ES2230291T3 - Virus del herpes destinado a la inmunomodulacion. - Google Patents
Virus del herpes destinado a la inmunomodulacion.Info
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Abstract
Uso de un virus del herpes atenuado que: (i) carece de un gen vhs funcional, o un equivalente funcional del mismo; (ii) comprende un gen UL43 funcional, o un equivalente funcional del mismo; en la fabricación de un medicamento para uso en un método para estimular una respuesta inmune, comprendiendo el método infectar células dendríticas con dicho virus.
Description
Virus del herpes destinado a la
inmunomodulación.
La presente invención se refiriere a virus del
herpes simple atenuados que pueden infectar de forma eficaz células
dendríticas. También se refiera al uso de tales virus en enfoques de
inmunoterapia para el tratamiento de la enfermedad.
Las células dendríticas (DC) son las células
presentadoras de antígenos más potentes y son eficaces induciendo
respuestas incluso a antígenos a los que el sistema inmune se ha
vuelto tolerante. De esta forma, para la inmunoterapia tumoral, en
la que aumenta la respuesta inmune contra un tumor, el uso de DC
puede ser ideal si se hace que tengan antígenos tumorales
específicos. Las DC también pueden usarse para que presenten
antígenos derivados de agentes infecciosos, tales como bacterias,
virus o parásitos, proporcionando vacunas protectoras o terapéuticas
para tales enfermedades. Sin embargo la transferencia eficaz de
antígenos en DC para cualquiera de estas dianas ha demostrado ser el
mayor problema de este enfoque.
Para proporcionar una oportunidad más realista de
generar una respuesta inmune terapéutica contra un antígeno tumoral
u otra enfermedad relacionada con antígenos, deben reunirse varias
condiciones. En primer lugar, es necesario identificar moléculas
cuya expresión es específica de un tumor o enfermedad (o al menos
selectiva), y que por lo tanto puede servir como diana para una
respuesta inmune. Esta tarea ha demostrado ser muy difícil para la
mayoría de los tumores comunes, pero se resuelve por ejemplo en el
caso de cáncer cervical por la presencia, en algunos casos, de
oncogenes virales E6 y E7, y para otros tumores, se están comenzando
a identificar buenos antígenos candidatos. Por ejemplo, el producto
génico MUC-1 esta sobreexpresado en un número de
tumores, incluyendo el 90% de los cánceres de ovario. También se han
identificado otros antígenos asociados a tumores, cualquiera de los
cuales puede usarse en un tratamiento de inmunoterapia del cáncer.
No hay ninguna duda de que con el tiempo se seguirán descubriendo
otros antígenos asociados a tumores. En segundo lugar, siguiendo la
identificación del antígeno/antígenos es necesario suministrar los
antígenos en una forma inmunogénica al sistema inmune. Para generar
la respuesta inmune celular vital para el rechazo del tumor, esto
significa que las proteínas deben subministrase dentro del
citoplasma de una célula hospedadora (una tarea difícil para los
antígenos proteicos con alto peso molecular) o pueden sintetizar por
parte de las propias células hospedadoras después del suministro
génico o de la inmunización del ADN. Los vectores virales que se han
considerado para este propósito incluyen vaccinia, adenovirus o
retrovirus.
El tipo celular que ahora se reconoce ampliamente
como el que proporciona el estimulo inmune óptimo es la célula
dendrítica (DC; véase por ejemplo Girolomoni y
Ricciardi-Castagnoli, 1997) De echo, la DC parece
ser el único tipo de célula capaz de estimular una respuesta inmune
primaria in vivo, y además también se ha demostrado que puede
romper la tolerancia establecida en ciertas circunstancias. Varios
grupos están explorando el uso de DC en protocolos de inmunoterapia
adoptivos autólogos para estimular respuestas inmunes contra tumores
con la esperanza de que puedan mostrar un efecto terapéutico. Tales
protocolos incluyen cultivo y/o enriquecimiento de DC a partir de la
sangre periférica, carga in vitro de DC con antígeno y
reintroducción de las DC al paciente o carga directa in vivo
de DC con antígeno. Sin embargo, este enfoque se ha visto
obstaculizado por la ausencia de medios eficaces para cargar estas
células con antígenos. Sin embargo, un trabajo reciente ha
demostrado que la presentación de antígenos mediante DC sometidas a
pulsos mediante péptidos ha producido respuestas
anti-tumorales in vivo (Celluzzi et
al., 1996; Zitvogel et al., 1996). Con respecto a los
vectores virales, los retrovirus no proporcionan un suministro
génico muy eficaz a las células dendríticas (Reeves et al.,
1996; Aicher et al., 1997), y en este caso, a menos que el
trabajo esté presentado por otros (Arthur et al., 1997), los
adenovirus solo proporcionan un suministro génico de baja
eficacia.
Se ha ensayado e informado previamente de que los
virus del herpes simple (HSV) pueden infectar eficazmente y
suministrar genes a células dendríticas (Coffin et al., 1998;
documento WO 00/08191). Los HSV tienen diversas ventajas sobre otros
sistemas de vectores para este propósito, en el sentido de que
pueden infectar eficazmente una amplia variedad de tipos de células
(incluyendo una muy difícil infectar con otros sistemas de vectores,
por ejemplo, Dilloo et al., 1997; Coffin et al.,
1998), es fácil de manipular y puede aceptar grandes inserciones de
ADN permitiendo la expresión de múltiples genes (revisado por Coffin
y Latchman, 1996). La liberación de múltiples antígenos a células
dendríticas ex vivo seguido de la reintroducción en el cuerpo
o de la administración directa de antígenos a células dendríticas
in vivo puede promocionar particularmente enfoques para que
tratamiento de algunos cánceres y enfermedades infecciosas.
El documento WO 00/08191 muestra que los virus
del herpes simple de tipo silvestre previenen el procesamiento de
antígenos que se produce en las células dendríticas infectadas y que
los virus del herpes que carecen tanto de genes funcionales UL43
como VHS o que contienen mutaciones que minimizan la expresión del
gen inmediatamente al principio pueden infectar de forma eficaz
células dendríticas sin evitar el procesamiento de antígenos que se
producen en las células infectadas.
Sorprendentemente ahora se ha descubierto que la
interrupción del gen que codifica la proteína hospedadora de cierre
del virión (vhs) en vectores HSV permite que la activación eficaz de
células dendríticas se produzca en células infectadas con HSV. No es
necesaria la alteración del gen UL43. Previamente se ha demostrado
que las células dendríticas infectadas con HSV normalmente no se
vuelven a activar por la propia infección o por otros estímulos
(Salio et al 1999, Kruse et al 2000)
Se ha identificado una función que se desconocía
previamente de la proteína vhs en la prevención de la activación de
células dendríticas. La activación de células dendríticas se define
como la regulación positiva de ciertos marcadores de la superficie
celular en comparación con el estado no activado. Estos marcadores
incluyen CD83 y CD86. La activación de células dendríticas puede
estimularse mediante el tratamiento con lipopolisacáridos (LPS). El
tratamiento con LPS de células dendríticas infectadas con HSV no da
lugar a una regulación positiva de CD83 O CD86. Se ha demostrado que
el tratamiento con LPS de células dendríticas infectadas con un HSV
mutante en donde vhs no está activado pero tiene un gen UL43
funcional que regula positivamente tanto CD83 como CD86. No se
observa regulación positiva de CD83 y CD86 siguiendo el tratamiento
con LPS de células dendríticas infectadas con virus que comprenden
un gen vhs funcional. De esta forma, los resultados indican que,
para células dendríticas transducidas para estimular al máximo una
respuesta inmune después de la infección con herpes virus, el gen
que codifica vhs debe alterarse, aunque no es necesario alterar el
gen que codifica UL43.
Los resultados también demuestran un papel para
las vhs en la patogénesis de los virus del herpes simple de tipo
silvestre. Los HSV infectan células dendríticas con una alta
eficacia y es probable que la razón por la que hacen esto haya
evolucionado como parte de su ciclo de vida natural porque minimiza
una respuesta inmune mediada por células que de otra forma
prevendría una infección por HSH latente establecida eficazmente o
como consecuencia de la clarificación del virus durante ciclos
repetidos de latencia y de reactivación. La activación de células
dendríticas es importante en la estimulación de una respuesta inmune
mediada por células eficaces. Vhs es una proteína del virión y por
tanto, mientras que los genes de HSV generalmente no se expresan a
altos niveles en células dendríticas, la proteína vhs se
suministraría a la célula dendrítica junto con el virus que empieza
a aparecer. De esta forma la nueva función de vhs en la prevención
de la activación de células dendríticas infectadas con HSV
probablemente sea una función importante de vhs en el ciclo de vida
de HSV después de la infección de un ser humano con HSV.
Por consiguiente, la presente invención
proporciona el uso de herpes virus atenuado que:
(i) carece de un gen vhs funcional, o un
equivalente funcional del mismo; y
(ii) comprende un gen UL43 funcional, o
equivalente funcional del mismo;
en la fabricación de un medicamento para uso en
un método para estimular una respuesta inmune, comprendiendo el
método infectar células dendríticas con dicho virus. Probablemente,
dicho virus es un virus de herpes simple humano. Más preferiblemente
dicho virus es HSV1 o HSV2. Las células dendríticas pueden
infectarse in vitro o in vivo.
El virus puede contener una o más mutaciones a
adicionales. Las mutaciones adicionales minimizan preferiblemente la
toxicidad del virus. Típicamente, tales mutaciones dan lugar a una
reducción o minimización de la expresión génica temprana e inmediata
(IE). La prevención o reducción de la expresión génica IE previene o
reduce la replicación del virus. Tales mutaciones incluyen, por
ejemplo, inactivación de mutaciones en genes que codifican ICP4,
ICP27, ICP0 y/o ICP22, preferiblemente ICP27 y/o ICO4. También puede
incluirse una mutación de inactivación en el gen que codifica vmw65
retirando su función de tras la activación (por ejemplo mutaciones
wmw65 como en Ace et al., 1989 Smiley et al 1997).
Preferiblemente, las mutaciones adicionales también pueden minimizar
la actividad inhibidora de la respuesta inmune del virus. Tales
mutaciones incluyen la inactivación del gen que codifica ICP47.
La figura uno muestra las cepas virales
1764/27-/4, 1764/27-/4-/pR20.5/vhs,
1764/27-/4-/pR20.5/vhs/HBS-Ag y la cepa HSV de tipo
silvestre 17+.
La figura 2 muestra los resultados de los
análisis FACS para determinar los niveles de expresión en la
superficie celular de CD40, CD80, CD83 Y CD86 en células infectadas
de manera simulada no estimuladas (figura 2A) y estimuladas con el
LPS (figura 2B) y células infectadas con cepas virales
17^{+},1764/27-/4 y 1764/27-/4-/pR20.5/vhs.
La figura 3 muestra los resultados del análisis
ELISA para determinar el efecto de la infección viral en la
secreción de IL-6 y TNF\alpha a partir de células
dendríticas no infectadas y de células dendríticas infectadas con
cepas virales 17^{+}, 1764/27-/4- y 1764/27-/4/pR20.5/vhs.
La figura 4 muestra las repuestas proliferativas
de células T preparadas a partir de individuos vacunados y no
vacunados de la hepatitis B en respuesta a HBS-Ag.
Las células dendríticas tomadas de cada individuo no se trataron, se
mezclaron con la proteína HBS-Ag recombinante
(HBSAg*), infectadas con el vector de control
(1740/27-/4-/pR20.5/vhs/HBS-Ag) o infectadas con el
vector que expresa HBS.Ag
(1764/27-/4-/pR20.5/vhs/HBS-Ag) antes de la mezcla
con las células T.
Un virus de la invención es capaz de infectar
células dendríticas sin evitar que se activen las células
dendríticas infectadas. Preferiblemente, las células dendríticas
infectadas con un virus de la invención en una multiplicidad de
infección (MOI) de 1 pueden activarse mediante el tratamiento con
LPS o mediante otros estímulos de activación.
Un virus de la invención no evita la activación
de células dendríticas. Para determinar cuando un virus permite que
se produzca la activación de células dendríticas, las células
dendríticas se infectan con el virus a un MOI=1 y las células
dendríticas infectadas se tratan con LPS. Los niveles de marcadores
de superficie celular tales como CD83 y/o CD86 que se regulan
positivamente en la activación de células dendríticas pueden
controlarse para determinar la activación de células dendríticas,
por ejemplo mediante el análisis FACS. El nivel de estos marcadores
en la superficie celular será significativamente más alto en células
dendríticas tratadas con LPS que en células que no se han tratado
con LPS si el virus con el que las células están infectadas permite
que se produzca la activación de células dendríticas. Algunos de
estos marcadores o todos también serán superiores en las células
dendríticas que se han infectado con un virus que permite que se
produzca la activación de las células dendríticas en comparación con
células dendríticas no infectadas. Si un virus del herpes simple que
no contiene una mutación de inactivación en VHS se usa para infectar
células dendríticas, se observa significativamente menos regulación
positiva de estos marcadores.
Para permitir que se produzca la activación de
células dendríticas infectadas, un virus de la invención carecerá de
un gen funcional que codifica vhs (en HSV) u homólogos o
equivalentes funcionales del mismo en otras especies virales.
Además, un virus de la invención tendrá un gen UL43 funcional. Las
mutaciones adicionales pueden realizarse para reducir los efectos
inhibidores de la respuesta inmune del virus, por ejemplo, mediante
la inclusión de una mutación en el gen que codifica ICP47.
Un virus atenuado de la invención puede infectar
preferiblemente células dendríticas de forma que se produce una
toxicidad mínima. Preferiblemente la supervivencia celular después
de la infección será de la menos el 50% un día después de la
infección, más preferiblemente la menos el 60, 70, 80 o 90% un día
después de la infección. Para conseguir una menor toxicidad puede
incluirse una o más mutaciones que reduzcan las reproducciones
virales en un virus de la invención. Por ejemplo, puede incluirse
una mutación en el gen que codifica VMW 65 la célula minimiza la
actividad de tras-activación de la proteína y/o una
mutación en una o más genes de regulación inmediata tales como ICP4,
ICP27, ICP0 e ICP22. De esta forma, típicamente un virus de la
invención puede carecer de genes vhs, ICP27, ICP4 funcionales y
comprenden un gen VMW65 que codifique una proteína que no muestra
actividad de activación transcripcional, o puede carecer típicamente
de genes vhs ICP47 e ICP4 funcionales.
Para uso directo in vivo, típicamente
puede ser beneficioso un cierto grado de replicación en la
estimulación de respuestas inmunes inducidas. De esta forma, en
estos casos, un virus de la invención carece preferiblemente del gen
vhs funcional y puede también carecer de uno o más genes funcionales
que son necesarios para la patogenicidad completa del virus pero que
no son necesarios para la replicación viral. Tales genes incluyen
los que codifican ICP34.5, ICP6, timidina quinasa y glicoproteínas
tales como gH. Preferiblemente, sin embargo, el gen que codifica la
timidina quinasa es funcional ya que la mutación de este gen haría
que el virus fuera insensible a gentes anti-virales
tales como aciclovir.
Aunque la presente invención se ha ilustrado
usando los virus del herpes simple, se entenderá que pueden
modificarse otros virus de la familia herpesviridae para
reducir la prevención de la activación de células dendríticas de
células dendríticas infectadas. En partículas, tales virus pueden
incluir virus de la varicela-zóster, virus
pseudos-rabias o virus del herpes bovino.
Cuando el virus de la invención es un virus del
herpes simple, el virus puede derivarse de, por ejemplo, cepas HSV1
o HSV2, o derivados de las mismas, preferiblemente HSV1. Los
derivados incluyen recombinantes inter-tipo que
contienen ADN de las cepas HSV1 y HSV2. Tales recombinantes
inter-tipo se describen en la técnica, por ejemplo
en Thompson et al (1988) y Meignier et al (1988). Los
derivados preferiblemente tiene al menos una homología secuencial
del 70% para los genomas HSV1 o HSV2, más preferiblemente de al
menos el 80%, incluso más preferiblemente de al menos el 90 o 95%,
típicamente medido mediante los métodos descritos en este documento.
Más preferiblemente, un derivado tiene al menos una identidad
secuencial del 70% para el genoma HSV1 o HSV2, más preferiblemente
de al menos una identidad del 80%, incluso más preferiblemente al
menos una identidad del 90%, 95% o 98%.
Un derivado puede tener la secuencia de un genoma
HSV1 o HSV2 modificada por sustituciones nucleotídicas, por ejemplo
de 1, 2 o 3 a 10, 25, 50 o 100 sustituciones. El genoma HSV1 o HSV2
puede modificarse alternativa o adicionalmente mediante una o más
inserciones y/o deleciones o mediante una extensión en uno o en
ambos extremos.
Los derivados que pueden usarse para obtener los
virus de la presente invención incluyen cepas que ya tienen
mutaciones en genes que se desea para inactivar funcionalmente en un
virus de la invención, por ejemplo, cepas inactivadas de vhs (como
en Jones et al. 1995), cepas inactivadas de ICP 47 (como en
Goldsmith et al. 1998) , cepa d120 que tiene una deleción en
ICP4 (DeLuca et al., 1985) , cepa d27-1 (Rice
y Knipe, 1990) que tiene una deleción en ICP27) o cepa d92 que tiene
deleciones tanto en ICP27 como en ICP4 (Samaniego et al.,
1995). El uso de esta cepa reducirá el número de etapas requeridas
para producir las cepas de HSV mutantes de la presente
invención.
La terminología usada en la descripción de los
diversos genes HSV se encuentra en Coffin y Latchman, 1996.
Cuando los homólogos génicos de los genes HSV
descritos anteriormente existen en otras especies del herpes virus,
entonces estos homólogos se modificarán. Por un "homólogo" se
entiende un gen que es funcionalmente equivalente a un gen HSV, un
homólogo normalmente muestra homología secuencial, homología de
secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos, para el correspondiente
gen HSV. Típicamente, un homólogo de un gen HSV será de al menos un
15%, preferiblemente de al menos un 20%, más preferiblemente de al
menos un 30%, 40%, 50% idéntico al aminoácido con respecto al gen
correspondiente de HSV.
El gen que codifica vhs es el gen UL41 en HSV1 y
HSV2. En la cepa HSV1 17+ (Nº de acceso de EMBL HE1CG), el gen UL41
es del nucleótido 91.170 al nucleótido 92.637. En la cepa HSV2 HG52
(Nº de acceso EMBL z86099) el gen UL41 es del nucleótido 91.800 al
nucleótido 93.275.
En la técnica se conocen bien métodos para medir
la homología del ácido nucleico y de las proteínas. Por ejemplo, el
envase UWGCG proporciona el programa BESTFIT que puede usarse para
calcular la homología (por ejemplo cuando se usa en su ajuste
inexacto) (Devereux et al., (1984) Nucleic Acids Research
12, p387-395). Los algoritmos (PILEUP y
BLAST pueden usarse para calcular la homología o las secuencias
lineales (típicamente en sus ajustes inexactos), por ejemplo como se
describe en Altschul (1993) J. Mol. Evol.
36:290-300; Altschul et al. (1990) J.
Mol. Biol. 215:403-10.
El software para realizar los análisis BLAST está
disponible para todo el público a través del Centro Nacional de
Información de Biotecnología (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este
algoritmo implica primero identificar el par de secuencia de alta
puntuación (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la
secuencia cuestionada que se ajusta o satisface el valor umbral T
valorado positivamente cuando se alinea con una palabra de la misma
longitud en una secuencia de la base de datos. T se refiere al valor
umbral de la palabra más cercana (Altschul et al., 1990).
Estos aciertos de la palabra más cercana iniciales actúan como base
para iniciar búsquedas para encontrar HSP que los contenga. Los
aciertos de palabra se amplían en ambas direcciones a lo largo de
cada secuencia hasta que el valor del alineamiento acumulativo
aumenta. Las extensiones para los aciertos de las palabras en cada
dirección se detienen cuando: el valor del alineamiento acumulativo
empeora mediante la cantidad X de su valor máximo conseguido; el
valor acumulativo llega a cero o por debajo de este valor, debido a
la acumulación de una o más alineaciones valoradas negativamente; o
se alcanza el final de la secuencia. Los parámetros del algoritmo
BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad del
alineamiento. El programa BLAST usa como valores por defecto una
longitud de palabra (W) de 11, la matriz valorada en BLOSUM62 (véase
Henikoff y Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados
Unidos 89: 10915-10919) alineamientos (B) de
50, expectativas (E) de 10, M = 5, N = 4 y una comparación de ambas
cadenas.
El algoritmo BLAST realiza un análisis
estadístico de la similitud entre dos secuencias; véase por ejemplo,
Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados
Unidos 90: 5873-5787. Una medición de
similitud proporcionaba por el algoritmo BLAST es la probabilidad de
la suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de
la probabilidad mediante la cual puede producirse un acierto entre
dos secuencias nucleotídicas o de aminoácido. Por ejemplo, una
secuencia se considera similar a otra secuencia si la probabilidad
de la suma más pequeña en comparación con la primera secuencia y la
segunda secuencia es inferior a aproximadamente 1, preferiblemente
inferior a aproximadamente 0,1, más preferiblemente inferior a
aproximadamente 0,01, y más preferiblemente inferior a
aproximadamente 0,001.
Las homologías de los genes HSV pueden
identificarse de diversas formas, por ejemplo mediante sondas de
bibliotecas de ADNc o genómicas realizadas por otros virus con
sondas que comprenden todos o parte del gen HSV en condiciones de
medio de alta severidad (por ejemplo cloruro sódico 0,03 M y citrato
sódico 0,03 M de aproximadamente 50ºC a aproximadamente 60ºC). Como
alternativa, las homologías de especies también pueden obtenerse
usando PCR degenerado que usará cebadores designados a secuencias
diana en las variante y homólogos que codifican secuencias de
aminoácidos conservadas. Los cebadores contendrán una o más
posiciones degeneradas y se usarán en condiciones de dificultad
inferiores a las usadas para la secuencias de clonación con
cebadores de secuencia única contra secuencias conocidas (por
ejemplo cloruro sódico 0,03 M y citrato sódico 0,03 M a
aproximadamente
40ºC).
40ºC).
Un homólogo en un herpes virus es un equivalente
funcional de una proteína HSV si comparte una o más características
funcionales con la proteína de HSV. Por ejemplo, una proteína vhs
desempeña un papel en la reducción de los niveles de expresión
proteicos en una célula infectada reduciendo la estabilidad del
ARNm. Por lo tanto un equivalente funcional de la proteína vhs
desempeña preferiblemente un papel en el cierre de la expresión
génica hospedador-célula reduciendo la estabilidad
del ARNm. Más preferiblemente, un equivalente funcional de vhs
previene la activación de células dendríticas en respuesta a
estímulos que activan células dendríticas no infectadas.
Por razones de seguridad, los virus de la
invención se atenúan típicamente de forma que no puedan provocar
enfermedades. La regiones virales alteradas para los propósitos de
atenuación pueden eliminarse (completa o parcialmente) pueden
hacerse no funcionales, o pueden sustituirse por otras secuencias,
en particular mediante una secuencia de gen heterólogo. Se han
descrito mutaciones atenuantes para todos los grupos virales usados
como vectores virales. Por ejemplo, HSV puede volverse a virulento
mediante mutaciones en ICP34.5 y/o genes esenciales tales como ICP4,
ICP27 y/o el propio gen vhs.
Los virus atenuados particularmente preferidos
incluyen virus que, además de carecer de un gen funcional que
codifique vhs y de carecer opcionalmente un gen ICP47 funcional,
carecen de un gen ICP34.5 funcional y de un gen ICP27 funcional y
opcionalmente carecen un gen ICP funcional y/o de un gen VMW65 que
codifica una proteína que tiene actividad de activación
transcripcional, y virus que tienen un gen ICP27 funcional pero que
carecen de un gen ICP4 funcional y de un gen ICP34.5 funcional y
carecen opcionalmente de un gen VMW65 que codifica una proteína que
tiene actividad de activación transcripcional. Tales virus se
describen en los documentos WO98/04726 y WO99/60145, cuyas
descripciones se incorporan en este documento como referencia.
Cuando el virus del herpes simple de la invención
carece de un gen esencial funcional particular, por ejemplo un gen
que codifica ICP4 o ICP27, el virus se propaga usando una línea
celular que expresa ese gen esencial. Por ejemplo, cuando el virus
carece de un gen ICP27 funcional, el virus puede propagarse usando
células V27 (Rice y Knipe, 1990), 2-2 células (Smith
et al., 1992) o células B130/2 (documento WO98/30707),
preferiblemente células B130/2. Cuando el virus carece de un gen
ICP4 funcional, el virus puede propagarse usando una línea celular
que expresa ICP4, por ejemplo células E5 (DeLuca et al.,
1985). Cuando el virus carece de un gen ICP4 funcional y de un gen
ICP27 funcional, el virus se propaga usando una línea celular que
expresa tanto ICP4 como ICP27 (tales como células E26; Samaniego
et al., 1995), y cuando el virus carece adicionalmente de un
gen vmw65 funcional, el virus puede propagarse usando una línea
celular que también contiene un homólogo de no HSV de vmw65 (por
ejemplo, gen del herpes virus equino 12 o BTIF del herpes virus
bovino).
Los diversos genes virales a los que se hace
referencia pueden volverse funcionalmente inactivos mediante
diversas técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, pueden
volverse funcionalmente inactivos mediante deleción o deleciones,
sustitución o sustituciones o inserción o inserciones,
preferiblemente mediante deleción. Una deleción puede retirar
porciones de un gen o el gen entero. Por ejemplo, puede realizarse
la deleción de un solo nucleótido, dando lugar a un cambio de
estructura. Sin embargo, las deleciones preferiblemente mayores se
realizan, por ejemplo, de 2, 3 ó 5 a 10, 20, 30, 50, 100 ó 200
sustituciones nucleotídicas. Preferiblemente, al menos un 25%, más
preferiblemente al menos un 50% del total de la secuencia codificada
y no codificada (o como alternativa, en términos generales, al menos
10 nucleótidos, más preferiblemente al menos 100 nucleótidos, aún
más preferiblemente al menos 1000 nucleótidos), se suprime o
sustituyen. Se prefiere particularmente retirar todo el gen y parte
de las secuencias flanqueantes. Las secuencias insertadas pueden
incluir los genes heterólogos descritos más adelante. Las mutaciones
pueden contener tanto deleción o deleciones como inserción o
inserciones. Por ejemplo, una inserción puede realizarse en el sitio
de una deleción. De esta forma, la inserción de un gen heterólogo en
un gen viral puede reemplazar parte o todo el gen viral. En
particular, se prefiere insertar el gen heterólogo en vhs, ICP47,
ICP27 o ICP4. En el caso del gen VMW65, no se suprime todo el gen ya
que este codifica una proteína estructural esencial, pero se realiza
típicamente una mutación de inactivación que suprime la capacidad de
VMW65 para activar transcripcionalmente genes IE (por ejemplo, como
en Ace et al., 1989 o Smiley et al., 1997).
Las mutaciones pueden realizarse en los virus del
herpes mediante métodos de recombinación homóloga bien conocidos
para los especialistas en la técnica. Por ejemplo, el ADN genómico
de HSV se transfecta conjuntamente con un vector preferiblemente un
vector plasmídico, que comprende la secuencia mutada flanqueada por
secuencias de HSV homólogas. La secuencia mutada puede comprender
deleciones, inserciones o sustituciones, las cuales pueden
construirse mediante técnicas comunes. Las inserciones pueden
incluir genes marcadores seleccionables, por ejemplo la Z o GFP,
para la selección de virus recombinantes mediante, por ejemplo,
actividad \beta-galactosidasa o de
fluorescencia.
Los virus de la invención pueden modificarse para
llevar gen/genes heterólogos. La expresión "gen heterólogo"
abarca cualquier gen. Aunque gen heterólogo típicamente es un gen
que no está presente en el genoma de un herpes virus, puede usarse
un gen de herpes con la condición de que la secuencia codificante no
se una de forma operativa a las secuencias de control viral con las
que normalmente se asocian. El gen heterólogo puede ser cualquier
variante alélica de un gen de tipo silvestre o puede ser un gen
mutante. El término "gen" pretende abarcar secuencias de ácidos
nucleicos que puedan al menos transcribirse para producir una
molécula de ARN, la cual preferiblemente puede traducirse para
producir un polipéptido o para regular negativamente los niveles de
expresión génica mediante un efecto de antisentido. Un virus de la
invención puede incluir opcionalmente algunas o todas las secuencias
flaqueantes transcritas pero no traducidas 5' y/o 3', o de otra
forma asociadas con la secuencia codificante traducida de un gen
heterólogo. Además pueden incluir opcionalmente la secuencia de
control transcripcional asociadas que normalmente se asocian con las
secuencias transcritas, por ejemplo señales de interrupción
transcripcional, sitios de poliadenilación y elementos que mejoran
cadena abajo.
El gen/genes heterólogos pueden insertarse en el
genoma viral mediante recombinación homóloga de cepas HSV con, por
ejemplo, vectores plasmídicos que llevan el gen/genes heterólogos
flanqueados mediante secuencias de HSV. El gen/genes heterólogos
pueden introducirse en un vector plasmídico adecuado que comprende
secuencias virales del herpes usando técnicas de clonación bien
conocidas en la técnica. El gen/genes heterólogos puede o pueden
insertarse en el genoma viral en cualquier sitio con la condición de
que el virus pueda continuar propagándose. Se prefiere que el
gen/genes heterólogos se inserte o inserten en un gen que da lugar a
la atenuación del virus. Los genes heterólogos pueden insertarse en
múltiples sitios sin el genoma del virus.
La secuencia transcrita del gen/genes heterólogos
se une preferiblemente de forma operativa a una secuencia de control
que permite la expresión del gen/genes heterólogos en células
dendríticas, preferiblemente células dendríticas en mamíferos, más
preferiblemente células dendríticas de ser humano. La expresión
"unida de forma operativa" se refiere a una yuxtaposición donde
los componentes descritos están en una relación que les permite
funcionar en la manera en que se pretende. Una secuencia de control
"unida de forma operativa" a una secuencia codificante se une
de tal forma que la expresión de la secuencia codificante se
consigue en condiciones compatibles con la secuencia de control.
La secuencia de control comprende un promotor que
permite la expresión del gen/genes heterólogos y una señal para la
finalización de la transcripción. El promotor se selecciona entre
promotores que son funcionales en células dendríticas de mamífero
preferiblemente de ser humano. El promotor/promotores puede o pueden
derivarse de las secuencias promotoras de genes eucarióticos. Por
ejemplo, los promotores pueden derivarse del genoma de una célula en
la que se puede producir la expresión del gen heterólogo,
preferiblemente en una célula dendrítica de mamífero o más
preferiblemente en una célula dendrítica de ser humano. Con respecto
a promotores eucarióticos, pueden ser promotores que funcionen de
una forma ubicua (tales como promotores de
\beta-actina, tubulina) o, como alternativa, de
una forma específica de la célula dendrítica. Pueden usarse
promotores virales, por ejemplo el promotor de repetición terminal
largo del virus murino de la leucemia Moloney o los otros promotores
retrovirales, los promotores IE citomegalovirus humanos o de ratón
(CMV).
Pueden obtenerse módulos de expresión y otras
construcciones adecuadas que comprenden el gen/genes heterólogos y
secuencias de control usando técnicas de clonación rutinaria
conocidas para las personas especialistas en la técnica (véase, por
ejemplo, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning - a
laboratory manual; Cold Spring Harbor Press).
Además, cualquiera de estos promotores puede
modificarse por la adición de secuencias reguladoras adicionales,
por ejemplo, secuencias potenciadoras (incluyendo elementos de la
región LAT de HSV). También pueden usarse promotores quiméricos que
comprenden elementos de secuencia de dos o más promotores diferentes
descritos anteriormente, por ejemplo, un promotor de fusión LTR/LAT
de MMLV (Lokensgard et al., 1994) o promotores que comprenden
elementos de la región LAT (documento WO98/30707).
Los genes heterólogos típicamente codificarán
polipéptidos de uso terapéutico. Por ejemplo, para promover una
respuesta inmune específicamente contra un tumor particular, será
deseable transfectar células dendríticas con un virus de la
invención que dirija la expresión de un antígeno/antígenos
tumorales. Un antígeno tumoral puede ser específico para una célula
tumoral, es decir, está presente en células tumorales pero no en
células no tumorales, o puede estar presente a mayores niveles en
esa célula tumoral que en una célula no tumoral de ese tipo, por
ejemplo, debido a una regulación positiva de la expresión del
antígeno. Esto será útil en la terapia para el cáncer, ya que una
célula dendrítica infectada de la invención puede usarse para
estimular el sistema inmune del hospedador para reaccionar con
el/los antígeno/antígenos específicos de tumor o dominantes en un
tumor dando como resultado una reducción/regresión del tumor. En
particular, se prefiere que el antígeno/antígenos tumorales se
exprese en la superficie de la célula tumoral, por ejemplo, un
receptor de la superficie celular o una proteína de adhesión
celular. Los ejemplos de antígenos tumorales incluyen el producto
génico MUC-1 (Gendler et al., 1990), que se
sobre expresa en varios tumores incluyendo cánceres de ovario,
proteínas de papiloma virus humanos E6 y E7 que están asociadas con
cáncer cervical, MaRT-I, MAGE-I, gp
100 y tirosina en melanoma, PSA en cáncer de próstata, CEA en varios
tipos diferentes de tumores y Her2neu en diversos cánceres
incluyendo el cáncer de mama.
Los genes heterólogos también puede codificar un
polipéptido que es capaz de modificar una respuesta inmune, por
ejemplo, citoquinas, (tales como interferón \alpha, \beta o
\gamma, interleuquinas incluyendo IL-1,
IL-2, factor de necrosis tumoral, o factores de
crecimiento semejantes a insulina I o II) u otras proteínas
inmunomoduladoras incluyendo quimioquinas tales como RANTES y
moléculas co-estimuladores tales como CD89, Cd86,
CD40 y ligando de
CD40.
CD40.
El gen heterólogo también puede codificar un
polipéptido/polipéptidos de origen patógeno de forma que, por
ejemplo, una célula dendrítica infectada con un virus de la
invención puede usarse para estimular el sistema inmune del
hospedador para producir una respuesta inmune contra un patógeno,
antes de la infección o después de la invención del hospedador por
el patógeno. Los virus para uso en vacunas típicamente comprenden
genes heterólogos que codifican polipéptidos antigénicos.
Preferiblemente, tales polipéptidos de origen patógeno proceden de
organismos patógenos, por ejemplo, parásitos, bacterias o virus. Los
ejemplos de tales polipéptidos antigénicos incluyen antígenos del
virus de la hepatitis C, antígenos nucleares o superficiales de la
hepatitis B, antígenos de papiloma virus, antígenos de VIH y
antígenos de malaria. Pueden usarse virus que comprendan genes
heterólogos de organismos patógenos para tratamiento terapéutico o
profiláctico o para ambos tratamientos.
Las aplicaciones terapéuticas pueden requerir la
administración de múltiples genes. La expresión de múltiples genes
puede ventajosa para el tratamiento de una diversidad de afecciones.
Los virus del herpes son especialmente apropiados ya que no tienen
las capacidades de empaquetamiento limitadas de otros sistemas
vectores virales. De esta manera, pueden acomodarse dentro de su
genoma múltiples genes heterólogos. Por ejemplo, pueden insertarse
en el genoma de 2 a 6 genes.
Por ejemplo, hay al menos dos formas en las que
podrían conseguirse esto. Por ejemplo, más de un gen heterólogo y
secuencias de control asociadas podría introducirse en una cepa de
HSV particular en un solo sitio o en múltiples sitios en el genoma
del virus. También sería posible usar pares de promotores
(promotores iguales o diferentes) mirando en orientaciones opuestas
entre sí, dirigiendo cada uno de estos promotores la expresión de un
gen heterólogo (el mismo gen heterólogo o un gen heterólogo
diferente) que se ha descrito anteriormente).
Pueden aislarse/prepararse células dendríticas
por varios medios, por ejemplo, pueden purificarse directamente a
partir de sangre periférica, o generarse a partir de células
precursoras CD34+, por ejemplo, después de la movilización en sangre
periférica por tratamiento con GM-CSF o directamente
a partir de médula ósea. Para la obtención a partir de sangre
periférica, pueden tratarse precursores adherentes con una mezcla de
GM-CSF/IL-4 (Inaba et al.,
1992), o para la obtención a partir de médula ósea pueden tratarse
células CD34+ no adherentes con GM-CSF y
TNF-\alpha (Caux et al., 1992). Pueden
prepararse rutinariamente DC a partir de la sangre periférica de
voluntarios humanos, de forma similar al método de Sallusto y
Lanzavecchia, 1994, usando mononeucleocitos de sangre periférica
purificados (PBMC) y tratando durante 2 horas las células adherentes
con GM-CSF e IL-4. Estos después se
retiran de las células B CD19+ y de las células T CD3+, CD2+ usando
perlas magnéticas (véase Coffin et al., 1998). Para la
preparación de células dendríticas también pueden usarse otros
métodos.
Pueden usarse métodos de terapia virus de la
invención y células dendríticas infectadas con virus de la
invención. En particular, pueden usarse virus de la invención, y
células dendríticas infectadas con virus de la invención, que
expresan antígenos tumorales, en métodos para tratar el cáncer.
Específicamente, los virus de la invención y las células dendríticas
infectadas con virus de la invención pueden usarse para inhibir el
crecimiento de diversos tumores en mamíferos, incluyendo seres
humanos, tales como, por ejemplo, tumores y carcinomas de ovario,
cervicales endometriales, por ejemplo, carcinoma de mamífero,
carcinoma de pulmón, carcinoma de vejiga y carcinoma de colón. Otros
neoplasmas cuyo crecimiento puede inhibirse incluyen sarcomas, por
ejemplo, sarcomas de tejido blando y de hueso, y malignidades
hematológicas tales como leucemias. Los ejemplos particulares de
cánceres que pueden tratarse usando virus de la invención y/o
células dendríticas infectadas con virus de la invención que
expresan antígenos tumorales incluyen melanomas, leucemias, cánceres
cervicales y cánceres de ovario. Un virus para uso en el tratamiento
del cáncer típicamente comprende un gen heterólogo que codifica un
antígeno tumoral. La administración de tal virus, o de células
dendríticas infectadas con tal virus, típicamente dará como
resultado la generación de una respuesta inmune contra el antígeno
tumoral. Los virus de la invención y las células dendríticas
infectadas con virus de la invención pueden usarse en métodos de
tratamiento o prevención de infecciones producidas por patógenos,
por ejemplo, infecciones parasitarias, bacterianas o virales. Un
virus para uso en el tratamiento de una infección producida por
patógenos típicamente comprende un gen heterólogo que codifica un
antígeno del organismo patógeno. La administración de tal virus o de
células dendríticas infectadas con tal virus, típicamente dará como
resultado la generación de una respuesta inmune contra un antígeno
del organismo patógeno. Tales infecciones virales incluyen
infecciones por un herpes virus. De esta manera, puede usarse un
virus de la invención para inducir respuestas inmunes contra el
propio virus, por ejemplo, en el tratamiento o vacunación de la
infección producida por HSV1 o HSV2. Cuando un virus se pretende
usar en el tratamiento de HSV1 o HSV2, el virus puede contener
opcionalmente un gen heterólogo, codificando dicho gen heterólogo un
antígeno de HSV (que no esté bajo el control de su promotor natural)
o una molécula inmunomoduladora. Los virus/células dendríticas
pueden administrarse antes de la infección para estimular una
respuesta inmune protectora en el hospedador, o después de la
infección para estimular el sistema inmune del hospedador para
combatir la infección.
Los herpes virus de la presente invención de esta
manera pueden usarse para suministrar genes terapéuticos a un ser
humano o animal en necesidad de tratamiento. El suministro de genes
terapéuticos usando los herpes virus de la invención puede usarse
para tratar, por ejemplo, malignidades y/o infecciones
patógenas.
Los virus de la invención pueden usarse en un
paciente, preferiblemente un paciente humano, en necesidad de
tratamiento. Una paciente en necesidad de tratamiento es un
individuo que padece cáncer, o un paciente con una infección
patogénica. El objetivo del tratamiento terapéutico es mejorar el
estado de un paciente. Típicamente, el tratamiento terapéutico
usando un virus de la invención alivia los síntomas del cáncer. Un
método de tratamiento de cáncer de acuerdo con la invención
comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un
virus que tiene un gen UL43 funcional y que carece de un gen vhs
funcional en un paciente que padece cáncer, de tal forma que el
virus esté presente en células dendríticas del paciente. La
administración del virus de la invención a un individuo que padece
un tumor típicamente destruirá las células del tumor reduciendo de
esta manera el tamaño del tumor y/o previniendo la extensión de
células malignas del tumor.
El tratamiento típicamente terapéutico de una
infección producida por patógenos usando un virus de la invención
alivia los síntomas de la infección y preferiblemente destruye al
organismo patógeno. Un método de tratamiento de una infección
producida por patógenos de acuerdo con la invención comprende
administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un virus que
carece de un gen VHS funcional a un paciente con una infección
producida por patógenos. Preferiblemente, el virus entra en las
células dendríticas en el paciente o al paciente se les administran
células dendríticas que se han infectado con el virus ex
vivo. El tratamiento profiláctico usando un virus de la
invención típicamente conduce a la producción de anticuerpos contra
un antígeno tumoral o contra un antígeno de un organismo patógeno en
un paciente con riesgo de cáncer o una infección patológica.
Típicamente, un paciente con riesgo de cáncer puede estar dispuesto
genéticamente al mismo o puede haberse expuesto o estar en riesgo de
exposición a un carcinógeno. Típicamente, es probable que un
paciente con riesgo de infección patógena pueda exponerse a un
organismo patógeno.
Un método para realizar una terapia implica
insertar el gen/genes terapéuticos en el genoma del virus del herpes
de la invención, como se ha descrito anteriormente, y después
combinar el virus recombinante resultante con un vehículo o
diluyente farmacéuticamente aceptable para producir una composición
farmacéutica. Los vehículos y diluyentes adecuados incluyen
soluciones isotónicas salinas, por ejemplo, solución salina
tamponada con fosfato. La composición puede formularse para
administración parenteral, ultramuscular, intravenosa,
intraperitoneal, subcutánea o transdérmica. Se prefiere la
administración subcutánea o intraperitoneal. Puede ser
particularmente preferida la administración trans- o
intradérmica.
La infección de células dendríticas con el virus
de la invención puede realizarse in vivo por medio de la
administración de una composición que comprende el virus a un
paciente. La composición farmacéutica se administra de tal forma que
el virus que contiene el gen/genes terapéuticos puede infectar a las
células dendríticas. La cantidad de virus administrado está en el
intervalo de 10^{4} a 10^{10} pfu, preferiblemente de 10^{5} a
10^{8}, o de 10^{5} a 10^{9} pfu, y más preferiblemente de
aproximadamente 10^{6} a 10^{8} pfu. Cuando se inyectan por vía
intradérmica o transdérmica, por ejemplo, usando un dispositivo sin
aguja, típicamente se administra de 10 \mul a 1 ml,
preferiblemente de 100 \mul a 1 ml de virus en un vehículo
farmacéuticamente o diluyente farmacéuticamente aceptable adecuado o
en una composición particulada.
Otro método implica aislar/preparar células
dendríticas a partir de sangre periférica o médula ósea e infectar
las células con el virus de la invención in vitro. Las
células dendríticas transducidas después típicamente se administran
al paciente por inyección intramuscular intraperitoneal subcutánea o
intravenosa, o por inyección directa en los ganglios linfáticos del
paciente, preferiblemente por inyección subcutánea, intraperitoneal
o directa en los ganglios linfáticos. Típicamente, se administran al
paciente de 10^{5} a 10^{9} células dendríticas transducidas,
preferiblemente de 10^{6}a 10^{8} células, y más preferiblemente
aproximadamente 10^{7} células.
Las vías de administración y las dosificaciones
descritas pretenden ser únicamente una guía, ya que el especialista
en la técnica podrá determinar fácilmente la vía de administración y
la dosificación óptimas para cualquier paciente particular. La
dosificación puede determinarse de acuerdo con diversos parámetros,
especialmente de acuerdo con, por ejemplo, la edad, el peso y el
estado del paciente.
Los siguientes Ejemplos ilustran la
invención.
Todas las cepas de virus proceden de la cepa de
HSV1 17+, cuya secuencia de nucleótidos se deposita en GenBank (Nº
de Acceso HE1CG). Se produjeron cepas virales y se propagaron usando
células BHK C-21 (ECACC Nº 8501143) o células BHK
transfectadas de forma estable con los genes que codifican ICP27 e
ICP4 de HSV1 y el gen 12 del virus del herpes equino (Thomas et
al., 1999).
En la caso de los virus con mutaciones en VMW65,
se incluyó hexametilen-bisacetamida (HMBA) 3 mM en
el medio usado para el crecimiento del virus (McFarlane et
al., 1992). Se usaron las siguientes cepas virales:
Un módulo del plásmido pR20.5 (Thomas et
al. 1999b) que constaba de una secuencia RSV/lacZ/pA y una
secuencia CMV/GFP/pa en orientaciones opuestas y separadas por una
secuencia de la región LAT de HSV (nucleótidos 118,
866-120.219) se insertó en el locus UL43 por
recombinación homóloga con ADN genómico de la cepa 17+ de HSV1
usando métodos convencionales. El módulo pR20.5 primero se insertó
en un plásmido que contenía regiones flanqueantes UL43 (Coffin et
al., 1996) en el único sitio NsiI, dando el plásmido pR20.5/43.
El módulo 20.5 puede escindirse de su esqueleto plasmídico pGEM5
(Promega) con SrfI como un oligonucleótido ya que en cualquier lado
del módulo se insertó un oligonucleótido que codificaba SrfI. El
promotor de RSV se escindió de pRc/RSV (Invitrogen), lacZ/pA de
pCH110 (Pharmacia), CMV/pA de pCDNA3 (Invitrogen) y GFP de
pEGFP-NI (Clontech) para la construcción del
plásmido pR20.5.
La cepa de virus 1764/27-/4- se construyó por
recombinación de ADN de la cepa de virus 1764/27-/4-/pR20.5 con
regiones flanqueante ICP4 vacías y la selección de placas de virus
que no expresan GPF o lacZ. La cepa de virus 1765/27-/4-/pR20.5 se
describe en Thomas et al., 1999b y contiene el módulo pR20.5
insertado en los genes ICP4 para reemplazar el gen que codifica ICP4
de un virus en el que también se han delecionado ICP27 e ICP34.5 y
con una mutación inactivadora en el gen que codifica VMW65.
La cepa de virus 1764/27-/4-/pR20,5/vhs se
construyó por inserción del módulo pR20.5 en regiones flanqueantes
vhs en el único sitio NruI en el gen codificante de vhs de
HSV1/cepa 17+ y el plásmido resultante (pR20.5/vhs) se recombinó en
el ADN de la cepa 1764/27-/4- de HSV. Por lo tanto, se delecionan
los genes que codifican ICP4, ICP27 e ICP34.5 de la cepa de virus
1764/27-/4-/pR20.5/vhs, y tiene mutaciones inactivadoras en los
genes que codifican vmw65 y vhs.
La cepa de virus 1764/27-/4-/pR19lacZ se
construyó como en el caso del virus (iv) anterior con la excepción
de que el módulo pR19lacZ (Wagstaff et al., 1998) se
recombinó en la región del transcrito asociado con latencia (LAT) de
una cepa de virus 1764/27-/4- en lugar de recombinarse el módulo
pR20.5 en vhs.
El gen lacZ del plásmido pR20.5/vhs se reemplazó
por el gen que codificaba el antígeno superficial de la hepatitis
(HBS-Ag) por digestión de pHBV130 (Gough y Murray,
1982) con XhoI y NsiI e inserción del fragmento liberado en pSP72
(Promega) entre los sitios SalI y SmaI. pR20.5/vhs se digirió con
XbaI y EcoRI para liberar el gen lacZ que se reemplazó por el gen
HBS-Ag escindido de pSP72 con HindIII y EcoRI. El
plásmido resultante se recombinó en ADN viral 1764/27-/4-/pR20.5/vhs
y se seleccionaron y purificaron las placas que no expresaban lacZ.
La estructura del genoma después se confirmo por transferencia de
Southern.
Se prepararon DC a partir de sangre periférica
como se ha descrito previamente (Coffin et al 1998). En
resumen, se prepararon células mononucleares de sangre periférica
(PBMC) a partir de 60 ml de sangre de donante sano/vacunado contra
la hepatitis B usando linfoprep (Nycomed). Después de retirar los
glóbulos rojos, se retiraron las células no adherentes
(principalmente células T y células B), se lavaron en HBSS y se
centrifugaron a 1400 rpm, durante 5 minutos a temperatura ambiente.
El sedimento celular se resuspendió en 2 ml de una mezcla de FCS al
90%: dimetilsulfóxido (DMSO) al 10%, se extrajeron alícuotas y se
almacenaron a -80ºC para el posterior aislamiento de las células T.
Las células adherentes se cultivaron en medio RPMI suplementado con
GM-CSF (0,1 \mug/ml) e IL-4 (0,05
\mug/ml) y se incubaron durante 7 días a 37ºC con un 5% de
CO_{2}. Después de una purificación adicional con linfoprep, las
células se redujeron magnéticamente usando anticuerpos
anti-CD19, anti-CD2 (Harlan) y
anti-CD3 (Harlan) y las DC se resuspendieron en
medio RPMI completo para el uso inmediato.
Células T y B congeladas como se ha indicado
anteriormente se descongelaron rápidamente, se lavaron en HBSS y se
centrifugaron a 1400 rpm durante 5 minutos. Las células se
resuspendieron en 2 ml de medio RPMI completo, se contaron y se
incubaron con mAb anti-CD19 (BU12 - 200 \mul puro,
departamento de Inmunología, UCL) anti-CD14 (HB246 -
200 \mul puro, departamento de Inmunología, UCL) y
anti-HLA-DR (L243- 100 \mul puro,
departamento de Inmunología, UCL) y se dejaron en hielo durante 30
minutos. Las células se lavaron en HBSS, se resuspendieron en 2 ml
de medio RPMI completo, se mezclaron con anticuerpos de oveja
anti-ratón unidos a perlas magnéticas (Dynabeads,
Dynal) en una relación de 10 \mul de perlas/10^{6} células
contaminantes y se incubaron en un mezclador de rotación a 4ºC
durante 45 minutos.
Las células T CD4+ después se redujeron retirando
el sobrenadante después de poner la mezcla de suspensión de
células/barras magnéticas en contacto con un imán, durante 10
minutos, en hielo. Las células T CD4+ se contaron, se resuspendieron
en medio RPMI completo a la concentración apropiada, se dejaron en
hielo o se cultivaron durante una noche a 37ºC, con un 5% de
CO_{2} para el uso posterior.
Se sedimentaron DC a 1400 rpm durante 5 minutos a
temperatura ambiente. Las DC después se infectaron a una MOI de 1
por resuspensión en medio RPMI que contenía virus durante 1 hora a
37ºC, con un 5% de CO_{2}. Después se añadió 1 ml de RPMI
suplementado con GM-CSF (0,1 \mug/ml) e
IL-4 (0,05 \mug/ml) y las DC se incubaron a 37ºC
con un 5% de CO_{2}. Para la estimulación con LPS, se usó RPMI que
también contenía 100 ng/ml de LPS.
En los sobrenadantes de cultivo de DC se midieron
IL-6 y TNF-\alpha usando kit ELISA
disponibles en el mercado (R&D Systems). Antes de la ELISA, los
sobrenadantes se recogieron 42 horas después de la infección de las
DC con los virus indicados y se almacenaron a -20ºC antes del
uso.
Se aislaron DC y células T CD4+ y se trataron
como se ha indicado anteriormente en los individuos humanos
vacunados contra la hepatitis B y no vacunados. Las DC se usaron a
diluciones de 1x10^{5} DC/ml a 1x10^{4} DC/ml y las células T
CD4+ a una dilución de 1x10^{6} células/ml. Los experimentos de
cada concentración de DC se realizaron por triplicado. Se añadieron
100 \mul de DC y 100 \mul de células T CD4+ a cada pocillo de
ensayo. Donde se indica, se añadió antígeno superficial de la
hepatitis B recombinante (Austral) a pocillos a una concentración
final de 1 \mug/pocillo. Las DC infectadas con
HSV-1 y no infectadas se cultivaron con las células
T CD4+ durante 6 días a 37ºC con un 5% de CO_{2}. Después se
añadió 1 \muCu/pocillo de [^{3}H] timidina (Amersham) y 18 horas
después las células se recogieron y se contó la incorporación de
[^{3}H] timidina.
Aquí, en cada caso se infectaron 1x10^{5}
células dendríticas con cada uno de los virus por sedimentación
suave, resuspensión en aproximadamente 100 \mul de suspensión de
virus en DMEM, incubación a 37ºC durante 1 hora y transferencia a
placas de 24 pocillos con 2 ml de RPMI/FCS al 10% + 100 ng/ml de
GM-CSF, y 50 ng/ml de IL-4.- Estas
placas después se incubaron a 37ºC con un 5% de CO_{2} durante una
noche. Las células dendríticas también se trataron con
lipopolisacárido (LPS), un activador conocido de las células
dendríticas, y se dejaron sin tratar como controles.
Los sobrenadantes de estas infecciones y del
control después se usaron en ensayos ELISA para detectar niveles de
citoquinas secretadas. También se usó separación de células
activadas con fluorescencia (FACS) para detectar los niveles de
expresión de CD86 en la superficie de células dendríticas infectadas
y de control. En los cultivos de células dendríticas hay dos
poblaciones de células con respecto a los niveles de expresión de
CD86. Esto se observan como dos picos por análisis de FACS,
reflejando un primer pico de células con un nivel relativamente
menor de expresión de CD86 y un segundo pico de células con un nivel
relativamente mayor de expresión de CD86. Tras la activación, por
ejemplo, por LPS, una mayor cantidad de las células expresan mayores
niveles de CD86 y, de esta manera, se encuentran más células en el
segundo pico.
Los resultados demuestran que las células
dendríticas no tratadas secretan niveles mínimos de las citoquinas
ensayadas y tienen los niveles de "reposo" esperados de CD86 en
su superficie. Después del tratamiento con LPS, los niveles de
citoquinas se estimulan significativamente y el nivel de la
expresión de CD86 en la superficie aumenta significativamente. En
los experimentos anteriores, la intensidad media de fluorescencia en
las células tratadas con LPS es de aproximadamente 1x10^{3} según
el análisis FACS con un anticuerpo anti-CD86. Estos
resultados indican que las células dendríticas están en un estado
activado.
Después de la infección de las células
dendríticas con los virus indicados, puede observarse claramente que
para que se produzca la activación de las células dendríticas por
estos ensayos, el virus debe contener una mutación de inactivación
en el gen que codifica vhs. Se han usado virus de niveles variables
de incapacitación, y sólo el virus que contiene la mutación vhs
proporciona una activación significativa de las células dendríticas
por estos ensayos. También puede verse que si la mutación en vhs no
se incluye cuando las células se tratan con LPS, así como cuando se
infectan con los virus indicados, los niveles de CD 86 no aumentan
en tantas células como ocurre por el tratamiento con LPS sólo.
Además, a menos que se incluya la mutación de vhs, la intensidad
media de fluorescencia de las células que expresan CD86 medida pos
SACS después de la infección por el virus se reduce desde la
observada cuando las células se tratan con LPS. De esta manera,
puede concluirse que para conseguir una estimulación inmune máxima
por células dendríticas, debe incluirse una o más mutaciones de
inactivación en el gen que codifica vhs.
Se usó separación de células activadas con
fluorescencia (FACS) para detectar los niveles de expresión de CD86,
CD80, CD83 y CD 40 en la superficie de células dendríticas
infectadas y de control. Se usaron sobrenadantes de las infecciones
para evaluar los niveles de citoquinas por ELISA.
Los resultados de ELISA (figura 3) demuestran que
aunque las DOCUMENTO pueden infectarse por HSV con una alta
eficacia, no se producen citoquinas indicativas de la activación de
la DC con un virus de tipo silvestre (cepa 17+) o con un virus
incapacitado (cepa 1764/27-/4-). Sin embargo, si se inactiva vhs de
la cepa 1764/27-/4-, dando la cepa 1764/27-/4-/pR20.5/vhs, se
producen citoquinas indicativas de la activación de DC. El análisis
FACS (figura2) de DC estimuladas sin LPS demuestra que la infección
con HSV de tipo esencialmente silvestre (cepa 17+) o un vector HSV
incompetente de replicación (cepa 1764/27-/4-) previene el aumento
de la expresión de CD86. Como se ha descrito anteriormente, se
esperaría una mayor expresión de CD86 si las DC se hubieran activado
por el proceso infección. Los niveles de CD40 también se
alteran/reducen en células infectadas con HSV. Sin embargo, si se
inactiva vhs (cepa 1764/27-/4-/pR20.5/vhs), los niveles CD86
aumentan indicando activación, y los niveles de CD40 no se ven
afectados. CD80 y CD83 no se ven afectados en gran medida en DC no
estimuladas infectadas con HSV. CD83 (B7.1) y CD86 (B7.2) son dos
moléculas coestimuladoras clave de células T, CD40 es un activador
clave de células T y CD83 es un marcador de DC regulado
positivamente durante la maduración y activación de las DC.
Cuando las DC se estimulan con LPS en el momento
de la infección los efectos sobre los niveles de CD40 son más
marcados tanto con el virus de tipo silvestre (cepa 17+) como con el
virus incapacitado (cepa 1764/27-/4-). Sin embargo, si se inactiva
vhs, se previenen estos efectos sobre CD40. Las DC estimuladas con
LPS normalmente regulan positivamente de una manera significativa la
expresión de CD83 y CD86, pero esto se bloquea por HSV (cepas 17+ y
1764/27-/4-) al menos que se inactive vhs (cepa
1764/27-/4-/pR20.5/vhs). Cuando se inactive vhs, tanto los niveles
de CD83 como los niveles de CD 86 aumentan en una medida similar o
mayor que en las células estimuladas con LPS pero no infectadas.
Como en los experimentos preliminares (Ejemplo
1), puede observarse claramente que para que las células dendríticas
se activen como se mide por los niveles de expresión de marcador
superficial en respuesta a la infección por HSV o la infección por
HSV y la estimulación por LPS, está claro que el gen que codifica
vhs debe inactivarse. Los virus que codifican vhs funcional no
permiten que las células dendríticas se activen significativamente,
como se mide por los niveles de expresión de los marcadores
superficiales ensayados.
Los resultados anteriores sugirieron que los
vectores de HSV en los que está inactivado vhs podrían usarse como
vectores eficaces para DC ya que se han prevenido los efectos
inactivadores de HSV en DC. De hecho, las DC infectadas con tales
mutantes de HSV parecen activarse específicamente en respuesta a la
infección como se mide por una regulación positiva de CD86 y la
secreción de ciertas citoquinas. Para ensayar si los mutantes de HSV
con vhs inactivado podrían usarse para dirigir respuestas inmunes
específicas de antígeno después de suministro de genes codificantes
de antígenos a DC, se realizaron experimentos usando DC y células T
preparadas a partir de individuos vacunados contra la hepatitis B y
no vacunados. En este caso, primero se construyó un virus en el que
se insertó un casete de expresión del antígeno superficial de la
hepatitis B (HBS-Ag) en el gen codificante de vhs
del virus con deficiencias en el gen IE. Después se realizaron
ensayos de proliferación celular en los que DC de individuos
vacunados o no vacunados se dejaron sin tratar, se "cargaron"
con antígeno mezclando con proteína HBS-Ag
recombinante, se infectaron con el vector que contenía gen marcador
de control (1764/27-/4-/pR20.5/vhs a MOI=1), se infectaron con el
vector de control (1764/27-/4-/pR20.5/vhs a MOI=1) y también se
mezclaron con HBS-Ag recombinante, o se infectaron
con el vector que expresaba HBS-Ag
(1764/27-/4-/pR20.5/vhs/HBS-Ag a MOI=1). Las DC
después se mezclaron con células T derivadas de los mismos
individuos vacunados o no vacunados respectivamente, y se observaron
los efectos sobre la proliferación de células T en ensayos de
proliferación de células T convencionales.
Estos experimentos demostraron (Fig.) que aunque
la proteína recombinante HBS-Ag y el vector HSV de
control podían inducir una pequeña respuesta proliferativa de
células T en individuos vacunados, indicando probablemente la
respuesta de HSV de la proliferación de células T específicas para
proteínas estructurales de HSV, y el vector de control mezclado con
HBS-Ag recombinante podía inducir una respuesta
ligeramente mayor, el vector que expresaba HBS-Ag
proporcionó una respuesta significativamente mayor que cualquiera de
las indicadas anteriormente. De esta manera, después de la
administración de HBS-Ag directamente en DC usando
un vector de HSV, se indujo una respuesta proliferativa de células T
significativa y específica que no se produjo después de la mezcla
con el antígeno recombinante solo. De esta manera, los vectores de
HSV con vhs inactivado permiten el suministro de genes codificantes
de antígeno a DC de tal forma que las DC retienen la capacidad de
estimular respuestas proliferativas de células T específicas de
antígeno.
- -
- Gendler, S.J. et al., (1990), J.Biol. Chem. 265:15286-15293.
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Claims (27)
1. Uso de un virus del herpes atenuado que
- (i)
- carece de un gen vhs funcional, o un equivalente funcional del mismo;
- (ii)
- comprende un gen UL43 funcional, o un equivalente funcional del mismo;
en la fabricación de un medicamento para uso en
un método para estimular una respuesta inmune, comprendiendo el
método infectar células dendríticas con dicho virus.
2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde
dicho virus es un virus del herpes simple 1 o 2.
3. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2,
donde dicho virus carece de un gen funcional que codifica ICP47.
4. Uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde dicho virus tiene un gen VMW65, o
un equivalente funcional del mismo, que codifica una proteína que
carece de actividad de activación transcripcional.
5. Uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde dicho virus carece de al menos un
gen funcional inmediatamente temprano.
6. Uso de acuerdo con la reivindicación 5, donde
dicho gen inmediatamente temprano se selecciona entre genes que
codifican ICP0, ICP4, ICP22, ICP27 o equivalentes funcionales de los
mismos.
7. Uso de acuerdo con la reivindicación 5 o 6,
donde dicho virus carece tanto de un gen funcional que codifica
ICP27 como de un gen funcional que codifica ICP4.
8. Uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 7, donde dicho virus carece tanto de un gen
funcional que codifica ICP27 como de un gen funcional que codifica
ICP4 y que tiene un gen VMW65, o un equivalente funcional del mismo,
que codifica una proteína que carece de actividad de activación
transcripcional.
9. Uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 8, donde el virus carece de genes funcionales
que codifican ICP0, ICP4, ICP22 e ICP27.
10. Uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde dicho virus carece adicionalmente
de un gen ICP34.5 funcional, o un equivalente funcional del
mismo.
11. Uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde dicho virus comprende un gen
heterólogo.
12. Uso de acuerdo con la reivindicación 11,
donde dicho gen heterólogo se une de manera operativa a una
secuencia de control que permite la expresión de dicho gen
heterólogo en una célula dendrítica.
13. Uso de acuerdo con la reivindicación 11 o 12,
donde dicho gen heterólogo codifica un antígeno tumoral.
14. Uso de acuerdo con la reivindicación 13,
donde dicho antígeno tumoral se aumenta en o sobre la superficie de
células tumorales comparado con las células no tumorales.
15. Uso de acuerdo con la reivindicación 13,
donde dicho antígeno tumoral está presente en o sobre la superficie
de células tumorales pero está ausente de células no tumorales.
16. Uso de acuerdo con la reivindicación 11 o 12,
donde dicho gen heterólogo codifica un polipéptido capaz de modular
una respuesta inmune.
17. Uso de acuerdo con la reivindicación 16,
donde dicho polipéptido es quimioquina, citoquina o una molécula
co-estimuladora.
18. Uso de acuerdo con la reivindicación 11 o 12,
donde dicho gen heterólogo codifica un polipéptido de origen
parasitario, vírico o bacteriano.
19. Uso de acuerdo con la reivindicación 18,
donde dicho polipéptido se selecciona entre antígenos del virus de
la hepatitis C, antígenos de superficie o núcleo de la hepatitis B,
antígenos de papilovirus, antígenos de VIH y antígenos de
malaria.
20. Uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 19, donde dicho virus comprende más de un gen
heterólogo.
21. Uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, donde dichas células dendríticas son
células dendríticas humanas.
22. Uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores donde dichas células dendríticas se
aislan o preparan a partir de sangre periférica o médula ósea antes
de la infección ex vivo.
23. Uso de acuerdo con la reivindicación 22,
donde dichas células dendríticas se devuelven al cuerpo después de
la inyección.
24. Uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 21, donde dichas células dendríticas se
infectan in vivo después de la administración del virus al
cuerpo humano o animal.
25. Uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores donde el medicamento es para
administración por inyección, por infusión, por una vía intra- o
trans-dérmica o por un medio biolístico.
26. Uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores donde el medicamento es para el
tratamiento o prevención de una infección patógena o un cáncer.
27. Uso de células dendríticas ex vivo
infectadas con un herpes virus atenuado como se ha definido en una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 en la fabricación de un
medicamento para usar en un método de estimulación de una respuesta
inmune.
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