DE69937239T2

DE69937239T2 - Herpesvirusvektoren für dendritische zellen

Info

Publication number: DE69937239T2
Application number: DE69937239T
Authority: DE
Inventors: Robert Stuart UCL Medical COFFIN; Benjamin UCL Medical CHAIN
Original assignee: Biovex Ltd
Current assignee: Biovex Ltd
Priority date: 1998-07-31
Filing date: 1999-08-02
Publication date: 2008-07-24
Anticipated expiration: 2019-08-03
Also published as: ATE374829T1; AU765105B2; CN1384884B; KR20010072162A; ES2294848T3; JP2003502008A; GB2361921B; WO2000008191A3; HK1037925A1; PT1100942E; CN1384884A; JP4430824B2; DK1100942T3; GB2361921A; BR9912653A; EP1100942B1; CY1107844T1; US6641817B1; GB0104400D0; CA2337494A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft abgeschwächte Herpes-simplex-Viren, die in der Lage sind, dendritische Zellen wirksam zu infizieren. Sie betrifft auch die Verwendung solcher Viren bei immuntherapeutischen Ansätzen zur Krankheitsbehandlung.
Hintergrund der Erfindung
Dendritische Zellen (DCs) sind die potentesten antigenpräsentierenden Zellen und sind bei der Auslösung von Reaktionen auch gegenüber Antigenen wirksam, gegenüber denen das Immunsystem tolerant geworden ist. Somit kann für die Tumor-Immuntherapie, wobei eine Immunreaktion gegen einen Tumor hervorgerufen wird, die Verwendung von DCs ideal sein, wenn sie hergestellt wurden, um tumorspezifische Antigene zu präsentieren. DCs können auch zur Präsentation von Antigenen eingesetzt werden, die sich von infektiösen Mitteln ableiten, wie Bakterien, Viren oder Parasiten, die protektive oder therapeutische Impfstoffe für solche Krankheiten bereitstellen. Allerdings hat sich der wirksame Transfer von Antigenen auf DCs für jedes von diesen Zielen als das größte Problem bei diesem Ansatz erwiesen.
Zur Bereitstellung einer realistischen Chance der Erzeugung einer therapeutischen Immunantwort gegen ein Tumorantigen oder ein anderes krankheitsverwandtes Antigen müssen mehrere Bedingungen erfült sein. Erstens ist es notwendig, Moleküle zu identifizieren, deren Expression tumor- oder krankheitsspezifisch (oder mindestens selektiv) ist, und die darum als das Ziel für eine Immunantwort dienen können. Diese Aufgabe hat sich für die Mehrheit von allgemeinen Tumoren als sehr schwierig erwiesen, jedoch wird es beispielsweise im Falle von Zervikalkrebs durch die Gegenwart, in den meisten Fällen, der viralen Onkogene E6 und E7 gelöst, und für andere Tumore werden gerade gute Antigenkandidaten identifiziert. Beispielsweise wird das MUC-1-Genprodukt in einer Anzahl von Tumoren überexprimiert, einschließlich 90% von Eierstockkrebsen. Verschiedene andere tumorassoziierte Antigene wurden ebenfalls identifiziert und wovon jedes möglicherweise bei einer Immuntherapiebehandlung von Krebs verwendet werden könnte. Zweitens ist es nach der Identifizierung des Antigens/der Antigene notwendig, die Antigene in einer immunogenen Form an das Immunsystem abzugeben. Zum Erzeugen der zellulären Immunantwort, die zur Tumorrejektion kritisch ist, bedeutet dies, dass die Proteine entweder im Inneren des Zytoplasmas einer Wirtszelle abgegeben werden müssen (eine schwierige Aufgabe für hochmolekulare Proteinantigene) oder von den Wirtszellen selbst nach der Genübertragung oder DNA-Immunisierung synthetisiert werden müssen. Virale Vektoren, die für diesen Zweck in Erwägung gezogen wurden, umfassen Vakzinia, Adenviren oder Retroviren.
Der Zelltyp, der nun zur Bereitstellung der optimalen Immunstimulanz breit anerkannt wird, ist die lymphoide dendritische Zelle (DC; siehe beispielsweise Girolomoni und Ricciardi-Castagnoli; 1997). In der Tat scheint die DC der einzige Zelltyp zu sein, der in der Lage ist, in vivo eine primäre Immunantwort zu stimulieren, und es hat sich ferner sogar gezeigt, dass er in der Lage ist, die entwickelte Toleranz unter bestimmten Umständen zu durchbrechen. Eine Anzahl von Gruppen untersuchen die Verwendung von DC in autologen adoptiven Immuntherapieprotokollen zur Stimulierung von Immunantworten gegen Tumore in der Hoffnung, dass sie vielleicht eine therapeutische Wirkung zeigen. Solche Protokolle umfassen die Kultur und/oder Anreicherung von DCs aus peripherem Blut, in vitro Beladung von DCs mit Antigen und anschließendes Wiedereinbringen der DCs in den Patienten. Dieser Ansatz ist allerdings durch das Fehlen von wirksamen Mitteln beeinträchtigt, durch die diese Zellen mit Antigenen geladen werden. Neuere Arbeiten haben allerdings gezeigt, dass die Präsentation von Antigenen durch Peptid-gepulste DCs Antitumorreaktionen in vivo erzeugt hat (Celluzzi et al., 1996; Zitvogel et al., 1996). Hinsichtlich viraler Vektoren ergeben Retroviren keine hocheffiziente Genübertragung an dendritische Zellen (Reeves et al., 1996; Aicher et al., 1997), und in unseren Händen ergeben Adenviren nicht wie bei der von anderen berichteten Arbeit (Arthur et al., 1997) nur eine Genübertragung mit geringer Effizienz.
Wir haben bisher getestet und berichtet, dass Herpes-simplex-Viren (HSV) wirksam Gene an dendritische Zellen übertragen und sie damit infizieren können (Coffin et al., 1998), obwohl die damit einhergehende Toxizität nicht quantifiziert wurde. HSV besitzt für diesen Zweck insofern eine Anzahl von Vorteilen gegenüber anderen Vektorsystemen als dies wirksam eine breite Vielzahl von Zelltypen infizieren kann (einschließlich einiger, die sehr schwer mit anderen Vektorsystemen zu infizieren sind, z. B. Dilloo et al., 1997; Coffin et al., 1998), leicht zu manipulieren ist und lange DNA-Insertionen aufnehmen kann, was die Expression von mehreren Genen erlaubt (Übersicht von Coffin und Latchman, 1996). Die Abgabe von mehreren Antigenen an dendritische Zellen und die anschließende Wiedereinbringung in den Körper kann ein besonders vielversprechender Ansatz zur Behandlung von einigen Krebsen und Infektionskrankheiten sein.
Zusammenfassung der Erfindung
Wir haben bisher festgestellt, dass im Gegensatz zu anderen Vektoren in unseren Händen, HSV wirksam dendritische Zellen transduzieren kann (Coffin et al., 1998), jedoch wurden toxische Wirkungen und die funktionellen Fähigkeiten der transduzierten dendritischen Zellen nicht getestet. Wir haben nun eine Vielzahl von HSV-Mutanten, von im Wesentlichen Wildtyp-Viren bis zu Viren mit Mutationen, die entweder die Replikation in einigen Zelltypen (Mutationen in nicht-essenziellen Genen) oder in allen Zelltypen (Mutationen in essenziellen Genen) verhindern, und einige Mutanten mit Kombinationen von Deletionen sowohl in essenziellen als auch nicht-essenziellen Genen getestet. Wir haben beträchtliche Unterschiede sowohl in den Genübertragungseffizienzen von diesen verschiedenen Mutanten als auch in dem gezeigten Toxizitätsniveau (wie durch den dendritischen Zelltod abgeschätzt) gefunden.
Wir haben überraschenderweise gefunden, dass: (i) ein Virus mit inaktivierenden Mutationen in ICP34.5, VMW65, vhs und UL43 ein Virus geringerer Toxizität und höherer Genübertragungseffizienz für dendritische Zellen als andere getestete replikationskompetente Viren bereitstellt, einschließlich des bereits beschriebenen Virus (Coffin et al., 1998) und auch einer Anzahl der getesteten replikationsinkompetenten Viren. Dies ist besonders überraschend, da ICP34.5, VMW65, vhs und UL43 im Allgemeinen als nicht-essenzielle Gene betrachtet werden. Beispielsweise zeigte ein ähnliches Virus, das die Deletion von einem essenziellen Gen (Mutationen in ICP34.5, VMW65, vhs und ICP27 einschloss, eine viel niedrigere Genübertragungseffizienz als dieses Virus. Ferner, im Gegensatz zu den anderen getesteten Virusmutanten konnten Ergebnisse, die angaben, dass wirksames Antigenprozessieren auftrat, innerhalb der Zielzellen gezeigt werden. Dies legt nahe, dass transduzierte dendritische Zellen eine funktionelle Fähigkeit beibehalten, die die Stimulation einer wirksamen Immunantwort in vivo ermöglichen würde. Wir haben auch gefunden, dass (ii) ein Virus, das so außer Kraft gesetzt wurde, dass nur sehr minimale Niveaus von unmittelbar frühen Genen in Zielzellen exprimiert werden (und somit wovon nur ein sehr niedriges HSV-Gen-Expressionsniveau im Allgemeinen erwartet werden würde), ähnliche Ergebnisse ergibt, im Gegensatz zu anderen Mutanten, wobei nur ein einziges unmittelbar frühes Gen entfernt wurde.
Diese Ergebnisse zeigen, dass, obgleich eine wirksame Genübertragung an dendritische Zellen relativ leicht unter Verwendung von HSV-Vektoren erreicht werden kann, für die Zellen zur Beibehaltung ihrer antigenprozessierenden Fähigkeiten, die bestimmte Kombination von Mutationen in dem Virus sorgfältig gewählt werden muss. Somit stellt die Erfindung zum ersten Mal virale Vektoren für dendritische Zellen bereit, die hochwirksame Genübertragung bereitstellen, ohne die antigenprozessierenden Fähigkeiten der infizierten dendritischen Zellen nachteilig zu beeinflussen.
Somit stellt die vorliegende Erfindung ein abgeschwächtes Herpes-Virus bereit, das in der Lage ist, dendritische Zellen wirksam zu infizieren, ohne wirksames Antigenprozessieren innerhalb der infizierten Zelle zu verhindern, wobei dem Virus ein funktionelles UL43 und ein funktionelles vhs-Gens fehlt. Vorzugsweise ist dieses Herpes-Virus ein humanes Herpessimplex-Virus. Stärker bevorzugt ist dieses Virus HSV1 oder HSV2.
Vorzugsweise fehlt dem erfindungsgemäßen Virus ein funktionelles HSV ICP34.5-Gen. Dem erfindungsgemäßen Virus kann auch ein funktionelles VMW65-Gen fehlen, insbesondere auf Grund einer Mutation in dem Gen, die seine Transkriptionsaktivität abschafft. Bei bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist das erfindungsgemäße Virus einer von einem abgeschwächten HSV-Stamm, der eine Mutation in mindestens vier Genen einschließt, sodass ihm ein funktionelles vhs-Gen, ein funktionelles UL43-Gen, ein funktionelles ICP34.5-Gen und ein funktionelles VMW65-Gen fehlt (auf Grund einer Mutation in dem besagten VMW65-Gen, die seine Transkriptionsaktivität abschafft).
Die Erfindung stellt auch die Verwendung eines abgeschwächten Herpes-simplex-Virus bereit, das in der Lage ist, wirksam eine dendritische Zelle zu infizieren, ohne das Antigenprozessieren zu verhindern, das innerhalb der infizierten Zelle auftritt, bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei einem Verfahren zur Stimulierung einer Immunantwort, wobei das Verfahren das Infizieren dendritischer Zellen mit dem Virus umfasst, wobei das Virus ein erfindungsgemäßes Virus ist.
Die Erfindung stellt weiterhin ein erfindungsgemäßes Virus, das ein heterologes Gen/Gene trägt, oder die Verwendung eines Virus gemäß der Erfindung, wobei das Virus ein heterologes Gen/Gene umfasst, bereit. Der Begriff „heterologes Gen" soll jedes Gen, das nicht in dem viralen Genom festgestellt wird, mit umfassen. Das heterologe Gen kann jede Allelvariante eines Wildtyp-Gens sein, oder es kann ein mutiertes Gen sein. Heterologe Gene sind vorzugsweise mit einer Kontrollsequenz operabel verknüpft, die die Expression des heterologen Gens in einer dendritischen Zelle, vorzugsweise einer menschlichen dendritischen Zelle, erlaubt. Das erfindungsgemäße Virus kann somit zur Übertragung eines heterologen Gens an eine dendritische Zelle verwendet werden, wo es exprimiert wird.
Das heterologe Gen/Gene codieren vorzugsweise ein Polypeptid mit therapeutischer Verwendung. Insbesondere kann das heterologe Gen/Gene ein Polypeptid codieren, das in der Lage ist, Immunantworten zu modifizieren, beispielsweise ein Zytokin oder ein anderes immunmodulatorisches Polypeptid. Das heterologe Gen/Gene können auch ein antigenisches Polypeptid codieren, das in Tumorzellen, jedoch nicht in Nicht-Tumorzellen vorhanden ist, oder das in Tumorzellen bezüglich Nicht-Tumorzellen aufreguliert ist. Dies ist bei der Krebstherapie geeignet, da eine infizierte erfindungsgemäße dendritische Zelle zur Stimulierung des Wirts-Immunsystems verwendet werden kann, um mit dem Tumor-spezifischen oder Tumor-vorherrschenden Antigen/Antigenen zu reagieren, was zur Tumorreduktion/Regression führt. Das Polypeptid-Antigen/Antigene ist vorzugsweise ein Zelloberflächenpolypeptid oder ein Polypeptid, das gentechnisch hergestellt wurde, sodass es an die Zelloberfläche transportiert wird (beispielsweise durch Fusion eines Signalpeptids). Das heterologe Gen kann auch ein Polypeptid/Polypeptide parasitären, viralen oder bakteriellen Ursprungs codieren, sodass beispielsweise eine mit einem erfindungsgemäßen Virus infizierte dendritische Zelle zur Stimulierung des Wirtsimmunsystems verwendet werden kann, um eine Immunantwort gegenüber einem Pathogen entweder vor Infektion oder nach Infektion der Wirtszelle durch das Pathogen, hervorzurufen. Das heterologe Gen/Gene können auch ein Protein/Proteine codieren, die mit anderen Krankheiten (z. B. neurodegenerativen Krankheiten, wie Huntingtons, Alzheimer oder Parkinson-Krankheit) zusammenhängen, gegenüber denen sie gesundheitsförderlich sein können, um eine Immunreaktion auszulösen.
Die Erfindung stellt weiterhin ein erfindungsgemäßes Virus bereit, das ein heterologes Gen/Gene trägt, zur Verwendung bei der Behandlung von Menschen und Tieren, insbesondere durch Immuntherapie. Beispielsweise können solche Viren bei der Behandlung oder Prävention von Tumoren oder von parasitischen, bakteriellen oder viralen Infektionen verwendet werden.
Eine mit einem erfindungsgemäßen Virus transduzierte dendritische Zelle wird ebenfalls bereitgestellt. Eine solche Zelle kann bei einem ex vivo Verfahren der Krankheitsbehandlung verwendet werden, beispielsweise Malignitäten oder eine Infektion durch virale oder bakterielle Pathogene. Demnach stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung einer ex-vivo-dendritischen Zelle bereit, die mit einem abgeschwächten Herpes-simplex-Virus infiziert ist, das in der Lage ist, wirksam eine dendritische Zelle zu infizieren, ohne Antigenprozessieren zu verhindern, das innerhalb der infizierten Zelle auftritt, bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei einem Verfahren zur Stimulierung einer Immunantwort, wobei das Verfahren die Infektion dendritischer Zellen mit einem erfindungsgemäßen Virus umfasst.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
A. Viren
Ein abgeschwächtes erfindungsgemäßes Virus ist zur wirksamen Infektion dendritischer Zellen ohne Verhinderung des innerhalb der infizierten Zelle auftretenden Antigenprozessierens in der Lage. Ein erfindungsgemäßes Virus ist vorzugsweise in der Lage, mindestens 40% von Zellen bei einer Infektionsmultiplizität von 1, stärker bevorzugt mindestens 50, 60, 70 oder 80% von Zellen, zu infizieren. Das Expressionsniveau/effizienz innerhalb einer einzelnen Zelle, das unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Virus erhalten wird, variiert in Abhängigkeit von dem Polypeptid (den Polypeptiden), die exprimiert werden, und von den Kontrollsequenz(en), die mit dem Gen operabel verknüpft sind, die das Polypeptid/die Polypeptide codieren, jedoch sind sie typischerweise mindestens so wirksam wie diejenigen, die unter Verwendung eines Wildtyp-Virus erhalten wurden. Zusätzlich zeigt das erfindungsgemäße Virus gegenüber infizierten Zellen eine geringe Toxizität. Vorzugsweise beträgt das Zellüberleben nach der Infektion mindestens 50% am Tag eins nach der Infektion, stärker bevorzugt mindestens 60, 70, 80 oder 90% am Tag eins nach der Infektion.
Um eine herabgesetzte Toxizität zu erreichen, obgleich eine wirksame Infektion von und ein Antigenprozessieren in dendritischen Zellen aufrechterhalten wird, fehlt einem erfindungsgemäßen Virus typischerweise ein funktionelles UL43-Gen und ein vhs-Gen (in HSV) oder homologe oder funktionelle Äquivalente davon in anderen viralen Spezies. Zusätzliche Mutationen können zur weiteren Herabsetzung der Toxizität des Virus vorgenommen werden, beispielsweise durch den Einschluss einer Mutation in dem Gen, das vmw65 codiert, derart, dass die Transaktivierungsaktivität des Proteins minimiert wird, und/oder durch Einschluss einer inaktivierenden Mutation in das Gen, das ICP34.5 codiert. Alternativ oder zusätzlich enthält das Virus Mutationen, die die unmittelbar frühe Genexpression aus dem Virus minimieren, gegebenenfalls zusammen mit weiteren Mutationen. Somit könnte ein erfindungsgemäßes Virus auch typischerweise in ICP27, ICP4 und mit einer Mutation zu vmw65, die die Transaktivierungsaktivität des Proteins minimiert, oder alternativ für jedes der Gene mutiert sein, die ICP4, ICP27, ICP0 und ICP22 codieren. Ein erfindungsgemäßes Virus kann zusätzlich für das Gen mutiert sein, das ICP47 codiert.
Obwohl die vorliegende Erfindung unter Verwendung von Herpes-simplex-Viren beispielhaft ausgeführt wurde, ist es selbstverständlich, dass andere Viren der Herpesviridae-Familie modifiziert werden können, um herabgesetzte Toxizität zu erreichen, während eine wirksame Infektion von und Antigenprozessieren in dendritischen Zellen beibehalten wird. Insbesondere wo Genhomologe der HSV-Gene, die vorstehend beschrieben sind (insbesondere UL43 und vhs), in anderen Herpes-Virus-Spezies existieren, werden diese Homologe dann modifiziert. Alternativ oder zusätzlich sind Viren mit Mutationen zu den unmittelbar frühen Genen oder mit Mutationen, die zur herabgesetzten unmittelbar frühen Genexpression führen, besonders bevorzugt. "Homolog" bedeutet ein Gen, das Sequenzhomologie, entweder Aminosäure- oder Nukleinsäuresequenzhomologie, mit dem entsprechenden HSV-Gen aufweist. Typischerweise ist ein Homologes eines HSV-Gens zu mindestens 15%, vorzugsweise zu mindestens 20%, auf dem Aminosäureniveau mit dem entsprechenden HSV-Gen identisch. Beispielsweise ist das prv43-Gen eines Schweine-Herpes-Virus, Pseudorabies-Virus, zu 23% mit UL43 identisch (Powers et al., 1994).
Verfahren zum Messen von Nukleinsäure- und Proteinhomologie sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Beispielsweise stellt das UWGCG-Paket das BESTFIT-Programm bereit, das zur Homologie-Berechnung verwendet werden kann (Devereux et al. (1984), Nucleic Acids Research 12: 387–395).
Gleichermaßen können der PILEUP- und BLAST-Algorithmus zum Abgleich von Sequenzen (wie beispielsweise bei Altschul, S. F. (1993), 1 Mol. Evol. 36: 290–300; Altschul, S. F. et al. (1990), 1 Mol. Biol. 215: 403–10 beschrieben) verwendet werden. Software zur Durchführung der BLAST-Analyse steht für die Öffentlichkeit durch das National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) zur Verfügung.
Viele verschiedene Einstellungen sind für solche Programme möglich. Erfindungsgemäß kann die Standardeinstellung verwendet werden.
Homologe der HSV-Gene können auf eine Anzahl von Wegen, beispielsweise durch Sondierung genomischer oder cDNA-Bibliotheken, die aus anderen Viren hergestellt wurden, mit Sonden, die alles oder einen Teil des HSV-Gens einschließen, unter Bedingungen von mittlerer oder hoher Stringenz (beispielsweise 0,03 M Natriumchlorid und 0,03 M Natriumcitrat bei etwa 50°C bis etwa 60°C) identifiziert werden. Alternativ können Spezies-Homologe auch erhalten werden unter Verwendung von degenerierter PCR, die Primer verwendet, die zum Abzielen auf Sequenzen innerhalb der Varianten und Homologen ausgelegt sind, die konservierte Aminosäuresequenzen codieren. Die Primer enthalten eine oder mehrere degenerierte Positionen und werden unter Stringenzbedingungen verwendet, die niedriger sind als diejenigen, die zur Klonierung von Sequenzen mit einzelnen Sequenzprimern gegen bekannte Sequenzen (beispielsweise 0,03 M Natriumchlorid und 0,03 M Natriumcitrat bei etwa 40°C) verwendet werden.
Aus Sicherheitsgründen werden die erfindungsgemäßen Viren abgeschwächt, typischerweise, sodass sie nicht in der Lage sind, sich in der Zielzelle wirksam zu replizieren. Die viralen Regionen, die für die Zwecke des Abschwächens verändert wurden, können entweder (vollständig oder teilweise) eliminiert sein oder nicht funktionell gemacht sein oder durch andere Sequenzen ersetzt sein, insbesondere durch eine heterologe Gensequenz. Die abschwächenden Mutationen wurden bereits für alle viralen Gruppen beschrieben, die als virale Vektoren verwendet werden. Beispielsweise kann HSV durch Mutationen in ICP34.5 und/oder in essenziellen Genen, wie ICP4 und ICP27, avirulent gemacht werden.
1. Herpes-simplex-Viren.
i. Viren
Wenn der erfindungsgemäße Virus ein Herpes-simplex-Virus ist, kann das Virus aus beispielsweise HSV1- oder HSV2-Stämmen oder Derivaten davon, vorzugsweise HSV1, erhalten werden. Derivate umfassen Zwischentyp-Rekombinationen, die DNA aus HSV1- und HSV2-Stämmen enthalten. Vorzugsweise besitzen die Derivate eine Sequenzhomologie von mindestens 70% gegenüber einem das HSV1- oder HSV2-Genoms, stärker bevorzugt von mindestens 80%, noch stärker bevorzugt von mindestens 90 oder 95%, typischerweise wie durch die hier beschriebenen Verfahren gemessen. Weitere Derivate, die zum Erhalt der erfindungsgemäßen Viren verwendet werden können, umfassen Stämme, die bereits Mutationen in Genen aufweisen, wovon die funktionelle Inaktivierung in einem erfindungsgemäßen Virus erwünscht ist, beispielsweise Stamm 1716 (MacLean et al., 1991), die Stämme R3616 und R4009 (Chou und Roizman, 1992) und R930 (Chou et al., 1994), wovon alle Mutationen in ICP34.5 aufweisen, Stamm d120, der eine Deletion in ICP4 aufweist (DeLuca et al., 1985), Stamm d27-1 (Rice und Knipe, 1990), der eine Deletion in ICP27 aufweist) oder Stamm d92, der Deletionen sowohl in ICP27 als auch ICP4 aufweist (Samaniego et al., 1995). Die Verwendung dieser Stämme verringert die Anzahl von Schritten, die zur Herstellung der erfindungsgemäßen mutanten HSV-Stämme nötig sind.
Die bei der Beschreibung der verschiedenen HSV-Gene eingesetzte Terminologie entspricht der bei Coffin und Latchman, 1996, gefundenen.
ii. Komplementierende Zelllinien
Wenn den erfindungsgemäßen Herpes-simplex-Viren ein bestimmtes funktionelles essenzielles Gen fehlt, beispielsweise ein Gen, das ICP4 oder ICP27 codiert, wird das erfindungsgemäße Virus unter Verwendung einer Zelllinie propagiert, die dieses essenzielle Gen exprimiert. Wenn beispielsweise dem Virus ein funktionelles ICP27-Gen fehlt, kann das Virus unter Verwendung von V27-Zellen propagiert werden (Rice und Knipe, 1990), 2-2-Zellen (Smith et al., 1992) oder B130/2-Zellen ( WO 98/30707 ), vorzugsweise B130/2-Zellen. Wenn dem Virus ein funktionelles ICP4-Gen fehlt, kann das Virus unter Verwendung einer Zelllinie, die ICP4 exprimiert, beispielsweise E5-Zellen (DeLuca et al., 1985) propagiert werden. Wenn dem Virus ein funktionelles ICP4-Gen und ein funktionelles ICP27-Gen fehlt, wird das Virus unter Verwendung einer Zelllinie propagiert, die sowohl ICP4 als auch ICP27 propagiert (wie E26-Zellen; Samaniego et al., 1995), und wenn dem Virus zusätzlich ein funktionelles vmw65-Gen fehlt, kann das Virus unter Verwendung einer Zelllinie propagiert werden, die auch ein Nicht-HSV-Homolog von vmw65 enthält (z. B. beispielsweise das Pferde-Herpes-Virus-Gen 12 oder BTIF aus Rinder-Herpes-Virus).
ICP27-exprimierende Zelllinien können durch Co-Transfizieren von Säugerzellen, beispielsweise Vero- oder BHK-Zellen, mit einem Vektor, vorzugsweise einem Plasmidvektor, der ein funktionelles HSV-ICP27-Gen umfasst, das in der Lage ist, in den Zellen exprimiert zu wer den, und mit einem Vektor, vorzugsweise einem Plasmid-Vektor, der einen selektierbaren Marker codiert, beispielsweise Neomycin-Resistenz hergestellt werden. Klone, die den selektierbaren Marker besitzen, werden sodann gescreent, weiterhin, um zu bestimmen, welche Klone ebenfalls funktionelles ICP27 exprimieren, beispielsweise auf der Grundlage ihrer Fähigkeit, das Wachstum von ICP27^–-HSV-Stämmen zu unterstützen, unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren (beispielsweise wie bei Rice und Knipe, 1990, beschrieben).
Zelllinien, die keine Reversion eines ICP27^–-Mutanten-HSV-Stammes zu einem Stamm mit funktionellem ICP27 erlauben, werden wie vorstehend geschrieben, produziert, was sicherstellt, dass der Vektor, der ein funktionelles ICP27-Gen umfasst, keine Sequenzen enthält, die mit (d. h. Homolog zu) Sequenzen überlappen, die in dem Mutanten-ICP27^–-Virus verbleiben.
Wo erfindungsgemäße HSV-Stämme inaktivierende Modifikationen in anderen essenziellen Genen, beispielsweise ICP4, einschließen, umfasst das Komplementieren von Zelllinien ein funktionelles HSV-Gen, welches das modifizierte essenzielle Gen auf die gleiche Weise wie für ICP27 beschrieben, komplementiert. Im Falle beispielsweise von HSV-Stämmen, die Mutationen sowohl in ICP27 als auch ICP4 umfassen, wird eine Zelllinie verwendet, die sowohl ICP27 als auch ICP4 exprimiert (wie E26-Zellen (Samaniego et al., 1995). HSV-Stämme, die andere essenzielle Gene exprimieren, können auf eine ähnliche Weise zu der für ICP27 beschriebenen konstruiert werden.
B. Mutationsverfahren
Die verschiedenen besprochenen viralen Gene können durch mehrere auf dem Fachgebiet bekannte Techniken funktionell inaktiv gemacht werden. Beispielsweise können sie durch Deletionen, Substitutionen oder Insertionen, vorzugsweise durch Deletion, funktionell inaktiv gemacht werden. Deletionen können Teile des Gens oder das gesamte Gen entfernen. Beispielsweise kann die Deletion von nur einem Nukleotid erfolgen, was zu einer Rasterverschiebung führt. Allerdings werden vorzugsweise größere Deletionen, beispielsweise mindestens 25%, stärker bevorzugt mindestens 50% der gesamten codierenden oder nicht-codierenden Sequenz (oder alternativ, absolut gesehen, mindestens 10 Nukleotide, stärker bevorzugt mindestens 100 Nukleotide, am stärksten bevorzugt mindestens 1 000 Nukleotide) vorgenommen. Es ist besonders bevorzugt, dass gesamte Gen und einige der flankierenden Sequenzen zu entfernen. Die inserierten Sequenzen können die heterologen Gene einschließen, die nachstehend beschrieben sind. Es ist besonders bevorzugt, das heterologe Gen in ICP27 oder ICP4 zu inserieren. Im Falle des VMW65-Gens wird nicht das gesamte Gen deletiert, da es ein essenzielles Strukturprotein codiert, sondern eine kleine inaktivierende Mutation wird vorgenommen, die die Fähigkeit von VMW65 zur transkriptionalen Aktivierung von IE-Genen abschafft (z. B. wie bei Ace et al., 1989, oder Smiley et al., 1997).
Mutationen werden in den Herpes-Viren durch homologe Rekombinationsverfahren, die den Fachleuten wohlbekannt sind, vorgenommen. Beispielsweise wird genomische HSV-DNA zusammen mit einem Vektor, vorzugsweise einem Plasmidvektor, transfiziert, der die mutierte Sequenz einschließt, die von homologen HSV-Sequenzen flankiert wird. Die mutierte Sequenz kann Deletionen, Insertionen oder Substitutionen einschließen, wovon alle durch Routinetechniken konstruiert werden können. Insertionen können selektierbare Markergene, beispielsweise lacZ oder GFP, zum Screening rekombinanter Viren beispielsweise durch α-Galactosidase-Aktivität oder Fluoreszenz einschließen.
C. Heterologe Gene und Promotoren
Die erfindungsgemäßen Viren können zur Durchführung modifiziert werden, um ein heterologes Gen/Gene zu tragen. Der Betriff "heterologes Gen" umfasst jedes Gen. Obwohl ein heterologes Gen typischerweise ein Gen ist, das nicht in dem Genom eines Herpes-Virus vorhanden ist, kann das Herpes-Gen verwendet werden, mit der Maßgabe, dass die codierende Sequenz nicht mit den viralen Kontrollsequenzen operabel verknüpft ist, mit denen es von Natur aus assoziiert ist. Das heterologe Gen kann jeder Allelvariante eines Wildtyp-Gens sein, oder es kann ein mutantes Gen sein. Der Begriff "Gen" soll Nukleinsäuresequenzen abdecken, die in der Lage sind, zumindest transkribiert zu werden. Somit sind innerhalb dieser Definition Sequenzen eingeschlossen, die mRNA, tRNA und rRNA codieren. Die vorliegende Erfindung betrifft allerdings die Expression von Polypeptiden, statt tRNA und rRNA. Sequenzen, die mRNA codieren, umfassen gegebenenfalls einige oder alle von 5'- und/oder 3'-transkribierten, jedoch untranslatierten flankierenden Sequenzen, die von Natur aus oder anderweitig mit der translatierten codierenden Sequenzen verknüpft sind. Sie kann gegebenenfalls weiterhin die assoziierten transkriptionalen Kontrollsequenzen einschließen, die normalerweise mit den transkribierten Sequenzen assoziiert sind, beispielsweise transkriptionale Stoppsignale, Polyadenylierungsstellen und stromabwärts gelegene Enhancer-Elemente.
Das heterologe Gen/Gene können in das virale Genom über homologe Rekombination von HSV-Stämmen mit beispielsweise Plasmidvektoren inseriert werden, die das heterologe Gen/Gene tragen, die von HSV-Sequenzen flankiert werden. Das heterologe Gen/Gene können in einem geeigneten Plasmidvektor, der Herpes-Virus-Sequenzen umfasst, unter Verwendung von auf dem Fachgebiet wohlbekannten Klonierungstechniken eingeführt werden. Das heterologe Gen/Gene können in das virale Genom an jeder Stelle inseriert werden, mit der Maßgabe, dass das Virus immer noch propagiert werden kann. Es ist bevorzugt, dass das heterologe Gen/Gene in ein essenzielles Gen inseriert wird. Heterologe Gene können an mehreren Stellen innerhalb des Virusgenoms inseriert werden.
Die transkribierte Sequenz des heterologen Gens/Gene ist vorzugsweise mit einer Kontrollsequenz operabel verknüpft, die die Expression des heterologen Gens/Gene in dendritischen Zellen, vorzugsweise in dendritischen Säugerzellen, stärker bevorzugt in menschlichen dendritischen Zellen erlaubt. Der Begriff "operabel verknüpft" bezieht sich auf eine Juxtaposition, wobei die beschriebenen Komponenten sich in einer Beziehung befinden, die es ihnen erlaubt auf ihre beabsichtige Weise zu funktionieren. Eine Kontrollsequenz, die mit einer codierenden Sequenz „operabel verknüpft" ist, wird so ligiert, dass die Expression der codierenden Sequenz unter Bedingungen erreicht wird, die mit der Kontrollsequenz kompatibel sind.
Die Kontrollsequenz umfasst einen Promotor, der die Expression des heterologen Gens/Gene erlaubt, und ein Signal zur Transkriptionstermination. Der Promotor wird aus Promotoren gewählt, die in Säugern, vorzugsweise in menschlichen dendritischen Zellen, funktionell sind. Der Promotor/Promotoren können sich von Promotorsequenzen eukaryotischer Gene ableiten. Beispielsweise können sich Promotoren von dem Genom einer Zelle ableiten, in der die Expression des heterologen Gens erfolgen soll, vorzugsweise von einer dendritischen Säugerzelle oder stärker bevorzugt von einer menschlichen dendritischen Zelle. Bezüglich eukaryotischer Promotoren können es Promotoren sein, die auf ubiquitäre Weise (wie Promotoren von β-Actin, Tubulin) oder alternativ auf eine gewebespezifische Weise funktionieren (wie Promotoren des Gens für Pyruvatkinase). Sie können auch Promotoren sein, die auf spezielle Stimuli reagieren, beispielsweise Promotoren, die Steroidhormonrezeptoren binden. Auch virale Promotoren können verwendet werden, beispielsweise der Maus-Moloney-Leukämie-Virus-lange terminale Wiederholungseinheit (MMLV LTR)-Promotor oder Promotoren von Herpes-Virus-Genen.
Der HSV-LAT-Promotor und Promotoren, die Elemente der LAT-Promotorregion enthalten, können besonders bevorzugt sein, da die Möglichkeit besteht, Langzeitexpression von heterologen Genen während einer Latenz zu erreichen. Insbesondere ist eine Expressionskassette besonders bevorzugt, die im Wesentlichen aus einer LAT-P2-Region besteht, die hier nicht selbst als Promotor wirkt, verknüpft mit einem Promotor und einem heterologen Gen, in dieser Reihenfolge.
Der Begriff "Langzeitexpression" soll in der Bedeutung der Expression eines heterologen Gens in einer Zelle, die mit einem erfindungsgemäßen Herpes-simplex-Virus infiziert ist, auch nachdem das Herpes-simplex-Virus in die Latenz eingetreten ist, verwendet werden. Vorzugsweise dauert diese mindestens zwei Wochen, stärker bevorzugt mindestens eine oder zwei Monate nach Infektion, noch stärker bevorzugt für die Lebensdauer der Zelle an.
Die Expressionskassetten können weiterhin einen zweiten Promotor und ein zweites heterologes Gen umfassen, das in dieser Reihenfolge mit der HSV-LAT-P2-Region und in der entgegengesetzten Orientierung mit dem ersten Promotor und dem ersten heterologen Gen operabel verknüpft ist, wobei der zweite Promotor und das zweite heterologe Gen gleich sind wie oder verschieden sind von dem ersten Promotor und dem ersten heterologen Gen. Somit flankiert ein Paar aus Promotor/heterologen Genkonstrukten in entgegengesetzten Orientierungen eine einzige LAT-P2-Region, was die Langzeitexpression von Paaren heterologer Gene erlaubt, die gleich oder verschieden sein können, angetrieben durch den gleichen oder durch verschiedene Promotoren. Außerdem kann das Produkt des ersten heterologen Gens die Expression des zweiten heterologen Gens (oder umgekehrt) unter geeigneten physiologischen Bedingungen regulieren.
Expressionskassetten und andere geeignete Konstrukte, die das heterologe Gen/Gene und Kontrollsequenzen einschließen, können unter Verwendung von routinemäßigen Klonierungstechniken, die den Fachleuten bekannt sind, hergestellt werden (siehe beispielsweise Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning – a laboratory manual; Cold Spring Harbor Press). Die LAT-P2-Region ist hier als HSV1-Nukleotide 118866–120219 des HSV-Stamms 17+ (Gen-Bank HE1CG: aus PstI-BstXI-Stellen) definiert und umfasst Fragmente oder Derivate dieser Region, einschließlich von homologen Regionen anderer HSV1-Stämme und von HSV2- Stämmen, die in der Lage sind, ein Langzeitexpressionsvermögen für Promotoren bereitzustellen, an die sie gebunden sind.
Es kann auch für die Promotoren zweckmäßig sein, induzierbar zu sein, sodass die Expressionsniveaus der heterologen Gene während der Lebenszeit der Zelle reguliert werden können. Induzierbar bedeutet, dass die Expressionsniveaus, die unter Verwendung des Promotors erhalten werden, reguliert werden können. Beispielsweise würde bei einer bevorzugten Ausführungsform, wobei mehr als ein heterologes Gen in das HSV-Genom inseriert wird, ein Promotor einen Promotor umfassen, der auf das tet-Repressor/VP16 transkriptionaler Aktivator-Fusionsprotein, das bereits beschrieben wurde (Gossen und Bujard, 1992, Gossen et al., 1995) reagiert und der das heterologe Gen antreibt, dessen Expression reguliert werden soll. Der zweite Promotor würde einen starken Promotor (z. B. den CMV-IE-Promotor) umfassen, der die Expression des tet-Repressor/VP16 Fusionsproteins antreibt. Somit würde bei diesem Beispiel die Expression des ersten heterologen Gens von der Gegenwart oder der Abwesenheit von Tetracyclin abhängen.
Zusätzlich kann jeder dieser Promotoren durch die Zugabe weiterer regulatorischer Sequenzen, beispielsweise Enhancer-Sequenzen (einschließlich von Elementen der HSV-LAT-Region), modifiziert werden. Chimäre Promotoren können ebenfalls verwendet werden, die Sequenzelemente aus zwei oder mehreren verschiedenen vorstehend beschriebenen Promotoren einschließen, beispielsweise ein MMLV LTR/LAT-Fusionspromotor (Lokensgard et al., 1994) oder von Promotoren, die Elemente der LAT-Region einschließen (siehe vorstehend).
Heterologe Gene codieren typischerweise Polypeptide von therapeutischer Anwendung. Beispielsweise ist es zur Beschleunigung einer spezifischen Immunantwort gegen einen bestimmten Tumor erwünscht, dendritische Zellen mit einem erfindungsgemäßen Virus zu transfizieren, das die Expression eines Tumorantigens/von Antigenen steuert. Ein Tumorantigen kann für eine Tumorzelle spezifisch sein oder es kann in höheren Konzentrationen in dieser Tumorzelle vorhanden sein als in einer Nicht-Tumorzelle dieses Typs, beispielsweise auf Grund der Aufregulierung der Expression des Antigens. Insbesondere ist es bevorzugt, dass das Tumorantigen/Antigene auf der Oberfläche der Tumorzelle, beispielsweise eines Zelloberflächenrezeptors oder eines Zelladhäsionsproteins, exprimiert wird. Beispiele für Tumorantigene umfassen das MUC-1-Genprodukt (Gendler et al., 1990), das in einer Anzahl von Tumoren überexprimiert wird, einschließlich von Eierstockkrebsen, menschlichem Papillomavirus- Proteinen E6 und E7, die mit Zervikalkrebs in Zusammenhang stehen. Tumorantigene, die T-Zellenreaktionen hervorrufen, sind besonders bevorzugt.
Heterologe Gene können auch ein Polypeptid codieren, das in der Lage ist, eine Immunreaktion zu modifizieren, beispielsweise Zytokine (wie α-, β- oder γ-Interferon, Interleukine, einschließlich IL-1, IL-2, Tumornekrosefaktor oder insulinartige Wachstumsfaktoren I oder II) oder andere immunmodulatorische Proteine.
Heterologe Gene können auch antigenische Polypeptide zur Verwendung als Impfstoffe codieren. Vorzugsweise leiten sich solche antigenischen Polypeptide von pathogenen Organismen, beispielsweise Parasiten, Bakterien oder Viren, ab. Beispiele für solche antigenischen Polypeptide umfassen Hepatitis C-Virus-Antigen, Hepatitis B-Oberflächen- oder Kern-Antigene, HIV-Antigene, Malaria-Antigene, Pertussistoxin, Choleratoxin oder Diphtherietoxin.
Heterologe Gene können auch Markergene einschließen (die beispielsweise β-Galactosidase oder grün fluoreszierendes Protein codieren) oder Gene, deren Produkte die Expression von anderen Genen regulieren (beispielsweise transkriptionale regulatorische Faktoren, einschließlich des tet-Repressor/VP16 transkriptionalen Aktivatorfusionsproteins, das vorstehend beschrieben ist).
Die Gentherapie und andere therapeutische Anwendungen können sehr wohl die Verabreichung mehrerer Gene erfordern. Die Expression von mehreren Genen kann zur Behandlung einer Vielzahl von Zuständen zweckmäßig sein. Herpes-Viren sind in einzigartiger Weise geeignet, da sie keine eingeschränkten Verpackungsmöglichkeiten von anderen viralen Vektorsystemen besitzen. Somit können mehrere heterologe Gene innerhalb seines Genoms aufgenommen werden. Es gibt beispielsweise mindestens zwei Wege, auf denen dies erreicht werden könnte. Beispielsweise könnte mehr als ein heterologes Gen und damit zusammenhängende Kontrollsequenzen in einen bestimmten HSV-Stamm eingebracht werden, entweder an einer einzigen Stelle oder an mehreren Stellen in dem Virusgenom. Es wäre auch möglich, Paare von Promotoren (die gleichen oder verschiedene Promotoren) zu verwenden, die in entgegengesetzte Richtungen voneinander weisen, wobei diese Promotoren jeweils die Expression eines heterologen Gens (des gleichen oder eines verschiedenen heterologen Gens), wie vorstehend beschrieben, antreiben.
D. Dendritische Zellen
Dendritische Zellen können durch eine Reihe von Mitteln isoliert/hergestellt werden, beispielsweise können sie entweder direkt aus peripherem Blut aufgereinigt oder aus CD34+-Vorläuferzellen erzeugt werden, beispielsweise nach Mobilisierung in peripheres Blut durch Behandlung mit G-CSF, oder direkt aus Knochenmark. Aus peripherem Blut können adhärente Vorläufer mit einem GM-CSF/IL-4-Gemisch (Inaba et al., 1992) behandelt werden, oder aus Knochenmark können nicht-adhärente CD34+-Zellen mit GM-CSF und TNF-α (Caux et al., 1992) behandelt werden. DCs können routinemäßig aus dem peripherem Blut von menschlichen Freiwilligen hergestellt werden, entsprechend dem Verfahren von Sallusto und Lanzavecchia, 1994, unter Verwendung von gereinigten peripheren Blut-Mononeucleocyten (PBMCs) und zwei Stunden Behandeln von adhärenten Zellen mit GM-CSF und IL-4. Diese sind dann an CD19+ B-Zellen und CD3+, CD2+ T-Zellen unter Verwendung von Magnetkügelchen (siehe Coffin et al., 1998) reduziert. Andere Verfahren können ebenfalls zur Herstellung dendritischer Zellen eingesetzt werden.
E. Therapeutische Anwendungen
Erfindungsgemäße Viren und dendritische Zellen, die mit erfindungsgemäßen Viren infiziert sind, können bei Therapieverfahren eingesetzt werden. Insbesondere können erfindungsgemäße Viren und mit erfindungsgemäßen Viren infizierte dendritische Zellen, die Tumorantigene exprimieren, bei Verfahren zur Krebsbehandlung verwendet werden. Insbesondere können die erfindungsgemäßen Viren und mit erfindungsgemäßen Viren infizierte dendritische Zellen zur Hemmung des Wachstums verschiedener Tumore in Säugern, einschließlich Menschen, verwendet werden, wie beispielsweise Eierstock-, Zervikal- und endometrische Tumore und Karzinome, beispielsweise Mammakarzinome, Lungenkarzinome, Blasenkarzinome und Dickdarmkarzinome. Weitere Neoplasmen, deren Wachstum gehemmt werden kann, umfassen Sarkome, beispielsweise Weichgewebe- und Knochensarkome und hämatologische Malignitäten, wie Leukämien. Bestimmte Beispiele für Krebse, die unter Verwendung von erfindungsgemäßen Viren und/oder dendritischen Zellen, die mit erfindungsgemäßen Viren infiziert sind, die Tumorantigene exprimieren, behandelt werden können, umfassen Melanome, Leukämien, Zervikalkrebse und Eierstockkrebse.
Erfindungsgemäße Viren und mit erfindungsgemäßen Viren infizierte dendritische Zellen können bei Verfahren zur Behandlung oder Prävention pathogener Infektionen, beispielsweise parasitärer, bakterieller oder viraler Infektionen, verwendet werden. In diesem Fall können die Viren/dendritische Zellen vor der Infektion verabreicht werden, um eine protektive Immunreaktion in dem Wirt zu stimulieren, oder nach der Infektion, um das Wirtsimmunsystem zur Bekämpfung der Infektion zu stimulieren.
F. Verabreichung
Die erfindungsgemäßen Herpes-Viren können somit zur Übertragung therapeutischer Gene an einen Menschen oder ein Tier, der der Behandlung bedarf, verwendet werden. Die Übertragung therapeutischer Gene unter Verwendung der erfindungsgemäßen Herpes-Viren kann zur Behandlung beispielsweise von Malignitäten und pathogenen Infektionen verwendet werden.
Ein Verfahren zur Durchführung einer Therapie umfasst die Insertion des therapeutischen Gens/Gene in das Genom des erfindungsgemäßen Herpes-Virus, wie vorstehend beschrieben, und die anschließende Kombination des resultierenden rekombinanten Virus mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel, um eine pharmazeutische Zusammensetzung herzustellen. Geeignete Träger und Verdünnungsmittel umfassen isotonische Kochsalzlösungen, beispielsweise phosphatgepufferte Salzlösung. Die Zusammensetzung kann zur parenteralen, intramuskulären, intravenösen, subkutanen oder transdermalen Verabreichung formuliert werden.
Die Infektion von dendritischen Zellen mit dem erfindungsgemäßen Virus kann in vivo durch Verabreichung einer Zusammensetzung, die das Virus umfasst, an einen Patienten durchgeführt werden. Die pharmazeutische Zusammensetzung wird so verabreicht, dass das Virus, das das therapeutische Gen/Gene enthält, in die Zellen in einem geeigneten Bereich eingebracht werden kann. Die verabreichte Virusmenge liegt im Bereich von 10⁴ bis 10¹⁰ pfu, vorzugsweise von 10⁵ bis 10⁸ pfu, stärker bevorzugt von etwa 10⁶ bis 10⁷ pfu. Bei Injektion werden typischerweise 10 μl bis 1 ml, vorzugsweise 100 μl bis 1 ml Virus in einem pharmazeutisch verträglichen geeigneten Träger oder Verdünnungsmittel verabreicht.
Ein weiteres Verfahren umfasst das Isolieren/Herstellen von dendritischen Zellen aus peripherem Blut oder Knochenmark, um die Zellen mit dem erfindungsgemäßen Virus in vitro zu infizieren. Anschließend werden transduzierte dendritische Zellen typischerweise dem Patienten über intramuskuläre, intraperitoneale, subkutane oder intravenöse Injektion oder durch direkte Injektion in die Lymphknoten des Patienten, vorzugsweise durch direkte Injektion in die Lymphknoten verabreicht. Typischerweise werden 10⁴ bis 10⁸ transduzierte dendritische Zellen, vorzugsweise 10⁵ bis 10⁷ Zellen, stärker bevorzugt etwa 10⁶ Zellen dem Patienten verabreicht.
Die beschriebenen Verabreichungswege und Dosierungen sollen nur eine Richtlinie sein, da ein Fachmann in der Lage ist, unschwer den optimalen Verabreichungsweg und die optimale Verabreichungsdosis für jenen bestimmten Patienten beispielsweise in Abhängigkeit vom Alter, Gewicht und Zustand des Patienten zu bestimmen.
Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben, die nur erläuternd und nicht einschränkend sein sollen.
BEISPIELE
Materialien und Methoden
Konstruktion und Wachstum von viralen Stämmen
Sämtliche Virusstämme stammen vom HSV1-Stamm 17+, dessen Nukleotidsequenz bei GenBank (Zugangsnummer HE1CG) hinterlegt ist. Sämtliche Stämme wurden unter Verwendung von BHK C-21-Zellen (ECACC Nr. 8501143) hergestellt und propagiert, abgesehen von den Stämmen 17+/27–/pR20 und 1764/27–/pR20.5/vhs, die auf B130/2-Zellen (BHK-Zellen, die stabil mit dem HSV1 ICP27-Gen transfiziert wurden) gewachsen sind, und vom Stamm 1764/27–4–/pR20.5, der unter Verwendung von Zellen propagiert wurde, die mit den Genen, die HSV1 ICP27, -ICP4 und Pferde-Herpes-Virus-Gen 12 codieren, transfiziert wurden. Das EHV-Gen 12 ist das EHV-Homologe von HSV vmw65, von dem wir festgestellt haben, dass es beim Einschluss in Zelllinien Wachstumsmängel ausgleichen kann, die mit einer vmw65-Mutation einhergehen, obwohl das EHV-Gen-12-Proteinprodukt dann nicht in die resultierenden HSV-Virionen verpackt ist, wie es der Fall sein würde, wenn nicht verändertes HSV vmw65 in die Zellen eingeschlossen wäre, die für das Viruswachstum eingesetzt werden. Solche Zellen wurden wie folgt erzeugt: BHK-Zellen (Wachstum in DMEM + 10% FCS, beide von Gibco, bei 37°C/5% CO₂) wurden transfiziert (durch das Verfahren von Gorman, 1985) in 10-cm-Platten mit Plasmiden, die das EHV-Gen 12 enthielten (Lewis, J. B. et al. (1997), Virology, 230, 369–375), unter der Kontrolle eines CMV-Promotors und der BGHpA-Sequenz (pcDNA3/E) und eines Plasmids, das ICP27 (pSG130BS [Sekulovich et al., 1988]) codiert. Nach Selektion mit Neomycin wurden Neomycin-resistente Klone selektiert und auf ihre Fähigkeit beurteilt, das Wachstum von HSV, das für ICP27 und vmw65 mutiert war, zu unterstützen und ein hoch permissiver Klon wurde selektiert. Zum Einbringen von ICP4 wurde eine Phleomycin/Neomycin-resistente Zelllinie aus diesen BHK-Zellen produziert, die das EHV-Gen 12 und ICP27 enthielten, worin ICP4 durch den Dexamethason-induzierbaren MMTV-Promotor und ein SV40 polyA (unter Verwendung des Plasmids pMAMzeo/ICP4) angetrieben wurde. Zur Konstruktion von pMAMzeo/ICP4 wurde das Neomycin-Resistenzgen (ausgeschnitten als ein BamHI-Fragment) in dem Plasmid pMAMneo (Invitrogen) durch das Phleomycin-Resistenzgen als ein BamHI-Fragment aus pVgRXR (Invitrogen) ersetzt. Die ICP4-codierende Region (HSV1 nts 127,167–131,187 [MseI-BstEII) GenBANK file helcg) wurde anschließend nach dem MMTV-Promotor an der XhoI-Schnittstelle inseriert. Ein für das Wachstum von HSV, mutiert für ICP4, ICP27 und vwm65, hoch permissiver Klon wurde anschließend nach Transfektion in die ICP27/EHV-Gen 12 enthaltenden Zellen und Selektion mit Phleomycin (Zeocin; Cayla, Toulouse, Frankreich) selektiert.
Für Viren mit Mutationen in VMW65 wurden 3 mM Hexamethylen-bisacetamid (HMBA) in das Medium, das für das Viruswachstum verwendet wurde, eingeschlossen (McFarlane et al., 1992).
(i) 17+/pR20.5/UL43
Eine Kassette aus dem Plasmid pR20.5, bestehend aus einer RSV/lacZ/pA-Sequenz und einer CMV/GFP/pA-Sequenz in entgegengesetzter aufeinanderfolgender Orientierung und getrennt durch eine HSV-LAT-Region-Sequenz (nts 118,866–120,219), wurde in den UL43-Locus durch homologe Rekombination mit gereinigter genomischer HSV1-Stamm 17+ DNA durch Standardverfahren gereinigt. Die pR20.5-Kassette wurde zunächst in ein Plasmid inseriert, das UL43-flankierende Regionen enthielt (Coffin et al., 1996) an der einzigen NsiI-Schnittstelle, was das Plasmid pR20.5/43 ergibt. Die 20.5-Kassette kann aus ihrem pGEM5 (Promega)-Plasmidskelett ausgeschnitten werden, wobei Srfl als ein Oligonukleotid, das Srfl codiert, auf einer von beiden Seiten der Kassette inseriert war. Der RSV-Promotor wurde aus pRc/RSV (Invitrogen), lacZ/pA aus pCH110 (Pharmacia), CMV/pA aus pcDNA3 (Invitrogen) und GFP aus pEGFP-N1 (Clontech) zur Konstruktion des Plasmids pR20.5 ausgeschnitten.
(ii) 17+/pR20.5/US5
Die prR20.5-Kassette wurde in den US5-Locus von HSV1 durch Insertion der pR20.5-Kassette in die US5-flankierenden Regionen (Plasmid pΔUS5) inseriert, was das Plasmid pR20.5/US5 erzeugte, gefolgt von homologer Rekombination zusammen mit gereinigter genomischer HSV1-Stamm 17+ DNA in BHK-Zellen, was den Virusstamm 17+/pR20.5/US5 ergab. Das Plasmid pΔUS5 wurde durch Klonieren eines BamHI-EcoNI-Fragments (nts 136,289–131,328) aus HSV1, welches die US5-codierende Region einschließt, in das Plasmid pAT153 hergestellt. pR20.5 wurde in einer einzigen SacI-Schnittstelle bei nt 137,945 in dem US5-Gen inseriert.
(iii) 17+/27–/pR20
Das Plasmid pR20 wurde zur homologen Rekombination in gereinigte HSV-Stamm 17+ DNA verwendet. Das Plasmid pR20 enthält ein LAT P2 (HSV1 nts 118866–120219)/CMV/lacZ-Kassette, inseriert in die ICP27-flankierenden Regionen (HSV1 nts 11095–113273 und nts 116869–118439 in pACYC184 [NBL], was die Insertion an der einzigen MluI-Schnittstelle erlaubt, die die beiden Fragmente verbindet). LacZ-exprimierende Plaques wurden unter Verwendung von B130/2-Zellen gereinigt.
(iv) 1764/pR20.5/UL43
Das Plasmid pR20.5/43 wurde zur homologen Rekombination in gereinigte HSV-Stamm 1764 DNA (Coffin et al., 1996) und zur Plaque-Reinigung von GFP- und LacZ-exprimierenden Plaques verwendet. Der Stamm HSV 1764 ist ein 17+-Stamm, aus dem beide Kopien von ICP34.5 deletiert wurden, und mit einer inaktivierenden Mutation in dem Gen für VMW65 (Ace et al., 1989).
(v) 1764/pR20.5/US5
Das Plasmid pR20.5/5 wurde zur homologen Rekombination in gereinigter HSV-Stamm 1764 DNA und zur Plaque-Reinigung von GFP- und LacZ-exprimierenden Plaques verwendet.
(vi) in1814/pR15
Das Plasmid pR15 wurde zur homologen Rekombination in das Gen für das Virion-Host-Shut-off-Protein (UL41) von Stamm in1814 (Ace et al., 1989) verwendet. Das Plasmid pR15 enthält vhs-flankierende Regionen, wobei die Insertion eines lacZ-Gens durch einen HSV LAT/MMLV LTR chimären Promotor (der im Wesentlichen identisch ist mit dem von Lokensgard et al., 1994 beschriebenen) an der einzigen NruI-Schnittstelle in dem UL41-Gen angetrieben wird. LacZ exprimierende Plaques wurden gereinigt.
(vii) 1764/pR15
Das Plasmid pR15 wurde zur homologen Rekombination in gereinigter HSV-Stamm 1764-DNA verwendet, und lacZ-exprimierende Plaques wurden gereinigt.
(viii) 1764/27–/pR20.5/vhs
Die pR20.5-Kassette wurde in vhs-flankierende Regionen an der einzigen NruI-Schnittstelle inseriert und das resultierende Plasmid (pR20.5/vhs) zur homologen Rekombination in gereinigter HSV-Stamm 1764/27-DNA verwendet. Plaques, die sowohl lacZ als auch GFP exprimieren, wurden unter Verwendung von B130/2-Zellen gereinigt. Der Stamm 1764/27– wurde aus dem Stamm 1764/27–/pR20 (erzeugt durch homologe Rekombination von Plasmid pR20 in HSV-Stamm 1764-DNA und Selektion von lacZ-exprimierenden Plaques) durch homologe Rekombination erzeugt, um das lacZ-Gen zu entfernen, Deletion der Nukleotide 113322–115743 um den ICP27-Locus.
(ix) 1764/pR15/MSVGFP/UL43
Eine MSV LTR-Promotor/GFP-Kassette wurde in UL43 flankierende Regionen an der einzigen NsiI-Schnittstelle inseriert, was das Plasmid pMSVGFP/43 ergab. pMSVGFP/43 wurde sodann zur homologen Rekombination in gereinigte HSV-Stamm 1764/pR15-genomische DNA verwendet, und Plaques, die sowohl lacZ als auch GFP exprimieren, wurden gereinigt.
(x) 1764/27–/4–/pR20.5
Der Virusstamm 1764/27–/4–/pR20.5 wurde durch Insertion einer Kassette konstruiert, bestehend aus GFP (E-GFP; Clontech) und lacZ, angetrieben von CMV- bzw. RSV-Promotoren, in einer aufeinanderfolgenden Orientierung und getrennt durch HSV1 LAT-Sequenzen (PstI-BstXI-: nts 118,866–120,219 [PstI-BstXI] GenBank file helcg) in ICP4-flankierende Regionen (HSV1 nts 123,459–126,774 [Sau3aI-Sau3aI] und 131,730–134,792 [SphI-KpnI] mit nts 124,945–125,723 [NotI–NotI; encodiertes ICP34.5] deletiert, getrennt durch eine einzige XbaI- und SalI-Schnittstelle in Plasmid pDICP4) und Rekombination in den Virusstamm 1764/27– (siehe vorstehend) unter Verwendung von B4/27-Zellen, die sowohl ICP27 als auch ICP4 komplementieren. X-gal-färbende/grün fluoreszierende Plaques wurden selektiert und weiter gereinigt. Die Zelllinie B4/27 wurde durch Co-Transfektion von pSG130BS, Plasmid p4/2 (codiert ICP4-codierende Regionen, Promotor- und Poly-A-Regionen) und pMAMneo (Invitrogen) in BHK-Zellen hergestellt. Anschließend wurden Neomycin-resistente Klone selektiert.
Beispiel 1: Gene können unter Verwendung von HSV-Vektoren wirksam an dendritische Zellen übertragen werden
Diese Experimente waren darauf ausgerichtet zu bestimmen, ob HSV Gene infizieren und an dendritische Zellen übertragen könnten, unter Verwendung von im Wesentlichen Wildtyp-Viren. Die Infektionsmultiplizitäten (MOI) zwischen 0,1 und 10 wurden verwendet. Hier wurden jeweils 1 × 10⁵ dendritische Zellen durch sanftes Pelletieren, Resuspendieren in etwa 100 μl Virussuspension in DMEM, Inkubation für 1 h bei 37°C und anschließendem Transfer in 24 Wellplatten mit 2 ml RPMI/10% FCS + 100 ng/ml GM-CSF, 50 ng/ml IL4 infiziert. Diese Platten wurden anschließend bei 37°C/5% CO₂ für den Rest des Experimentes inku biert. Die Viren 17+/pR20.5/UL43 und 17+/pR20.5/US5 wurden für diese Experimente verwendet, jeweils für ein durch die Insertion der pR20.5-Kassette mutiertes unterschiedliches Gen (UL43 oder US5). Sowohl UL43 als auch US5 wurden zuvor als für das Wachstum von HSV in Kultur unnötig und als die Kinetik der Infektion in Mausmodellen in vivo nicht beeinflussend identifiziert. Die Wirksamkeit der Genübertragung wurde durch Zählen von GFP-positiven Zellen unter Fluoreszenz-Mikroskopie 24 h nach der Infektion bewertet. Die nachstehend in Tabelle 1 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass HSV wirksam Gene an dendritische Zellen übertragen kann. Ergebnisse – Tabelle 1

MOI % Gen-Übertragung

17+/pR20.5/UL43 17+/pR20.15/US5

0,1 10 11

0,5 15 30

1 45 45

5 65 55

10 85 75
Beispiel 2: Dendritische Zellen sind relativ nicht-permissiv für das Wachstum von HSV, wobei die Inaktivierung von UL43 das Wachstum weiter herabsetzt

Um zu bestimmen, ob die effiziente Genübertragung, die in Beispiel 1 beobachtet wurde, auf der lytischen Replikation der Viren beruhte, wurden Wachstumskurven durchgeführt, in denen dendritische Zellen bei MOIs im Bereich von 0,1 bis 10, wie in Beispiel 1, infiziert wurden, und das Viruswachstum zeitlich quantifiziert. Nach 24-stündigen Intervallen wurden Proben der Kulturmedien auf BHK-Zellen – permissiv auf das HSV-Wachstum – titriert und die Anzahl von Plaques gezählt. Ergebnisse – Tabelle 2 Gesamt-Virus in dendritischen Zellkulturmedien (pfu)

Zeit nach Infektion (Tage)	17+/pR20.5/UL43			17+/pR20.5/US5
	MOI			MOI
	0.1	1	10	0.1	1	10
0	10000	100000	1000000	10000	10000	1000000
1	200	100000	300000	100	100000	10000
2	2000	10000	60000	10000	40000	8000
3	20000	1000	20000	300000	30000	2000
4	1000	1000	10000	100000	20000	2000

Wie in Tabelle 2 vorstehend gezeigt, zeigten diese Experimente, dass, obgleich eine begrenzte produktive Infektion in dendritischen Zellkulturen auftreten kann, die mit HSV infiziert sind, dies nur bei niedrigen MOI offensichtlich ist (insbesondere bei dem US5-deletierten Virus).
Die Inaktivierung von UL43 anstelle von US5 reduziert diese begrenzte produktive Infektion weiter. Es scheint, dass ein niedriger Turnover von Wildtyp HSV in dendritischen Zellkulturen auftreten kann, der durch die Inaktivierung von UL43 reduziert wird, jedoch dass dies mit einem signifikanten dendritischen Zelltod einhergeht (siehe Beispiel 3). Bisher wurde nicht festgestellt, dass die Inaktivierung von UL43 die Wachstumskinetik von HSV beeinflusst (Maclean et al., 1991).
Beispiel 3: Verschiedene HSV-Mutanten zeigen verschiedene Niveaus der Genübertragungseffizienz und der Toxizität in dendritischen Zellen

Die Virusstämme (i)–(x), die vorstehend beschrieben wurden, wurden zur Infektion dendritischer Zellen bei MOI's im Bereich zwischen 0,1–10, wie in Beispiel 1, verwendet. In Zeitintervallen wurden doppelte Proben (2 × 100 μl der Kultur) gezogen, und eine Probe auf die GFP-Expression angeschaut (Fluoreszenzmikroskopie) und/oder mit X-gal durch sanftes Pelletieren und Resuspendieren in Fix (0,8% Glutaraldehyd, 10 min) anschließend mit X-gal- Puffer (wie bei Coffin et al., 1996) und 2 h Inkubation bei 37°C, in Abhängigkeit von der Natur der Insertion in dem bestimmten Virus im Test, gefärbt. Die andere Probe wurde mit Trypan-blau gefärbt, wobei lebende Zellen die Färbung ausschlossen, und die Anzahl von nicht färbenden Zellen als Prozentsatz der Anzahl von Zellen in der Originalkultur gezählt. Bei jeder einzelnen Serie von Experimenten, die zweimal wiederholt wurden, und wobei normalerweise drei Viren gleichzeitig getestet wurden, wurde Virus (i) als interne Kontrolle verwendet, um Variationen zwischen dendritischen Zellpräparationen zu ermöglichen. Die Ergebnisse sind für MOI = 1 gezeigt. Ergebnisse – Tabelle 3

Gene Inaktiviert (X)	Virus										Kontrolle (ohne Virus)
	(i)	(ii)	(iii)	(iv)	(v)	(vi)	(vii)	(viii)	(ix)	(x)
UL43	X			X					X
US5		X			X
VMW65				X	X	X	X	X	X	X
ICP27			X					X		X
Vhs						X	X	X	X
ICP34.5				X	X		X	X	X	X
ICP4										X
% Genabgabe 1 Tag (lacZ/GFP)	45/45	45/45	3/-	70/70	70/70	35/-	30/-	15/15	*/85	20/252
% überlebende Zellen 1 Tag	85	84	90	75	70	58	70	90	90	92	99
% überlebende Zellen 4 Tage	60	50	ND	41	47	38	45	ND	65	80	82

* viele Zellen mit X-gal blau gefärbt, jedoch Blaufärbung von sehr geringer Intensität. Genaue Quantifizierung nicht möglich.
Z siehe Beispiel 5
ND nicht erfolgt.

Diese Ergebnisse zeigten, dass verschiedene Kombinationen von Gendeletionen Viren mit verschiedenen Kombinationen von Genübertragungseffizienz und Toxizitätsmangel bereitstellten, wobei einige für das eine oder andere oder für beide Merkmale im Vergleich zu den Originalviren (i) und (ii) verbessert waren und andere, wobei entweder die Genübertragungseffizienz oder das Zellüberleben herabgesetzt war. Die Entfernung von einem essenziellen unmittelbar frühen Gen (ICP27) ergab anscheinend Viren, die offenbar minimal toxisch waren, in denen jedoch die Genübertragungseffizienz beträchtlich herabgesetzt war. Es wurde festgestellt, dass ein Virus mit einer Kombination von nicht-essenziellen inaktivierten Genen (ICP34.5, VMW65, vhs und UL43), von denen zuvor jeweils gezeigt wurde, dass sie die Virulenz in vivo individuell (anders als UL43) reduzieren, die beste Kombination von Genübertragungseffizienz (zumindest für GFP, siehe Beispiel 4) und Mangel an Toxizität ergeben, wobei diese Genübertragungseffizienz beträchtlich größer ist, als mit jedem der anderen getesteten Viren. Von Virus (x) allerdings, welches ebenfalls minimal toxisch war, wurde gezeigt, dass es hohe GFP- und lacZ-RNA-Expressionsniveaus ergibt (siehe nachstehend), ähnlich dem Niveau von Virus (ix), obwohl durch Fluoreszenz weniger GFP nachgewiesen werden konnte. Westernblots unter Verwendung von anti-HSV ICP27-, ICP4-, ICP0-, ICP22- und ICP47-Antikörpern haben bereits gezeigt, dass dieses Virus nur sehr niedrige Niveaus eines unmittelbar frühen Gens auf Zellen exprimiert, die die Mängel in dem Virus nicht ausgleichen (d. h. die Mutationen in ICP27, ICP4 und vmw65).
Beispiel 4: HSV mit inaktivierenden Mutationen in UL43, ICP34.5, vhs und VMW65 ergibt Ergebnisse, die anzeigen, dass wirksames proteolytisches Prozessieren von abgegebenem Antigen in transduzierten dendritischen Zellen auftritt
Das für UL43, ICP34.5, vhs und VMW65 deletierte Virus ergab eine hochwirksame Abgabe von GFP. Die LacZ-Aktivität war andererseits, obgleich in vielen Zellen vorhanden, nur 24 h nach der Infektion auf einem sehr niedrigen Niveau in den Nachweisgrenzen mit X-gal-Färbung vorhanden. Dies erhöhte die Möglichkeit, dass sowohl lacZ als auch GFP wirksam in den Zellen produziert wurden, allerdings dass die offensichtliche lacZ-Aktivität durch wirksames proteolytisches Prozessieren des lacZ-Antigens herabgesetzt war – wie es in einer voll funktionsfähigen dendritischen Zelle erwartet werden könnte. Das lacZ-Gen wird aus einem identischen Promotor zu demjenigen in anderen der Viren transkribiert, die starke X-gal-Färbung in dendritischen Zellen ergeben. Wenn somit das Prozessieren des lacZ innerhalb der Zellen auftritt, sollten sowohl lacZ mRNA als auch GFP-mRNA leicht auf relativ gleichen Niveaus durch Northernblot nachweisbar sein, jedoch sollten die lacZ-Proteinniveaus durch Westernblot deutlich herabgesetzt sein.
Northern- und Westernblots wurden unter Verwendung von RNA und Protein (extrahiert aus 1 × 10⁵ Zellen/Spur in jedem Fall) aus dendritischen Zellen, infiziert mit entweder 17+/pR20.5/UL43 oder 1764/pR15/MSVGFP/UL43 bei einem MOI von 1 infiziert. Die Westernblots wurden sodann mit entweder einem Anti-lacZ-Antikörper (Promega) oder einem Anti-GFP-Antikörper (Quantum) sondiert. Die Northernblots wurden mit dem lacZ-Gen (ausgeschnitten aus pCH110 (Pharmacia) mit HindIII und BamHI) oder dem GFP-Gen (ausgeschnitten aus pEGFP-N1 (Clontech) mit NotI und HindIII) sondiert. Northern- und Westernblots wurden durch Standardverfahren (Sambrook et al., 1989) durch radioaktive (Northernblots) oder nicht-radioaktive (Westernblots; ECL, Amersham) Mittel durchgeführt.
Ergebnisse
Die Westernblots zeigten:

(i) Wirksamer Nachweis sowohl von lacZ als auch GFP in dendritischen Zellen, die mit 17+/pR20.5/UL43 infiziert waren. Eine einzige definierte Bande wurde bei dem erwarteten Molekulargewicht in jedem Fall festgestellt, wobei etwas kleinere schwächere Banden ebenfalls sichtbar waren.
(ii) Wie bei der X-gal-Färbung erwartet, obgleich GFP leicht mit 1764/pR15/MSV/GFP/UL43 nachgewiesen wurde, waren lacZ-Proteinniveaus bei dem erwarteten Molekulargewicht signifikant herabgesetzt.

Die Northernblots zeigten in jedem Fall eine starke definierte Bande der erwarteten Größe, gleich ob Zellen mit 17+/pR20.5/UL43 oder 1764/pR15/MSVGFP/UL43 infiziert waren.
Diese Ergebnisse zeigen, dass, obgleich lacZ-mRNA wirksam in dendritischen Zellen nach Infektion sowohl mit 1754/pR15/MSVGFP/UL43 als auch 17+/pR20.5/UL43 produziert wird, für 1764/pR15/MSVGFP/UL43 diese RNA entweder nicht translatiert ist oder das lacZ-Protein schnell nach Translation abgebaut wird, sodass die Niveaus des Volllängenproteins, die durch Westernblot nachweisbar sind, signifikant herabgesetzt sind. In Anbetracht der Rolle dendritischer Zellen beim Antigenprozessieren ist letzteres wahrscheinlich der Fall, da dies erwartet werden würde, wenn ein solches abgegebenes Gen effizient prozessiert werden würde. Ein solches effizientes Antigenprozessieren tritt somit mit den anderen getesteten Mutanten (die anders sind als in Beispiel 5 nachstehend) nicht auf, da eine starke X-gal-Färbung in jedem Fall festgestellt werden kann. Somit muss, damit Antigenprozessieren eines viral abgegebenen Antigens in dendritischen Zellen auftritt, die exakte Wahl der Virusmutante, die zur Abgabe verwendet wird, sorgfältig gewählt werden.
Beispiel 5: HSV, aus dem nur die minimale unmittelbar frühe Genexpression möglich ist, erlaubt auch wirksame Genübertragung mit geringer Toxizität an dendritische Zellen und ergibt Ergebnisse, die anzeigen, dass das Prozessieren von abgegebenem Antigen in transduzierten dendritischen Zellen auftritt
Wie in Beispiel 4 vorstehend, wurden vergleichende Western- und RNA-Blots durchgeführt (hier für RNA unter Verwendung von Slotblots). LacZ- und GFP-Protein und die RNA-Niveaus in Extrakten von dendritischen Zellen, infiziert mit 17+/pR20.5/UL43, 1764/pR15/MSVGFP/UL43 oder 1764/27–/4–/pR20.5, wurden verglichen.
Ergebnisse
Die Ergebnisse dieses Experiments waren wie in Beispiel 4, außer für 1764/27–4–/pR20.5-infizierte Zellen. Hier konnte, obgleich gleichwertige Niveaus von GFP- und lacZ-RNA nachgewiesen werden konnten, wie mit 17+/pR20.5/UL43 und 1764/pR15/MSVGFP/UL43-infizierten Zellen, nur relativ niedrig konzentriertes GFP durch Westernblot nachgewiesen werden, beträchtlich weniger als mit 17+/pR20.5/UL43 oder 1764/pR15/MSVGFP/UL43. Somit konnten im Fall von 1764/27–/4–/pR20.5 niedrigere Niveaus sowohl an lacZ- als auch GFP-Protein nachgewiesen werden (statt nur niedrigere Niveaus von lacZ-Protein mit 1764/pR15/MSVGFP/UL43 wie zuvor in Beispiel 4) als es erwartet werden würde angesichts der Menge an lacZ- und GFP-spezifischer RNA, die vorhanden ist, die mit sämtlichen getesteten Viren in den Beispielen 4 und 5 ähnlich war. Dieses Ergebnis ist ein Hinweis darauf, dass im Gegensatz zu jedem der anderen getesteten Viren, nach Genübertragung mit 1764/27–14–/pR20.5 sowohl lacZ als auch GFP proteolytisches Prozessieren erfahren, wie es in einer funktionsfähigen dendritischen Zelle erwartet werden würde. Dies legt eine weitere Funktionalität über und oberhalb derjenigen nahe, die nach Genübertragung unter Verwendung von 1764/pR15/MSVGFP/UL43 bereitgestellt wird.
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Claims

Abgeschwächtes Herpesvirus, das in der Lage ist, eine dendritische Zelle wirksam zu infizieren, ohne die innerhalb der infizierten Zelle auftretende Antigenprozessierung zu verhindern, wobei dem Virus ein funktionelles UL43-Gen und ein funktionelles vhs-Gen fehlt.
Virus nach Anspruch 1, der ein Herpes simplex Virus 1 oder 2 ist.
Virus nach Anspruch 1 oder 2, dem weiterhin ein funktionelles ICP34.5-Gen fehlt.
Virus nach Anspruch einem der Ansprüche 1 bis 3, dem auf Grund einer Mutation in dem Gen, das seine transkriptionale Aktivierungsaktivität aufhebt, weiterhin ein funktionelles VMW65-Gen fehlt.
Virus nach Anspruch nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dem mindestens ein funktionelles unmittelbar frühes Gen fehlt.
Virus nach Anspruch 5, wobei das unmittelbar frühe Gen aus Genen ausgewählt ist, die ICP0, ICP4, ICP22 und ICP27 codieren.
Virus nach Anspruch 5 oder 6, dem sowohl ein funktionelles Gen, das ICP4 codiert, als auch ein funktionelles Gen, das ICP27 codiert, fehlt und das in dem Gen, das VMW65 codiert, eine Inaktivierungsmutation aufweist, die seine transkriptionale Aktivierungsaktivität aufhebt.
Virus nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dem funktionelle Gene fehlen, die ICP0, ICP4, ICP22 und ICP27 codieren.
Virus nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dem weiterhin ein funktionelles Gen, das ICP47 codiert, fehlt.
Virus nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welches ein heterologes Gen umfasst.
Virus nach Anspruch 10, wobei das heterologe Gen mit einer Kontrollsequenz operabel verknüpft ist, die die Expression des heterologen Gens in einer dendritischen Zelle erlaubt.
Virusstamm nach Anspruch 10 oder 11, wobei das heterologe Gen ein Polypeptid zur therapeutischen Anwendung codiert.
Virus nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei das heterologe Gen ein Polypeptid, dessen Expressionsniveau in oder auf der Oberfläche von Tumorzellen im Vergleich zu Nicht-Tumorzellen erhöht ist; oder ein Polypeptid, welches in oder auf der Oberfläche von Tumorzellen, jedoch nicht in Nicht-Tumorzellen vorhanden ist; oder ein Polypeptid, das zur Modifizierung von Immunantworten in der Lage ist, codiert.
Virus nach einem der Ansprüche 10 bis 13, wobei das heterologe Gen ein Polypeptid parasitären, viralen oder bakteriellen Ursprungs codiert.
Virus nach Anspruch 14, wobei das heterologe Gen ein HSV-Gen ist, das nicht mit den Kontrollsequenzen, mit denen es von Natur aus assoziiert ist, operabel verknüpft ist.
Virus nach einem der Ansprüche 10 bis 13, wobei das heterologe Gen ein Tumorantigen codiert.
Virus nach einem der Ansprüche 10 bis 16, das mehr als ein heterologes Gen einschließt.
Isolierte dendritische Zelle, die mit einem Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 17 infiziert ist.
Dendritische Zelle nach Anspruch 18, die eine menschliche dendritische Zelle ist.
Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 17 oder eine Zelle nach Anspruch 18 oder 19 zur Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers.
Verwendung eines Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 17 bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei einem Verfahren zur Stimulierung einer Immunantwort, wobei das Verfahren die Infizierung dendritischer Zellen mit dem Virus umfasst.
Verwendung einer ex vivo dendritischen Zelle nach Anspruch 18 oder 19 bei der Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung einer Immunantwort.
Verwendung nach Anspruch 21 oder 22, wobei die Immunantwort auf ein Polypeptid parasitären, viralen oder bakteriellen Ursprungs gerichtet ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 21 bis 23, wobei die Immunantwort gegen eine virale Infektion schützt oder sie behandelt.
Verwendung nach Anspruch 21 oder 22, wobei die Immunantwort gegen ein Tumorantigen gerichtet ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 20 bis 25, wobei die dendritischen Zellen aus peripherem Blut oder Knochenmark isoliert oder hergestellt und nach der Infektion wieder in den Körper zurückgeführt werden.
Verwendung nach einem der Ansprüche 21 bis 25, wobei die dendritischen Zellen in vivo nach Verabreichung des Virus an den menschlichen oder tierischen Körper infiziert werden.
Verfahren zur Herstellung einer Zelle nach Anspruch 18 oder 19, das die Infizierung, in vitro, einer dendritischen Zelle mit einem Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 17 umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 17 oder eine Zelle nach Anspruch 18 oder 19 zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel umfasst.