KR100805771B1 - 면역조절을 위한 허피스 바이러스 - Google Patents

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Abstract

수상세포용 허피스 바이러스 벡터
기능적인 vhs유전자 또는 그의 기능적 등가물이 결여된, 약독화된 허피스 바이러스의, 전기 바이러스로 수상세포를 감염시키는 단계를 포함하는 면역치료방법 또는 면역예방방법에 사용하는 의약의 제조에 사용하기 위한 용도.

Description

면역조절을 위한 허피스 바이러스{Herpes Viruses for Immune Modulation}
본 발명은 수상돌기 세포에 효과적으로 감염시킬수 있는 약독화된 허피스 심플렉스 바이러스에 관한 것이다. 또한, 질병의 치료에 대한 면역치료적인 방법에 있어서의 전기 바이러스의 용도에 관한 것이다.
수상세포(dendritic cell, DC)는 가장 강력한 항원제시세포(antigen presenting cell)이며, 면역시스템에 대해 관용상태에 있는 항원에 대해서도 반응을 유발하는데 효과적이다. 그러므로, 종양에 대한 면역반응을 증가시키는 종양 면역요법에 있어서, 수상세포가 종양특이적 항원을 제시하도록 할 수 있다면, 수상세포의 용도는 종양 면역요법에 아주 이상적일 것이다. 수상세포는 세균, 바이러스 또는 기생충과 같은 감염원으로부터 유래된 항원을 제시하는데 사용되어, 전기 감염원의 질병에 대한 예방 또는 치료 백신으로 제공될 수 있다. 그러나, 이러한 접근법에 있어서 전기의 표적에 대한 항원을 어떻게 수상세포로 효과적으로 전이시키는 것이 가장 큰 문제점으로 대두되었다.
종양 항원 또는 다른 질병과 연관된 항원에 대한 면역반응을 발생시키려는 기회를 제공하는데 있어서, 몇 가지 조건이 충족되어야 한다. 첫 번째로, 면역반응에 대한 표적으로서 작용할 수 있는 종양 또는 질병 특이적인(또는 적어도 선택적인) 분자를 식별하는 것이 필수적이다. 이것은 대부분의 흔한 종양에 대해 매우 어려운 과제임이 판명되었지만, 대부분의 자궁암의 경우 E6 및 E7 종양유발 유전자가 존재한다는 것이 알려졌으며, 다른 종양에 대해서도 훌륭한 후보 항원들이 식별되기 시작하고 있다. 예를 들어, MUC-1 유전자 산물은 난소암의 90%를 포함한 수많은 종양에서 과발현된다. 다양한 종양과 연관된 항원들이 또한 식별되고 있으며, 그것 중의 어느 것이라도 암치료를 위한 면역요법에 사용될 수도 있다. 두 번째로, 항원의 식별 후에, 면역유발형(immunogenic)의 항원을 면역계로 운반하는 것이 필수적이다. 이것은 종양 제거에 필수적인 세포면역반응을 발생시키기 위해, 단백질이 숙주세포의 세포질 안으로 운반되거나(고분자 단백질 항원에 대해서는 어려운 일) 또는 유전자 운반(gene delivery) 혹은 DNA 접종후에 숙주세포에 의해 합성되어야 한다는 것을 의미한다. 이러한 목적을 위해 고려될 수 있는 바이러스 벡터로는 백시니아(vaccinia), 아데노바이러스(adenovirus) 또는 리트로바이러스(retrovirus)가 포함한다.
최적화된 면역 자극을 제공한다고 널리 인식되고 있는 세포유형은 바로 림프 수상세포(수상세포)이다(참조: Girolomoni and Ricciardi Castagnoli, 1997). 참으로, 수상세포는 in vivo에서 일차면역반응(primary immune response)을 자극할 수 있는 유일한 세포유형인 것처럼 보이며, 더구나 어떤 환경에서는 이미 성립된 관용상태를 깨뜨릴 수 있는 것으로 알려졌다. 수많은 연구 그룹이 치료효과를 기 대하며 종양에 대한 면역반응을 자극시키는 자가채용면역요법(autologous adoptive immunotherapy) 방법에 있어서 수상세포의 용도를 탐구하고 있다. 그러한 방법은 말초혈액으로부터 수상세포를 배양하여, in vitro에서 수상세포에 항원을 얹은 후, 수상세포를 환자에게 재주입시키는 단계를 포함한다. 그러나, 이러한 접근법은 수상세포에 항원을 얹는 효율적인 방법이 없어서 실용적이지 못하였다. 최근의 연구에서, 펩티드로 흥분된 수상세포에 의한 항원제시가 in vivo에서 항종양반응을 유발하였다는 것이 보고되었다(참조: Celluzzi et al., 1996; Zitvogel et al., 1996). 바이러스 벡터에 대해서, 리트로바이러스는 높은 효율로 수상세포에 유전자 운반을 하지 않음이 밝혀졌고(참조: Reeves et al., 1996; Aicher et al., 1997), 본 연구진의 연구에서는, 다른 연구진에 의해 보고된 연구와는 다르게(참조: Arthur et al., 1997), 아데노바이러스는 아주 낮은 효율의 유전자 운반을 하였다.
본 연구진은 예전의 연구에서, 비록 연관된 독성은 측정되지 않았지만, 허피스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus, HSV)가 수상세포에 효율적으로 감염되고 유전자를 운반한다는 사실을 보고하였다(참조: Coffin et al., 1998). HSV는 넓은 범위의 다양한 세포를 효과적으로 감염시킬 수 있고(다른 벡터 시스템으로는 감염시키기 어려운 것들을 포함하여, 참조: Dilloo et al., 1997; Coffin et al., 1998), 조작하기 쉬우며, 다종 유전자(multiple gene)를 발현할 수 있는 거대한 DNA를 수용할 수 있다(참조: Coffin and Latchman 1996). 수상세포에 여러 항원을 운반하여 몸 속에 재주입하는 것은 어떤 종류의 암과 감염 질병의 치료에 있어서 특별히 전도유망한 접근법이다.
WO 00/08191호는 야생형 허피스 심플렉스 바이러스는 감염된 수상세포에서 시발되는 항원처리과정(antigen processing)의 진행을 방해하고, 기능적인 UL43 유전자 또는 비리온 호스트 셧오프 단백질(vhs)을 암호화하는 유전자가 결여되거나 또는 초기반응 유전자 발현을 최소화하는 돌연변이를 포함하는 허피스 바이러스는 감염된 세포에서 시발되는 항원처리과정의 진행을 방해하지 않고 수상세포를 효과적으로 감염시킬 수 있음을 개시하고 있다.
발명의 요약
놀랍게도, 본 발명자들은 HSV 벡터에서 비리온 호스트 셧오프 단백질(virion host shut-off protein, vhs)을 암호화하는 유전자의 파괴가 HSV 감염세포에서 효과적인 수상세포 활성의 발생을 가능하게 함을 발견하였다. 또한, UL43 유전자의 파괴는 필요하지 않았다. 일반적으로, HSV가 감염된 수상세포는 감염 그 자체 또는 다른 자극원에 의해 활성화되지 않는다(참조: Salio et al., 1999; Kruse et al., 2000).
본 발명자들은 방어적인 수상세포 활성에있어서, vhs 단백질의 종래에 알려지지 않은 기능을 확인하였다. 수상세포 활성은 활성화되지 않은 상태와 비교하여 일종의 세포 표면 마커의 상위조절(up-regulation)로서 확인된다. 이러한 마커는 CD83과 CD86을 포함한다. 수상세포 활성은 당지질(lipopolysaccharide, LPS)의 처리로 인하여 자극될 수도 있다. HSV에 의하여 감염된 수상세포의 LPS 처리는 CD83 또는 CD86의 상위조절 결과를 나타내지 못한다. 본 발명자들은 vhs가 볼활성화되고, 기능적인 UL43유전자를 가지는 돌연변이 HSV에 의하여 감염된 수상세포의 LPS 처리가 CD83과 CD86을 상위조절함을 발견하였다. CD83과 CD86의 상위조절은 기능적인 vhs 유전자를 포함하는 바이러스에 의하여 감염된 수상세포의 LPS 처리시에는 관찰되지 않았다. 따라서, 본 발명자들의 결과는, 허피스 바이러스의 감염에 따르는 면역반응이 최대한 자극된 전환된 수상세포를 위하여, vhs를 암호화하는 유전자가 파괴되어야 하고, 반면에 UL43을 암호화하는 유전자는 필요없음을 시사한다.
또한, 본 발명자들의 결과는 야생형 허피스 심플렉스 바이러스의 발병학적인 측면에서 vhs의 역할을 나타낸다. HSV는 높은 효율로 수상세포를 감염시키고, 그의 자연적인 생활환의 부분으로서 이것을 수행하도록 발전된 이유는 그가 효과적으로 형성된 잠복된 HSV 감염을 방지하거나 또는 반복된 잠복과 재활성의 순환 기간에 바이러스의 제거하는 세포-매개 면역반응을 최소화 할 수 있다는 것을 보여준다. 수상세포 활성은 효과적인 세포매개 면역반응의 유발에 매우 중요하다. Vhs는 바이러스 단백질이고, 일반적으로 수상세포에서 HSV 유전자가 높은 수준으로 발현되지 않을 동안, vhs 단백질은 침입하는 바이러스를 따라서 수상세포로 분배된다. 따라서, HSV로 인하여 감염된 수상세포의 방어활성에서 vhs의 새로운 기능은 HSV로 인한 인간의 감염에 따른 HSV 생활환에서 vhs의 주요한 기능이 되는것으로 여겨진다.
이에 따라, 본 발명은
(i) 기능적인 vhs유전자 또는 그의 기능적 등가물이 결여되고; 및,
(ii) UL43 유전자 또는 그의 기능적 등가물을 포함하는, 약독화된 허피스 바이러스의, 전기 바이러스로 수상세포를 감염시키는 단계를 포함하는 면역반응을 자극시키는 방법에 사용하는 의약의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
바람직하게는, 전기 바이러스는 인간의 허피스 심플렉스 바이러스이다. 보다 바람직하게는, 전기 바리어스는 HSV1 또는 HSV2이다. 전기 수상세포는 실험실적 환경 또는 생물학적 환경에서 감염될 수 있다.
전기 바이러스는 하나 또는 그 이상의 추가적인 돌연변이를 포함할 수도 있다. 전기 추가적인 돌연변이는 바이러스의 독성을 최소화하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 이러한 돌연변이는 직접적인 초기(immediate early, IE) 유전자 발현을 감소시키거나 또는 최소화한다. IE 유전자 발현의 저해 또는 감소는 바이러스 복제를 저해하거나 또는 감소시킨다. 예를 들어, 이러한 돌연변이는 ICP4, ICP27, ICP0 및/또는 ICP22, 바람직하게는 ICP27 및/또는 ICP4를 암호화하는 유전자에서 불활성화 돌연변이를 포함한다. 또한, 그들의 교차 활성화기능을 제거하는 vmw65-암호화 유전자에서 불활성화 돌연변이가 포함될 수도 있다(참조: vmw65 mutations as in Ace et al., 1989 or Smiley et al., 1997). 또한, 전기 추가적인 돌연변이는 바이러스의 면역반응-억제활성을 최소화할 수도 있다. 이러한 돌연변이는 ICP47을 암호화하는 유전자의 불활성화를 포함한다.
도 1은 바이러스 균주 1764/27-/4-, 1764/27-/4-/pR20.5/vhs, 1764/27-/4-/pR20.5/vhs/HBS-Ag 및 야생형 HSV 균주 17+를 나타낸다.
도 2는 자극되지 않은 세포(도 2A), LPS로 유사자극된 감염세포(도 2B) 및 17+, 1764/27-/4- 및 1764/27-/4-/pR20.5/vhs 바이러스 균주에 의하여 감염된 세포에서, CD40, CD80, CD83 및 CD86의 세포표면 발현의 수준을 결정하는 FACS 분석결과를 나타낸다.
도 3은 17+, 1764/27-/4- 및 1764/27-/4-/pR20.5/vhs 바이러스 균주에 의하여 감염된 수상세포 또는 감염되지 않은 수상세포에서 IL6 및 TNFα의 바이러스 감염효과를 결정하는 ELISA 분석결과를 나타낸다.
도 4는 HBS-Ag에 대한 반응에서 B형 간염으로 면역되거나 또는 면역되지 않은 개인으로부터 수득한 T세포의 증식반응을 나타낸다. 각 개인으로부터 수득한 수상세포는 처리되지 않거나, 재조합 HBS-Ag 단백질(HBSAg*)과 혼합되거나, 대조군 벡터(1764/27-/4-/pR20.5/vhs HBSAg)로 감염되거나 또는 T세포와 혼합하기 전에 HBS-Ag 발현벡터(1764/27-/4-/pR20.5/vhs/HBS-Ag)로 감염되었다.
A. 바이러스
본 발명의 바이러스는 활성화된 것으로부터 감염된 수상세포의 저해 없이, 수상세포의 감염을 가능하게 한다. 바람직하게는, 본 발명의 바이러스에 의하여 1의 감염다중도(multiplicity of infection, MOI)로 감염된 수상세포는 LPS 도는 다른 활성화된 자극원의 처리에 의하여 활성화될 수 있다.
본 발명의 바이러스는 수상세포의 활성화를 저해하지 않는다. 바이러스가 수상세포의 활성화를 허용하는 때를 결정하기 위하여, 수상세포가 1이상의 MOI의 바이러스로 감염되고, 감염된 수상세포를 LPS로 치료하였다. 수상세포의 활성화를 상위-조절하는 CD83 및/또는 CD86같은 세포표면 마커의 수준은, 예를 들어 FACS 분석방법에 의하여 수상세포의 활성화를 결정하도록 모니터될 수도 있다. 세포에 감염된 바이러스가 수상세포의 활성화를 유발시킨다면, 이러한 세포 표면에서의 마커의 수준은 LPS가 처리되지 않은 세포 보다 LPS가 처리된 처리된 수상세포에서 유의적으로 높아질 것이다. 또한, 이러한 마커의 일부 또는 전부는, 감염되지 않은 수상세포와 비교해서, 수상세포의 활성화를 유발시키는 바이러스로 감염된 수상세포에서 더욱 높아질 것이다. vhs 유전자가 불활성화된 돌연변이를 포함하지 않는 허피스 심플렉스 바이러스가 수상세포의 감염에 이용된다면, 이들 마커의 유의적으로 낮은 상위-조절이 관찰된다.
감염된 수상세포의 활성화의 유발을 허용하기 위하여, 본 발명의 바이러스는 vhs(HSV에 있는) 또는 상동체를 암호화하는 기능적인 유전자 또는 다른 바이러스 종에 있는 이들의 기능적인 등가물이 결여될 것이다. 추가로, 본 발명의 바이러스 는 기능적인 UL43 유전자를 포함할 것이다. 추가적인 돌연변이는, 예를 들어 IVP46을 암호화하는 유전자에서 돌연변이 함유물에 의하여 바이러스의 추가적인 면역-저해 효과를 감소시키도록 제조될 수도 있다.
본 발명의 약독화된 바이러스는 최소 독성(minimal toxicity)을 나타내도록 수상세포를 감염시킬 수 있다. 감염후 세포생존율은 감염 1일후에 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 감염 1일후에 적어도 60. 70, 80 또는 90%이다. 독성을 감소시키기 위하여, 바이러스 복제를 감소시키는 하나 또는 그 이상의 돌연변이가 본 발명의 바이러스에 포함될 수도 있다. 예를 들어, 단백질의 상호-활성 활성화(trans-activating activity)를 최소화하는 VMW65를 암호화하는 유전자에서의 돌연변이 및/또는 ICP4, ICP27, ICP0 및 ICP22 같은 하나 또는 그 이상의 초기반응 유전자에서의 돌연변이가 포함될 수도 있다. 따라서, 본 발명의 바이러스는 기능적인 vhs, ICP27, ICP4 유전자가 결여되고, 전사-활성을 나타내지 않는 단백질을 암호화하는 VMW65 유전자를 포함하거나, 또는 기능적인 vhs, ICP47, ICP4 유전자가 결여될 수도 있다.
체내에서 직접적으로 사용하기 위하여, 복제 량의 어느 정도는 유발된 면역반응의 증가에 유익할 수도 있다. 이러한 경우, 본 발명의 바이러스는 바람직하게는 기능적인 vhs 유전자가 결여되고, 또한, 바이러스의 완전한 질환발병에는 필요하지만, 바이러스의 복제에는 필요하지 않은 하나 또는 그 이상의 기능적인 유전자가 결여될 수도 있다. 이러한 유전자는 ICP34.5, ICP6, 티미딘 키나제 및 gH같은 당단백질을 포함한다. 그러나, 바람직하게는, 티미딘 키나제를 암호화하는 유전자는 에이사이클로비어 같은 항바이러스제에 대하여 바이러스가 둔감하게되는 유전자 의 돌연변이로서 기능을 한다.
비록, 본 발명이 허피스 심플렉스 바이러스를 이용하여 실시되었으나, 허피스 바이러스 패밀리의 다른 바이러스가 감염된 수상세포의 수상세포 활성화의 예방을 감소시키도록 변형될 수도 있음은 자명할 것이다. 특히, 전기 바이러스들은 바리셀라 조스터 바이러스, 슈도-라비스 바이러스 또는 보바인 허피스 바이러스를 포함할 수도 있다.
본 발명의 바이러스가 허피스 심플렉스 바이러스 일 때, 전기 바이러스는, 예를 들어 HSV1 또는 HSV2 균주, 바람직하게는 HSV1 또는 이들의 유도체로부터 유도될 수도 있다. 유도체들은 HSV1 및 HSV2 균주로부터 유래된 DNA를 포함하는 인터-타입 재조합체(inter-type recombinant)를 포함한다. 전기 인터-타입 재조합체는 예를 들어 톰슨 등(1988) 및 메이그니어 등(1988)에서 알려져 있다. 바람직하게는, 본 명세서에 개시된 방법에 의하여 측정된 바와 같이, 유도체는 HSV1 또는 HSV2의 게놈과 최소한 70%, 좀 더 바람직하게는 최소한 80%, 가장 바람직하게는 최소한 90 또는 95%의 서열 상동성(homology)을 가진다. 보다 바람직하게는, 유도체는 HSV1 또는 HSV2의 게놈과 최소한 70%, 좀 더 바람직하게는 최소한 80%, 가장 바람직하게는 최소한 90, 95 또는 98%의 서열 동일성(identity)을 가진다.
유도체는 염기 치환, 예를 들어 1, 2 또는 3 내지 10, 25, 50 또는 100번쩨 염기의 치환에 의하여 변형된 HSV1 또는 HSV2 게놈의 서열을 가질 수도 있다. HSV1 또는 HSV2 게놈은 하나 또는 그 이상의 삽입 및/또는 결실에 의하거나 및/또는 한쪽 또는 양쪽 말단의 신장에 의하여, 변형적으로 또는 추가적으로 변형될 수도 있 다.
본 발명의 바이러스를 수득하는데 이용될 수도 있는 유도체는, 이미 본 발명의 바이러스에서 기능적으로 불활성화되도록 요구된 유전자에서 돌연변이를 가지는 균주, 예를 들어 vhs이 불활성화된 균주(참조: Jones et al., 1995), ICP47이 불활성화된 균주(참조: Goldsmith et al., 1998), ICP4이 결실된 d120 균주(참조: DeLuca et al., 1985), ICP27이 결실된 d27-1 균주(참조: Rice and Knipe et al., 1990) 또는 ICP27과 ICP4가 모두 결실된 d92 균주(참조: Samaniego et al., 1995)를 포함한다. 이들의 사용은 본 발명의 돌연변이 HSV 균주의 생산에 필요한 많은 과정을 감소시킬 수 있을 것이다.
여러 가지 HSV 유전자를 설명하는데 사용된 단어는 코핀과 라츠만(Coffin and Latchman, 1996)에서 발견된다
상술한 여러 가진 HSV 유전자와 상동성을 가지는 유전자는 다른 허피스 바이러스 종에서 존재한다. "상동체(homologue)"라는 말은 HSV 유전자와 상응하는 아미노산 또는 핵산 서열 상동성을 나타내는 HSV 유전자 상동체에 대한 기능적인 등가물인 유전자를 의미한다. 전형적으로, HSV 유전자의 상동체는 최소한 15%, 바람직하게는 최소한 20%, 보다 바람직하게는 최소한 30%, 40% 또는 50%의 HSV 유전자에 상응하는 아미노산 수준의 동일성을 나타낼 것이다.
vhs를 암호화하는 유전자는 HSV1 및 HSV2에서 UL41유전자이다. HSV1 균주 17+(EMBL accession No. HE1CG)에서, UL41 유전자는 91,170 내지 92,637개의 염기를 포함한다. HSV2 균주 HG52(EMBL accession No. z86099)에서, UL41 유전자는 91,800 내지 93,275개의 염기를 포함한다.
핵산 및 단백질 상동성을 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, UWGCG 팩키지는 상동성을 계산하는데 사용될 수 있는 BESTFIT 프로그램을 제공한다(그들의 초기 세팅에 사용된 바와 같이)(Devereux et al., (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395). 전기 BESTFIT와 BLAST 알고리즘은, 예를 들어 알츠컬(Altschul) (1993) J. Mol. Evol. 36:290-300; 알츠컬 등(Altschul et al.) (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10에서 사용된 바와 같이, 상동성을 계산하거나 또는 서열을 정렬하는데 사용될 수 있다(일반적인 초기 세팅을 사용하여).
BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 생명공학 정보센터(National Centre for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/))를 통하여 유용하게 사용된다. 이러한 알고리즘은 데이터베이스 서열과 동일한 길이의 단어가 배열될 때, 맞거나 또는 만족할 만한 양성 수치의 시작점수 T를 가지는 질문 서열에서 길이 W의 짧은 단어의 확인에 의하여, 고득점 서열쌍(high scoring sequence pair, HSPs)을 처음으로 확인하는 단계를 포함한다. T는 관련된 단어 시작 점수로 간주된다(참조: Altschul et al., 1990). 이러한 초기의 관련단어 히트는 그들을 포함하는 HSPs를 찾기 위한 초기의 검색을 위한 근원으로 활용된다. 전기 단어 히트는 누적된 배열 점수가 증가될 수 있을 때까지, 서열을 따라 양 방향으로 확장될 수 있다. 각 방향으로 단어 히트를 위한 확장은, 축적된 배열점수가 그의 최대 점수로부터의 양 X에 의하여 줄어들거나; 축적된 점수가 하나 또는 그 이상의 음성-점수 잔여 배열의 축적으로 인하여 0 또는 그 이하로 가거나; 또는 한 쪽 서열의 끝에 도달한 경우에 중지된다. 전기 BLAST 알고리즘 변수 W, T 및 X는 알고리즘의 민감도와 속도를 결정한다. 전기 BLAST 프로그램은 단어 길이(W) 11, BLOSUM62 점수 매트릭스(참조: Henikoff and Henikoff(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919) 배열(B) 50, 기대값(E) 10, M=5, N=4 및 양측 사슬의 비교의 초기값으로 사용한다.
전기 BLAST 알고리즘은 두 서열 사이의 유사성의 통계적인 분석을 수행한다(참조: Karlin and Altschul(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787). BLAST 알고리즘에 의하여 제공된 유사성의 하나의 측정값은 최소 종합확률(smallest sum probability, P(N))로서, 기회에 의하여 발생되는 두개의 염기 또는 아미노산 서열사이의 등가물에 의한 확률표시를 제공한다. 예를 들어, 두번째 서열에 대한 첫번째 서열의 비교에 있어서, 최소 종합확률이 1 이하, 바람직하게는 0.1 이하, 보다 바람직하게는 0.01 이하, 가장 바람직하게는 0.001 이하라면, 하나의 서열이 다른 서열과 유사하다고 간주된다.
HSV 유전자의 상동체는, 예를 들어 엄격한 배지의 상태(예를 들어, 50 내지 60℃에서 0.03M 염화나트륨과 0.03M 소듐 시트레이트) 하에서, HSV 유전자의 전부 또는 일부를 포함하는 탐침으로 다른 바이러스로부터 제조되는 검색용 게놈 또는 cDNA 라이브러리와 같은 여러 가지 방법으로 확인될 수 있다. 또한, 변형적으로, 종간의 상동성은 보존적인 아미노산서열을 암호화하는 변형체 및 상동체내에 있는 목적 서열로 디자인된 프라이머를 이용한 변성 PCR(degenerate PCR)을 이용하여 수득할 수도 있다. 전기 프라이머는 하나 또는 그 이상의 변형 위치를 포함하고, 알 려진 서열에 대한 단일 사슬 프라이머로 클로닝된 서열에 사용되는 것 보다 더욱 낮은 엄격한 상태(예를 들어, 40℃에서 0.03M 염화나트륨과 0.03M 소듐 시트레이트)에서 사용될 것이다.
HSV 단백질의 하나 또는 그 이상의 기능적인 특징을 공유한다면, 허피스 바이러스의 상동체는 기능적인 등가물이다. 예를 들어, vhs 단백질은 mRNA의 안정성을 감소시켜서 감염된 세포에서 단백질의 발현을 감소시키는 역할을 한다. 그러므로, 바람직하게는, vhs 단백질의 기능적인 등가물은 mRNA의 안정성을 감소시켜서 숙주세포 유전자 발현을 저하시키는 역할을 한다. 더욱 바람직하게는 vhs 단백질의 기능적인 등가물은 감염되지 않은 수상세포를 활성화시키는 자극에 대한 반응에 있어서, 수상세포 활성화를 저해한다.
안정성을 이유로, 본 발명의 바이러스는 약독화되었는데, 그들은 질병을 유발시킬 수 없다. 약독화의 목적으로 변형된 바이러스 부분은 제거되거나(전부 또는 일부가), 기능을 불활성시키거나 또는 특별히 이형유전자 서열 같은 다른 서열로 치환될 수도 있다. 약독화 돌연변이는 바이러스 벡터로 서 사용되는 모든 바이러스 군을 위하여 설명되었다. 예를 들어, HSV는 ICP34.5 및/또는 ICP4, ICP27 같은 필수 유전자 및/또는 vhs 유전자 그 자체에서의 돌연변이에 의하여 불활성화되는 경향을 보인다.
특별히, 바람직하게 약독화된 바이러스는 추가적으로 vhs를 암호화하는 기능적인 유전자가 결여되고, 기능적인 ICP47 유전자, ICP34.5 유전자 및 ICP27유전자가 선택적으로 결여되며, 기능적인 ICP4 유전자 및/또는 전사-활성을 가지는 단백 질을 암호화하는 유전자인 VMW65 유전자가 선택적으로 결여된 바이러스 및 기능적인 ICP27 유전자는 포함하지만, 기능적인 ICP4 유전자 및 ICP34.5 유전자가 결여되어 있고, 전사-활성을 가지는 단백질을 암호화하는 유전자인 VMW65 유전자가 선택적으로 결여된 바이러스를 포함한다. 이러한 바이러스는 WO98/04726 및 WO99/60145에 개시되어 있고, 참조문헌에 상응하는 본원에 개시되어 있다.
본 발명의 허피스 심플렉스 바이러스가 ICP4 또는 ICP27를 암호화하는 특정 필수유전자가 결핍되어 있을때, 본 발명의 바이러스는 필수유전자를 발현하는 세포주를 사용하여 증식할 수 있다. 예를 들어, 바이러스가 ICP27 유전자가 결핍되어 있을때, 바이러스는 V27 세포주(참조: Rice and Knipe, 1990), 2-2 세포주(참조: Smith et al., 1992) 또는 B130/2 세포주(참조: WO98/30707), 바람직하게는 B130/2 세포주를 사용하여 증식할 수 있다. 바이러스가 ICP4 유전자가 결핍되어 있을때, 바이러스는 ICP4를 발현하는 E5 세포주(참조: Deluca et al., 1985)를 사용하여 증식할 수 있다. 바이러스가 ICP4 및 ICP27 유전자가 결핍되어 있을때, 바이러스는 ICP4 및 ICP27을 동시에 발현하는 E26 세포주(참조: Samaniego et al., 1995)를 사용하여 증식할 수 있으며, 바이러스가 부가적으로 기능적인 vmw65 유전자가 결핍되어 있을때, 바이러스는 vmw65의 비HSV 유사유전자(예를 들어, 이퀸 허피스 바이러스(equine herpes virus) 유전자 12 또는 보바인 허피스 바이러스(bovine herpes virus)로부터의 BTIF)를 포함하는 세포주를 사용하여 증식할 수 있다.
B. 돌연변이 방법
언급된 다양한 바이러스 유전자가 당업계에 잘 알려진 몇 가지 기술에 의해 기능적으로 불활성화될 수 있다. 예를 들어, 결실, 치환 또는 삽입, 바람직하게는 결실에 의해 기능적으로 불활성화 될 수 있다. 결실은 유전자의 일부 또는 전체를 제거하는 것이다. 예를 들어, 오직 한 개의 뉴클레오티드의 결실은 해독틀의 이동(frame shift)으로 나타난다. 그러나, 더욱 커다란 결실, 바람직하게는 전체 암호화 및 비암호화 서열의 적어도 25%, 보다 바람직하게는 적어도 50%(또는 선택적으로, 절대적인 용어로서 적어도 10개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 100개, 가장 바람직하게는 적어도 1000개의 뉴클레오티드)의 결실이 이루어진다. 특히 전체유전자 및 그 주변의 서열을 제거하는 것이 바람직하다. 삽입될 서열은 아래에 설명할 이종 유전자를 포함하는데, 특히 이종 유전자를 ICP4 또는 ICP27에 삽입하는 방법이 선호된다. VMW65 유전자의 경우에는 이들이 필수적인 구조 단백질을 암호화하기 때문에 전체 유전자를 결실할 수 없으나, 전사적으로 IE 유전자를 활성화시키는 VMW65의 기능을 제거하기 위해 크기가 작은 불활성화 삽입이 만들어진다(참조: Ace et al., 1989; Smiley et al., 1997).
HSV의 돌연변이는 당업자들에게 잘 알려진 상동 재조합에 의해서 작출된다. 예를 들어, HSV 게놈 DNA를 상동 HSV 염기서열이 인접하고 있는 돌연변이 염기서열을 포함하는 벡터, 바람직하게는 플라스미드 벡터와 같이 트랜스펙션(transfection)한다. 돌연변이된 염기서열은 결실, 삽입 또는 치환을 포함하는데, 이들은 모두 일반적인 방법으로 만들어진다. 삽입을 위해 베타-갈락토시다제(β-galactosidase, lacZ) 또는 녹색형광단백질(green fluorescence protein, GFP)과 같은 선택적 표지 유전자가 사용되는데, 이는 이 유전자의 베타-갈락토시다제 활성 측정법 또는 형광에 의해 재조합 바이러스를 선별할 수 있기 때문이다.
C. 이종 유전자 및 프로모터
본 발명의 바이러스는 이종유전자를 가지도록 변형될 수 있다. "이종유전자(heterologous gene)"란 용어는 임의의 유전자를 포함한다. 비록 이종유전자는 허피스 바이러스 게놈에 존재하지 않는 유전자이지만, 암호화 서열이 원래의 바이러스 통제 서열과 작동가능하게 연결되어 있지 않을 때에는, 허피스 유전자도 사용될 수 있다. 이종유전자는 야생형의 임의의 대립형질 변이체(allelic variant) 또는 돌연변이된 유전자일 수 있다. "유전자(gene)"란 용어는 적어도 전사가 될 수 있는 핵산 서열을 포함하는 것으로 해석되는 술어이다. 그러므로, mRNA, tRNA 및 rRNA를 암호화하는 서열이 이 정의안에 포함된다. 그러나, 본 발명은 tRNA 및 rRNA보다 폴리펩티드의 발현에 관련되어 있다. mRNA를 암호화하는 서열은 전사는 되지만 번역은 되지 않는, 그렇지 않으면 번역되는 암호화 서열과 연관된 5' 및/또는 3'쪽 인접서열의 일부 또는 전부를 임의적으로 포함한다. mRNA 암호화 서열은 더 나아가서 전사 중지신호(transcriptional stop signal), 폴리아데닐레이션 부위(polyadenylation site) 및 하류 인핸서 요소(downstream enhancer element)와 같은 전사서열과 연관된 전사통제서열(transcriptional control sequence)을 임의적으로 포함할 수 있다.
이종유전자는 HSV 서열에 인접한 이종유전자를 지니고 있는 플라스미드 벡터를 HSV 균주의 상동재조합에 의해 바이러스 게놈 속으로 삽입될 수 있다. 이종유전자는 당업자들에게 잘 알려진 클로닝 기법으로 허피스 바이러스 서열을 포함하는 적당한 플라스미드 벡터속으로 도입될 수 있다. 이종유전자는 바이러스가 계속 증식하는 한, 바이러스 게놈의 어느 위치에도 삽입될 수 있다. 이종유전자는 필수유전자로 삽입되는 것이 바람직하다. 이종유전자는 바이러스 게놈내 여러 부위에 삽입될 수 있다.
이종유전자의 전사서열(transcribed sequence)은 수상세포(dendritic cell, 수상세포), 바람직하게는 포유동물의 수상세포, 보다 바람직하게는 인간의 수상세포 내에서 이종유전자의 발현을 허락하는 통제서열(control sequence)에 작동가능하게 연결된다. "작동가능하게 연결된(operably linked)"이라는 용어는 병치상태(juxtaposition)를 언급하며, 이는 그 구성 요소들이 원래 의도되어진대로 서로서로 기능을 수행하도록 허용하는 관계에 있음을 의미한다. 암호화 서열에 "작동가능하게 연결된" 통제 서열은, 그것과 양립할 수 있는 조건하에서 암호화 서열이 발현될 수 있게 하는 방식으로 연결된다.
통제 서열은 이종유전자의 발현을 가능하게 하는 프로모터 및 전사의 종결을 위한 신호를 포함한다. 프로모터는 포유동물에서, 바람직하게는 인간 수상세포에서 기능을 발휘할 수 있는 프로모터들로부터 선택된다. 프로모터는 진핵 유전자의 프로모터 염기서열로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 프로모터는 이종 유전자의 발현을 가능케 하는 세포, 바람직하게는 포유동물의 수상세포, 보다 바람직하게는 인간의 수상세포 게놈으로부터 유래한 프로모터이다. 이러한 진핵 프로모터들에 관해, 그것이 조직에 상관없이 항상 일정하게(β-actin 및 tubulin의 프로모터들) 또는 선택적으로는, 조직-특이적 방식(tissue-specific manner)으로 (피루베이트 인산화효소(pyruvate kinase)와 같은 유전자의 프로모터들)으로 작용하는 프로모터들이다. 또한, 그들은, 예를 들어, 스테로이드 호르몬 수용체(steroid hormone receptor)에 결합하는 프로모터 같이 특별한 자극에 반응하는 프로모터들이다. 또한, 바이러스 프로모터는, 예를 들어 몰로니 뮤린 류케미아 바이러스 롱 터미널 리피트(Moloney murine leukemia virus long terminal repeat, MMLV LTR) 프로모터 또는 인간 또는 마우스의 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus, CMV) IE 프로모터 같은 다른 레트로 바이러스의 프로모터가 사용될 수도 있다.
발현 카세트 및 이종유전자와 통제서열을 포함하는 다른 적당한 구조물들은 당업자들에게 널리 알려진 일반적인 클로닝 방법을 사용하여 만들어진다(참조: Sambrook et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Press, 1989).
게다가, 이러한 프로모터들 중 일부는, 인핸서 염기서열(enhancer sequence, HSV 잠재성 전사물(latency-associated transcript, LAT) 부분의 구성요소 포함)과 같은 조절 염기서열의 부가에 의해 변형될 수 있다. 상술한 둘 또는 그 이상의 다른 프로모터들로 이루어진, 예를 들어 MMLV LTR/LAT 융합 프로모터(참조: Lokensgard et al., 1994) 또는 LAT 부분의 구성요소들로 이루어진 프로모터(WO98/30707)와 같은 키메라 프로모터(chimeric promoter)가 사용된다.
이종유전자는 전형적으로 치료용 폴리펩티드를 암호화한다. 예를 들어, 특정 종양에 대한 면역반응을 특이적으로 증가시키기 위하여, 종양 항원의 발현을 조절하는 본 발명의 바이러스를 수상세포에 형질도입하는 것이 바람직하다. 종양 항원은 종양세포에 특이하거나 또는 같은 유형의 비종양세포에 비해 항원 발현의 상승 조절에 의하여 종양세포에서 훨씬 높은 수준으로 발현될 수 있다. 특히, 종양 항원이 종양세포 표면에서 발현(예를 들어, 세포 표면 수용체나 세포 부착 단백질)되는 것이 바람직하다. 종양 항원의 예로는 난소암을 포함한 수많은 종양에서 과발현되는 MUC-1 유전자 산물, 자궁암과 관련된 인간 파필로마 바이러스(human papilloma virus) 단백질인 E6 및 E7를 포함한다. MART-1, MAGE-1, 멜라노마의 gp100 및 타이로시나제, 전립선 암의 PSA, 종양의 무수한 서로 다른 타입에서의 CEA 및 유방암을 포함하는 여러 가지 암에서의 Her2neu.
이종유전자는, 예를 들어 사이토카인(α, β 또는 γ-인터페론, IL-1, IL-2를 포함하는 인터루킨, 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor), 또는 인슐린 유사 성장 인자(insulin-like growth factor) I 또는 II)) 또는 RANTES 같은 키모카인과 CD80, CD86, CD40 및 CD40 리간드 같은 보조-자극분자를 포함하는 다른 면역 조절 단백질같은 면역반응을 매개하는 폴리펩티드를 암호화할 수 있다.
또한, 이종유전자는 병원성 기원의 폴리펩티드/폴리펩티드들을 암호화할 수 있는데, 예를 들어, 본 발명의 바이러스로 감염된 수상세포는, 감염 이전 또는 병원균에 의하여 숙주가 감염된 이후에, 병원균에 대한 면역반응을 나타내는 숙주의 면역체계를 자극하는데 이용될 수 있다. 백신으로 사용되는 항원성 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 바람직하게는, 항원성 폴리펩티드는 기생충, 세균, 또는 바이러스 등의 질환성 생물로부터 유래된다. 이러한 항원성 폴리펩티드의 예로는 C형 간염 바이러스 항원, B형 간염 바이러스 항원, 인간면역결핍바이러스(human immunodeficiency virus, HIV) 항원, 말라리아 항원, 백일해 독소, 콜레라 독소 또는 디프테리아 독소를 포함한다. 질환성 생물로부터 유래된 이형유전자를 포함하는 바이러스는 치료 또는 예방에 사용될 수도 있다.
유전자 요법과 이외의 다른 치료에 사용하기 위하여는, 다양한 유전자의 투여를 필요로 한다. 다양한 유전자의 발현은 다양한 조건에서의 치료에 유용하다. 허피스 바이러스는 다른 바이러스벡터 체계와는 달리 팩키징능력이 제한되지 않기 때문에 특히 적당하다. 그리하여 다양한 이종유전자들이 그것의 게놈안에 수용될 수 있다. 예를 들어, 2 내지 6개의 유전자가 게놈안에 삽입될 수도 있다.
이러한 것을 가능하게 하는 적어도 2가지의 방법이 있다. 예를 들어, 한 종류 이상의 이종유전자와 이와 관련된 조절 서열을 특정한 HSV균주로 바이러스 게놈안의 한 부위 또는 여러 부위에 삽입할 수 있다. 또한, 서로 반대 방향으로 마주보고 있는 프로모터의 쌍(동일하거나 또는 서로 다른 프로모터)을 사용할 수 있는데, 이러한 프로모터들은 전기에서 설명한 바와 같이 이종유전자(동일하거나 또는 서로 다른 이종유전자)의 발현을 촉진시킨다.
D. 수상세포
수상세포는 여러가지 방법으로 분리/제조될 수 있는데, 예를 들어 말초혈액으로부터 직접 정제되거나, G-CSF의 처리에 의해 말초혈액으로 이동 후 CD34+ 전구세포로부터 발생되거나 또는 직접 골수로부터 얻을 수 있다. 말초혈액으로부터의 부착 전구세포(adherent precursor)를 과립구-대식구집락 자극인자(granulocyte/macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)/IL-4 혼합물로 처리하거나(참조: Inaba et al., 1992) 또는 골수로부터의 비부착 CD34+ 세포를 GM-CSF/TNF-α로 처리한다(참조: Caux et al., 1992). 수상세포는 Sallusto 및 Lanzavecchia(1994)의 방법과 마찬가지로, 정제된 PBMC(peripheral blood mononucleocyte cell)를 사용하여 부착세포를 GM-CSF 및 IL-4로 2시간 처리함으로써, 인간 지원자의 말초혈액으로부터 일상적으로 획득할 수 있다. 전기 획득물에 대해 마그네틱 비드(magnetic bead)를 사용하여 CD19+ B-세포 및 CD3+, CD2+ T-세포를 제거시킨다(참조: Coffin et al., 1998). 다른 방법들이 또한 수상세포의 획득을 위해 사용될 수 있다.
E. 치료 용도
본 발명의 바이러스 및 본 발명의 바이러스에 감염된 수상세포는 치료용으로 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 바이러스 및 종양 항원을 발현할 수 있는 본 발명의 바이러스에 감염된 수상세포는 암 치료에 사용될 수 있다. 보다 자세하게, 본 발명의 바이러스 및 본 발명의 바이러스에 감염된 수상세포는 인간을 포함한 포유동물의 다양한 종양, 예를 들어, 난소암, 자궁암 및 자궁내막암, 유방암, 폐암, 방광암 및 결장암,의 성장을 억제하는데 사용될 수 있다. 억제될 수 있는 다른 암 의 예로는 연조직(soft tissue) 및 뼈의 육종암 및 백혈병같은 혈액악성종양을 포함한다. 본 발명의 바이러스 및 종양항원을 발현하는 본 발명의 바이러스에 감염된 수상세포를 사용하여 치료될 수 있는 암의 예로는 흑색종(melanoma), 백혈병(leukemia), 자궁암(cervical cancer) 및 난소암(ovarian cencer)이 있다. 전형적으로, 항암치료용 바이러스는 암 항원을 암호화하는 이형유전자를 포함한다. 전기 바이러스 또는 전기 바이러스로 감염된 수상세포의 투여는 암 항원에 대하여 면역반응이 유발되는 결과를 나타낼 것이다.
본 발명의 바이러스 및 본 발명의 바이러스에 감염된 수상세포는, 예를 들어, 기생충, 세균, 또는 바이러스 감염 같은 질환성 감염을 치료 또는 예방에 사용될 수 있다. 일반적으로, 질환성 감염 치료용 바이러스는 질환성 생물로부터 유래된 항원을 암호화하는 이형유전자를 포함한다. 일반적으로, 전기 바이러스 또는 전기 바이러스로 감염된 수상세포의 투여는 질환성 생물의 항원에 대한 면역반응을 유발시키는 결과를 초래할 것이다. 전기 바이러스 감염은 허피스 바이러스 감염을 포함한다. 따라서, 본 발명의 바이러스는, 예를 들어 HSV1 또는 HSV2 감염에 대한 치료 또는 예방에 있어서, 바이러스 자체에 대한 면역반응의 유발에 사용될 수도 있다. 바이러스가 HSV1 또는 HSV2의 치료에 사용될 경우, 전기 바이러스는 HSV 항원(자연적인 프로모터의 조절하에 있지 않은)을 암호화하는 이형유전자 또는 면역조절 분자를 선택적으로 포함할 수도 있다. 바이러스/수상세포는 숙주의 예방 면역반응을 자극하기 위해 감염전에 투여되거나 또는 감염에 맞서 싸우는 면역계를 자극하기 위해 감염후에 투여될 수 있다.
F. 투여
본 발명의 HSV는 치료를 필요로 하는 사람이나 동물에게 치료 유전자를 전달하는데 사용된다. 본 발명의 HSV를 사용한 치료 유전자의 전달은 악성종양 및 감염 치료에 사용된다.
본 발명의 바이러스는 환자, 바람직하게는 치료가 필요한 인간의 환자에게 사용될 수도 있다. 치료가 필요한 환자는 암이 발병한 개인 또는 질환성 감염된 환자이다. 치료의 목적은 환자의 상태를 향상시키는 것이다. 일반적으로, 본 발명의 바이러스를 이용한 치료는 암 증상에 효과적이다. 본 발명에 의한 암 치료방법은 바이러스가 환자의 수상세포에 존재하도록, 기능적인 UL43 유전자를 포함하고, 기능적인 vhs 유전자가 결여된 바이러스의 유효량을 암이 발병한 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 암이 발병한 환자에게 본 발명의 바이러스의 투여는 암세포를 사멸시켜서, 종양의 크기를 감소시키거나 및/또는 종양으로부터 악성종양 세포의 확장을 저해시킬 것이다.
일반적으로, 본 발명의 바이러스를 이용한 질환성 감염의 치료는 감염증상에 효과적이고, 바람직하게는 질환성 생물을 사멸시킨다. 본 발명에 의한 질환성 감염의 치료방법은 기능적인 vhs 유전자가 결여된 바이러스의 유효량을 질환성 감염을 가진 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 전기 바이러스가 환자의 수상세포에 들어가거나 또는 체외환경(ex vivo)에서 바이러스에 감염된 수상 세포가 환자에게 투여된다. 일반적으로, 본 발명의 바이러스를 이용한 예방치료는 암 또는 질환성 감염의 위험을 가지는 환자에게 암 항원에 대한 항체 또는 질환성 생물에 대한 항체의 생산을 유도한다. 일반적으로, 암 발명의 위험이 있는 환자는 유전적으로 그들에게 영향받거나 또는 발암물질에 노출되거나 노출될 위험이 있을 수도 있다. 일반적으로, 질환성 감염에 위험이 있는 환자는 질환성 생물에 노출될 수도 있다.
유전자 치료를 위한 투여 방법의 하나는 전기에서 설명한 바와 같이 본 발명의 HSV 게놈에 치료 유전자를 삽입하고, 전기에서 수득된 재조합 바이러스를 약제학적으로 허용되는 담체나 희석제와 조합하여 약제학적인 조성물을 만드는 것이다. 적당한 담체와 희석제는 인산 완충 식염수(phosphate-buffered saline) 등의 등장 식염 용액을 포함한다. 조성물은 비경구적, 근육내, 정맥내, 피하 또는 피부투과(transdermal) 투여를 위해 조제된다. 피하 또는 정맥내 투여가 바람직하다. 피부투과 또는 피부내 투여가 가장 바람직하다.
본 발명의 바이러스를 수상세포에 감염시키는 것은 환자에 바이러스를 포함한 조성물 투여에 의해 in vivo에서 수행될 수 있다. 약학적 조성물은 치료용 유전자를 포함하는 바이러스가 적당한 부위에 있는 세포에 병합되도록 투여된다. 투여될 바이러스의 양은 104 내지 1010pfu의 범위이고, 바람직하게는 105 내지 108pfu의 범위, 보다 바람직하게는 106 내지 107pfu의 범위이다. 접종할 때는, 전형적으로 10μl 내지 1ml, 바람직하게는 100μl 내지 1ml의 바이러스를 약제학적으로 허 용되는 적당한 담체나 희석제를 사용하여 투여된다.
또 다른 방법은 말초혈액 또는 골수로부터 수상세포를 분리하여 in vitro에서 본 발명의 바이러스를 감염시키는 것을 포함한다. 형질도입된 수상세포는 근육내, 복강내, 피하 또는 정맥내 주사에 의해 환자에게 투여되거나, 또는 환자의 림프절로 직접 투여되는데, 림프절로의 직접투여가 바람직하다. 일반적으로, 104 내지 108개의 형질도입된 수상세포, 바람직하게는 105 내지 107개의 수상세포, 보다 바람직하게는 약 106개의 수상세포가 환자에게 투여된다.
상술한 투여 경로와 투여량은 특별한 환자에 대한 최적의 투여경로와 투여량을 결정할 수 있는 당업계의 전문의들에 의하여 결정된다. 상기 투여량은 환자의 나이, 체중 및 상태를 고려한 여러가지 변수에 의하여 결정될 것이다.
이하의 실시예에서 본 발명을 설명한다.
재료 및 방법
바이러스 균주의 형성 및 성장
모든 바이러스 균주는 HSV1 17+로부터 유래되며, 그것의 서열은 GenBank(Accession No. HE1CG)에 기탁되었다. 모든 균주는 HSV1 ICP27, ICP4 및 이퀸 허피스 바이러스(equine herpes virus, EHV) 유전자 12로 형질도입된 BHK C- 21세포(ECACC No.8501143) 또는 BHK 세포를 사용하여 작제되고 증식되었다(Thomas et al., 1999).
VMW65에 대해 돌연변이를 가지는 바이러스에 대해, 3mM 헥사메틸렌-비스아세트아미드(hexamethylene-bisacetamide)가 바이러스 증식에 사용되도록 배지에 포함되었다(참조: McFarlane et al., 1992). 다음의 바이러스 균주가 사용되었다.
(i) 17+(야생형 HSV1)
(ii) 17+/pR20.5/UL43
서로 반대방향이고 HSV LAT 영역서열(nts 118,866-120,219)에 의해 분리된 라우스 사코마 바이러스(rous sarcoma virus, RSV)/lacZ/pA 서열 및 CMV/GFP/pA 서열로 구성된 플라스미드 pR20.5(Thomas et al., 1999)로부터의 카세트를 표준방법에 의해 정제된 HSV1 균주 17+ 게놈 DNA의 UL43위치에 상동성 재조합에 의해 삽입하였다. pR20.5 카세트는 NsiI 부위의 UL43 인접영역(참조: Coffin et al., 1996)을 포함하는 플라스미드로 삽입하여 플라스미드 pR20.5/43을 만들었다. 20.5 카세트는 SrfI을 가지고 pGEM5(Promega) 플라스미드로부터 잘라질 수 있는데, 이것은 SrfI을 암호화하는 올리고뉴클레오티드가 카세트의 양쪽에 삽입되어 있기 때문이다. 플라스미드 pR20.5의 작제를 위해서 RSV 프로모터는 pRc/RSV(Invitrogen)로부터 잘라내며, lacZ/pA는 pCH10(Pharmacia)로부터, CMV/pA는 pcDNA3(Invitrogen)으로부터 GFP는 pEGFP-N1(Clontech)로부터 잘라내었다.
(iii) 1764/27-/4-
바이러스 균주 1764/27-/4-는 비어있는 ICP4 플랭킹 부위를 가진 바이러스 균주 1764/27-/4-/pR20.5 DNA의 재조합과 GFP와 lacZ를 발현하지 않는 바이러스 플라크의 선별로 형성되었다. 바이러스 균주 1764/27-/4-/pR20.5는 토마스 등(Thomas et al., 1999)에 의하여 발표되었는데, 전기 균주는 ICP27과 ICP34.5가 결실되고 VMW65를 암호화하는 유전자에서 불활성화 돌연변이를 가지는 바이러스의 ICP4를 암호화하는 유전대를 치환하여, ICP4 내부에 삽입된 pR20.5 카세트를 포함한다.
(iv) 1764/27-/4-/pR20.5/vhs
바이러스 균주 1764/27-/4-/pR20.5/vhs는 HSV 균주 17+의 vhs 암호화 유전자에 있는 독특한 NruI 죄위에 있는 vhs 플랭킹 부위안에 pR20.5 카세트가 삽입되고, 결과적으로 수득한 플라스미드를 HSV 균주인 1764/27-/4- DNA에 재조합하여 형성되었다. 따라서, 바이러스 균주 1764/27-/4-/pR20.5/vhs는 ICP4, ICP27 및 ICP34.5를 암호화하는 유전자가 결실되고, VMW65 및 vhs를 암호화하는 유전자에서 불활성화 돌연변이를 가진다.
(v) 1764/27-/4-/pR19lacZ
바이러스 균주 1764/27-/4-/pR19lacZ는 vhs 로 pR20.5 카세트가 삽입되는 대 신에, 1764/27-/4- 바이러스 균주의 잠재 결합 전사체(latency associated transcript, LAT) 내부에 재조합된 pR19lacZ 카세트(Wagstaff et al., 1998)를 사용한 것을 제외하고는, (iv) 바이러스와 동일한 방법으로 형성되었다.
(vi) 1764/27-/4-/pR20.5/vhs/HBS-Ag
pR20.5/vhs 플라스미드의 lacZ 유전자는 XhoI 및 NsiI로 처리된 pHBV130(Gough and Murray, 1982) 및 SalI 및 SmaI 좌위 사이에 pSP72(Promega) 내부로 해리된 절편의 삽입에 의한 B형 간염 표면항원(HBS-Ag)으로 대체되었다. pR20.5/vhs는 HindIII 및 EcoRI에 의하여 pSP72에서 잘려진 HBS-Ag 유전자에 의하여 대체된 lacZ 유전자를 해리하도록 XbaI 및 EcoRI으로 처리하였다. 그 결과로 수득한 플라스미드는 1764/27-/4-/pR20.5/vhs 바이러스 DNA 내부로 재조합되었고, lacZ 를 발현하지 않는 플라크를 선별한 다음 순수분리하였다. 그런 다음, 게놈 구조를 서던블롯 방법으로 확인하였다.
수상세포의 수득
DC는 상술한 바와 같이, 말초혈로부터 수득되었다(참조: Coffin et al., 1998). 요약하면, 말초혈 단핵세포(PBMCs)는 림포프렙(Nycomed)을 이용하여 건강하고/B형간염 예방되어 있는 공여자의 혈액 60ml로부터 수득되었다. 적혈구를 제거한 후, 비-점착성 세포(주로 T 세포와 B 세포)를 제거하고, 행크즈 버퍼드 염 용액(Hank's Buffered Salt Solution, HBSS)의 완충용액으로 세척한 다음, RT에서 14,000rpm으로 5분간 원심분리하였다. 전기 세포 침전물은 2ml 90% FCS와 10% 디메틸설폭사이드(DMSO)의 혼합물에 재현탁되고, 일부를 수득하여 뒤이은 T 세포추출이 진행되는 동안 -80℃에 저장하였다. 점착성 세포는 GM-CSF(0.1ug/ml)과 IL-4(0.05ug/ml)를 포함하는 로즈웰 파크 메모리얼 연구소(Roswell Park Memorial Institute, RPMI) 배지에서 5% CO2, 37℃의 조건에서 7일동안 배양되었다. 추가적인 림포프렙 이후에, 순수분리된 세포들은 항-CD19, 항-CD2(Harlan), 항-CD3(Harlan) 항체를 이용하여 급격히 감소되었고, CD는 빠른 사용을 위하여 완전한 RPMI 배지에 현탁되었다.
CD4+ T 세포의 순수분리
상술한 냉동된 T 및 B 세포는 급속해동되고, HBSS로 세척된 후, 14,000rpm으로 5분동안 원심분리되었다. 세포는 2ml의 완전한 RPMI 배지에 재현탁되고, 계수된 다음, 항-CD19(BU12 - 200ul neat, Immunology dept, UCL), 항-CD14(HB246 - 200ul neat, Immunology dept, UCL) 및 항-HLA-DR(L243 - 100ul neat, Immunology dept, UCL) 단클론항체와 혼합하여 방치되고, 얼음에서 30분간 방치되었다. 전기 세포는 HBSS로 세척되고, 2ml의 완전한 RPMI 배지에 재현탁되며, 자석 비드(Dynabeads, Dynal)에 부착된 양의 항-마우스 항체와 10ul beads/106 세포의 비율로 혼합되고, 회전교반기위에서 4℃에서 45분동안 방치되었다. CD4+ T세포는 자석위에 접촉한 세포현탁액/자석비드 혼합물을 10분동안 얼음에 넣은 후, 상등액을 제거함으로써 급격히 감소되었다. CD4+ T세포는 계수되고, 적절한 농도의 완전한 RPMI배지에 현탁된 다음, 얼음에 방치하거나 또는 연속적인 사용을 위하여 37℃, 5% CO2에서 하룻밤동안 배양되었다.
DC의 감염
DC는 실온에서 5분동안 14,000rpm으로 원심분리하여 침전되었다. DC는 5% CO2, 37℃에서 1시간 동안, 바이러스가 포함된 완전한 RPMI 배지에 현탁액에 의하여 1MOI로 감염되었다. GM-CSF(0.1ug/ml)과 IL-4(0.05ug/ml)를 포함하는 RPMI 배지 1ml이 추가되고, DC는 5% CO2, 37℃에서 방치되었다. LPS 자극을 위하여, 100ng/ml LPS를 포함하는 RPMI 배지가 추가적으로 사용되었다.
사이토카인 분석
인터루킨 6(interleukin-6, IL-6) 및 종양괴사인자-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)는 상업적으로 사용가능한 효소면역분석(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 키트(Ramp;D Systems)를 이용한 DC 배양 상등액에서 측정되었다. ELISA 이전에, 상등액은 인식된 바이러스로 DC가 감염되지 이전 42시간 동안 수집되었고, 사용전에 -20℃에서 저장되었다.
T세포 분화 분석법
DC 및 CD4+ T세포는 B형 간염이 예방된 인간과 예방되지 않은 개인으로부터, 상술한 방법에 의하여 분리되고 처리되었다. DC는 1 x 105DC/ml 내지 1 x 104DC/ml로 희석되어 사용되고, CD4+ T세포는 1 x 105세포/ml로 희석되어 사용되었다. 각 DC의 농도에서 실험은 3회 반복으로 수행되었다. 100ul DC와 100ul CD4+ T세포는 각 분석 웰에 추가되었다. 인식된 재조합 B형 간염 표면 항원(Austral)은 1ug/웰의 최종농도로 각 웰에 추가되었다. HSV-1이 감염되거나 또는 감염되지 않은 DC는 5% CO2, 37℃에서 6일동안 CD4+ T세포와 함께 배양되었다. 1uCu/웰의 [3H] 티미딘(Amersham)이 추가되고, 18시간 이후에 세포를 수득하며, 함입된 [3H] 티미딘을 계수하였다.
실시예 1: 기능적인 vhs 유전자를 포함하지 않는 HSV 균주가 나타내는 예비자료는 바이러스 감염에 따르는 수상세포의 신장된 활성화를 제공한다.
각 경우에, 1 x 105 수상세포가 침전되고, DMEM에 100ul로 재현탁되며, 37℃에서 1시간동안 방치된 각 바이러스로 감염되고, 2ml의 RPMI/10% FCS + 100ng/ml GM-CSF, 50nm/ml IL-4와 함께 24웰 플레이트로 이동되었다. 전기 플레이트는 하룻밤동안 5% CO2, 37℃에서 방치되었다. 또한, 수상세포는 수상세포 활성인자인 당지질(LPS)로 처리되고, 대조군은 처리안된 것을 이용하였다.
전기 감염물과 대조군의 상등액이 분비된 사이토카인의 수준을 측정하기 위한 ELISA 시험에 이용되었다. 또한, 활성화 세포 배열 형광(fluorescence activated cell sorting, FACS)은 감염된 수상세포와 대조군의 수상세포 표면에 CD86 발현수준을 측정하는데 이용되었다. 수상세포 배양물에서, CD86 발현수준에 따른 두개의 집단이 존재한다. 이들은 상대적으로 낮은 수준으로 CD86을 발현시키는 세포인 첫번째 피크와 상대적으로 높은 수준으로 CD86을 발현시키는 세포인 두번째 피크인, FACS 분석결과를 반영하는 두개의 피크가 관찰되었다. 예를 들어, LPS에 의한 세포의 활성화는 보다 높은 수준으로 CD86을 발현시키고, 이들은 두번째 피크에서 발견되었다.
실험결과
1MOI의 바이러스에 의하여 감염된 24시간 후의 배양물의 상등액과 대조군 상등액에서의 사이토카인 농도. ELISA로 측정.
처리군 사이토카인 농도(ng/웰)
IL-6 TNFα
17+/pR20.5/UL43 6 1.1
1764/27-/4-/pR19lacZ 4 0.8
1764/27-/4-/pR20.5/vhs 46 7.1
비 감염 4 0.9

대조군과 바이러스로 감염된 세포에서의 CD86의 발현
처리군 1번 피크의 세포% 2번 피크의 세포% 2번 피크의 평균 형광강도
17+/pR20.5/UL43 43.35 46.85 5 x 102
17+/pR20.5/UL43 + LPS 56.93 29.06
1764/27-/4-/pR19lacZ 24.1 68.5 5 x 102
1764/27-/4-/pR19lacZ + LPS 52.71 35.32 7 x 102
1764/27-/4-/pR20.5/vhs 27.81 64.61 1 x 103
1764/27-/4-/pR20.5/vhs + LPS 39.52 52.40 9 x 102
비 감염 48.95 31.45 1 x 103
비 감염 + LPS 30.33 60.81 9 x 102

결론
전기 실험결과는 처리되지 않은 수상세포가 측정된 사이토카인을 최소수준으로 분비하고, 그들의 표면에서 CD86의 "휴지(resting)"수준으로 예상되었다. 이어, LPS를 처리한 경우 사이토카인 수준은 급격히 자극되고, CD86의 표면발현이 급격히 증가하였다. 상기 실험에서, LPS가 처리된 세포에서의 평균 형광강도는 항-CD86 항체를 이용한 FACS 분석에 의하여 거의 1 x 103이었다. 이들 실험결과는 수상세포가 활성화된 상태로 있음을 시사한다.
이어, 바이러스를 이용한 수상세포의 감염은 vhs를 암호화하는 유전자에서 불활성화 돌연변이를 포함하는 바이러스를 이용한 분석법에 의하여, 수상세포의 활성화가 유발됨을 명확하게 보여주었다. 무능력하게 변하는 바이러스가 사용되었고, vhs 돌연변이를 포함하는 바이러스만이 이러한 분석법에 의해서 수상세포를 급격히 활성화 시켰다. 또한, vhs에 대한 돌연변이가 세포가 LPS로 처리되고, 바이러스로 감염될 때, 포함되지 않는다면, CD86 수준은 LPS 단독으로 처리되어 유발되 는 것처럼, 많은 세포에서 증가하지 않을 것이다. 또한, vhs 돌연변이가 포함되지 않는다면, 바이러스 감염에 이은 FACS에 의하여 측정된 것처럼, D86 발현 세포의 평균 형광강도는 LPS로 처리된 세포에서 보여지는 것보다 감소되었다. 따라서, 수상세포에 의한 최대 면역유발을 위하여는, vhs를 암호화하는 유전자에서의 불활성화 돌연변이가 포함되어야 한다고 결론지을 수 있다.
실시예 2: 기능적인 vhs 단백질을 포함하지 않는 HSV 균주는 수상세포 활성화를 저해하지 않는다.
FACS는 감염된 수상세포의 표면 및 대조군 수상세포의 표면에서 CD86, CD80, CD83 및 CD40의 발현수준을 측정하기 위하여 사용되었다. 감염물로부터의 상등액은 ELISA에 의하여 사이토카인의 수준을 평가하는데 사용되었다.
실험결과
전기 ELISA 결과(도 3)는 DC가 높은 효율로 HSV에 감염될 수 있는 반면, DC 활성화를 나타내는 사이토카인은 야생형(균주 17+) 또는 무독화 바이러스(균주 1764/27-/4-)로 처리된 경우에 생산되지 않는다는 것을 보여준다. 그러나, vhs가 1764/27-/4-로부터 불활성화 된다면, 주어진 균주인 1764/27-/4-/pR20.5/vhs에서, DC 활성화를 나타내는 사이토카인이 생산된다. LPS로 자극되지 않은 DC에서의 FACS 분석(도 2)은 필수적인 야생형(균주 17+)으로 인한 감염 또는 무독화된 HSV 벡터의 복제(균주 1764/27-/4-)가 CD86의 증가된 발현을 저해함을 나타낸다. 상술한 바와 같이, DC가 감염과정에 의하여 활성화되면 증가된 CD86 발현이 기대되었다. 또한, CD40 수준은 HSV 감염된 세포에서 변형/감소된다. 그러나, vhs가 불활성화된다면(균주 1764/27-/4-/pR20.5/vhs), CD86 수준은 활성화를 나타내도록 증가하고, CD40 수준은 영향을 받지 않는다. CD80 및 CD83은 HSV에 감염된 비자극화된 DC에 크게 영향받지 않는다. CD83(B7.1) 및 CD86(B7.2)은 구대의 중요한 T세포 보조-자극 분자(co-stimulatory molecule)이고, CD40은 중요한 T세포 자극원이며, CD83은 DC의 성숙 및 활성화 동안에, 상위-조절된 DC 마커이다.
DC가 있을 때, CD40 수준에 영향을 미치는 감염시간에 자극된 LPS는 야생형(균주 17+) 또는 무독화 바이러스(균주 1764/27-/4-)로 표지된 다. 그러나, vhs가 불활성화 된다면, CD40에 대한 효과는 저해된다. 일반적으로, DC로 자극된 LPS는 CD83과 CD86 발현을 현저하게 상위-조절하지만, vhs가 불활성화 되지 않는다면(균주 1764/27-/4-/pR20.5/vhs), 이는 HSV(균주 야생형 17+ 및 1764/27-/4-)에 의하여 저해된다. vhs가 불활성화될 때, CD83 및 C D86 수준은 LPS 자극되었으나 감염되지 않은 세포에서처럼, 유사한 또는 크게 확장된 것으로 증가된다.
결론
기초 실험(실시예 1)에서 보듯이, HSV 감염 또는 HSV 감염 및 LPS 자극에 대 한 반응에서 표면 마커 발현 수준에 의하여 측정된 바와 같이 수상세포가 활성화되기 위하여는, vhs를 암호화하는 유전자가 불활성화되어야만 함을 명백히 보여준다. 시험된 표면 마커의 발현수준에 의하여 측정된 것처럼, 기능적인 vhs를 암호화하는 바이러스는 수상세포가 유의하게 활성화되지 못하도록 한다.
실시예 3: vhs 불활성화된 HSV 벡터로 형질전환된 DC는 실험실적 환경(in vitro)에서 항원 특이적인 T세포 반응에 영향을 미친다.
상술한 실험결과는, DC에서 HSV의 불활성화 효과가 저해된 것처럼, vhs가 불활성화된 HSV 벡터가 DC를 위한 효과적인 벡터로서 사용될 수도 있음을 제시하였다. 실제로, CD86 상위-조절과 어떠한 사이토카인의 분비에 의하여 측정된 것처럼, HSV 돌연변이로 감염된 DC는 감염에 대한 반응에 있어서 특별히 활성화되는 것처럼 보여진다. vhs 불활성화된 HSV가 DC에 대한 항원을 암호화하는 유전자의 분배에 따른 항원 특이적인 면역반응에 사용될 수 있는지 알아보기 위하여, B형 간염에 면역되고, 면역되지 않은 개인으로부터 수득한 DC와 T세포를 이용하여 실험이 수행되었다. 여기서, B형 간염 표면항원(HBS-Ag) 발현 카세트가 IE 유전자 결실 바이러스의 유전자를 암호화하는 vhs 내부로 삽입된 바이러스가 먼저 형성되었다. T세포 증식 분석법은 처리되지 않거나, 재조합 HBS-Ag 단백질과 혼합된 항원으로 처리되거나, 벡터(1764/27-/4-/pR20.5/vhs at MOI=1)를 포함하는 대조군 마커 유전자로 감염되거나, 대조군 벡터(1764/27-/4-/pR20.5/vhs at MOI=1)와 재조합 HBS-Ag 단백질의 혼합물로 감염되거나 또는 HBS-Ag를 발현시키는 벡터(1764/27-/4-/pR20.5/vhs/HBS-Ag at MOI=1)로 감염시켰다. 이어, DC를 각각 면역된 또는 면역되지 않은 개인으로부터 유래된 T세포와 혼합하고, 표준 T-세포 증식분석법에서 관찰된 T세포 증식에 대한 효과를 관찰하였다.
이러한 실험은 HBS-Ag 재조합 단백질과 대조군 HSV 벡터가 면역화된 개인에서 적은량의 T세포 증식 반응을 초래하는 반면에, HSV 구조 단백질과 재조합 HBS-Ag로 혼합된 대조군 벡터에 대한 특이적인 T세포의 증식을 나타내는 HSV 반응이 서서히 더 크게 반응하고, 이들 중의 어느것 보다도 HBS-Ag 발현 벡터가 유의적으로 증가된 반응을 나타냄을 보여주었다(도). 따라서, HSV 벡터를 사용하여 DC내부로 직접적인 HBS-Ag의 분배에 따르는, 중요하고 특이적인 T세포 증식반응은 재조합 항원만으로 혼합된 경우에는 발생하지 않았음을 알 수 있었다. 따라서, DC가 항원 특이적인 T세포 증식반응을 자극할 수 있도록 불활성화된 vhs를 가지는 HSV 벡터는 DC에 대한 유전자를 암호화하는 항원의 분배를 허가한다.
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Claims (38)

  1. (i) 비리온 호스트 셧오프 단백질(vhs)을 암호화하는 기능적인 유전자가 결여되고; 및,
    (ii) UL43 유전자를 포함하며, 수상세포를 감염시키는 단계를 포함하는 면역반응을 자극시키는 방법에 사용하는 약독화된 허피스 바이러스.
  2. 제 1항에 있어서,
    전기 바이러스는 허피스 심플렉스 바이러스 1 또는 2인 것을 특징으로 하는
    약독화된 허피스 바이러스.
  3. 제 1항에 있어서,
    전기 바이러스는 ICP47을 암호화하는 기능적인 유전자가 결여된 것을 특징으로 하는
    약독화된 허피스 바이러스.
  4. 제 1항에 있어서,
    전기 바이러스는 전사-활성이 결여된 단백질을 암호화하는 VMW65유전자를 가지는 것을 특징으로 하는
    약독화된 허피스 바이러스.
  5. 제 1항에 있어서,
    전기 바이러스는 ICP0, ICP4, ICP22, 또는 ICP27을 암호화하는 유전자로부터 선택되는 최소한 하나의 기능적인 초기반응 유전자가 결여된 것을 특징으로 하는
    약독화된 허피스 바이러스.
  6. 삭제
  7. 제 5항에 있어서,
    전기 바이러스는 ICP4를 암호화하는 기능적인 유전자가 결여된 것을 특징으로 하는
    약독화된 허피스 바이러스.
  8. 제 5항에 있어서,
    전기 바이러스는 ICP27을 암호화하는 기능적인 유전자 및 ICP4를 암호화하는 기능적인 유전자가 둘 다 결여된 것을 특징으로 하는
    약독화된 허피스 바이러스.
  9. 제 8항에 있어서,
    전기 바이러스는 ICP27을 암호화하는 기능적인 유전자 및 ICP4를 암호화하는 기능적인 유전자가 둘 다 결여되고, 전사-활성이 결여된 단백질을 암호화하는 VMW65유전자를 가지는 것을 특징으로 하는
    약독화된 허피스 바이러스.
  10. 제 5항에 있어서,
    전기 바이러스는 ICP22를 암호화하는 기능적인 유전자가 결여된 것을 특징으로 하는
    약독화된 허피스 바이러스.
  11. 제 5항에 있어서,
    전기 바이러스는 ICP0, ICP4, ICP22 및 ICP27을 암호화하는 기능적인 유전자가 결여된 것을 특징으로 하는
    약독화된 허피스 바이러스.
  12. 제 1항 내지 제 5항 및 제 7항 내지 제 11항의 어느 한 항에 있어서,
    전기 바이러스는 기능적인 ICP34.5 유전자가 추가로 결여된 것을 특징으로 하는
    약독화된 허피스 바이러스.
  13. 제 1항 내지 제 5항 및 제 7항 내지 제 11항의 어느 한 항에 있어서,
    전기 바이러스는 이종유전자(heterologous gene)를 포함하는 것을 특징으로 하는
    약독화된 허피스 바이러스.
  14. 제 13항에 있어서,
    전기 이종유전자는 조절서열과 양립할 수 있는 조건하에서 암호화 서열이 발현될 수 있게 하는 방식으로 조절 서열에 작동가능하도록 연결된 것을 특징으로 하는
    약독화된 허피스 바이러스.
  15. 제 13항에 있어서,
    전기 이종유전자는 치료용도의 폴리펩티드를 암호화하는 것을 특징으로 하는
    약독화된 허피스 바이러스.
  16. 제 15항에 있어서,
    전기 이종유전자는 발병 원(pathogenic origin)의 폴리펩티드를 암호화하는 것을 특징으로 하는
    약독화된 허피스 바이러스.
  17. 제 16항에 있어서,
    전기 폴리펩티드는 기생충, 바이러스 또는 박테리아 기원인 것을 특징으로 하는
    약독화된 허피스 바이러스.
  18. 제 17항에 있어서,
    전기 이종유전자는 허피스 유전자인 것을 특징으로 하는
    약독화된 허피스 바이러스.
  19. 삭제
  20. 제 15항에 있어서,
    전기 이종유전자는 면역 반응을 변형시킬 수 있는 폴리펩티드를 암호화하는 것을 특징으로 하는
    약독화된 허피스 바이러스.
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 제 15항에 있어서,
    전기 이종유전자는 비-종양세포에 비하여 종양세포의 내부 또는 표면에서 발현수준이 향상된 폴리펩티드; 종양세포의 내부 또는 표면에는 존재하지만, 비-종양세포에는 없는 폴리펩티드를 암호화하는 것을 특징으로 하는
    약독화된 허피스 바이러스.
  24. 삭제
  25. 제 15항에 있어서,
    전기 바이러스는 2 내지 6개의 이종유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는
    약독화된 허피스 바이러스.
  26. 제 23항에 있어서,
    전기 바이러스는 면역반응을 조절할 수 있는 이종유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는
    약독화된 허피스 바이러스.
  27. 제 20항에 있어서,
    전기 면역반응을 조절할 수 있는 폴리펩티드는 키모카인, 사이토카인 또는 보조-자극 분자(co-stimulatory molecule)인 것을 특징으로 하는
    약독화된 허피스 바이러스.
  28. 제 1항 내지 제 5항 및 제 7항 내지 제 11항의 어느 한 항에 있어서,
    전기 수상세포는 인간의 수상세포인 것을 특징으로 하는
    약독화된 허피스 바이러스.
  29. 제 1항 내지 제 5항 및 제 7항 내지 제 11항의 어느 한 항에 있어서,
    전기 수상세포는 체외환경(ex vivo)에서 감염시키기 이전에 말초혈 또는 골수로부터 분리되거나 수득되는 것을 특징으로 하는
    약독화된 허피스 바이러스.
  30. 제 29항에 있어서,
    전기 수상세포는 감염후에 체내에 다시 이식되는 것을 특징으로 하는
    약독화된 허피스 바이러스.
  31. 제 1항 내지 제 5항 및 제 7항 내지 제 11항의 어느 한 항에 있어서,
    전기 수상세포는 인간 또는 동물의 체내로 바이러스를 투여한 이후에, 체내환경(in vivo)에서 감염되는 것을 특징으로 하는
    약독화된 허피스 바이러스.
  32. 제 1항 내지 제 5항 및 제 7항 내지 제 11항의 어느 한 항에 있어서,
    전기 바이러스는 주사, 주입, 피부간 또는 피부투과 수단에 의하여 투여되는 것을 특징으로 하는
    약독화된 허피스 바이러스.
  33. 제 1항 내지 제 5항 및 제 7항 내지 제 11항의 어느 한 항의 허피스 바이러스에 감염된 체외환경(ex vivo) 수상세포.
  34. 삭제
  35. (i) 비리온 호스트 셧오프 단백질(vhs)을 암호화하는 기능적인 유전자가 결여되고;
    (ii) ICP47을 암호화하는 기능적인 유전자가 결여되고;
    (iii) 기능적인 UL43유전자를 포함하고;
    (iv) 전사-활성이 결여된 단백질을 암호화하는 VMW65유전자를 포함하거나, 기능적인 ICP34.5 유전자가 결여되거나, 또는 상기 VMW65유전자를 포함하고 상기 ICP34.5 유전자가 결여되며; 및,
    (v) 항원의 폴리펩티드를 암호화하는 이종유전자를 포함하는 약독화된 허피스 바이러스.
  36. 제 35항에 있어서,
    허피스 심플렉스 바이러스 1 또는 2인 것을 특징으로 하는
    바이러스.
  37. 제 35항 또는 제 36항에 있어서,
    면역 반응을 조절할 수 있는 유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는
    바이러스.
  38. 제 35항 또는 제 36항에 개시된 바이러스와 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
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