipopolysaccharid (LPS) stimuliert werden. Die LPS-Behandlung von mit HSV infizierten dendritischen Zellen führt nicht zur Heraufregulierung von CD83 oder CD86. Wir haben gezeigt, dass die LPS-Behandlung von dendritischen Zellen, die mit einer HSV-Mutante infiziert sind, worin HSV inaktiviert ist, doch die ein funktionelles UL43-Gen aufweisen, sowohl CD83 als auch CD86 heraufreguliert. Die Heraufregulierung von CD83 und CD86 wird auf eine LPS-Behandlung von dendritischen Zellen, die mit Viren infiziert sind, die ein funktionelles vhs-Gen umfassen, nicht beobachtet. Daher zeigen unsere Ergebnisse, dass zur maximalen Stimulierung durch tranduzierte dendritische Zellen einer Immunantwort auf eine Herpes-Virusinfektion hin, das vhs codierende Gen unterbrochen werden sollte, dies beim UL543 codierenden Gen dagegen nicht erforderlich ist.
Unsere Ergebnisse weisen auch eine Rolle von vhs in der Pathogenese von Wildtyp-Herpes-simplex-Viren nach. HSV infiziert dendritische Zellen bei hoher Effizienz, und es erschiene wahrscheinlich, dass der Grund dafür, dass es sich dazu als einem Teil eines natürlichen Lebenszkylus entwickelt hat, der ist, dass es eine zellvermittelte Immunantwort minimieren kann, die im anderen Falle eine latente HSV-Infektion am wirksamen Manifestieren hindern oder zu einer Beseitigung des Virus während wiederholter Zyklen von Latenz und Reaktivierung führen könnte. Die Aktivierung der dendritischen Zellen ist bei der Stimulierung einer wirksamen zellvermittelten Immunantwort wichtig. vhs stellt ein Virion-Protein dar, weshalb das vhs-Protein, während HSV-Gene generell in dendritischen Zellen nicht in hohen Mengen exprimiert werden, an die dendritische Zelle zusammen mit dem eindringenden Virus transportiert werden würde. Daher ist die neuartige Funktion des vhs in der Verhinderung der Aktivierung von mit HSV infizierten dendritischen Zellen wahrscheinlich eine wichtige Funktion des vhs im HSV-Lebenszyklus auf die Infektion eines Menschen mit HSV hin.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines abgeschwächten Herpes-Virus bereit, welchem/s:

(i) ein funktionelles vhs-Gen, oder ein funktionelles Äquivalent davon, fehlt; und
(ii) ein funktionelles UL43-Gen, oder ein funktionelles Äquivalent davon, umfasst;

Das Virus kann eine oder mehrere zusätzliche Mutationen enthalten. Die zusätzlichen Mutationen minimieren vorzugsweise die Toxizität des Virus. Typischerweise führen solche Mutationen zu einer verminderten oder minimierten immediate-early-(IE)-Genexpression. Die Verhinderung oder Verminderung der IE-Genexpression verhindert oder vermindert die Virus-Replikation. Zu diesen Mutationen zählen beispielsweise inaktivierende Mutationen in den Genen, die ICP4, IPC27, PC0 und/oder ICP22 codieren, vorzugsweise ICP27 und/oder ICP4. Eine inaktivierende Mutation im vmw65-codierenden Gen, die seine transaktivierende Funktion entfernt, kann ebenfalls aufgenommen werden (z. B. vmw56-Mutationen wie bei Ace et al., 1989 oder Smiley et al., 1997). Vorzugsweise können die zusätzlichen Mutationen auch die Immunantwort-hemmende Aktivität des Virus minimieren. Zu solchen Mutationen zählen die Inaktivierung des IC47 codierenden Gens.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Virusstämme 1764/27-/4-, 1764/27-/4-/pR20.5/vhs, 1764/27-/4-/pR20.5/vhs/HBS-Ag und Wildtyp-HSV-Stamm 17+.
2 zeigt die Ergebnisse der FACS-Analyse zur Bestimmung der Niveaus der Zelloberflächen-Expression von CD40, CD80, CD83 und CD86 auf unstimulierte (2A) und LPS-stimulierte (2B) mock-infizierte Zellen und mit 17⁺, 1764/27-/4- und 1764/27-/4-/pR20.5/vhs-Virusstämmen infizierte Zellen.
3 zeigt die Ergebnisse der ELISA-Analyse zur Bestimmung der Wirkung einer Virusinfektion auf die IL-6- und TNFα-Sekretion aus uninfizierten dendritischen Zellen und mit 17⁺, 1764/27-/4- und 1764/27-/4-/pR20.5/vhs-Virusstämmen infizierten dendritischen Zellen.
4 zeigt die proliferativen Reaktionen auf T-Zellen, die aus Hepatitits-B-geimpften und nicht-geimpften Individuen als Reaktion auf HBS-Ag präpariert wurden. Die von jedem Individuum genommenen dendritischen Zellen waren entweder unbehandelt, mit rekombinantem HBS-Ag-Protein (HBSAg*) gemischt, mit dem Kontroll-Vektor (1764/27-/4-/pR20.5/vhs HBSAg) infiziert oder mit dem Vektor infiziert, der HBS-AG (1764/27-/4-/pR20.5/vhs/HBS-Ag) exprimiert, bevor sie mit den T-Zellen gemischt werden.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
A. Viren
Ein Virus der Erfindung ist zum Infizieren von dendritischen Zellen fähig, ohne die Aktivierung der infizierten dendritischen Zellen zu behindern. Vorzugsweise können die mit einem Virus der Erfindung bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 1 infizierten dendritischen Zellen durch eine Behandlung mit LPS oder anderen Aktivierungsstimuli aktiviert werden.
Ein Virus der Erfindung verhindert die Aktivierung der dendritischen Zellen nicht. Um zu bestimmen, ob ein Virus das Erfolgen der Aktivierung der dendritischen Zellen erlaubt, werden dendritische Zellen mit dem Virus bei einer MOI ≥ 1 infiziert und die infizierten dendritischen Zellen mit LPS behandelt. Die Mengen an Zelloberflächen-Marker wie CD83 und/oder CD86, die durch Aktivierung der dendritischen Zellen heraufreguliert werden, können zur Bestimmung der Aktivierung der dendritischen Zellen zum Beispiel durch FACS-Analyse überwacht werden. Die Menge dieser Marker auf der Zelloberfläche wird bei LPS-behandelten dendritischen Zellen signifikant höher sein als bei Zellen, die nicht mit LPS behandelt wurden, sofern das Virus, mit dem die Zellen infiziert sind, das Erfolgen der Aktivierung der dendritischen Zellen erlaubt. Einige oder alle dieser Marker werden auch in höheren Mengen auf dendritischen Zellen, die mit einem Virus infiziert wurden, das das Erfolgen der Aktivierung der dendritischen Zellen erlaubt, im Vergleich zu nicht-infizierten dendritischen Zellen vorkommen. Wird ein Herpes simplex-Virus, das keine inaktivierende Mutation in vhs enthält, zum Infizieren von dendritischen Zellen verwendet, so wird eine beträchtlich geringere Heraufregulierung dieser Marker beobachtet.
Um das Erfolgen der Aktivierung der infizierten dendritischen Zellen zu ermöglichen, wird einem Virus der Erfindung ein funktionelles Gen, das vhs (in HSV) codiert, oder Homologa oder funktionelle Äquivalente davon in anderen Virusspezies fehlen. Außerdem wird ein Virus der Erfindung ein funktionelles UL43-Gen aufweisen. Zusätzliche Mutationen können zur weiteren Verminderung der Immunantwort-hemmenden Wirkungen des Virus vorgenommen werden, zum Beispiel durch Einbau einer Mutation im IC47 codierenden Gen.
Ein abgeschwächtes Virus der Erfindung ist vorzugsweise zum Infizieren von dendritischen Zellen so fähig, dass eine minimale Toxizität resultiert. Vorzugsweise beträgt die Zellüberlebensrate nach Infektion mindestens 50% einen Tag nach der Infektion, bevorzugter mindestens 60, 70, 80 oder 90% einen Tag nach der Infektion. Um eine verminderte Toxizität zu erreichen, können ein oder mehrere Mutationen, welche die Virusreplikationen vermindern, in ein Virus der Erfindung eingebaut werden. Zum Beispiel kann eine Mutation im VMW65 codierenden Gen, welche Mutation die transaktivierende Aktivität des Proteins minimiert, und/oder eine Mutation in ein oder mehreren regulatorischen immediate-early-Genen wie ICP4, ICP27, ICP0 und ICP22, aufgenommen werden. So können einem Virus der Erfindung typischerweise die funktionellen vhs-, ICP27-, ICP4-Gene fehlen und kann es ein VMW65-Gen umfassen, welches ein Protein codiert, das keine Aktivität für die transkriptionelle Aktivierung aufweist, oder dem typischerweise die funktionellen vhs-, ICP47- und ICP4-Gene fehlen.
Zur direkten in vivo-Anwendung kann ein gewisser Grad an Replikations-Kompetenz typischerweise zum Verstärken der induzierten Immunantwort vorteilhaft sein. Daher fehlt einem Virus der Erfindung unter diesen Umständen vorzugsweise ein funktionelles vhs-Gen, und können ihm außerdem ein oder mehrere funktionelle Gene fehlen, die für die volle Pathogenität des Virus erforderlich sind, doch nicht für die Virusreplikation notwendig sind. Zu diesen Genen zählen jene, die ICP34.5, ICP6, Thymidinkinase und Glykoproteine wie gH codieren. Vorzugsweise ist jedoch das Thymidinkinase codieren de Gen funktionell, da eine Mutation dieses Gens das Virus gegenüber antiviralen Agenzien wie Acyclovir unempfindlich machen würde.
Obschon die vorliegende Erfindung anhand der Herpes-simplex-Viren beispielhaft veranschaulicht wurde, wird zu verstehen sein, dass andere Viren der Herpesviridae-Familie modifiziert werden können, um die Verhinderung der dendritischen Zellaktivierung von infizierten dendritischen Zellen zu vermindern. Insbesondere können diese Viren Varicella-zoster-Virus, Pseudowut-Virus oder Rinder-Herpes-Viren umfassen.
Ist das Virus der Erfindung ein Herpes-simplex-Virus, so kann das Virus beispielsweise von HSV1- oder HSV2-Stämmen, oder Derivaten davon, vorzugsweise HSV1, stammen. Zu Derivaten zählen Intertyp-Rekombinanten, die DNA von HSV1- und HSV2-Stämmen enthalten. Solche Intertyp-Rekombinanten sind im Fachgebiet beschrieben, zum Beispiel bei Thompson et al. (1988) und Meignier et al. (1988). Die Derivate weisen vorzugsweise mindestens 70% Sequenzhomologie entweder zu den HSV1- oder HSV2-Genomen auf, bevorzugter mindestens 80%, sogar noch bevorzugter mindestens 90 oder 95%, wie typischerweise mittels den hierin beschriebenen Methoden gemessen. Bevorzugter weist ein Derivat mindestens 70% Sequenzidentität entweder zum HSV1- oder HSV2-Genom auf, bevorzugter mindestens 80% Identität, sogar noch bevorzugter mindestens 90%, 95% oder 98% Identität.
Ein Derivat kann die Sequenz eines HSV1- oder HSV2-Genoms aufweisen, das durch Nukleotid-Substitutionen modifiziert ist, zum Beispiel 1, 2 oder 3 bis 10, 25, 50 oder 100 Substitutionen. Das HSV1- oder HSV2-Genom kann alternativ oder zusätzlich durch ein oder mehrere Insertionen und/oder Deletionen und/oder durch eine Extension an einem oder beiden Enden modifiziert sein.
Derivate, die zum Erhalt der Viren der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen Stämme, die bereits Mutationen in Genen aufweisen, deren funktionelle Inaktivierung in einen Virus der Erfindung erwünscht ist, zum Beispiel vhs-inaktivierte Stämme (wie bei Jones of al. 1995), ICP47-inaktivierte Stämme (wie bei Goldsmith et al. 1998), Stamm d120, der eine Deletion in ICP4 aufweist (DeLuca et al. 1985), Stamm d27-1 (Rice und Knipe, 1990), der eine Deletion in ICP27 aufweist oder Stamm d92, der Deletionen sowohl in ICP27 als auch ICP4 aufweist (Samaniego et al., 1995). Die Verwendung dieser Stämme wird die Zahl der Schritte verringern, die zur Erzeugung der mutierten HSV-Stämme der vorliegenden Erfindung erforderlich sind.
Die zur Beschreibung der verschiedenen HSV-Gene verwendete Terminologie ist wie bei Coffin und Latchman, 1996, zu finden.
Dort, wo Gen-Homologa der oben beschriebenen HSV-Gene in anderen Herpes-Virus-Spezies existieren, werden diese Homologa modifiziert. Mit einem "Homologon" ist ein Gen gemeint, das einem HSV-Gen funktionell äquivalent ist, wobei ein Homologon typischerweise eine Sequenzhomologie, d. h. entweder Aminosäure- oder Nukleinsäure-Sequenzhomologie, zum entsprechenden HSV-Gen aufweist. Typischerweise wird ein Homologon eines HSV-Gens zu mindestens 15%, vorzugsweise mindestens 20%, bevorzugter mindestens 30%, 40% oder 50% identisch zum entsprechenden HSV-Gen hinsichtlich der Aminosäuresequenz sein.
Ein vhs codierendes Gen ist das UL41-Gen in HSV1 und HSV2. Im HSV1-Stamm 17+ (EMBL Zugriffsnr. HE1CG) geht das UL41-Gen von Nukleotid 91.170 bis Nukleotid 92.637. Im HSV2-Stamm HG52 (EMBL Zugriffsnr. Z86099) geht das UL41-Gen von Nukleotid 91.800 bis Nukleotid 93.275.
Methoden zur Messung der Nukleinsäure- und Proteinhomologie sind im Fachgebiet wohlbekannt. Zum Beispiel enthält das UWGCG-Package das BESTFIT-Programm, das zur Berechnung der Homologie verwendet werden kann (beispielsweise bei seinen Default-Settings verwendet) (Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Research 12, S. 387–395). Die PILEUP- und BLAST-Algorithmen können zur Berechnung der Homologie oder Aufstellung der Sequenzen (typischerweise bei ihren Default-Settings) verwendet werden, wie zum Beispiel beschrieben bei Altschul (1993) J. Mol. Evol. 36: 290–300; Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–10.
Die Software zur Durchführung der BLAST-Analysen ist öffentlich zugänglich durch die National Centre for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Dieser Algorithmus beinhaltet zunächst das Identifizieren von high scoring Sequenzpaaren (HSPs) durch Identifizieren kurzer Wörter der Länge W in der fraglichen Sequenz, die entweder übereinstimmen oder einen gewissen positiv-gewerteten Schwellenwert T erfüllen, wenn unter ein Wort derselben Länge in einer Datenbank-Sequenz geschrieben. T wird als die Nachbarschaftswort-Schwellenwert bezeichnet (Altschul et al., 1990). Diese anfänglichen Nachbarschafts-Worttreffer dienen als Nährboden zur Einleitung der Suche nach HSPs, die es enthalten. Die Worttreffer werden in beide Richtungen entlang jeder Sequenz ausgeweitet, und zwar so weit, wie der Gesamtalignmentscore erhöht werden kann. Die Ausweitungen der Worttreffer in jeder Richtung werden zum Einhalten gebracht, wenn: der Gesamtalignmentscore um die Menge X von seinem maximal erreichten Wert abfällt; der Gesamtscore gegen Null oder darunter geht aufgrund der Anhäufung einer oder mehrerer negative-scoring residue alignments; oder das Ende jeder Sequenz erreicht ist. Die BLAST-Algorithmus-Parameter W, T und X bestimmen die Empfindlichkeit und Geschwindigkeit des Alignment. Das BLAST-Programm verwendet als Defaults eine Wortlänge (W) von 11, die BLOSUM62-Scoring-Matrix (siehe Henikoff und Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915–10919), Alignments (B) von 50, Erwartung (E) von 10, M = 5, N = 4 und einen Vergleich beider Stränge.
Der BLAST-Algorithmus führt eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen durch; siehe z. B. Karlin und Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873–5787. Ein durch den BLAST-Algorithmus geliefertes Maß der Ähnlichkeit ist die kleinste Summenwahrscheinlichkeit (P(N)), welche eine Angabe der Wahrscheinlichkeit liefert, mit der eine Passung zwischen zwei Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen zufällig auftreten würde. So wird beispielsweise eine Sequenz als ähnlich zu einer anderen Sequenz erachtet, wenn die kleinste Summenwahrscheinlichkeit im Vergleich der ersten Sequenz zur zweiten Sequenz weniger als etwa 1, vorzugsweise weniger als etwa 0,1, bevorzugter weniger als etwa 0,01 und am bevorzugtesten weniger als etwa 0,001 beträgt.
Homologa der HSV-Gene können in einer Reihe von Weisen identifiziert werden, zum Beispiel durch Sondieren von genomischen oder cDNA-Banken, die von anderen Viren hergestellt wurden, mit Sonden, die das gesamte oder einen Teil des HSV-Gens unter Bedingungen von mittlerer bis hoher Stringenz umfassen (z. B. 0,03 M Natriumchlorid und 0,03 M Natriumcitrat bei etwa 50°C bis etwa 60°C). Alternativ können Spezies-Homologa auch unter Anwendung der degenerierten PCR erhalten werden, bei der zum Anzielen von Sequenzen innerhalb der Varianten und Homologa, die konservierte Aminosäuresequenzen codieren, gestaltete Primer verwendet werden. Die Primer werden ein oder mehrere degenerierte Positionen enthalten und werden bei weniger stringenten Bedingungen als für das Klonieren von Sequenzen mit einzelnen Sequenz-Primern gegen bekannte Sequenzen (z. B. 0,03 M Natriumchlorid und 0,03 M Natriumcitrat bei etwa 40°C) verwendet eingesetzt werden.
Ein Homologon in einem Herpes-Virus ist ein funktionelles Äquivalent eines HSV-Proteins, wenn es eine oder mehrere funktionelle Eigenschaften mit dem HSV-Protein teilt. Zum Beispiel spielt ein vhs-Protein eine Rolle in der Reduzierung der Niveaus der Proteinexpression in einer infizierten Zelle, indem es die Stabilität der mRNA vermindert. Daher spielt ein funktionelles Äquivalent eines vhs-Proteins vorzugsweise eine Rolle im Einstellen der Wirtszell-Genexpression, indem es die Stabilität der mRNA vermindert. Bevorzugter verhindert ein funktionelles Äquivalent von vhs die dendritische Zellaktivierung als Reaktion auf Stimuli, die nicht-infizierte dendritische Zellen aktivieren.
Aus Gründen der Sicherheit sind die Viren der Erfindung abgeschwächt, und zwar typischerweise so, dass sie zur Verursachung einer Erkrankung unfähig sind. Zu Zwecken der Abschwächung veränderte virale Regionen können entweder eliminiert (vollständig oder teilweise) oder nicht-funktionell gemacht werden oder durch andere Sequenzen, insbesondere durch eine heterologe Gensequenz, substituiert werden. Abschwächende Mutationen wurden für alle als virale Vektoren verwendete Virusgruppen beschrieben. Zum Beispiel kann HSV durch Mutationen in ICP34.5 und/oder essentielle Gene wie ICP4, ICP27 und/oder das vhs-Gen selbst avirulent gemacht werden.
Zu besonders bevorzugten abgeschwächten Viren zählen Viren, denen über das Fehlen eines funktionellen Gens, das vhs codiert, und wahlweise Fehlens eines funktionellen ICP47-Gens hinaus, ein funktionelles ICP34.5-Gen und ein funktionelles ICP27-Gen fehlt und denen wahlweise ein funktionelles ICP4-Gen und/oder ein VMW65-Gen fehlt, welches ein Protein codiert, das eine Aktivität für die transkriptionelle Aktivierung aufweist, und Viren, die ein funktionelles ICP27-Gen aufweisen, doch denen ein funktionelles ICP4-Gen und ein funktionelles ICP34.5-Gen fehlt und denen wahlweise ein VMW65-Gen fehlt, welches ein Protein codiert, das eine Aktivität für die transkriptionelle Aktivierung aufweist. Solche Viren sind beschrieben in WO98/04726 und WO99/60145, deren Beschreibungen hierin durch Bezugnahme mit aufgenommen sind.
Fehlt einem Herpes-simplex-Virus der Erfindung ein bestimmtes funktionelles essentielles Gen, zum Beispiel ein ICP4 oder ICP27 codierendes Gen, so wird das Virus unter Verwendung einer Zelllinie vermehrt, die dieses essentielle Gen exprimiert. Fehlt dem Virus beispielsweise ein funktionelles ICP27-Gen, so kann das Virus unter Verwendung von V27-Zellen (Rice und Knipe, 1990), 2-2-Zellen (Smith et al., 1992) oder B130/2-Zellen (WO98/30707), vorzugsweise B130/2-Zellen vermehrt werden. Fehlt dem Virus ein funktionelles ICP4-Gen, so kann das Virus unter Verwendung einer Zelllinie vermehrt werden, die ICP4 exprimiert, zum Beispiel E5-Zellen (DeLuca et al., 1985). Fehlt dem Virus ein funktionelles ICP4-Gen und ein funktionelles ICP27-Gen, so wird das Virus unter Verwendung einer Zelllinie vermehrt, die sowohl ICP4 als auch ICP27 exprimiert (wie etwa E26-Zellen; Samaniego et al., 1995), und fehlt dem Virus außerdem ein funktionelles VMW65-Gen, so kann das Virus unter Verwendung einer Zelllinie vermehrt werden, die außerdem ein Nicht-HSV-Homologon von VMW65 enthält (z. B. Schweine-Herpes-Virus-Gen 12 oder BTIF von Rinder-Herpes-Virus).
B. Methoden der Mutation
Die verschiedenen genannten viralen Gene können mittels verschiedener im Fachgebiet wohlbekannter Techniken funktionell inaktiv gemacht werden. Zum Beispiel können sie durch Deletion(en), Substitution(en) oder Insertion(en), vorzugsweise durch Deletion, funktionell inaktiv gemacht werden. Eine Deletion kann Teile eines Gens oder das gesamte Gen entfernen. Zum Beispiel kann eine Deletion lediglich eines Nukleotids vorgenommen werden, was zu einem Frame-Shift führt. Vorzugsweise werden jedoch größere Deletionen vorgenommen, zum Beispiel von 2, 3 oder 5 bis 10, 20, 30, 50, 100 oder 200 Nukleotid-Substitutionen. Vorzugsweise werden mindestens 25%, bevorzugter mindestens 50% der gesamten codierenden und nicht-codierenden Sequenz (oder alternativ, absolut ausgedrückt, mindestens 10 Nukleotide, bevorzugter mindestens 100 Nukleotide, am bevorzugtesten mindestens 1000 Nukleotide) deletiert oder substituiert. Besonders bevorzugt wird das gesamte Gen und ein Teil der flankierenden Sequenzen entfernt. Inserierte Sequenzen können die nachstehend beschriebenen heterologen Gene umfassen. Mutationen können sowohl Deletion(en) als auch Insertionen) umfassen. Zum Beispiel kann eine Insertion in die Stelle einer Deletion erfolgen. So kann die Insertion eines heterologen Gens in ein virales Gen einen Teil oder das gesamte virale Gen ersetzen. Besonders bevorzugt ist die Insertion des heterologen Gens in vhs, ICP47, ICP27 oder ICP4. Im Falle des VMW65-Gens wird nicht das gesamte Gen deletiert, da es ein wesentliches Strukturprotein codiert, doch wird typischerweise eine inaktivierende Mutation vorgenommen, welche die Fähigkeit des VMW65 aufhebt, transkriptionelle IE-Gene zu aktivieren (z. B. wie bei Ace et al., 1989 oder Smiley et al., 1997).
Mutationen können in den Herpes-Viren durch homologe Rekombinationsmethoden vorgenommen werden, wie sie den Fachleuten des Gebiets wohlbekannt sind. Zum Beispiel wird HSV-genomische DNA zusammen mit einem Vektor, vorzugsweise einem Plasmid-Vektor, transfiziert, der die mutierte Sequenz, flankiert durch homologe HSV-Sequenzen, enthält. Die mutierte Sequenz kann Deletionen, Insertionen und Substitutionen umfassen, die alle durch routinemäßige Techniken konstruiert werden können. Insertionen können selektierbare Marker-Gene umfassen, zum Beispiel lacZ oder GFP, um rekombinante Viren mittels zum Beispiel der β-Galactosidase-Aktivität oder der Fluoreszenz zu screenen.
C. Heterologe Gene und Promotoren
Die Viren der Erfindung können so modifiziert werden, dass sie ein oder mehrere heterologe Gene tragen. Der Begriff "heterologes Gen" umfasst ein beliebiges Gen. Obschon ein heterologes Gen typischerweise ein solches ist, das im Genom eines Herpes-Virus nicht vorhanden ist, kann ein Herpes-Gen verwendet werden, vorausgesetzt, dass die Codierungssequenz nicht funktionsfähig an die viralen Kontrollsequenzen geknüpft ist, mit denen es natürlicherweise assoziiert ist. Das heterologe Gen kann eine beliebige allele Variante eines Wildtyp-Gens sein oder kann ein mutiertes Gen sein. Der Begriff "Gen" soll Nukleinsäuresequenzen abdecken, die zumindest transkribierbar sind, um ein RNA-Molekül zu erzeugen, welches RNA-Molekül vorzugsweise zur Er zeugung eines Polypeptids oder zur Herabregulierung der Genexpressionshöhen durch eine Antisense-Wirkung translatierbar ist. Ein Virus der Erfindung kann wahlweise einen Teil oder die gesamten 5'- und/oder 3'-transkribierten, doch untranslatierten flankierenden Sequenzen natürlicherweise umfassen, oder ansonsten mit der translatierten Codierungssequenz eines heterologen Gens assoziiert sein. Es kann außerdem wahlweise die assoziierten Transkriptionskontrollsequenzen enthalten, die normalerweise mit den transkribierten Sequenzen assoziiert sind, zum Beispiel Transkriptionsstoppsignale, Polyadenylierungsstellen oder Downstream-Enhancer-Elemente.
Das oder die heterologe(n) Gen(e) können in das virale Genom durch homologe Rekombination der HSV-Stämme mit beispielsweise Plasmid-Vektoren inseriert werden, die das oder die heterologe(n) Gene, flankiert durch HSV-Sequenzen, tragen. Das oder die heterologe(n) Gene) können in einen geeigneten Plasmid-Vektor eingeführt werden, der Herpes-Virussequenzen umfasst, unter Anwendung von im Fachgebiet wohlbekannten Klonierungstechniken. Das heterologe Gen/Gene kann in das virale Genom an einem beliebigen Ort eingebaut werden, vorausgesetzt, dass das Virus nach wie vor vermehrt werden kann. Bevorzugt ist, dass das oder die heterologe(n) Gen(e) so in ein Gen eingebaut wird/werden, dass dies zu einer Abschwächung des Virus führt. Heterologe Gene können an vielfältigen Stellen innerhalb des Virus-Genoms inseriert werden.
Die transkribierte Sequenz des/r heterologen Gens/Gene ist vorzugsweise funktionsfähig an eine Kontrollsequenz geknüpft, was die Expression des heterologen Gens/Gene in dendritischen Zellen, vorzugsweise dendritischen Säugerzellen, noch bevorzugter humanen dendritischen Zellen, erlaubt. Der Begriff "funktionsfähig verknüpft" bezieht sich auf eine Juxtaposition, bei der die beschriebenen Komponenten in einer Beziehung zueinander stehen, die ihnen ihre Funktion in der vorgesehenen Weise erlaubt. Eine Kontrollsequenz, die "funktionsfähig geknüpft" an eine Codierungssequenz ist, ist in solcher Weise ligiert, dass die Expression der Codierungssequenz unter Bedingungen erreicht wird, die mit der Kontrollsequenz kompatibel sind.
Die Kontrollsequenz umfasst einen Promotor, der die Expression des/r heterologen Gens/Gene erlaubt, und ein Signal zur Beendigung der Transkription. Der Promotor wird gewählt aus Promotoren, die in Säugern funktional sind, vorzugsweise humane dendritische Zellen. Der/Die Promotor(en) kann von Promotorsequenzen von eukaryontischen Genen hergeleitet sein. Zum Beispiel können die Promotoren vom Genom einer Zelle hergeleitet sein, in der die Expression des heterologen Gens erfolgen soll, vorzugsweise einer dendritischen Säugerzelle oder noch bevorzugter einer humanen dendritischen Zelle. Bezüglich der eukaryontischen Promotoren können dies Promotoren sein, die überall funktionieren (wie etwa Promotoren von β-Actin, Tubulin), oder alternativ spezifisch in einer dendritischen Zelle. Virale Promotoren können ebenfalls verwendet werden, zum Beispiel der Murine Moloney-Leukämie-Virus-Long-Terminal-Repeat (MMLV LTR)-Promotor oder andere retrovirale Promotoren, die humanen oder Mäuse-Cytomegalovirus (CMV)-IE-Promotoren.
Expressionskassetten und andere geeignete Konstrukte, die das/die heterologe(n) Gen(n) und Kontrollsequenzen umfassen, können unter Anwendung routinemäßiger Kloniertechniken erzeugt werden, wie sie den Fachleuten des Gebiets bekannt sind (siehe zum Beispiel Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning – a laboratory manual; Cold Spring Harbor Press).
Außerdem können jegliche dieser Promotoren durch Hinzufügung weiterer regulatorischer Sequenzen modifiziert werden, zum Beispiel Enhancer-Sequenzen (einschließlich Elementen der HSV-LAT-Region). Chimäre Promotoren können ebenfalls verwendet werden, die Sequenzelemente von zwei oder mehreren der oben beschriebenen unterschiedlichen Promotoren umfassen, zum Beispiel einen MMLV LTR/LAT-Fusionspromotor (Lokensgard et al., 1994) oder Promotoren, die Elemente der LAT-Region umfassen (WO98/30707).
Heterologe Gene codieren typischerweise Polypeptide zur therapeutischen Anwendung. Um zum Beispiel eine spezifisch gegen einen bestimmten Tumor gerichtete Immunantwort zu fördern, ist es wünschenswert, dendritische Zellen mit einem Virus der Erfindung zu transfizieren, das die Expression eines Tumorantigens/e lenkt. Ein Tumorantigen kann für eine Tumorzelle spezifisch sein, d. h. in Tumorzellen vorhanden sein, doch nicht in Nicht-Tumorzellen, oder in höheren Mengen in der Tumorzelle vorhanden sein als in einer Nicht-Tumorzelle jenes Typs, zum Beispiel aufgrund der Heraufregulierung der Expression des Antigens. Dies wird in der Krebstherapie nützlich sein, da eine infizierte dendritische Zelle der Erfindung zum Stimulieren des Wirts-Immunsystems verwendet werden kann, um auf das/die Tumor-spezifische(n) oder Tumor-vorherr-schende(n) Antigen/e zu reagieren, was zur Reduktion/Rückbildung des Tumors führt. Besonders bevorzugt ist, dass das/die Tumorantigen/e an der Oberfläche der Tumorzelle exprimiert wird, zum Beispiel an einem Zelloberflächenrezeptor oder Zell-Adhäsionsprotein. Zu Beispielen der Tumorantigene zählen das MUC-1-Genprodukt (Gendler et al., 1990), welches in einer Reihe von Tumoren überexprimiert wird, einschließlich Eierstockkrebs, die humanen Papillomavirus-Proteine E6 und E7, die mit Zervikalkrebs in Verbindung stehen, MART-I, MAGE-I, gp100 und Tyrosinase in Melanom, PSA in Prostatakrebs, CEA in einer Reihe unterschiedlicher Tumorarten und Her2neu in verschiedenen Krebsarten, einschließlich Brustkrebs.
Heterologe Gene können auch ein Polypeptid codieren, welches zum Modifizieren einer Immunantwort in der Lage ist, zum Beispiel Zytokine (wie etwa α-, β- oder γ-Interferon, Interleukine einschließlich IL-1, IL-2, Tumornekrosefaktor oder Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren I oder II) oder andere immunmodulatorische Proteine einschließlich Chemokinen wie RANTES und costimulatorischen Molekülen wie CD80, CD86, CD40 und CD40-Ligand.
Das heterologe Gen kann auch ein oder mehrere Polypeptide von pathogenem Ursprung codieren, so dass zum Beispiel eine mit einem Virus der Erfindung infizierte dendritische Zelle zum Stimulieren des Wirts-Immunsystems verwendet werden kann, um eine Immunantwort auf ein Pathogen, entweder vor der Infektion oder nach der Infektion des Wirts durch das Pathogen, zu erhalten. Viren zur Verwendung in Impfstoffen können typischerweise heterologe Gene umfassen, die ein oder mehrere antigenes Polypeptide codieren. Vorzugsweise sind diese Polypeptide eines pathogenen Ursprungs von pathogenen Organismen abgeleitet, zum Beispiel Parasiten, Bakterien oder Viren. Zu Beispielen solcher antigener Polypeptide zählen Hepatitis-C-Virus-Antigene, Hepatitis-B-Oberflächen- oder Kernantigene, Papillomavirus-Antigene, HIV-Antigene und Malaria-Antigene. Viren, die heterologe Gene von pathogenen Organismen umfassen, können für die therapeutische und/oder prophylaktische Behandlung verwendet werden.
Therapeutische Anwendungen können durchaus die Verwendung vielfacher Gene erfordern. Die Expression der vielfachen Gene kann für die Behandlung einer Vielfalt von Bedingungen vorteilhaft sein. Herpes-Viren sind in einzigartiger Weise geeignet, da sie nicht die begrenzten Verpackungsmöglichkeiten der anderen viralen Vektorsysteme aufweisen. So können vielfache heterologe Gene innerhalb ihres Genoms untergebracht werden. Zum Beispiel können 2 bis 6 Gene in das Genom eingebaut werden.
Es gibt zum Beispiel mindestens zwei Weisen, in der dies erreicht werden könnte. Zum Beispiel könnten mehr als ein heterologes Gen und die assoziierten Kontrollsequenzen in einen bestimmten HSV-Stamm entweder an einer einzelnen Stelle oder an vielfachen Stellen im Virusgenom eingeführt werden. Es wäre ebenfalls möglich, Promotor-Paare zu verwenden (dieselben oder unterschiedliche Promotoren), die in entgegengesetzte Orientierungen voneinander weg zeigen, wobei diese Promotoren jeweils die Expression eines heterologen Gens (desselben oder eines unterschiedlichen heterologen Gens) antreiben, wie oben beschrieben.
D. Dendritische Zellen
Dendritische Zellen können anhand einer Reihe von Methoden isoliert/präpariert werden; zum Beispiel können sie entweder direkt aus peripherem Blut ausgereinigt oder aus CD34+-Vorläuferzellen zum Beispiel nach Mobilisierung in peripheres Blut durch Behandlung mit G-CSF oder direkt aus Knochenmark generiert werden. Adhärente Vorläufer aus peripherem Blut können mit einem GM-CSF/IL-4-Gemisch behandelt werden (Inaba et al., 1992), oder nicht-adhärente CD34+-Zellen aus Knochenmark können mit GM-CSF und TNF-α behandelt werden (Caux et al., 1992). DCs können aus dem peripheren Blut menschlicher Freiwilliger routinemäßig hergestellt werden, ähnlich der Methode von Sallusto und Lanzavecchia, 1994, unter Verwendung von aus peripherem Blut ausgereinigten Mononukleozyten (PBMCs) und 2-stündiger Behandlung der adhärenten Zellen mit GM-CSF und IL-4. Diese werden dann von CD19+-B-Zellen und CD3+-, CD2+-T-Zellen unter Verwendung von Magnetkügelchen befreit (siehe Coffin et al., 1998). Auch andere Methoden können zur Präparierung der dendritischen Zellen angewendet werden.
E. Therapeutische Anwendungen
Die Viren der Erfindung, und die mit Viren der Erfindung infizierten dendritischen Zellen, können bei Therapiemethoden angewendet werden. Insbesondere Viren der Erfindung, und mit Viren der Erfindung infizierte dendritische Zellen, die Tumorantigene exprimieren, können bei Methoden zur Behandlung von Krebs angewendet werden. Spezifisch können Viren der Erfindung, und mit Viren der Erfindung infizierte dendritische Zellen, zur Hemmung des Wachstums verschiedener Tumoren in Säugern, einschließlich Menschen, verwendet werden, wie zum Beispiel Eierstock-, Zervikal- und Endometrialtumoren, und Karzinomen, zum Beispiel Brustkarzinom, Lungenkarzinom, Blasenkarzinom und Dickdarmkarzinom. Zu weiteren Neoplasmen, deren Wachstum gehemmt werden kann, zählen Sarkome, zum Beispiel Weichteil- und Knochensarkome, und hämatologische Malignitäten wie Leukämien. Zu spezifischen Beispielen der Krebsarten, die unter Verwendung der Viren der Erfindung und/oder der mit Viren der Erfindung infizierten dendritischen Zellen, die Tumorantigene exprimieren, behandelt werden können, zählen Melanome, Leukämien, Zervikalkrebsarten und Eierstockkrebsarten. Ein Virus zur Verwendung in der Behandlung von Krebs umfasst typischerweise ein heterologes Gen, das ein Tumorantigen codiert. Die Verabreichung solch eines Virus, oder von mit solch einem Virus infizierten dendritischen Zellen, führt typischerweise zur Generierung einer Immunantwort auf das Tumorantigen.
Die Viren der Erfindung, und die mit den Viren der Erfindung infizierten dendritischen Zellen, können bei Methoden zur Behandlung oder Verhütung von pathogenen Infektionen, zum Beispiel parasitären, bakteriellen oder viralen Infektionen, verwendet werden. Ein Virus zur Verwendung in der Behandlung einer pathogenen Infektion umfasst typischerweise ein heterologes Gen, das ein Antigen vom pathogenen Organismus codiert. Die Verabreichung solch eines Virus, oder mit solch einem Virus infizierter dendritischer Zellen, führt typischerweise zur Generierung einer Immunantwort auf das Antigen vom pathogenen Organismus. Zu diesen Virusinfektionen zählen Herpes-Virus-Infektionen. So kann ein Virus der Erfindung zum Induzieren von Immunantworten auf das Virus selbst verwendet werden, zum Beispiel in der Behandlung oder Vakzination einer HSV1- oder HSV2-Infektion. Wo ein Virus zur Verwendung in der Behandlung von HSV1 oder HSV2 vorgesehen ist, kann das Virus wahlweise ein heterologes Gen enthalten, welches heterologe Gen ein HSV-Antigen codiert (welches nicht unter der Kontrolle seines natürlichen Promotors ist) oder ein immunmodulatorisches Molekül. Die Viren/dendritischen Zellen können vor der Infektion zur Stimulierung einer schützenden Immunantwort im Wirt oder nach der Infektion zur Stimulierung des Wirts-Immunsystems zur Abwehr der Infektion verabreicht werden.
F. Verabreichung
Die Herpes-Viren der vorliegenden Erfindung können daher zur Verabreichung therapeutischer Gene an einen Menschen oder ein Tier, der oder das einer Behandlung bedarf, verwendet werden. Die Verabreichung therapeutischer Gene unter Verwendung der Herpes-Viren der Erfindung kann zur Behandlung beispielsweise von Malignitäten und/oder pathogenen Infektionen verwendet werden.
Die Viren der Erfindung können bei einem Patienten, vorzugsweise einem menschlichen Patienten, verwendet werden, der einer Behandlung bedarf. Ein Patient, der einer Behandlung bedarf, ist ein Individuum, das an Krebs leidet, oder ein Patient mit einer pathogenen Infektion. Das Ziel der therapeutischen Behandlung besteht in der Verbesserung des Zustands eines Patienten. Eine typische therapeutische Behandlung unter Verwendung eines Virus der Erfindung mildert die Symptome von Krebs. Eine Methode zur Behandlung von Krebs gemäß der Erfindung umfasst die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Virus mit einem funktionellen UL43-Gen, dem aber ein funktionelles vhs-Gen fehlt, an einen an Krebs leidenden Patienten, so dass das Virus in dendritischen Zellen im Patienten vorhanden ist. Die Verabreichung des Virus der Erfindung an ein Individuum, das an einem Tumor leidet, wird typischerweise die Zellen des Tumors abtöten und dadurch die Größe des Tumors verringern und/oder das Ausbreiten maligner Zellen vom Tumor verhindern.
Eine typische therapeutische Behandlung einer pathogenen Infektion unter Verwendung eines Virus der Erfindung mildert die Symptome der Infektion und tötet vorzugsweise den pathogenen Organismus ab. Eine Methode zur Behandlung einer pathogenen Infektion gemäß der Erfindung umfasst die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Virus, dem ein funktionelles vhs-Gen fehlt, an einen Patienten mit einer pathogenen Infektion. Vorzugsweise dringt das Virus in die dendritischen Zellen im Patienten ein, oder dendritische Zellen, die mit dem Virus ex vivo infiziert worden sind, werden an den Patienten verabreicht. Die prophylaktische Behandlung unter Ver wendung eines Virus der Erfindung führt typischerweise zur Produktion von Antikörpern gegen ein Tumorantigen oder gegen ein Antigen von einem pathogenen Organismus in einem Patienten, bei dem ein Risiko von Krebs oder eine pathologische Infektion besteht. Typischerweise kann ein Patient mit Krebsrisiko genetisch dazu disponiert sein oder kann einem Karzinogen ausgesetzt worden sein oder unter dem Risiko des Aussetzens einem Karzinogen stehen. Typischerweise besteht bei einem Patienten mit einem Risiko einer pathogenen Infektion die Wahrscheinlichkeit, dass es einem pathogenen Organismus ausgesetzt werden wird.
Eine Methode zur Durchführung der Therapie beinhaltet das Einbauen des therapeutischen Gens/e in das Genom des Herpes-Virus der Erfindung, wie oben beschrieben, und dann das Kombinieren des resultierenden rekombinanten Virus mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung. Zu geeigneten Trägern und Verdünnungsmitteln zählen isotonische Kochsalzlösungen, zum Beispiel Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung. Die Zusammensetzung kann zur parenteralen, intramuskulären, intravenösen, intraperitonealen, subkutanen oder transdermalen Verabreichung formuliert sein. Die subkutane oder intraperitoneale Verabreichung ist bevorzugt. Die Trans- oder intradermale Verabreichung kann besonders bevorzugt sein.
Die Infektion von dendritischen Zellen mit dem Virus der Erfindung kann in vivo durch Verabreichung einer Zusammensetzung, die das Virus umfasst, an einen Patienten vorgenommen werden. Die pharmazeutische Zusammensetzung wird in solcher Weise verabreicht, dass das Virus, das das/die therapeutische(n) Gen(e) enthält, die dendritischen Zellen infizieren kann. Die Menge an verabreichtem Virus liegt im Bereich von 10⁴ bis 10¹⁰ pfu, vorzugsweise 10⁵ bis 10⁸ oder 10⁵ bis 10⁹ pfu, noch bevorzugter etwa 10⁶ bis 10⁸ pfu. Bei intradermaler Injektion oder transdermaler Verabreichung, z. B. unter Anwendung einer nadelfreien Vorrichtung, werden typischerweise 10 μl bis 1 ml, bevorzugt 100 μl bis 1 ml des Virus in einem pharmazeutisch akzeptablen geeigneten Träger oder Verdünnungsmittel oder in einer partikulären Zusammensetzung verabreicht.
Eine andere Methode bezieht das Isolieren/Präparieren von dendritischen Zellen aus peripherem Blut oder Knochenmark und das Infizieren der Zellen mit dem Virus der Erfindung in vitro ein. Transduzierte dendritische Zellen werden dann typischerweise an den Patienten durch intramuskuläre, intraperitoneale, subkutane oder intravenöse Injektion verabreicht, oder durch direkte Injektion in die Lymphknoten des Patienten, vorzugsweise durch subkutane, intraperitoneale oder direkte Injektion in die Lymphknoten. Typischerweise werden dem Patienten 10⁵ bis 10⁹ transduzierte dendritische Zellen, bevorzugt 10⁶ bis 10⁸ Zellen, bevorzugter etwa 10⁷ Zellen, verabreicht.
Die beschriebenen Verabreichungswege und Dosierungen sollen lediglich als Richtlinien dienen, da ein erfahrener Arzt zur Bestimmung des optimalen Verabreichungsweges und der Dosierung für jeden individuellen Patienten ohne weiteres in der Lage ist. Die Dosierung kann entsprechend verschiedener Parameter bestimmt werden, insbesondere entsprechend beispielsweise dem Alter, Gewicht und Zustand des Patienten.
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung der Erfindung.
BEISPIELE
Materialien und Methoden
Konstruktion und Züchtung der Virusstämme
Alle Virusstämme stammen vom HSV1-Stamm 17+, dessen Nukleotidsequenz bei GenBank (Zugriffsnr. HE1CG) hinterlegt ist. Die Virusstämme wurden erzeugt und vermehrt unter Verwendung von BHK C-21-Zellen (ECACC Nr. 8501143) oder BHK-Zellen, die mit den Genen stabil transfiziert werden, die HSV1 ICP27, ICP4 und Schweine-Herpes-Virus-Gen 12 codieren (Thomas et al., 1999).
Für Viren mit Mutationen in VMW65 wurden 3 mM Hexamethylen-Bisacetamid (HMBA) in das zur Virusanzucht verwendete Medium aufgenommen (McFarlane et al., 1992). Die folgenden Virusstämme wurden verwendet:
(i) 17+ (Wildtyp-HSVI)
(ii) 17+/pR20.5/UL43
Eine Kassette von Plasmid pR20.5 (Thomas et al., 1999b), bestehend aus einer RSV/lacZ/pA-Sequenz und einer CMV/GFP/pA-Sequenz in entgegengesetzten Rücken-an-Rücken-Orientierungen und getrennt durch eine HSV LAT-Region-Sequenz (nts 118.866–120.219) wurde in den UL43-Locus durch homologe Rekombination mit gereinigter genomischer HSV1-Stamm 17+-DNA mittels standardmäßiger Methoden inseriert. Die pR20.5-Kassette wurde zunächst in ein Plasmid, das UL43-flankierende Regionen enthielt (Coffin et al., 1996), an der unikalen NsiI-Stelle eingebaut, was Plasmid pR20.5/43 ergab. Die 20.5-Kassette kann aus ihrem pGEM5 (Promega)-Plasmid-Rückgrat mit SrfI ausgeschnitten werden, da ein für SrfI codierendes Oligonukleotid auf beiden Seiten der Kassette inseriert wurde. Der RSV-Promotor wurde aus pRc/RSV (Invitrogen), lacZ/pA aus pCH110 (Pharmacia), CMV/pA aus pcDNA3 (Invitrogen) und GFP aus pEGFP-N1 (Clontech) für die Konstruktion des Plasmids pR20.5 ausgeschnitten.
(iii) 1764/27-/4-
Der Virusstamm 1764/27-/4- wurde durch Rekombination von Virusstamm 1764/27-/4-/pR20.5-DNA mit leeren ICP4-flankierenden Regionen und der Auswahl von Virusplaques, die GDP oder lacZ nicht exprimieren, konstruiert. Virusstamm 1764/27-/4-/pR20.5 ist beschrieben bei Thomas et al., 1999b, und enthält die pR20.5-Kassette inseriert in das ICP4-Gen, um das ICP4 codierende Gen eines Virus zu ersetzen, das außerdem für ICP27 und ICP34.5 deletiert ist und eine inaktivierende Mutation im VMW65 codierenden Gen aufweist.
(iv) 1764/27-/4-/pR20.5/vhs
Der Virusstamm 1764/27-/4-/pR20.5/vhs wurde durch Insertion der pR20.5-Kassette in die vhs-flankierenden Regionen an der unikalen NruI-Stelle im vhs-codierenden Gen des HSV1-Stamms 17+ konstruiert, und das resultierende Plasmid (pR20.5/vhs) wurde in die HSV-Stamm 1764/27-/4-DNA rekombiniert. Virusstamm 1764/27-/4-/pR20.5/vhs ist daher für die Gene deletiert, die ICP4, ICP27 und ICP34.5 codieren, und weist inaktivierende Mutationen in den VMW65 und vhs-codierenden Genen auf.
(v) 1764/27-/4-/pR19lacZ
Der Virusstamm 1764/27-/4-/pR19lacZ wurde wie für das obige Virus (iv) konstruiert, mit der Ausnahme, dass die pR19lacZ-Kassette (Wagstaff et al. 1998) in die Latenzassoziierte Transkript-(LAT)-Region des Virusstamms 1764/27-/4- anstelle der pR20.5-Kassette in vhs rekombiniert wurde.
(vi) 1764/27-/4-/pR20.5/vhs/HBS-Ag
Das lacZ-Gen im pR20.5/vhs-Plasmid wurde durch das Gen ersetzt, das Hepatitis-Oberflächenantigen (HBS-Ag) codiert, durch Verdau von pHBV130 (Gough und Murray, 1982) mit XhoI und NsiI und Insertion des in pSP72 (Promega) freigesetzten Fragments zwischen die SalI und SmaI-Stellen. pR20.5/vhs wurde mit XbaI und EcoRI zur Freisetzung des lacZ-Gens verdaut, welches durch das HBS-Ag-Gen ersetzt wurde, das aus pSP72 mit HindIII und EcoRI ausgeschnitten wurde. Das resultierende Plasmid wurde in 1764/27-/4-/pR20.5/vhs-virale DNA rekombiniert und nicht-lacZ-exprimierende Plaques ausgewählt und gereinigt. Die Genomstruktur wurde dann durch Southern-Blot bestätigt.
Präparierung der dendritischen Zellen
DC wurde aus peripherem Blut wie zuvor beschrieben (Coffin et al., 1998) hergestellt. Kurz gesagt wurden mononukleare Zellen aus peripherem Blut (PBMCs) aus 60 ml gesundem/Hepatitis-B-geimpftem Spenderblut unter Verwendung von Lymphoprep (Nycomed) präpariert. Nach der Entfernung der roten Blutkörperchen wurden nichtadhärente Zellen (hauptsächlich T-Zellen und B-Zellen) entfernt, in HBSS gewaschen und bei 1400 UpM für 5 Minuten bei RT zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in einem Gemisch aus 2 ml an 90% FCS : 10% Dimethylsulfoxid (DMSO) resuspendiert, in Teilmengen aufgeteilt und bei –80°C für die anschließende T-Zellisolierung gelagert. Adhärente Zellen wurden in RPMI-Medium, ergänzt mit GM-CSF (0,1 μg/ml) und IL-4 (0,05 μg/ml) gezüchtet und 7 Tage lang bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert. Nach einer weiteren Lymphoprep-Reinigung wurden die Zellen dann unter Verwendung von Anti-CD19, Anti-CD2 (Harlan) und Anti-CD3 (Harlan)-Antikörpern magnetisch entzogen, und die DC wurden in komplettem RPMI-Medium zur sofortigen Verwendung resuspendiert.
Isolierung der CD4+-T-Zellen
Die wie oben eingefrorenen T- und B-Zellen wurden schnell aufgetaut, in HBSS gewaschen und bei 1400 UpM für 5 Minuten zentrifugiert. Die Zellen wurden in 2 ml komplettem RPMI-Medium resuspendiert, ausgezählt und mit Anti-CD19 (BU12 – 200 μl rein, Immunologie-Abteilung, UCL), Anti-CD14 (HB246 – 200 μl rein, Immunologie-Abteilung, UCL) und Anti-HLA-DR (L243 – 100 μl rein, Immunologie-Abteilung, UCL)-mAb inkubiert und 30 Minuten lang auf Eis belassen. Die Zellen wurden in HBSS gewaschen, in 2 ml komplettem RPMI-Medium resuspendiert, mit Schaf-Anti-Maus-Antikörpern in Bindung an Magnetkügelchen (Dynabeads, Dynal) bei einem Verhältnis von 10 μl Kügelchen/10⁶ kontaminierenden Zellen gemischt und auf einem Rotationsmischer bei 4°C für 45 Minuten inkubiert. Die CD4+-T-Zellen wurden dann durch Entfernung des Überstands entzogen, nachdem das Zellsuspension/Magnetkügelchen-Gemisch in Kontakt mit einem Magnet für 10 Minuten auf Eis platziert worden war. Die CD4+-T-Zellen wurden gezählt, in komplettem RPMI-Medium bei der geeigneten Konzentration resuspendiert, auf Eis ruhen gelassen oder über Nacht bei 37°C in 5% CO₂ für die anschließende Verwendung gezüchtet.
Infektion der DC
Die DC wurden bei 1400 UpM für 5 Minuten bei Raumtemperatur pelletiert. Die DC wurden dann bei einem MOI von 1 durch Resuspension in das Virus enthaltende RPMI-Medium für 1 Stunde bei 37°C in 5% CO₂ infiziert. 1 ml RPMI, ergänzt mit GM-CSF (0,1 μg/ml) und IL-4 (0,05 μg/ml) wurde dann zugegeben und die DC bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert. Für die LPS-Stimulation wurden RPMI, die außerdem 100 ng/ml LPS enthielten, verwendet.
Zytokin-Analyse
IL-6 und TNF-α wurden in DC-Kulturüberständen unter Verwendung von handelsüblichen ELISA-Kits (R&D Systems) gemessen. Vor dem ELISA wurden die Überstände 42 Stunden nach der Infektion der DC mit den angegebenen Viren abgesammelt und bei –20°C vor der Verwendung gelagert.
T-Zell-Proliferations-Assays
DCs und CD4+-T-Zellen wurden isoliert und wie oben beschrieben behandelt aus Hepatitis-B-geimpften und nicht-geimpften menschlichen Individuen. Die DCs wurden bei Verdünnungen von 1 × 10⁵ DC/ml bis 1 × 10⁴ DC/ml und die CD4+-T-Zellen bei 1 × 10⁶ Zellen/ml verwendet. Die Experimente bei jeder der DC-Konzentrationen wurden im Triplikat vorgekommen. 100 μl DC und 100 μl CD4+-T-Zellen wurden jeder Assay-Vertiefung zugesetzt. Wo angegeben, wurde rekombinantes Hepatitis-B-Oberflächenantigen (Austral) den Vertiefungen bei einer Endkonzentration von 1 μg/Vertiefung zugegeben. HSV-1-infizierte und uninfizierte DCs wurden mit CD4+-T-Zellen für 6 Tage bei 37°C bei 5% CO₂ gezüchtet. 1 μCu/Vertiefung [³H]Thymidin (Amersham) wurde dann zugegeben, und 18 Stunden später wurden die Zellen geerntet und der [³H]Thymidin-Einbau gezählt.
Beispiel 1 Vorläufige Daten zeigen, dass HSV-Stämme, die kein funktionelles vhs-Gen enthalten, eine erhöhte Aktivierung der dendritischen Zellen nach der Virusinfektion ergeben
Hierbei wurden in jedem Fall 1 × 10⁵ dendritische Zellen mit jedem der Viren durch leichtes Pelletieren infiziert, in etwa 100 μl Virussuspension in DMEM resuspendiert, bei 37°C für 1 Stunde inkubiert und in 24-Well-Platten mit 2 ml RPMI/10% FCS + 100 ng/ml GM-CSF, 50 ng/ml IL-4 übertragen. Diese Platten wurden dann bei 37°C/5% CO₂ über Nacht inkubiert. Die dendritischen Zellen wurden ebenfalls mit Lipopolysaccharid (LPS) als einem bekannten Aktivator für dendritische Zellen behandelt und für die Kontrolle nicht behandelt.
Die Überstände aus diesen Infektionen und aus der Kontrolle wurden dann in ELISA-Tests zum Nachweis der Mengen an sekretierten Zytokinen verwendet. Eine Fluoreszenz-aktiverte Zellsortierung (FACS) wurde ebenfalls zum Nachweis der Expressionshöhen der CD86 auf der Oberfläche von infizierten und Kontroll-dendritischen Zellen angewendet. In den dendritischen Zellkulturen finden sich zwei Populationen von Zellen bezüglich der Mengen der CD86-Expression. Diese werden mittels FACS-Analyse als zwei Peaks beobachtet, die einen ersten Peak der Zellen mit einer relativ geringeren Menge der CD86-Expression und einen zweiten Peak von Zellen mit einer relativ höheren Menge der CD86-Expression wiedergeben. Auf die Aktivierung mittels z. B. LPS hin exprimiert ein höherer Anteil der Zellen höhere Mengen an CD86, weshalb mehr Zellen im zweiten Peak zu finden sind.
Ergebnisse
Tabelle 1: Zytokin-Konzentration in den Kulturüberständen 24 Stunden nach Infektion mit den angegebenen Viren oder in Kontrollüberständen bei einem MOI von 1. Gemessen mittels ELISA
Tabelle 2: Expression von CD86 bei Kontrollzellen und mit den angegebenen Viren infizierten Zellen
Schlussfolgerungen
Die Ergebnisse zeigen, dass unbehandelte dendritische Zellen minimale Mengen der getesteten Zytokine sekretieren und die erwarteten "Ruhe"-Mengen an CD86 auf ihren Oberflächen aufweisen. Auf die LPS-Behandlung hin sind die Zytokinmengen signifikant stimuliert, und das Niveau der Oberflächenexpression von CD86 steigt signifikant. In den obigen Experimenten beträgt die mittlere Fluoreszenzintensität in LPS- behandelten Zellen etwa 1 × 10³ mittels FACS-Analyse mit einem Anti-CD86-Antikörper. Diese Ergebnisse zeigen auf, dass sich die dendritischen Zellen in einem aktivierten Zustand befinden.
Auf die Infektion der dendritischen Zellen mit den angegebenen Viren hin ist klar zu erkennen, dass zum Erfolgen der Aktivierung der dendritischen Zellen gemäß diesen Assays das Virus eine inaktivierende Mutation im vhs codierenden Gen aufweisen muss. Viren mit variierenden Graden einer Verstümmelung wurden verwendet, wobei lediglich das Virus, das die vhs-Mutation enthält, eine signifikante Aktivierung der dendritischen Zellen gemäß dieser Assays ergibt. Es ist außerdem erkennbar, dass dann, wenn keine Mutation in vhs enthalten ist, und die Zellen mit LPS behandelt als auch mit den angegebenen Viren infiziert werden, die CD86-Mengen in ebenso vielen Zellen nicht erhöht ist, wie dies bei der Behandlung mit LPS alleine der Fall ist, vorausgesetzt, dass die vhs-Mutation nicht enthalten ist, ist die mittlere Fluoreszenzintensität von CD86-exprimierenden Zellen, wie mittels FACS im Anschluss an die Virusinfektion gemessen, gegenüber der vermindert, die bei mit LPS behandelten Zellen zu finden ist. Für eine maximale Immunstimulation durch dendritische Zellen kann daher gefolgert werden, dass eine/mehrere inaktivierende Mutationen) im vhs codierenden Gen aufgenommen werden sollte.
Beispiel 2 HSV-Stämme, die kein funktionelles vhs-Protein enthalten, blockieren die dendritische Zellaktivierung nicht
Eine Durchflusszytometrie (fluorescence activated cell sorting – FACS) wurde zum Nachweis der Expressionsmengen von CD86, CD80, CD83 und CD40 auf der Oberfläche von infizierten und Kontroll-dendritischen Zellen angewendet. Die Überstände aus den Infektionen wurden zur Auswertung der Mengen an Zytokinen mittels ELISA verwendet.
Ergebnisse
Die ELISA-Ergebnisse (3) zeigen, dass, während DC mit HSV bei hoher Effizienz infiziert werden kann, keine für die DC-Aktivierung indikativen Zytokine erzeugt werden, weder mit einem Wildtyp-(Stamm 17+) noch einem unschädlich gemachten (Stamm 1764/27-/4-) Virus. Ist jedoch vhs aus Stamm 1764/27-/4- inaktiviert, was Stamm 1764/27-/4-/pR20.5/vhs ergibt, so werden für die DC-Aktivierung indikative Zytokine erzeugt. Die FACS-Analyse (2) an nicht-LPS-stimulierten DC zeigt, dass eine Infektion mit im wesentlichen Wildtyp-HSV (Stamm 17+) oder einem Replikationsinkompetenten HSV-Vektor (Stamm 1764/27-/4-) die erhöhte Expression von CD86 verhindert. Wie oben erörtert, wäre eine erhöhte CD86-Expression zu erwarten, wenn DC durch den Infektionsprozess aktiviert worden wäre. Die CD40-Mengen sind ebenfalls verändert/vermindert in HSV-infizierten Zellen. Ist vhs jedoch inaktiviert (Stamm 1764/27-/4-/pR20.5/vhs), so sind die CD86-Mengen erhöht, was auf eine Aktivierung hinweist, und die CD40-Mengen unbeeinflusst. CD80 und CD83 sind in unstimulierten DCs, die mit HSV infiziert wurden, nicht stark verändert. CD83 (B7.1) und CD86 (B7.2) stellen zwei T-Zell-costimulatorische Schlüsselmoleküle dar, CD40 stellt einen T-Zell-Schlüsselaktivator dar und CD83 ist ein DC-Marker, der während der DC-Reifung und Aktivierung heraufreguliert wird.
Werden die DCs zum Zeitpunkt der Infektion LPS-stimuliert, so sind die Wirkungen auf die CD40-Mengen bei sowohl Wildtyp- (Stamm 17+) als auch unschädlich gemachten (Stamm 1764/27-/4-) Viren ausgeprägter. Ist vhs jedoch inaktiviert, so werden diese Wirkungen auf CD40 verhindert. LPS-stimulierte DCs regeln die CD83- und CD86-Expression gewöhnlich signifikant herauf, was jedoch durch HSV (Stämme 17+ und 1764/27-/4-) blockiert wird, sofern vhs nicht inaktiviert ist (Stamm 1764/27-/4-/pR20.5/vhs). Ist vhs inaktiviert, so sind sowohl die CD83- als auch CD86-Mengen in einem ähnlichen oder größeren Umfang erhöht als bei LPS-stimulierten, doch uninfizierten Zellen.
Schlussfolgerung
Wie in den vorangegangenen Experimenten (Beispiel 1) ist klar zu erkennen, dass zur Aktivierung der dendritischen Zellen, wie mittels der Oberflächen-Marker-Expressionshöhen als Reaktion auf eine HSV-Infektion oder HSV-Infektion plus LPS-Stimulation gemessen, es klar ist, dass das vhs codierende Gen inaktiviert sein muss. Funktionelle vhs codierende Viren lassen es nicht zu, dass dendritische Zellen signifikant aktiviert werden, wie durch die Expressionsmengen der getesteten Oberflächenmarker gemessen.
Beispiel 3 Mit einem vhs-inaktivierten HSV-Vektor transduzierte DC lenken Antigen-spezifische T-Zell-Antworten in vitro
Die obigen Ergebnisse legen nahe, dass HSV-Vektoren, in denen vhs inaktiviert ist, als wirksame Vektoren für DC verwendet werden könnten, da die inaktivierenden Effekte von HSV in DC verhindert wurden. Tatsächlich scheinen mit solchen HSV-Mutanten infizierte DC als Reaktion auf eine Infektion spezifisch aktiviert zu sein, wie mittels der CD86-Heraufregulierung und der Sekretion bestimmter Zytokine gemessen. Um zu testen, ob vhs-inaktivierte HSV-Mutanten zum Lenken der Antigen-spezifischen Immunantworten auf die Übermittlung der Antigen-codierenden Gene an DC hin verwendet werden könnten, wurden Experimente unter Verwendung von DC- und T-Zellen durchgeführt, die aus Hepatitis-B-geimpften und ungeimpften Individuen präpariert worden waren. Hierbei wurde zunächst ein Virus konstruiert, in dem eine Hepatitis-B-Oberflächenantigen-(HBS-Ag)-Expressionskassette in das vhs codierende Gen des IE-Gen-defizienten Virus eingebaut war. Daraufhin wurden T-Zell-Proliferations-Assays vorgenommen, in denen DC von geimpften oder ungeimpften Individuen entweder unbehandelt waren, mit Antigen durch Mischen mit rekombinantem HBS-Ag-Protein "beladen" waren, mit dem Kontroll-Markergen infiziert wurden, das Vektor (1764/27-/4-/pR20.5/vhs bei MOI = 1) enthielt, mit dem Kontroll-Vektor (1764/27-/4-IpR20.5/vhs bei MOI = 1) infiziert wurden oder außerdem mit rekombinantem HBS-Ag gemischt wurden, oder mit dem Vektor infiziert wurden, der HBS-Ag (1764/27-/4-/pR20.5/vhs/HBS-Ag bei MOI = 1) exprimierte. Die DCs wurden dann mit T-Zellen gemischt, die von denselben geimpften bzw. ungeimpften Individuen stammten, und die Wirkungen auf die T-Zellvermehrung in standardmäßigen T-Zell-Proliferations-Assays beobachtet.
Diese Experimente zeigten (Figur), dass zwar HBS-Ag-rekombinantes Protein und der Kontroll-HSV-Vektor eine geringfügige T-Zell-proliferative Reaktion in geimpften Individuen induzieren konnten, wobei die HSV-Reaktion möglicherweise eine Vermehrung der für HSV-Strukturproteine spezifischen T-Zellen anzeigte, und der mit rekombinan tem HBS-Ag gemischte Kontroll-Vektor eine etwas stärkere Reaktion auslösen konnte, jedoch der HBS-Ag-exprimierende Vektor eine signifikant stärkere Reaktion ergab als jegliches der anderen. So wurde auf den Transport von HBS-Ag direkt in DCs unter Verwendung eines HSV-Vektors eine signifikante und spezifische T-Zell-proliferative Reaktion induziert, die auf das Mischen mit rekombinantem Antigen alleine hin nicht erfolgte. HSV-Vektoren mit inaktiviertem vhs erlauben so den Transport von Antigen-codierenden Genen in DCs, so dass die DCs ihre Fähigkeit zur Stimulierung Antigen-spezifischer T-Zell-proliferativer Reaktionen beibehalten.
LITERATURNACHWEISE

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Claims

Verwendung eines abgeschwächten Herpes-Virus, welchem/s (i) ein funktionelles vhs-Gen, oder ein funktionelles Äquivalent davon, fehlt; (ii) ein funktionelles UL43-Gen, oder ein funktionelles Äquivalent davon, umfasst; in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei einer Methode zur Stimulierung einer Immunantwort, welche Methode das Infizieren von dendritischen Zellen mit dem Virus umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Virus ein Herpes-simplex-Virus 1 oder 2 ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei dem Virus ein für ICP47 codierendes funktionelles Gen fehlt.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Virus ein VMW65-Gen, oder ein funktionelles Äquivalent davon, aufweist, welches für ein Protein codiert, dem eine Aktivität für die transkriptionelle Aktivierung fehlt.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei dem Virus mindestens ein funktionelles immediate early-Gen fehlt.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei das immediate early-Gen ausgewählt ist aus Genen, die für ICP0, ICP4, ICP22, ICP27 oder funktionelle Äquivalente davon codieren.
Verwendung nach Anspruch 5 oder 6, wobei dem Virus sowohl ein für ICP27 codierendes funktionelles Gen als auch ein für ICP4 codierendes funktionelles Gen fehlt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 7, wobei dem Virus sowohl ein für ICP27 codierendes funktionelles Gen als auch ein für ICP4 codierendes funktionelles Gen fehlt, und welches ein VMW65-Gen, oder ein funktionelles Äquivalent davon, aufweist, das für ein Protein codiert, dem eine Aktivität für die transkriptionelle Aktivierung fehlt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei dem Virus die für ICP0, ICP4, ICP22 und ICP27 codierenden funktionellen Gene fehlen.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei dem Virus außerdem ein funktionelles ICP34,5-Gen, oder ein funktionelles Äquivalent davon, fehlt.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Virus ein heterologes Gen umfasst.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei das heterologe Gen funktionsfähig an eine Kontrollsequenz geknüpft ist, welche die Expression des heterologen Gens in einer dendritischen Zelle erlaubt.
Verwendung nach Anspruch 11 oder 12, wobei das heterologe Gen für ein Tumorantigen codiert.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei das Tumorantigen in oder auf der Oberfläche von Tumorzellen erhöht vorkommt im Vergleich zu nicht-Tumorzellen.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei das Tumor-Antigen in oder auf der Oberfläche von Tumorzellen vorhanden ist, doch in nicht-Tumorzellen abwesend ist.
Verwendung nach Anspruch 11 oder 12, wobei das heterologe Gen für ein Polypeptid codiert, das zum Modulieren einer Immunantwort fähig ist.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei das Polypeptid Chemokin, Cytokin oder costimulatorisches Molekül ist.
Verwendung nach Anspruch 11 oder 12, wobei das heterologe Gen für ein Polypeptid von parasitärem, viralem oder bakteriellem Ursprung codiert.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei das Polypeptid ausgewählt ist aus Hepatitis-C-Virus-Antigenen, Hepatitis-B-Oberflächen- oder -Kern-Antigenen, Papillomavirus-Antigenen, HIV-Antigenen und Malaria-Antigenen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 11 bis 19, wobei das Virus mehr als ein heterologes Gen umfasst.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die dendritischen Zellen humane dendritische Zellen sind.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die dendritischen Zellen aus peripherem Blut oder Knochenmark vor der ex vivo-Infektion isoliert oder präpariert werden.
Verwendung nach Anspruch 22, wobei die dendritischen Zellen dem Körper nach Infektion zurückgegeben werden.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei die dendritischen Zellen auf die Verabreichung des Virus an den menschlichen oder tierischen Körper hin in vivo infiziert werden.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Medikament zur Verabreichung durch Injektion, durch Infusion, auf einem intra- oder transdermalen Weg oder durch biolistische Methoden dient.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Medikament zur Behandlung oder Verhütung einer pathogenen Infektion oder von Krebs ist.
Verwendung von ex vivo mit einem abgeschwächten Herpes-Virus infizierten dendritischen Zellen, wie in einem der Ansprüche 1 bis 16 definiert, in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei einer Methode zur Stimulierung einer Immunantwort.