CN105121636A - 非复制型病毒衍生颗粒及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文中描述了缺乏在细胞之间扩散的能力并对永生化细胞具有向性的非复制型弹状病毒衍生颗粒。所述非复制型弹状病毒衍生颗粒可具有对永生化细胞的溶细胞向性。还描述了缺乏在细胞之间扩散的能力但具有先天性和/或适应性免疫刺激特性的非复制型弹状病毒衍生颗粒。

Description

非复制型病毒衍生颗粒及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2012年12月21日提交的美国临时专利申请No.61/740,856和于2013年6月14日提交的美国临时专利申请No.61/835,310的优先权权益，其通过引用整体并入文本。
技术领域
本公开内容总体上涉及非复制型病毒衍生颗粒(non-replicatingvirus-derivedparticle)及其作为抗癌剂的用途。
背景技术
以下背景讨论并不暗示或承认下文所述的任何内容在任何国家中是现有技术或本领域技术人员知识的一部分。
已通过减毒突变或缺失改造了溶瘤病毒(oncolyticvirus，OV)，其允许病毒仅在与免疫应答受损或代谢活动增强(肿瘤发生的两个关键特征)相关的细胞中复制。目前，先进的溶瘤治疗剂的实例包括单纯疱疹病毒(HerpesSimplexVirus)OncoVEXGM-CSF和痘苗病毒(JX594)。迄今为止，OV领域的主要焦点一直是开发活病毒在局部肿瘤环境中具有优先复制/扩散能力的平台。
目前，正在研究弹状病毒(Rhabdovirusvirus，RV)(例如水疱性口炎病毒(vesicularstomatitisvirus，VSV)和马拉巴(Maraba)作为抗癌治疗剂。在肿瘤中，不受限制的代谢活动和受损的抗病毒程序使得病毒能够增殖。由于倾向于病毒介导的细胞凋亡，肿瘤对RV治疗的敏感性进一步增强。
在弹状病毒领域中，迄今开发的溶瘤平台利用其中病毒在肿瘤细胞之间扩散的具有复制能力的病毒。实际上，描述使用活的具有复制/表达能力的弹状病毒作为癌症直接病毒治疗的报道通常将其效力与其中未观察到可测量的效力的非复制型/非表达型病毒对照进行比较。在这些报道中，推断弹状病毒基因组的复制和/或表达是肿瘤细胞毒性和治疗效力的关键且必需的要素。
这些之前的研究缺少溶瘤作用反映在用于破坏病毒基因组复制和/或表达的方法以及所使用的病毒颗粒数目。实际上，当使用这些先前的方法破坏病毒基因组复制和/表达时，未观察到病毒的生物活性。此外，在这些研究中，非复制型病毒对照以与其活病毒对应物相同的剂量而非更高的剂量施用以确保每个细胞都遇到非复制型颗粒。
作为替代且优选更有效地，期望治疗和治愈大多数癌症形式的方法。例如，患有急性成淋巴细胞白血病或急性髓细胞白血病的大多数成年患者的结果依然不佳。这部分地归因于这些疾病的显著的免疫受损性质。对于少数患者而言，抗肿瘤免疫应答通过在于清髓性预处理(myeloablativeconditioning)后进行同种异体干细胞移植而得以部分地恢复。这种治疗具有潜在的治愈性，但与频繁的不良事件和显著的治疗相关死亡率有关。对于很多患有慢性期慢性髓细胞白血病(chronicmyeloidleukemia，CML)的患者而言，靶向酪氨酸激酶抑制剂(tyrosinekinaseinhibitor，TKI)治疗提供了优异的疾病控制。然而，当发展到出现急性白血病性原始细胞危象(blastcrisis)时，由于多药抗性的出现和这种形式的顽固性白血病的快速动力学，存在非常有限的治疗选择。
因此，需要特别用于免疫受损患者的作为替代的抗癌剂。所述抗癌剂凭借其设计和组分将优选能够解决目前尚未满足的临床需求和/或克服至少一些上文所讨论的问题。
发明概述
以下概述旨在向读者介绍本文中所述的一个或更多个发明，并非旨在对他们中的任何一个进行限定。发明可存在于本文件中任何部分所述的特征的任意组合中。
尽管一直在寻求治疗多种肿瘤类型的活OV策略，但是特别地其在造血系统恶性肿瘤中的应用因若干因素而变得复杂。病毒体的产生有限和在白血病细胞间的扩散降低要求高剂量的病毒治疗来克服这些低效性。然而，在正常组织中不受控制的活病毒扩散和脱靶作用使这种方法的安全性受损，特别是在免疫抑制患者中。
与使用活病毒相关的问题包括：1)安全性，其依赖于活弹状病毒只在病变肿瘤组织中扩散而不干扰健康组织的能力；2)低剂量施用，因为向患者引入活的可扩散病毒需要施用相对低剂量的这些活病毒剂以确保安全性；3)从肿瘤向活病毒的免疫转移，其有效地降低抗肿瘤免疫应答的效力；和4)与野生型病毒相比，设计有针对肿瘤之倾向的经改造活病毒具有受损的产生能力，并因此从制备方面来看，制剂效率和生产成本是次最佳的。
先前已表明，用被改造成缺失糖蛋白基因(阻止最后的病毒体装配和扩散)的VSV(VSV△G)进行瘤内注射引起抗肿瘤免疫应答。然而，用VSV△G治疗不能使散布的肿瘤体发生显著减少，这部分地归因于不能制备和递送治疗有效的剂量。
作者知晓没有报道详述非复制和非表达型弹状病毒衍生平台作为抗癌治疗剂的用途。本公开内容的非复制型病毒衍生颗粒(non-replicatingvirus-derivedparticle，NVRP)，特别是非复制型弹状病毒衍生颗粒(non-replicatingrhabdovirus-derivedparticle，NRRP)是被修饰以缺乏在细胞之间扩散的能力的野生型病毒颗粒。一旦被改造，非复制型病毒衍生颗粒(NVRP)就不能维持病毒体复制。
NVRP的独特之处在于其保留对永生化细胞的向性(tropism)，例如溶细胞向性。这意味着NVRP将优先在永生化细胞(例如肿瘤细胞或癌细胞以及经转化的永生化细胞)中诱导细胞死亡。NVRP的特别实例对永生化细胞具有先天性和/或适应性免疫刺激特性。
在一方面，本公开内容描述了一种非复制型弹状病毒衍生颗粒，其缺乏在细胞之间扩散的能力但对永生化细胞具有向性。所述向性可以是溶细胞向性。所述非复制型弹状病毒衍生颗粒可具有对永生化细胞的先天性或适应性免疫刺激特性。
在另一方面，本公开内容提供了非复制型弹状病毒衍生颗粒治疗过度增殖细胞群或癌细胞群的用途。所述过度增殖细胞群优选具有造血性，并且优选是白血病细胞。所述过度增殖细胞群可以是实体瘤细胞。
在又一方面，本公开内容描述了一种治疗具有过度增殖细胞群或癌细胞群的患者的方法。所述方法包括向所述患者施用非复制型病毒衍生颗粒。所述过度增殖细胞群可优选具有造血性，优选是白血病细胞。过度增殖细胞群可以是实体瘤细胞。
本领域的普通技术人员在阅读下文中结合附图对本发明一些特定实施方案的描述后，本公开内容的其他方面和特征将变得明显。
附图简述
现在，将参考附图仅作为示例对本公开内容的一些实施方案进行描述。
图1A是显示UV剂量对Vero和HDFN细胞之NRRP介导的细胞毒性的影响的图。在UV-诱导的NRRP产生之后没有检测到GFP信号。在感染后72小时，使用刃天青(resazurin)测定对生存力进行量化。将该实验的MOI设定为100个颗粒/细胞。误差条表示三个平行实验之间的标准差。
图1B是显示MOI对Vero和HDFN细胞中NRRP诱导的细胞毒性的影响的图，如作为函数MOI的生存力所示。在感染后72小时，使用刃天青测定对生存力进行量化。误差条表示三个平行实验之间的标准差。
图2A是通过于感染后或处理后24小时和72小时对经PBS、活VSV-GFP或NRRP处理的Vero细胞拍摄的荧光和亮视野显微图像显示Vero永生化细胞中的NRRP细胞毒性的图像组。将这些试验中所使用的感染复数(multiplicityofinfection，MOI)设定为100个颗粒/细胞。
图2B是显示通过在处理后72小时对细胞生存力进行刃天青量化的NRRP细胞毒性的图。误差条表示三个平行实验之间的标准差。
图2C是显示所产生的病毒滴度的图。NAN指“非数”，此时未检测到病毒体。
图3A是经PBS、活马拉巴病毒和马拉巴病毒衍生NRRP处理的白血病细胞(L1210)和Vero细胞的荧光显微图像组(4X)。图像拍摄于处理后24小时。
图3B是显示从肿瘤细胞获得的病毒滴度的图。
图3C是显示于感染后72小时对L1210白血病细胞和HDF正常细胞之细胞生存力进行刃天青量化的图。
图4A是显示经PBS、活VSV-GFP或NRRP处理的L1210细胞和Vero细胞的荧光图像的图像组。
图4B是显示由L1210急性白血病细胞和Vero永生化细胞产生的病毒滴度的图。
图5是与暴露于20,000mJ/cm2UV剂量之病毒的基因组表达相比，NRRP基因组表达的Western印迹图像，其中观察到细胞毒性丧失，并且或活病毒作为对照。提及的1x或2x指上样到凝胶上的蛋白质的量。蛋白质提取于感染后15小时。
图6A是经化学产生的NRRP和白消安产生的NRRP处理之Vero细胞的荧光和亮视野图像组。
图6B是经单独白消安以与图6A中产生NRRP所使用的相同剂量处理15小时的Vero细胞的亮视野显微图像。
图6C是经活VSV-GFP处理的Vero细胞的荧光和亮视野图像组。
图7A是经NRRP处理的Vero细胞的亮视野和荧光图像组，所述NRRP通过获取1E10的冷冻野生型VSV并将该制备物用15kGy钴-60辐照产生。
图7B是经活野生型VSV-GFP处理的Vero细胞的亮视野和荧光图像组。
图7C是PBS中的Vero细胞的亮视野和荧光图像组。
图8A是经PBS或NRRP以100的MOI处理的L1210细胞和HDF细胞的亮视野图像组。
图8B是显示对白血病细胞系和正常细胞系的生存力的刃天青量化的图。鼠细胞系用＊表示。
图8C是对鼠的人JurkatT细胞急性白血病、鼠A20B细胞成淋巴细胞白血病、A301T细胞成淋巴细胞白血病和HL60急性早幼粒细胞性白血病以及GM38和HDF正常细胞系的PBS、活VSV-GFP或NRRP处理的荧光显微图像组。
图9是显示对经PBS或NRRP处理之L1210细胞的AnnexinV-APC和7-AAD染色的流式细胞术分析的图组。
图10是说明对在用UV产生之NRRP和UV产生之NRRP与苯达莫司汀(300μM)的组合作用处理72小时后取得的L1210急性白血病细胞系进行刃天青量化测定后的细胞生存力的图。
图11是说明对在用UV产生之NRRP和UV产生之NRRP与地塞米松(45μM)的组合作用处理72小时后取得的L1210急性白血病细胞系进行刃天青量化测定后的细胞生存力的图。
图12是说明对在用UV产生之NRRP和UV产生之NRRP与多柔比星(0.025μM)的组合作用处理72小时后取得的L1210急性白血病细胞系进行刃天青量化测定后的细胞存活力的图。
图13是说明对在用UV产生之NRRP和UV产生之NRRP与长春新碱(0.0125μM)的组合作用处理72小时后取得的L1210急性白血病细胞系进行刃天青量化测定后的细胞生存力的图。
图14是说明对在用UV产生之NRRP和UV产生之NRRP与伊达比星(0.05μM)的组合作用处理15小时后取得的K562Ph-阳性髓细胞白血病细胞系进行刃天青量化测定后的细胞生存力的图。
图15A是由LeBoeuf等开发之模拟正常细胞和抗病毒信号传导途径具有缺陷的肿瘤中刺激NRRP细胞毒性的现象学模型。为了说明NRRP动力学，将原始模型通过去除病毒复制(X)进行改造。点划线说明与肿瘤细胞相关的IFN缺陷。
图15B是显示抗病毒信号传导途径中的缺陷与NRRP处理72小时后的生存力之间的模拟关系的图。
图15C是显示在存在或不存在IFN的情况下MOI与正常HDF细胞中在NRRP感染后72小时的生存力之间的体外关系的图。
图15D是显示在存在或不存在IFN的情况下MOI与白血病L1210细胞中在NRRP处理后72小时的生存力之间的体外关系的图。
图16A是经PBS或NRRP处理的两个慢性髓细胞白血病-原始细胞危象患者的亮视野显微图像组。
图16B是来自人患者外周血样品的急性白血病(CML原始细胞危象)的荧光显微图像组(4X)。从经PBS、活VSV-GFP或编码GFP的NRRP处理的外周血收集的白血病富集样品。图像为以MOI＝100感染后24小时。
图16C是在处理后48小时对两个经PBS或NRRP(MOI＝100)处理之CML原始细胞危象患者样品的Annexin-V和CD33染色的流式细胞术图表，其补充图16A和16C中所示的数据。CD33+原始细胞群通过长期培养该细胞富集。
图16D是显示对两个经PBS或NRRP处理之CML原始细胞危象患者样品的CD33染色的流式细胞术分析的图。
图17A是经PBS或NRRP处理18小时的健康骨髓样品的亮视野显微图像组。
图17B是显示对经PBS或NRRP处理65小时之健康骨髓样品的Annexin-V染色的量化的图。
图18A是显示鼠原始细胞危象处理模型中存活曲线的图。在小鼠于第一天遭受L1210攻击后，使小鼠接受三个日剂量的NRRP或PBS。
图18B是显示对在急性原始细胞危象期间携带L1210的小鼠中NRRP诱导的细胞因子之基于Luminex的量化的图组。经NRRP处理小鼠之所有鉴定的细胞因子都被诱导超过2倍，并且是统计学上显著的(非配对t-检验pV＜0.05)。pV已经过校正以解释多重假设检验(Beniamini和Hochberg方法)。
图19是显示免疫原性凋亡的鼠免疫活性模型中存活曲线的图。在第一天的L1210攻击之前，使小鼠接受3个每周剂量的用或未用NRRP孵育的γ-辐照的L1210细胞。
图20是在PBS或NRRP处理后15小时拍摄的骨髓瘤细胞系MPC-11和RPMI-8226的亮视野显微图像组。NRRP以MOI＝250施用，即此前确定对正常细胞的生存力无影响的剂量。
图21是显示对在以MOI＝250施用NRRP处理15小时后取得的骨髓瘤细胞系MPC-11和RPMI-8226进行刃天青量化测定后的细胞生存力的图。SR4987是正常的骨髓基质细胞系。
图22是说明对在用UV产生之NRRP和UV产生之NRRP与美法仑(20μM)的组合作用处理72小时后取得的MPC-11多发性骨髓瘤细胞系进行刃天青量化测定后的细胞生存力的图。
图23是说明对在用UV产生之NRRP和UV产生之NRRP与第二线粒体来源的胱天蛋白酶活化剂(secondmitochondria-derivedactivatorofcaspase，SMAC)模拟物LCL161(15uM)的组合作用处理72小时后取得的MPC-11多发性骨髓瘤细胞系进行刃天青量化测定后的细胞存活力的图。
图24是说明对在用UV产生之NRRP和UV产生之NRRP与卡非佐米(5nM)的组合作用处理72小时后取得的RPMI-8226多发性骨髓瘤细胞系进行刃天青量化测定的细胞生存力的图。
图25A是在PBS或NRRP处理后24小时拍摄的小鼠迟发性脑肿瘤成胶质细胞瘤细胞系(DBT)的亮视野显微图像组。
图25B是在PBS或NRRP处理后24小时拍摄的星形细胞瘤细胞系(K1491)的亮视野显微图像组。
图25C是在PBS或NRRP处理后24小时拍摄的小鼠神经胶质瘤细胞系(GL261)的亮视野显微图像组。
图26是显示相对于正常HDFN对照对脑癌细胞系DBT、K1491、K1492、CT2A和GL261进行刃天青量化测定后的细胞存活力的图。
图27是说明对在用UV产生之NRRP和UV产生之NRRP与HDAC抑制剂SAHA(10μM)的组合作用处理72小时后取得的CT2A成胶质细胞瘤细胞系进行刃天青量化测定后的细胞存活力的图。
图28A是抗性实体瘤细胞系中NRRP介导的肿瘤细胞细胞毒性的荧光显微图像组(4X)。该图像组示出了经PBS、活VSV和NRRP处理的小鼠乳房或乳腺(4T1)和人肾(786-0)癌细胞。图像拍摄于感染后24小时。
图28B是经PBS、活VSV和NRRP处理的乳腺(4T1)和肾(786-0)癌细胞中抗性实体瘤细胞系之NRRP介导的肿瘤细胞细胞毒性的在感染后72小时拍摄的亮视野显微图像组(4X)。
图28C是显示在感染后72小时对经PBS、活VSV和NRRP处理的乳腺(4T1)和肾(786-0)癌细胞中抗性实体瘤细胞系之细胞生存力进行刃天青量化的图。
图29是说明经2E9UV产生之NRRP在肿瘤植入后第16天、第18天和第21天处理的皮下CT-26结肠癌中的存活优势的图。
发明详述
总体上，本公开内容提供了非复制型病毒衍生颗粒及其作为抗癌剂的用途。非复制型病毒衍生颗粒(NRVP)是能够结合细胞并且被细胞内化，但已被改造成当NRVP在细胞中时阻止或显著降低新病毒颗粒形成的病毒衍生颗粒。NRVP的一个实例是非复制型弹状病毒衍生颗粒(NRRP)。
NRVP包括：包膜，所述包膜在其表面上具有足够数目的功能性G蛋白以允许病毒衍生颗粒结合细胞表面并且被内化。NRVP还包括具有编码新病毒颗粒装配所需之所有蛋白质的序列的RNA多核苷酸和形成RNA多核苷酸周围的结构的蛋白质混合物。然而，NRVP的RNA结构是充分交联的或者已被切割以形成不连续的RNA片段，使得NRVP基因组不能被用于产生形成新病毒所需的蛋白质。例如，当所述颗粒在细胞中时，RNA序列可能不能被转录成mRNA、翻译成蛋白质或上述二者。转录和/翻译受损或缺乏意指细胞中不产生足够的蛋白质并且不能装配新的病毒颗粒。
功能性G蛋白可具有包含如下所示SEQIDNO：1的序列，其是水泡性口炎印第安纳病毒的糖蛋白成熟肽的序列。这种功能性G蛋白具有NCBI登录号NP955548.1。
或者，功能性G蛋白可具有与SEQIDNO：1具有至少75％同一性的序列，只要其能够与细胞表面结合并使颗粒内化即可。例如，可进行氨基酸的保守替换而不消除蛋白质与细胞表面结合并使颗粒内化的能力。保守替换的实例示于如下表1中。
表1-保守氨基酸替换
可在不参与细胞表面结合的G蛋白部分中(例如在跨膜结构域中)进行较少保守替换，而可要求在与G蛋白受体相互作用的蛋白质部分中进行较多保守替换。G蛋白在本领域中是已知的并且技术人员将能够确定可进行哪些氨基酸替换而不消除该蛋白质与细胞表面结合并使颗粒内化的能力。
形成RNA周围的结构的蛋白质混合物可至少包含N蛋白、P蛋白、M蛋白和L蛋白。具有N蛋白、P蛋白、M蛋白、G蛋白和L蛋白的NRVP可包括弹状病毒衍生的NRVP。可将弹状病毒衍生的NRVP称为非复制型弹状病毒衍生颗粒(NRRP)。出于本公开内容的目的，术语“弹状病毒”(NCBI分类ID：11270)可包括属于下列病毒属的任一种及其变体：质型弹状病毒属(Cytorhabdovirus)(NCBI分类ID：11305)、短暂热病毒属(Ephemerovirus)(NCBI分类ID：32613)、水泡性病毒属(Vesiculovirus)(NCBI分类ID：11271)、未分类的双感染弹状病毒超群(Dimarhabdovirussupergroup)(NCBI分类ID：349166)、狂犬病毒属(Lyssavirus)(NCBI分类ID：11286)、粒外弹状病毒属(Novirhabdovirus)(NCBI分类ID：186778)、核型弹状病毒属(Nucleorhabdovirus)(NCBI分类ID：11306)、未分配的弹状病毒(NCBI分类ID：686606)和未分类的弹状病毒(NCBI分类ID：35303)。弹状病毒科中的物种包括但不限于：马拉巴病毒、水泡性口炎病毒(VSV)和法明顿病毒(Farmingtonvirus)。
N蛋白可具有包含如下所示的SEQIDNO：2的序列，其是水泡性口炎印第安纳病毒的核衣壳蛋白的序列。这种N蛋白具有NCBI登录号NC041712.1。
或者，N蛋白可具有与SEQIDNO：2具有至少80％同一性的序列，只要其能够参与形成蛋白质结构即可。例如，可进行氨基酸的保守替换而不消除该蛋白质参与形成蛋白质结构的能力。保守替换的实例示于表1中。
P蛋白可具有包含如下所示的SEQIDNO：3的序列，其是水泡性口炎印第安纳病毒的NS蛋白的序列。这种P蛋白具有NCBI登录号NC041713.1。
或者，P蛋白可具有与SEQIDNO：3具有至少80％同一性的序列，只要其能够参与形成蛋白质结构即可。例如，可进行氨基酸的保守替换而不消除该蛋白质参与形成蛋白质结构的能力。保守替换的实例示于表1中。
M蛋白可具有包含如下所示的SEQIDNO：4的序列，其是水泡性口炎印第安纳病毒的基质蛋白的序列。这种M蛋白具有NCBI登录号NC041714.1。
或者，M蛋白可具有与SEQIDNO：4具有至少80％同一性的序列，只要其能够参与形成蛋白质结构即可。例如，可进行氨基酸的保守替换而不消除该蛋白质参与形成蛋白质结构的能力。保守替换的实例示于表1中。
L蛋白可具有包含如下所示的SEQIDNO：5的序列，其是水泡性口炎印第安纳病毒的聚合酶蛋白的序列。这种L蛋白具有NCBI登录号NC041716.1。
或者，L蛋白可具有与SEQIDNO：5具有至少70％同一性的序列，只要其能够参与形成蛋白质结构即可。例如，可进行氨基酸的保守替换而不消除该蛋白质参与形成蛋白质结构的能力。保守替换的实例示于表1中。
在一些实例中，NRVP可在其被细胞结合并内化后产生功能性N蛋白、P蛋白、M蛋白和G蛋白。然而，NRVP缺乏产生功能性L蛋白的能力或者产生功能L蛋白的能力降低。在没有功能性L蛋白或没有正确量的功能性L蛋白的情况下，新的病毒颗粒不能被装配。
在另一些实例中，NRVP可在其被细胞结合并内化后产生功能性N蛋白、P蛋白和M蛋白。然而，NRVP缺乏产生功能性G蛋白和L蛋白的能力或者产生功能性G蛋白和L蛋白的能力降低。在没有功能性G蛋白和L蛋白或没有正确量的功能性G蛋白和L蛋白的情况下，新的病毒颗粒不能被装配。
在又一些实例中，NRVP可在其被细胞结合并内化后产生功能性N蛋白和P蛋白。然而，NRVP缺乏产生功能性M蛋白、G蛋白和L蛋白的能力或者产生功能性M蛋白、G蛋白和L蛋白的能力降低。在没有功能性M蛋白、G蛋白和L蛋白或没有正确量的功能性M蛋白、G蛋白和L蛋白的情况下，新的病毒颗粒不能被装配。
在又一些实例中，NRVP可在其被细胞结合并内化后产生功能性N蛋白。然而，NRVP缺乏产生功能性P蛋白、M蛋白、G蛋白和L蛋白的能力或者产生功能性P蛋白、M蛋白、G蛋白和L蛋白的能力降低。在没有功能性P蛋白、M蛋白、G蛋白和L蛋白或没有正确量的功能性P蛋白、M蛋白、G蛋白和L蛋白的情况下，新的病毒颗粒不能被装配。
在又一些实例中，NRVP缺乏产生功能性N蛋白、P蛋白、M蛋白、G蛋白和L蛋白的能力或者产生功能性N蛋白、P蛋白、M蛋白、G蛋白和L蛋白的能力降低。在没有功能性N蛋白、P蛋白、M蛋白、G蛋白和L蛋白或没有正确量或比例的功能性N蛋白、P蛋白、M蛋白、G蛋白和L蛋白的情况下，新的病毒颗粒不能被装配。
为了使非复制型病毒衍生颗粒能够结合细胞表面并且被内化，NRVP必须在病毒颗粒的包膜上具有足够数目的功能性G蛋白。预期具有见于野生型病毒颗粒上的G蛋白数目的至少5％的NRVP依然能够结合细胞并且被内化。优选地，NRVP将具有见于野生型病毒颗粒上的G蛋白数目的至少50％，并且更优选地，NRVP将具有见于野生型病毒颗粒上的G蛋白数目的至少100％。在一些特别实例中，NRVP具有至少60个功能性G蛋白/颗粒、至少600个功能性G蛋白/颗粒或至少1200个功能性G蛋白/颗粒。
如上所述，NRVP包含具有编码新病毒颗粒装配所需的所有蛋白质的序列的RNA。当NRVP在细胞中时RNA序列可能不能产生那些蛋白质的一个原因是RNA是否交联至使蛋白质产生降低或停止的程度。在一些实例中，至少0.05％的交联核苷酸可足以降低或停止由RNA序列的蛋白质产生。在另一些实例中，交联RNA可包含至少0.5％的交联核苷酸。优选地可具有至少1％的核苷酸交联，并且更优选地使至少10％或至少20％的核苷酸交联。
使核苷酸交联可提高G蛋白不能结合细胞表面的可能性。因此，可优选地，少于80％的核苷酸是交联的。
RNA结构中的核苷酸可与其他RNA核苷酸、RNA周围的蛋白质结构中的蛋白质中的氨基酸或上述二者交联。
除交联的RNA结构之外，RNA周围的蛋白质结构可包含具有以下氨基酸的蛋白质，所述氨基酸：与蛋白质结构中的另一蛋白质交联；与同一蛋白质的另一氨基酸交联；与RNA结构交联；或其任意组合。
此外，通过移除由P蛋白和L蛋白编码的NRVPRNA聚合酶活性的功能，NRVPRNA结构可能不能复制。这可通过使P蛋白和L蛋白与RNA结构充分交联、通过使P蛋白和L蛋白与其他蛋白质交联或者通过损坏NRVP蛋白质结构使得P蛋白和L蛋白的功能受到负面影响来实现。
当NRVP在细胞中时RNA序列可能不能产生那些蛋白质的另一个原因是RNA结构是否已被切割以形成不连续的RNA片段。RNA病毒(例如弹状病毒)具有单个连续的RNA多核苷酸，其包含编码病毒复制所需蛋白质的所有基因的序列。将单个连续的多核苷酸切割成两个或更多个不连续的RNA多核苷酸导致缺陷型基因组转录、翻译或上述二者。在不合转录起始位点的多核苷酸上编码的蛋白质不能被转录。此外，基因组不能进行全长复制并且不能被正确地并入到新生病毒颗粒中，从而阻止病毒颗粒产生。
NRVP可包含至少2个不连续的RNA多核苷酸，其中只有一个包含转录起始位点。然而，优选地可将RNA切割成多于两个片段。因此，NRVP优选包含至少5个、更优选至少10个并且甚至更优选至少100个不连续的RNA多核苷酸。
RNA病毒可具有包含约11,000个核苷酸量级的RNA序列。在具有包含约11,000或更多个核苷酸之RNA序列的RNA病毒中，可期望的是将该RNA切割成具有不超过10,000个核苷酸的片段。则通过切割具有11,000个核苷酸之RNA病毒产生的NRVP可具有至少一个小于10,000个核苷酸的RNA片段和另一个小于1,000个核苷酸的RNA片段。由于只有一个片段包含转录起始位点或者由于蛋白质编码序列是不连续的，另一个片段不能被转录或翻译并且将不会产生在所述片段上编码的任何蛋白质。
优选地，可将RNA切割成较小的部分。例如，不连续的RNA多核苷酸可以是不超过7000个、不超过5000个、不超过3000个或不超过1000个核苷酸。
非复制型病毒衍生颗粒由包含具有编码N蛋白、P蛋白、M蛋白、G蛋白和L蛋白之序列的RNA的活病毒如下产生：任选地使病毒衍生颗粒与UV吸收化合物分离；并且然后使活病毒经受RNA损伤剂以使RNA结构交联或切割RNA结构，由此阻止RNA产生新病毒颗粒装配所需的足够的蛋白质。
使活病毒的RNA结构充分交联使得当活病毒衍生颗粒在细胞中时：RNA转录成mRNA降低；mRNA翻译成蛋白质降低；或上述二者。类似地，将活病毒的RNA结构切割成足够不连续的RNA片段使得当病毒衍生颗粒在细胞中时：RNA转录成mRNA降低；mRNA翻译成蛋白质降低；或上述二者。
使RNA交联可通过使活病毒经受电磁辐射来实现。电磁辐射的波长小于约1mm。与电磁辐射相关的能量随波长的减小而提高。能量提高与DNA损伤有关，这通过在暴露于UV光、X-射线和γ辐射时癌症率提高证明。因此，优选地电磁辐射的波长小于约500nm，并且更优选地波长小于约280nm。在一些特别实例中，所述波长为约0.1皮米(picometer)至280nm。
可尤其期望的是，使用波长为约100nm至约280nm的电磁辐射，因为该波长相对于蛋白质交联优先诱导核苷酸交联。当电磁辐射在UV光谱内，即在约100nm与约400nm之间时，可使包含活病毒的溶液经受约100mJ/cm2至约8,000mJ/cm2剂量的电磁辐射。优选地，所述剂量为约150mJ/cm2至约5,000mJ/cm2。甚至更优选地，所述剂量为约150mJ/cm2至约1,000mJ/cm2。仍然甚至更优选地，所述剂量为150mJ/cm2至约500mJ/cm2。最优选地，所述剂量为约150mJ/cm2至约300mJ/cm2。
实际剂量可取决于溶液的特征。例如，如果溶液包含吸收UV光的染料，那么需要较大的剂量。类似地，如果从单点辐照溶液并且容器较大，可能存在未暴露于UV光的全强度的活病毒。在这样的情况下，较大的剂量或搅拌溶液可能是有益的。技术人员将能够确定提供合适剂量所必需的参数。
在其中保持活病毒的介质是混浊的、包含染料或者以其他方式吸收UV光的情况下，可期望的是用x-射线(即波长为0.01nm至10nm的电磁辐射)或γ射线(即波长小于约10皮米的电磁辐射)辐照活病毒。当电磁辐射是γ辐照时，可使活病毒经受约1kGy至约50kGy的剂量。更优选地，所述剂量为约5kGy至约20kGy。γ辐照可由钴-60产生。
可使活病毒在4℃或更低的温度下经受电磁辐射。例如，可使活病毒在约4℃的温度下经受UV辐射。在另一个实例中，可使活病毒在约-80℃的温度下经受γ辐射。在又一个实例中，可使活病毒在约-130℃的温度下经受γ辐射。
如上所述，RNA结构可以是交联的或者被切割成足够不连续的RNA片段，以降低或阻止RNA转录成mRNA；mRNA翻译成蛋白质；或上述二者。除上文所讨论的电磁辐射之外，这还可通过使活病毒暴露于化学试剂来实现，所述化学试剂是例如能够使RNA交联的烷化剂或能够切割RNA的自由基形成剂。这样的交联剂的实例包括白消安、环磷酰胺、美法仑、甲醛、碳二亚胺和辛二酸双磺基琥珀酰亚胺辛二酸酯。自由基形成剂的实例包括过氧化物、溴化氢(hydrogenbromine)、过硫酸铵和羟自由基。
可通过对用于产生病毒颗粒的生长介质进行分级来使活病毒与UV吸收化合物分离。可将生长介质在例如蔗糖梯度中分级。一旦制备了NRVP，就可通过分级或过滤包含病毒衍生颗粒的稀释剂来分离NRVP。可将稀释剂在例如蔗糖梯度中分级或者通过切向流过滤来过滤。
本公开内容还包括通过向患者施用上述非复制型病毒衍生颗粒来刺激免疫应答的方法。NRVP的施用诱导患者中表达和释放细胞因子。患者中可释放的示例性细胞因子包括：白介素、干扰素、炎性细胞因子、CXC趋化因子家族的成员、肿瘤坏死因子家族的成员，或其任意组合。这些因子可导致肿瘤抗原被呈递或识别。
本公开内容还包括在患者中诱导癌细胞发生细胞死亡的方法。所述方法包括向患者施用上述非复制型病毒衍生颗粒。
本公开内容还包括优先诱导癌细胞或非癌细胞发生细胞死亡的方法。所述方法包括向患者施用上述非复制型病毒衍生颗粒。
细胞死亡可通过细胞凋亡，例如由细胞中NRVP或NRVP之成分的存在引起的细胞凋亡。或者，细胞死亡可归因于先天性免疫效应细胞、适应性免疫效应细胞或其任意组合的募集，例如由细胞释放的细胞因子引起的募集。适应性免疫效应细胞可以是T细胞、B细胞或上述二者。先天性免疫效应细胞可以是肥大细胞、吞噬细胞(例如巨噬细胞、嗜中性粒细胞或树突细胞)、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、自然杀伤细胞、γδT细胞或其任意组合。
将患者用足够数目的NRVP治疗以刺激免疫应答或诱导癌细胞发生细胞死亡。由于NRVP不形成活病毒颗粒，理想地以大于用具有复制能力的病毒治疗的剂量施用NRVP。可向患者施用1E10至1E15的非复制型病毒衍生颗粒，但是在一些优选实施例中，向患者施用1E11至1E13的非复制型病毒衍生颗粒。
当将对患者的NRVP治疗与化学治疗剂治疗组合时，可存在协同益处。化学治疗剂可以是例如：苯达莫司汀、地塞米松、多柔比星、长春新碱、伊马替尼、达沙替尼或伊达比星。这些药剂提高对NRVP介导的细胞凋亡的敏感性、增强细胞因子分泌、改善抗肿瘤免疫应答、促进血管关闭、或其任意组合。
NRVP可用于治疗实体瘤或非实体瘤，例如白血病。然而，由于NRVP在细胞中不形成活病毒，因此尤其理想地使所有的癌细胞暴露于所注射的NRVP。这与施用具有复制能力的病毒形成对比，后者使癌细胞的一部分暴露于所注射的病毒导致产生另外的病毒并且使剩余的癌细胞随后暴露于所产生的病毒颗粒。
鉴于缺乏病毒颗粒的产生，优选使用NRVP来治疗白血病，因为静脉内施用NRVP导致很大一部分白血病细胞暴露于颗粒。相比之下，在实体瘤的情况下，实体瘤中的一部分细胞可能不暴露于所注射的NRVP。非复制型病毒衍生颗粒的施用方式可根据待治疗的癌症确定。可将NRVP向患者瘤内、鼻内、肌内、皮内、腹膜内、动脉内、静脉内、皮下或颅内施用。
本公开内容的非复制型病毒衍生颗粒(NRVP)可由被改造成缺乏在细胞之间扩散的能力的野生型弹状病毒颗粒形成。非复制型弹状病毒衍生颗粒可衍生自具有复制能力的野生型弹状病毒颗粒。一旦被改造，NRRP不能维持病毒体复制。NRRP可保留对永生化细胞的溶细胞向性。NRRP的特定实例对永生化细胞具有先天性和/或适应性免疫刺激性。
出于本公开内容的目的，表达“永生化细胞”指细胞分裂不受抑制的细胞，并且包括但不限于过度增殖细胞、肿瘤或癌细胞和经转化的永生化细胞。过度增殖细胞指任何赘生物或任何被慢性感染的细胞或组织。赘生物可以是例如任何良性赘生物、囊性赘生物、原位癌、恶性赘生物、转移性赘生物或继发性赘生物。过度增殖细胞可以是造血系统癌细胞或来自实体瘤的细胞。
根据本公开内容的NRRP可保留对永生化细胞的溶细胞向性。这意味着NRRP将优先诱导永生化细胞(例如肿瘤或癌细胞和经转化的永生化细胞)发生细胞死亡。
可将野生型弹状病毒通过破坏其基因组复制和/或表达的方式进行改造以产生NRRP。这意味着与亲本基线表达相比，基因组复制和/表达降低。还可消除基因组表达。
可使用电磁(EM)辐照来破坏野生型弹状病毒的基因组表达。电磁辐照可包括UV辐照、红外线、X-射线、γ辐照以及在EM光谱内的其他辐照类型，例如UVC(200-280纳米)。还可使用化学诱导的破坏来破坏野生型弹状病毒的基因组表达。例如，可使用基因组损伤剂，例如白消安。
充分破坏野生型弹状病毒的基因组表达所需的EM剂量将是方法依赖性的，并且将根据例如以下参数而不同：病毒浓度、病毒储备液制备物的浊度、所使用的体积、病毒储备液制备物中污染物的存在或纯度、所使用的稀释剂以及其中储存病毒制备物以用于操作的容器(塑料、玻璃等)。化学给药也受多种参数的影响。
在一个实例中，将50μl用蔗糖垫方法纯化的野生型弹状病毒的1E10PFU/ml储备液以250mJ/cm2辐照(持续约40秒)。
本公开内容还提供了由野生型弹状病毒衍生颗粒制备而成的非复制型弹状病毒衍生颗粒。所述野生型病毒已被改造以缺乏在细胞之间扩散的能力，但保留先天性和/或适应性免疫刺激特性。
本公开内容还提供了NRVP(特别是NRRP)用于治疗永生化细胞群的用途。
出于本公开内容的目的，“治疗”将被理解为指这样的应用，其中NRVP或NRRP被单独使用或与放射治疗、化学治疗、免疫治疗、手术、基于溶瘤病毒的治疗或基于其他病毒的治疗组合使用。
本领域技术人员将理解：“化学治疗”包括但不限于涉及使用以下物质的治疗：有丝分裂抑制剂、IMiDS(例如来那度胺或泊马度胺)、染色质修饰剂、HDAC抑制剂(例如SAHA)、低甲基化剂、烷化剂、mTOR抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂、抗代谢物、DNA损伤剂或DNA调节剂、磷酸二酯酶抑制剂、SMAC模拟物(例如LCL161)、皮质类固醇和细胞因子/趋化因子。
例如，化学治疗可包括使用以下物质的治疗：烷化剂、DNA损伤剂或DNA调节剂、有丝分裂抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂、IMiDS、抗代谢物、mTOR抑制剂、染色质修饰剂、HDAC抑制剂、低甲基化剂、磷酸二酯酶抑制剂、皮质类固醇和细胞因子/趋化因子。特别的化学治疗剂包括但不限于：苯达莫司汀、白消安、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、达卡巴嗪、洛莫司汀、美法仑、替莫唑胺、噻替派、奥沙利铂、丙卡巴肼、喷司他丁、克拉屈滨、氯法拉滨、阿糖胞苷、氟达拉滨、吉西他滨、羟基脲、巯嘌呤、奈拉滨、氟尿嘧啶、博来霉素、放线菌素D、柔红霉素、多柔比星、多柔比星脂质体、伊达比星、米托蒽醌、卡培他滨、拓扑替康、伊立替康、依托泊苷、紫杉醇、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、高三尖杉酯碱(omacetaxin)、六甲蜜胺、天冬酰胺酶、天冬酰胺酶、培门冬酶(pegaspargase)、异维A酸、视黄酸、砷、长春碱、长春新碱、长春新碱脂质体、博舒替尼、达沙替尼、伊马替尼、尼罗替尼、舒尼替尼、维罗非尼、瑞戈非尼、硼替佐米、卡非佐米、沙利度胺、来那度胺、泊马度胺、甲氨蝶呤、普拉曲沙、依维莫司、坦西莫司、伏立诺他、罗米地辛、丙戊酸、地西他滨、阿扎胞苷、阿那格雷、可的松、地塞米松、泼尼松和曲安西龙、干扰素α2a、干扰素α2b、聚乙二醇化干扰素α2b、干扰素β1b、阿地白介素/IL-2、地尼白介素(denileukindiftitox)、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子。
出于本公开内容的目的，术语“免疫治疗”应当指靶向以下的免疫治疗：CD20(例如利妥昔单抗、替伊莫单抗(IbritumomabTiuxetan)和托西莫单抗(tositumomab))、CD47、CD33、CD38、CD138、CS1、CD52(例如阿仑单抗(alemtuzimab))、VEGF(例如贝伐单抗)、Her2/Neu(例如曲妥珠单抗)、EGFR(例如西妥昔单抗和尼妥珠单抗)、CTLA4(例如易普利单抗(ipilimumab))或IGF-1(例如ganitumab)。本领域技术人员已知的其他免疫治疗也可包括在术语“免疫治疗”的范围之内。
提及的“基于溶瘤病毒的治疗”包括本领域中已知的那些，包括基于痘病毒的治疗(基于牛痘的病毒)、基于单纯疱疹病毒的治疗(OncoVEXGMCSF)、基于弹状病毒的治疗(MG1、VSV-IFNb、VSVd51)、呼肠孤病毒(Reolysin)、基于腺病毒的治疗(ONYX015)、基于麻疹病毒的治疗、基于新城疫病毒的治疗、基于α病毒的治疗和基于细小病毒属的治疗。
NRVP和NRRP可瘤内、鼻内、肌内、皮内、腹膜内、动脉内、静脉内、皮下或颅内施用。
证明NRRP在使用两种不同弹状病毒衍生毒株和若干不同细胞类型(包括患者样品)的若干不同体外和体内模型中的溶瘤特性，如下文中更详细讨论的。
在多个测定中表征肿瘤特异性细胞毒性，包括显微术表征细胞表型、刃天青细胞毒性量化和对肿瘤细胞杀伤进行流式细胞术。
使用针对L1210的免疫保护模型显示程序性细胞死亡途径中的NRRP活化导致产生针对肿瘤的先天性和适应性免疫应答。因此，NRRP治疗无需使每个细胞变得被感染以维持效力，并且因此可用作单独治疗或者可用作抗癌治疗方案中的辅助剂。
还进行了对在急性原始细胞危象期间携带L1210的小鼠中NRRP诱导的细胞因子之基于Luminex的量化。经NRRP处理小鼠的所有经鉴定的细胞因子都被诱导超过2倍，并且是统计学上显著的(非配对t-检验pV＜0.05)。pV已经过校正以解释多重假设检验(Benjamini和Hochberg方法)。
该实验还显示NRRP在以高NRRP与细胞比值(即，＞1)施加时是效果最佳的。这种较高的剂量确保细胞群中的大多数细胞遇到细胞毒NRRP。这与活OV治疗形成对比，活OV治疗依赖病毒扩散来希望获得治疗效力并且固有地利用低OV与细胞比值以促进被安全递送至接受者。实施例
对于除图1A之外的所有附图而言，NRRP均通过对用蔗糖垫方法纯化的50μl1E10PFU/ml活VSV-GFP进行250mJ/cm2剂量的UVC辐照产生，在所述蔗糖垫方法中，将病毒制备物通过水(5mi)中的20％(w/v)蔗糖垫以148,000×g离心120分钟。
实施例1：通过用电磁辐射辐照产生的基于VSV的NRRP
可使用弹状病毒的UV光损伤来产生保留生物活性的非复制型病毒衍生颗粒。使用高剂量的UV辐照去除弹状病毒的基因组，从而使所述病毒变成生物学惰性的。然而，现在已发现UV辐照可以以仍允许病毒被细胞结合和内化但当病毒颗粒在细胞中时形成新病毒颗粒的能力停止或显著降低的剂量施加。因此，病毒复制丧失，但仍维持生物活性。
经确定，对表达绿色荧光蛋白的经纯化VSV(一种弹状病毒)进行剂量为约100mJ/cm2至约1000mJ/cm2的UV通量剂量的辐照产生保留对永生化细胞的溶细胞向性(图1A和图1B)但缺乏在细胞之间扩散之能力(图2A)的NRRP。
向VSV的野生型菌株施加250mJ/cm2剂量的UV辐照以产生根据本公开内容的基于VSV的NRRP。在图1A中，UV剂量1E2对应于100mJ/cm2。因此，当以250mJ/cm2的剂量辐照时，VSV-eGFP丧失其表达能力，但仍对永生化产生细胞系(Vero)维持有效的细胞毒性(图2B)。感染后的病毒滴度分析证实：与活病毒感染形成强烈的对比，所得到的颗粒不能在这些细胞中复制(图2C)。当使用弹状病毒家族的其他成员(包括马拉巴病毒)时，同样观察到这种作用(图3A、3B和3C)。
图1A中所示的剂量响应曲线显示当UV剂量高于1000mJ/cm2时细胞毒性降低，并且当UV剂量为10,000mJ/cm2时细胞毒性完全去除。认为，在该剂量下细胞毒性完全去除是因为G蛋白交联至不能允许经处理的病毒结合细胞表面和/或被细胞内化的程度。通过与正常的新生人真皮成纤维细胞(humandermalfibroblast，HDF)进行比较和对比(图1A和1B)，可知与非癌细胞相比，细胞毒性优先针对癌细胞。实际上，非癌细胞看来需要约10倍更多的病毒以变得对NRRP介导的细胞毒性敏感(图1B)。
为了证实急性白血病细胞中不存在NRRP复制和扩散，在对侵袭性鼠急性成淋巴细胞白血病细胞系(L1210)与Vero对照细胞系(正常肾上皮细胞)同时进行体外处理后量化GFP合成和病毒滴度。在这两个经处理的细胞系中，均未观察到可检测的活病毒(图4A和4B)。
病毒基因组的Western印迹分析显示NRRP的整体基因组表达降低(图5)。阻断病毒体产生并降低基因组表达的UV剂量与显著的溶瘤活性相关。在这些实验中，可使用高(大于或等于1)感染复数(MOI)或颗粒与细胞比值以确保每个肿瘤细胞都遇到NRRP并诱导整个群中发生广泛的细胞死亡(图1B)。
实施例2：通过暴露于RNA烷化剂产生的基于VSV的NRRP
在另一个实施例中，通过将VSV用6mg/mL白消安在4℃下处理24小时化学地产生NRRP并将其添加至Vero细胞24小时。不到4％的Vero细胞在处理后保持存活(图6A)。这种作用归因于NRRP，因为单独白消安处理24小时表现为Vero细胞保持约82％的存活(图6B)。图6C示出了活的经VSV-GFP感染的Vero细胞在24小时时的致细胞病变效应并且衍生出这种NRRP的活病毒储备液(VSV-GFP)确实有可复制能力-通过GFP表达证明。
实施例3：通过暴露于γ辐射产生的基于VSV的NRRP
在又一个实施例中，通过将1E10的冷冻VSV用15kGy钴-60在-80℃下辐照产生NRRP，并将其以1000个颗粒/细胞添加至Vero细胞48小时。再一次，在这些永生化细胞上明显显示了NRRP的致细胞病变效应(图7A)。将NRRP诱导的细胞凋亡和死亡的形态学效应与用活VSV-GFP在相同的48小时时间内处理相同细胞的致细胞病变效应进行比较(图7B)。经单独PBS处理的Vero细胞保持完全存活而无致细胞病变效应并且不显示荧光(图7C)。
实施例4：NRRP是体外针对白血病细胞的高效治疗
用通过UV方法产生的基于VSV的NRRP来检测急性白血病细胞是否对NRRP介导的细胞死亡敏感。首先，确定L1210细胞系中诱导的细胞毒性和在正常人真皮成纤维细胞(HDF)中观察到的细胞毒性。尽管两个细胞系都对活病毒感染敏感，但是NRRP只诱导白血病L1210细胞死亡(图8A)。在急性白血病L1210细胞中观察到典型的凋亡表型，其以细胞直径减小、具有多个凋亡体的“干瘪”外观和片段化的核内含物为特征。使用标准刃天青测定在数个人和鼠细胞系中对细胞毒性进行量化。在这些实验中，急性白血病对NRRP介导的细胞死亡高度敏感，而保留正常细胞的生存力(图8B)。使用基于马拉巴病毒的NRRP(一种作为替代的弹状病毒毒株)得到类似的结果(图3A和3B)。基因组表达的不存在通过荧光显微术得到证实(图8C)。
通过流式细胞术量化L1210细胞系中的凋亡水平。在处理后30个小时，NRRP诱导广泛的(群体的84％)早期/晚期凋亡(图9)。已表明，VSV诱导的凋亡与存在的内质网(ER)应激水平直接相关(10)。有趣的是，当细胞减轻ER应激的能力被破坏时，可诱导免疫原性凋亡(16)。NRRP诱导这种如下文所述的独特的细胞死亡形式。
在另一些实施例中，将L1210白血病细胞用NRRP与300μM苯达莫司汀(图10)、45μM地塞米松(图11)、0.025μM多柔比星(图12)或0.0125μM长春新碱(图13)组合处理72小时。显示NRRP自身以普通方式诱导细胞毒效应，然而当与上述药物组合时观察到相加和/或协同细胞毒效应。这证明当将NRRP治疗与其他化学治疗剂/药理活性剂组合时发生独特的治疗强化效应。
在又一个实施例中，将K562Ph-阳性髓细胞白血病细胞用UV--产生的NRRP与0.05μM伊达比星(irarubicin)(图14)组合处理72小时。同样地，在该实施例中，髓细胞白血病细胞系对NRRP介导的细胞死亡高度敏感并且通过将这类化学治疗剂与NRRP组合使用再次观察到强化效应。这些观察结果表明NRRP治疗确实可通过使用另外的治疗剂而增强。这代表了治疗癌症(特别是可能需要这种独特的组合方法以提高效力的顽固癌症形式)的一种作为替代的策略。
实施例5：描绘NRRP抗肿瘤特异性的模型
用于描述针对具有抗病毒信号途径缺陷的细胞的NRRP特异性的模型改编自我们先前在LeBoeuf等2013中描述的工作(图15A)。简言之，该模型由6个普通的微分方程式的子集表示，所述微分方程式描述了细胞群(UP、IP、AP和PP)间随环境中NRRP(N)和干扰素(IFN)的浓度的转变。这些方程式是：
d U P d t = - K V I × [ N ] × [ U P ] - ( - K I F N o n 1 + ( [ I F N ] E C 50 ) 2 + K I F N o n ) × [ U P ] + K T F N o f f × [ P P ] ,
d I P d t = K V I × [ N ] × [ U P ] - ( - K I F N o n 1 + [ I F N ] E C 50 2 + K I F N o n ) × [ I P ] - γ c × [ I P ] ,
d A P d t = ( - K I F N o n 1 + [ I F N ] E C 50 2 + K I F N o n ) [ I P ] - K V C × [ A P ] - γ c × [ A P ] ,
d P P d t = ( - K I F N o n 1 + [ I F N ] E C 50 2 + K I F N o n ) [ U P ] + K V C × [ A P ] - K I F N o f f × [ P P ] .
上述方程式中所使用的参数表示NRRP内化速率(KNI)、IFN信号传导活化速率(KIFNon)、IFN信传导失活速率(KIFNoff)、IFN的EC50(EC50)、细胞死亡速率(γC)和NRRP清除速率(KNC)。
下一个方程式子集通过以下方程式描述了NVRP(N)和干扰素(IFN)的动力学：
d N d t = - K V I × [ V ] × [ U P ] - γ V × [ V ] ,
d I F N d t = K I F N 1 × [ I P ] + K I F N 2 , 1 × [ A P ] + K I F N 2 , 2 × [ P P ] - γ I F N × I F N .
上述方程式中所使用的参数表示NRRP内化速率(KNI)；NRRP降解速率(γN)；IP、AP和PP的IFN产生速率(分别是KIFN1、KIFN2.1和KIFN2.2)和IFN降解速率(γIFN)。
通过围绕来自文献和实验证据的生理学参数在1log窗口内(表2)随机改变上述参数来进行MonteCarlo模拟(18)。使用施加非负限制的ODE15在Matlab中进行模拟。图15B中所述的趋势表示1000次模拟的中值。这些模拟中所使用的细胞数目是2.5E5、将介质体积设定为1ml并将PFU与细胞比值设定为100个颗粒/细胞。在这些模拟中，IFN信号传导途径中的缺陷通过将KIFN1、KIFN2.1、KIFN2.2、Kvc和KIFNon从其原始值的100％降低至1％进行模拟。
为了研究实现针对肿瘤细胞之特异性的机制，本公开内容的作者模拟了正常细胞和肿瘤细胞中NRRP诱导的细胞毒性。最近，本公开内容的作者已开发了描述正常细胞和肿瘤细胞中细胞毒性与活溶瘤病毒复制动力学之间的关系的基于群体的模型。根据该模型，当未感染的细胞群(uninfectedpopulation，UP)遇到病毒体时，感染周期开始。这允许UP群变得被感染并且在活病毒的情况下，病毒体和已知为干扰素(IFN)的细胞因子被释放到环境中。
随着IFN逐渐提高，细胞群激活抗病毒信号传导(antiviralsignalling，AP)，而抗病毒信号传导随着时间允许该群清除病毒感染并变得被保护免受进一步的损害(PP)。为了使该模型适应NRRP，本公开内容的作者将病毒复制动力学从模型去除，并模拟NRRP介导的细胞毒性与IFN信号传导途径中缺陷(已知发生在约80％癌症中的过程)的程度之间的关系。这些缺陷通过降低肿瘤细胞和正常细胞间的IFN产生速率、IFN信号传导活化速率和NRRP清除速率进行模拟。为了确保该观察是系统性的，使用Monte-Carlo模拟平台。在此，所有的动力学参数围绕来自文献或实验证据的估计值在1log窗口内变化(表2)。
在对1000个随机参数对的模拟(图15B)后，本公开内容的作者确定：随着癌细胞丧失其对IFN传导信号或作出响应的能力，这些细胞变得对NRRP介导的细胞毒性更敏感。为了证实这一观察结果，本公开内容的作者研究了IFN对正常细胞(HDF)和白血病细胞(L1210)中NRRP介导的细胞毒性的影响。有趣的是，尽管IntronA(重组IFN)可进一步提高正常细胞针对NRRP损害的保护(图15C)，但IntronA对白血病细胞却无可检测的影响(图15D)。
表2：围绕LeBoeuf等(2013)所述的实验和文献证据的参数估值的列表
表2
实施例6：AML原始细胞危象中的NRRP活性
在临床样品中研究NRRP平台的翻译潜力。从两个患有高负荷急性原始细胞危象的人患者获取外周血单核细胞并测试对NRRP介导的细胞死亡的敏感性。患者具有呈CD33阳性表型的循环原始细胞。这两个患者此前均已接受针对慢性髓细胞白血病(CML)的广泛治疗并对酪氨酸激酶抑制剂(TKI)治疗产生抗性。与L1210原始细胞中的观察结果类似，患者样品发生明显的具有典型形态学的NRRP诱导的凋亡(图16A)。荧光显微术证实不存在NRRP基因组表达(图16B)。实际上，在NRRP处理之后，这些CD33+白血病细胞被凋亡标志物AnnexinV强烈染色(图16C)。使用未经培养的患者样品的用途来评价这一应答的特异性。实际上，在这两个患者中，占优势的白血病CD33+群在NRRP处理后被去除，而留下正常细胞主导样品(图16D)。
为了确保NRRP不影响正常的白细胞，将从健康供体分离的骨髓单核细胞用PBS或NRRP处理。在早期(18小时)和晚期(65小时)两个时间点，NRRP均不诱导这些样品中发生凋亡(图17A和17B)。
实施例7：体内NRRP抗白血病活性
使用白血病原始细胞危象的鼠模型来评价NRRP作为治疗剂的潜力。简言之，在第一天，用1×106剂量的L1210原始细胞攻击DBA/2小鼠。第二天，使小鼠开始连续3天静脉内施用3×109NRRP的方案，并监测存活力。平行地，将小鼠的单独群(separatecohort)用活VSV以每次注射2×106病毒的MTD处理(19)，或者用PBS以相同的处理方案处理。在达到第40天时，经NRRP处理的小鼠获得80％的存活力，相对于经PBS(P≤0.0045)或活病毒(P≤0.044)处理的那些小鼠表现出显著优势(图18A)。NRRP被良好耐受并且以针对这一具体实验的最大可行剂量施用，所述最大可行剂量表示1500×高于活病毒的MTD的剂量。考虑到急性白血病频繁散布至中枢神经系统并且野生型VSV具有高神经毒性，进行颅内注射NRRP和活病毒。尽管小鼠可耐受颅内注射1×108个颗粒的最大产生剂量，但是所有的小鼠迅速死于1×104剂量的活病毒。
受NRRP治疗提供的效力和差别MTD的激发，有兴趣知道免疫系统在处理后是否被激活。在PBS或NRRP处理后20小时，从携带L1210肿瘤的小鼠收集鼠血清(图18B)。在该分析中，清楚的是通常已知招募和区分T细胞的细胞因子在NRRP处理后被诱导。这样的被NRRP处理显著诱导的免疫调节细胞因子的实例包括白血病抑制因子LIF、IL-2、IL-4、CCL-2、RANTES和MIP-1α(图18B)。
为了证实免疫系统刺激，特别是T细胞活化，本公开内容的作者采取了先前出版物中所述的疫苗策略。在实验上，该平台由以下组成：将凋亡细胞注射到免疫活性动物中并测量针对随后的肿瘤攻击的保护性适应性免疫。实际上，如在图16C中通过Annexin-V染色提高可看到的，经NRRP处理的L1210细胞发生显著凋亡。因此，采用这种典型的实验方法来探究NRRP是否触发免疫原性凋亡。
使DBA/2小鼠的两个群(与L1210同基因)每周三次接受静脉内给药1×106γ-辐照的经NRRP预处理的L1210细胞。使另一个群接受相同数目的γ-辐照的L1210细胞。在该方案后一周，经尾静脉施用L1210白血病攻击(1×106个细胞)并记录存活。接受经NRRP处理之L1210细胞的群在白血病攻击后具有80％的保护，与之不同的是，白血病攻击在施用未经处理的L1210的群中则是一致地致命的(图19)。使存活的小鼠保持＞150天以确保持久保护。这与以下观点一致：经NRRP处理的急性白血病细胞经历免疫原性凋亡。
通过使用来自处于急性原始细胞危象之经重度预治疗CML患者的急性成淋巴细胞和髓细胞白血病细胞系以及原代白血病细胞，证明NRRP是至少白血病特异性的溶细胞剂。通过上述详述的体外和体内实验，证实NRRP提供了多模式治疗平台。
实施例8：多发性骨髓瘤、脑癌和结肠癌细胞系中的NRRP活性
除上文所述的实验之外，当用PBS或VSV衍生的NRRP处理细胞系15小时时，还显示NRRP在多发性骨髓瘤细胞系MCP-11和RPMI-8226中是致细胞病变的(图20)。特别地，图21示出了以MOI＝250施用NRRP处理后72小时取得的骨髓瘤细胞系的阿拉莫蓝(Alamarblue)细胞毒性测定或刃天青测定后的细胞生存力。在该实验中，SR4987是正常的骨髓基质细胞系。如图21中所看到的，SR4987证明对NRRP具有抗性，因为其是非恶性细胞。当产生NRRP时，未发现NRRP或VSV基因组复制，因为没有产生病毒编码的GFP(数据未示出)。
在另一个实施例中，将MCP-11多发性骨髓瘤细胞系用20μM美法仑(图22)或15μMSMAC模拟物LCL161(图23)与NRRP组合处理。在这两种情况下，组合治疗均增强NRRP的致细胞病变效应。SMAC模拟物与NRRP之间的协同活性代表了一种有前景的方法。观察到SMAC模拟物的抗肿瘤活性被显著增强或者在一些情况下基本依赖于NRRP共施用。
在又一个实施例中，将RPMI-8226多发性骨髓瘤细胞系用增强细胞毒作用的5nM卡非佐米处理(图24)。证明NRRP与烷化剂(例如美法仑)、蛋白酶体抑制剂(例如卡非佐米)或SMAC模拟物(例如LCL161)的共施用代表了针对多种癌症的作为替代的治疗策略，特别是在基于造血系统的癌症(例如多发性骨髓瘤)中有前景的作为替代的治疗策略。
NRRP作为抗癌治疗剂的可用性通过其对脑肿瘤细胞系的作用而得到进一步证明。当将这些细胞用PBS或NRRP处理24小时后(图26)，与HDNF正常细胞相比，确定成胶质细胞瘤细胞系CT2A、迟发性脑肿瘤成胶质细胞瘤细胞系(DBT)(图25A)、星形细胞瘤细胞系K1491(图25B)和K1492以及小鼠神经胶质瘤细胞系(GL261)(图25C)中的NRRP介导的细胞毒性。
此外，在又一个实例中，将成胶质细胞瘤细胞系CT2A用10μMHDAC抑制剂SAHA与NRRP组合处理，并且与NRRP加PBS相比观察到致细胞病变效应增强(图27)。HDAC抑制已显示出作为抗癌剂的少量希望。然而，当与NRRP组合时，观察到显著的活性，代表了一种治疗基于成胶质细胞瘤之恶性肿瘤(尚未满足的临床需求)的非常有前景的方法。
肾癌(786-0)和乳腺癌(4T1)细胞系对NRRP的致细胞病变效应同等敏感(图28A、28B和28C)。在这一系列实验中，在72小时的时间内将细胞系用NRRP以MOI＝250处理，并通过刃天青测定量化生存力。在整个实验期间进行的荧光显微术证实不存在基因组表达。
在另一个实例中，将皮下CT26结肠癌细胞植入小鼠中。然后，将小鼠在肿瘤植入后的第16天、第18天和第21天用2E9个NRRP处理(图29)。不管在NRRP处理之前的大肿瘤负荷，当将NRRP通过瘤内或静脉内途径施用时，均获得延长的存活和治愈。经PBS对照处理的小鼠全部迅速达到终点。这一模型代表了实体瘤还可经受基于NRRP的方案的另外证据。
上述实施例通过计算机和体外测试表明：与活病毒类似，NRRP是肿瘤选择性的，因为它们利用大多数肿瘤常见的先天性免疫途径中的缺陷。然而，NRRP平台所提供的安全边界通过以下观察例示：高滴度颅内NRRP施用被鼠接受者良好耐受。
患有急性成淋巴细胞或急性髓细胞白血病的大多数成年患者的结果仍是凄惨的。对于少数患者而言，在清髓性预处理后进行同种异体干细胞移植具有潜在的治愈性，然而这种方法与频繁的不良事件和显著的治疗相关死亡率有关。对于患有慢性期CML的很多患者而言，靶向酪氨酸激酶抑制剂治疗提供了优异的疾病控制。当发展到急性白血病原始细胞危象时，由于发生多抗药性和这种形式的顽固白血病快速动力学而存在非常有限的治疗选择。
NRRP在多个急性白血病鼠模型中表现出直接的溶细胞性和免疫原性二者。程序性细胞死亡的特有形式涉及诱导针对垂死细胞的适应性免疫应答。这一过程(通常被称为免疫原性凋亡)对若干现有的化学治疗剂的效力来说是必须的并且是针对病毒感染(包括活RV)的宿主防御所需要的。上述体内结果表明NRRP诱导类似的过程并且该过程是治疗效力的驱动因素。
更相关的是以下观察结果：来自处于CML原始细胞危象之患者的多药抗性原代成髓细胞被迫使发生凋亡并且最终被NRRP处理根除。此外，从健康骨髓获取的非白血病白细胞未受到不利影响。该观察结果表明：尽管NRRP强大的杀肿瘤活性，但可避免在标准的诱导和巩固化学治疗后通常观察到的白细胞降低。这可显著降低治疗相关的不良事件。再者，考虑到正常白细胞在通过NRRP的白血病细胞缩减期间得以保留，对于不是高剂量放射化学治疗以及随后同种异体干细胞移植的候选者的大多数患者而言可实现同时诱导有效的抗白血病免疫应答。在NRRP诱导免疫原性凋亡之后，大批的免疫调节细胞因子被释放并且可能有助于发生有效的适应性免疫活性(实现持久治愈反应的关键因素)。
这些实施例证明了高滴度NRRP的产生。通过诱导主要经由程序性细胞死亡途径的细胞溶解，肿瘤-NRRP中的全身和瘤内免疫应答(包括自然杀伤细胞活化以及树突细胞活化或脉管系统关闭)具有若干种抗癌特性。可如下利用这些特征：单独使用NRRP或者将其作为辅助剂与放射治疗、化学治疗、免疫治疗、手术、溶瘤病毒衍生的或其他病毒衍生的治疗平台组合使用。
为了说明的目的，在以上描述中阐述了大量的具体细节以提供对实施例的充分理解。然而，对本领域技术人员显而易见的是，这些具体细节并不是所需要的。
上述实施例仅旨在为示例性的。本领域技术人员可对特定的实施例进行替换、修改和变更而不脱离只受所附权利要求限定的本发明的范围。参考文献
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Claims (75)

1.非复制型病毒衍生颗粒，其包含：
包膜，所述包膜在其表面上具有足够数目的功能性G蛋白以允许所述病毒衍生颗粒结合细胞表面并被内化；
RNA多核苷酸，所述RNA多核苷酸具有编码新病毒颗粒装配所需的所有蛋白质的序列；和
形成所述RNA周围的结构的蛋白质混合物；
其中所述RNA：
(a)具有充分交联的结构，使得所述RNA序列在所述细胞中不能用于：
转录完整基因组；
翻译所有蛋白质；或
上述二者；
以产生新病毒颗粒装配所需的足够的大分子；
(b)是充分不连续的，使得所述RNA序列在所述细胞中不能用于：
转录完整基因组；
翻译所有蛋白质；或
上述二者；
以产生新病毒颗粒装配所需的足够的大分子；或者
上述(a)和(b)二者。
2.根据权利要求1所述的非复制型病毒衍生颗粒，其中所述功能性G蛋白：
具有包含SEQIDNO：1的序列；
具有与SEQIDNO：1具有至少75％同一性并且能够与细胞表面结合并使所述颗粒内化的序列。
3.根据权利要求1或2所述的非复制型病毒衍生颗粒，其中所述形成所述RNA周围的结构的蛋白质混合物至少包含N蛋白、P蛋白、M蛋白和L蛋白。
4.根据权利要求3所述的非复制型病毒衍生颗粒，其中所述N蛋白：
具有包含SEQIDNO：2的序列；或
具有与SEQIDNO：2具有至少80％同一性并且能够参与形成蛋白质结构的序列。
5.根据权利要求3或4所述的非复制型病毒衍生颗粒，其中所述P蛋白：
具有包含SEQIDNO：3的序列；或
具有与SEQIDNO：3具有至少80％同一性并且能够参与形成蛋白质结构的序列。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的非复制型病毒衍生颗粒，其中所述M蛋白：
具有包含SEQIDNO：4的序列；或
具有与SEQIDNO：4具有至少80％同一性并且能够参与形成蛋白质结构的序列。
7.根据权利要求3至6中任一项所述的非复制型病毒衍生颗粒，其中所述L蛋白：
具有包含SEQIDNO：5的序列；或
具有与SEQIDNO：5具有至少70％同一性并且能够参与形成蛋白质结构的序列。
8.根据权利要求3至7中任一项所述的非复制型病毒衍生颗粒，其中所述RNA序列在所述颗粒结合和内化后产生功能性N蛋白、P蛋白、M蛋白和G蛋白，并且缺乏产生功能性L蛋白的能力。
9.根据权利要求3至7中任一项所述的非复制型病毒衍生颗粒，其中所述RNA序列在所述颗粒结合和内化后产生N蛋白、P蛋白和M蛋白，并且缺乏产生功能性G蛋白和L蛋白的能力。
10.根据权利要求3至7中任一项所述的非复制型病毒衍生颗粒，其中所述RNA序列在所述颗粒结合和内化后产生N蛋白和P蛋白，并且缺乏产生功能性M蛋白、G蛋白和L蛋白的能力。
11.根据权利要求3至7中任一项所述的非复制型病毒衍生颗粒，其中所述RNA序列在所述颗粒结合和内化后产生N蛋白，并且缺乏产生功能性P蛋白、M蛋白、G蛋白和L蛋白的能力。
12.根据权利要求3至7中任一项所述的非复制型病毒衍生颗粒，其中所述RNA序列缺乏产生功能性N蛋白、P蛋白、M蛋白、G蛋白和L蛋白的能力。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的非复制型病毒衍生颗粒，其中所述包膜的表面具有至少60个功能性G蛋白/颗粒。
14.根据权利要求1至12中任一项所述的非复制型病毒衍生颗粒，其中所述包膜的表面具有至少600个功能性G蛋白/颗粒。
15.根据权利要求1至12中任一项所述的非复制型病毒衍生颗粒，其中所述包膜的表面具有至少1200个功能性G蛋白/颗粒。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的非复制型病毒衍生颗粒，其中交联RNA包含至少0.05％的交联核苷酸。
17.根据权利要求1至15中任一项所述的非复制型病毒衍生颗粒，其中交联RNA包含至少0.5％的交联核苷酸。
18.根据权利要求1至15中任一项所述的非复制型病毒衍生颗粒，其中交联RNA包含至少1％的交联核苷酸。
19.根据权利要求1至15中任一项所述的非复制型病毒衍生颗粒，其中交联RNA包含至少10％的交联核苷酸。
20.根据权利要求1至15中任一项所述的非复制型病毒衍生颗粒，其中交联RNA包含至少20％的交联核苷酸。
21.根据权利要求16至20中任一项所述的非复制型病毒衍生颗粒，其中所述交联RNA包含少于80％的交联核苷酸。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的非复制型病毒衍生颗粒，其中所述RNA结构与RNA交联，与所述RNA周围的蛋白质结构中的蛋白质交联，或上述二者。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的非复制型病毒衍生颗粒，其中所述RNA周围的蛋白质结构包含这样的蛋白质，所述蛋白质：
与所述蛋白质结构的另一蛋白质交联；
是内部交联的；
与所述RNA结构交联；或
其任意组合。
24.根据权利要求1至15中任一项所述的非复制型病毒衍生颗粒，其中所述RNA包含至少2个不连续的RNA多核苷酸。
25.根据权利要求1至15中任一项所述的非复制型病毒衍生颗粒，其中所述RNA包含至少5个不连续的RNA多核苷酸。
26.根据权利要求1至15中任一项所述的非复制型病毒衍生颗粒，其中所述RNA包含至少10个不连续的RNA多核苷酸。
27.根据权利要求1至15中任一项所述的非复制型病毒衍生颗粒，其中所述RNA包含至少100个不连续的RNA多核苷酸。
28.根据权利要求1至15中任一项所述的非复制型病毒衍生颗粒，其中所述RNA包含不超过1000个核苷酸的不连续RNA多核苷酸。
29.根据权利要求1至15中任一项所述的非复制型病毒衍生颗粒，其中所述RNA包含不超过3000个核苷酸的不连续RNA多核苷酸。
30.根据权利要求1至15中任一项所述的非复制型病毒衍生颗粒，其中所述RNA包含不超过5000个核苷酸的不连续RNA多核苷酸。
31.根据权利要求1至15中任一项所述的非复制型病毒衍生颗粒，其中所述RNA包含不超过7000个核苷酸的不连续RNA多核苷酸。
32.根据权利要求1至15中任一项所述的非复制型病毒衍生颗粒，其中所述RNA包含不超过10,000个核苷酸的不连续RNA多核苷酸。
33.由活病毒产生非复制型病毒衍生颗粒的方法，所述活病毒包含具有编码N蛋白、P蛋白、M蛋白、G蛋白或L蛋白的序列的RNA，所述方法包括：
任选地使所述活病毒与UV吸收化合物分离；
使所述活病毒经受RNA损伤剂以：
(a)使所述活病毒的RNA结构充分交联，使得当所述病毒衍生颗粒在细胞中时：
RNA转录成mRNA降低；
mRNA翻译成蛋白质降低；或
上述二者；
从而防止产生新病毒颗粒装配所需的足够的蛋白质；
(b)将所述活病毒的RNA结构充分切割成不连续的RNA片段，使得当所述病毒衍生颗粒在细胞中时：
RNA转录成mRNA降低；
mRNA翻译成蛋白质降低；或
上述二者；
从而防止产生新病毒颗粒装配所需的足够的蛋白质；或
(c)(a)和(b)二者。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述G蛋白：
具有包含SEQIDNO：1的序列；
具有与SEQIDNO：1具有至少75％同一性并且能够与细胞表面结合并使所述颗粒内化的序列。
35.根据权利要求33或34所述的方法，其中所述N蛋白：
具有包含SEQIDNO：2的序列；或
具有与SEQIDNO：2具有至少80％同一性并且能够参与形成蛋白质结构的序列。
36.根据权利要求33至35中任一项所述的方法，其中所述P蛋白：
具有包含SEQIDNO：3的序列；或
具有与SEQIDNO：3具有至少80％同一性并且能够参与形成蛋白质结构的序列。
37.根据权利要求33至36中任一项所述的方法，其中所述M蛋白：
具有包含SEQIDNO：4的序列；或
具有与SEQIDNO：4具有至少80％同一性并且能够参与形成蛋白质结构的序列。
38.根据权利要求33至37中任一项所述的方法，其中所述L蛋白：
具有包含SEQIDNO：5的序列；或
具有与SEQIDNO：5具有至少70％同一性并且能够参与形成蛋白质结构的序列。
39.根据权利要求33至38中任一项所述的方法，其中使所述活病毒经受RNA损伤剂包括使所述活病毒经受电磁辐射。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述电磁辐射的波长小于约1mm。
41.根据权利要求39所述的方法，其中所述电磁辐射的波长小于约500nm。
42.根据权利要求39所述的方法，其中所述电磁辐射的波长小于约280nm。
43.根据权利要求39所述的方法，其中所述电磁辐射的波长为约1皮米至约300nm。
44.根据权利要求39所述的方法，其中所述电磁辐射的波长为约100nm至约400nm，并且其中使所述活病毒经受约100mJ/cm2至约8,000mJ/cm2剂量的电磁辐射。
45.根据权利要求39所述的方法，其中所述电磁辐射的波长为约100nm至约400nm，其中使所述活病毒经受约100mJ/cm2至约1000mJ/cm2剂量的电磁辐射。
46.根据权利要求39所述的方法，其中所述电磁辐射的波长为约100nm至约400nm，其中使所述活病毒经受约150mJ/cm2至约500mJ/cm2剂量的电磁辐射。
47.根据权利要求39所述的方法，其中所述电磁辐射的波长为约100nm至约280nm，并且使所述活病毒经受约150至约300mJ/cm2剂量的电磁辐射。
48.根据权利要求39所述的方法，其中所述电磁辐射是γ辐照，并且使所述活病毒经受约1kGy至约50kGy剂量的电磁辐射。
49.根据权利要求39所述的方法，其中所述电磁辐射是γ辐照，并且使所述活病毒经受约5kGy至约20kGy剂量的电磁辐射。
50.根据权利要求33至49中任一项所述的方法，其中使所述活病毒在37℃或更低的温度下经受RNA损伤剂。
51.根据权利要求44至47中任一项所述的方法，其中使所述活病毒在约25℃的温度下经受RNA损伤剂。
52.根据权利要求48或49所述的方法，其中使所述活病毒在约-80℃的温度下经受RNA损伤剂。
53.根据权利要求33至38中任一项所述的方法，其中使所述活病毒经受RNA损伤剂包括使所述活病毒暴露于RNA损伤化学试剂。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述RNA损伤化学试剂是能够使RNA交联的烷化剂。
55.根据权利要求53所述的方法，其中所述RNA损伤化学试剂是白消安、环磷酰胺、美法仑、甲醛、碳二亚胺或双磺基琥珀酰亚胺辛二酸酯。
56.根据权利要求53所述的方法，其中所述RNA损伤化学试剂是能够切割RNA的自由基形成剂。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述自由基形成剂是过氧化物、溴化氢、过硫酸铵或羟自由基。
58.根据权利要求33至57中任一项所述的方法，其中使所述活病毒与UV吸收化合物分离包括在蔗糖梯度中对包含所述活病毒的生长介质进行分级。
59.包括以下的方法：
向患者中的细胞群施用根据权利要求1至32中任一项所述的非复制型病毒衍生颗粒，其中所述细胞群包含癌细胞和非癌细胞，并且所述施用在所述患者中诱导细胞因子的表达和释放。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述患者中释放的所述细胞因子包括：白介素、干扰素、炎性细胞因子、CXC趋化因子家族的成员、肿瘤坏死因子家族的成员、或其任意组合。
61.在患者中诱导癌细胞发生细胞死亡的方法，所述方法包括：
向所述患者施用根据权利要求1至32中任一项所述的非复制型病毒衍生颗粒。
62.包括以下的方法：
向患者中的细胞群施用根据权利要求1至32中任一项所述的非复制型病毒衍生颗粒，其中所述细胞群包含癌细胞和非癌细胞，并且所述施用相比于所述非癌细胞优先导致所述癌细胞发生细胞死亡。
63.根据权利要求61或62所述的方法，其中所述细胞死亡通过凋亡实现。
64.根据权利要求61、62或63所述的方法，其中所述细胞死亡通过先天性免疫效应细胞、适应性免疫效应细胞或上述二者来实现。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述适应性免疫效应细胞是T细胞、B细胞或上述二者。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述先天性免疫效应细胞是肥大细胞、吞噬细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、自然杀伤细胞、γδT细胞或其任意组合。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述吞噬细胞是巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞或其任意组合。
68.根据权利要求59至67中任一项所述的方法，其中向所述患者施用1E10至1E15的非复制型病毒衍生颗粒。
69.根据权利要求59至67中任一项所述的方法，其中向所述患者施用1E11至1E13的非复制型病毒衍生颗粒。
70.根据权利要求59至69中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向所述患者施用化学治疗剂。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述化学治疗剂是苯达莫司汀、地塞米松、多柔比星、长春新碱、伊达比星、卡非佐米、辛二酰苯胺异羟肟酸、美法仑或SMAC模拟物LCL161。
72.根据权利要求72所述的方法，其中所述化学治疗剂是苯达莫司汀、白消安、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、达卡巴嗪、洛莫司汀、美法仑、替莫唑胺、噻替派、奥沙利铂、丙卡巴肼、喷司他丁、克拉屈滨、氯法拉滨、阿糖胞苷、氟达拉滨、吉西他滨、羟基脲、巯嘌呤、奈拉滨、氟尿嘧啶、博来霉素、放线菌素D、柔红霉素、多柔比星、多柔比星脂质体、伊达比星、米托蒽醌、卡培他滨、拓扑替康、伊立替康、依托泊苷、紫杉醇、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、高三尖杉酯碱、六甲蜜胺、天冬酰胺酶、天冬酰胺酶、培门冬酶、异维A酸、视黄酸、砷、长春碱、长春新碱、长春新碱脂质体、博舒替尼、达沙替尼、伊马替尼、尼罗替尼、舒尼替尼、维罗非尼、瑞戈非尼、硼替佐米、卡非佐米、沙利度胺、来那度胺、泊马度胺、甲氨蝶呤、普拉曲沙、依维莫司、坦西莫司、伏立诺他、罗米地辛、丙戊酸、地西他滨、阿扎胞苷、阿那格雷、可的松、地塞米松、泼尼松、曲安西龙、干扰素α2a、干扰素α2b、聚乙二醇化干扰素α2b、干扰素β1b、阿地白介素/IL-2、地尼白介素、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、抗CD20、抗CD47、抗CD33、抗CD38、抗CD138、抗CS1、抗CD52、抗VEGF、抗Her2/Neu、抗EGFR、抗CTLA4或抗IGF-1。
73.根据权利要求59至72中任一项所述的方法，其中所述癌是白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肾癌、乳腺癌、结肠癌或成胶质细胞瘤。
74.根据权利要求59至72中任一项所述的方法，其中所述癌是肝细胞癌、前列腺癌、肺癌、间皮瘤、子宫癌、子宫颈癌、膀胱癌、卵巢癌、胰腺癌、黑素瘤、基底细胞癌、黑素瘤、鳞状细胞癌、食管癌、胃癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、软组织癌、头癌、颈癌、甲状腺癌、成视网膜细胞瘤、或口腔癌。
75.根据权利要求59至74中任一项所述的方法，其中所述非复制型病毒衍生颗粒向所述患者瘤内、鼻内、肌内、皮内、腹膜内、动脉内、静脉内、皮下或颅内施用。
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