CN107530384A - 利用抗体组合的病毒疗法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了可用于癌症治疗方法的病毒。更具体地，该病毒表达诱导有效的抗肿瘤免疫反应的两种或更多种抗体。该病毒也可用于诊断方法中。

Description

利用抗体组合的病毒疗法

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年3月18日提交的美国临时申请62/135,096的利益和优先权，通过引用将其全部内容合并至本文中。

背景技术

癌症是美国第二大最常见死亡原因，仅次于心脏病。在美国，每4例死亡中有1例是癌症死亡。1996-2003期间诊断出的所有癌症患者的5年相对存活率是66%，比1975-1977年间的50%有所上升(Cancer Facts & Figures American Cancer Society: Atlanta, GA(2008))。发现高度有效的癌症治疗方法是癌症研究的主要目标。

发明内容

本发明大体上涉及人类癌症的治疗，更具体地，涉及多种治疗形态的组合以诱导有效的抗肿瘤免疫响应。

在一些实施方式中，本发明公开了一种治疗实体瘤的方法，该方法包括向对象施用能够感染肿瘤中的细胞的重组病毒，或施用包含能够感染肿瘤中的细胞的病毒的细胞，其中所述病毒表达：(i)靶向肿瘤微环境(TME)的两种或更多种抗体；(ii)靶向TME的两种或更多种刺激性或抑制性蛋白；或(iii)至少一种靶向TME的抗体以及来自靶向TME的刺激性或抑制性蛋白中的至少一种。在一些实施方式中，该病毒是溶瘤病毒。在一些实施方式中，该溶瘤病毒是牛痘病毒。在一些实施方式中，该病毒是可复制溶瘤牛痘病毒(VACV)。在一些实施方式中，该病毒表达靶向TME的两种或更多种抗体。在一些实施方式中，所述两种或更多种抗体选自：(i)结合至刺激血管生成和/或血管化的蛋白的抗体，(ii)结合至选自表皮生长因子受体(EGFR)、Her2/c-neu、Her3和Her4的受体酪氨酸激酶的抗体，和(iii)结合至上皮-间质相互作用的发展所涉及的蛋白的抗体。在一些实施方式中，所述两种或更多种抗体选自：结合至血管内皮生长因子(VEGF)的抗体、结合至表皮生长因子受体(EGFR)的抗体、以及结合至成纤维细胞活化蛋白(FAP)的抗体。在一些实施方式中，所述两种或更多种抗体的其中一种是结合至VEGF的抗体。在一些实施方式中，该结合至VEGF的抗体是G6-31。在一些实施方式中，所述两种或更多种抗体中的其中一种是结合至EGFR的抗体。在一些实施方式中，该结合至EGFR的抗体是抗EGFR VHH。在一些实施方式中，所述两种或更多种抗体的其中一种是结合至FAP的抗体。在一些实施方式中，该结合至FAP的抗体是M036。在一些实施方式中，所述两种或更多种抗体包含结合至VEGF的抗体和结合至EGFR的抗体。在一些实施方式中，所述两种或更多种抗体包含结合至VEGF的抗体和结合至FAP的抗体。在一些实施方式中，所述两种或更多种抗体包含结合至EGFR的抗体和结合至FAP的抗体。在一些实施方式中，VACV选自GLV-1h444和GLV-1h446。在一些实施方式中，所述方法进一步包括施用额外的癌症疗法。在一些实施方式中，所述额外的癌症疗法选自：放射疗法、化学疗法、光疗及其组合。在一些实施方式中，所述肿瘤选自：恶性胶质瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌、卵巢癌、成神经细胞瘤、中枢神经系统肿瘤和黑素瘤。在一些实施方式中，所述病毒被静脉内递送至所述对象。在一些实施方式中，所述病毒被静脉内直接递送进肿瘤，或递送至所述对象的肿瘤区域内。在一些实施方式中，所述方法进一步包括向所述对象提供至少一种能够感染肿瘤的细胞的另外的病毒，其中该病毒表达一种或多种以下物质：(i)靶向肿瘤微环境(TME)的抗体或(ii)靶向TME的刺激性或抑制性蛋白，其中该至少一种另外的病毒表达一种或多种以下物质：(i)靶向TME的抗体或(ii)靶向TME的刺激性或抑制性蛋白，它们不同于表达(i)靶向肿瘤微环境(TME)的抗体或(ii)靶向TME的刺激性或抑制性蛋白的病毒所表达的那些抗体或蛋白。

在一些实施方式中，本发明公开一种能够感染实体瘤中的细胞的重组病毒，其中该病毒表达：(i)靶向肿瘤微环境(TME)的两种或更多种抗体；(ii)靶向TME的刺激性或抑制性蛋白中的两种或更多种，或(iii)靶向TME的至少一种抗体以及靶向TME的刺激性或抑制性蛋白质中的至少一种。在一些实施方式中，该病毒是溶瘤病毒。在一些实施方式中，该溶瘤病毒是牛痘病毒。在一些实施方式中，该病毒是可复制溶瘤牛痘病毒(VACV)。在一些实施方式中，该病毒表达两种或更多种抗体。在一些实施方式中，所述两种或更多种抗体选自：(i)结合至刺激血管生成和/或血管化的蛋白的抗体，(ii)结合至选自表皮生长因子受体(EGFR)、Her2/c-neu、Her3和Her4的受体酪氨酸激酶的抗体，和(iii)结合至上皮-间质相互作用的发展所涉及的蛋白的抗体。在一些实施方式中，该病毒包含两种或更多种编码或表达选自以下的两种或更多种抗体的异源核酸：结合至血管内皮生长因子(VEGF)的抗体、结合至表皮生长因子受体(EGFR)的抗体、和结合至成纤维细胞活化蛋白(FAP)的抗体。在一些实施方式中，结合至VEGF的抗体是G6-31。在一些实施方式中，所述两种或更多种抗体的其中一种是结合至EGFR的抗体。在一些实施方式中，结合至EGFR的抗体是抗EGFR VHH。在一些实施方式中，所述两种或更多种抗体的其中一种是结合至FAP的抗体。在一些实施方式中，结合至FAP的抗体是M036。在一些实施方式中，所述两种或更多种抗体包含结合至VEGF的抗体和结合至EGFR的抗体。在一些实施方式中，所述两种或更多种抗体包含结合至VEGF的抗体和结合至FAP的抗体。在一些实施方式中，所述两种或更多种抗体包含结合至EGFR的抗体和结合至FAP的抗体。在一些实施方式中，所述VACV选自GLV-1h444和GLV-1h446。在一些实施方式中，所述病毒是李斯特病毒株。在一些实施方式中，A34R基因被来自另一牛痘病毒株的A34R基因取代。在一些实施方式中，A34R基因被来自牛痘IHD-J病毒株的A34R基因所取代。在一些实施方式中，该病毒缺失A35R基因。在一些实施方式中，该病毒进一步包含额外的编码诊断性或治疗性蛋白的异源核酸分子。在一些实施方式中，该额外的异源核酸分子编码诊断性蛋白。在一些实施方式中，该诊断性蛋白选自荧光素酶、荧光蛋白、储铁分子(iron storage molecule)、铁转运体、铁受体或结合至造影剂的蛋白、可被检测到的发色团或化合物或可检测配体。在一些实施方式中，该额外的异源核酸分子编码治疗性蛋白。在一些实施方式中，该治疗性蛋白选自细胞因子、趋化因子、免疫调节分子、抗原、单链抗体、反义RNA、前药转化酶、siRNA、血管新生抑制剂、毒素、抗肿瘤寡肽、有丝分裂抑制蛋白、抗有丝分裂寡肽、抗癌多肽抗生素和组织因子。

本发明在一些实施方式中公开了一种包含如本文所公开的重组病毒的宿主细胞。

本发明在一些实施方式中公开了包含如本文所公开的重组病毒的肿瘤细胞。

本发明在一些实施方式中公开了包含本文所公开的重组病毒的哺乳动物生物体或被本文所公开的重组病毒感染的哺乳动物生物体。

本发明进一步公开了本文所公开的重组牛痘病毒在治疗对象的肿瘤中的应用。

本发明还公开了本文所公开的牛痘病毒在制备用于治疗对象的肿瘤的药物组合物中的应用。在一些实施方式中，该药物组合物进一步包含抗癌化合物。

本发明还公开了能够感染肿瘤中的细胞的重组病毒或包含能够感染肿瘤的病毒的细胞在治疗对象的实体瘤的方法中的应用，所述方法包括向该对象施用所述能够感染肿瘤中的细胞的重组病毒或施用包含能够感染肿瘤的病毒的细胞，其中该病毒表达：(i)靶向肿瘤微环境(TME)的两种或更多种抗体；(ii)靶向TME的刺激性或抑制性蛋白中的两种或更多种，以及(iii)靶向TME的至少一种抗体以及靶向TME的刺激性或抑制性蛋白质中的至少一种。

附图说明

图1示例性给出了抗体和新VACV的示意图。(a)抗EGFRVHHFLAG、抗VEGF scAb(GLAF-2)和抗FAP scAb(GLAF-5)构建体的示意图。(b)新重组VACV及其亲本病毒的基因组结构。GLV-1h442和GLV-1h282源自GLV-1h68，分别用在PSEL启动子控制下的抗EGFRVHHFLAG和GLAF-5盒取代J2R基因座上的lacZ表达盒而获得。GLV-1h164源自GLV-1h68，通过用PSE启动子控制下的hNET替换J2R基因座上的lacZ表达盒、用PSL启动子控制下的GLAF-2表达盒替换A56R基因座上的gusA表达盒而获得。GLV-1h444和GLV-1h446源自GLV-1h164，分别用在VACV PSEL启动子控制下的抗EGFRVHHFLAG和GLAF-5表达盒取代J2R基因座处的hNET表达盒而获得。所有病毒在F14.5L基因座处含有ruc-gfp表达盒。PSE、PSEL、PSL、P11和P7.5分别是VACV合成早期、合成早/晚期、合成晚期11K和7.5K启动子。

图2举例说明靶向TME的病毒表达的单独治疗性抗体在A549和DU145肿瘤异种移植模型中显著增强病毒疗法。(a)从GLV-1h164表达的靶向VEGF的抗体显著增强了病毒疗法。将携带A549异种移植肿瘤(n≥7)的小鼠分别单独用病毒、单独用Avastin、单独用PBS或用病毒联合Avastin处理。当肿瘤体积达到450 mm³时，静脉内(i.v.)给予单剂量的病毒(2×10⁶ pfu /小鼠)。 Avastin通过腹腔给药，剂量为5mg / kg，每周两次，持续5周，从10 dpi开始。 箭头指示剂量治疗的开始和结束。使用单向ANOVA进行统计分析(*** P <0.001，**P <0.01，* P <0.05)。星号表示GLV-1h68组与GLV-1h164组(黑色)的比较以及与GLV-1h68+ Avastin组(空心)的比较。 αV表示抗VEGF。(b)从GLV-1h442表达的靶向EGFR的抗体显著增强了病毒疗法。 携带A549异种移植肿瘤(n≥7)的小鼠分别单用病毒、单用Erbitux、单用PBS或病毒联合Erbitux治疗。当肿瘤体积达到450 mm³时静脉给予单次剂量的病毒(2×10⁶pfu /小鼠)。Erbitux经i.p.给药，剂量为3mg / kg，每周两次，持续5周，从10 dpi开始。箭头表示Erbitux治疗的开始和结束。采用单因素ANOVA进行统计分析(** P <0.01，* P <0.05)。星号表示GLV-1h68组与GLV-1h442组的比较。 αE表示抗EGFR。(c)从GLV-1h282表达的靶向FAP的抗体显著增强了病毒疗法。当肿瘤体积达到450 mm³时向A549异种移植瘤(n≥7)小鼠静脉注射单剂量的GLV-1h68或GLV-1h282(2×10⁶ pfu /小鼠)。统计分析采用单因素ANOVA进行(** P <0.01，* P <0.05)。星号表示GLV-1h68组与GLV-1h282组的比较。 αF表示抗FAP。(d)当肿瘤体积达到450 mm³时向DU145荷瘤小鼠(n = 5)静脉内注射每种VACV毒株(2×10⁶ pfu /小鼠)，然后每周监测肿瘤体积。 使用单向ANOVA进行统计分析(*** P <0.001，** P <0.01，* P <0.05)。星号表示GLV-1h68组与GLV-1h164组(黑色)、GLV-1h282组(空心)和GLV-1h442组(灰色)的比较。

图3举例说明靶向VEGF、EGFP和FAP的肿瘤内表达的抗体对TME的影响。(a)病毒治疗对DU145肿瘤中肿瘤血管系统的影响(n = 3)。将切片染色以检测CD31表达(红色)。 GFP表达(绿色)表示病毒感染。(b)通过在每个载玻片的8个不重叠的显微镜视野中计数CD31 +血管进行血管的定量分析。统计学分析采用双尾不成对Student t检验(** P <0.01，* P <0.05)。(c)病毒处理对DU145肿瘤中细胞增殖的影响(n = 3)。将切片染色以检测Ki67表达(红色)。GFP表达(绿色)表示病毒感染。在a，c中，比例尺代表1 mm。(d)通过在每个载玻片的八个不重叠的显微镜视野中计数Ki67 +细胞来进行细胞增殖的定量分析。统计学分析采用双尾不成对Student t检验(** P <0.01，* P <0.05)。(e)病毒复制和基质生成(stromagenesis)的免疫组化表征。将福尔马林固定且石蜡包埋的肿瘤组织(n = 4-5 /组)切成5μm切片并进行H＆E染色。相邻切片用抗A27染色VACV、用抗CD31染色血管、用抗FAP染色FAP +基质细胞。(f)条形图显示感染或未感染区域中CD31 +细胞和FAP +基质簇的平均数目。计数每个肿瘤5个不重叠的显微镜视野(100×放大率)中的CD31 +和FAP +基质簇。统计学分析采用双尾不成对Student t检验(** P <0.01，* P <0.05)。

图4举例说明了如何通过表达抗FAP scab的GLV-1h282显著抑制FaDu肿瘤生长。但是，FaDu肿瘤对GLV-1h68的处理没有反应。

图5举例说明每个重组VACV如何表达预期的抗体。

图6举例说明两种抗体的表达如何不显示对病毒复制效率的负面影响。病毒复制试验是以0.01的感染复数(MOI)在A549细胞中进行的。

图7举例说明病毒表达的靶向TME的两种治疗性抗体进一步改善病毒疗法。(a)GLV-1h444在携带A549荷瘤裸鼠中增强的治疗效果。将小鼠(n≥7)单用病毒、用Avastin+Erbitux、单用PBS或用病毒联合Avastin和Erbitux治疗。当肿瘤体积达到450 mm³时静脉给予单次剂量的病毒(2×10⁶ pfu /小鼠)。Avastin和Erbitux通过腹腔注射，剂量分别为5mg/ kg和3mg / kg，每周两次，持续5周，从10dpi开始。箭头表示Avastin和Erbitux治疗的开始和结束。使用单向ANOVA进行统计分析(*** P <0.001，** P <0.01，* P <0.05)。星号表示GLV-1h68组与GLV-1h444组(黑色)、GLV-1h68 + Avastin + Erbitux组(空心)和PBS +Avastin + Erbitux组(灰色)的比较。(b)在携带A549肿瘤的裸鼠中GLV-1h446与其亲本病毒相比具有增强的治疗效果。当肿瘤体积达到450 mm³时，小鼠(n≥7)以2×10⁶ pfu /小鼠的剂量i.v.单独注射每种VACV毒株。使用单向ANOVA进行统计分析(*** P <0.001，** P <0.01，* P <0.05)。星号表示GLV-1h68组与GLV-1h446组(黑色)的比较。(c)在携带DU145肿瘤的小鼠中，GLV-1h444和GLV-1h446与它们的亲代病毒相比具有增强的治疗效果。当肿瘤体积达到450 mm³时，小鼠(n = 5)以2×10⁶ pfu /小鼠的剂量静脉单独注射每种VACV毒株。使用单向ANOVA进行统计分析(*** P <0.001，** P <0.01，* P <0.05)。星号表示GLV-1h68组与GLV-1h444组(黑色)和GLV-1h446组(空心)的比较。(d-f)VACV处理后携带A549肿瘤的小鼠体内肿瘤体积的变化和小鼠血清中抗体的检测。在7、21和35 dpi下眼眶后取血。用预包被的FAP、EGFR和VEGF平板通过ELISA测定小鼠血清中抗体的浓度。用数字卡尺测量肿瘤。统计分析采用双尾不成对Student's t-检验(*** P <0.001)。

图8举例说明了携带A549肿瘤的各个小鼠的肿瘤生长曲线。

图9举例说明了通过标准病毒空斑试验确定的在14 dpi的A549肿瘤携带小鼠的不同器官和肿瘤中的病毒生物分布。

图10举例说明了表达抗体的VACV施用对小鼠的可能不利影响的评估。 通过评估治疗过程中净体重的变化进行所述评估。在A549和DU145肿瘤异种移植模型中，对于任何处理组或对照组，都没有观察到平均净体重的显著变化。

图11举例说明GLV-1h444和GLV-1h446的病毒表达的两种抗体有助于抑制肿瘤中的细胞增殖。(a)在DU145肿瘤中通过VACV抑制细胞增殖(n = 3)。GFP表达(绿色)表示病毒感染。通过用抗Ki67抗体(红色)染色来检查细胞增殖。(b，c)通过在每个载玻片的8个不重叠的显微镜视野中计数Ki67 +细胞来进行未感染或感染区域中细胞增殖的定量分析。统计学分析采用双尾不成对Student t检验(** P <0.01，* P <0.05)。

图12举例说明GLV-1h444和GLV-1h446病毒表达的两种抗体有助于抑制肿瘤中的血管生成。(a)DU145肿瘤中VACV减少了肿瘤血管系统(n = 3)。切片用抗CD31抗体染色(红色)。 GFP表达(绿色)表示病毒感染。(b，c)通过在每个载玻片的8个不重叠的显微镜视野中计数CD31 +细胞来进行未感染或感染区域中血管的定量分析。使用双尾不成对Student'st-检验进行统计分析(*** P <0.001，** P <0.01，* P <0.05)。a，d中比例尺表示1mm。

详细描述

虽然在过去30年中抗癌治疗取得了巨大的进步，但在世界范围内癌症仍然是主要的死亡原因。忽视肿瘤微环境(TME)在癌生长和转移中的重要作用可能是仍未实现完全有效的癌症治疗的原因之一。肿瘤基质中的细胞的血管生成和增殖不仅支持癌症的生长，而且促进其发展(例如在转移过程中)。

TME内的因素，例如血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子受体(EGFR)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)，在癌症起始和发展中起到至关重要的作用。VEGF或EGFR的高水平表达与乳腺癌、结肠癌、肺癌、头颈癌及其他癌症患者的预后差相关。抗VEGF单抗(mAb)贝伐珠单抗(Avastin)在2004年被美国食品药品管理局(FDA)批准用于治疗转移性结肠癌，随后被批准用于其他转移性结肠癌。同年，抗EGFR mAb西妥昔单抗(Erbitux)被FDA批准用于治疗转移性结肠癌。但是，Avastin和Erbitux的临床效果某种程度上来说是有限的，这可能是由于其肿瘤穿透性差以及mAb快速从血液循环中清除导致的，因而需要频繁高剂量给药，给药时间长，也使得这些疗法极其昂贵。

对目前 mAb治疗剂的药效学性质的改进以及识别靶向TME的另外的功能物质可能会非常有益。例如，G6-31是来自噬菌体展示库的改进的抗VEGF抗体，其在动物模型中比Avastin具有更好的结合亲和性和更强的疗效。为改善肿瘤穿透性，最近开发出了一种抗EGFR的来自美洲驼的15 kDa单域抗体(称为抗EGFR VHH)。这种美洲驼纳米抗体在小鼠中是无免疫源性的，并且被证明阻断了EGF与EGFR的结合，从而抑制EGFR信号转导，展示出特异性的肿瘤靶向。抗EGFR VHH被用于分子成像和治疗用途。FAP(也称为seprase)是一种高度保守的蛋白质，其在侵袭性癌症的基质中特别丰富地表达。高水平的FAP表达与癌症进展相关。M036是一种跨物种反应性FAP特异性单链抗体(scAb)，其通过连续噬菌体展示而分离，并且显示能够结合不同的人癌的基质细胞上的FAP以及人肿瘤异种移植物中的鼠科宿主基质的细胞上的FAP。M036的治疗潜力尚未被评估。

可复制型溶瘤牛痘病毒(VACV)GLV-1h68在人异种移植裸鼠模型中单剂量给药后即在肿瘤细胞中定位、复制和裂解肿瘤细胞。此外，重组VACV能够在遗传学上被修饰以表达功能性转基因，包括scAb。之前研究显示，表达抗VEGF scAb GLAF-1的VACV(根据G6-31的序列设计)与亲本病毒GLV-1h68相比显著改善了在小鼠中的抗癌疗效。当与放疗结合使用时，该疗效进一步增强。

因此，通过编码抗FAP的scAb(GLV-1h282)和抗EGFR的单域抗体(GLV-1h442)构建了表达新的TME靶向抗增殖活性的新的重组VACV。表达这些单独抗体的VACV显著抑制异种移植肿瘤模型中的肿瘤生长，证实了这些通过病毒表达的抗体的功能性和疗效。最后，编码具有抗增殖活性和抗血管生成活性的两种抗体的其他重组VACV也被生产出来了，分别靶向VEGF和EGFR(GLV-1h444)，或靶向VEGF和FAP(GLV-1h446)。表达TME靶向的抗体(单独或组合形式)的新VACV显著增强了溶瘤性病毒疗法的抗肿瘤效果。

而且，用这两个表达抗体的VACV(GLV-1h444(抗EGFR和抗VEGF)或GLV-1h446(抗FAP和抗VEGF))治疗小鼠肿瘤，令人惊讶的是，效果要好于用GLV-1h68与连续给予Avastin(抗VEGF)和Erbitux (抗EGFR)联合治疗。病毒表达的抗体的抗增殖和抗血管生成效果在肿瘤的被该病毒直接感染之外的区域也是明显的，证实scAb能够实现肿瘤穿透，同时局部地表达。因此，我们的结果证实VACV的溶瘤病毒疗法因共表达具有靶向TME的抗增殖和抗血管生产活性的病毒编码抗体而显著增强。此外，该增强的治疗效果是通过单次给予可复制型重组VACV实现的。

因此，表达靶向VEGF、EGFR和FAP的抗体(单独或组合)的新重组VACV在临床前动物模型中显著增强溶瘤病毒疗法。GLV-1h164、GLV-1h442和GLV-1h282(每个都表达scAb)的疗效比它们的亲本病毒GLV-1h68显著更佳，表明溶瘤病毒疗法可通过抗VEGF(降低血管生成)、EGFR(抑制细胞增殖)或FAP(降低血管生成和抑制MSC的招募)的单独抗体的病毒性表达来改善。而且，该疗效通过在单个VACV病毒株中表达两种抗体而进一步增强。表达靶向VEGF和EGFR的抗体的GLV-1h444的疗效比Avastin和Erbitux的组合治疗显著更佳，并且也比用GLV-1h68与Avastin和Erbitux联合治疗更好。

肿瘤中VEGF、EGFR和FAP的高水平表达与预后差相关。虽然临床前实验结果很有前景，但Avastin和Erbitux仅显示出有限的临床效果，部分原因在于穿透性差、抗体肿瘤靶向性低以及系统给药后从循环中快速清除。溶瘤VACV不仅特异性地靶向和摧毁肿瘤细胞，而且介导治疗性蛋白质在受感染的肿瘤中的局部生产，从而避免了使用抗体治疗剂相关的局限性。检测用表达一种或两种抗体的VACV处理的小鼠的血清证实了抗体的持续。在注射病毒后，抗体在早期被检测到比后期(35 dpi)具有更高的量(7和21 dpi)，在后期时肿瘤已开始缩小。此外，用GLV-1h282和GLV-1h442处理的小鼠的血清中的抗FAP 抗体(GLAF-5)和抗EGFRVHHFLAG抗体的量分别比用GLV-1h164处理的小鼠血清中抗VEGF (GLAF-2)抗体的量更高。这与GLV-1h282 和GLV-1h442在肿瘤中的病毒滴度比GLV-1h164更高是一致的。虽然GLV-1h68在肿瘤中的病毒滴度显著高于GLV-1h164 (P = 0.02)，但GLV-1h164在培养物中比GLV-1h68复制得稍快，表明GLAF-2的表达降低了肿瘤中的病毒复制。靶向EGFR 或FAP的抗体的表达对肿瘤中的病毒复制没有负面作用。

众所周知，癌症进展是由于癌细胞的不受控生长导致的。用GLV-1h68处理可抑制肿瘤中的细胞增殖，这可从感染区域Ki67+细胞的数量急剧降低明显看出，这和VACV感染的固有性质是一致的。值得注意的是，用表达抗EGFR纳米抗体的GLV-1h442 和GLV-1h444处理显著降低了受感染区域以及未感染区域的Ki67+细胞的数量，表明从感染细胞中分泌的抗EGFR纳米抗体扩散进入了未感染区域，抑制了EGFR+细胞的增殖。虽然用表达抗VEGF抗体的GLV-1h164或表达抗FAP抗体的GLV-1h282处理显著抑制了肿瘤的感染区域的增殖，但在未感染区域的作用仅仅是轻微的，并不显著。重要的是，用表达抗VEGF和抗FAP的GLV-1h446处理显著地抑制了感染和未感染区域的增殖，证实了两种抗体表达对细胞生长的叠加抑制作用。

癌的生长和发展还需要通过血管的持续的营养输送。在GLV-1h68感染的肿瘤的感染区域观察到了血管密度(BVD)的降低，但在未感染区域未观察到，表明VACV感染本身可导致肿瘤血管系统的破坏。抗VEGF scAb的表达不仅在受感染区域增强了血管破坏，而且在未感染区域导致BVD的显著降低。因此，与抗EGFR纳米抗体类似，抗VEGF scAb也可以从感染区域扩散到未感染区域。靶向FAP的疗法部分地通过抑制肿瘤血管生成而抑制肿瘤生长。病毒表达的抗FAP scAb显著降低了FaDu肿瘤异种移植模型中感染区域和未感染区域中的BVD，而在DU145肿瘤异种移植模型中显著降低了感染区域的BVD。虽然抗EGFR纳米抗体的表达不会显著影响DU145肿瘤异种移植模型中感染区域或未感染区域的BVD，但是已有报道称EGFR促进肿瘤血管生成。

FAP是支持肿瘤生长的癌相关成纤维细胞(CAF)表达的标记物之一。FAP+ CAF的消融已显示能够抑制肿瘤生长。与用GLV-1h68处理相比，用表达抗FAP scAb的GLV-1h282处理具有FaDu肿瘤异种移植物的小鼠导致在肿瘤的感染和未感染区域FAP+细胞数量的大大降低。GLV-1h282的这种增强的抗肿瘤作用可能归因于对CAF(而非对癌细胞)的作用，因为FaDu肿瘤细胞不表达FAP。

因此，溶瘤VACV感染本身极大降低了受感染肿瘤的细胞增殖和血管分布。这些抗肿瘤效果因抗VEGF、EGFR和FAP的scAb在重组VACV中单独或组合地表达而显著增强。抗体的共表达的效果比得上或优于VACV与临床抗体的组合治疗，并且具有单次给药和局部瘤内递送的好处。该疗效将受感染肿瘤细胞的溶瘤性与TME的抗肿瘤改变结合起来。据我们所知，这是首次证实了病毒表达的抗EGFR和FAP的抗体单独增强溶瘤病毒疗法，并且当与抗VEGF抗体结合时进一步增强了抗肿瘤疗效。

定义

如本文所使用的，对象包括预期进行诊断、筛选、监控或治疗的任何动物。动物包括哺乳动物(如灵长类)和饲养动物。在一些实施方式中，对象是哺乳动物。在一些实施方式中，对象是选自小鼠、大鼠、兔、狗或猫的哺乳动物。在一些实施方式中，对象是灵长类动物。一种示例性的灵长类动物是人。患者是指受疾病病症折磨或要确定疾病病症或要确定疾病病症的风险的对象，例如哺乳动物、灵长类动物、人或牲畜。

如本文所使用的，术语“抗体”具有最广义的涵义并且具体覆盖单克隆抗体(包括全程单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(如双特异性抗体)、双特异性T细胞衔接(BiTE)抗体以及抗体片段(如单链、纳米抗体等)，只要它们表现出期望的生物学活性。在一些实施方式中，该抗体是多克隆抗体。在一些实施方式中，该抗体是单克隆抗体。在一些实施方式中，该抗体是Fab片段。在一些实施方式中，该抗体是单链抗体。在一些实施方式中，该抗体是纳米抗体。在一些实施方式中，该抗体选自Fab、Fv、F(ab')2、scFV、双链抗体(diabody)和双特异性抗体。在一些实施方式中，该抗体是人源化抗体。在一些实施方式中，本文引述的任何一个抗体实施方式被明确地排除。

如本文所使用的，“病毒”是指被称为病毒的任何一大群实体。病毒通常含有包围遗传材料的RNA或DNA核的蛋白质衣壳，但不具有半透膜，并且仅能够在活细胞中生长和复制。可用于本文提供的方法的病毒包括，但不限于，痘病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、新城疫病毒、水疱性口炎病毒、腮腺炎病毒、流感病毒、麻疹病毒、呼肠孤病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、汉坦病毒、黏液瘤病毒、巨细胞病毒(CMV)、慢病毒和任何植物或昆虫病毒。在一些实施方式红，本文引述的任何一个病毒实施方式被明确地排除。

如本文所使用的，术语“病毒载体”具有本领域公认的涵义。它是指包括至少一个来源于病毒的元件并且可被包装称病毒载体颗粒的核酸载体构建体。病毒载体颗粒可被用来在体外或体内将DNA、RNA或其他核酸转移到细胞中。病毒载体包括，但不限于，逆转录病毒载体、牛痘病毒载体、慢病毒载体、疱疹病毒载体(如HSV)、杆状病毒载体、巨细胞病毒(CMV)载体、乳头瘤病毒病毒、猴病毒(SV40)载体、semliki森林病毒载体、噬菌体载体、腺病毒载体和腺相关病毒(AAV)载体。

如本文所使用的，“血液系统恶性肿瘤”是指血液和淋巴系统的肿瘤(如霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、恶性免疫增殖性疾病、多发性骨髓瘤和恶性浆细胞瘤、淋巴性白血病、髓性白血病、急性或慢性淋巴细胞性白血病、单核细胞性白血病、其他具体细胞类型的白血病、未指明细胞类型的白血病、其他及未指明的恶性淋巴瘤、恶性造血及其他组织瘤(如大细胞淋巴瘤)、T细胞淋巴瘤或皮肤T细胞淋巴瘤)。

重组病毒及应用方法

本发明在一些实施方式中公开了一种治疗是实体瘤的方法，该方法包括向对象提供能够感染肿瘤细胞的重组病毒或包含能够感染肿瘤细胞的病毒的细胞，其中该病毒表达两种或更多种：(i)靶向肿瘤微环境(TME)的抗体或(ii)靶向TME的刺激性或抑制性蛋白。在一些实施方式中，该病毒是溶瘤病毒。在一些实施方式中，该溶瘤病毒是牛痘病毒。在一些实施方式中，该病毒是可复制型溶瘤牛痘病毒(VACV)。在一些实施方式中，该方法进一步包含向该对象提供额外的病毒，其中该额外的病毒表达一种或多种：(i)靶向肿瘤微环境(TME)的抗体或(ii)靶向TME的刺激性或抑制性蛋白，其中该至少一种额外的病毒表达一种或多种(i)靶向TME的抗体或(ii)靶向TME的刺激性或抑制性蛋白，其不同于表达(i)靶向肿瘤微环境(TME)的抗体或(ii)靶向TME的刺激性或抑制性蛋白的病毒所表达的抗体或蛋白。

因此，本发明提供了用于治疗和诊断的病毒，包括含有异源核酸分子的重组牛痘病毒，该异源核酸分子编码至少两种治疗性基因产物(即，两种或更多种：(i)靶向肿瘤微环境的抗体或(ii)靶向肿瘤微环境的刺激性或抑制性蛋白)。这样的治疗性基因产物可被可操作地连接至任何合适的启动子(例如牛痘病毒启动子，如牛痘早期启动子、牛痘中间启动子、牛痘早期/晚期启动子和牛痘晚期启动子)。

在一些实施方式中，靶向肿瘤微环境(TME)的两种或更多种抗体选自：(i)结合至刺激血管生成和/或血管化的蛋白的抗体，(ii)结合至选自表皮生长因子受体(EGFR)、Her2/c-neu、Her3和Her4(Erb家族)的受体酪氨酸激酶的抗体，和(iii)结合至上皮-间质相互作用的发展所涉及的蛋白的抗体。刺激血管生成和/或血管化的示例性蛋白包括旁分泌因子(包括血管生成素、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和转化生长因子-β (TGF-β)及整合素。

涉及上皮间质转化的发展的蛋白质包括成纤维细胞活化蛋白(FAP)、HSP47、胶原1、胶原2、波形蛋白FSP1、DDR2、N-钙粘蛋白、Snail、Slug、Twis、OB-钙粘蛋白、整合素、Syndecan-1、FSP-1、β-连环蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白5、ZEB1、LEF-1、Ets-1、FOXC2和Goosecoid。在一些实施方式中，所述两种或更多种抗体包括VEGF特异性抗体、血管生成素、FGF、TGF-β或整合素(如α_Vβ3、α_Vβ5或α₅β1)。在一些实施方式中，所述两种或更多种抗体包括对EGFR、Her2/c-neu、Her3或Her4特异的抗体。在一些实施方式中，所述两种或更多种抗体包括对FAP、HSP47、、胶原1、胶原2、波形蛋白FSP1、DDR2、N-钙粘蛋白、Snail、Slug、Twis、OB-钙粘蛋白、整合素、Syndecan-1、FSP-1、β-连环蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白5、ZEB1、LEF-1、Ets-1、FOXC2或Goosecoid特异的抗体。在一些实施方式中，在本段列出的任何一个抗原实施方式被明确地排除。

在一些实施方式中，所述两种或更多种抗体选自：结合至血管内皮生长因子(VEGF)的抗体、结合至表皮生长因子受体(EGFR)的抗体以及结合至成纤维细胞活化蛋白(FAP)的抗体。在一些实施方式中，所述两种或更多种抗体的其中一种是结合至VEGF的抗体。在一些实施方式中，结合至VEGF的抗体是G6-31。在一些实施方式中，结合至VEGF的抗体选自：4G3、ab52917、ab68334、ab46154、A-20、OTI4E3、Ab-3. SP28. 贝伐单抗、拉尼珠单抗(ranibuzumab)、帕唑帕尼(pazopanib)、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼、凡德他尼(vandeteanib)、卡博替尼(cabozantinib)、帕纳替尼(ponatinib)、阿西替尼(axitinib)和阿柏西普(aflibercept)以及能够结合至与这些抗体的任何一个相同的表位的抗体。在一些实施方式中，所述两种或更多种抗体的其中一种是结合至EGFR的抗体。在一些实施方式中，结合至EGFR的抗体是抗EGFRVHH。在一些实施方式中，结合至EGFR的抗体选自西妥昔单抗、马妥珠单抗(matuzumab)、帕尼单抗(panitumumab)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、扎鲁木单抗(zalutumumab)、528、SC-03、DR8. 3、DH8.3、L8A4、Y10、ICR62、ABX-EGF、EMD72000、MM-151、Sym004、mAB 806以及能够结合至与这些抗体的任何一个相同的表位的抗体。在一些实施方式中，所述两种或更多种抗体的其中一种是结合至FAP的抗体。在一些实施方式中，结合至FAP的抗体是抗M036。在一些实施方式中，结合至FAP的抗体是ab54651、vF19、ESC11、ESC14、F11-24、SS-13、D394、MAb克隆 427819、M05、M02、M01、LS-C348807、2F2以及能够结合至与这些抗体的任何一个相同的表位的抗体。在一些实施方式中，所述两种或更多种抗体包含结合至VEGF的抗体和结合至EGFR的抗体。在一些实施方式中，所述两种或更多种抗体包含结合至VEGF的抗体和结合至FAP的抗体。在一些实施方式中，所述两种或更多种抗体包含结合至EGFR的抗体和结合至FAP的抗体。在一些实施方式中，该段列出的任何一种特异性抗体或该段列出的结合至与该特异性抗体相同表位的抗体被明确地排除。

在一些实施方式中，本文公开的发明不包含下述病毒，即其表达抗VEGF的抗体，但不表达结合至选自上皮生长因子受体(EGFR)、Her2/c-neu、Her3和Her4 (Erb家族)的受体酪氨酸激酶的抗体或蛋白，并且不表达结合至上皮-间质相互作用的发展所涉及的蛋白质的抗体或蛋白。

示例性的溶瘤病毒包括牛痘病毒、水疱性口炎病毒(VSV)、新城疫病毒(NDV)、逆转录病毒、呼肠孤病毒、麻疹病毒、Sinbis病毒、流感病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、牛痘病毒和腺病毒。

在一些实施方式中，本文公开的病毒是减毒病毒。对病毒进行减毒的技术在本领域是已知的。

本文提供的示例性病毒包括含有经修饰的血细胞凝集素(HA)基因、胸苷激酶(TK)基因和F14.5L基因的重组牛痘病毒，其中一种或多种所述修饰包括将异源非编码核酸分子插入到HA基因座、TK基因座或F14.5L基因座中。这样的病毒不表达有功能的HA、TK和F14.5L多肽。

本文提供的用于治疗和诊断用途的示例性病毒也可包括Western Reserve (WR)、Copenhagen、Tashkent、Tian Tan、Lister、Wyeth、IHD-J、IHD-W、Brighton、Ankara、MVA、Dairen I、LIPV、LC16M8、LC16MO、LIVP、WR 65-16、Connaught, New York City Board ofHealth。用于本文所描述的方法的本文所述的LIVP牛痘病毒包括GLV-1h22、GLV-1h68、GLV-1i69、GLV-1h70、GLV-1h71、GLV-1h72、GLV-1h73、GLV-1h75、GLV-1h81、GLV-1h82、GLV-1h83、GLV-1h84、GLV-1h85、GLV-1h86、GLV-1j87、GLV-1j88、GLV-1j89、GLV-1h90、GLV-1h91、GLV-1h92、GLV-1h96、GLV-1h97、GLV-1h98、GLV-1h104、GLV-1h105、GLV-1h106。用于本文描述的方法的本文提供的示例性LIVP牛痘病毒包括GLV-1h107、GLV-1h108和GLV-1h109。在一些实施方式中，用于本文描述的方法的病毒选自GLV-1h107、GLV-1h108和GLV-1h109。

在一些实施方式中，所要求保护的病毒选自GLV-1h444和GLV-1h446。

在一些实施方式中，本文提供的用于治疗和诊断用途的病毒包括含有异源核酸分子的重组牛痘病毒，所述异源核酸分子编码可检测蛋白质或能够诱导可检测信号的蛋白质。这样的蛋白质的例子有荧光素酶(如磕头虫荧光素酶、海肾荧光素酶或萤火虫荧光素酶)、荧光蛋白(如GFP或RFP)、或可结合造影剂的蛋白质、发色团、或可被检测到的化合物或配体(转铁蛋白受体或铁蛋白)。本文提供所要求保护的表达磕头虫荧光素酶(CBG99)和RFP的Lister病毒株牛痘病毒(如GLV-1h84)。

本文描述了用于治疗和诊断用途的病毒，其包含异源核酸分子，该异源核酸分子编码两种或更多种诊断或治疗基因产物，其中所述基因产物连接有小核糖核酸病毒2A元件。在本文描述的一个实施例中，该重组牛痘病毒含有异源核酸分子，该分子编码CBG99，其通过小核糖核酸病毒2A元件连接至编码RFP的第二异源核酸分子(例如GLV-1h84)。

在一些实施方式中，本文描述了一种用于治疗和诊断用途的重组牛痘病毒，其A34R基因被来自另一个牛痘病毒株的A345基因取代。本文提供了一种所要求保护的Lister株牛痘病毒，其A34R基因被来自牛痘IHD-J株的A34R基因所取代(如GLV-1 i69)。这种取代增加了胞外包膜病毒(EEV)形式的牛痘病毒并增加了病毒对中和抗体的抗性。

本文描述了缺失了A35R基因的用于治疗和诊断用途的重组牛痘病毒。

本文描述了用于治疗和诊断用途的重组牛痘病毒，其可通过添加一种或多种额外的异源核酸分子而被进一步修饰，这些额外的异源核酸分子编码治疗性蛋白、可检测蛋白或能够诱导可检测信号的蛋白质。这样的蛋白质的例子有荧光素酶(如磕头虫荧光素酶、海肾荧光素酶或萤火虫荧光素酶)、荧光蛋白(如GFP或RFP)、或可结合造影剂的蛋白质、发色团、或可被检测到的化合物或配体(转铁蛋白受体或铁蛋白)。在一些实施方式中，所述诊断蛋白选自荧光素酶、荧光蛋白、储铁分子、铁转运体、铁受体或结合造影剂的蛋白质、发色团、或可被检测的化合物和可检测配体。

这些方法还包括插入编码治疗性基因产物的异源核酸分子，例如细胞因子、趋化因子、免疫调节分子、单链抗体、反义RNA、siRNA、前药转化酶、生物毒素、抗肿瘤寡肽、抗癌多肽抗生素、血管生成抑制剂或组织因子。示例性的抗原包括肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、肿瘤特异性抗原、细菌性抗原、病毒性抗原、酵母抗原、真菌抗原、原生动物抗原、寄生虫抗原和丝裂原。编码治疗性蛋白、可检测蛋白或能够诱导可检测信号的蛋白质的一种或多种额外的异源核酸分子可被操作性地连接至启动子，如牛痘病毒启动子。在一些实施方式中，治疗性蛋白选自细胞因子、趋化因子、免疫调节分子、抗原、单链抗体、反义RNA、前药转化酶、siRNA、血管生成抑制剂、毒素、抗肿瘤寡肽、有丝分裂抑制蛋白、抗有丝分裂寡肽、抗癌多肽抗生素和组织因子。

本文提供包含所要求保护的重组病毒的宿主细胞。一种示例性的宿主细胞是包含所要求保护的重组病毒的肿瘤细胞。在一些实施方式中，宿主细胞是培养中的哺乳动物细胞系。在一些实施方式中，宿主细胞是培养中的人细胞系。

本文还公开了包含所要求保护的重组病毒或被所要求保护的重组病毒感染的哺乳动物生物体。在一些实施方式中，哺乳动物生物体是小鼠、大鼠、兔或猴。

本文提供了一种含有所要求保护的重组病毒以及药学上可接受的载体的药物组合物。该组合物含有一定量或一定浓度的适用于预期用途(例如治疗、诊断或此两者)和给药途径的病毒。本文提供了被配制用于局部或系统给药的这样的药物组合物。本文提供了含有两种或更多种病毒的这样的药物组合物。本文提供了被配制作为疫苗(如天花疫苗)给药的这样的药物组合物。

本文提供了用于治疗对象的肿瘤、癌症或转移瘤的药物组合物，例如是人类对象或动物对象。给予药物组合物导致肿瘤生长停止或延迟，导致肿瘤体积减小，或导致肿瘤从该对象消除。

本文公开的方法和药物组合物可被用来治疗任何实体瘤或恶性血液肿瘤。可被本文公开的方法治疗的肿瘤包括，但不限于，膀胱肿瘤、乳腺肿瘤、前列腺肿瘤、癌、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、CNS癌、神经胶质瘤、宫颈癌、绒毛膜癌、结直肠癌、结缔组织癌、消化系统癌、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、头颈癌、胃癌、上皮内肿瘤、肾癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、成神经细胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌，成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、肾癌、呼吸系统癌、肉瘤、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌和泌尿系统癌症、例如淋巴肉瘤、骨肉瘤、乳房肿瘤、肥大细胞瘤、脑肿瘤、黑素瘤、腺鳞癌、肺部类癌肿瘤、支气管腺瘤、细支气管腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、纤维瘤、粘液软骨瘤、肺肉瘤、神经肉瘤、骨瘤、乳头状瘤、成视网膜细胞瘤、尤因氏肉瘤、Wilm肿瘤、Burkitt淋巴瘤、小胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、破骨细胞瘤、口腔瘤、纤维肉瘤、骨肉瘤和横纹肌肉瘤、生殖器鳞状细胞癌、传染性性病肿瘤、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、Sertoli细胞瘤、血管外皮细胞瘤、组织细胞瘤、绿叶性细胞肉瘤、角膜乳头状瘤、角膜鳞状细胞癌、血管肉瘤、胸膜间皮瘤、基底细胞瘤、胸腺瘤、胃肿瘤、肾上腺癌、口腔乳头瘤病、血管内皮瘤、囊腺瘤、滤泡性淋巴瘤、肠淋巴肉瘤、纤维肉瘤和肺鳞状细胞癌、白血病、血管外皮细胞瘤、包皮纤维肉瘤、溃疡性鳞状细胞癌、肥大细胞瘤、肝细胞癌、淋巴瘤、肺腺瘤、肺肉瘤、劳斯肉瘤、网状内皮增生症、纤维肉瘤、肾母细胞瘤、B细胞淋巴瘤、淋巴样白血病、成视网膜细胞瘤、肝瘤、淋巴肉瘤(在鱼中)、干酪性结肠炎、肺癌、胰岛瘤、淋巴瘤、肉瘤、神经瘤、胰岛细胞瘤、胃MALT淋巴瘤和胃腺癌。在一些实施方式中，肿瘤选自：成胶质细胞瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌、卵巢癌、成神经细胞瘤、中枢神经系统肿瘤和黑素瘤。

本文提供的药物组合物可通过以下方式给药：系统性、静脉内、动脉内、瘤内、内窥镜、病灶内、肌内、皮内、腹腔内、血管内、关节内、胸膜内、经皮、皮下、口服、肠胃外、鼻内、气管内、吸入、颅内、前列腺内、玻璃体内、局部、眼部、阴道或直肠给药。

本文提供的药物组合物可与抗病毒剂一起给药，例如但不限于，西多福韦、西多福韦的烷氧基烷基酯、格列卫、更昔洛韦、阿昔洛韦和ST-26。

本文提供了所要求保护的含有本文提供的药物组合物和抗癌剂的组合。用于该本文提供的组合的示例性抗癌剂包括，但不限于，细胞因子、趋化因子、生长因子、光敏剂、毒素、抗癌抗生素、化疗化合物、放射性核素、血管生成抑制剂、信号传导调节剂、抗代谢药、抗癌疫苗、抗癌寡肽、有丝分裂抑制蛋白、抗有丝分裂寡肽、抗癌抗体、抗癌抗生素、免疫治疗剂、高热或高热疗法、细菌、放射疗法或其组合。用于所述组合的化疗化合物的例子包括，但不限于，烷化剂(如铂配位络合物)及其他本文提供的化疗化合物。铂配位络合物的例子包括，但不限于，顺铂、卡铂、奥沙利铂、DWA2114R、NK121、IS 3 295和254-S。

本文提供了所要求保护的病毒和抗癌剂的组合，抗癌剂例如是细胞因子、趋化因子、生长因子、光敏剂、毒素、抗癌抗生素、化疗化合物、放射性核素、血管生成抑制剂、信号传导调节剂、抗代谢药、抗癌疫苗、抗癌寡肽、有丝分裂抑制蛋白、抗有丝分裂寡肽、抗癌抗体、抗癌抗生素、免疫治疗剂、高热或高热疗法或细菌。本发明提供了所要求保护的病毒与抗癌剂的组合，所述抗癌剂例如是顺铂、卡铂、吉西他滨、伊立替康、抗EGFR抗体和抗VEGF抗体。

本文提供了所要求保护的组合，其中化合物和病毒被分别配制为两种组合物。本文提供所要求保护的组合，其中化合物和病毒被配制为单个组合物。

本文提供了所要求保护的病毒在治疗肿瘤、癌症或转移瘤中的应用。本发明还提供了所要求保护的病毒在制备用于治疗肿瘤、癌症或转移瘤的药物组合物中的应用。

本发明提供了包含所要求保护的药物组合物或组合以及任选地包含其用于治疗癌症的给药说明的套装。

本发明提供了含有所要求保护的重组牛痘病毒的疫苗，例如天花疫苗。而且，本发明提供了所要求保护的重组牛痘病毒作为疫苗(如天花疫苗)用于施用至对象以产生免疫响应。

本文在一些实施方案中公开了一种使肿瘤对随后的治疗方式敏感的方法。 根据一些实施方式的技术的敏化部分可以使用本文所述的任何方法来执行。

在一些实施方案中，随后的治疗方式选自放射疗法、化学疗法、免疫疗法、光疗或其组合。 在一些实施方案中，敏化肿瘤包括对对象施用辐射。 在一些实施例中，辐射是电离辐射。 在一个实施方案中，敏化将通过局部肿瘤辐射来实现，例如高剂量超分割放射治疗(HDHRT)。

电离辐射具有改变肿瘤微环境和促进免疫介导的肿瘤排斥的显著潜力。具体而言，放射可以诱导异常肿瘤血管的重塑和血管细胞粘附分子(例如VCAM-1)和趋化因子分泌(例如CXCL16)的上调，导致T细胞有效地浸润到肿瘤中。 辐射的其他重要作用包括上调MHCI类分子、NKG2D配体和Fas / CD95，从而增强T细胞结合并杀死癌细胞。 然而，尽管有这些显著的促免疫原性效应，辐射本身不足以诱导能导致肿瘤根除的长效的和足够强的抗肿瘤免疫反应。放射治疗包括但不限于光动力疗法、放射性核素、放射免疫疗法和质子束治疗。

在一些实施方案中，随后的治疗方式包括施用化疗化合物。化疗化合物包括但不限于铂；铂类似物(例如铂配位络合物)，例如顺铂、卡铂、奥沙利铂、DWA2114R、NK121、IS3295和254-S；蒽醌类；长春碱；烷化剂如噻替派和环磷酰胺；烷基磺酸盐，如白消安、硫丹和硫磺；吖丙啶类如苯并二氢吡喃酮、卡洛酮、麦曲多巴(meturedopa)和乌雷多巴；氯丙嗪、氯磷酰胺、雌二醇氮芥、雌二醇氮芥、异环磷酰胺、氮芥、盐酸二甲氧苄胺、美法仑、新恩比兴(novembichin)、苯乙酸、泼尼氮芥(prednimustine)、曲洛磷胺(trofosfamide)、乌拉莫司汀；三乙烯三胺和三甲基乙二胺；亚硝基脲如卡莫司汀、氯氮酮、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、拉莫司汀；抗生素如阿奇霉素、放线菌素、阿曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、卡诺霉素、加利车霉素、carabicin、carminin、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表柔比星、依索比星、伊达比星、 麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、麦考酚酸、诺卡霉素、橄榄霉素、培洛霉素、potfiromycin、嘌呤霉素，quelamycin、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链唑霉素、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星；抗代谢物如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫喷妥钠、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素，例如卡鲁诺酮、丙酸倍他龙酮、表氯醇、美替亭、睾内酯；抗肾上腺素如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂如弗洛林酸；醋葡醛内酯；醒磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸；安吖啶； bestrabucil；比生群；依达曲沙(edatraxate)； defofamine；地美可辛；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；取代的脲；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌；莫哌达醇(mopidamol)；硝氨丙吖啶(nitracrine)；喷司他丁；苯来美特(phenamet)；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼；甲基苄肼；抗癌多糖；多糖-K；雷佐生(razoxane)；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonicacid)；三亚胺醌；2,2',2''-三氯三乙胺；氨基甲酸乙酯；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；胞嘧啶阿拉伯糖苷；环磷酰胺；塞替派；类紫杉醇，如紫杉醇和多西他赛；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；替尼泊苷；道诺霉素；氨喋呤；XELODA；伊班膦酸盐；CPT11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸； esperamicins；卡培他滨；甲基肼衍生物；厄洛替尼(TARCEVA)；苹果酸舒尼替尼(SUTENT)；以及以上任何物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。还包括在该定义中的有抗激素剂，其调节或抑制对肿瘤的激素作用，例如抗雌激素，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制4(5)咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、keoxifene、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬(FARESTON)；肾上腺皮质抑制剂；和抗雄激素药，如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。 可用于本文的化疗化合物包括其毒性使该化合物被排除用于一般全身性化疗方法的化合物。在一些实施方案中，随后的治疗方式选自：局部肿瘤辐射、细胞因子注射、抗体注射和注射分泌细胞因子和/或趋化因子的干细胞。

治疗方式的实施

在本发明的组合疗法中使用的本文公开的每种治疗方式(包括本文公开的重组病毒)的有效剂量可以根据具体治疗、所采用的化合物或药物组合物、给药模式、被治疗的病症以及所治疗疾病的严重程度而变化。因此，根据本发明的治疗的给药方案根据多种因素来选择，包括给药途径和患者的肾功能和肝功能。具有常规技能的医师、临床医师或兽医可以容易地确定和开出预防、抵抗或阻止病症进展所需的有效量的单一活性成分的处方。使活性成分浓度达到产生功效而无毒性的范围内的最佳精确度需要基于活性成分对靶位点的可用性的动力学的方案。

制备包含本文公开的相关治疗的药物组合物的方法是本领域已知的，并且可从现有技术中、从已知的标准参考文献中容易得到，例如Remington's PharmaceuticalSciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 18th edition (1990)。

实施例

实施例1 - 材料和方法

细胞系

从美国典型培养物保藏中心获得非洲绿猴肾成纤维细胞CV-1、人肺癌细胞A549、下咽癌细胞系FaDu和人前列腺癌细胞系DU145。将CV-1细胞在DMEM中培养；将A549细胞在RPMI1640中培养；FaDu和DU145在Eagle最小基本培养基中培养。所有培养基补充有10％胎牛血清(Cellgro)。

质粒构建和抗体表达

如之前所述构建亲本三重突变体VACV GLV-1h68(Zhang et al., Cancer Res. 67:10038-10046)。 简言之，它包含三个分别整合到LIVP病毒基因组的F14.5L、J2R和A56R基因座中的编码海肾荧光素酶 - Aequorea GFP融合蛋白(RUC-GFP)、β-半乳糖苷酶和β-葡糖醛酸糖苷酶的外来基因表达盒。如之前所述设计GLAF-5的序列(Frentzen et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 106: 12915-12920)，并由GENEART-Invitrogen合成。 将DYKDDDDK标签(gac tac aag gat gac gac gac gac aag)加入到抗EGFRVHH的C端编码区中，产生抗EGFRVHHFLAG。将DNA片段克隆到质粒pCR-TK-P_SEL的Sal I和Pac I位点，得到质粒pCR-TK-P_SEL(GLAF-5)和pCR-TK-P_SEL(抗EGFRVHHFLAG) ，以通过双向交换而同源重组到GLV-1h68的J2R基因座中，分别得到GLV-1h282和GLV-1h442。使用与亲本病毒相同的质粒和GLV-1h164以类似方式产生GLV-1h446和GLV-1h444。通过测序确认重组VACV。所有VACV在CV-1细胞中增殖并通过标准方案借助蔗糖梯度纯化。

为了检测抗体的表达，在用MOI为1的每种VACV株感染后24小时收获细胞样品，通过12％SDS-PAGE分离。 使用以下抗体：用于检测FLAG标签的抗DDDDK抗体(Abcam)，用于检测scAb的定制抗体G6和用于检测VACV的膜蛋白的抗A27抗体(GenScript公司)。

如前所述(Frentzen et al.，上文引用的)，使用市售重组人类EGFR(Abnova)、FAP(R＆D系统)和VEGF(Sigma)，在标准ELISA测定中测定小鼠血清中抗体的浓度。

病毒复制试验

用VACV以0.01的MOI感染细胞，在感染后的每个时间点收集样品，一式三份。

动物实验

从Harlan(Livermore, CA)购买5至6周龄的裸鼠(Hsd:无胸腺Nude-Foxn1nu小鼠)，按Explora Biolabs(San Diego Science Center, San Diego, CA)的动物护理和使用委员会批准的方案照料和养护。1 × 10⁶个FaDu细胞、5 × 10⁶个A549细胞或1 × 10⁷个DU145被皮下移植到小鼠的右后腿。使用数字卡尺每周测量肿瘤三维体积，体积计算为((长×宽×(高-5))/ 2)，并且每周测量体重。 通过从肿瘤重量(假设肿瘤密度为1g / cc)中减去各时间点的总体重计算每只动物的净体重。

净体重的变化百分比是每只动物在特定时间点的净体重与刚处理前的净体重之间的差值除以处理前的净体重，以百分比表示。当肿瘤体积达到~450mm³时，通过眼眶后注射给予在100-μl PBS中的每种VACV毒株，单剂量2×10⁶ pfu /小鼠(除非另有说明)。 注射100微升PBS作为阴性对照。

对于用治疗性抗体治疗，从10dpi开始，小鼠每周两次腹膜内(i.p.)注射Avastin(5mg / kg)和/或Erbitux(3mg / kg)，持续5周。

切除肿瘤和器官，使用MagNA Lyser(Roche Diagnostics)进行匀浆。 通过标准噬菌斑试验测定在CV-1细胞中的病毒滴度。

组织学分析

切除FaDu肿瘤并石蜡包埋，然后进行标准的脱水过程。将肿瘤样品切成5-μm切片并用苏木精和伊红(H＆E)染色。将切片脱蜡并在柠檬酸钠缓冲液中进行抗原修复。 使用以下抗体：抗-FAP(Abcam)和抗-A27L(GenScript Corporation)。使用生物素化的二抗(山羊抗兔；Jackson ImmunoResearch Laboratories)，用Vectorstain Elite ABC试剂和VectorImmPact DAB过氧化物酶底物(Vector Laboratories)进行检测。

以36 dpi切下DU145肿瘤，接着用多聚甲醛固定，然后切成100-μm切片。 用抗CD31抗体(BD Pharmingen)和抗Ki67抗体(BD Pharmingen)分别检测血管和细胞增殖。

用配备有数字电荷耦合装置照相机(Leica)的MZ16FA荧光立体显微镜(Leica)进行肿瘤切片的检查。 使用Adobe Photoshop 7.0软件处理数字图像(1,300至1,030像素图像)。

统计分析

使用双尾不成对Student's t-检验(Excel 2003; Microsoft，Redmond，WA)或STATISTICS中的单向方差分析(ANOVA)来分析动物组之间差异的统计学显著性。 P值<0.05被认为是显著的。

实施例2 –编码靶向EGFR和FAP的单独抗体的重组VACV的构建

先前已经显示，由VACV(GLV-1h108(参考文献29)和GLV-1h164(Buckel et al., Int.J. Cancer 133:2989-2999)表达的抗VEGF scAb(GLAF-1或GLAF-2)在几种人类肿瘤异种移植物模型中显著降低肿瘤生长，并通过对TME血管生成的抑制作用而表现出“Avastin样作用模式”。EGFR和FAP是TME中参与调节肿瘤发生和发展的其他重要因素。 为了评价靶向EGFR和FAP的抗体对溶瘤病毒疗法治疗效果的影响，通过用抗EGFR纳米抗体(抗EGFRVHHFLAG)表达盒或抗-FAP scAb(GLAF-5)表达盒(两个表达盒都在VACV合成早期/后期(PSEL)启动子控制下)替换GLV-1h68的J2R基因座上的lacZ表达盒，构建了两种新的重组VACV分别产生GLV-1h442和GLV-1h282(图1a，b)。

实施例3 –靶向VEGF、EGFR和FAP的病毒表达抗体显著增强病毒疗法

在小鼠中研究了编码抗VEGF、抗FAP scAb或抗EGFR纳米抗体的VACV毒株的抗肿瘤作用。 将VACV毒株或PBS(磷酸盐缓冲盐水)以2×10⁶噬菌斑形成单位(PFU)/小鼠的单次剂量眼眶后注射到带有不同人类肿瘤异种移植物的小鼠中。在病毒注射10天后(如图2a-c中的箭头所示)，通过腹膜内(i.p.)注射给予小鼠Avastin 或Erbitux，每周两次，给药5周。 在A549异种移植模型(n≥7)(图2a，b)中，PBS处理的肿瘤显示出持续的生长，直到由于过度的肿瘤负荷而必须处死小鼠。在用GLV-h168处理的小鼠中观察到肿瘤的典型的三相生长模式(Zhang et al.，上面引用)。 在开始时，肿瘤体积超过了PBS处理组，随后是显著的肿瘤生长停滞，然后为持续的肿瘤缩小。单用Avastin治疗的小鼠与PBS相比肿瘤体积减小，但是肿瘤生长是连续的(图2a)。 用GLV-1h68联合Avastin治疗相比于用任一种单独处理具有改善的功效，而表达抗VEGF scAb的GLV-1h164的疗效与GLV-1h68+Avastin组合的疗效相当。GLV-1h68联合Erbitux的治疗比在Erbitux给药期间单独使用GLV-1h68的治疗产生更小的肿瘤，但在停止Erbitux治疗后肿瘤体积短暂地反弹(图2b)。相比之下，用表达抗EGFR纳米抗体的GLV-1h442处理的小鼠的肿瘤生长始终比用GLV-1h68处理的小鼠慢，并且没有观察到肿瘤体积的反弹。另外，用表达抗FAP scAb的 GLV-1h282处理小鼠，也比用GLV-1h68处理表现出显著更小的肿瘤体积(图2c)。因此，与GLV-1h68相比，在用各自表达治疗性抗体的GLV-1h164、GLV-1h442或GLV-1h282处理小鼠时观察到对A549肿瘤生长的增强的治疗效果。而且，该效果优于单独使用治疗性抗体的治疗，并且相当于或优于治疗性抗体和GLV-1h68的组合治疗。在携带DU145肿瘤异种移植物的小鼠中也观察到类似的治疗效果(n = 5)(图2d)。

实施例4 –靶向VEGF、EGFR和FAP的瘤内表达抗体对TME的影响

在VACV注射后36天(dpi)切除的DU145肿瘤中评估病毒表达的抗VEGF scAb对肿瘤血管系统的影响。进行肿瘤切片的免疫组织化学(IHC)染色以评估血管密度(BVD)，其通过计数肿瘤切片内的CD31 +血管来确定。病毒表达的GFP荧光表明VACV感染(图3a)。与PBS处理的肿瘤和相同肿瘤的未感染区域相比，VACV感染导致肿瘤感染区域的BVD显著降低(图3b)。GLV-1h68和GLV-1h164处理的肿瘤也是如此。 然而，GLV-1h68处理的肿瘤的未感染区域中的BVD与PBS处理的肿瘤中的BVD没有显著差异。相比之下，与GLV-1h68处理的肿瘤相比，GLV-1h164的处理显著降低了肿瘤的感染和未感染区域中的BVD。 因此，尽管通过GLV-1h68单独的VACV感染降低了肿瘤中的BVD，但是该效应局限于感染部位，而GLV-1h164的VACV感染和抗VEGF scAb表达的组合不仅进一步降低了肿瘤感染区域的BVD，还将该效果扩大到未感染区域。

众所周知，EGFR的过度表达导致不受控制的细胞生长。 用抗Ki67进行IHC染色以评估病毒表达的抗EGFR纳米抗体是否抑制肿瘤中的细胞增殖。如所预期的，与PBS处理的肿瘤相比，使用表达抗EGFR纳米抗体的GLV-1h68或GLV-1h442感染肿瘤大大减少感染区域中的Ki67 +细胞的数量(图3c)。有趣的是，与GLV-1h68处理的肿瘤的未感染区域相比，GLV-1h442处理的肿瘤的未感染区域中的Ki67 +细胞的数量也显著减少(图3d)。 这表明从GLV-1h442感染的细胞分泌的抗EGFR纳米抗体也作用于未感染的细胞，减少其增殖。

FAP是参与血管生成的间充质干细胞(MSC)标志物。 通过计数表达高水平FAP的FaDu肿瘤中的FAP +细胞和CD31 +细胞来评估肿瘤内表达的抗FAP scAb的作用。尽管FaDu肿瘤对GLV-1h68的处理没有反应，但是它们的生长被表达抗FAP scAb的GLV-1h282显著抑制(图4)。与PBS处理的肿瘤相比，在GLV-1h68感染的肿瘤中，感染区的CD31 +细胞和FAP +细胞的数量大大减少，而未感染的区域没有观察到效果(图3e，f)。相比之下，与GLV-1h68处理的肿瘤相比，GLV-1h282处理的肿瘤中的CD31 +细胞和FAP +细胞的数目在感染区和未感染区均显著降低。

实施例5 - 表达靶向VEGF和EGFR或VEGF和FAP的两种抗体的另外的新重组VACV的 构建

基于表达单个抗体的VACV治疗的积极作用，我们构建了表达两种抗体(靶向VEGF和EGFR或VEGF和FAP)的另外的新重组VACV。将抗EGFR纳米抗体(抗EGFRVHHFLAG)或抗FAPscAb(GLAF-5)的表达盒插入到GLV-1h164的J2R基因座中(该基因座也含有抗VEGF(GLAF-2)表达盒)，以取代人去甲肾上腺素转运蛋白(hNET)表达盒，分别得到GLV-1h444和GLV-1h446(图1b)。为了验证来自新重组VACV的每种抗体的表达，用新的VACV毒株感染A549细胞，并通过Western印迹分析细胞裂解物。 结果显示各个抗体均按预期从每种病毒表达(图5)。

实施例6 –病毒表达的两种抗体对病毒复制效率没有显示出负面作用

以0.01的感染复数(MOI)在A549细胞中进行病毒复制试验(图6)。 表达单个或两种抗体的重组VACV在感染后24小时(hpi)显示出比GLV-1h68显著更高的复制效率。然而，在48或72 hpi时复制效率没有显著差异。 在DU145细胞中获得相似的结果。 因此，两种抗体在VACV中的表达对其在细胞培养中的总体复制效率没有显示出负面影响。

实施例7 –病毒表达的靶向TME的两种抗体进一步改善病毒疗法

受到表达靶向TME的单一抗体的重组VACVs的结果的鼓励，我们评估了从相同VACV表达的两种抗体是否会进一步改善病毒疗法。 将单剂量的每种VACV毒株注射到携带A549肿瘤异种移植物的小鼠中(图7a，b)。对照动物用PBS处理或用Avastin和Erbitux联合处理。Avastin和Erbitux每周两次治疗，持续5周，从10dpi开始，其在抗体治疗期间延迟肿瘤生长，但在抗体治疗终止后肿瘤生长恢复。令人惊讶的是，用表达两种抗体的GLV-1h444或GLV-1h446处理的小鼠的肿瘤在整个实验期间仅显示出最小的生长。相比之下，用表达单一抗体的VACV治疗的小鼠的肿瘤，在肿瘤生长显著减慢之前，最初生长的速度与PBS处理的肿瘤一样快或仅略慢，随后肿瘤缩小。总体而言，在用表达两种抗体的GLV-1h444或GLV-1h446处理的小鼠中的肿瘤体积小于用表达单一抗体的VACV处理的小鼠的肿瘤体积。携带A549肿瘤的单个小鼠的肿瘤生长曲线显示在图8中。用DU145肿瘤获得了类似的肿瘤生长模式(图7c)。

实施例8 –在处理小鼠的血清中可检测到病毒表达的抗体

在培养的病毒感染细胞中抗体表达的验证之后，还研究了荷瘤小鼠中是否存在抗体。在7、21和35dpi从相同的小鼠眼眶采集血样。对于所有样品，用FAP预包被平板测试是否存在抗FAP scAb，用EGFR预包被平板测试是否存在抗EGFR纳米抗体，用VEGF预包被平板测试是否存在抗VEGF scAb。 所有的抗体在所有三个时间点均可检测到(图7d-f)。在用GLV-1h164(单种抗体)处理的小鼠中GLAF-2的表达低于用GLV-1h444和GLV-1h446(两种抗体)在7和21 dpi处理的小鼠中的表达，这与在GLV-1h164处理组中在14 dpi时肿瘤中较低的病毒滴度一致(图9)。 尽管如此，在所有情况下，抗体在早期阶段(第7天和第21天)的表达与低肿瘤体积一致，并且在晚期(第35天)早于肿瘤缩小。

实施例9 –病毒表达的两种抗体不改变小鼠内的病毒分布和毒性

通过在治疗过程中评估净体重的变化来评估表达抗体的VACV可能给小鼠带来的不利影响。在A549和DU145肿瘤异种移植物模型中，对于任何处理组或对照组，都没有观察到平均净体重的显著变化(图10a-c)。还通过标准病毒空斑试验测定了在14 dpi时携带A549肿瘤的小鼠中不同器官和肿瘤中的病毒生物分布(图9)。在所有治疗的肿瘤中均检测到显著的病毒滴度，而在其他器官中未检测到滴度或仅检测到最低的滴度。表达抗-FAP scAb的GLV-1h282和表达抗EGFR纳米抗体的GLV-1h442处理的肿瘤中的病毒滴度高于用GLV-1h68处理的肿瘤中的病毒滴度(尽管不具有统计学显著性)，而表达抗-VEGF scAb的GLV-1h164在肿瘤中的病毒滴度显著低于其他病毒株(GLV-1h164相对于GLV-1h68，P = 0.02，相对于GLV-1h446，P = 0.04)。

实施例10 –瘤内表达的靶向VEGF和EGFR或VEGF和FAP的两种抗体对TME的影响

两种病毒表达的抗体对TME的影响通过用抗-Ki67和抗-CD31抗体染色在36dpi获得的肿瘤切片来检查DU145肿瘤异种移植物中的细胞增殖和BVD来评估。 VACV感染由GFP荧光证实。图11a显示了增殖性Ki67 +细胞的IHC染色的代表性图像。在肿瘤感染区域，用任何一种VACV毒株(包括GLV-1h68)处理后，Ki67 +细胞显著减少(图11c)。 在VACV处理的肿瘤的未感染区域中，仅在用表达单一抗EGFR纳米抗体的VACV(GLV-1h442)和表达两种抗体的VACV(GLV-1h444和GLV-1h446)处理后，Ki67 +细胞才显著降低(图11b)。

用抗CD31抗体染色的DU145肿瘤切片的图像显示，无论何种用于处理的VACV，与未感染区域相比，肿瘤感染区域BVD显著减少(图12a-c)。与GLV-1h68相比，使用表达抗VEGF抗体(GLAF-2)的VACV无论单独或与其他抗体组合都观察到BVD显著的进一步降低。如所预期的，使用表达抗EGFR但不表达抗VEGF的GLV-1h442处理的肿瘤中的BVD与用GLV-1h68处理的肿瘤中的BVD没有显著差异，但用GLV-1h444和GLV-1h446处理的感染区显示出进一步减少的BVD。

本文引用的所有出版物都通过引用并入本文。

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其他实施例在权利要求中阐述。

Claims (58)

1.一种治疗对象的实体瘤的方法，所述方法包括向所述对象施用能够感染该肿瘤的细胞的重组病毒，或施用包含能够感染该肿瘤细胞的病毒的细胞，其中所述病毒表达：(i)靶向肿瘤微环境(TME)的两种或更多种抗体；(ii)靶向所述TME的刺激性或抑制性蛋白中的两种或更多种，或(iii)至少一种靶向所述TME的抗体以及靶向所述TME的刺激性或抑制性蛋白中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述病毒是溶瘤病毒。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述溶瘤病毒是牛痘病毒。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述病毒是可复制型溶瘤牛痘病毒(VACV)。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述病毒表达靶向TME的两种或更多种抗体。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述两种或更多种抗体选自：(a) 结合至刺激血管生成和/或血管化的蛋白的抗体，(b)结合至选自表皮生长因子受体(EGFR)、Her2/c-neu、Her3和Her4的受体酪氨酸激酶的抗体，和(c)结合至上皮-间质相互作用的发展所涉及的蛋白的抗体。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述两种或更多种抗体选自结合至血管内皮生长因子(VEGF)的抗体、结合至表皮生长因子受体(EGFR)的抗体、以及结合至成纤维细胞活化蛋白(FAP)的抗体。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述病毒表达结合至VEGF的抗体、结合至EGFR的抗体、以及结合至FAP的抗体。

9.根据权利要求7所述的方法，其中所述两种或更多种抗体的其中一种是结合至VEGF的抗体。

10.根据权利要求8所述的方法，其中所述结合至VEGF的抗体是G6-31。

11.根据权利要求7所述的方法，其中所述两种或更多种抗体的其中一种是结合至EGFR的抗体。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述结合至EGFR的抗体是抗EGFRVHH。

13.根据权利要求7所述的方法，其中所述两种或更多种抗体的其中一种是结合至FAP的抗体。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述结合至FAP的抗体是抗M036。

15.根据权利要求7所述的方法，其中所述两种或更多种抗体包含结合至VEGF的抗体和结合至EGFR的抗体。

16.根据权利要求7所述的方法，其中所述两种或更多种抗体包含结合至VEGF的抗体和结合至FAP的抗体。

17.根据权利要求7所述的方法，其中所述两种或更多种抗体包含结合至EGFR的抗体和结合至FAP的抗体。

18.根据权利要求4所述的方法，其中所述VACV选自GLV-1h444和GLV-1h446。

19.根据权利要求1至18任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括施用额外的癌症疗法。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述额外的癌症疗法选自：放射疗法、化学疗法、免疫疗法、光疗及其组合。

21.根据权利要求1至20任一项所述的方法，其中所述肿瘤选自：胶质母细胞瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、中枢神经系统肿瘤和黑素瘤。

22.根据权利要求1至21任一项所述的方法，其中所述病毒被静脉内递送至所述对象。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述病毒被静脉内直接递送至肿瘤，或被静脉内递送至所述对象的肿瘤区域内。

24.据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括向所述对象提供能够感染该肿瘤细胞的至少一种额外的病毒，其中所述至少一种额外的病毒表达一种或多种：(i)靶向肿瘤微环境(TME)的抗体或(ii)靶向TME的刺激性或抑制性蛋白，其中所述至少一种额外的病毒表达的所述一种或多种：(i)靶向肿瘤微环境(TME)的抗体或(ii)靶向TME的刺激性或抑制性蛋白不同于权利要求1所述的病毒所表达的抗体。

25.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括向所述对象施用至少一种额外的病毒，其中所述至少一种额外的病毒表达：(i)靶向肿瘤微环境(TME)的两种或更多种抗体；(ii)靶向TME的两种或更多种刺激性或抑制性蛋白，或(iii)至少一种靶向TME的抗体和靶向TME的刺激性或抑制性蛋白中的至少一种，其中所述至少一种额外的病毒表达不同于权利要求1所述的病毒所表达的：(i)靶向肿瘤微环境(TME)的两种或更多种抗体；(ii)靶向TME的两种或更多种刺激性或抑制性蛋白，或(iii)至少一种靶向TME的抗体和靶向TME的刺激性或抑制性蛋白中的至少一种。

26.一种能够感染实体瘤中的细胞的重组病毒，其中所述病毒表达(i)靶向肿瘤微环境(TME)的两种或更多种抗体；(ii)靶向TME的刺激性或抑制性蛋白中的两种或更多种，或(iii)至少一种靶向TME的抗体和靶向TME的刺激性或抑制性蛋白中的至少一种。

27.根据权利要求26所述的重组病毒，其中所述病毒是溶瘤病毒。

28.根据权利要求27所述的重组病毒，其中所述溶瘤病毒是牛痘病毒。

29.根据权利要求28所述的重组病毒，其中所述病毒是可复制型溶瘤牛痘病毒(VACV)。

30.根据权利要求26所述的重组病毒，其中所述病毒表达两种或更多种抗体。

31.根据权利要求30所述的重组病毒，其中所述两种或更多种抗体选自：(a) 结合至刺激血管生成和/或血管化的蛋白的抗体，(b)结合至选自表皮生长因子受体(EGFR)、Her2/c-neu、Her3和Her4的受体酪氨酸激酶的抗体，和(c)结合至上皮-间质相互作用的发展所涉及的蛋白的抗体。

32.根据权利要求26至31的任一项所述的重组病毒，其中所述病毒包含编码两种或更多种抗体的两种或更多种异源核酸，所述两种或更多种抗体选自结合至血管内皮生长因子(VEGF)的抗体、结合至表皮生长因子受体(EGFR)的抗体、以及结合至成纤维细胞活化蛋白(FAP)的抗体。

33.根据权利要求32所述的重组病毒，其中所述两种或更多种抗体的其中一种是结合至VEGF的抗体。

34.根据权利要求33所述的重组病毒，其中所述结合至VEGF的抗体是G6-31。

35.根据权利要求32所述的重组病毒，其中所述两种或更多种抗体的其中一种是结合至EGFR的抗体。

36.根据权利要求35所述的重组病毒，其中所述结合至EGFR的抗体是抗EGFRVHH。

37.根据权利要求32所述的重组病毒，其中所述两种或更多种抗体的其中一种是结合至FAP的抗体。

38.根据权利要求37所述的重组病毒，其中所述结合至FAP的抗体是M036。

39.根据权利要求32所述的重组病毒，其中所述两种或更多种抗体包含结合至VEGF的抗体和结合至EGFR的抗体。

40.根据权利要求32所述的重组病毒，其中所述两种或更多种抗体包含结合至VEGF的抗体和结合至FAP的抗体。

41.根据权利要求32所述的重组病毒，其中所述两种或更多种抗体包含结合至EGFR的抗体和结合至FAP的抗体。

42.根据权利要求29所述的重组病毒，其中所述VACV选自GLV-1h444和GLV-1h446。

43.根据权利要求26所述的重组病毒，其中所述病毒是李斯特毒株。

44.根据权利要求28所述的重组病毒，其中A34R基因被来自另一牛痘病毒株的A34R基因替代。

45.根据权利要求44所述的重组病毒，其中A34R基因被来自牛痘IHD-J毒株的A34R基因替代。

46.根据权利要求28所述的重组病毒，其中所述病毒缺失了A35R基因。

47.根据权利要求26至46任一项所述的重组病毒，所述重组病毒进一步包含编码诊断性或治疗性蛋白的额外的异源核酸分子。

48.根据权利要求47所述的重组病毒，其中所述额外的异源核酸分子编码诊断性蛋白。

49.根据权利要求48所述的重组病毒，其中所述诊断性蛋白选自荧光素酶、荧光蛋白、储铁分子、铁转运体、铁受体或结合可被检测到的造影剂、发色团或化合物或可检测配体的蛋白。

50.根据权利要求47所述的重组病毒，其中所述额外的异源核酸分子编码治疗性蛋白。

51.根据权利要求50所述的重组病毒，其中所述治疗性蛋白选自细胞因子、趋化因子、免疫调节分子、抗原、单链抗体、反义RNA、前药转化酶、siRNA、血管生成抑制剂、生物学毒素、抗肿瘤寡肽、有丝分裂抑制蛋白、抗有丝分裂寡肽、抗癌多肽抗生素和组织因子。

52.一种包含权利要求26至51任一项所述的重组病毒的宿主细胞。

53.一种包含权利要求26至51任一项所述的重组病毒的肿瘤细胞。

54.一种哺乳动物生物体，其包含权利要求26至51任一项所述的重组病毒，或其被权利要求26至51任一项所述的重组病毒感染。

55.权利要求26至51任一项的重组牛痘病毒在治疗对象的肿瘤中的应用。

56.权利要求26至51任一项所述的重组病毒在制备治疗对象的肿瘤的药物组合物中的应用。

57.根据权利要求56所述的应用，其中所述药物组合物进一步包含抗癌化合物。

58.能够感染肿瘤细胞的重组病毒或包含能够感染肿瘤细胞的病毒的细胞在治疗对象的实体瘤的方法中的应用，所述方法包括向所述对象施用能够感染肿瘤细胞的重组病毒或包含能够感染肿瘤细胞的病毒的细胞，其中所述病毒表达：(i)靶向肿瘤微环境(TME)的两种或更多种抗体；(ii)靶向TME的刺激性或抑制性蛋白中的两种或更多种，或(iii)至少一种靶向TME的抗体和靶向TME的刺激性或抑制性蛋白中的至少一种。