CN107208069A - 用于表达免疫检查点调节因子的溶瘤病毒 - Google Patents

用于表达免疫检查点调节因子的溶瘤病毒 Download PDF

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Abstract

本发明提供溶瘤病毒，其包含编码一或多种免疫检查点调节因子的核苷酸序列。还涉及药物组合物，其包含有效量的所述溶瘤病毒和，最终地，药学可接受的载体，以及涉及其用于治疗增生性疾病例如癌症的用途。

Description

用于表达免疫检查点调节因子的溶瘤病毒
技术领域
本发明基本涉及溶瘤病毒疗法技术领域并且更具体涉及治疗、预防或抑制增生性疾病，特别是癌症组合物和方法。实施方式包括溶瘤病毒，其包含编码一或多种免疫检查点调节因子的核苷酸序列。实施方式还包括药物组合物，其包含这种溶瘤病毒和最终药学可接受的载体以及用于治疗增生性疾病例如癌症的用途。
癌症由外界因素(例如烟草、传染性的有机体、饮食习惯、化学物质和辐射)和内部因素(例如遗传突变、激素、免疫情况和新陈代谢中发生的突变)引起。每年全球有1200百万的受试者被诊断患有癌症。在工业化的国家，大约五个人中有一个死于癌症。虽然存在大量的化学疗法，但通它们常并不有效，特别是针对疾病非常初期建立的恶性和转移性的肿瘤。此外，由于肿瘤细胞进化出逃避宿主防御的机制，抗肿瘤免疫通常没有效果。免疫抑制的主要机制中的一种是被称为“T细胞耗竭”的过程，其由抗原持续暴露造成并且以抑制性受体上调为特点。这些抑制性受体充当免疫检查点以防止不受控制的免疫反应。文献中已经描述各种免疫检查点在T细胞免疫的不同层面上起作用，包括程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)及其配体PD-L1和PD-L2、CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4)、LAG3、B和T淋巴细胞弱化因子、T细胞免疫球蛋白、粘蛋白3(TIM-3)和T细胞活化的免疫球蛋白抑制V型结构域。
无论作用机理是什么，这些免疫检查点能够抑制有效抗肿瘤免疫反应的发展。对于阻断此类免疫检查点作为抑制免疫系统对肿瘤的耐受并因此挽救耗竭的抗肿瘤T细胞的手段所带来的可能的治疗益处越来越感兴趣(Leach et al.,1996,Science 271:1734-6)。在过去的十年间，已经开发了大量的拮抗抗体(例如抗Tim3、抗-PD-L1、抗-CTLA-4、抗-PD1等等)，而更重要的是，其中的一些已经与在癌症患者中的客观临床反应关联。针对CTLA-4的抗体已经投放市场(例如：易普利姆玛，Yervoy，百时美施贵宝)用于转移性黑色素瘤。BMS的报告显示在1800个使用易普利姆玛治疗的黑色素瘤患者中，22％在三年后还活着。抗PD-L1(例如：MPDL3280A，Roche)和抗PD-1(例如Nivolumab，BMS)的抗体疗法还在进行中。
另一种在癌症领域兴起的治疗方式为溶瘤病毒(Hermiston,2006,Curr.Opin.Mol.Ther.8:322-30)。溶瘤病毒能够选择性地在分裂中的细胞(例如癌症细胞)中复制而不伤害非分裂中的细胞(例如正常细胞)。当受感染的分裂中的细胞被溶解破坏，它们会释放新的感染性病毒颗粒去感染周围的分裂中的细胞。癌症细胞是很多病毒的理想宿主，因为它们的抗病毒干扰素路径被关闭或肿瘤抑制基因发生突变致使病毒复制可以不受限制的进行(Chernajovsky et al.,2006,British Med.J.332:170-2)。许多病毒包括腺病毒(adenovirus)、呼肠孤病毒(reovirus)、麻疹病毒(measles)、单纯疱疹病毒(herpessimplex)、新城疫病毒(Newcastle disease virus)以及痘苗病毒(vaccinia)已经作为溶瘤剂进行了临床试验。
一些病毒天然溶瘤(例如呼肠孤病毒和塞内加谷小核糖核苷酸病毒(Senecavalley picornavirus))，另一些通过修饰病毒基因组而针对肿瘤选择性进行改造。这种修饰包括关键病毒基因中的功能性缺失，利用肿瘤或组织特异性启动子控制病毒基因的表达以及趋向性修饰以将病毒重定向至癌细胞表面。
第一种被管理机构批准的溶瘤病毒是遗传修饰的腺病毒，被命名为H101(上海三维生物技术)，其在2005年获得中国国家食品药品监督管理局的批准用于治疗头颈癌。另一种叫ONYX-015的溶瘤腺病毒在进行治疗各种实体瘤的临床试验阶段(在治疗复发性头颈癌的三期临床试验中)(Cohen et al.,2001,Curr.Opin.Investig.Drugs 2:1770-5)。另一个示例是，溶瘤单纯疱疹1(T-VEC)通过遗传工程改造减弱病毒毒力，并增加对癌症细胞的选择性以及增强抗肿瘤免疫反应(通过GM-CSF的表达)。在二期和三期临床试验中已经证明针对手术不能切除的黑色素瘤的临床疗效(Senzer et al,2009,J.Clin.Oncol.27:5763-71)。
痘苗病毒(VV)具有许多溶瘤病毒疗法所必须的关键性质，例如对肿瘤的天然趋向性、溶解能力强、生命周期短且细胞-细胞间传播迅速、基因表达效率高以及克隆容量大。此外，它们在消灭天花的运动中还曾被递送给数百万个体而没有重大安全隐患。在这方面，TK和VGF双缺失且表达GM-CSF的VV(被命名为JX-963)在荷瘤小鼠中表现出显著的癌症选择性(Thorne et al.,2007,J Clin Invest.117:3350-8)。同样地，JX-594，具有GM-CSF且胸苷激酶缺失的VV(Wyeth株)，展现出有前景的临床数据，并且其在肝细胞癌中的随机三期临床实验预期即将开展。
文献中也已经记载了涉及溶瘤病毒和免疫检查点抑制因子的组合治疗法。WO2014/022138记述了将放疗后的肿瘤细胞、溶瘤腺病毒和抗CTLA4抗体组合使用以治疗膀胱癌或前列腺癌。WO2014/047350设想了在具有编码抗-PD-1抗体基因插入病毒基因组的重组溶瘤病毒，没有提供任何可起作用的示例以支持这种溶瘤病毒的使用。
技术问题
由于大量的致病因子可能相互作用或单独引发或促使癌症的发生，人们认为癌症会在很多年内继续是严重的全球健康威胁。此外，恶性的特别是转移性的肿瘤经常对常规治疗方法产生耐受性导致一些癌症的高发病率。
因此，迫切需要为预防和治疗增生性疾病特别是转移性癌症开发更有效的途径。本发明提供独特的产品结合杀死分裂的细胞和免疫检查点的溶瘤作用，以打破癌症相关的免疫耐受性。
在权利要求书中提供的实施方式的具体条款解决了这个技术问题。
其他和进一步的方面，本发明的特点以及优势在以下说明书中的优选实施方式中体现。提供这些实施方式是为了满足充分公开的要求。
发明概述
本发明涉及溶瘤病毒，其包含插入它的基因组中的一或多个编码一或多种免疫检查点调节因子的核苷酸分子。
溶瘤病毒优选选自呼肠孤病毒、新城疫病毒(NDV)、水疱性口炎病毒(VSV)、麻疹病毒、流感病毒、辛德比斯病毒(Sinbis virus)、腺病毒、痘病毒和疱疹病毒(HSV)等组成的组。在一实施方式中，所述溶瘤病毒为痘苗病毒。在一优选的实施方式中，所述痘苗病毒被工程改造为缺少胸苷激酶(TK)活性(例如，所述VV的基因组具有在J2R基因中的失活突变以产生TK缺陷表型)。可选地或者组合地，所述痘苗病毒被工程改造为缺少RR活性(例如，所述VV的基因组具有在I4L基因和/或F4L基因中的失活突变以产生RR缺陷表型)。
在一实施方式中，所述痘苗病毒进一步表达至少一个治疗性基因，尤其是编码自杀基因产物和/或免疫刺激蛋白的基因。
在一实施方式中，所编码的一或多种免疫检查点调节因子为拮抗PD-1、PD-L1或CTLA4的活性的拮抗分子，特别优选抗PD-1抗体和/或抗CTLA4抗体。
本发明进一步提供组合物，其包含所述溶瘤病毒，最终具有药学可接受的载体。在一个实施方式中，组合物配制为用于静脉内或瘤内施用。
本发明也涉及本发明的所述溶瘤病毒或组合物用于治疗增生性疾病的用途以及依赖施用有效量的本发明的所述溶瘤病毒或组合物治疗的方法。在一个实施方式中，使用本发明的方法治疗的增生性疾病是癌症，特别是黑色素瘤、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌和肝癌。在一个实施方式中，用途或方法包含额外步骤，其中向所述哺乳动物施用药学可接受的量的前体药物。所述前体药物的施用优选发生在所述溶瘤病毒或病毒组合物施用的3天之后。
发明详述
本发明涉及溶瘤病毒，其包含插入到它的基因组中的一或多个编码一或多种免疫检查点调节因子的核酸分子
定义
在整个申请文件中，除非另有说明，否则术语“一个(种)(a)”和“一个(种)(an)”的意义为“至少一个(种)”，“至少第一”，“一或多个(种)”或者“多个(种)”所述指代的组分或步骤。例如，术语“一个细胞”包含多个细胞及其混合物。
术语“一或多个(种)”表示一个(种)或一以上的数目(例如2、3、4、5等)。
本文任何地方用到的术语“和/或”包含“和”、“或”以及“通过所述术语关联的元件的全部或任何其他组合”的意思。
本文使用的术语“约”或“大概”表示给定值或范围的20％以内，优选为10％以内，并且更优选为5％以内。
如本文所用，当用于定义产物、组合物和方法时，术语“包含(comprising)”(以及包含(comprising)的任何形式，如“comprise”和“comprises”)、“具有(having)”(以及具有(having)的任何形式，如“have”和“has”)、“包括(including)”(以及包括(including)的任何形式，如“include”和“includes”)或“含有(containing)”(以及含有(comprising)的任何形式，如“contains”和“contain”)为开放式的且不排除额外的未记载的元件或方法步骤。因此，多肽“包含”氨基酸序列表示所述氨基酸序列可能是所述多肽的最终氨基酸序列的一部分。此多肽可以包含多达数百个额外氨基酸残基。“基本上由.......组成”表示将其他有重要意义的组分或步骤排除在外。所以，基本上由所记载的组分组成的组合物并不排除痕量的污染物和药学可接受的载体。多肽基本上由氨基酸序列组成表示这个氨基酸序列最终将存在少数几个额外氨基酸残基。“由……组成”表示不仅排除微量的其他成分或步骤。例如，多肽由氨基酸序列组成表示所述多肽不含有除了所述的氨基酸序列外的任何氨基酸。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”指的是氨基酸残基聚合物，包含通过肽键相连的至少九个或以上的氨基酸。所述聚合物可以是线性的、分支的或环状的，并且可以包含天然氨基酸和/或氨基酸类似物，并且其可以被非氨基酸间断。一般来讲，如果所述氨基酸聚合物多于50个氨基酸残基，那么优选称其为多肽或蛋白质，而如有当其长50个氨基酸或更少，称其为“肽”。
本发明上下文中，术语“核酸”、“核酸分子”、“多核苷酸”和“核苷酸序列”可相互替换使用并且定义任何长度的多脱氧核糖核苷酸(DNA)(例如cDNA、基因组DNA、质粒、载体、病毒基因组、分离的DNA、探针、引物以及其任何混合物)或多核糖核苷酸(RNA)(例如mRNA、反义RNA、SiRNA)或混合的多核糖-多脱氧核糖核苷酸的聚合物。它们涵盖单链或双链、线性或环状、天然或合成、修饰或未经修饰的多核苷酸。此外，多核苷酸可以包含非天然存在的核苷酸并且可以被非核苷酸组分间断。
如本文所用，术语“类似物”或“变体”表示分子(多肽或核酸)相对于其天然对应物而言展现一个或多个修饰。可以设想任何修饰，包括一个或多个核苷酸或氨基酸残基的取代、插入和/或缺失。优选的是保留与天然的对应物至少80％、优选至少85％、更优选至少90％和甚至更优选至少98％的序列相同性的类似物。
通常地，术语“相同性”表示在两个多肽或核苷酸序列中氨基酸与氨基酸或核苷酸与核苷酸的对应性。两个序列相同性百分比是所述序列共享的相同位置数目的函数，考虑需要导入以优化比对的缺口数目和每个缺口的长度。在本领域中有多种计算机程序和数学算法来确定氨基酸序列之间的相同性百分比，例如NCBI的Blast程序或在Atlas ofProtein Sequence and Structure中的ALIGN(Dayhoffed,1981,Suppl.,3:482-9)。确定核苷酸序列之间相同性的程序也可以在专业数据库上获得(例如Genbank、the WisconsinSequence Analysis Package、BESTFIT、FASTA和GAP程序)。为说明目的，“至少80％的相同性”表示80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
本文中使用的术语“分离的”指蛋白质、多肽、肽、多核苷酸、载体等从其天然环境中移除(即与至少一种其天然伴随或在自然界中发现与其一起的其他组分分离)。例如，当核苷酸序列与在自然状态下通常与其相连的序列分离(例如从基因组解离)，所述核苷酸序列是分离的，但它可与异源序列相连。
术语“获得自”、“源自(originating)”或“源自(originate)”用于表示组分(例如多肽和核苷酸分子)的原始来源，但不意味着限制制备所述组分的方法，所述方法可以是例如化学合成或重组手段。
本文中所使用的术语“宿主细胞”应当被广义理解，不受任何关于组织、器官或分离的细胞的特定结构的限制。这样的细胞可能是独特类型的细胞或一组不同类型的细胞，例如培养的细胞系、原代细胞以及分裂中的细胞。在本发明上下文中，术语“宿主细胞”包括原核细胞、低等真核细胞例如酵母、其他真核细胞例如昆虫细胞、植物和哺乳动物(例如人或非人)细胞以及能生产用于本发明的溶瘤病毒和/或免疫检查点调节因子的细胞。该术语还包括可以是或已经是本文中所描述的载体的受体的细胞以及这些细胞的后代。
本文中使用的术语“溶瘤病毒”表示这样的病毒，其在体外或在体内能选择性地在分裂中的细胞(例如增生细胞，例如癌症细胞)复制以减慢所述分裂中的细胞的生长和/或裂解所述分裂中的细胞，而在非分裂中的细胞显示不复制或最少的复制。一般地，溶瘤病毒包含包装进病毒颗粒(或病毒体)中的病毒基因组，并且是感染性的(即能够感染和进入宿主细胞或对象)。本文中使用的此词汇包含DNA或RNA载体(取决于使用的病毒)以及其产生的病毒颗粒。
术语“治疗”如本文所用涵盖预防(例如在具有患上待治疗的病理状态的风险的对象中的预防措施)和/或治疗(例如在已经诊断为患有所述病理状态的对象中)，最终与常规治疗模式相关。治疗的结果是减慢、治愈、改善或控制目标病理状态的进展。例如，如果在施用如本文所述的溶瘤病毒之后，对象表现出可以观察到的临床状态的改善，则成功治疗所述对象的癌症。
本文中的术语“施用”表示向对象递送治疗剂，例如文中所描述的溶瘤病毒。
本文中的术语“增生性疾病”涵盖由不受控的细胞生长和扩散导致的任何疾病或状况包括癌症，以及与破骨细胞活性升高相关的疾病(例如类风湿性关节炎、骨质疏松症等)和心血管疾病(血管壁平滑肌细胞增生引起的再狭窄等)。术语“癌症”可与以下任何术语互换使用：“肿瘤”、“恶性肿瘤”、“新生物(neoplasm)”等。这些术语旨在包含任何类型的组织、器官或细胞以及恶性肿瘤的任意阶段(例如从癌前病变到IV期)。
术语“对象”通常表示需要本发明的任何产品和方法或可从本发明的任何产品和方法中获益的生物体。典型地，所述生物体是哺乳动物，特别是选自家畜、农场动物、运动动物和灵长类的哺乳动物。优选地，所述对象是已经被诊断为患有患有增生性疾病例如癌症或者处于患上增生性疾病例如癌症的风险中的人类。术语“对象”和“患者”当指代人类生物体时可以互换使用并且涵盖男性和女性。治疗的对象可以是新生儿、婴儿、年轻人或成年人。
本文中的术语“组合”或“联合”表示多种成分的任意可能的排列组合(例如溶瘤病毒和一或多种抗癌治疗有效物质)。这种排列组合包含同时或相继施用的所述成分以及单独组合物的混合物。本发明包含组合物，该组合物或包含摩尔浓度的每种成分或包含完全不同的浓度。本领域技术人员可以确定组合中的每种成分的最适浓度。
术语“免疫检查点调节因子”指的是能够以正或负的方式调节免疫检查点蛋白的方能的分子(特别是，抗原递呈细胞(APC)例如癌症细胞和免疫T效应细胞间的相互作用)。术语“免疫检查点”表示直接或间接参与免疫路径的蛋白质，所述免疫路径为在正常生理条件下对于预防不受控的免疫反应至关重要，并因此对于维持自体耐受性和/或组织保护至关重要。本文所述一或多种免疫检查点调节因子可独立作用于T细胞介导的免疫的任何步骤，包括抗原特异性细胞的克隆选择、T细胞激活、增殖、运输到抗原和炎症部位、执行直接效应子功能和通过细胞因子和膜配体的信号传导。这些步骤的每个通过抗衡刺激性和抑制性信号而调节以对反应进行微调。在本发明上下文，此术语涵盖能够至少部分地下调抑制性免疫检查点功能的免疫检查点调节因子(拮抗剂)和/或能够至少部分地上调刺激性免疫检查点功能的免疫检查点调节因子(激动剂)。
溶瘤病毒
本发明使用的所述溶瘤病毒可获得自目前被鉴定的病毒的任何成员，只要其溶瘤，由于其与非分裂中细胞相比在分裂中的细胞中选择性复制并杀死分裂中的细胞的特性。其可以是天然溶瘤的天然病毒或可以通过修饰一个或多个病毒基因以增加肿瘤选择性和/或在分裂中的细胞的优先复制来改造，所述病毒基因例如那些涉及DNA复制、核酸代谢、宿主趋向性、表面附着、毒力、细胞溶解和扩散的基因(见例如Kirn et al.,2001,Nat.Med.7:781；Wong et al.,2010,Viruses 2:78-106)。也可设想将一个或多个病毒基因置于事件或组织特异性调控元件(例如启动子)的控制之下。
典型的溶瘤病毒包含但不限于呼肠孤病毒(reovirus)、塞内加谷病毒(SenecaValley virus)(SVV)、水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus)(VSV)、新城疫病毒(Newcastle disease virus)(NDV)、单纯孢疹病毒(herpes simplex virus)(HSV)、麻疹病毒属病毒(morbillivirus virus)、逆转录病毒(retrovirus)、流感病毒(influenzavirus)、辛德比斯病毒(Sinbis virus)、痘病毒(poxvirus)、腺病毒(adenovirus)等。
在一实施方式中，本发明使用的所述溶瘤病毒获得自呼肠孤病毒(reovirus)。代表性的实例包括Reolysin(Oncolytics Biotech正在研发中；NCT01166542)。
在一实施方式中，本发明使用的所述溶瘤病毒获得自塞内加谷病毒(SenecaValley virus)。代表性的实例包括NTX-010(Rudin et al.,2011,Clin.Cancer.Res.17(4):888-95)。
在一实施方式中，本发明使用的所述溶瘤病毒获得自水疱性口炎病毒(VSV)。用于本发明的代表性实例在文献中已有描述(例如Stojdl et al.,2000,Nat.Med.6(7):821-5；Stojdl et al.,2003,Cancer Cell 4(4):263-75)。
在一个实施方式中，本发明使用的所述溶瘤病毒获得自新城疫病毒。本发明的代表性的实例包含但不限于73-T PV701和HDV-HUJ株以及在文献中记载的那些(例如Phuangsab et al.,2001,Cancer Lett.172(1):27-36；Lorence et al.,2007,Curr.Cancer Drug Targets 7(2):157-67；Freeman et al.,2006,Mol.Ther.13(1):221-8)。
在一实施方式中，本发明使用的所述溶瘤病毒获得自单纯孢疹病毒(HSV)。疱疹病毒科为DNA病毒的大家族，其全部具有共同的结构并包含衣壳化于二十面体衣壳中的相对大的编码100-200个基因的双链线性DNA基因组，该二十面体衣壳包裹在脂质双层膜中。虽然所述溶瘤疱疹病毒可衍生自不同类型的HSV，但特别优选的是HSV1和HSV2。所述疱疹病毒可被遗传改造以限制病毒在肿瘤内的复制或降低它在非分裂中细胞内的细胞毒性。例如，任何涉及核酸代谢的病毒基因可被失活，例如胸苷激酶(Martuza et al.,1991,Science252:854-6)、核糖核苷酸还原酶(RR)(Boviatsis et al.,1994,Gene Ther.1:323-31；Mineta et al.,1994,Cancer Res.54:3363-66)或尿嘧啶-N-糖基化酶(Pyles et al.,1994,J.Virol.68:4963-72)。另一方面涉及病毒突变体，其具有编码毒力因子的基因功能的缺陷，所述基因例如ICP34.5基因(Chambers et al.,1995,Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:1411-5)。溶瘤疱疹病毒的代表性实例包括NV1020(例如Geevarghese et al.,2010,Hum.Gene Ther.21(9):1119-28)和T-VEC(Andtbacka et al.,2013,J.Clin.Oncol.31,abstract number LBA9008)。
在一实施方式中，本发明使用的所述溶瘤病毒获得自麻疹病毒属，所述麻疹病毒属可以获得自副粘液病毒科，特别优选麻疹病毒。合适的溶瘤麻疹病毒的代表性实例包含但不限于MV-Edm(McDonald et al.,2006；Breast Cancer Treat.99(2):177-84)和HMWMAA(Kaufmann et al.,2013,J.Invest.Dermatol.133(4):1034-42)。
在一实施方式中，本发明的所述溶瘤病毒获得自腺病毒。本领域已有改造溶瘤腺病毒的方法。有利的策略包括用肿瘤选择性启动子置换病毒启动子或修饰E1腺病毒基因产物以灭活其与在肿瘤细胞中被改变的p53或视网膜母细胞瘤(retinoblastoma)(Rb)蛋白的结合功能。在天然环境中，腺病毒E1B55kDa基因与其他腺病毒产物协作使p53失活(在癌细胞中p53通常失调)，因此阻止细胞凋亡。溶瘤腺病毒的代表性实例包括ONYX-015(例如Khuri et al.,2000,Nat.Med 6(8):879-85)和也叫Oncorine的H101(Xia et al.,2004,AiZheng 23(12):1666-70)。
在一实施方式中，本发明使用的所述溶瘤病毒是痘病毒。本发明使用的术语“痘病毒”表示属于痘病毒科的病毒，特别优选属于脊椎动物痘病毒(Chordopoxviridae)亚科的痘病毒，并且更优选属于正痘病毒(Orthopoxvirus)属。多种痘病毒的基因组序列，例如痘苗病毒(Vaccinia virus)、牛痘病毒(cowpox virus)、金丝雀痘病毒(Canarypox virus)、鼠痘病毒(Ectromelia virus)和粘液瘤病毒(Myxoma virus)的基因组在本领域以及专业数据库中可以获得，例如Genbank(登录号分别为NC_006998、NC_003663、NC_005309、NC_004105、NC_001132)。
期望地，所述溶瘤痘病毒为溶瘤痘苗病毒。痘苗病毒是痘病毒科的成员，其特征为200kb双链DNA基因组，所述基因组编码大量使病毒能够不依赖于宿主细胞结构进行复制的病毒酶和因子。大部分的痘苗病毒粒子是细胞内的(IMV意为细胞内成熟病毒体)，具有单层脂质包膜并在被感染细胞的细胞质中存留直至溶解。另一种感染性的形式为双层包膜粒子(EEV意为细胞外包被的病毒体)，其从被感染细胞出芽而不溶解该细胞。
虽然可以衍生自任何痘苗病毒株，但更优选埃尔斯特里(Elstree)、惠氏(Wyeth)、哥本哈根(Copenhagen)和西储(Western Reserve)株。本文使用的基因命名法为哥本哈根(Copenhagen)痘苗病毒株的命名法。除非另有指示，此法还用于本文中的其他痘病毒科的同源基因。然而，基因命名法可能根据痘株而有所不同，但哥本哈根(Copenhagen)和其他痘苗病毒株之间的对应关系通常可在文献中获得。
优选地，本发明的所述溶瘤痘苗病毒通过改变一个或多个病毒基因进行修饰。优选地，所述修饰导致合成(或不合成)有缺陷的蛋白，该蛋白不具备未经修饰的基因在正常条件下产生的蛋白的活性。修饰涵盖病毒基因或其调控元件内一个或多个核苷酸(连续或不连续)的缺失、突变和/或取代。修饰可通过本领域技术人员已知的许多方式使用常规重组技术进行。示例性的修饰在文献中公开，特别优选那些改变参与DNA代谢、宿主毒力和IFN途径的病毒基因的修饰(见例如Guse et al.,2011,Expert Opinion Biol.Ther.11(5):595-608)。
更优选地，本发明中的所述溶瘤痘病毒通过改变编码胸苷激酶的基因(J2R基因座)进行修饰。所述胸苷激酶涉及脱氧核糖核苷酸的合成。胸腺激酶对于正常细胞中的病毒复制是必需的，因为这些细胞通常具有低浓度的核苷酸，而胸腺激酶在分裂中的细胞中是可有可无的，因为分裂中的细胞有高核苷酸浓度。
可选地或者组合地，本发明的所述溶瘤痘病毒通过改变至少编码核糖核苷酸还原酶(RR)的一个或者两个基因进行修饰。在自然环境中，该酶催化核糖核苷酸还原为脱氧核糖核苷酸，其是DNA生物合成的关键步骤。该病毒酶在亚基结构上与哺乳动物的酶相似，均包含两个异源亚基，称为R1和R2，分别由I4L和F4L基因座编码。不同痘病毒中的I4L和F4L基因的序列以及在基因组上的位置在公共数据库上可以获得，例如通过登录号DQ437594、DQ437593、DQ377804、AH015635、AY313847、AY313848、NC_003391、NC_003389、NC_003310、M-35027、AY243312、DQ011157、DQ011156、DQ011155、DQ011154、DQ011153、Y16780、X71982、AF438165、U60315、AF410153、AF380138、U86916、L22579、NC_006998、DQ121394和NC_008291。在本发明中，I4L基因(编码R1大亚基)或F4L基因(编码R2小亚基)之一或两者可被失活。
可选地或者组合地，也可使用其他策略来进一步地增加病毒肿瘤特异性。合适的修饰的代表性实例包括从病毒基因组中破坏VGF编码基因。VGF(痘苗病毒生长因子)是分泌蛋白，其在细胞感染后的早期表达并且其功能似乎对于病毒在正常细胞间传播十分重要。另一个实例是破坏编码血凝素(hemagglutinin)的A56R基因，最后与胸苷激酶缺失组合(Zhang et al.,2007,癌症Res.67:10038-46)。破坏干扰素调节基因(例如B8R或B18R基因)或者是胱天蛋白酶-1抑制因子B13R基因也是有利的。另一个适当的修饰的典型示例包含破坏F2L基因，其编码涉及DNA复制保真和为通过胸苷酸合成酶生产的TMP提供前体的病毒脱氧尿苷三磷酸酶(dUTPase)(Broyles et al.,1993,Virol.195:863-5)。痘苗病毒F2L基因的序列在genbank中通过登录号M25392可以获得。
优选实施方式中，本发明所使用的溶瘤病毒是由J2R基因中的失活突变导致TK缺陷的痘苗病毒。在另一个优选实施方式中，本发明所使用的溶瘤病毒是由病毒基因组携带的所述J2R基因和所述I4L和/或F4L基因两者中的失活突变导致TK和RR活性均缺陷的痘苗病毒(如WO2009/065546和Foloppe et al.,2008,Gene Ther.,15:1361-71中所述)。在另一个优选实施方式中，本发明的溶瘤病毒是由F2L基因失活突变导致的dUTPase缺陷的痘苗病毒(如WO2009/065547中所述)，最终与破坏至少TK和RR活性中的一个或两个相结合(导致失活突变F2L失活突变；F2L和J2R基因失活突变；F2L和I4L失活突变；或F2L、J2R和I4L失活突变的病毒)。
治疗性基因
在一实施方式中，本发明中使用的所述溶瘤病毒进一步地表达至少一个插入病毒基因组中的治疗性基因。当正确施用于对象时，“治疗性基因”编码能够提供生物活性的产物，预期该生物活性可以对待治疗的病理状态的进程和症状产生有益效果，其通过加强抗肿瘤功效或强化病毒的溶瘤性。在本发明中，所述治疗性基因可以是哺乳动物来源(例如人、鼠类、兔类等)或非哺乳动物来源(例如细菌、酵母或病毒来源)。优选地，所述治疗性基因不是编码如本文所述的免疫检查点调节因子的基因或核苷酸序列。
在本发明上下文中，可以设想到大量的治疗性基因，例如那些编码能够补偿对象中的蛋白缺陷或不足的多肽的基因，或那些通过毒性效应从体内限制或除去有害细胞的基因，或那些编码免疫效应的多肽的基因。他们可以是天然基因或者通过之后一个或多个核苷酸的突变、缺失、取代和/或添加获得的基因。
有利地，本发明使用的溶瘤病毒携带治疗性基因，该治疗性基因选自编码自杀基因产物和免疫刺激蛋白的基因。
自杀基因
术语“自杀基因”表示编码可以将药物前体转换为细胞毒性化合物的蛋白的基因。自杀基因包含但不限于编码具有胞嘧啶脱氨酶活性、胸苷激酶活性、尿嘧啶磷酸核糖转移酶活性、嘌呤核苷磷酸化酶活性以及胸苷酸激酶活性的蛋白的基因。自杀基因以及相应的包含一个核碱基部分的药物前体的实例在下表列出。
表1
期望地，所述自杀基因编码至少具有胞嘧啶脱氨酶(CDase)活性的蛋白质。在原核生物和低等真核生物中(在哺乳动物中不存在)，CDase参与嘧啶代谢途径，经由该途径，外源胞嘧啶通过水解脱氨基作用被转变为尿嘧啶。CDase也能够脱去胞嘧啶类似物即5-氟胞嘧啶(5-FC)的氨基，从而形成5-氟二氧嘧啶(5-FU)，5-氟二氧嘧啶(5-FU)是一种当转变为5-氟-UMP(5-FUMP)后具有强细胞毒性的化合物。CDase编码的核苷酸分子可以获得自任何原核和低等真核生物，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(FCY1基因)、白色念珠菌(Candida Albicans)(FCA1基因)和大肠杆菌(codA gene)。基因序列和编码的CDase蛋白已经发表且可以在专门的数据库中获得(SWISSPROT EMBL、Genbank、Medline等)。也可以使用这些基因的功能类似物。优选地，所述类似物具有与天然基因的核酸序列具有至少70％，有利地至少80％，优选至少90％，最优选95％相同性程度的核酸序列。
可选地或者组合地，本发明的所述溶瘤病毒在其病毒基因组中携带编码具有尿嘧啶磷酸核糖转移酶(UPRTase)活性的多肽的自杀基因。在原核生物和低等真核生物中，尿嘧啶通过UPRTase的作用转化成UMP。该酶将5-FU转化为5-FUMP。举例说明，从大肠杆菌(Andersen et al.,1992,European J.Biochem.204:51-56)、从乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)(Martinussen et al.,1994,J.Bacteriol.176:6457-63)、从牛结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis)(Kim et al.,1997,Biochem.Mol.Biol.Internat.41:1117-24)以及从枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)(Martinussen et al.,1995,J.Bacteriol.177:271-4)中获得的编码UPRTase的核酸序列可用在本发明中。但是，最特别优选使用酵母UPRTase，特别是酿酒酵母(S.cerevisiae)(FUR1基因)编码的，其序列在Kern等(1990,Gene88:149-57)中公开。也可以使用功能性的UPRTase类似物，例如在EP998568中记载的氮末端截短的FUR1突变体(缺失前35个残基直至存在于天然蛋白第36位的第二个Met残基)，所述突变体与天然酶相比展现出更高的UPRTase活性。
优选地，插入本发明所使用的溶瘤病毒的病毒基因组中的自杀基因编码具有CDase和UPRTase活性的多肽。此多肽可通过融合两个酶促结构域而改造，其中一个结构域具有CDase活性而另一个具有UPRTase活性。示例性的多肽包含但不限于在WO96/16183、EP998568和WO2005/07857记载的融合多肽codA::upp、FCY1::FUR1和FCY1::FUR1[Delta]105(FCU1)以及FCU1-8。特别感兴趣的是FCU1自杀基因(或FCY1::FUR1[Delta]105融合)，其编码包含在WO2009/065546中序列编号SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的多肽。本发明涵盖所述多肽的类似物，只要其保留CDase和/或UPRTase活性。本领域技术人员有能力从已发布的数据中分离编码CDase和/或UPRTase的核苷酸分子，最终改造其类似物并且在无细胞或者细胞系统中利用常规技术检验酶促活性(见例如EP998568)。
免疫刺激治疗性基因
在本文中，术语“免疫刺激蛋白”表示具有以特异性或非特异性方式刺激免疫系统的能力的蛋白质。大量蛋白质由于它们实现免疫刺激效果的能力而被本领域所知晓。在本发明中，合适的免疫刺激的蛋白的实例包含但不限于细胞因子，特别是白细胞介素(例如IL-2、IL-6、IL-12、IL-15以及IL-24)、趋化因子(例如CXCL10、CXCL9以及CXCL11)、干扰素(例如IFNg以及IFNalpha)、肿瘤坏死因子(TNF)、集落刺激因子(例如GM-CSF、C-CSF以及M-CSF……)、APC(抗原呈递细胞)-外露蛋白(例如B7.1、B7.2等)、生长因子(转化生长因子TGF、纤维母细胞生长因子FGF、血管内皮细胞生长因子VEGF等)、I型或II型主要组织相容性复合物(MHC)抗原、细胞凋亡诱导剂或抑制剂(例如Bax、Bcl2、BcIX……)、细胞静止素(p21、p16、Rb等)、免疫毒素(immunotoxin)、抗原性多肽(抗原性多肽、表位等)以及标记物(β-半乳糖苷酶、荧光素酶……)。优选地，所述免疫刺激蛋白是白细胞介素或集落刺激因子，特别优选GM-CSF。
免疫检查点调节因子
免疫检查点和其调节因子以及使用此类化合物的方法在文献中描述。根据本发明，一或多种免疫检查点调节因子可能独立地是多肽，所述多肽包含能够结合靶免疫检查点和/或抑制配体结合所述靶免疫检查点以发挥拮抗功能(即能够拮抗免疫检查点介导的抑制信号)或激动剂功能(即能够加强免疫检查点介导的刺激信号)的结构域。这样的一或多种免疫检查点调节因子能独立地选自肽(例如肽配体)、天然受体的可溶结构域、RNAi、反义分子、抗体和蛋白质支架。
在一个优选的实施方式中，所述免疫检查点调节因子是抗体。在本发明的情况下，“抗体”(“Ab”)具有最广的含义并且包含自然出现的和人工制备的以及全长抗体或其能够结合到靶免疫检查点或表位(因此保留靶结合部分)的功能性片段或类似物。由本发明的溶瘤病毒编码的所述抗体可能是任何来源，例如人抗体、人源化抗体、动物抗体(例如啮齿动物或骆驼科的抗体)或者嵌合抗体。可能是任何同种型(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgM等的同种型)。此外，可能是糖基化的、部分糖基化的或者非糖基化的(例如通过突变糖基化位点内的一或多个残基)。术语抗体还包含双特异性或多特异性抗体，只要他们显示出上述的结合特异性。
为说明目的，全长抗体是糖蛋白，其包含通过二硫键互相连接的至少两个重链(H)和两个轻链(L)。每个重链包含重链可变区(VH)和重链恒定区，重链恒定区由三个CH1、CH2和CH3结构域组成(最终CH1和CH2之间存在铰链)。每个轻链包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区，轻链恒定区包含CL结构域。VH和VL区包含高变区，称为互补决定区(CDR)，间隔有更保守的区域，称为骨架区(FR)。每个VH和VL以下列顺序包含三个CDR和四个FR：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。重链和轻链的所述CDR区域是结合特异性的决定因素。
如本文中所使用的，“人源化抗体”表示非人类(例如小鼠、骆驼、大鼠等)抗体其蛋白质序列被改变以增加与人类抗体(即人类天然产生的抗体)的相似性。人源化方法是本领域众所周知的(例子见Presta et al.,1997,Cancer Res.57(20):4593-9；US 5,225,539；US 5,530,101；US 6,180,370；WO2012/110360)。例如，可以人源化本文所用的免疫检查点抗体，通过取代一个或多个FR区的残基使其看起来像人类免疫球蛋白序列，而可变区的绝大多数残基没有被改变且与非人免疫球蛋白的那些对应。作为一般通则，在FR区的这些氨基酸取代的数目在每个VH或VL的可变区内通常不超过20个。
如本文中所使用的，“嵌合抗体”表示包含一种物种的一或多个元件和另一物种的一或多个元件的抗体，例如，包含人类免疫球蛋白的恒定区(Fc)的至少一部分的非人抗体。
很多形式的抗体可以被本发明的溶瘤病毒表达。典型的实例包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、dAb、Fd、Fv、scFv、双-scFv和双抗体(diabody)等。更具体地：
(i)表示为由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段的Fab片段；
(ii)表示为包含两个在铰链区通过至少一个二硫键相连的Fab片段的二价片段的F(ab')2片段；
(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；
(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；
(v)由单个可变结构域片段(VH或VL结构域)组成的dAb片段；
(vi)单链Fv(scFv)，其包含Fv片段的两个结构域，VL和VH，最终通过接头融合在一起形成单蛋白质链(例子见Bird et al.,1988,Science 242:423-6；Huston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-83；US 4,946,778；US 5,258,498)；以及
(vii)任何其他人工抗体。
如果有需要，可以与原抗体相同的方式(例如通过标准ELISA实验)针对功能性筛选这些片段和类似物。
在一个优选的实施方式中，本发明的溶瘤病毒编码的一或多种免疫检查点调节因子的至少一种是单克隆抗体，特别优选人抗体(其中两个骨架区来源于人种系免疫球蛋白序列)或根据熟知的人源化方法的人源化抗体。
期望地，本发明的溶瘤病毒编码的一或多种免疫检查点调节因子至少部分拮抗(例如大于50％)抑制性免疫检查点的活性，特别是通过以下任一介导的：PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG3、Tim3、BTLA和CTLA4，特别优选特异性结合任何这样的靶蛋白的单克隆抗体。术语“特异性结合”表示甚至在其他异源蛋白和生物制剂存在的条件下对特定靶或表位的结合特异性和亲和力的大小。因此，在指定的测定条件下，本发明的溶瘤病毒编码的抗体优先结合它的靶，且不以显著量结合测试样品或对象中存在的其他成分。优选地，此抗体表现出对它的靶结合的高亲和力，其平衡解离常数等于或小于1x10-6M(例如至少0.5x10-6、1x10-7、1x10-8、1x10-9、1x10-10等)。可选地，本发明的一或多种免疫检查点调节因子执行激动剂的功能，能够刺激或加强刺激信号，特别是那些CD28介导的优选为ICOS、CD137(4-1BB)、OX40、CD27、CD40、GITR免疫检查点的任一种。评估抗体对免疫检查点的结合能力的标准测定为本领域已知，包括例如ELISA、蛋白质印迹(Western blot)、RIA和流式细胞术(flowcytometry)。抗体的结合动力学(例如结合亲和力)也能通过本领域已知的标准测定进行评估，例如通过Biacore分析。
在一个优选的实施方式中，本发明使用的至少一种所述一或多种检查点调节因子包含人或人源化的抗体，其能拮抗涉及T细胞介导的反应的免疫检查点。优选的免疫检查点调节因子实例为能够至少部分拮抗程序性死亡蛋白(PD-1)的调节因子，并且特别是特异性地结合人PD-1的抗体。PD-1是免疫球蛋白(Ig)基因超家族的一部分，是CD28家族成员。它是在抗原刺激过的细胞(例如活化的B细胞、T细胞、以及骨髓细胞)(Agata et al.,1996,Int.Immunol.8:765-72；Okazaki et al.,2002,Curr.Opin.Immunol.14:391779-82；Bennett et al.,2003,J.Immunol 170:711-8)中表达的55kDa的1型跨膜蛋白。在正常环境中，它通过在炎症反应时限制T细胞的活性起作用，从而保护正常组织不被破坏(Topalian,2012,Curr.Opin.Immunol.24:207-12)。PD-1的两个配体已被识别，分别是PD-L1(程序性死亡配体1)和PD-L2(程序性死亡配体2)(Freeman et al.,2000,J.Exp.Med.192:1027-34；Carter et al.,2002,Eur.J.Immunol.32:634-43)。PD-L1在20-50％的人类癌症中被发现(Dong et al.,2002,Nat.Med.8:787-9)。PD-1和PD-L1间的相互作用导致肿瘤浸润性淋巴细胞的降低，T-细胞受体介导的增殖降低，以及癌症细胞的免疫逃避(Dong et al.,2003,J.MoI.Med.81:281-7；Blank et al.,2005,Cancer Immunol.Immunother.54:307-314)。PD-1的完整的核苷酸和氨基酸序列能在GenBank登录号No U64863和NP_005009.2找到。一些抗PD1抗体可在本领域获得(例如在以下中描述的：WO2004/004771；WO2004/056875；WO2006/121168；WO2008/156712；WO2009/014708；WO2009/114335；WO2013/043569；和WO2014/047350)。优选地，本发明的溶瘤病毒编码并表达抗PD-1抗体，其为FDA批准的或在高级临床研发，例如下列那些已投入市场或已研发的：Nivolumab(由Bristol Myer Squibb开发，也称为BMS-936558)、Pembrolizumab(由Merck开发，也称为Lanbrolizumab或MK-3475)以及Pidilizumab(由CureTech开发，也称为CT-011)。基于本文公开的信息，根据标准技术能克隆或分离对应的核苷酸序列。
另一个优选的适合在本发明的溶瘤病毒中表达的免疫检查点调节因子的示例为能至少部分拮抗称为PD-L1的PD-1配体的调节因子，尤其是能够结合已知的人类PD-L1的抗体。一些抗PD-L1抗体在本领域可获得(例子见在EP1907000描述的那些)。优选的抗PD-L1抗体为FDA认证的或在高级临床开发的(例如由Genentech/Roche开发的MPDL3280A和由Bristol Myer Squibb开发的BMS-936559)以及抗-PD-L1Fc fusions(例如Medimmune和AstraZeneca开发的AMP-224)。
人们也可使用最近发现的VISTA蛋白的拮抗剂，其表现出T-细胞反应负调节(Wanget al.,2011,J.Exp.Med.208(3):577-592)。VISTA，也指定为PD-1H和PD-L3，与PD-L1家族成员相似。例如抗-VISTA拮抗剂在US2013-0177557中描述。
另一个合适的免疫检查点调节因子的优选示例为能至少部分拮抗CTLA-4蛋白的调节因子，尤其是能够辨识人类CTLA-4的抗体。CTLA4(即细胞毒性T-淋巴细胞相应抗原4)也称为CD152发现于1987年(Brunet et al.,1987,Nature 328:267-70)，由CTLA4基因编码(Dariavach et al.,Eur.J.Immunol.18:1901–5)。CTLA4是受体免疫球蛋白超家族的一员。它在辅助性T细胞的表面表达，在那里它主要调节早期T细胞激活的幅度。最近的研究表明CTLA-4可在生物体内通过从抗原递呈细胞的细胞膜上移除B7-1和B7-2起作用，因此使CD28无法被激活(Qureshi et al.,Science,2011,332:600-3)。完整的CTLA-4核苷酸序列能够在GenBank编号No Ll 5006下获得。一些抗CTLA-4抗体在本领域中可获得(例子见在US 8,491,895中描述的)。本发明情况下优选的抗CTLA-4抗体为FDA认证的或在高级临床研发的。人们尤其可引用伊匹单抗(ipilimumab)由Bristol Myer Squibb作为Yervoy推广(例子见US 6,984,720；US 8,017,114)、由辉瑞开发的tremelimumab(例如US 7,109,003和US 8,143,379)以及单链抗CTLA4抗体(例如WO97/20574和WO2007/123737)。
本发明的溶瘤病毒也可表达免疫检查点调节因子以拮抗LAG3受体(例子见US 5,773,578)。
另一个合适的免疫检查点调节因子的示例为OX40兴奋剂，例如OX40的兴奋剂配体(OX40L)(例子见US 5,457,035、US 7,622,444；WO03/082919)或指向OX40受体的抗体(例子见US 7,291,331和WO03/106498)。
另一个免疫检查点调节因子的例为CD8+T细胞和NK细胞包含的以抑制性受体为目标的抗KIR或抗CD96抗体。
本发明包含溶瘤病毒，其编码多于一种免疫检查点调节因子。优选示例包括但不限于表达抗CTLA-4抗体和抗PD-1抗体。
表达编码免疫检查点调节因子的一或多个核苷酸分子和如果任何治疗性基因插 入病毒基因组。
编码免疫检查点调节因子的核苷酸分子和治疗性基因可利用在本领域中可得的序列数据和其提供的信息通过标准分子生物学技术(例如PCR扩增、cDNA克隆、化学合成)获得。克隆抗体、其片段和类似物的方法为本领域已知(例子见Harlow and Lane,1988,Antibodies–A laboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor NY)。例如，编码抗体的轻链和重链或他们的CDR的核苷酸分子(例如cDNA)可从增殖中的杂交瘤中、免疫球蛋白基因库或其他任何来源分离(例子见Kohler and Milstein,1975,Nature 256:495-7；Cote et al.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:2026-30；Coleet al.in Monoclonal antibodies and Cancer Therapy；Alan Liss pp77-96)，或核苷酸序列可通过化学合成生成。类似物和片段可施用常规分子生物学技术生成。
编码免疫检查点调节因子的核苷酸分子和最终的治疗性基因能单独被插入病毒基因组的认可位置，特别优选非必需基因座。插入溶瘤病毒可通过常规分子生物学手段进行，例如在Sambrook等中描述的(2001,Molecular Cloning-A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory)。插入腺病毒载体或痘病毒载体能通过分别在Chartier等(1996,J.Virol.70:4805-10)中描述的和Paul等(2002,Cancer Gene Ther.9:470-7)中描述的同源重组实现。例如，TK、RR和F2L基因以及基因间区段分别适合插入溶瘤痘苗病毒和插入溶瘤腺病毒的E3和E4区段。
此外，编码核苷酸序列能被优化以在特定宿主细胞内或对象内提供高表达水平。确实被观察到，生物体的密码子使用模式是非常不随机的，并且密码子的使用可在不同的宿主中显著不同。例如，治疗性基因可是细菌或低等真核生物来源的(例如自杀基因)，因此此密码子使用模式不适合在高等真核生物中提供有效的表达(例如人类)。典型地，密码自由化通过替换一或多个“天然”(例如细菌或酵母)的对应在宿主生物体内不常用的密码子的密码子为一或多个编码相同氨基酸的更常使用的密码子。不必须替换所有的对应不常用密码子的天然密码子，因为部分替换即可达成增强的表达的目的。
进一步优化密码子使用，在宿主细胞或对象中的表达能通过修改核苷酸序列进一步被提高。例如，为防止罕用密码子非优化密码子在集中区聚集和/或抑制或修改负面影响表达水平的“负”序列元件，多种修饰可被设想。这些负序列元件包括但不限于具有很高(>80％)或很低(<30％)GC含量的区段；AT–富集或GC-富集的序列延伸；不稳定的直接或反响重复序列；RNA二级结构；和/或内部隐藏调控元件，例如内部TATA盒、chi位点、核糖体进入位点和/或剪接供体/接受部位。
根据本发明，每个编码所述免疫检查点调节因子的一或多个核苷酸分子以及插入本发明溶瘤病毒基因组的治疗性基因可操作地连接到合适的调节元件以使其在宿主细胞或对象中表达。如本文中使用的，词汇“调控元件”或“调控序列”表示任何允许、贡献或调节编码核苷酸分子在给定宿主细胞或对象中的表达的元件，包括复制、增加拷贝数、转录、剪切、翻译、稳定和/或运输核苷酸或其衍生物(即m RNA)。如本文中使用的，“可操作地连接”的意思是排列被连接的元件以使他们的功能与他们的目的功能相一致。例如，启动子可操作地连接到核苷酸分子，当启动子在允许的宿主细胞中从转录开始到所述核苷酸分子的终止子影响转录。
本领域技术人员会领会到调控序列的选择能取决于例如核苷酸分子本身、插入的病毒、宿主细胞或对象、合意的表达水平等这些因素。启动子特别重要。在本发明的情况下，它在多种宿主细胞或针对特定宿主细胞(例如肝-特异性调控序列)中组成性指引核苷酸分子的表达或调控对特殊事件或外源因子反应(例如温度、营养添加剂、激素等)或根据病毒周期的阶段(例如晚期或早期)。人们也可使用在生产阶段被抑制的启动子对特殊事件或外源因子起反应，以优化病毒生产和规避潜在的表达的多肽的毒性。
适合在哺乳动物细胞中组成性表达的启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子(US 5,168,062)、RSV启动子、腺病毒主要晚期启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子(Adra et al.,1987,基因60:65-74)、单纯性疱疹病毒的胸苷激酶(TK)启动子和T7聚合酶启动子(WO98/10088)。痘苗病毒启动子特别适于调整溶瘤痘病毒中的表达。典型示例包括但不限于痘苗病毒7.5K、H5R、11K7.5(Erbs et al.,2008,Cancer Gene Ther.15(1):18-28)、TK、p28、p11、pB2R、pA35R和K1L启动子以及合成启动子，例如那些在Chakrabarti等中描述的(1997,Biotechniques 23:1094-7；Hammond et al,1997,J.Virol Methods 66:135-8；and Kumar and Boyle,1990,Virology 179:151-8)以及早期/晚期嵌合启动子。适合溶瘤麻疹病毒的启动子包括但不限于指引麻疹转录单元表达的任何启动子(Brandlerand Tangy,2008,CIMID 31:271)。
特别是当被编码的免疫检查点调节因子包含抗体特别是mAb，优选为抗-PD1抗体时，重链或其片段的表达被置于自动子的控制之下，比轻链或其片段使用的启动子更强。具体地，用于表达较重组分的启动子与所述较轻组分表达相比提供至少10％、15％、20％、25％、30％的更多的产物。合适的用于表达的启动子可在生物体外(例如在适当的培养细胞系中)或在生物体内(例如在适当的动物模型或对象中)进行测试。适于表达所述免疫检查点调节因子的较重组分的启动子的示例包括CMV、RSV和痘苗病毒pH5R和p11K7.5启动子。适于表达所述免疫检查点调节因子的较轻组分的启动子的示例包括PGK、β肌动蛋白和痘苗病毒p7.5K和pA35R启动子。
本领域技术人员会领会控制核苷酸分子表达的调控因子插入病毒基因组，可进一步包含额外元件以正确启动、调节和/或终止转录(例如polyA转录终止序列)、mRNA运输(例如核定位信号序列)、加工(例如剪切信号)和稳定(例如内含子和非编码5'和3'序列)、翻译(例如起始子Met、三重先导序列(tripartite leader sequences)、内部核糖体进入位点(IRES)核糖体结合位点、信号肽等)。
适当的时候，有利地包括额外调控元件以促进至少一个插入本发明的溶瘤病毒的病毒基因组的基因的表达、运输和生物活性即治疗性基因和/或一或多种免疫检查点调节因子)。例如，信号肽可被包括以促进从感染细胞的分泌。信号肽典型地插入蛋白质的N-末端紧接在Met起始子之后。信号肽的选择广泛并且本领域技术人员容易获得。人们也可设想加入跨膜结构域以促进被编码的蛋白质在合适的被感染的细胞膜(例如原生质膜)的锚定。跨膜结构域典型地插入蛋白质的C-末端，仅在终止密码子之前或非常接近终止密码子。大量的各种跨膜结构域在本领域可获得(例子见WO99/03885)。
作为额外示例，肽标签(典型地是可以通过可获得的抗血清或化合物辨识的短肽序列)也可被加入以跟踪被编码的基因产物的表达、运输或纯化。用于本发明情况下的大量的各种标签肽包括但不限于PK标签、FLAG八肽(FLAG octa肽)、MYC标签、HIS标签(通常是4-10组氨酸残基的延伸)和e-标签(US 6,686,152)。标签肽可单独放置在蛋白质的N-末端或二者择其一地在C-末端或二者择其一地在内部或当运用几个标签时放在任何这些位置。标签肽能被使用抗-标签抗体的免疫检测实验检测到。
作为另一个示例，糖基化可被修饰以增加被编码的基因产物的生物活性(例如增加)。这样的修饰可以通过例如突变一或多个在糖基化的位点上的残基来完成。改变的糖基化模式可增加抗体的ADCC能力和/或他们对他们的靶的亲和力。
本发明情况下可操作的另一个方法是将本发明的溶瘤病毒编码的基因产物与外部因子相偶联，例如细胞毒素剂(cytotoxic agent)和/或标记剂(labelling agent)。本文中所使用的词汇“细胞毒剂(cytoxic agent)”表示直接对细胞有毒的化合物，阻止他们的复制和生长，例如毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素或其片段)。本文中所使用的“标记剂”表示可被检测到的化合物。标记剂自身可被检测到(例如放射性同位素标签或荧光标签)或酶标签的情况下，可能催化对基质化合物的化学修饰，此修饰是可检测到的。通过基因产物(治疗性基因和/或免疫检查点调节因子)和外部因子的基因融合完成偶联。
一个优选的实施方式，本发明的溶瘤病毒是痘苗病毒(优选来自哥本哈根株)在基因组中TK和RR活性均缺陷(例如由于病毒的J2R和I4L基因失活突变导致的)，基因组被插入编码抗-PD-1抗体的核苷酸分子。期望地，重链和轻链元件(例如为mAb表达的重链和轻链，或为Fab和scFv表达的其可变片段)分别置于pH5R和p7.5K痘苗病毒启动子的转录控制之下。优选地，编码抗-PD1-的核苷酸分子被插入病毒基因组的TK基因座。更优选地，所述痘苗病毒装备有自杀基因，特别优选本文描述的FCU1自杀基因。甚至更优选地，自杀基因(例如FCU1)被置于p11K7.5痘苗病毒启动子的转录控制之下。还更优选，置于痘苗病毒启动子的转录控制之下的FCU1被插入病毒基因组的TK基因座。
可选的并且优选的实施方式，本发明的溶瘤病毒是基因组中TK活性缺陷(由于病毒的J2R基因失活突变导致)的痘苗病毒(优选来自惠氏株(Wyeth strain))，所述基因组被插入编码抗-PD1抗体的核苷酸分子。更优选地，所述痘苗病毒装备有免疫刺激治疗性基因，特别有选为本文描述的人GM-CSF基因。甚至更优选地，治疗性基因(例如GM-CSF)被置于合成的早期-晚期启动子痘苗病毒启动子的转录控制之下，优选被插入TK基因座。
典型地，本发明的溶瘤病毒通过常规技术手段植入合适的宿主细胞中，常规手段包括在合适的条件下培养转染的或感染的宿主细胞以允许感染性病毒颗粒的生产和从培养的所述细胞中回收生产的感染性病毒颗粒，和任选地纯化所述回收的感染性病毒颗粒。合适的用于生产溶瘤病毒的宿主细胞包括但不限于人类细胞系，例如海拉细胞(HeLa)(ATCC)、293细胞(Graham et al.,1997,J.Gen.Virol.36:59-72)、HER96、PER-C6(Fallauxet al.,1998,Human Gene Ther.9:1909-17)、鸟类细胞、例如那些在WO2005/04272、WO2006/108846、WO2008/129058、WO2010/130756、WO2012/001075等中描述的)、仓鼠细胞系例如BHK-21(ATCC CCL-10)以及从受精蛋获取的鸡胚制备的原代鸡胚纤维母细胞((CEF)。根据本发明，溶瘤病毒在使用之前能至少部分分离。多种纯化步骤可被设想，包括纯化、酶处理(例如核酸酶、蛋白酶)、层析分离和过滤步骤。合适的方法在本领域中已被描述(例如WO2007/147528；WO2008/138533；WO2009/100521；WO2010/130753；WO2013/022764)。
免疫检查点调节因子的制备
在一个实施方式中，在本发明的情况下，也可使用溶瘤病毒通过重组手段制备被其编码的一或多种免疫检查点调节因子。有利地，包含一或多个使编码免疫检查点调节因子的核苷酸分子在宿主细胞中维护、增殖或表达额外元件。这些额外元件包含为促进生产宿主细胞的鉴别和分离的标记基因(例如通过与细胞营养缺陷型或互补或通过抗生素抗性)。合适的标记基因包括但不限于二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase)(dhfr)，其赋予氨甲叶酸(methotrexate)抗性(Wigler et al.,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:3567；O'Hare et al.,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1527)；gpt赋予霉酚酸(mycophenolic acid)抗性(Mulligan and Berg,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2072)；neo赋予氨基糖苷G-418抗性(aminoglycoside G-418)(Colberre-Garapin et al.,1981,J.Mol.Biol.150:1)；zeo赋予博来霉素(zeomycin)抗性；kana赋予卡那霉素(kanamycin)抗性；hygro赋予潮霉素(hygromycin)抗性(Santerre et al.,1984,Gene 30:147)。缺少功能性TK的重组病毒(例如将编码免疫检查点调节因子的核苷酸分子插入TK基因座导致的)可通过包含溴脱氧尿苷(BrdU)的介质进行选择。的确，TK-病毒对BrdU药物敏感，然而该药物干扰DNA在TK+病毒中的合成。人们也可依赖发光报告基因或比色系统，例如基于绿色荧光蛋白(GFP)、荧光酶素和β-半乳糖苷酶。
重组生产免疫检查点调节因子的方法在本领域中常见。典型地，这些方法包含(a)将本文描述的溶瘤病毒引入合适的生产细胞中制备转染或感染的生产细胞，(b)在适于其生长的条件下体外培养所述转染或感染的生产细胞，(c)从细胞培养物中回收免疫检查点调节因子，以及(d)任选地，纯化回收的免疫检查点调节因子。在本发明的情况下，生产细胞优选为人或非人真核细胞。优选的生产细胞包括但不限于BHK-21(仓鼠婴儿肾脏)、CV-1(非洲猴肾脏细胞系)、COS(例如COS-7)细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小鼠NIH/3T3细胞、小鼠NSO骨髓瘤细胞、海拉细胞(HeLa cells)、韦罗细胞(Vero cells)、HEK293细胞和PERC.6细胞以及相应的鸟类细胞(例如本文所描述的鸡、鸭细胞)。
所述生产细胞能够在发酵生物反应器、烧瓶和培养皿内培养。培养可以在适合给定宿主细胞的温度、pH以及氧含量条件下进行。在此不再尝试赘述已知的在原核和真核细胞中生产蛋白质的多种方法。免疫检查点调节因子的生产可是细胞内的或优选分泌到生产细胞外的(例如在培养基中)。
免疫检查点调节因子之后能通过周知的纯化方法被纯化。使用的纯化特定蛋白质的条件和技术手段依赖于因素，例如表达条件、净电荷、分子量、疏水性、亲水性和那些对本领域技术人员显见得因素。此外，纯化水平依赖于预期用途。如果必须，特别是当免疫检查点调节因子不分泌到生产细胞外时或没有完全分泌时，其可以通过常规的细胞裂解回收，包括冻融、声波裂解法、机械裂解、使用裂解剂等依此类推。如果分泌，则可从培养基中直接回收。合适的纯化技术手段包括但不限于硫酸铵沉淀、酸萃取、凝胶电泳、过滤和层析方法(例如反向层析、体积排阻、离子交换、亲和、磷酸纤维素、疏水反应或羟基磷灰石等层析法)。期望地，为本发明的溶瘤病毒重组生产的免疫检查点调节因子至少部分纯化，就实质上不含其他具有不同抗原特异性的抗体和/或其他细胞物质而言。进一步地，可根据本领域使用的常规条件合成免疫检查点调节因子(例如WO2009/073569)。
治疗用途
本发明还提供组合物包含有效治疗剂量的本发明的溶瘤病毒，任选地和药学可接受的载体。此组合物可一次或多次通过相同或不同的路径被施用。
“有效治疗剂量”相当于本发明的组合物或组合物中包含的每个活性剂的剂量(溶瘤病毒和其一或多种免疫检查点调节因子)，其足够产生一或多个有益效果。此有效治疗剂量可随着各种变量的功能特别是施用方式、疾病状态、对象的年龄体重、对象对治疗的应答能力、并行治疗的种类、治疗频率和/或治疗或预防的需要的变化而变化。当涉及预防疾病的用途，本发明的溶瘤病毒或组合物以足够能够预防或拖延病理情况(例如增生性疾病例如癌症)的发生和/或确立和/或复发的剂量在特别是在有得病风险的对象体内施用。为“治疗”用途，本发明的溶瘤病毒或组合物在被确诊患有病理装态(例如增生性疾病例如癌症)的对象中施用，目的是为了治疗疾病，最终与一或多种传统治疗方式联用。尤其有效治疗剂量可能是与不进行治疗的基状态或预期状态相比造成可见的临床状态改善的必须剂量，例如肿瘤数目的降低、肿瘤大小的降低、转移的数目或范围的降低、缓解期的延长、疾病状态的稳定(即没有恶化)、疾病的发展或严重程度的延缓或减慢、疾病状态的改善或缓和、生存期延长、对常规治疗的更好应答、生活质量的提高、死亡率降低等。有效治疗剂量还可能是造成有效非特异性(先天的)和/或特异性抗肿瘤应答的发展的必须剂量。典型地，在特定T细胞应答中的免疫应答的发展可在体外、在合适的动物模型内或使用从对象中收集的生物样品进行评估。例如，在实验室中通常使用的技术手段(例如流式细胞术、组织学)可能被用来监控肿瘤。人们可能还会使用多种既有的抗体以辨认不同的涉及抗肿瘤应答的存在于受治对象中的免疫细胞群，例如细胞毒性T细胞、活化的细胞毒性T细胞、自然杀伤细胞和活化的自然杀伤细胞。临床状态的改善能容易地通过任何医生或其他医疗保健技术人员使用的相关临床测量手段进行评估。
词汇“药学可接受的媒介”意图包含任何和所有运输媒介、溶剂、稀释剂、赋型剂、佐剂、分散介质、包被、抗菌剂和抗真菌剂、吸收剂等在哺乳动物和特别是人类对象中与施用兼容的此类物质。
溶瘤病毒或其组合物可被放置于适合人类或动物使用的溶剂或稀释剂中。所述溶剂或稀释剂优选为等渗的、低渗的或弱低渗的并且具有相对低的离子强度。典型示例包括无菌水、生理盐水(例如氯化钠)、林格液(Ringer’s solution)、葡萄糖、海藻糖或蔗糖溶液、Hank’s液和其他水性生理平衡盐溶液(例如Remington最新一期:The Science andPractice of Pharmacy,A.Gennaro,Lippincott,Williams&Wilkins)。
在一个实施方式中，溶瘤病毒组合物为人类使用做适当缓冲。合适的缓冲剂包括但不限于磷酸盐缓冲液(例如PBS)、碳酸氢盐缓冲液和/或能够保持生理上或微偏碱性的pH(例如从大约pH7到大约pH9)的Tris缓冲液。
溶瘤病毒组合物可能还包含其他药学可接受的赋型剂以提供合意的药物或药效的性能、包含例如同渗容摩、黏度、透明度、颜色、灭菌度、稳定性、配方溶解速率、改变或保持在人或动物对象中的释放或吸收、促进穿越血液屏障的运输或促进在特定器官的渗透力。
每种溶瘤病毒和免疫检查点调节因子组合物还可包含一个或多个能够刺激免疫的佐剂(尤其是T细胞介导的免疫)或促进在施用后感染肿瘤细胞，例如通过toll样受体(toll-like receptors)(TLR)例如TLR-7、TLR-8和TLR-9，包括但不限于明矾、矿物油乳胶例如弗氏完全佐剂和不完全佐剂(Freunds complete and incomplete)(IFA)、脂多糖(lipopolysaccharide)或其衍生物(Ribi et al.,1986,Immunology andImmunopharmacology of Bacterial Endotoxins,Plenum Publ.Corp.,NY,p407-419)、皂苷(saponins)例如QS21(Sumino et al.,1998,J.Virol.72:4931；WO98/56415)、咪唑-喹啉化合物(imidazo-quinoline compounds)例如咪喹莫特(Imiquimod)(Suader,2000,J.AmAcad Dermatol.43:S6)、S-27609(Smorlesi,2005,Gene Ther.12:1324)和相关化合物例如在WO2007/147529中描述的,CpG寡聚脱氧核苷酸(cytosine phosphate guanosineoligodeoxynucleotides)例如CpG(Chu et al.,1997,J.Exp.Med.186:1623；Tritel etal.,2003,J.Immunol.171:2358)以及阳离子多肽(cationic peptides)例如IC-31(Kritsch et al.,2005,J.Chromatogr Anal.Technol.Biomed.Life Sci.822:263-70)。
在一个实施方式中，本发明的溶瘤病毒组合物可能为提高其稳定性特别是在生产条件下和长期(即至少6个月，优选至少2年)冰冻(例如-70℃、-20℃)储存、冷藏储存(例如4℃)、室温环境储存的稳定性而制备。多种本领域既有的病毒制剂或为冰冻的液体形式或为冻干的形式(例如WO98/02522、WO01/66137、WO03/053463、WO2007/056847和WO2008/114021等)。固体(例如干粉或冻干)组合物能通过涉及真空干燥和冻干的步骤获得。为说明目的，加入NaCl和糖的缓冲制剂特别适于保存病毒(例如Tris 10mM pH 8加入蔗糖5％(W/V)、谷氨酸钠10mM和NaCl 50mM，或磷酸盐缓冲的盐溶液加入甘油(10％)和NaCl)。
在特定实施例中，溶瘤病毒组合物可为保证在生物体内正常分布或延时释放而制备。例如它可在脂质体中被制备。可使用生物可降解的、生物相容性的高分子，例如乙稀醋酸乙烯酯(ethylene vinyl acetate,polyanhydrides)，聚乙醇酸(polyglycolic acid)、胶原蛋白(collagen)、聚正酯(polyorthoesters)和聚乳酸(polylactic acid)。很多制备此制剂的方法被描述，例如J.R.Robinson在“Sustained and Controlled Release DrugDelivery Systems”,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978中。
溶瘤病毒的合适剂量可根据多种参数进行改变并且从业者可根据相关情况日常确定。溶瘤病毒的合适剂量约为105到约1013vp(病毒粒子)、iu(传染单位)或pfu(空斑形成单位)取决于使用的病毒和定量技术。作为通用指导，痘苗病毒的合适剂量从约105到约1013pfu，优选从约106pfu到约1011pfu，更优选从约107pfu到约5x109pfu；剂量为约108pfu到约109pfu特别有选，特别适于人类使用。病毒在样品中存在的数量能通过常规滴定手段确定，例如使用受纳细胞并感染受纳细胞之后数空斑的数量(例如BHK-21或CEF)、免疫染色(例如使用抗病毒抗体；Caroll et al.,1997,Virology 238:198-211)、测量A260吸光度(vp效价)或定量荧光免疫检测法(iu效价)。
在一个优选实施方式中，溶瘤病毒组合物的施用允许在从对象中获取的人体样品中投放至少50ng/ml。在一个实施方式中，免疫检查点的所述水平是在单次施用约107pfu到约5x109pfu的本文描述的溶瘤病毒后获取的，可通过后续施用进一步增加。在另一个实施方式中，人体样品是血液、血清、细胞质、肿瘤组织切片、肿瘤匀浆、肿瘤液等，在所述施用发生后的至少一小时到一个月后收集。更优选地，被编码的免疫检查点调节因子的就地生产达到至少100ng(例如至少200ng/ml、至少400ng/ml、至少500ng/ml、至少700ng/ml、至少800ng/ml、至少900ng/ml、至少1000ng/ml、至少1200ng/ml、至少1500ng/ml、至少1800ng/ml、至少2000ng/m、至少至少2500ng/ml和至少至少3000ng/ml)从对象中在所述溶瘤病毒的施用之后的2-8天内收集的每毫升的所述生物样品(例如3-7天或更优选为5天)。免疫检查点抑制剂就地分泌的水平可按实施例中描述的方式评估。
施用
本发明的溶瘤病毒或组合物可向对象中单一剂量或多剂量施用。如果多剂量施用，可通过相同的或不同的路径进行施用，并且可在同一部位或不同部位施用。也可连续循环施用，在休息期之后重复。每次施用之间的间隔可从几小时到一年(例如24h、48h、72h、每周、每两周、每月或每年)。间隔也可是不定期的(例如在肿瘤发展之后)。每次施用剂量可在上述范围内变化。
任何常规的施用路径都可在本发明的情况下使用，包括非肠道的、局部的或粘膜路径。非肠道途径为注射或输液施用，包含全身以及局部路径。通常非肠道注射类型是静脉内的(进入静脉)、动脉内的(进入动脉)、皮肤内的(进入真皮层)、皮下的(表皮以下)、肌肉的(进入肌肉)以及瘤内的(进入肿瘤或极为贴近肿瘤的部位)。典型的输液是通过静脉途径。粘膜施用包含但不限于口/食道、鼻内、气管、肺内、阴道内、或直肠内的途径。局部施用也可通过透皮肤的手段完成(例如贴片等依此类推)。可使用常规的注射器和针头来施用(例如Quadrafuse注射针)或任何现有技术中已有的能够促进或提高在对象内提送活性剂的化合物或装置。优选的施用溶瘤病毒的路径包括静脉内的和瘤内的路径。
在本发明的情况下，可一次或多次施用溶瘤病毒(例如2、3、4、5、6、7或8次等)，剂量在107到5x109pfu的范围之内。每次病毒施用的间隔可从约1天到约8周范围内变化，有利为约2天到约6周，优选为约3天到约4周，更优选为从约1周到约3周(例如每两周)。另一优选治疗方案涉及108或109pfu的溶瘤痘苗病毒的2到5次(例如3)静脉或瘤内施用，大约有1或2周间隔。
本发明还涉及治疗增生性疾病例如癌症的方法，包含向有此需要的对象中施用本文描述的溶瘤病毒。
本发明还涉及抑制肿瘤细胞在生物体内生长的方法，其包含向需要其的对象施用本文描述的溶瘤病毒。
本发明还涉及增强对肿瘤细胞免疫应答的方法，其包含向需要其的对象施用本文描述的溶瘤病毒。
在一个实施方式中，施用本发明使用的溶瘤病毒引出、刺激和/或重定向免疫应答。尤其该施用在被治疗的宿主中诱导防护性的T或B细胞应答，例如针对所述溶瘤病毒或最终针对任何插入病毒基因组的治疗性基因编码的产物。防护性T应答可是CD4+或CD8+或CD4+和CD8+细胞介导的。B细胞应答可通过ELISA测试，T细胞应答可通过常规ELISpot、ICS实验测试对任何从免疫动物或对象中收集的样品进行评估(例如血液、器官、肿瘤等)。
在一个实施方式中，溶瘤病毒的施用允许改变肿瘤微环境，目的为增强肿瘤中效应细胞的活性，特别是T淋巴细胞效应细胞，和/或促进至少部分Treg损耗。肿瘤浸润细胞能通过常规免疫染色实验轻易地辨认。
本发明的方法的一个实施方式提供与使用相同的溶瘤病毒或免疫检查点调节因子或单独或结合施用所获得的治疗效率相比更高的治疗效率。在本发明的情况下，本发明的方法提供与病毒或免疫检查点调节因子单独或结合施用相比至少5％、10％、15％、20％或25％的更高治疗效率。上文中的词汇“治疗有效剂量”特别有选更长存活期中所描述的可证明更高的治疗效率。
可使用本发明的溶瘤病毒、组合物和方法治疗得增生性疾病的示例包括骨癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、结肠直肠癌、食道癌、口咽癌、肺癌、头颈癌、皮肤癌、黑色素瘤、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、直肠癌、肛门癌、前列腺癌、淋巴瘤、内分泌系统的癌症、甲状腺癌、软组织瘤、慢性或急性白血病、膀胱癌、肾癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、神经胶质瘤等。本发明还用于治疗转移性癌症，特别是表达PD-L1的转移性癌症(Iwai et al.,2005,Int.Immunol.17:133-44)。优选的可通过本发明的组合疗法治疗的癌症包括对免疫疗法典型地应答的癌症。非限定性的优选治疗的癌症示例包含黑色素瘤(例如转移性的恶性黑色素瘤)、肾癌(例如明细胞癌(clear cell carcinoma))、前列腺癌(例如激素难以治疗的前列腺腺癌)、乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌(例如非小细胞肺癌)和肝癌(例如肝癌)。
根据有利实施例，特别当溶瘤病毒装备有自杀基因时，本发明的溶瘤病毒疗法或方法可包含额外步骤，其中向对象施用药学可接受量的前体药物,优选为胞嘧啶的类似物，特别是5-FC。以实例说明，可使用50-500mg/kg/天的剂量，优选为200mg/kg/天或100mg/kg/天。在本发明的情况下，前体药物按照与通常操作一样的方式施用(例如口服、系统性地等)。优选地，该施用发生在施用溶瘤病毒之后，在施用病毒之后优选至少3天,更优选至少4天并且更更优选至少7天。优选口服路径。可施用单剂量的前体药物或在一段时间内反复施用足够使得有毒代谢物在宿主组织或细胞中生产的剂量。
本发明的溶瘤病毒、组合物或方法与一或多种有效抗癌治疗的物质和疗法相关。本发明也涉及包含向对象中递送额外癌症疗法的方法。在本发明的情况下，所述额外癌症疗法包含手术、放疗、化疗、免疫疗法、激素疗法或其结合。在一个优选实施方式中，其包含施用一或多中在抗癌疗法中有效的物质。在有效抗癌治疗的药物物质中，其可与本发明的溶瘤病毒、组合物或方法联合或组合使用，可更具体描述如下：
√烷化剂，例如丝裂霉素C(mitomycin C)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、白消安(busulfan)、异环磷酰胺(ifosfamide)、异环磷酰胺(isosfamide)、美法仑(melphalan)、六甲聚氰胺(hexamethylmelamine)、噻替哌(thiotepa)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)或氮烯唑胺(dacarbazine)；
√抗代谢物，例如吉西他滨(gemcitabine)、卡培他滨(capecitabine)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、阿糖胞苷(cytarabine)、2-氟脱氧胞嘧啶(2-fluorodeoxycytidine)、氨甲叶酸(methotrexate)、伊达曲沙(idatrexate)、拓优得(tomudex)或曲美沙特(trimetrexate)；
√拓扑异构酶Il抑制剂，例如阿霉素(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)或米托蒽醌(mitoxantrone)；
√拓扑异构酶I抑制剂，例如伊立替康(irinotecan(CPT-11)),7-乙基-10-羟基-喜树碱(7-ethyl-10-hydroxy-camptothecin(SN-38))或拓扑替康(topotecan)；
√抗有丝分裂药，例如紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel)、长春花碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)或长春瑞滨(vinorelbine)；
√铂派生物(platinum derivatives)例如铂化合物(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、顺螺铂(spiroplatinum)或卡铂(carboplatinum)；
√酪氨酸激酶活性的受体抑制剂，例如舒尼替尼(sunitinib)(Pfizer)和索拉非尼(sorafenib)(Bayer)；
√在特殊抗体中影响细胞表面受体调节的抗肿瘤抗体(anti-neoplasticantibodies)例如、曲妥单抗(trastuzumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗(panitumumab)、扎鲁木单抗(zalutumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、马妥珠单抗(matuzumab)、贝伐单抗(bevacizumab)和兰尼单抗(ranibizumab)；
√表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂，例如吉非替尼(gefitinib)、埃罗替尼(erlotinib)和拉帕替尼(lapatinib)；以及
√免疫调节剂，例如α或β或γ干扰素、白介素(特别是IL-2、IL-6、IL-10或IL-12)或肿瘤坏死因子；
本发明的溶瘤病毒、组合物或方法还能与放疗联用。
本发明还提供包含在不同的容器内放入被施用的每病毒剂量的试剂盒。任选地，试剂盒能包含施用活性剂的装置。试剂盒还能包含说明书，其包括涉及试剂盒中组成成分或各部分成分以及剂型的信息。
附图简要说明
图1说明从被感染的CED生产纯化后的抗-PD-1mAb、Fab、scFv的量。
图2说明在还原(R)和非还原(NR)条件下，通过电泳分析纯化后的重组mAb(Vacc.mAb)和scFv(Vacc.scFv)以及商业J43(BioXCell)。
图3：在生物体外，病毒在MOI为0.0001、0.001和0.01被所示病毒感染的LoVo中在感染后的第五天的复制效率。3个单独测定的平均值加减标准差(±SD)表示该值。
图4说明本文描述的溶瘤痘苗病毒表达的抗-PD1抗体的重链和轻链的氨基酸序列。
图5说明免疫印迹法分析分泌到细胞培养液上层的重组mAb和Fab，其从感染了WRTG18618、WRTG18619、WRTG18620和WRTG18621的CEF中获取。商业J43作为参考使用；M表示MW标记和C阴性对照。
图6说明血清中生产的重组J43的浓度(图6A)和在单次瘤内(通过皮下植入B16F10肿瘤)注射施用WRTG18618(107pfu)的小鼠的肿瘤匀浆中的重组J43的浓度(图6B)或皮下(无肿瘤小鼠)或瘤内施用1μg或10μg商业J43(Bioxcell)。重组J43的浓度通过定量ELISA在注射后的1、5、11天测量。
实施例
这些实施例说明为表达多种形式的抗-免疫检查点抑制剂而制备的溶瘤痘苗病毒。表达来自病毒载体的免疫检查点阻断剂的有益效果的临床前证据在小鼠肿瘤模型中进行演示。这意味着使用i)鼠特异性抗-免疫检查点抗体，以及ii)能够高效感染鼠细胞的溶瘤痘病毒。
鼠特异性仓鼠抗体J43被选中针对免疫检查点阻断剂鼠PD-1(mPD-1)。这个抗体被显示阻断mPD1和PD-L1间的相互作用(US patent7,858,746)。抗体J43和它的同种型对照(仓鼠IgG)从BioXCell可得。抗mPD-1抗体和它的同种型对照被用于建立功能的实验和生物体外的定量ELISA。进一步地，J43和其多种型式在溶瘤病毒中克隆，并且在生物体内肿瘤动物模型中进行测试。
为这些研究选择的溶瘤病毒是痘苗病毒(VV)西储系(Western Reserve(WR)strain)陷胸苷激酶缺陷型(thymidine kinase(TK-))(J2R基因座)和RR-(I4L基因座)致使病毒在健康(不分裂)细胞中不复制。相反，VV TK-RR-应当有选择地有效地在肿瘤细胞中复制。
在溶瘤TK-RR-痘苗病毒中将抗mPD-1分子抗体化
J43的重链显示出与抗CD79b免疫球蛋白的重链的高同源性。因此，为克隆重链而保留的序列是J43的可变链和抗CD79b的恒定链。J43连同来自抗J43轻链的信号序列被克隆。重链和轻链被置于病毒启动子pH5R或p7.5K的控制之下，两者强度稍有不同。关于“整个”抗体的构建，衍生物分别通过His-标记抗原连接片段(Fab)构建和His-标签单链抗体(scFv)构建生成。两种构建形式也为依赖于轻链或重链部分的Fab置于每个启动子之下而生成。全部5个构建插入缺失TK、RR的WR VV的主干。构建总结如下：
WRTG18618(或mAb1)对应于pH5R-HC–p7.5K-LC
WRTG18619(或mAb2)对应于pH5R-LC–p7.5K-HC
WRTG18621(or Fab1)对应于pH5R-(VH-CH1-6His)–p7.5K-LC
WRTG18620(or Fab2)对应于pH5R-LC–p7.5K-(VH-CH1-6His)
WRTG18616(scFv)对应于pH5R-VH-gs-VL-6His)。
HC和LC为重链和轻链的缩写。VH和VL是总可变结构域和轻可变结构域的缩写。HIS标签的6His表示6组氨酸。gs表示多甘氨酸-丝氨酸连接器(poly Glycine-Serinelinker)。
Constructs 1表示重组mAb或Fab的最高表达水平与预期的链装配简介。
储存WRTG18616(scFv)、WRTG18618(mAb1)和WRTG18621(Fab1)的病毒在BHK-21细胞中生产并且通过正切流动过滤(TFF)进行纯化。
构建WRTG18618(pH5R-HC–p7.5K-LC):mAb1
包含HC的片段后有p7.5K启动子通过合成方法(Geneart:Regensburg,Germany)生产并且被PstI和EcoRI限制克隆入痘苗病毒转移质粒pTG18496获得pTG18614。包含LC的片段通过合成方法生产并且被NsiI和SalI限制克隆入pTG18614获得pTG18618。
痘苗病毒转移质粒pTG18496用于通过与VV基因组上的TK基因同源重组被转移允许插入核苷酸序列。它包含围绕着J2R基因的侧翼序列(BRGTK和BRDTK)以及pH5R启动子其后具有多克隆位点。
抗-PD-1HC核LC的氨基酸序列在图4和SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中分别展示。
WRTG18618的生成通过在感染了RR-敲除的WR的原代鸡胚成纤维细胞(CEF)中的同源重组实现，并且通过pTG18618核转染(根据Amaxa Nucleofector技术)进行转染。在胸苷激酶-缺陷(TK-)143B细胞在溴脱氧尿苷存在的条件下培养生长后，病毒选择通过噬斑纯化完成。这种选择只允许TK-rWR存活。PCT验证不存在亲代WR的污染物。
构建WRTG18619(pH5R-LC–p7.5K-HC):mAb2
包含LC的片段后有p7.5K启动子通过合成方式生产并且被PstI和EcoRI限制克隆入痘苗病毒转移质粒pTG18496获得pTG18615。包含HC的片段通过合成方法生产并且被NsiI和MluI限制克隆入pTG18615获得pTG18619。
WRTG18619病毒的生产通过上述在CEF中的同源重组完成。
构建WRTG18621(pH5R-(VH-CH1-6His)–p7.5K-LC):Fab1
包含VH-CH1-6His的片段后有p7.5K启动子通过合成方式生产并且被PstI和EcoRI限制克隆入痘苗病毒转移质粒pTG18496获得pTG18617。包含LC的片段通过合成方法生产并且被NsiI和SalI限制克隆入pTG18617获得pTG18621。
WRTG18621病毒的生产通过上述在CEF中的同源重组完成。
构建WRTG18620(pH5R-LC–p7.5K-(VH-CH1-6His):Fab2
包含LC的片段后有p7.5K启动子通过合成方式生产并且被PstI和EcoRI限制克隆入痘苗病毒转移质粒pTG18496获得pTG18615。包含VH-CH1-6His的片段通过合成方法生产并且被NsiI和MluI限制克隆入pTG18615获得pTG18620。
WRTG18620病毒的生产通过上述在CEF中的同源重组完成。
构建WRTG18616(pH5R-VH-gs-VL-6His):scFv
包含VH-gs-VL-6His的片段通过合成方式生产并且被PstI和EcoRI限制克隆入痘苗病毒转移质粒pTG18496获得pTG18616。
WRTG18616病毒的生产通过上述在CEF中的同源重组完成。
所编码的抗-PD-1抗体的体外表征
测试上述的重组溶瘤载体以评估被编码的抗-mPD-1分子的生产。对此，感染允许的原代细胞或细胞系并收取上清液。抗-mPD-1分子的存在可被SDS-PAGE、蛋白质印迹分析(Western blot analysis)、质谱分析(mass spectrometry analysis)、ELISA和功能性实验(functional assays)检测到。市售的抗-mPD-1抗体作为对照。
通过Western Blot在非还原条件下使用多克隆抗-仓鼠免疫球蛋白抗体检测分析来自被感染的CEF(moi 0.2)的上清液(在感染48和72h后)。WRTG18618(mAb1)和WRTG18621(Fab1)可通过ELISA检测。观察到WRTG18618感染的细胞分泌的产物的表达谱与WRTG18621感染的细胞分泌的产物的表达谱具有相似图样。在培养物上清中通过Western Blot检测到预期尺寸的ScFv表达。
mAb纯化和生物体外评估抗PD-1抗体
在F175烧瓶中培养CEF并使其感染2.7x108pfu的抗-PD-1-表达病毒。48-72h后，收集培养物上清并用0.2μm滤器过滤。mAb1通过Hitrap蛋白A(GE Healthcare)纯化，后通过Superdex 200凝胶过滤(GE Healthcare)，其中Fab1和scFv HIS-Trap(GE Healthcare)通过纯化，后Superdex 75凝胶过滤(GE Healthcare)。scFv从凝胶过滤上的两个峰值洗脱，第一个对应二聚物，第二个对应单体。如图1所示，生产了大量的mAbs、Fab和scFv。根据抗体的形式，产量在0.5和2μg/ml上清之间。
重组纯化的mAb与市售mAbs有相似的电泳谱，在非还原条件下具有正确的2个轻链和2个重链的集合，在还原条件下单个轻链和重链的检测如图2所示。而且，纯化的scFv在SDS-PAGE的转移在预期尺寸(见图2)。
重组产物可通过ELISA被检测并且在竞争ELISA(competition ELISA)中是功能性的(即阻断在0.2μg/mL的小鼠PD-L1二抗(biot)连接到在1μg/mL的小鼠PD-1包膜)，在这个竞争实验中mAb比Fab更高效。此外，重组mAb1比它的市售J43相对物更高效以及VV-生产的scFv二聚碎片比其单体更高效，二者间的差异为约一个对数的EC50。
VV-编码的mAb1、Fab1和scFv的与PD-1细胞表面相互作用的能力在基于流式细胞术的结合实验中使用PD-1-阳性T淋巴瘤细胞系EL4和RMA研究。在冰上温育105EL4或RMA细胞45min加入100μl的mAb1(5μg/ml)、市售抗-mPD-1抗体J43(5μg/ml,BioXCell)或阴性对照仓鼠免疫球蛋白(5μg/ml,BioXCell)并洗涤。通过在冰上温育细胞45min加入100μl的10μg/ml FITC-缀合单克隆小鼠抗-亚美尼亚+叙利亚抗体混合物(FITC-conjugatedmonocolonal mouse anti-Armenia+Syrian antibody cocktail)(BD Pharmingen)可检测与PD-1的结合。洗涤之后，在NaviosTM流式细胞分析仪(Beckman Coulter)中测量荧光强度。使用Kaluza 1.2软件(Beckman Coulter)分析数据。WRTG18618-编码的mAb1高效地结合到EL4和RMA细胞上。
为测量Fab1和scFv的结合，5x 105EL4或RMA细胞间接沾染5μg/ml Fab1或2.5μg/ml单体scFv(均His-标签标记)后有PE-缀合的单克隆小鼠抗-His标签抗体(稀释成1/10，Miltenyi Biotec)并且如上所述进行分析。显示从WRTG18621和WRTG18616生产的Fab1和单体scFv高效地结合到EL4和RMA细胞的表面。一同温育EL4细胞和Fab1或单体cFv和全长J43或阴性对照仓鼠免疫球蛋白(BioXCell)，后用PE-缀合抗-His标签抗体(PE-conjugatedanti-His tag antibody)染色可演示特异性结合。全长J43存在时EL4染色被还原，但阴性对照仓鼠免疫球蛋白不被还原。总之，结果显示在两个鼠科T淋巴细胞细胞系中，VV-编码的mAb1、Fab1和scFv能辨认内源表达的PD-1。
进行基于流式细胞术的竞争实验以对比阻断抗-mPD-1分子的活性。实验基于高度PD-1阳性的鼠科T淋巴瘤细胞系。mPD-L1-hFc(鼠科PD-L1(鼠科PD-配体1)包含人免疫球蛋白Fc片段)结合到PD1细胞表面能被使用PE-标记的抗-hFc单克隆抗体的流式细胞数检测到。抗-PD-1抗体能竞争mPD-L1-hFc的结合导致细胞连接的PE信号的减少。
通过市售J43抗-PD-1抗体(BioXCell)评估和比较PD-L1上的重组mAb1、Fab1和scFv结合到EL4细胞的抑制活性。更具体地说，105EL4细胞与2μg/ml的mPD-L1hFc(R&DSystems)共同温育，在冰上增加在100μl中多种抗-PD-1抗体的浓度。洗涤后，在冰上细胞与100μl的5μg/ml PE-缀合小鼠抗人免疫球蛋白Fc(BioLegend)温育45分钟。洗涤细胞并且通过上述方法测量平均荧光强度。在这些条件下，对照抗mPD-1克隆J43显示出IC50为1.6μg/ml。
不出所料地，对照仓鼠免疫球蛋白不显示任何PD-L1结合到EL4细胞的阻断活性。分别由WRTG18618、WRTG18621和WRTG18616生产的重组mAb1、Fab1、单体的和二聚的scFv能阻断配体结合到细胞表面受体，像来自BioXCell的J43一样。重要的是，在这个实验中，WRTG18618-编码的mAb1显示出与Fab1和scFv的版本以及来自BioXCell的J43相比增强的阻断活性。
设定定量ELISA实验，在小鼠血清中量化抗体浓度或通过重组WR感染的细胞使用包被兔来源的抗仓鼠抗体来捕捉J43，其反过来可以被山羊来源的抗仓鼠抗体检测到。此实验对小鼠血清灵敏，必须在50％小鼠血清存在的条件下生成标准曲线。
生物体外细胞毒性实验(溶瘤活性)
人LoVo结肠直肠癌细胞系通过0.001和0.0001MOI的TK-RR敲除的无转基因的WR痘苗病毒(WRTG18011)，以及表达不同抗mPD-1分子(WRTG18616、WRTG18618和WRTG8621)的TK-RR敲除的WR痘苗病毒悬浮转换。总共3x105细胞/孔放置在6孔培养皿中，加入2ml的介质外加10％的FCS。之后，再37℃下培养细胞，细胞的存活率在5天之后通过台盼蓝拒染实验确定。如图3所示，不同病毒在0.0001和0.001MOI的溶瘤活性分别导致75-95％和99％的活细胞减少。TK-RR敲除的无转基因的WR病毒以及表达不同抗mPD-1分子的TK-RR敲除的WR病毒显示细胞毒性无差别。因此不同抗mPD-1分子的表达不影响痘苗病毒的溶瘤活性。
抗体表达优化设计
重组溶瘤载体通过免疫印迹法检测以评估表达水平和分泌的抗体的装配。将CEF感染上述mAb和Fab构建体，24h后取细胞培养上清液进行免疫印迹分析。上清液在16000g离心5min，在无还原剂的Laemmli缓冲液中制备25μl，将其装入PrecastGel 4-15％的聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)(Biorad)。市售的单克隆J43(BioXcell)被用作参照分子。将1μg的每种分子装入胶中。在非还原条件下进行凝胶电泳以保持轻链和重链的装配并且允许优化检测(即使用多克隆抗体检测没有被辨识的还原免疫球蛋白和Fab链)。通过Trans-blot Turbo系统(Transblot Turbo Transfer pack Biorad)利用预编的操作(高MW:10min；2.5A常数；高至25V)将蛋白质转移到PVDF膜上。用封闭液(8mM NaPO4、2mM KPO4、154mM NaCl pH 7.2(PBS)加入0.05％Tween20和5％Biorad脱脂奶粉)在4℃过夜浸泡膜。将80ng/mL辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase)(HRP)缀合的山羊抗亚美尼亚仓鼠免疫球蛋白(conjugated goat anti Armenian Hamster IgG)(Jackson Immunoresearch)放入稀释缓冲液中(PBS,0.05％Tween20和0.5％脱脂奶粉)，并使用其进行免疫检测。Development was performed使用Amersham ECL Prime Western Blotting测试试剂完成开发，并且使用Molecular Imager ChemiDOCTM XRS捕捉化学发光。
如图5所示，WRTG18618和WRTG18619分泌大致相同量的抗体产物，其具有与市售J43mAb表观尺寸一致的连在一起的两个重链和两个轻链。但是，WRTG18619还生产了不期而至的产品，在43和55kDa标记之间游移(见第四栏箭头指出的额外条带“18619”)。同样地，额外条带也出现在WRTG18620感染的培养物上清液中(在第5栏“18620”相同位置和相同强度)然而WRTG18621生产大量的正确组装的Fab，无任何可检测到的非正确组装的产物(见在第六栏中箭头指向的“18621”)。
在感染哺乳动物细胞系HK21和A549后，分析细胞培养液上清液产生同样的图谱(没显示数据)。
当观察构建体的设计时，看上去在WRTG18619和WRTG18620构建体中，抗体的轻链被置于pH5R启动子(强启动子)的转录控制之下。一个假说是在这个构型中，抗体的轻链可相对于重链被过表达，因此能以同源二聚体的形式装配。所以，这个在43和55kDa标记之间游移的额外条带或许是过度生产的轻链被装配成理论质量为47kDa的同源二聚体。
因此，相较表达轻链的启动子，控制表达重链的启动子优选更强的启动子，以降低产生异常装配的风险(例如轻链的同源二聚体)。
这些所有的结果验证了confirmed the ability of the本文所述的重组溶瘤病毒以可以检测到的水平分泌mAb和Fab的能力。选择WRTG18618和WRTG18621进行剩余的实验，由于他们比WRTG18619和WRTG18620具有能生产更接近于预期的抗体产物的能力。
生物体内表达载体化的抗-PD1抗体
在生物体内有或没有皮下植入B16F10肿瘤的小鼠内评估载体化的抗-PD1J43mAb的表达。瘤内或皮下注射WRTG18618(mAb1构建体)，并且与市售J43(瘤内注射)对比。
生物体内实验和样品采集
更具体地说，向六周大的雌性C57BL/6小鼠的右侧胸部皮下(S.C.)注射3x105B16F10细胞(鼠科黑色素瘤)。在第0天(D0)，当肿瘤体积达到100-200mm3时，瘤内(I.T.)注射100微升WRTG18618(107pfu)或市售J43(1μg或10μg，Bioxcell)。
也向没有肿瘤的小鼠中S.C注射WRTG18618。
在第1、5、11天采集血液和肿瘤。每个时间点，使用200μL戊巴比妥麻醉3只小鼠，并且通过心脏穿刺采集血液。血液在4℃下储藏8小时，并且再2次离心分离后获取血清，-20℃储藏直至分析。取血样之后，使用颈椎脱臼法杀死小鼠并且获取肿瘤。称重肿瘤，切成小块，转移到装有3ml PBS的GentleMACS C–型管(Miltenyi)中。使用程序“m-imptumor01”(GentleMacs,Miltenyi)对肿瘤进行机械破碎。在300g 7min离心之后，获取上清液，-20℃储存直至分析。
血清中的以及肿瘤匀浆中的J43浓度在注射病毒或市售J43mAb后不同时间点通过量化ELISA测量。
定量ELISA
评估在血清和肿瘤匀浆中的J43浓度。更具体地说，将装有100μL/孔的0.8μg/mL的山羊抗仓鼠免疫球蛋白(Southern Biotech)和包被液(0.05M钠碳酸盐(Na carbonate)pH9.6，Sigma)的96孔板(Nunc immune plate Maxisorp)在4℃过夜培养。用缓冲液(300μL/孔的PBS，0.05％Tween20)洗涤孔板3次，用200μL/孔的阻断液(PBS，0.05％Tween 20，5％脱脂奶粉)室温温育1h。用洗涤液洗涤孔板3次。在100％小鼠血清(Sigma)中使用2倍连续稀释液制备标准范围的J43(BioXcell)从1000到0.488ng/mL。每个标准液然后进一步在阻断液中进行2倍稀释(最终J43浓度from 500to 0.244ng/mL)以获得终浓度为血清中浓度的50％。将100μL/孔的每个标准液加入到另一一式两份的孔板中。在封闭缓冲液中至少稀释血清样品2倍，如果必要进一步在1体积/1体积的封闭缓冲液/血清的混合物中稀释并且向孔板中加入100μL。在37℃温育孔板2h。洗涤液洗涤3次之后，加入100μL/孔的80ng/mL的HRP缀合的山羊抗亚美尼亚仓鼠免疫球蛋白(HRP conjugated goat anti Armenian Hamster IgG)(Jackson Immunoresearch)，并且将孔板在37℃下温育1h。洗涤3次，加入100μL/孔的3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine(TMB，Sigma)，并且将孔板在室温下温育30min。加入100μL/孔的2M H2SO4停止反应和在450nm使用孔板检测仪(TECAN Infinite M200PRO)测量吸光度。获取的OD值转入GraphPadPrism软件中，使用5个参量拟合的标准曲线倒退计算样品的浓度。
如图6A所示，当皮下注射首次接受实验(无植入肿瘤)的小鼠时，从WRTG18618中生产重组J43是很弱的(在第一天9ng/ml，在第5天4.5ng/ml)。相反，向具有B16F10肿瘤的小鼠瘤内注射WRTG18618，其血清中分泌大量的重组J43，在第1天和第5天分别比皮下注射病毒之后测量的重组J43的浓度高9和1900倍(83ng/ml和9500ng/ml)。此结果表明与皮下健康组织相比，溶瘤病毒优先在肿瘤中繁殖。相比之下，在瘤内注射10μg市售J43之后，发现血清浓度(seric concentrations)达到约1000ng/ml(在第1天1306ng/ml，在第5天1049ng/ml)然而注射1μg的市售J43的血清浓度就低多了(在第1天73ng/ml，在第5天35ng/ml)。
在肿瘤匀浆中，重组J43的生产按照与血清中同样的趋势，在第5天达到浓度峰值(见图6B)。单次IT注射市售mAb或WRTG18618之后J43的药物动力学是非常不同的。IT注射10μg的市售J43之后，如预期一致，在第1天在血清和肿瘤中测量到最高抗体浓度(分别为1306ng/ml和173ng/ml)，然而IT注射WRTG18618导致在第5天出现最高血清和肿瘤浓度(分别为9500ng/ml和3800ng/ml)。应该被强调的是，重组J43的肿瘤浓度在病毒IT注射后产生比IT注射10μg市售J43在所有时间点测量到的都高得多(在第1天410ng/ml v.173ng/ml；在第5天3800ng/ml v.51ng/ml，在第11天700ng/ml v.无法测量到)。重要的是，病毒治疗后的第11天，还能在肿瘤中检测到抗体的生产，而注射市售J43后则不能。
这些数据显示与IT注射市售抗体相比，在溶瘤病毒中载体化的J43允许抗体在肿瘤中更高浓度更长时间的积累。
在皮下肿瘤模型中的抗肿瘤活性
上述的表达多种抗-PD-1的痘苗病毒的抗肿瘤活性可通过常规临床前模型在植入肿瘤后注射构建体进行测试。例如，鼠科癌症细胞皮下注射入具有免疫能力的小鼠侧胸部。当肿瘤体积达到50-70mm3时，将小鼠盲选式随机化并用所示痘苗病毒治疗，剂量为1x107PFU。在植入肿瘤后的第10、12、14天将运载体或对照载体(使用缓冲液重悬病毒)直接注射入肿瘤内。肿瘤尺寸用卡尺一周测量2次。特别是载体化的scFv和mAb1抗体至少与同时施用WR载体和市售J43相比在拖延肿瘤生长和增加存活率上具有相同效率。
使用不超出常规实验，本领域技术人员会确认或能够弄清很多与本文描述的特定方法等同的方法和试剂，包括替代物、变体、新增、缺失、修改和替换。这些等同物也被认为是包含在本发明范围中的，并且被以下权利要求所覆盖。

Claims (25)

1.溶瘤病毒，其包含插入其基因组中的编码一或多种免疫检查点调节因子的核酸分子。
2.权利要求1的溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒选自呼肠孤病毒、塞内卡谷病毒(SVV)、水疱性口炎病毒(VSV)、新城疫病毒(NDV)、单纯疱疹病毒(HSV)、麻疹病毒、逆转录病毒、流感病毒、辛德比斯病毒、痘病毒和腺病毒。
3.权利要求2的溶瘤病毒，其中所述痘病毒是痘苗病毒，特别是选自Elstree、Wyeth、Copenhagen和Western Reserve株的痘苗病毒。
4.权利要求3的溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒是胸苷激酶(TK)缺陷的痘苗病毒，所述胸苷激酶(TK)缺陷由J2R病毒基因中的失活突变导致。
5.权利要求3或4的溶瘤病毒，其中所述病毒是核糖核苷酸还原酶(RR)活性缺陷的痘苗病毒，所述核糖核苷酸还原酶(RR)活性缺陷由病毒I4L和/或F4L基因中的失活突变导致。
6.权利要求1-5的溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒进一步包含至少一个插入病毒基因组的治疗性基因。
7.权利要求6的溶瘤病毒，其中所述治疗性基因选自编码自杀基因产物的自杀基因和编码免疫刺激蛋白的基因。
8.权利要求7的溶瘤病毒，其中所述自杀基因选自编码具有胞嘧啶脱氨酶(CDase)活性、胸苷激酶活性、尿嘧啶磷酸核糖转移酶活性、嘌呤核苷磷酸化酶活性和胸苷酸激酶活性的蛋白质的基因。
9.权利要求8的溶瘤病毒，其中所述自杀基因产物具有胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶磷酸核糖转移酶活性，优选选自codA::upp、FCY1::FUR1和FCY1::FUR1[Delta]105(FCU1)和FCU1-8多肽。
10.权利要求8或9的溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒是胸苷激酶和核糖核苷酸还原酶活性缺陷的且包含插入其基因组的治疗性FCU1自杀基因的痘苗病毒。
11.权利要求7的溶瘤病毒，其中所述免疫刺激蛋白是白介素或集落刺激因子，特别优选GM-CSF。
12.权利要求11的溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒是胸苷激酶活性缺陷的且包含插入其基因组的治疗性人GM-CS的痘苗病毒。
13.权利要求1-12中任一项的溶瘤病毒，其中所述一或多种免疫检查点调节因子选自肽配体、天然受体的可溶结构域、RNAi、反义分子、抗体和蛋白支架。
14.权利要求13的溶瘤病毒，其中所述一或多种免疫检查点调节因子拮抗至少部分抑制性免疫检查点活性，特别是那些PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG3、Tim3、BTLA和CTLA4介导的抑制性免疫检查点活性。
15.权利要求14的溶瘤病毒，其中所述一或多种免疫检查点调节因子包含特异性结合人PD-1的抗体，特别是选自抗Nivolumab、Pembrolizumab和pidilizumab的PD-1抗体。
16.权利要求14的溶瘤病毒，其中所述一或多种免疫检查点调节因子包含特异性结合人PD-L1的抗体，特别是选自MPDL3280A和BMS-936559的抗PD-L1抗体。
17.权利要求14的溶瘤病毒，其中所述一或多种免疫检查点调节因子包含特异性结合人CTLA-4的抗体，特别是选自ipilimumab、tremelimumab和单链抗-CTLA4抗体的抗CTLA4抗体。
18.药物组合物，其包含有效量的权利要求1-17任一项的溶瘤病毒和药学可接受的载体。
19.权利要求18的药物组合物，其包含约107pfu至约5x109pfu的所述溶瘤病毒。
20.权利要求18或19的药物组合物，其被配制成用于肠胃外施用。
21.权利要求1-17任一项的溶瘤病毒或权利要求18-20任一项的药物组合物在治疗增生性疾病中的用途。
22.权利要求21的用途，其中所述增生性疾病是癌症，优选选自黑色素瘤、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌和肝癌的癌症。
23.权利要求21或22的用途，其中所述溶瘤病毒通过静脉内或瘤内途径施用。
24.权利要求23的用途，其包含2-5次静脉内或瘤内施用108或109pfu的所述溶瘤痘苗病毒，间隔为约1或2周。
25.权利要求21-24中任一项的用途，其进一步包含施用前药和/或抗癌治疗中有效的物质。
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