JP4430824B2 - 樹状細胞のためのヘルペスウイルスベクター - Google Patents
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Description
【０００１】
発明の分野
本発明は、樹状細胞に効率的に感染し得る弱毒化された単純ヘルペスウイルスに関する。本発明はまた、疾患の治療のための免疫療法的手法におけるかかるウイルスの使用に関する。
【０００２】
発明の背景
樹状細胞(DC)は、最も強力な抗原提示細胞であり、免疫系が既に寛容性が獲得されている抗原に対してすらも応答を誘導することにおいて効果的である。従って、治療中に腫瘍に対する免疫応答が誘導される腫瘍の免疫療法のために、樹状細胞を使用することは、腫瘍特異的抗原を提示するように樹状細胞が作製された場合には理想的であろう。樹状細胞を使用して、細菌、ウイルスまたは寄生生物などの感染性病原体に由来する抗原を提示し、このような疾患に対する防御ワクチンまたは治療ワクチンを提供できる。しかしながら、これらの標的のいずれかに関する抗原を効率的にDC中に移送することが、この手法における最も重大な問題点であることが明らかである。
【０００３】
腫瘍抗原または他の疾患関連抗原に対する治療上有効な免疫応答を生じさせる現実の機会を提供するには、いくつかの条件を満たすことを要する。第一に、発現が腫瘍または疾患に特異的（または、少なくとも選択的）であり、それ故に免疫応答の標的として機能し得る分子を同定することが必要である。この課題は、一般的な腫瘍の大多数においては、非常に困難であることが判明しているが、例えば、子宮頚癌の場合には、ほとんどの場合にウイルス腫瘍遺伝子E6およびE7が存在することにより解決される。他の腫瘍に関しても、優れた候補となる抗原が同定され始めている。例えばMUC-1遺伝子産物は、卵巣癌の90％を含む、数多くの腫瘍において過剰発現されている。様々な他の腫瘍関連抗原が同定されており、それらのいずれもが、癌の免疫療法での治療において使用され得る可能性を有する。第二には、抗原の同定に続いて、その抗原を免疫原性である形態で免疫系へ送達することが必要である。これについて、腫瘍の排除のために重要な細胞性免疫応答を生じさせるためには、タンパク質は宿主細胞の細胞質内に送達されるか(分子量の大きなタンパク質抗原については困難な課題である)、または遺伝子送達もしくはDNA免疫化の後にタンパク質が宿主細胞自身によって産生されなければならないことを意味する。この目的のために考慮されてきたウイルスベクターとしては、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、またはレトロウイルスが挙げられる。
【０００４】
最適の免疫刺激を提供するものとして現在広く認識されている細胞型は、リンパ球様樹状細胞(DC;例えばGirolomoniおよびRicciardi-Castagnoli, 1997を参照)である。事実、DCはin vivoで初期免疫応答を刺激し得る唯一の細胞型であるとされており、さらに、特定の状況においては確立された寛容性すらも破壊する能力を有することも示されている。多数のグループが、治療効果を示す可能性があることを期待して、自己養子免疫治療の手法においてDCを使用して腫瘍に対する免疫応答を刺激することについて研究を行っている。そのような手法は、末梢血液に由来するDCの培養/富化、in vitroでのDCへの抗原の装填、それに続くDCの被験体への再導入を含むものである。しかしながら、この手法は、これらの細胞に抗原を装填するための効果的な手段が存在しないために、これまでは妨げられていた。しかしながら、最近の成果において、ペプチドパルスを受けたDCによる抗原の提示により、in vivoでの抗腫瘍応答がもたらされることが示されている(Celluzziら、1996;Zitvogelら、1996)。ウイルスベクターに関しては、レトロウイルスは樹状細胞への効果的な遺伝子送達をもたらさず(Reevesら、1996;Aicherら、1997)、本発明者らが進めている研究においては、他の研究者によって報告された成果(Arthurら、1997)とは異なり、アデノウイルスのみが低効率の遺伝子送達をもたらした。
【０００５】
本発明者らは、単純ヘルペスウイルス(HSV)が効果的に樹状細胞に感染し遺伝子を送達し得ることを試験し、報告しているが(Coffinら、1998)、それに伴う毒性は定量していない。HSVは、広範囲の多様な細胞型(他のベクター系では感染が非常に困難な数種の細胞を含む。Dillooら、1997;Coffinら、1998など)に効果的に感染することができ、操作が容易であり、大きなDNA挿入物を受け入れ複数の遺伝子の発現が可能であるという点で、この目的に関して他のベクター系を超える多数の利点を有する(CoffinおよびLatchman 1996により総説)。複数の抗原を樹状細胞に送達し、続いて身体内に細胞を再導入することは、数種類の癌および感染性疾患を治療するための、特に有望な手法となり得る。
【０００６】
発明の概要
本発明者らは以前に、本発明者らが所有している他のベクターとは異なり、HSVは効果的に樹状細胞を形質導入し得ることを見出した(Coffinら、1998)が、毒性の効力や形質導入された樹状細胞の機能性能力を試験してはいなかった。本発明者らは現在までに、本来の野生型ウイルスに始まり、特定の細胞において複製を妨げる変異(非必須遺伝子の変異)または全ての細胞において複製を妨げる変異(必須遺伝子の変異)を有するウイルス、さらに必須遺伝子と非必須遺伝子の双方において欠失を組み合わせて有する変異体に至るまでの、多様なHSV変異体を試験した。本発明者らは、これらの多様な変異体の、遺伝子送達効率とそれらの示す毒性レベル(樹状細胞の細胞死として評価したもの)の双方において、注目すべき差異を見出した。
【０００７】
驚くべきことに、本発明者らは以下のことを見出した：(i)ICP34.5、VMW65、vhs、およびUL43において不活性化変異を有するウイルスは、試験した他の複製能を有するウイルス(以前に報告したウイルス(Coffinら、1998)を含む)および試験した他の多数の複製能を有しないウイルスと比較して、より低い毒性およびより高い樹状細胞に対する遺伝子送達効率を有している。これは非常に驚くべきことである。なぜなら、ICP34.5、VMW65、vhs、およびUL43は全て、通常は非必須遺伝子とみなされるからである。例えば、1つの必須遺伝子を欠失(ICP34.5、VMW65、vhsおよびICP27中の変異)している類似のウイルスは、このウイルスよりも格段に低い遺伝子送達効率を示す。さらに、試験した他のウイルス変異体とは異なり、標的細胞内で効果的な抗原のプロセシングが起こることを示す結果が実証された。このことは、形質導入された樹状細胞が、in vivoでの効果的な免疫応答を刺激し得る機能性能力を維持していることを示唆するものである。また本発明者らは、(ii)標的細胞中で正確な最少レベルでの前初期遺伝子のみが発現されるように不活性化された(それ故にHSV遺伝子発現は非常に低いレベルであることが一般に予測される)ウイルスが、単一の前初期遺伝子が除去された他の変異体とは異なり、同様の結果をもたらすことを見出した。
【０００８】
これらの結果は、HSVベクターを用いることにより、樹状細胞への効果的な遺伝子送達を比較的容易に行い得る一方で、抗原プロセシング能力を保持している細胞については、ウイルス内の特定の変異の組合せを慎重に選択しなければならないことを示している。このように、本発明は、感染した樹状細胞の抗原プロセシング能力に対して好ましくない影響を及ぼすことなく非常に効果的な遺伝子送達を提供する、樹状細胞のためのウイルスベクターを世界初で提供するものである。
【０００９】
このように、本発明は、感染細胞内の効果的な抗原のプロセシングを妨害せずに、樹状細胞に効果的に感染する能力を有する弱毒化ヘルペスウイルスを提供する。好ましくは、当該ウイルスは、ヒト単純ヘルペスウイルスである。より好ましくは、当該ウイルスは単純ヘルペスウイルスの、HSV1またはHSV2、またはそれらの相同性ウイルス株などである。
【００１０】
1つの実施形態(前述の実施形態(i))においては、本発明のヘルペスウイルスは、典型的には機能性UL43遺伝子および機能性vhs遺伝子(HSV株の場合)、または他のウイルス種における機能性等価物を欠失している。好ましくは、本発明のウイルスはさらに、機能性HSV ICP34.5遺伝子、または他のウイルス種の機能性等価物を欠失している。また本発明のウイルスはさらに、機能性VMW65遺伝子、または他のウイルス種の機能性等価物を（特に当該遺伝子の転写活性化活性を喪失させる変異により）欠失していてもよい。第2の実施形態(前述の実施形態(ii))においては、本発明のヘルペスウイルスは、細胞内における前初期遺伝子を最小にする変異を（ウイルス内での欠失は意図しないで）含むものである。かかるウイルスは、例えば、ICP27およびICP4をコードする遺伝子内に不活性化変異を有し、またvmw65コード遺伝子内にそのトランス活性化機能を除く不活性化変異(例えば、Aceら、1989またはSmileyら、1997にあるような、vmw65変異など)を有するものである。かかるウイルスはまた、個々の制御性の前初期遺伝子(ICP4、ICP27、ICP0およびICP22をコードするもの)それぞれに不活性化変異を、残りの非制御性の前初期遺伝子であるICP47を最適に不活性化しながら有する。
【００１１】
本発明の好ましい実施形態においては、本発明のウイルスは、機能性vhs遺伝子、機能性UL43遺伝子、機能性ICP34.5遺伝子および機能性VMW65遺伝子を欠失させる（該VMW65遺伝子の場合はその転写活性化活性を喪失させる変異による）変異を少なくとも4つの遺伝子内に有する弱毒化HSV株、または、少なくとも機能性ICP4遺伝子、機能性ICP27遺伝子、機能性ICP0遺伝子および機能性ICP22遺伝子を欠失させる変異を有する弱毒化HSV株のいずれかである。
【００１２】
本発明はさらに、異種遺伝子を担持するウイルスを提供する。異種遺伝子という用語には、ウイルスゲノム中に見出されないなんらかの遺伝子が含まれるものとする。異種遺伝子は、野生型の対立遺伝子のいずれかである場合もあり、また変異型遺伝子である場合もある。異種遺伝子は好ましくは、当該異種遺伝子を樹状細胞（好ましくはヒト樹状細胞）中で発現させる制御配列に機能しうる形で連結されている。このように、本発明のウイルスは、異種遺伝子をそれが発現される樹状細胞へ送達するために使用し得る。
【００１３】
異種遺伝子は、好ましくは治療用のポリペプチドをコードするものである。特に、異種遺伝子は、免疫応答を改変し得るポリペプチド(サイトカイン、または他の免疫調整ポリペプチドなど)をコードする。また異種遺伝子は、腫瘍細胞中には存在するが非腫瘍細胞中には存在しない抗原性ペプチド、または腫瘍細胞中においては非腫瘍細胞と比較してアップレギュレートされている抗原性ペプチドをコードしていてもよい。このことは、癌の治療において有用である。なぜなら、本発明の感染樹状細胞を用いて、宿主の免疫系を刺激して腫瘍特異的抗原または腫瘍選択的(prevalent)抗原と反応させることにより、腫瘍の減少または軽減をもたらし得るからである。このポリペプチド抗原は、好ましくは、細胞表面ポリペプチド、または細胞表面に移動するように(シグナルペプチドとの融合などにより)遺伝子操作されたポリペプチドである。この異種遺伝子はまた、寄生生物、ウイルス、細菌起源のポリペプチドを、病原体に宿主が感染する前か後のいずれかにおいて、宿主の免疫系を刺激してその病原体に対する免疫応答を引き起こすようにコードしている。異種遺伝子はまた、その疾患に対する免疫応答を生じさせることが有益であるような他の疾患(例えば、ハンチントン病、アルツハイマー病またはパーキンソン病などの神経変性疾患)に関連するタンパク質をコードしてもよい。
【００１４】
本発明はさらに、ヒトおよび動物の治療、特に免疫療法に用いるための異種遺伝子を担持するウイルスを提供する。例えば、かかるウイルスは、腫瘍、または寄生生物、細菌もしくはウイルス感染の治療または予防のために使用できる。
【００１５】
本発明のウイルスによって形質導入された樹状細胞もまた提供される。かかる細胞は、悪性疾患や、ウイルスまたは細菌病原体による感染などの疾患の、ex vivoでの治療方法のために使用できる。
【００１６】
発明の詳細な説明
A. ウイルス
本発明の弱毒化ウイルスは、感染した細胞内で起こる抗原のプロセシングを妨げずに効率的に樹状細胞に感染する能力を有する。本発明のウイルスは、感染多重度1で少なくとも40％の細胞に感染し、より好ましくは50％、60％、70％または80％の細胞に感染する能力を有する。本発明のウイルスを用いて得られる個々の細胞中における発現のレベル/効率は、発現されるポリペプチドおよびポリペプチドをコードする遺伝子に機能しうる形で連結された制御配列に依存して変化し得るが、一般に、少なくとも野生型ウイルスを用いて得られるものと同程度には効果的なものであろう。さらに、本発明のウイルスが感染した細胞に対して示す毒性は低い。好ましくは、感染後の細胞の生存率は、感染後1日目で少なくとも50％、より好ましくは感染後1日目で60％、70％、80％または90％である。
【００１７】
樹状細胞への効率的な感染と樹状細胞中での抗原のプロセシングを維持すると同時に毒性を減少させるために、本発明のウイルスでは、典型的には、機能性UL43遺伝子およびvhs遺伝子(HSVの場合)、または他のウイルス種におけるそれらに相同な遺伝子もしくは機能性等価物を欠失している。付加的な変異により(例えば、vmw65をコードする遺伝子においてタンパク質のトランス活性化活性を最少とするなどの変異を含めることにより、および/またはICP34.5をコードする遺伝子において不活性化変異を含めることにより)、ウイルスの毒性をさらに減少させることもできる。あるいは、または付加的には、ウイルスには、前初期遺伝子のウイルスからの発現を最少とする変異が、場合によっては、さらなる変異とともに含まれる。このように、本発明のウイルスは典型的は、ICP27、ICP4において変異され、またタンパク質のトランス活性化活性を最少とするvmw65に対する変異を有し、またはICP4、ICP27、ICP0、およびICP22をコードする遺伝子それぞれに関して変異を施されている。本発明のウイルスは、さらにICP47をコードする遺伝子に関しても変異され得る。
【００１８】
本発明を単純ヘルペスウイルスを使用して例示しているが、他のヘルペスウイルス科のウイルスを改変して、樹状細胞への効率的な感染と樹状細胞中の抗原のプロセシングを維持しながら毒性を減少させ得ることは理解されるであろう。特に、他のヘルペスウイルス種内に上記のHSV遺伝子(特にUL43およびvhs)の遺伝子相同体が存在する場合には、これらの相同体を改変し得る。他に、または付加的には、前初期遺伝子に対する変異を有するウイルス、または前初期遺伝子発現の減少をもたらす変異を有するウイルスが特に好ましい。用語「相同体」とは、相当するHSV遺伝子に対して配列相同性（アミノ酸配列または核酸配列のいずれか）を示す遺伝子である。典型的には、HSV遺伝子の相同体は、相当するHSV遺伝子に対してアミノ酸レベルで少なくとも15％、好ましくは少なくとも20％の同一性を有するであろう。例えば仮性狂犬病ウイルス、ブタヘルペスウイルスのprv43遺伝子はUL43に23％の同一性を有する(Powerら、1994)。
【００１９】
核酸およびタンパク質の相同性を測定する方法は、当技術分野でよく知られている。例えば、相同性の計算に使用できるBESTFITプログラムがUWGCG Packageによって提供されている(Devereuxら、(1984) Nucleic Acid Research 12:387-395)。
【００２０】
同様に、PILEUPアルゴリズムおよびBLASTアルゴリズムを使用しても、配列を列記することができる (例えば、Altschul S.F.(1993) J. Mol. Evol. 36:290-300;Altschul, S.F.ら、(1990)J. Mol. Biol. 215:403-10に記載されている)。BLAST分析を実行するためのプログラムは、National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)から公的に入手し得る。
【００２１】
かかるプログラムに関しては、多数の異なる設定が可能である。本発明では、デフォルトの設定を使用してもよい。
【００２２】
HSV遺伝子の相同体は多数の方法で同定し得る。例えば、他のウイルスから作製されたゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーを、HSV遺伝子の全体または一部を含むプローブを用いて、中程度〜高度のストリンジェンシー条件(例えば、約50℃〜約60℃、0.03M 塩化ナトリウムおよび0.03M クエン酸ナトリウム)の下で探索する方法がある。また、他にも、種相同体は、保存アミノ酸配列コードする変異体および相同体内の配列を標的とするプライマーを使用する縮重PCRを行って取得し得る。プライマーは1以上の縮重位置を含む。またプライマーは、公知の配列に対する単一配列プライマーを用いる配列のクローニングにおけるストリンジェンシー条件よりは低いストリンジェンシー条件で使用される(例えば、約40℃、0.03M 塩化ナトリウムおよび0.03M クエン酸ナトリウム)。
【００２３】
安全上の理由により、本発明のウイルスは、典型的には、標的細胞中では効果的な複製能を有しないように弱毒化される。弱毒化の目的で改変するウイルス領域を、（完全にまたは部分的に）除去するか、非機能性とするか、または他の配列(特に異種遺伝子配列)で置換することができる。弱毒化変異は、ウイルスベクターとして使用できる全てのウイルスのグループに関して既に公表されている。例えば、HSVは、ICP34.5内の、および/またはICP4やICP27などの必須遺伝子の変異により、無毒化し得る。
【００２４】
1. 単純ヘルペスウイルス
i ウイルス
本発明のウイルスが単純ヘルペスウイルスである場合には、該ウイルスは、例えば、HSV1株またはHSV2株、またはそれらの誘導体に由来するものであり、HSV1に由来するものが好ましい。誘導体には、HSV1株およびHSV2株に由来するDNAを含む相互型(inter-type)組換体が含まれる。誘導体は、好ましくは、HSV1またはHSV2のゲノムのいずれかに対して、本明細書に記載の方法による典型的な測定した場合、少なくとも70％の配列相同性、より好ましくは少なくとも80％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも90％または95％の相同性を有している。本発明のウイルスを取得するために使用し得る他の誘導体には、本発明のウイルスにおいて機能的に不活性化されることが望まれている遺伝子において、既に変異を有する株が含まれる。このような例として、いずれもICP34.5に変異を有する1716株(MacLeanら、1991)、R3616株およびR4009株(ChouおよびRoizman、1992)、およびR930株(Chouら、1994)、IPC4に変異を有するd120株(DeLucaら、1985)、ICP127に変異を有するd27-1株(RiceおよびKnipe、1990)、またはICP27とICP4との双方に変異を有するd92株(Samaniegoら、1995)が挙げられる。これらの株を使用すると、本発明の変異HSV株を作製するために必要な手順の数を減らすことができる。
【００２５】
本明細書で用いた様々なHSV遺伝子を記述する用語は、CoffinおよびLatchman、1996に記載の通りである。
【００２６】
ii. 補足細胞系
本発明の単純ヘルペスウイルスが、特定の機能性遺伝子(例えばICP4またはICP27をコードする遺伝子)を欠失している場合には、本発明のウイルスは、必須遺伝子を発現する細胞系において増殖させる。例えば、ウイルスが機能性ICP27遺伝子を欠失している場合には、ウイルスはV27細胞(RiceおよびKnipe、1990)、2-2細胞(Smithら、1992)、またはB130/2細胞(WO98/30707)において増殖できる(B130/2細胞が好ましい)。ウイルスが機能性ICP4遺伝子を欠失している場合には、ウイルスはICP4を発現する細胞系、例えばE5細胞(DeLucaら、1985)において増殖できる。ウイルスが機能性ICP4遺伝子と機能性ICP27遺伝子を欠失している場合には、ウイルスはICP4とICP27の双方を発現する細胞系 (E26細胞など；Samaniegoら、1995)において増殖できる。ウイルスがさらに機能性vmw65遺伝子を欠失している場合には、ウイルスはvmw65の非HSV相同体(ウマヘルペスウイルス遺伝子12またはウシヘルペスウイルス由来のBTIFなど)を含む細胞系において増殖できる。
【００２７】
ICP27発現細胞系は、哺乳動物細胞系（例えばVero細胞またはBHK細胞）に、これらの細胞中で発現され得る機能性HSV ICP27遺伝子を含むベクター(好ましくはプラスミドベクター)と選択マーカー(ネオマイシン耐性など)をコードするベクター(好ましくはプラスミドベクター)とを同時トランスフェクトすることにより作製できる。続いて選択マーカーを有するクローンをスクリーニングし、さらにどのクローンが機能性ICP27を有しているかを決定する。決定方法には、例えば、ICP27- HSV株の増殖をサポートする能力に基づいて、当業者によく知られた方法を用いて行う方法がある(RiceおよびKnipe、1990に記載の方法など)。
【００２８】
ICP27-変異HSV株を機能性ICP27を有する株へ逆転換させない細胞系は、上記の通り作製するものである。これにより、機能性ICP27遺伝子を含むベクターが、ICP27-変異ウイルス中に残存する配列にオーバーラップする(すなわち相同性を有する)配列を含まないことを確実にしている。
【００２９】
本発明のHSV株が、他の必須遺伝子(ICP4など)中に不活性化改変を有している場合には、補足細胞系は、ICP27に関して記載されたのと同じ方法で改変された必須遺伝子を補足する機能性HSV遺伝子を含むものとなる。例えば、ICP27およびICP4の双方において変異を含むHSV株の場合には、ICP27とICP4の双方を発現する細胞系(E26細胞など；Samaniegoら、1995)を使用する。他の必須遺伝子を発現するHSV株を、ICP27に関して記載されたのと同じように構築できる。
【００３０】
B. 突然変異誘発法
これまでに言及した多様なウイルス遺伝子を、当技術分野でよく知られたいくつかの技法により機能的に不活性化とし得る。例えばウイルスは、欠失、置換、または挿入により機能的に不活性とし得るが、好ましいものは欠失である。欠失により、遺伝子の一部または遺伝子全体を除去できる。例えば、僅か1つのヌクレオチドを欠失させたとしても、フレームシフトが起こる。しかしながら、より大規模に欠失させる、例えば、全コード領域および非コード領域の少なくとも25％、より好ましくは少なくとも50％を（または絶対数でいうと、少なくとも10ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも100ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも1000ヌクレオチド）欠失させることが好ましい。全体の遺伝子および隣接配列のいくつかを除去することが特に好ましい。挿入する配列には、下記の異種配列が含まれ得る。特に、異種遺伝子をICP27またはICP4中へ挿入することが好ましい。VMW65の場合には、VMW65は必須構造タンパク質をコードしているので遺伝子全体を欠失させるのではなく、VMW65がIE遺伝子の転写において活性化する能力を喪失させる(例えば、Aceら、1989またはSmileyら、1997に記載されているような)小規模の不活性化変異を行う。
【００３１】
ヘルペスウイルスにおいては、当業者によく知られた相同的組換え法により変異を生じさせる。例えば、HSVゲノムDNAを、相同性HSV配列に隣接した変異配列を含むベクター(好ましくはプラスミドベクター)と共にトランスフェクトする。変異配列は、いずれも日常的な技法により構築される欠失、挿入、または置換を含み得る。挿入物に、たとえば、α-ガラクトシダーゼ活性または蛍光などにより、組換えウイルスをスクリーニングするための選択マーカー、LacZまたはGFPなどを含めてもよい。
【００３２】
C. 異種遺伝子およびプロモーター
本発明のウイルスを改変し、異種遺伝子を担持するものとし得る。用語「異種遺伝子」とは、任意の遺伝子を包含するものである。異種遺伝子とは、典型的にはヘルペスウイルスのゲノム中に存在しない遺伝子のことであるが、ヘルペス遺伝子もまた、そのヘルペス遺伝子が本来結合しているウイルス制御配列に機能しうる形で連結していない場合には使用し得る。異種遺伝子は、野生型遺伝子の対立遺伝子変異体のいずれかであることもあり、また変異体遺伝子である場合もある。用語「遺伝子」とは、少なくとも転写はされ得る核酸配列を包含するものである。故に、mRNAをコードする配列、tRNA、rRNAはこの定義の範囲内である。しかしながら、本発明は、tRNAやrRNAではなくポリペプチドの発現に関するものである。mRNAをコードする配列は、場合によっては、翻訳されるコード配列に天然にまたは人為的に連結された、5’および/または3’の、転写されるが翻訳されない隣接配列の全てまたはいくつかを含む。該配列はさらに、任意で転写される配列に通常は連結される関連転写制御配列(転写停止シグナル、ポリアデニル化部位および下流エンハンサーエレメントなど)を含み得る。
【００３３】
異種遺伝子は、例えば、HSV配列に隣接した異種遺伝子を担持するプラスミドベクターを用いるHSV株の相同的組換えによってウイルスゲノム中に挿入できる。異種遺伝子は、当技術分野でよく知られたクローニング技術を用いて、ヘルペスウイルス配列を含む好適なプラスミドベクター中に導入できる。異種遺伝子は、挿入後もなおウイルスを増殖させ得る限り、ウイルスゲノム中の任意の位置に挿入させ得る。異種遺伝子を、必須遺伝子内に挿入することが好ましい。異種遺伝子は、ウイルスゲノム内の複数の部位へ挿入できる。
【００３４】
異種遺伝子の転写される配列は好ましくは、樹状細胞(好ましくは哺乳動物樹状細胞、より好ましくはヒト樹状細胞)中で当該異種遺伝子を発現させ得る制御配列に機能しうる形で連結されている。用語「機能しうる形で連結された」とは、前述の構成物を意図された様式で機能させ得る関係にあるように並置されていることを意味する。コード領域に「機能しうる形で連結された」制御配列とは、制御配列が適合し得る条件下でコード配列の発現が成されるように連結されているものである。
【００３５】
制御配列には、異種遺伝子の発現を可能とするプロモーターと転写終結シグナルが含まれる。プロモーターは、哺乳動物(好ましくはヒト樹状細胞)において機能し得るプロモーターの中から選択する。プロモーターは、真核生物遺伝子のプロモーター配列から誘導し得る。例えば、プロモーターは、内部で異種遺伝子を発現させようとしている細胞(好ましくは哺乳動物樹状細胞、より好ましくはヒト樹状細胞)のゲノムから誘導し得る。真核生物のプロモーターに関しては、それらは遍在的様式で機能するプロモーター(βアクチン、チューブリンのプロモーターなど)であってもよく、あるいは、組織特異的様式で機能するプロモーターであってもよい(ピルビン酸キナーゼ遺伝子のプロモーターなど)。またプロモーターは、特定の刺激に応答するプロモーターであってもよい(ステロイドホルモン受容体結合プロモーターなど)。ウイルスプロモーター(モロニーマウス白血病ウイルスの長い末端反復配列プロモーター(MMLV LTR)またはヘルペスウイルス遺伝子のプロモーターなど)も使用できる。
【００３６】
HSV LATプロモーター、およびLATプロモーター領域のエレメントを含むプロモーターが特に好ましい。なぜなら、潜伏期間中に異種遺伝子の長期発現を成し得る可能性があるからである。特に、それ自体ではプロモーターとして機能しないLAT P2領域から実質的になり、プロモーターと異種遺伝子とにこの順序で連結された発現カセットは特に好ましい。
【００３７】
用語「長期発現」とは、本発明の単純ヘルペスウイルスを感染させた細胞内で、該単純ヘルペスウイルスが潜伏期間に入った後にも、異種遺伝子を発現することを意味する。好ましくは、長期発現は、感染後少なくとも2週間、より好ましくは1または2ヶ月にわたるものであるが、さらにより好ましくは細胞の寿命にわたるものである。
【００３８】
発現カセットはさらに、前記HSV LAT P2領域にこの順序で機能しうる形で連結され、第1のプロモーターおよび第1の異種遺伝子とは反対の方向にある、第2のプロモーターおよび第2の異種遺伝子を含み得る。この場合、当該第2のプロモーターおよび第2の異種遺伝子は、前述の第1のプロモーターおよび第1の異種遺伝子と同じであっても異なっていてもよい。このように、1組のプロモーター/異種遺伝子構築物が単一のLAT P2領域に反対の方向で隣接することにより、同じかまたは異なるプロモーターによって駆動される、同じかまたは異なる異種遺伝子の組の長期発現が可能となる。さらに、第1の異種遺伝子の産物が、好適な生理的条件の下で第2の異種遺伝子発現を制御しても(またはその逆でも)よい。
【００３９】
発現カセット、および異種遺伝子と制御配列を含むその他の好適な構築物を、当技術分野の当業者に公知の日常的なクローニング技術を用いて作製できる(Sambrookら、1989, Molecular Cloning: a laboratory manual; Cold Spring Harbor Pressなどを参照されたい)。LAT P2領域を本明細書ではHSV株17+のHSV1ヌクレオチド118866-120219として定義する(GenBank HE1CG:PstI部位〜BstXI部位)。この領域には、領域の断片および誘導体(他のHSV1株、およびHSV2株の相同性領域を含む)であり、連結されたプロモーターに長期発現能を提供できるものが含まれるものとする。
【００４０】
プロモーターにとっては、異種遺伝子の発現レベルを細胞の寿命の間に制御し得るように誘導し得ることが有利であろう。「誘導し得る」とは、当該プロモーターを使用して得られる発現レベルを制御できることを意味する。例えば、好ましい実施形態においては、1以上の異種遺伝子がHSVゲノム中に挿入され、1つのプロモーターは、以前に報告されたtetリプレッサー/VP16転写活性化因子融合タンパク質に応答性であるプロモーターを含み(GossenおよびBujard、1992, Gossenら、1995)、発現を制御すべき異種遺伝子を駆動している。第2のプロモーターは、tetリプレッサー/VP16融合タンパク質の発現を駆動する強力なプロモーター(CMV IEプロモーターなど)を含んでいる。このように、この例では、第1の異種遺伝子の発現はテトラサイクリンの存在または不在に依存している。
【００４１】
さらに、これらのプロモーターはいずれも、エンハンサー配列などの更なる制御配列(HSV LAT領域の配列エレメントを含む)を加えることにより改変されていてもよい。2以上の上記の異なるプロモーターに由来する配列エレメント(MMLV LTR/LAT融合プロモーター(Lokensgardら、1994)、またはLAT領域のエレメントを含むプロモーター(上記参照)など)を含むキメラプロモーターもまた、使用できる。
【００４２】
異種遺伝子は、治療用のポリペプチドをコードする。例えば、特定の腫瘍に対する特異的な免疫応答を促進させるために、腫瘍抗原の発現を指令する本発明のウイルスで樹状細胞をトランスフェクトすることが望ましい。腫瘍抗原は腫瘍細胞に特異的であるか、または同じ型の非腫瘍細胞と比較して腫瘍細胞において、例えば抗原の発現のアップレギュレーションにより、より高いレベルで存在し得るものである。特に、腫瘍抗原は腫瘍細胞の表面に発現されること(細胞表面受容体または細胞接着タンパク質など)が好ましい。腫瘍抗原の例には、卵巣癌を含む多数の腫瘍において過剰発現されるMUC-1遺伝子産物(Gendlerら、1990)、子宮頸癌に関連するヒトパピローマウイルスタンパク質E6およびE7が含まれる。T-細胞応答を誘導する腫瘍抗原が特に好ましい。
【００４３】
異種遺伝子はまた、サイトカイン(例えば、α-、β-、γ-インターフェロン、IL-1、IL-2を含むインターロイキン、腫瘍壊死因子またはインスリン様成長因子IまたはII)などの、免疫応答を改変し得るポリペプチドをコードしてもよい。
【００４４】
異種遺伝子はまた、ワクチンとして使用するための抗原性ポリペプチドをコードしてもよい。好ましくは、このような抗原性ポリペプチドは、寄生生物、細菌またはウイルスなどの病原体生物から誘導される。このような抗原性ポリペプチドの例としては、C型肝炎ウイルス抗原、B型肝炎表面またはコア抗原、HIV抗原、マラリア抗原、百日咳毒素、コレラ毒素またはジフテリア毒素が挙げられる。
【００４５】
また異種遺伝子は、マーカー遺伝子(βガラクトシダーゼまたはグリーン蛍光タンパク質をコードするものなど)または遺伝子産物が他の遺伝子の発現を調節する遺伝子(上述のtetリプレッサー/VP16転写活性化因子融合タンパク質を含む転写制御因子など)を含んでもよい。
【００４６】
遺伝子治療および他の治療用用途においてもまた、複数の遺伝子の投与が必要となることが考えられる。複数の遺伝子の発現は、様々な症状の治療のために有益である。ヘルペスウイルスは、他のウイルスベクター系のようにパッケージング能力に制限が無いので、とりわけ好適である。このように、複数の異種遺伝子をゲノム内に収容できる。これを達成するには、例えば、少なくとも2つの方法がある。例えば、1以上の異種遺伝子および関連する制御配列を、特定のHSV株へ、ウイルスゲノム中の単一の部位へ、または複数の部位へのいずれかで導入できる。また、互いに逆方向で対面しているプロモーターの組(同じかまたは異なるプロモーター)を使用することもできる。これらのプロモーターはそれぞれ異種遺伝子(同じかまたは異なる異種遺伝子)の発現を上述のように駆動している。
【００４７】
D. 樹状細胞
樹状細胞を、多数の手段により単離/調製できる。例えば、それらを末梢血から直接精製することもでき、または、CD34+前駆体細胞を、例えば末梢血中へ動員した後でG-CSFで処理することにより、または骨髄から直接発生させ得る。末梢血から、付着性前駆体をGM-CSF/IL-4混合物で処理してもよく(Inabaら、1992)、また骨髄非付着性CD34+細胞をGM-CSFおよびTNF-αで処理してもよい(Cauxら、1992)。DCはヒトのボランティアの末梢血から日常的な方法（SallustoおよびLanzavecchia、1994と類似の方法）で、精製された末梢血の単核細胞(PBMC)を用いて、2時間付着性細胞をGM-CSFおよびIL-4で処理して調製できる。続いてこれらを、CD19+ B細胞およびCD3+、CD2+ T細胞がについてマグネチックビーズを用いて枯渇させる(Coffinら、1998)。他の方法もまた、樹状細胞を調製するために使用できる。
【００４８】
E. 治療用用途
本発明のウイルス、および本発明のウイルスに感染した樹状細胞を、治療方法において使用できる。特に、本発明のウイルス、および本発明のウイルスに感染して腫瘍抗原を発現する樹状細胞は、癌の治療において使用できる。特に、本発明のウイルス、および本発明のウイルスに感染した樹状細胞は、ヒトを含む哺乳動物中で様々な腫瘍(卵巣、子宮頚、および子宮内膜腫瘍および、乳癌、肺癌、膀胱癌および大腸癌などの癌)の増殖を阻止するために使用できる。本発明によりその増殖を阻害し得る他の新生物には、軟部組織肉腫および骨肉腫などの肉腫、ならびに白血病などの血液学的悪性疾患が含まれる。本発明のウイルス、および本発明のウイルスに感染して腫瘍抗原を発現する樹状細胞を用いて治療できる癌の具体的な例には、黒色腫、白血病、子宮頚癌および卵巣癌が含まれる。
【００４９】
本発明のウイルス、および本発明のウイルスに感染させた樹状細胞は、寄生生物、細菌またはウイルス感染などの病原体による感染症を治療または予防する方法においてh使用できる。この場合には、ウイルス/樹状細胞は、感染の前に投与して防御免疫応答を宿主細胞において刺激するために、または感染後に投与して感染と戦うための宿主免疫系を刺激するために使用できる。
【００５０】
F. 投与
このように、本発明のヘルペスウイルスは、治療用遺伝子を、かかる治療を要するヒトまたは動物へ送達するために使用できる。本発明のヘルペスウイルスを用いた治療用遺伝子の送達を、例えば、悪性疾患や病原体による感染を治療するために使用し得る。
【００５１】
治療を行う方法の1つは、上記の通り、治療用の遺伝子を本発明のヘルペスウイルスのゲノム中に挿入し、続いてその結果得られる組換えウイルスを製薬上許容し得る担体または希釈剤と組合わせ、医薬組成物を製造することを含んでなる。好適な担体および希釈剤には、等張生理食塩水、例えばリン酸緩衝化生理食塩水が含まれる。組成物は、非経口、筋内、静脈内、皮下または経皮投与のために製剤化することができる。
【００５２】
本発明のウイルスによる樹状細胞の感染は、当該ウイルスを含んでなる組成物を患者に投与することによりin vivoで実行できる。医薬組成物は、治療用遺伝子を含有するウイルスが、好適な領域において細胞中に取り込まれるような方法により投与される。投与されるウイルスの量は、104〜1010 pfu、好ましくは105〜108 pfu、より好ましくは約106〜107 pfuの範囲にある。注入の際には、典型的には10μl〜1ml、好ましくは100μl〜1mlの、製薬上許容し得る好適な担体または希釈剤中のウイルスが投与される。
【００５３】
他の方法は、樹状細胞を末梢血または骨髄から単離/精製し、本発明のウイルスを用いて細胞をin vitroで感染させることを含んでなる。続いて、形質導入された樹状細胞を、典型的には、患者に筋内、腹腔内、皮下もしくは静脈内注入で投与するか、または患者のリンパ節に直接注入して投与するが、リンパ節への直接注入が好ましい。典型的には104〜108 個の形質導入樹状細胞、好ましくは105〜107 個の形質導入樹状細胞、より好ましくは約106個の形質導入樹状細胞が患者に投与される。
【００５４】
記載した投与経路および用量は、単なるガイドとしてのものである。なぜなら、熟練した開業医は、最適である投与経路および用量を、いずれの特定の患者のためにも、例えば患者の年齢、体重および症状に応じて容易に決定し得るからである。
【００５５】
本発明を、以下の実施例を参照しながら記述するが、これらは例示のみを意図したものであり、限定するものではない。
【００５６】
実施例
材料および方法
ウイルス株の構築および増殖
全てのウイルス株はHSV1株17+に由来するものであり、HSV1株17+のヌクレオチド配列はGenBankに寄託されている(受託番号HE1CG)。全ての株をBHK C-21細胞(ECACC番号8501143)を用いて作製し、増殖させたが、株17+/27-/pR20および株1764/27-/pR20.5/vhsはB130/2細胞(HSV1 ICP27遺伝子で安定にトランスフェクトしたBHK細胞)上で増殖させ、また株1764/27-4-/pR20.5はHSV1 ICP27、ICP4をコードする遺伝子およびウマヘルペスウイルス遺伝子12を用いて安定にトランスフェクトした細胞を用いて増殖させた。EHV遺伝子12はHSV vmw65のEHV相同体であり、本発明者らは該遺伝子が細胞系に含まれている場合にはvmw65変異に伴う増殖欠損を補償し得ることを見出したが、ウイルス増殖のために使用する細胞に未改変HSV vmw65が含まれる場合に期待されるようには、EHV遺伝子12タンパク質産物は結果として得られるHSVビリオン中にパッケージングされない。かかる細胞は以下のようにして作製する：BHK細胞（37℃／5％CO2にて、DMEM+10％FCS[いずれもGibcoより入手]中で増殖させたもの）を、CMVプロモーターおよびBGHpA配列(pcDNA3/E)の制御下にあるEHV遺伝子12（Lewis JBら、(1997) Virology,230,369-375）を含むプラスミド、ならびにICP27(pSG130BS[Sekulovichら、1988])をコードするプラスミドを用いて、10cmプレート中でGormanの方法(1985)によりトランスフェクトした。ネオマイシンで選択した後、ネオマイシン耐性クローンを選んで、ICP27およびvmw65について変異させたHSVの増殖を支持するその能力について評価し、許容性の高いクローンを選択した。ICP24を導入する為に、フレオマイシン(phleomycin)／ネオマイシン耐性細胞系を、EHV遺伝子12およびICP27を含有するこれらのBHK細胞から作製した。前記細胞系において、ICP4はデキサメタゾン誘導性MMTVプロモーターおよびSV40ポリAにより(プラスミドpMAMzeo/ICP4を用いて)駆動される。pMAMzeo/ICP4を構築するために、プラスミドpMAMneo(Invitrogen)中のネオマイシン耐性遺伝子をBamHI断片として切り出して、pVgRXR(Invitrogen)からのBamHI断片としてのフレオマイシン耐性遺伝子と置き換えた。次いで、ICP4コード領域(HSV1 nts 127,167〜131,187 [MseI-BstEII]GenBANK file he1cg)を、XhoI部位にMMTVプロモーターの後に続いて挿入した。次いで、ICP27/EHV遺伝子12含有細胞にトランスフェクトし、さらにプレオマイシンで選択(Zeocon;Cayla,Toulouse,France)した後に、ICP4,ICP27およびvmw65について変異させたHSVの増殖に対して許容性が高いクローンを選択した。
【００５７】
VMW65に変異を有するウイルスについては、ウイルス増殖のために使用する培地に3mMのヘキサメチレン−ビスアセトアミド(HMBA)を含ませた。
【００５８】
(i)17+/pR20.5/UL43
RSV/lacZ/pA配列およびCMV/GFP/pA配列からなるプラスミドpR20.5由来のカセットであって、前記２つの配列が正反対の位置で背中合わせの方向に配置されており、かつHSV LAT領域配列(nts 118,866-120,219)により隔てられている前記カセットを、標準的な方法により、HSV1株17+の精製ゲノムDNAとの相同的組換えによりUL43座に挿入した。まず最初にpR20.5カセットを、UL43隣接領域(Coffinら、1996)を含有するプラスミドの固有NsiI部位で挿入し、プラスミドpR20.5/43を作製した。この20.5カセットは、そのpGEM5(Promega)プラスミド骨格からSrfIを用いて切り出すことができる。何故なら、SrfIをコードするオリゴヌクレオチドが予め前記カセットの両側に挿入されているからである。プラスミドpR20.5を構築するために、RSVプロモーターをpRc/RSV(Invitrogen)から切り出し、lacZ/pAをpCH110 (Pharmacia)から切り出し、CMV/pAをpcDNA3(Invitrogen)から切り出し、またGFPをpEGFP-N1(Clontech)から切り出した。
【００５９】
(ii)17+/pR20.5/US5
pR20.5カセットを、US5隣接領域(プラスミドpΔUS5)に挿入することによりプラスミドpR20.5/US5を作製し、続いてHSV1株17+の精製ゲノムDNAと相同的組換えしてBHK細胞中に入れることによりHSV1のUS5座に挿入して、ウイルス株17+/pR20.5/US5を得た。プラスミドpΔUS5は、HSV1由来のUS5コード領域を含むBamHI-EcoNI断片(nts 136,289-131,328)をプラスミドpAT153中にクローニングすることにより調製した。pR20.5をUS5遺伝子のヌクレオチド137,945位で固有SacI部位に挿入した。
【００６０】
(iii)17+/27-/pR20
精製HSV株17+DNAへの相同的組換えのために、プラスミドpR20を使用した。プラスミドpR20は、ICP27隣接領域(pACYC184[NBL]中のHSV nts 11095〜113273およびnts 116869〜118439により、この２つの断片を連結する固有のMIuI部位での挿入が可能となる)に挿入されたLAT P2(HSV1 nts 118866〜120219)/CMV/lacZカセットを含有する。LacZを発現するプラークを、B130/2細胞を用いて精製した。
【００６１】
(iv)1764/pR20.5/UL43
プラスミドpR20.5/43を、精製HSV株1764 DNAへの相同的組換え(Coffinら、1996)ならびにGFPおよびLacZ発現プラークのプラーク精製のために使用した。HSV株1764は、ICP34.5の両方のコピーが欠失しており、かつVMW65の遺伝子(Aceら、1989)に不活性化変異を有する株17+である。
【００６２】
(v)1764/pR20.5/US5
プラスミドpR20.5/5を、精製HSV株1764 DNAへの相同的組換えならびにGFPおよびLacZ発現プラークのプラーク精製のために使用した。
【００６３】
(vi)in1814/pR15
プラスミドpR15を、株in1814のビリオン宿主シャットオフ(shutoff)タンパク質(UL41)の遺伝子(Aceら、1989)への相同的組換えのために使用した。プラスミドpR15は、UL41遺伝子中の固有NruI部位でHSV LAT/MMLV LTRキメラプロモーター(Lokensgardら、[1994]により報告されているものと本質的に同一である)により駆動されるLacZ遺伝子が挿入されているvhs隣接領域を含有する。LacZ発現プラスミドを精製した。
【００６４】
(vii)1764/pR15
プラスミドpR15を、精製HSV株1764 DNAへの相同的組換えに使用し、LacZ発現プラークをプラーク精製した。
【００６５】
(viii)1764/27-/pR20.5/vhs
pR20.5カセットを固有NruI部位でvhs隣接領域に挿入し、得られたプラスミド(pR20.5/vhs)を精製HSV株1764/27-DNAへの相同的組換えのために使用した。lacZおよびGFPの両方を発現するプラークを、B130/2細胞を用いて精製した。株1764/27-は、lacZ遺伝子を取り除くために相同的組換えにより株1764/27-/pR20(プラスミドpR20のHSV株1764 DNA中への相同的組換えおよびlacZ発現プラークの選択により作製したもの)から作製したものであり、ICP27座周辺のヌクレオチド113322〜115743が欠失している。
【００６６】
(ix)1764/pR15/MSVGFP/UL43
MSV LTRプロモーター／GFPカセットを固有のNsiI部位でUL43隣接領域に挿入し、プラスミドpMSVGFP/43を得た。次いで、pMSVGFP/43を、精製HSV株1764/pR15ゲノムDNAへの相同的組換えのために使用し、lacZおよびGFPの両方を発現するプラークを精製した。
【００６７】
(x)1764/27-/4-/pR20.5
ウイルス株1764/27-/4-/pR20.5は、GFP(E-GFP;Clontech)およびlacZ(それぞれCMVおよびRSVプロモーターによって駆動され、背中合わせの向きでHSV1 LAT配列[PstI〜BstXI:nts 118,866〜120,219{PstI〜BstXI}GenBank file he1cg]により隔てられた状態で配置されている)からなるカセットをICP4隣接領域(HSV1 nts 123,459〜126,774[Sau3aI〜Sau3aI]および131,730〜134,792[SphI〜KpnI]であり、その内nts 124,945〜125,723[NotI〜NotI;ICP34.5をコードする]が欠失しており、プラスミドpDICP4中の固有XbaIおよびSalI部位により隔てられている)に挿入し、さらにICP27およびICP4の両方を補完するB4/27細胞を用いるウイルス株1764/27-(前述)への相同的組換えにより構築した。X-gal染色／緑色蛍光プラークを選択し、さらに精製した。pSG130BS、プラスミドp4/2(ICP4コード領域、プロモーター領域およびポリA領域をコードする)およびpMAMneo(Invitrogen)をBHK細胞中に共トランスフェクトすることにより、細胞系B4/27を調製した。次いで、ネオマイシン耐性クローンを選択した。
【００６８】
実施例１： HSV ベクターを用いて遺伝子を樹状細胞へ効率的に送達することが出来る
これらの実験では、HSVが樹状細胞に感染して該細胞へ遺伝子を送達することができるか否かを、本質的に野生型のウイルスを用いて確認することを目的とした。0.1〜10の感染多重度(MOI)を使用した。ここでは、各場合において、1×105個の樹状細胞を穏やかにペレット化し、DMEM中約100μlのウイルス懸濁液に再懸濁し、37℃で1時間インキュベートし、その後2 mlのRPMI/10％FCS＋100 ng/mlのGM-CSF、50 ng/mlのIL-4を含む24ウェルプレートに移すことにより、前記樹状細胞に感染させた。次いで、これらのプレートを、以後の実験中37℃／5％CO2下にてインキュベートした。pR20.5カセットの挿入により各々異なる遺伝子(UL43またはUS5)について変異が生じているウイルス17+/pR20.5/UL43および17+/pR20.5/US5をこれらの実験に使用した。UL43およびUS5はいずれも、培養におけるHSVの増殖にとって必須ではなく、またマウスモデルでのin vivo感染における感染キネティクスには影響を及ぼさないものとして以前に同定されている。感染後24時間、蛍光顕微鏡検査法によりGFP陽性細胞を計測することにより、遺伝子送達効率を評価した。下記表１に示す結果には、HSVが樹状細胞に遺伝子を効率的に送達し得ることが示されている。
【００６９】
結果
【表１】
実施例２：樹状細胞は HSV の増殖について比較的非許容性であり、 UL43 の不活性化は増殖をさらに低減する
実施例１で観察された効率的な遺伝子送達がウイルスの溶菌性複製によるものかどうかを調べるために、増殖曲線を作製した。ここで樹状細胞は実施例１と同様に0.1〜10の範囲のMOIで感染させ、ウイルス増殖を時間に関して定量した。24時間間隔で培養培地のサンプルをBHK細胞(HSVの増殖に対して許容性)上に滴下し、プラークの数を計測した。
【００７０】
結果
【表２】
上記表２に示すように、これらの実験は、HSVに感染した樹状細胞培養物において生産性が制限される感染が起こり得るものの、このことはMOIが低い時のみに認められる(特にUS5欠失ウイルス)ということを示す。US5の代わりにUL43を不活性化することにより、この生産性が制限された感染がさらに低減する。樹状細胞培養物中で野生型HSVの遅い代謝回転が生じ、この代謝回転はUL43の不活性化により低減されるが、このことは樹状細胞の有意な死滅を伴わないように思われる(例えば実施例３を参照されたい)。UL43の不活性化がHSVの増殖キネティクスに影響を及ぼすことは、以前は見出されていなかった(Macleanら、1991)。
【００７１】
実施例３：異なる HSV 変異体は樹状細胞において異なるレベルの遺伝子送達効率および毒性を示す
前述のウイルス株(i)〜(x)を使用して、実施例１と同様に0.1〜10の範囲のMOIにて樹状細胞に感染させた。時々、サンプルを２回ずつ(２×培養物100μl)採取し、試験に用いている特定のウイルス中の挿入物の性質に応じて、一方のサンプルをGFP発現(蛍光顕微鏡)および／またはX-galを用いる染色について観察した。X-galを用いる染色は、サンプルを穏やかにペレット化し、固定液(0.8％グルタルアルデヒドで10分)およびその後はX-gal緩衝液(Coffinら[1996]に記載されている通り)中に再懸濁し、37℃で2時間インキュベートすることにより実施した。もう一方のサンプルをトリパンブルーで染色し(生存細胞は染色を排除する)、染色されなかった細胞の数を、元の培養物中の細胞数の割合として計測した。実験の個々のセットにそれぞれにおいては、セットを２回ずつ繰り返し、また通常は３種のウイルスを同時に試験した。ウイルス(i)を内部対照として用いることにより樹状細胞調製物間のいずれの変動も考慮した。MOI=1についての結果を示す。
【００７２】
結果
【表３】
＊ ：多くの細胞がX-galにより青色に染色されるが、青色染色の強度は非常に低く、正確な定量は不可能である。
【００７３】
Ｚ ：実施例５を参照されたい
ＮＤ：測定せず
ウイルス(材料および方法の項を参照されたい)：(i) 17+pR20.5/UL43、(ii) 17+/pR20.5/US5、(iii) 17+/27-/pR20、(iv) 1764/pR20.5/UL43、(v) 1764/pR20.5/US5、(vi) in1814/pR15、(vii) 1764/pR15、(viii) 1764/27-/pR20.5/vhs、(ix) 1764/pR15/MSVGFP/UL43、(x) 1764/27-/4-/pR20.5。
【００７４】
これらの結果から、遺伝子欠失の異なる組み合わせにより、遺伝子送達効率と毒性の無さとの種々の組み合わせを有するウイルスが提供されることが示された。また、これらのウイルスの中には元のウイルス(i)および(ii)と比較した場合に一方または両方の特性が改善されているものもあれば、遺伝子送達効率または細胞生存率のいずれかが低減されているものもあることが示された。ある必須の前初期遺伝子(ICP27)を取り除くことで、明らかに最小限の毒性を有するが、遺伝子送達効率がかなり低減されているウイルスが生じるように思われる。各遺伝子を個々に不活性化させるとin vivoでのビルレンスが低減することが以前に示されている(UL43以外)、不活性化された非必須遺伝子(ICP34.5、VMW65、vhsおよびUL43)の組み合わせを有するウイルスは、最適な組み合わせの遺伝子送達効率(少なくともGFPについては、実施例４を参照されたい)および毒性の欠損を付与することが見出されており、この遺伝子導入効率は試験した他のいずれのウイルスの遺伝子導入効率よりもかなり大きい。しかしながら、前記同様に最小限の毒性を有するウイルス(x)は、高レベルのGFPおよびlacZ RNA発現(後述参照)を与えるが、RNAレベルの点でウイルス(ix)と同程度であっても、蛍光により検出され得るGFPはより少ないことが示された。抗HSV ICP27, ICP4, ICP0, ICP22およびICP47抗体を用いてのウェスタンブロットにより、ウイルスは該ウイルスの欠損（すなわち、ICP27、ICP4およびvmw65における突然変異）を補完しない細胞上ではどの前初期遺伝子も非常に低いレベルでしか発現しないことが以前に示された。
【００７５】
実施例４： UL43 、 ICP34.5 、 vhs および VMW65 に不活性化突然変異を有する HSV により、送達された抗原の効率的なタンパク質分解プロセシングが形質導入した樹状細胞内で生じていることを示す結果が得られる
UL43、ICP34.5、vhsおよびVMW65を欠失させたウイルスはGFPの送達効率が高かった。その一方で、LacZ活性は多くの細胞で存在したが、感染後24時間では、X-gal染色による検出限界程度の非常に低いレベルでしか見られなかった。このことは、lacZおよびGFPの両方が細胞中で効率的に産生されたが、見かけのlacZ活性は、完全に機能性である樹状細胞について予想された通り、該lacZ抗原の効率的なタンパク質分解プロセシングにより低減されたという可能性を提起する。lacZ遺伝子は、樹状細胞に強力なX-gal染色を付与する他のウイルス内のプロモーターと同一のプロモーターから転写される。従って、lacZのプロセシングが細胞内で生じる場合、lacZ mRNAおよびGFP mRNAの両方をノーザンブロッティングにより相対的に同レベルで容易に検出可能であるだろうが、ウェスタンブロッティングによるlacZタンパク質のレベルは著しく減少しているだろう。
【００７６】
MOIを１として17+/pR20.5/UL43または1764/pR15/MSVGFP/UL43のいずれかを感染させた樹状細胞由来のRNAおよびタンパク質(各々の場合、1×105個の細胞／レーンから抽出した)を用いて、ノーザンブロットおよびウェスタンブロットを実施した。次いでウェスタンブロットを、抗LacZ抗体(Promega)または抗GFP抗体(Quantum)のいずれかを用いてプローブした。ノーザンブロットはLacZ遺伝子(pCH110[Pharmacia]からHindIIIおよびBamHIを用いて切り出した)またはGFP遺伝子(pEGFP-N1[Clontech]からNotIおよびHindIIIを用いて切り出した)を用いてプローブした。ノーザンおよびウェスタンブロットは、放射性(ノーザンブロット)または非放射性(ウェスタンブロット；ECL、Amersham)手段による標準的な技法により実施した。
【００７７】
結果
ウェスタンブロットにより以下のことが示された：
(i)17+/pR20.5/UL43に感染した樹状細胞におけるlacZおよびGFPの効率的な検出。各場合について、予想された分子量の部位で単一の規定されたバンドが、やはり肉眼で観察できるいくつかのより小さな弱いバンドと共に確認された。
【００７８】
(ii)X-gal染色について予測されたように、GFPが1764/pR15/MSV/GFP/UL43を用いて容易に検出される一方で、予想分子量部位でのlacZタンパク質のレベルは有意に減少していた。
【００７９】
ノーザンブロットは、細胞が17+/pR20.5/UL43または1764/pR15/MSVGFP/UL43のいずれに感染していようと、いずれの場合においても予測された大きさの強力な規定されたバンドを示した。
【００８０】
これらの結果は、1764/pR15/MSVGFP/UL43および17+/pR20.5/UL43の両方に感染した後にlacZ mRNAが樹状細胞で効率的に産生されるにもかかわらず、1764/pR15/MSVGFP/UL43の場合はこのRNAが翻訳されないか、またはlacZタンパク質が翻訳後に急速に分解されるために、ウェスタンブロッティングにより検出できる全長タンパク質のレベルが有意に低下することを実証している。抗原プロセシングにおける樹状細胞の役割を考慮すれば、そのような送達された抗原が効率的な様式でプロセシングされると仮定すると、このことはと予想されるので、後者はかかるケースの1つであることが考えられる。そして、そのような効率的な抗原プロセシングは、強力なX-gal染色が各場合において見られる試験した他の変異体(後述の実施例５で使用したもの以外)に関しては起こらない。従って、ウイルスにより送達された抗原の、樹状細胞におけるプロセシングのためには、送達のために使用するウイルス変異体の的確な選択を注意深く行なわなくてはならない。
【００８１】
実施例５ 最少量のみの前初期遺伝子発現が可能である HSV によっても、効率的で、低毒性の樹状細胞への遺伝子送達がなされ、形質導入樹状細胞において送達された抗原のプロセシングが起きることを示す結果が得られる
上記の実施例４と同様に、比較のためのウエスタンおよびRNAブロット(本実施例においては、RNAに関してはスロットブロットを用いた)を行った。17+/pR20.5/UL43、1764/pR15/MSVGFP/UL43、または1764/27-/4-/pR20.5を感染させた樹状細胞の抽出物中のLacZおよびGFPタンパク質およびRNAレベルを比較した。
【００８２】
結果
この実験の結果では、1764/27-4-/pR20.5を除いては実施例４と同様であった。本実施例においては、GFPおよびlacZ RNAのレベルは、17+/pR20.5/UL43、および1764/pR15/MSVGFP/UL43感染細胞について同程度に検出された一方で、比較的低レベルのGFPがウエスタンブロットにより検出された(17+/pR20.5/UL43、または1764/pR15/MSVGFP/UL43と比較すると格段に少ないものであった)。このように、1764/27-/4-/pR20.5の場合には、lacZとGFPタンパク質の双方が低レベル(実施例４において以前みられた、1764/pR15/MSVGFP/UL43についてのlacZタンパク質レベルよりも僅かに低いというものではなかった)で検出された(実施例４および５において試験された全てのウイルスに関して同程度であったlacZおよびGFP特異的RNAの存在量から期待されるよりも低いレベルであった）。この結果は、試験された他のウイルスとは異なり、1764/27-/4-/pR20.5についての遺伝子送達に続いて、lacZとGFPの双方が、機能性樹状細胞において期待され得るようなタンパク分解プロセシングを経ていることを示すものである。この結果はさらに、1764/pR15/MSVGFP/UL43を用いた遺伝子送達に続いてもたらされるものを超えて上位にある、さらなる機能性を示唆する。
【００８３】
参考文献
発明の分野
本発明は、樹状細胞に効率的に感染し得る弱毒化された単純ヘルペスウイルスに関する。本発明はまた、疾患の治療のための免疫療法的手法におけるかかるウイルスの使用に関する。
【０００２】
発明の背景
樹状細胞(DC)は、最も強力な抗原提示細胞であり、免疫系が既に寛容性が獲得されている抗原に対してすらも応答を誘導することにおいて効果的である。従って、治療中に腫瘍に対する免疫応答が誘導される腫瘍の免疫療法のために、樹状細胞を使用することは、腫瘍特異的抗原を提示するように樹状細胞が作製された場合には理想的であろう。樹状細胞を使用して、細菌、ウイルスまたは寄生生物などの感染性病原体に由来する抗原を提示し、このような疾患に対する防御ワクチンまたは治療ワクチンを提供できる。しかしながら、これらの標的のいずれかに関する抗原を効率的にDC中に移送することが、この手法における最も重大な問題点であることが明らかである。
【０００３】
腫瘍抗原または他の疾患関連抗原に対する治療上有効な免疫応答を生じさせる現実の機会を提供するには、いくつかの条件を満たすことを要する。第一に、発現が腫瘍または疾患に特異的（または、少なくとも選択的）であり、それ故に免疫応答の標的として機能し得る分子を同定することが必要である。この課題は、一般的な腫瘍の大多数においては、非常に困難であることが判明しているが、例えば、子宮頚癌の場合には、ほとんどの場合にウイルス腫瘍遺伝子E6およびE7が存在することにより解決される。他の腫瘍に関しても、優れた候補となる抗原が同定され始めている。例えばMUC-1遺伝子産物は、卵巣癌の90％を含む、数多くの腫瘍において過剰発現されている。様々な他の腫瘍関連抗原が同定されており、それらのいずれもが、癌の免疫療法での治療において使用され得る可能性を有する。第二には、抗原の同定に続いて、その抗原を免疫原性である形態で免疫系へ送達することが必要である。これについて、腫瘍の排除のために重要な細胞性免疫応答を生じさせるためには、タンパク質は宿主細胞の細胞質内に送達されるか(分子量の大きなタンパク質抗原については困難な課題である)、または遺伝子送達もしくはDNA免疫化の後にタンパク質が宿主細胞自身によって産生されなければならないことを意味する。この目的のために考慮されてきたウイルスベクターとしては、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、またはレトロウイルスが挙げられる。
【０００４】
最適の免疫刺激を提供するものとして現在広く認識されている細胞型は、リンパ球様樹状細胞(DC;例えばGirolomoniおよびRicciardi-Castagnoli, 1997を参照)である。事実、DCはin vivoで初期免疫応答を刺激し得る唯一の細胞型であるとされており、さらに、特定の状況においては確立された寛容性すらも破壊する能力を有することも示されている。多数のグループが、治療効果を示す可能性があることを期待して、自己養子免疫治療の手法においてDCを使用して腫瘍に対する免疫応答を刺激することについて研究を行っている。そのような手法は、末梢血液に由来するDCの培養/富化、in vitroでのDCへの抗原の装填、それに続くDCの被験体への再導入を含むものである。しかしながら、この手法は、これらの細胞に抗原を装填するための効果的な手段が存在しないために、これまでは妨げられていた。しかしながら、最近の成果において、ペプチドパルスを受けたDCによる抗原の提示により、in vivoでの抗腫瘍応答がもたらされることが示されている(Celluzziら、1996;Zitvogelら、1996)。ウイルスベクターに関しては、レトロウイルスは樹状細胞への効果的な遺伝子送達をもたらさず(Reevesら、1996;Aicherら、1997)、本発明者らが進めている研究においては、他の研究者によって報告された成果(Arthurら、1997)とは異なり、アデノウイルスのみが低効率の遺伝子送達をもたらした。
【０００５】
本発明者らは、単純ヘルペスウイルス(HSV)が効果的に樹状細胞に感染し遺伝子を送達し得ることを試験し、報告しているが(Coffinら、1998)、それに伴う毒性は定量していない。HSVは、広範囲の多様な細胞型(他のベクター系では感染が非常に困難な数種の細胞を含む。Dillooら、1997;Coffinら、1998など)に効果的に感染することができ、操作が容易であり、大きなDNA挿入物を受け入れ複数の遺伝子の発現が可能であるという点で、この目的に関して他のベクター系を超える多数の利点を有する(CoffinおよびLatchman 1996により総説)。複数の抗原を樹状細胞に送達し、続いて身体内に細胞を再導入することは、数種類の癌および感染性疾患を治療するための、特に有望な手法となり得る。
【０００６】
発明の概要
本発明者らは以前に、本発明者らが所有している他のベクターとは異なり、HSVは効果的に樹状細胞を形質導入し得ることを見出した(Coffinら、1998)が、毒性の効力や形質導入された樹状細胞の機能性能力を試験してはいなかった。本発明者らは現在までに、本来の野生型ウイルスに始まり、特定の細胞において複製を妨げる変異(非必須遺伝子の変異)または全ての細胞において複製を妨げる変異(必須遺伝子の変異)を有するウイルス、さらに必須遺伝子と非必須遺伝子の双方において欠失を組み合わせて有する変異体に至るまでの、多様なHSV変異体を試験した。本発明者らは、これらの多様な変異体の、遺伝子送達効率とそれらの示す毒性レベル(樹状細胞の細胞死として評価したもの)の双方において、注目すべき差異を見出した。
【０００７】
驚くべきことに、本発明者らは以下のことを見出した：(i)ICP34.5、VMW65、vhs、およびUL43において不活性化変異を有するウイルスは、試験した他の複製能を有するウイルス(以前に報告したウイルス(Coffinら、1998)を含む)および試験した他の多数の複製能を有しないウイルスと比較して、より低い毒性およびより高い樹状細胞に対する遺伝子送達効率を有している。これは非常に驚くべきことである。なぜなら、ICP34.5、VMW65、vhs、およびUL43は全て、通常は非必須遺伝子とみなされるからである。例えば、1つの必須遺伝子を欠失(ICP34.5、VMW65、vhsおよびICP27中の変異)している類似のウイルスは、このウイルスよりも格段に低い遺伝子送達効率を示す。さらに、試験した他のウイルス変異体とは異なり、標的細胞内で効果的な抗原のプロセシングが起こることを示す結果が実証された。このことは、形質導入された樹状細胞が、in vivoでの効果的な免疫応答を刺激し得る機能性能力を維持していることを示唆するものである。また本発明者らは、(ii)標的細胞中で正確な最少レベルでの前初期遺伝子のみが発現されるように不活性化された(それ故にHSV遺伝子発現は非常に低いレベルであることが一般に予測される)ウイルスが、単一の前初期遺伝子が除去された他の変異体とは異なり、同様の結果をもたらすことを見出した。
【０００８】
これらの結果は、HSVベクターを用いることにより、樹状細胞への効果的な遺伝子送達を比較的容易に行い得る一方で、抗原プロセシング能力を保持している細胞については、ウイルス内の特定の変異の組合せを慎重に選択しなければならないことを示している。このように、本発明は、感染した樹状細胞の抗原プロセシング能力に対して好ましくない影響を及ぼすことなく非常に効果的な遺伝子送達を提供する、樹状細胞のためのウイルスベクターを世界初で提供するものである。
【０００９】
このように、本発明は、感染細胞内の効果的な抗原のプロセシングを妨害せずに、樹状細胞に効果的に感染する能力を有する弱毒化ヘルペスウイルスを提供する。好ましくは、当該ウイルスは、ヒト単純ヘルペスウイルスである。より好ましくは、当該ウイルスは単純ヘルペスウイルスの、HSV1またはHSV2、またはそれらの相同性ウイルス株などである。
【００１０】
1つの実施形態(前述の実施形態(i))においては、本発明のヘルペスウイルスは、典型的には機能性UL43遺伝子および機能性vhs遺伝子(HSV株の場合)、または他のウイルス種における機能性等価物を欠失している。好ましくは、本発明のウイルスはさらに、機能性HSV ICP34.5遺伝子、または他のウイルス種の機能性等価物を欠失している。また本発明のウイルスはさらに、機能性VMW65遺伝子、または他のウイルス種の機能性等価物を（特に当該遺伝子の転写活性化活性を喪失させる変異により）欠失していてもよい。第2の実施形態(前述の実施形態(ii))においては、本発明のヘルペスウイルスは、細胞内における前初期遺伝子を最小にする変異を（ウイルス内での欠失は意図しないで）含むものである。かかるウイルスは、例えば、ICP27およびICP4をコードする遺伝子内に不活性化変異を有し、またvmw65コード遺伝子内にそのトランス活性化機能を除く不活性化変異(例えば、Aceら、1989またはSmileyら、1997にあるような、vmw65変異など)を有するものである。かかるウイルスはまた、個々の制御性の前初期遺伝子(ICP4、ICP27、ICP0およびICP22をコードするもの)それぞれに不活性化変異を、残りの非制御性の前初期遺伝子であるICP47を最適に不活性化しながら有する。
【００１１】
本発明の好ましい実施形態においては、本発明のウイルスは、機能性vhs遺伝子、機能性UL43遺伝子、機能性ICP34.5遺伝子および機能性VMW65遺伝子を欠失させる（該VMW65遺伝子の場合はその転写活性化活性を喪失させる変異による）変異を少なくとも4つの遺伝子内に有する弱毒化HSV株、または、少なくとも機能性ICP4遺伝子、機能性ICP27遺伝子、機能性ICP0遺伝子および機能性ICP22遺伝子を欠失させる変異を有する弱毒化HSV株のいずれかである。
【００１２】
本発明はさらに、異種遺伝子を担持するウイルスを提供する。異種遺伝子という用語には、ウイルスゲノム中に見出されないなんらかの遺伝子が含まれるものとする。異種遺伝子は、野生型の対立遺伝子のいずれかである場合もあり、また変異型遺伝子である場合もある。異種遺伝子は好ましくは、当該異種遺伝子を樹状細胞（好ましくはヒト樹状細胞）中で発現させる制御配列に機能しうる形で連結されている。このように、本発明のウイルスは、異種遺伝子をそれが発現される樹状細胞へ送達するために使用し得る。
【００１３】
異種遺伝子は、好ましくは治療用のポリペプチドをコードするものである。特に、異種遺伝子は、免疫応答を改変し得るポリペプチド(サイトカイン、または他の免疫調整ポリペプチドなど)をコードする。また異種遺伝子は、腫瘍細胞中には存在するが非腫瘍細胞中には存在しない抗原性ペプチド、または腫瘍細胞中においては非腫瘍細胞と比較してアップレギュレートされている抗原性ペプチドをコードしていてもよい。このことは、癌の治療において有用である。なぜなら、本発明の感染樹状細胞を用いて、宿主の免疫系を刺激して腫瘍特異的抗原または腫瘍選択的(prevalent)抗原と反応させることにより、腫瘍の減少または軽減をもたらし得るからである。このポリペプチド抗原は、好ましくは、細胞表面ポリペプチド、または細胞表面に移動するように(シグナルペプチドとの融合などにより)遺伝子操作されたポリペプチドである。この異種遺伝子はまた、寄生生物、ウイルス、細菌起源のポリペプチドを、病原体に宿主が感染する前か後のいずれかにおいて、宿主の免疫系を刺激してその病原体に対する免疫応答を引き起こすようにコードしている。異種遺伝子はまた、その疾患に対する免疫応答を生じさせることが有益であるような他の疾患(例えば、ハンチントン病、アルツハイマー病またはパーキンソン病などの神経変性疾患)に関連するタンパク質をコードしてもよい。
【００１４】
本発明はさらに、ヒトおよび動物の治療、特に免疫療法に用いるための異種遺伝子を担持するウイルスを提供する。例えば、かかるウイルスは、腫瘍、または寄生生物、細菌もしくはウイルス感染の治療または予防のために使用できる。
【００１５】
本発明のウイルスによって形質導入された樹状細胞もまた提供される。かかる細胞は、悪性疾患や、ウイルスまたは細菌病原体による感染などの疾患の、ex vivoでの治療方法のために使用できる。
【００１６】
発明の詳細な説明
A. ウイルス
本発明の弱毒化ウイルスは、感染した細胞内で起こる抗原のプロセシングを妨げずに効率的に樹状細胞に感染する能力を有する。本発明のウイルスは、感染多重度1で少なくとも40％の細胞に感染し、より好ましくは50％、60％、70％または80％の細胞に感染する能力を有する。本発明のウイルスを用いて得られる個々の細胞中における発現のレベル/効率は、発現されるポリペプチドおよびポリペプチドをコードする遺伝子に機能しうる形で連結された制御配列に依存して変化し得るが、一般に、少なくとも野生型ウイルスを用いて得られるものと同程度には効果的なものであろう。さらに、本発明のウイルスが感染した細胞に対して示す毒性は低い。好ましくは、感染後の細胞の生存率は、感染後1日目で少なくとも50％、より好ましくは感染後1日目で60％、70％、80％または90％である。
【００１７】
樹状細胞への効率的な感染と樹状細胞中での抗原のプロセシングを維持すると同時に毒性を減少させるために、本発明のウイルスでは、典型的には、機能性UL43遺伝子およびvhs遺伝子(HSVの場合)、または他のウイルス種におけるそれらに相同な遺伝子もしくは機能性等価物を欠失している。付加的な変異により(例えば、vmw65をコードする遺伝子においてタンパク質のトランス活性化活性を最少とするなどの変異を含めることにより、および/またはICP34.5をコードする遺伝子において不活性化変異を含めることにより)、ウイルスの毒性をさらに減少させることもできる。あるいは、または付加的には、ウイルスには、前初期遺伝子のウイルスからの発現を最少とする変異が、場合によっては、さらなる変異とともに含まれる。このように、本発明のウイルスは典型的は、ICP27、ICP4において変異され、またタンパク質のトランス活性化活性を最少とするvmw65に対する変異を有し、またはICP4、ICP27、ICP0、およびICP22をコードする遺伝子それぞれに関して変異を施されている。本発明のウイルスは、さらにICP47をコードする遺伝子に関しても変異され得る。
【００１８】
本発明を単純ヘルペスウイルスを使用して例示しているが、他のヘルペスウイルス科のウイルスを改変して、樹状細胞への効率的な感染と樹状細胞中の抗原のプロセシングを維持しながら毒性を減少させ得ることは理解されるであろう。特に、他のヘルペスウイルス種内に上記のHSV遺伝子(特にUL43およびvhs)の遺伝子相同体が存在する場合には、これらの相同体を改変し得る。他に、または付加的には、前初期遺伝子に対する変異を有するウイルス、または前初期遺伝子発現の減少をもたらす変異を有するウイルスが特に好ましい。用語「相同体」とは、相当するHSV遺伝子に対して配列相同性（アミノ酸配列または核酸配列のいずれか）を示す遺伝子である。典型的には、HSV遺伝子の相同体は、相当するHSV遺伝子に対してアミノ酸レベルで少なくとも15％、好ましくは少なくとも20％の同一性を有するであろう。例えば仮性狂犬病ウイルス、ブタヘルペスウイルスのprv43遺伝子はUL43に23％の同一性を有する(Powerら、1994)。
【００１９】
核酸およびタンパク質の相同性を測定する方法は、当技術分野でよく知られている。例えば、相同性の計算に使用できるBESTFITプログラムがUWGCG Packageによって提供されている(Devereuxら、(1984) Nucleic Acid Research 12:387-395)。
【００２０】
同様に、PILEUPアルゴリズムおよびBLASTアルゴリズムを使用しても、配列を列記することができる (例えば、Altschul S.F.(1993) J. Mol. Evol. 36:290-300;Altschul, S.F.ら、(1990)J. Mol. Biol. 215:403-10に記載されている)。BLAST分析を実行するためのプログラムは、National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)から公的に入手し得る。
【００２１】
かかるプログラムに関しては、多数の異なる設定が可能である。本発明では、デフォルトの設定を使用してもよい。
【００２２】
HSV遺伝子の相同体は多数の方法で同定し得る。例えば、他のウイルスから作製されたゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーを、HSV遺伝子の全体または一部を含むプローブを用いて、中程度〜高度のストリンジェンシー条件(例えば、約50℃〜約60℃、0.03M 塩化ナトリウムおよび0.03M クエン酸ナトリウム)の下で探索する方法がある。また、他にも、種相同体は、保存アミノ酸配列コードする変異体および相同体内の配列を標的とするプライマーを使用する縮重PCRを行って取得し得る。プライマーは1以上の縮重位置を含む。またプライマーは、公知の配列に対する単一配列プライマーを用いる配列のクローニングにおけるストリンジェンシー条件よりは低いストリンジェンシー条件で使用される(例えば、約40℃、0.03M 塩化ナトリウムおよび0.03M クエン酸ナトリウム)。
【００２３】
安全上の理由により、本発明のウイルスは、典型的には、標的細胞中では効果的な複製能を有しないように弱毒化される。弱毒化の目的で改変するウイルス領域を、（完全にまたは部分的に）除去するか、非機能性とするか、または他の配列(特に異種遺伝子配列)で置換することができる。弱毒化変異は、ウイルスベクターとして使用できる全てのウイルスのグループに関して既に公表されている。例えば、HSVは、ICP34.5内の、および/またはICP4やICP27などの必須遺伝子の変異により、無毒化し得る。
【００２４】
1. 単純ヘルペスウイルス
i ウイルス
本発明のウイルスが単純ヘルペスウイルスである場合には、該ウイルスは、例えば、HSV1株またはHSV2株、またはそれらの誘導体に由来するものであり、HSV1に由来するものが好ましい。誘導体には、HSV1株およびHSV2株に由来するDNAを含む相互型(inter-type)組換体が含まれる。誘導体は、好ましくは、HSV1またはHSV2のゲノムのいずれかに対して、本明細書に記載の方法による典型的な測定した場合、少なくとも70％の配列相同性、より好ましくは少なくとも80％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも90％または95％の相同性を有している。本発明のウイルスを取得するために使用し得る他の誘導体には、本発明のウイルスにおいて機能的に不活性化されることが望まれている遺伝子において、既に変異を有する株が含まれる。このような例として、いずれもICP34.5に変異を有する1716株(MacLeanら、1991)、R3616株およびR4009株(ChouおよびRoizman、1992)、およびR930株(Chouら、1994)、IPC4に変異を有するd120株(DeLucaら、1985)、ICP127に変異を有するd27-1株(RiceおよびKnipe、1990)、またはICP27とICP4との双方に変異を有するd92株(Samaniegoら、1995)が挙げられる。これらの株を使用すると、本発明の変異HSV株を作製するために必要な手順の数を減らすことができる。
【００２５】
本明細書で用いた様々なHSV遺伝子を記述する用語は、CoffinおよびLatchman、1996に記載の通りである。
【００２６】
ii. 補足細胞系
本発明の単純ヘルペスウイルスが、特定の機能性遺伝子(例えばICP4またはICP27をコードする遺伝子)を欠失している場合には、本発明のウイルスは、必須遺伝子を発現する細胞系において増殖させる。例えば、ウイルスが機能性ICP27遺伝子を欠失している場合には、ウイルスはV27細胞(RiceおよびKnipe、1990)、2-2細胞(Smithら、1992)、またはB130/2細胞(WO98/30707)において増殖できる(B130/2細胞が好ましい)。ウイルスが機能性ICP4遺伝子を欠失している場合には、ウイルスはICP4を発現する細胞系、例えばE5細胞(DeLucaら、1985)において増殖できる。ウイルスが機能性ICP4遺伝子と機能性ICP27遺伝子を欠失している場合には、ウイルスはICP4とICP27の双方を発現する細胞系 (E26細胞など；Samaniegoら、1995)において増殖できる。ウイルスがさらに機能性vmw65遺伝子を欠失している場合には、ウイルスはvmw65の非HSV相同体(ウマヘルペスウイルス遺伝子12またはウシヘルペスウイルス由来のBTIFなど)を含む細胞系において増殖できる。
【００２７】
ICP27発現細胞系は、哺乳動物細胞系（例えばVero細胞またはBHK細胞）に、これらの細胞中で発現され得る機能性HSV ICP27遺伝子を含むベクター(好ましくはプラスミドベクター)と選択マーカー(ネオマイシン耐性など)をコードするベクター(好ましくはプラスミドベクター)とを同時トランスフェクトすることにより作製できる。続いて選択マーカーを有するクローンをスクリーニングし、さらにどのクローンが機能性ICP27を有しているかを決定する。決定方法には、例えば、ICP27- HSV株の増殖をサポートする能力に基づいて、当業者によく知られた方法を用いて行う方法がある(RiceおよびKnipe、1990に記載の方法など)。
【００２８】
ICP27-変異HSV株を機能性ICP27を有する株へ逆転換させない細胞系は、上記の通り作製するものである。これにより、機能性ICP27遺伝子を含むベクターが、ICP27-変異ウイルス中に残存する配列にオーバーラップする(すなわち相同性を有する)配列を含まないことを確実にしている。
【００２９】
本発明のHSV株が、他の必須遺伝子(ICP4など)中に不活性化改変を有している場合には、補足細胞系は、ICP27に関して記載されたのと同じ方法で改変された必須遺伝子を補足する機能性HSV遺伝子を含むものとなる。例えば、ICP27およびICP4の双方において変異を含むHSV株の場合には、ICP27とICP4の双方を発現する細胞系(E26細胞など；Samaniegoら、1995)を使用する。他の必須遺伝子を発現するHSV株を、ICP27に関して記載されたのと同じように構築できる。
【００３０】
B. 突然変異誘発法
これまでに言及した多様なウイルス遺伝子を、当技術分野でよく知られたいくつかの技法により機能的に不活性化とし得る。例えばウイルスは、欠失、置換、または挿入により機能的に不活性とし得るが、好ましいものは欠失である。欠失により、遺伝子の一部または遺伝子全体を除去できる。例えば、僅か1つのヌクレオチドを欠失させたとしても、フレームシフトが起こる。しかしながら、より大規模に欠失させる、例えば、全コード領域および非コード領域の少なくとも25％、より好ましくは少なくとも50％を（または絶対数でいうと、少なくとも10ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも100ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも1000ヌクレオチド）欠失させることが好ましい。全体の遺伝子および隣接配列のいくつかを除去することが特に好ましい。挿入する配列には、下記の異種配列が含まれ得る。特に、異種遺伝子をICP27またはICP4中へ挿入することが好ましい。VMW65の場合には、VMW65は必須構造タンパク質をコードしているので遺伝子全体を欠失させるのではなく、VMW65がIE遺伝子の転写において活性化する能力を喪失させる(例えば、Aceら、1989またはSmileyら、1997に記載されているような)小規模の不活性化変異を行う。
【００３１】
ヘルペスウイルスにおいては、当業者によく知られた相同的組換え法により変異を生じさせる。例えば、HSVゲノムDNAを、相同性HSV配列に隣接した変異配列を含むベクター(好ましくはプラスミドベクター)と共にトランスフェクトする。変異配列は、いずれも日常的な技法により構築される欠失、挿入、または置換を含み得る。挿入物に、たとえば、α-ガラクトシダーゼ活性または蛍光などにより、組換えウイルスをスクリーニングするための選択マーカー、LacZまたはGFPなどを含めてもよい。
【００３２】
C. 異種遺伝子およびプロモーター
本発明のウイルスを改変し、異種遺伝子を担持するものとし得る。用語「異種遺伝子」とは、任意の遺伝子を包含するものである。異種遺伝子とは、典型的にはヘルペスウイルスのゲノム中に存在しない遺伝子のことであるが、ヘルペス遺伝子もまた、そのヘルペス遺伝子が本来結合しているウイルス制御配列に機能しうる形で連結していない場合には使用し得る。異種遺伝子は、野生型遺伝子の対立遺伝子変異体のいずれかであることもあり、また変異体遺伝子である場合もある。用語「遺伝子」とは、少なくとも転写はされ得る核酸配列を包含するものである。故に、mRNAをコードする配列、tRNA、rRNAはこの定義の範囲内である。しかしながら、本発明は、tRNAやrRNAではなくポリペプチドの発現に関するものである。mRNAをコードする配列は、場合によっては、翻訳されるコード配列に天然にまたは人為的に連結された、5’および/または3’の、転写されるが翻訳されない隣接配列の全てまたはいくつかを含む。該配列はさらに、任意で転写される配列に通常は連結される関連転写制御配列(転写停止シグナル、ポリアデニル化部位および下流エンハンサーエレメントなど)を含み得る。
【００３３】
異種遺伝子は、例えば、HSV配列に隣接した異種遺伝子を担持するプラスミドベクターを用いるHSV株の相同的組換えによってウイルスゲノム中に挿入できる。異種遺伝子は、当技術分野でよく知られたクローニング技術を用いて、ヘルペスウイルス配列を含む好適なプラスミドベクター中に導入できる。異種遺伝子は、挿入後もなおウイルスを増殖させ得る限り、ウイルスゲノム中の任意の位置に挿入させ得る。異種遺伝子を、必須遺伝子内に挿入することが好ましい。異種遺伝子は、ウイルスゲノム内の複数の部位へ挿入できる。
【００３４】
異種遺伝子の転写される配列は好ましくは、樹状細胞(好ましくは哺乳動物樹状細胞、より好ましくはヒト樹状細胞)中で当該異種遺伝子を発現させ得る制御配列に機能しうる形で連結されている。用語「機能しうる形で連結された」とは、前述の構成物を意図された様式で機能させ得る関係にあるように並置されていることを意味する。コード領域に「機能しうる形で連結された」制御配列とは、制御配列が適合し得る条件下でコード配列の発現が成されるように連結されているものである。
【００３５】
制御配列には、異種遺伝子の発現を可能とするプロモーターと転写終結シグナルが含まれる。プロモーターは、哺乳動物(好ましくはヒト樹状細胞)において機能し得るプロモーターの中から選択する。プロモーターは、真核生物遺伝子のプロモーター配列から誘導し得る。例えば、プロモーターは、内部で異種遺伝子を発現させようとしている細胞(好ましくは哺乳動物樹状細胞、より好ましくはヒト樹状細胞)のゲノムから誘導し得る。真核生物のプロモーターに関しては、それらは遍在的様式で機能するプロモーター(βアクチン、チューブリンのプロモーターなど)であってもよく、あるいは、組織特異的様式で機能するプロモーターであってもよい(ピルビン酸キナーゼ遺伝子のプロモーターなど)。またプロモーターは、特定の刺激に応答するプロモーターであってもよい(ステロイドホルモン受容体結合プロモーターなど)。ウイルスプロモーター(モロニーマウス白血病ウイルスの長い末端反復配列プロモーター(MMLV LTR)またはヘルペスウイルス遺伝子のプロモーターなど)も使用できる。
【００３６】
HSV LATプロモーター、およびLATプロモーター領域のエレメントを含むプロモーターが特に好ましい。なぜなら、潜伏期間中に異種遺伝子の長期発現を成し得る可能性があるからである。特に、それ自体ではプロモーターとして機能しないLAT P2領域から実質的になり、プロモーターと異種遺伝子とにこの順序で連結された発現カセットは特に好ましい。
【００３７】
用語「長期発現」とは、本発明の単純ヘルペスウイルスを感染させた細胞内で、該単純ヘルペスウイルスが潜伏期間に入った後にも、異種遺伝子を発現することを意味する。好ましくは、長期発現は、感染後少なくとも2週間、より好ましくは1または2ヶ月にわたるものであるが、さらにより好ましくは細胞の寿命にわたるものである。
【００３８】
発現カセットはさらに、前記HSV LAT P2領域にこの順序で機能しうる形で連結され、第1のプロモーターおよび第1の異種遺伝子とは反対の方向にある、第2のプロモーターおよび第2の異種遺伝子を含み得る。この場合、当該第2のプロモーターおよび第2の異種遺伝子は、前述の第1のプロモーターおよび第1の異種遺伝子と同じであっても異なっていてもよい。このように、1組のプロモーター/異種遺伝子構築物が単一のLAT P2領域に反対の方向で隣接することにより、同じかまたは異なるプロモーターによって駆動される、同じかまたは異なる異種遺伝子の組の長期発現が可能となる。さらに、第1の異種遺伝子の産物が、好適な生理的条件の下で第2の異種遺伝子発現を制御しても(またはその逆でも)よい。
【００３９】
発現カセット、および異種遺伝子と制御配列を含むその他の好適な構築物を、当技術分野の当業者に公知の日常的なクローニング技術を用いて作製できる(Sambrookら、1989, Molecular Cloning: a laboratory manual; Cold Spring Harbor Pressなどを参照されたい)。LAT P2領域を本明細書ではHSV株17+のHSV1ヌクレオチド118866-120219として定義する(GenBank HE1CG:PstI部位〜BstXI部位)。この領域には、領域の断片および誘導体(他のHSV1株、およびHSV2株の相同性領域を含む)であり、連結されたプロモーターに長期発現能を提供できるものが含まれるものとする。
【００４０】
プロモーターにとっては、異種遺伝子の発現レベルを細胞の寿命の間に制御し得るように誘導し得ることが有利であろう。「誘導し得る」とは、当該プロモーターを使用して得られる発現レベルを制御できることを意味する。例えば、好ましい実施形態においては、1以上の異種遺伝子がHSVゲノム中に挿入され、1つのプロモーターは、以前に報告されたtetリプレッサー/VP16転写活性化因子融合タンパク質に応答性であるプロモーターを含み(GossenおよびBujard、1992, Gossenら、1995)、発現を制御すべき異種遺伝子を駆動している。第2のプロモーターは、tetリプレッサー/VP16融合タンパク質の発現を駆動する強力なプロモーター(CMV IEプロモーターなど)を含んでいる。このように、この例では、第1の異種遺伝子の発現はテトラサイクリンの存在または不在に依存している。
【００４１】
さらに、これらのプロモーターはいずれも、エンハンサー配列などの更なる制御配列(HSV LAT領域の配列エレメントを含む)を加えることにより改変されていてもよい。2以上の上記の異なるプロモーターに由来する配列エレメント(MMLV LTR/LAT融合プロモーター(Lokensgardら、1994)、またはLAT領域のエレメントを含むプロモーター(上記参照)など)を含むキメラプロモーターもまた、使用できる。
【００４２】
異種遺伝子は、治療用のポリペプチドをコードする。例えば、特定の腫瘍に対する特異的な免疫応答を促進させるために、腫瘍抗原の発現を指令する本発明のウイルスで樹状細胞をトランスフェクトすることが望ましい。腫瘍抗原は腫瘍細胞に特異的であるか、または同じ型の非腫瘍細胞と比較して腫瘍細胞において、例えば抗原の発現のアップレギュレーションにより、より高いレベルで存在し得るものである。特に、腫瘍抗原は腫瘍細胞の表面に発現されること(細胞表面受容体または細胞接着タンパク質など)が好ましい。腫瘍抗原の例には、卵巣癌を含む多数の腫瘍において過剰発現されるMUC-1遺伝子産物(Gendlerら、1990)、子宮頸癌に関連するヒトパピローマウイルスタンパク質E6およびE7が含まれる。T-細胞応答を誘導する腫瘍抗原が特に好ましい。
【００４３】
異種遺伝子はまた、サイトカイン(例えば、α-、β-、γ-インターフェロン、IL-1、IL-2を含むインターロイキン、腫瘍壊死因子またはインスリン様成長因子IまたはII)などの、免疫応答を改変し得るポリペプチドをコードしてもよい。
【００４４】
異種遺伝子はまた、ワクチンとして使用するための抗原性ポリペプチドをコードしてもよい。好ましくは、このような抗原性ポリペプチドは、寄生生物、細菌またはウイルスなどの病原体生物から誘導される。このような抗原性ポリペプチドの例としては、C型肝炎ウイルス抗原、B型肝炎表面またはコア抗原、HIV抗原、マラリア抗原、百日咳毒素、コレラ毒素またはジフテリア毒素が挙げられる。
【００４５】
また異種遺伝子は、マーカー遺伝子(βガラクトシダーゼまたはグリーン蛍光タンパク質をコードするものなど)または遺伝子産物が他の遺伝子の発現を調節する遺伝子(上述のtetリプレッサー/VP16転写活性化因子融合タンパク質を含む転写制御因子など)を含んでもよい。
【００４６】
遺伝子治療および他の治療用用途においてもまた、複数の遺伝子の投与が必要となることが考えられる。複数の遺伝子の発現は、様々な症状の治療のために有益である。ヘルペスウイルスは、他のウイルスベクター系のようにパッケージング能力に制限が無いので、とりわけ好適である。このように、複数の異種遺伝子をゲノム内に収容できる。これを達成するには、例えば、少なくとも2つの方法がある。例えば、1以上の異種遺伝子および関連する制御配列を、特定のHSV株へ、ウイルスゲノム中の単一の部位へ、または複数の部位へのいずれかで導入できる。また、互いに逆方向で対面しているプロモーターの組(同じかまたは異なるプロモーター)を使用することもできる。これらのプロモーターはそれぞれ異種遺伝子(同じかまたは異なる異種遺伝子)の発現を上述のように駆動している。
【００４７】
D. 樹状細胞
樹状細胞を、多数の手段により単離/調製できる。例えば、それらを末梢血から直接精製することもでき、または、CD34+前駆体細胞を、例えば末梢血中へ動員した後でG-CSFで処理することにより、または骨髄から直接発生させ得る。末梢血から、付着性前駆体をGM-CSF/IL-4混合物で処理してもよく(Inabaら、1992)、また骨髄非付着性CD34+細胞をGM-CSFおよびTNF-αで処理してもよい(Cauxら、1992)。DCはヒトのボランティアの末梢血から日常的な方法（SallustoおよびLanzavecchia、1994と類似の方法）で、精製された末梢血の単核細胞(PBMC)を用いて、2時間付着性細胞をGM-CSFおよびIL-4で処理して調製できる。続いてこれらを、CD19+ B細胞およびCD3+、CD2+ T細胞がについてマグネチックビーズを用いて枯渇させる(Coffinら、1998)。他の方法もまた、樹状細胞を調製するために使用できる。
【００４８】
E. 治療用用途
本発明のウイルス、および本発明のウイルスに感染した樹状細胞を、治療方法において使用できる。特に、本発明のウイルス、および本発明のウイルスに感染して腫瘍抗原を発現する樹状細胞は、癌の治療において使用できる。特に、本発明のウイルス、および本発明のウイルスに感染した樹状細胞は、ヒトを含む哺乳動物中で様々な腫瘍(卵巣、子宮頚、および子宮内膜腫瘍および、乳癌、肺癌、膀胱癌および大腸癌などの癌)の増殖を阻止するために使用できる。本発明によりその増殖を阻害し得る他の新生物には、軟部組織肉腫および骨肉腫などの肉腫、ならびに白血病などの血液学的悪性疾患が含まれる。本発明のウイルス、および本発明のウイルスに感染して腫瘍抗原を発現する樹状細胞を用いて治療できる癌の具体的な例には、黒色腫、白血病、子宮頚癌および卵巣癌が含まれる。
【００４９】
本発明のウイルス、および本発明のウイルスに感染させた樹状細胞は、寄生生物、細菌またはウイルス感染などの病原体による感染症を治療または予防する方法においてh使用できる。この場合には、ウイルス/樹状細胞は、感染の前に投与して防御免疫応答を宿主細胞において刺激するために、または感染後に投与して感染と戦うための宿主免疫系を刺激するために使用できる。
【００５０】
F. 投与
このように、本発明のヘルペスウイルスは、治療用遺伝子を、かかる治療を要するヒトまたは動物へ送達するために使用できる。本発明のヘルペスウイルスを用いた治療用遺伝子の送達を、例えば、悪性疾患や病原体による感染を治療するために使用し得る。
【００５１】
治療を行う方法の1つは、上記の通り、治療用の遺伝子を本発明のヘルペスウイルスのゲノム中に挿入し、続いてその結果得られる組換えウイルスを製薬上許容し得る担体または希釈剤と組合わせ、医薬組成物を製造することを含んでなる。好適な担体および希釈剤には、等張生理食塩水、例えばリン酸緩衝化生理食塩水が含まれる。組成物は、非経口、筋内、静脈内、皮下または経皮投与のために製剤化することができる。
【００５２】
本発明のウイルスによる樹状細胞の感染は、当該ウイルスを含んでなる組成物を患者に投与することによりin vivoで実行できる。医薬組成物は、治療用遺伝子を含有するウイルスが、好適な領域において細胞中に取り込まれるような方法により投与される。投与されるウイルスの量は、104〜1010 pfu、好ましくは105〜108 pfu、より好ましくは約106〜107 pfuの範囲にある。注入の際には、典型的には10μl〜1ml、好ましくは100μl〜1mlの、製薬上許容し得る好適な担体または希釈剤中のウイルスが投与される。
【００５３】
他の方法は、樹状細胞を末梢血または骨髄から単離/精製し、本発明のウイルスを用いて細胞をin vitroで感染させることを含んでなる。続いて、形質導入された樹状細胞を、典型的には、患者に筋内、腹腔内、皮下もしくは静脈内注入で投与するか、または患者のリンパ節に直接注入して投与するが、リンパ節への直接注入が好ましい。典型的には104〜108 個の形質導入樹状細胞、好ましくは105〜107 個の形質導入樹状細胞、より好ましくは約106個の形質導入樹状細胞が患者に投与される。
【００５４】
記載した投与経路および用量は、単なるガイドとしてのものである。なぜなら、熟練した開業医は、最適である投与経路および用量を、いずれの特定の患者のためにも、例えば患者の年齢、体重および症状に応じて容易に決定し得るからである。
【００５５】
本発明を、以下の実施例を参照しながら記述するが、これらは例示のみを意図したものであり、限定するものではない。
【００５６】
実施例
材料および方法
ウイルス株の構築および増殖
全てのウイルス株はHSV1株17+に由来するものであり、HSV1株17+のヌクレオチド配列はGenBankに寄託されている(受託番号HE1CG)。全ての株をBHK C-21細胞(ECACC番号8501143)を用いて作製し、増殖させたが、株17+/27-/pR20および株1764/27-/pR20.5/vhsはB130/2細胞(HSV1 ICP27遺伝子で安定にトランスフェクトしたBHK細胞)上で増殖させ、また株1764/27-4-/pR20.5はHSV1 ICP27、ICP4をコードする遺伝子およびウマヘルペスウイルス遺伝子12を用いて安定にトランスフェクトした細胞を用いて増殖させた。EHV遺伝子12はHSV vmw65のEHV相同体であり、本発明者らは該遺伝子が細胞系に含まれている場合にはvmw65変異に伴う増殖欠損を補償し得ることを見出したが、ウイルス増殖のために使用する細胞に未改変HSV vmw65が含まれる場合に期待されるようには、EHV遺伝子12タンパク質産物は結果として得られるHSVビリオン中にパッケージングされない。かかる細胞は以下のようにして作製する：BHK細胞（37℃／5％CO2にて、DMEM+10％FCS[いずれもGibcoより入手]中で増殖させたもの）を、CMVプロモーターおよびBGHpA配列(pcDNA3/E)の制御下にあるEHV遺伝子12（Lewis JBら、(1997) Virology,230,369-375）を含むプラスミド、ならびにICP27(pSG130BS[Sekulovichら、1988])をコードするプラスミドを用いて、10cmプレート中でGormanの方法(1985)によりトランスフェクトした。ネオマイシンで選択した後、ネオマイシン耐性クローンを選んで、ICP27およびvmw65について変異させたHSVの増殖を支持するその能力について評価し、許容性の高いクローンを選択した。ICP24を導入する為に、フレオマイシン(phleomycin)／ネオマイシン耐性細胞系を、EHV遺伝子12およびICP27を含有するこれらのBHK細胞から作製した。前記細胞系において、ICP4はデキサメタゾン誘導性MMTVプロモーターおよびSV40ポリAにより(プラスミドpMAMzeo/ICP4を用いて)駆動される。pMAMzeo/ICP4を構築するために、プラスミドpMAMneo(Invitrogen)中のネオマイシン耐性遺伝子をBamHI断片として切り出して、pVgRXR(Invitrogen)からのBamHI断片としてのフレオマイシン耐性遺伝子と置き換えた。次いで、ICP4コード領域(HSV1 nts 127,167〜131,187 [MseI-BstEII]GenBANK file he1cg)を、XhoI部位にMMTVプロモーターの後に続いて挿入した。次いで、ICP27/EHV遺伝子12含有細胞にトランスフェクトし、さらにプレオマイシンで選択(Zeocon;Cayla,Toulouse,France)した後に、ICP4,ICP27およびvmw65について変異させたHSVの増殖に対して許容性が高いクローンを選択した。
【００５７】
VMW65に変異を有するウイルスについては、ウイルス増殖のために使用する培地に3mMのヘキサメチレン−ビスアセトアミド(HMBA)を含ませた。
【００５８】
(i)17+/pR20.5/UL43
RSV/lacZ/pA配列およびCMV/GFP/pA配列からなるプラスミドpR20.5由来のカセットであって、前記２つの配列が正反対の位置で背中合わせの方向に配置されており、かつHSV LAT領域配列(nts 118,866-120,219)により隔てられている前記カセットを、標準的な方法により、HSV1株17+の精製ゲノムDNAとの相同的組換えによりUL43座に挿入した。まず最初にpR20.5カセットを、UL43隣接領域(Coffinら、1996)を含有するプラスミドの固有NsiI部位で挿入し、プラスミドpR20.5/43を作製した。この20.5カセットは、そのpGEM5(Promega)プラスミド骨格からSrfIを用いて切り出すことができる。何故なら、SrfIをコードするオリゴヌクレオチドが予め前記カセットの両側に挿入されているからである。プラスミドpR20.5を構築するために、RSVプロモーターをpRc/RSV(Invitrogen)から切り出し、lacZ/pAをpCH110 (Pharmacia)から切り出し、CMV/pAをpcDNA3(Invitrogen)から切り出し、またGFPをpEGFP-N1(Clontech)から切り出した。
【００５９】
(ii)17+/pR20.5/US5
pR20.5カセットを、US5隣接領域(プラスミドpΔUS5)に挿入することによりプラスミドpR20.5/US5を作製し、続いてHSV1株17+の精製ゲノムDNAと相同的組換えしてBHK細胞中に入れることによりHSV1のUS5座に挿入して、ウイルス株17+/pR20.5/US5を得た。プラスミドpΔUS5は、HSV1由来のUS5コード領域を含むBamHI-EcoNI断片(nts 136,289-131,328)をプラスミドpAT153中にクローニングすることにより調製した。pR20.5をUS5遺伝子のヌクレオチド137,945位で固有SacI部位に挿入した。
【００６０】
(iii)17+/27-/pR20
精製HSV株17+DNAへの相同的組換えのために、プラスミドpR20を使用した。プラスミドpR20は、ICP27隣接領域(pACYC184[NBL]中のHSV nts 11095〜113273およびnts 116869〜118439により、この２つの断片を連結する固有のMIuI部位での挿入が可能となる)に挿入されたLAT P2(HSV1 nts 118866〜120219)/CMV/lacZカセットを含有する。LacZを発現するプラークを、B130/2細胞を用いて精製した。
【００６１】
(iv)1764/pR20.5/UL43
プラスミドpR20.5/43を、精製HSV株1764 DNAへの相同的組換え(Coffinら、1996)ならびにGFPおよびLacZ発現プラークのプラーク精製のために使用した。HSV株1764は、ICP34.5の両方のコピーが欠失しており、かつVMW65の遺伝子(Aceら、1989)に不活性化変異を有する株17+である。
【００６２】
(v)1764/pR20.5/US5
プラスミドpR20.5/5を、精製HSV株1764 DNAへの相同的組換えならびにGFPおよびLacZ発現プラークのプラーク精製のために使用した。
【００６３】
(vi)in1814/pR15
プラスミドpR15を、株in1814のビリオン宿主シャットオフ(shutoff)タンパク質(UL41)の遺伝子(Aceら、1989)への相同的組換えのために使用した。プラスミドpR15は、UL41遺伝子中の固有NruI部位でHSV LAT/MMLV LTRキメラプロモーター(Lokensgardら、[1994]により報告されているものと本質的に同一である)により駆動されるLacZ遺伝子が挿入されているvhs隣接領域を含有する。LacZ発現プラスミドを精製した。
【００６４】
(vii)1764/pR15
プラスミドpR15を、精製HSV株1764 DNAへの相同的組換えに使用し、LacZ発現プラークをプラーク精製した。
【００６５】
(viii)1764/27-/pR20.5/vhs
pR20.5カセットを固有NruI部位でvhs隣接領域に挿入し、得られたプラスミド(pR20.5/vhs)を精製HSV株1764/27-DNAへの相同的組換えのために使用した。lacZおよびGFPの両方を発現するプラークを、B130/2細胞を用いて精製した。株1764/27-は、lacZ遺伝子を取り除くために相同的組換えにより株1764/27-/pR20(プラスミドpR20のHSV株1764 DNA中への相同的組換えおよびlacZ発現プラークの選択により作製したもの)から作製したものであり、ICP27座周辺のヌクレオチド113322〜115743が欠失している。
【００６６】
(ix)1764/pR15/MSVGFP/UL43
MSV LTRプロモーター／GFPカセットを固有のNsiI部位でUL43隣接領域に挿入し、プラスミドpMSVGFP/43を得た。次いで、pMSVGFP/43を、精製HSV株1764/pR15ゲノムDNAへの相同的組換えのために使用し、lacZおよびGFPの両方を発現するプラークを精製した。
【００６７】
(x)1764/27-/4-/pR20.5
ウイルス株1764/27-/4-/pR20.5は、GFP(E-GFP;Clontech)およびlacZ(それぞれCMVおよびRSVプロモーターによって駆動され、背中合わせの向きでHSV1 LAT配列[PstI〜BstXI:nts 118,866〜120,219{PstI〜BstXI}GenBank file he1cg]により隔てられた状態で配置されている)からなるカセットをICP4隣接領域(HSV1 nts 123,459〜126,774[Sau3aI〜Sau3aI]および131,730〜134,792[SphI〜KpnI]であり、その内nts 124,945〜125,723[NotI〜NotI;ICP34.5をコードする]が欠失しており、プラスミドpDICP4中の固有XbaIおよびSalI部位により隔てられている)に挿入し、さらにICP27およびICP4の両方を補完するB4/27細胞を用いるウイルス株1764/27-(前述)への相同的組換えにより構築した。X-gal染色／緑色蛍光プラークを選択し、さらに精製した。pSG130BS、プラスミドp4/2(ICP4コード領域、プロモーター領域およびポリA領域をコードする)およびpMAMneo(Invitrogen)をBHK細胞中に共トランスフェクトすることにより、細胞系B4/27を調製した。次いで、ネオマイシン耐性クローンを選択した。
【００６８】
実施例１： HSV ベクターを用いて遺伝子を樹状細胞へ効率的に送達することが出来る
これらの実験では、HSVが樹状細胞に感染して該細胞へ遺伝子を送達することができるか否かを、本質的に野生型のウイルスを用いて確認することを目的とした。0.1〜10の感染多重度(MOI)を使用した。ここでは、各場合において、1×105個の樹状細胞を穏やかにペレット化し、DMEM中約100μlのウイルス懸濁液に再懸濁し、37℃で1時間インキュベートし、その後2 mlのRPMI/10％FCS＋100 ng/mlのGM-CSF、50 ng/mlのIL-4を含む24ウェルプレートに移すことにより、前記樹状細胞に感染させた。次いで、これらのプレートを、以後の実験中37℃／5％CO2下にてインキュベートした。pR20.5カセットの挿入により各々異なる遺伝子(UL43またはUS5)について変異が生じているウイルス17+/pR20.5/UL43および17+/pR20.5/US5をこれらの実験に使用した。UL43およびUS5はいずれも、培養におけるHSVの増殖にとって必須ではなく、またマウスモデルでのin vivo感染における感染キネティクスには影響を及ぼさないものとして以前に同定されている。感染後24時間、蛍光顕微鏡検査法によりGFP陽性細胞を計測することにより、遺伝子送達効率を評価した。下記表１に示す結果には、HSVが樹状細胞に遺伝子を効率的に送達し得ることが示されている。
【００６９】
結果
【表１】
実施例１で観察された効率的な遺伝子送達がウイルスの溶菌性複製によるものかどうかを調べるために、増殖曲線を作製した。ここで樹状細胞は実施例１と同様に0.1〜10の範囲のMOIで感染させ、ウイルス増殖を時間に関して定量した。24時間間隔で培養培地のサンプルをBHK細胞(HSVの増殖に対して許容性)上に滴下し、プラークの数を計測した。
【００７０】
結果
【表２】
【００７１】
実施例３：異なる HSV 変異体は樹状細胞において異なるレベルの遺伝子送達効率および毒性を示す
前述のウイルス株(i)〜(x)を使用して、実施例１と同様に0.1〜10の範囲のMOIにて樹状細胞に感染させた。時々、サンプルを２回ずつ(２×培養物100μl)採取し、試験に用いている特定のウイルス中の挿入物の性質に応じて、一方のサンプルをGFP発現(蛍光顕微鏡)および／またはX-galを用いる染色について観察した。X-galを用いる染色は、サンプルを穏やかにペレット化し、固定液(0.8％グルタルアルデヒドで10分)およびその後はX-gal緩衝液(Coffinら[1996]に記載されている通り)中に再懸濁し、37℃で2時間インキュベートすることにより実施した。もう一方のサンプルをトリパンブルーで染色し(生存細胞は染色を排除する)、染色されなかった細胞の数を、元の培養物中の細胞数の割合として計測した。実験の個々のセットにそれぞれにおいては、セットを２回ずつ繰り返し、また通常は３種のウイルスを同時に試験した。ウイルス(i)を内部対照として用いることにより樹状細胞調製物間のいずれの変動も考慮した。MOI=1についての結果を示す。
【００７２】
結果
【表３】
【００７３】
Ｚ ：実施例５を参照されたい
ＮＤ：測定せず
ウイルス(材料および方法の項を参照されたい)：(i) 17+pR20.5/UL43、(ii) 17+/pR20.5/US5、(iii) 17+/27-/pR20、(iv) 1764/pR20.5/UL43、(v) 1764/pR20.5/US5、(vi) in1814/pR15、(vii) 1764/pR15、(viii) 1764/27-/pR20.5/vhs、(ix) 1764/pR15/MSVGFP/UL43、(x) 1764/27-/4-/pR20.5。
【００７４】
これらの結果から、遺伝子欠失の異なる組み合わせにより、遺伝子送達効率と毒性の無さとの種々の組み合わせを有するウイルスが提供されることが示された。また、これらのウイルスの中には元のウイルス(i)および(ii)と比較した場合に一方または両方の特性が改善されているものもあれば、遺伝子送達効率または細胞生存率のいずれかが低減されているものもあることが示された。ある必須の前初期遺伝子(ICP27)を取り除くことで、明らかに最小限の毒性を有するが、遺伝子送達効率がかなり低減されているウイルスが生じるように思われる。各遺伝子を個々に不活性化させるとin vivoでのビルレンスが低減することが以前に示されている(UL43以外)、不活性化された非必須遺伝子(ICP34.5、VMW65、vhsおよびUL43)の組み合わせを有するウイルスは、最適な組み合わせの遺伝子送達効率(少なくともGFPについては、実施例４を参照されたい)および毒性の欠損を付与することが見出されており、この遺伝子導入効率は試験した他のいずれのウイルスの遺伝子導入効率よりもかなり大きい。しかしながら、前記同様に最小限の毒性を有するウイルス(x)は、高レベルのGFPおよびlacZ RNA発現(後述参照)を与えるが、RNAレベルの点でウイルス(ix)と同程度であっても、蛍光により検出され得るGFPはより少ないことが示された。抗HSV ICP27, ICP4, ICP0, ICP22およびICP47抗体を用いてのウェスタンブロットにより、ウイルスは該ウイルスの欠損（すなわち、ICP27、ICP4およびvmw65における突然変異）を補完しない細胞上ではどの前初期遺伝子も非常に低いレベルでしか発現しないことが以前に示された。
【００７５】
実施例４： UL43 、 ICP34.5 、 vhs および VMW65 に不活性化突然変異を有する HSV により、送達された抗原の効率的なタンパク質分解プロセシングが形質導入した樹状細胞内で生じていることを示す結果が得られる
UL43、ICP34.5、vhsおよびVMW65を欠失させたウイルスはGFPの送達効率が高かった。その一方で、LacZ活性は多くの細胞で存在したが、感染後24時間では、X-gal染色による検出限界程度の非常に低いレベルでしか見られなかった。このことは、lacZおよびGFPの両方が細胞中で効率的に産生されたが、見かけのlacZ活性は、完全に機能性である樹状細胞について予想された通り、該lacZ抗原の効率的なタンパク質分解プロセシングにより低減されたという可能性を提起する。lacZ遺伝子は、樹状細胞に強力なX-gal染色を付与する他のウイルス内のプロモーターと同一のプロモーターから転写される。従って、lacZのプロセシングが細胞内で生じる場合、lacZ mRNAおよびGFP mRNAの両方をノーザンブロッティングにより相対的に同レベルで容易に検出可能であるだろうが、ウェスタンブロッティングによるlacZタンパク質のレベルは著しく減少しているだろう。
【００７６】
MOIを１として17+/pR20.5/UL43または1764/pR15/MSVGFP/UL43のいずれかを感染させた樹状細胞由来のRNAおよびタンパク質(各々の場合、1×105個の細胞／レーンから抽出した)を用いて、ノーザンブロットおよびウェスタンブロットを実施した。次いでウェスタンブロットを、抗LacZ抗体(Promega)または抗GFP抗体(Quantum)のいずれかを用いてプローブした。ノーザンブロットはLacZ遺伝子(pCH110[Pharmacia]からHindIIIおよびBamHIを用いて切り出した)またはGFP遺伝子(pEGFP-N1[Clontech]からNotIおよびHindIIIを用いて切り出した)を用いてプローブした。ノーザンおよびウェスタンブロットは、放射性(ノーザンブロット)または非放射性(ウェスタンブロット；ECL、Amersham)手段による標準的な技法により実施した。
【００７７】
結果
ウェスタンブロットにより以下のことが示された：
(i)17+/pR20.5/UL43に感染した樹状細胞におけるlacZおよびGFPの効率的な検出。各場合について、予想された分子量の部位で単一の規定されたバンドが、やはり肉眼で観察できるいくつかのより小さな弱いバンドと共に確認された。
【００７８】
(ii)X-gal染色について予測されたように、GFPが1764/pR15/MSV/GFP/UL43を用いて容易に検出される一方で、予想分子量部位でのlacZタンパク質のレベルは有意に減少していた。
【００７９】
ノーザンブロットは、細胞が17+/pR20.5/UL43または1764/pR15/MSVGFP/UL43のいずれに感染していようと、いずれの場合においても予測された大きさの強力な規定されたバンドを示した。
【００８０】
これらの結果は、1764/pR15/MSVGFP/UL43および17+/pR20.5/UL43の両方に感染した後にlacZ mRNAが樹状細胞で効率的に産生されるにもかかわらず、1764/pR15/MSVGFP/UL43の場合はこのRNAが翻訳されないか、またはlacZタンパク質が翻訳後に急速に分解されるために、ウェスタンブロッティングにより検出できる全長タンパク質のレベルが有意に低下することを実証している。抗原プロセシングにおける樹状細胞の役割を考慮すれば、そのような送達された抗原が効率的な様式でプロセシングされると仮定すると、このことはと予想されるので、後者はかかるケースの1つであることが考えられる。そして、そのような効率的な抗原プロセシングは、強力なX-gal染色が各場合において見られる試験した他の変異体(後述の実施例５で使用したもの以外)に関しては起こらない。従って、ウイルスにより送達された抗原の、樹状細胞におけるプロセシングのためには、送達のために使用するウイルス変異体の的確な選択を注意深く行なわなくてはならない。
【００８１】
実施例５ 最少量のみの前初期遺伝子発現が可能である HSV によっても、効率的で、低毒性の樹状細胞への遺伝子送達がなされ、形質導入樹状細胞において送達された抗原のプロセシングが起きることを示す結果が得られる
上記の実施例４と同様に、比較のためのウエスタンおよびRNAブロット(本実施例においては、RNAに関してはスロットブロットを用いた)を行った。17+/pR20.5/UL43、1764/pR15/MSVGFP/UL43、または1764/27-/4-/pR20.5を感染させた樹状細胞の抽出物中のLacZおよびGFPタンパク質およびRNAレベルを比較した。
【００８２】
結果
この実験の結果では、1764/27-4-/pR20.5を除いては実施例４と同様であった。本実施例においては、GFPおよびlacZ RNAのレベルは、17+/pR20.5/UL43、および1764/pR15/MSVGFP/UL43感染細胞について同程度に検出された一方で、比較的低レベルのGFPがウエスタンブロットにより検出された(17+/pR20.5/UL43、または1764/pR15/MSVGFP/UL43と比較すると格段に少ないものであった)。このように、1764/27-/4-/pR20.5の場合には、lacZとGFPタンパク質の双方が低レベル(実施例４において以前みられた、1764/pR15/MSVGFP/UL43についてのlacZタンパク質レベルよりも僅かに低いというものではなかった)で検出された(実施例４および５において試験された全てのウイルスに関して同程度であったlacZおよびGFP特異的RNAの存在量から期待されるよりも低いレベルであった）。この結果は、試験された他のウイルスとは異なり、1764/27-/4-/pR20.5についての遺伝子送達に続いて、lacZとGFPの双方が、機能性樹状細胞において期待され得るようなタンパク分解プロセシングを経ていることを示すものである。この結果はさらに、1764/pR15/MSVGFP/UL43を用いた遺伝子送達に続いてもたらされるものを超えて上位にある、さらなる機能性を示唆する。
【００８３】
参考文献
Claims (16)
- 感染細胞中で起こる抗原のプロセシングを妨げることなく樹状細胞へ効果的に感染し得る弱毒化1型または2型単純ヘルペスウイルスであって、機能性UL43遺伝子および機能性vhs遺伝子を欠失している前記ウイルス。
- ICP47をコードする機能性遺伝子をさらに欠失している請求項１に記載のウイルス。
- 機能性ICP34.5遺伝子をさらに欠失している、請求項１または２に記載のウイルス。
- 機能性UL43遺伝子、機能性vhs遺伝子、機能性ICP47遺伝子および機能性ICP34.5遺伝子を欠失している、請求項１〜３のいずれか１項に記載のウイルス。
- 機能性VMW65遺伝子を、該遺伝子内の転写活性化活性を破壊する該遺伝子の変異により欠失している、請求項１〜４のいずれか１項に記載のウイルス。
- ICP0、ICP4、ICP22、およびICP27をコードする遺伝子から選択される少なくとも1つの機能性前初期遺伝子を欠失している請求項１〜５のいずれか１項に記載のウイルス。
- ICP22をコードする機能性遺伝子を欠失している、請求項６に記載のウイルス。
- 異種遺伝子を含んでなる請求項１〜７のいずれか１項に記載のウイルス。
- 前記異種遺伝子が、非腫瘍細胞と比較して腫瘍細胞中もしくは腫瘍細胞表面上で発現レベルが増大するポリペプチド；または非腫瘍細胞中には存在しないが腫瘍細胞中もしくは腫瘍細胞表面上に存在するポリペプチド；または免疫応答を改変し得るポリペプチド；をコードする、請求項８に記載のウイルス。
- 前記異種遺伝子が、寄生生物、ウイルスまたは細菌起源のポリペプチドをコードする、請求項８に記載のウイルス。
- 前記ウイルス起源のポリペプチドが、ヘルペスウイルス由来である、請求項１０に記載のウイルス。
- 前記異種遺伝子が腫瘍抗原をコードする、請求項８または９に記載のウイルス。
- １より多くの異種遺伝子を含む、請求項８〜１２のいずれか１項に記載のウイルス。
- 請求項１〜１３のいずれか１項に記載のウイルスに感染した樹状細胞。
- ヒト樹状細胞である、請求項１４記載の樹状細胞。
- in vitroで樹状細胞を請求項１〜１３のいずれか１項に記載のウイルスに感染させることを含んでなる、請求項１４または１５記載の細胞の製造方法。
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