CN111712250A

CN111712250A - 靶向部分修饰的溶瘤病毒

Info

Publication number: CN111712250A
Application number: CN201880085194.6A
Authority: CN
Inventors: 贾威廉; 德米特里·V·泽耶科; 刘小虎; 亚纳尔·M·穆拉德; 卜学贤
Original assignee: Virogin Biotech Canada Ltd
Current assignee: Virogin Biotech Canada Ltd
Priority date: 2017-11-16
Filing date: 2018-11-16
Publication date: 2020-09-25
Also published as: EP3710018A1; US20210177921A1; WO2019099947A1; EP3710018A4

Abstract

本发明提供了用于治疗癌症的组合物和方法，其包括包含溶瘤病毒和在病毒表面上的靶向部分的组合物，其中所述溶瘤病毒在各个方面不编码或表达所述靶向部分，所述组合物和方法可用于治疗多种癌症(例如，胃肠癌，如食道癌，胃癌和结肠癌)。

Description

靶向部分修饰的溶瘤病毒

相关申请的交叉引用

本专利申请根据35U.S.C.§119(e)要求2017年11月16日提交的美国临时专利申请号62/587,103的权益，所述申请通过引用整体并入本文用于所有目的。

发明领域

本发明一般涉及在其表面上具有靶向部分的溶瘤病毒。

对序列表、表格或计算机程序的参考

序列表的正式副本与作为ASCII格式文本文件的说明书通过EFS-Web同时提交，文件名为“VIRO405_ST25.txt”，创建日期为2017年11月16日，大小为4.30KB。通过EFS-Web提交的序列表是说明书的一部分，并通过引用将其整体并入本文。

背景

溶瘤病毒疗法已经被认为是用于癌症治疗的有前景的新治疗方法，因为溶瘤病毒引起强的肿瘤溶瘤并诱导全身肿瘤特异性免疫，同时引起比化学疗法或放射疗法治疗显著更少的副作用。

在各种OV中，基于单纯疱疹病毒1型(“HSV-1”)的OV是最先进的，例如，基于疱疹病毒的OV(T-Vec)已经被美国FDA批准用于治疗黑色素瘤。HSV载体的代表性实例包括美国专利号7,223,593、7,537,924、7,063,835、7,063,851、7,118,755、8,277,818和8,680,068中所述的那些。

然而，治疗癌症的一个难题是直接靶向和杀死癌症，而不靶向和杀死其它非癌组织和细胞的能力。为满足这种需要而开发的一种方法是减毒溶瘤病毒，例如通过缺失或改变某些病毒基因或基因区域，从而使病毒更安全和更具癌症特异性。

已开发用于制备更具癌症特异性的溶瘤病毒的其它方法包括例如：1)转导靶向(例如，修饰病毒衣壳蛋白以特异性靶向癌细胞，同时降低进入非癌细胞的可能性)；和2)非转导靶向(例如，修饰病毒基因组以仅在癌细胞中复制，或转录控制病毒基因组的关键部分以仅在癌症中复制，例如在肿瘤特异性启动子的控制下)。

然而，靶向特定癌细胞群的一个难题是，在临床环境中自身存在的癌症很少作为单一单克隆群存在(参见。例如，Shen，Michael M.“The complex seeds of metastasis：Analyses of prostate-cancer metastases reveal a complex cellulararchitecture，and show that secondary sites can be seeded by multiple cellpopulations derived from both the primary tumor and other metastases.”Nature，vol.520，no.7547，2015)。因此，虽然可能靶向肿瘤细胞的单克隆群，但在临床环境中，这样的治疗只能达到有限的成功。

本发明克服了目前商业溶瘤病毒的缺点，并进一步提供了其他预料不到的益处。

在背景技术部分中讨论的所有主题不一定是现有技术，并且不应该仅仅因为其在背景技术部分中讨论就被认为是现有技术。按照这些方式，在背景技术部分中讨论的现有技术中或与这种主题相关的问题的任何认识不应被视为现有技术，除非明确地陈述为现有技术。相反，在背景技术部分中对任何主题的讨论应当被视为发明人对特定问题的方法的一部分，这本身也可能是有创造性的。

发明内容

简而言之，本发明提供了用溶瘤病毒治疗癌症的组合物和方法，其利用了一种新的策略，即仅为病毒复制的第一周期提供OV的特异性靶向，然后允许OV的后代根据其如何(或已经)被遗传构建而在细胞中复制。例如，第一代OV可以被构建成在其表面上用靶向部分修饰(如下面更详细描述的)。不表达靶向部分的后代OV将根据OV的遗传特性在细胞中靶向和复制。

本文所述的技术可与多种不同的溶瘤病毒一起使用，包括例如腺病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、流感病毒、弹状病毒(例如水疱性口炎病毒(VSV))和痘病毒如牛痘病毒。

在本发明的一个实施方案中，靶向部分是与包膜蛋白结合的肿瘤抗原特异性多肽或抗体。在某些实施方案中，包膜蛋白不负责OV感染(例如，在HSV、gC或gG的情况下)。在替代实施方案中，包膜蛋白(至少部分)负责OV感染(例如，在HSV、gD的情况下)。例如，包膜蛋白可与体外肿瘤特异性抗体结合(通过本文所述的技术)以产生用于肿瘤靶向的抗体修饰的oHSV。这种策略的一个关键优点在于其通用性，这是因为基于个体患者高度表达的细胞表面蛋白，可以将oHSV与针对每种不同肿瘤的任何肿瘤特异性抗体组合，这为每位患者提供了更精确的靶向和更个人化的方法。此外，因为抗体不是在病毒基因组中遗传编码的，所以来自最初感染的肿瘤细胞的子代病毒不仅仅限于带有细胞表面标志物的肿瘤细胞，并且可以感染肿瘤块内的所有细胞，这将大大增强肿瘤破坏。

另一种策略是使用双特异性抗体靶向OV包膜蛋白和肿瘤表面抗原。将双特异性抗体与OV混合，用抗体包被病毒表面，并引发病毒优先靶向肿瘤细胞。在肿瘤块中复制后，子代病毒也失去抗体并且不限于特定的肿瘤细胞靶标，因此允许更广泛的感染性范围以杀死各种肿瘤相关细胞。

在本发明特别优选的实施方案中，通过工程化双特异性抗体以结合例如HSV糖蛋白D，从而通过改变gD介导的组织趋向性将病毒从其天然受体去靶向，可以进一步增强肿瘤靶向。使用抗-gD抗体的类似方法可用于在病毒已经被修饰以显示肿瘤特异性抗体之后使病毒更具癌症特异性。

本发明内容已经被提供来以简化的形式介绍某些概念，这些概念将在下面的详细描述中进一步详细描述。除非另有明确说明，否则本发明内容不旨在标识所要求保护的主题的关键或必要特征，也不旨在限制所要求保护的主题的范围。

在下面的描述中阐述了一个或多个实施方案的细节。结合一个示例性实施方案示出或描述的特征可以与其它实施方案的特征组合。因此，可组合本文所述的各实施方案中的任一者以提供其它实施方案。如果需要，可以修改实施方案的各方面，以采用如本文所标识的各专利，申请和出版物的概念来提供另外的实施方案。根据说明书，附图和权利要求书，其它特征，目的和优点将是显而易见的。

附图的简要说明

从附图和以下对各种实施方案的详细描述中，本公开的示例性特征，其性质和各种优点将是显而易见的。参考附图描述了非限制性和非穷举的实施方案，其中除非另有说明，否则在各个视图中相似的标记或参考数字表示类似的部分。附图中的元件的尺寸和相对位置不必按比例绘制。例如，选择，放大和定位各种元件的形状以提高图的可读性。为了易于在附图中识别，已经选择了所绘制的元件的特定形状。在下文中参考附图描述一个或多个实施方案，其中：

图1图解说明了代表性的单一结构域抗体，重链抗体和传统抗体的比较。

图2说明了可用于定量与oHSV结合的抗-gC-抗-CEACAM6双特异性抗体的量的代表性夹心ELISA测定。双特异性抗体与oHSV缀合的效率的定量可以通过将病毒裂解物施用于包被有抗-llama或抗-gG抗体的ELISA板，然后与检测探针孵育来进行。如考虑到本文所提供的公开内容所显而易见的，可类似地进行类似的ELISA测定以定量其它抗体(例如，双特异性抗体，其中抗体的一个方面结合选自gB、gC、gE、gI、gJ、gK、gM、gN、UL20、UL24、UL43、UL45、UL56和US9的包膜蛋白。在某些优选的实施方案中，双特异性抗体的一个方面结合gD。

图3说明了可用于定量与含Spycatcher的oHSV结合的SpyTag-CEACAM6H的量的代表性ELISA测定。Spycatcher/SpyTag与oHSV缀合的效率的定量可以通过向用Spycatcher/SpyTag-抗-CEACAM6-修饰的oHSV的病毒裂解物包被的ELISA板中加入检测抗体或探针来进行。

图4提供了重组SpyCather和SpyTag抗-CEACAM6之间缀合的代表性说明。

图5提供了通过ELISA定量表达Spycatcher的病毒和SpyTag抗-CEACAM6之间的缀合的代表性图示。

图6提供了使用Spycatcher/SpyTag体外重靶向病毒的代表性图示。

图7提供了抗-gD-抗CEACAM6双特异性抗体的代表性图示和oHSV-1与双特异性抗体之间相互作用的测定。

图8A提供了同框融合成gG和gC的Spycatcher的示意图。图8B提供了细胞裂解物在SDS-PAGE上的图示。

发明的详细描述

通过参考本发明的优选实施方案的以下详细描述和本文包括的实施例，可以更容易地理解本发明。

本文所用的术语“靶向部分”是指特异性或选择性结合靶分子、细胞、颗粒、组织或聚集体的分子、复合物或聚集体。在优选的实施方案中，靶向部分是抗体，如下文更详细描述的。靶向部分的其它代表性实例包括适体，Avimer，受体结合配体和核酸。术语“靶向部分”和“结合部分”在本文中同义使用。

术语“抗体”是指全长免疫球蛋白(即，天然存在的或重组形成的完整分子)(例如，IgG抗体，如IgG1、IgG2a、IgG3、IgG4(和IgG4亚型)、IgA同种型、IgE和IgM)或免疫球蛋白分子的免疫活性(即，特异性结合)部分，例如抗体片段或区段。代表性的抗体片段或区段包括分离的重链，轻链和抗体的部分，例如F(ab′)₂、F(ab)₂、Fab′、Fab、Fv、scFv(单链Fv)等，包括IgG4的半分子(参见van der Neut Kolfschoten等人，(Science 2007；317(14年9月)：1554-1557)。抗体片段或区段还包括免疫活性的最小识别单位，其由模拟高变区的氨基酸残基例如CDR组成。抗体片段或区段可通过完整免疫球蛋白的酶促或化学分离，或通过重组技术产生。术语“抗体”还应理解为包括与其它蛋白化学缀合，或作为与其它蛋白的融合蛋白一起表达的一个或多个免疫球蛋白链。

术语“抗体”还包括单一结构域抗体(sdAb)或纳米抗体，以及双特异性或双功能抗体(例如，具有两个不同的重链/轻链对和两个不同的结合位点的人工杂交体抗体)。SdAb由单一单体可变区组成，并且可以衍生自重链或轻链。sdAb相对于传统的单克隆抗体或其它抗体如scFv或双抗体的一个优点是单一结构域抗体的显著较小的尺寸(～2nm)(图1)，因此由于空间位阻使得它们不太可能干扰病毒包膜上必需糖蛋白的功能。此外，sdAb和纳米抗体对它们的靶标表现出高亲和性和优异的生物物理性质，例如热稳定性。

提供图1以示例性地比较代表性的单一结构域抗体，重链抗体和传统的抗体。

共价结合对(“CBP”，或单独地，“CPB1”和“CPB2”)是指对彼此结合具有高特异性的两个分子。在本发明的优选实施方案中，CPB应该：1)彼此具有高特异性；以及2)对于在人类受试者中天然存在或能够发现的分子具有非常低的特异性。在本发明特别优选的实施方案中，CPB彼此共价结合。CPB的代表性实例包括SpyTag/Spycatcher对(参见，例如，Reddington和Howarth，“Secrets of a coloid interaction for biomaterials andbiotechnology：SpyTag和Spycatcher，”Current Opinion in Chemical Biology，2015：29：94-99；还参见美国专利号9,547,003，题目为“Peptide tag systems thatspontaneously form an irreversible link to protein partners via isopeptidebonds”；两者的内容通过引用整体并入本文中)。其它代表性的例子包括以下公开的那些：Zakeri和Howarth，“Spontaneous IntermolecularAmide Bond Formation between SideChains for Inversible Peptide Targeting”，4526 J.Am.Chem.Soc.2010，132，4526-4527；Tan II，Hoon SS，Wong FT(2016)“Kinetic Controlled Tag-Catcher Interactionsfor Directed Covalent Protein Assembly.PloS ONE 11(10)：e0165074doi：10.137/journal.pone.0165074”，两者的内容通过引用整体并入本文中。术语“溶瘤病毒”通常是指能够在肿瘤细胞中复制并杀死肿瘤细胞的任何病毒。在某些实施方案中，可以对病毒进行工程改造以更选择性地靶向肿瘤细胞。溶瘤病毒的代表性实例包括但不限于腺病毒，柯萨奇病毒，H-1细小病毒，单纯疱疹病毒(HSV)，流感病毒，麻疹病毒，粘液瘤病毒，新城疫病毒，细小病毒小核糖核酸病毒，呼肠孤病毒，弹状病毒(例如水疱性口炎病毒(VSV))，副粘病毒如新城疫病毒，小RNA病毒如脊髓灰质炎病毒或仙台山谷病毒，痘病毒如牛痘病毒(例如Copenhagen，Indiana Western Reserve和Wyeth株)，呼肠孤病毒或逆转录病毒如鼠白血病病毒。其它代表性实例描述于：US8,147,822和9,045,729(溶瘤弹状病毒/VSV)；US9,272,008(溶瘤麻疹病毒)；美国专利号7,223,593，7,537,924，7,063,835，7,063,851，7,118,755，8,216,564，8,277,818和8,680,068(溶瘤疱疹病毒载体)；和US 8,980,246(溶瘤牛痘病毒)，其内容在此通过引用整体并入本文。

本文所用的“治疗(treat)”或“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指获得有益或期望结果(包括临床结果)的方法。有益的或期望的临床结果可包括但不限于减轻或改善一种或多种症状或病症、减少疾病程度、稳定(即不恶化)疾病状态、预防疾病传播、延缓或减缓疾病进展、改善或减轻疾病状态、减少疾病复发和缓解(无论是部分或全部)，无论是可检测的或不可检测的。术语“治疗”也可以指与未接受治疗的预期存活相比延长的存活。

癌症的代表性形式包括癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤和肉瘤。其它实例包括但不限于胆管癌，脑癌(例如成胶质细胞瘤)，乳腺癌，子宫颈癌，结肠直肠癌，CNS(例如听神经瘤，星形细胞瘤，颅咽管瘤，室管膜瘤，成胶质细胞瘤，成血管细胞瘤，成髓细胞瘤，脑膜细胞瘤，成神经细胞瘤，少突神经胶质瘤，松果体瘤和视网膜母细胞瘤)，子宫内膜衬癌，造血细胞癌(例如白血病和淋巴瘤)，肾癌，喉癌，肺癌，肝癌，口腔癌，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，皮肤癌(例如黑色素瘤和鳞状细胞癌)和甲状腺癌。癌症可以包括实体瘤(例如，肉瘤，如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤和成骨肉瘤)、弥漫性肿瘤(例如，白血病)或这些肿瘤的一些组合(例如，具有实体瘤和播散性或弥漫性癌细胞的转移性癌症)。癌症也可以耐受常规治疗(例如常规化学疗法和/或放射疗法)。

良性肿瘤和其它不需要的细胞增殖病症也可被治疗。

本文所用的“肿瘤抗原”是指在肿瘤细胞表面上由I类或II类MHC分子呈递的抗原。仅在肿瘤细胞上发现的抗原被称为“肿瘤特异性抗原”或“TSA”，而肿瘤细胞和正常细胞都呈递的抗原被称为“肿瘤相关抗原”或“TSA”。肿瘤抗原的代表性实例包括但不限于AIM-2、AIM-3、ART1、ART4、BAGE、β1、6-n、β-连环蛋白、β-细胞周期蛋白、BMI1、BRAF、BRAP、C13orf24、C6orfl53、C9orfl12、CA-125、CABYR、CASP-8、组织蛋白酶B、Cav-1、CD74、CDK-1、CEAmidkin、COX-2、CRISP3、CSAG2、CTAG2、CYNL2、DHFR、E-钙粘蛋白，EGFRvIII、EphA2/E ck、ESO-1、EZH2、Fra-1/Fosl1、FTHL17、GAGE1，神经节苷脂/GD2、GLEA2、Glil、GnT-V、GOLGA、gp75、gp100、HER-2、HSPH1、IL13Rα、IL13Rα2、ING4、Ki67、KIAA0376、Ku70/80、LDHC、LICAM、Livin、MAGE-A1、MAGE-2、MAGE-A3、MAGE-B6、MAPPK1、MART-1、MICA、MRP-3、MUC-1、MUM-1、巢蛋白、NKTR、NLRP4、NSEP1、NY-ES-01、OLIG2、p53、PAP、PBK、PRAME、PROX 1、PSA、PSCA、PSMA、ras、RBPSUH、RTN4、SART1、SART2、SART3、SOX10、SOX11、SOX2、SPANXA1、SSX2、SSX4、SSX5、存活素、TNKS2、TPR、TRP-1、TRP-2、TSGA10、TSSK6、TULP2、酪氨酸酶、U2AF1L、UPAR、WT-1、XAGE2和ZNF165。

在本发明的某些实施方案中，CEACAM6和EpCAM被用作肿瘤靶向的表面标志物。简言之，CEACAM6(癌胚抗原相关细胞粘附分子)是细胞表面糖蛋白，其作为细胞间粘附分子起作用。EpCAM(上皮细胞粘附分子)是介导同型细胞-细胞粘附的跨膜糖蛋白。EpCAM在大多数上皮来源的肿瘤中高度表达，并且已经被用作多种癌症的诊断和预后标志物。EpCAM通过促进细胞增殖和转移以及通过转录上调癌基因c-myc和细胞周期蛋白4/E而在癌发生中起作用。

A.溶瘤病毒载体

如上所述，本发明提供了可以用靶向部分修饰的溶瘤病毒。简言之，溶瘤病毒是优选以选择性方式裂解癌细胞(溶瘤)的病毒。相对于非分裂细胞，在分裂细胞中选择性复制的病毒通常是溶瘤的。适用于本发明的溶瘤病毒包括单纯疱疹病毒1和2。

单纯疱疹病毒(HSV)1和2是感染人类的疱疹病毒科的成员。HSV基因组合有两个独特的区域，它们被命名为独特的长(UL)区域和独特的短(US)区域。这些区域中的每一个的侧翼是一对反向末端重复序列。大约有75个已知的开放阅读框架。已经对病毒基因组进行了工程改造以开发用于例如癌症治疗的溶瘤病毒。HSV的肿瘤选择性复制可以通过HSVICP34.5(也称为γ34.5)基因的突变赋予。HSV含有两个拷贝的ICP34.5。已知灭活ICP34.5基因的一个或两个拷贝的突变体缺乏神经毒力，即是无毒力/非神经毒力的并且是溶瘤的。肿瘤选择性复制也可以在不缺失ICP34.5的情况下实现，但是通过基因表达的基于microRNA的调节，或者通过使用肿瘤特异性启动子来驱动所选病毒基因的表达。

合适的溶瘤HSV可以来源于HSV-1或HSV-2，包括任何实验室菌株或临床分离物。在一些实施方案中，oHSV可以来源于实验室菌株HSV-1菌株17，HSV-1菌株F或HSV-2菌株HG52中的一种。在其它实施方案中，它可以来源于非实验室菌株JS-1。其它合适的HSV-1病毒包括HrrR3(Goldstein和Weller，J.Virol.62，196-205，1988)，G2O7(Mineta等人，NatureMedicine.1(9)：938-943，1995；Kooby等人，The FASEB Journal，13(11)：1325-1334，1999)；G47Δ(Todo等人，Proceedings of the National Academy of Sciences.2001；98(11)：6396-6401)；HSV 1716(Mace等人，Head&Neck，2008；30(8)：1045-1051；Harrow等人，Gene Therapy.2004；11(22)：1648-1658)；HF10(Nakao等人，Cancer Gene Therapy.2011；18(3)：167-175)；NV1020(Fong等人，Molecular Therapy，2009；17(2)：389-394)；T-VEC(Andtbacka等人，Journal of Clinical Oncology，2015：33(25)：2780-8)；J100(Gaston等人，PloS one，2013；8(11)：e81768)；M002(Parker等人，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences，2000；97(5)：2208-2213)；NV1042(Passer等人，Cancer GeneTherapy.2013；20(1)：17-24)；G2O7-IL2(Carew等人，Molecular Therapy，2001；4(3)：250-256)；rQNestin34.5(Kambara等人，Cancer Research，2005；65(7)：2832-2839)；G47Δ-mIL-18(Fukuhara等人，Cancer Research，2005；65(23)：10663-10668)；以及题目为“HSVVectors with Enhanced Replication in Cancer Cells”的PCT公开PCT/US2017/030308和题目为“Compositions and Methods of Using Stat1/3Inhibitors with OncolyticHerpes Virus”的PCT/US2017/018539中公开的那些抗体，以上所有通过引用整体并入本文中。

oHSV载体可以具有至少一个γ34.5基因的修饰，突变或缺失。在一些实施方案中，两个基因都被缺失，突变或修饰。在其它实施方案中，一个被缺失，而另一个被突变或修饰。可以缺失天然γ34.5基因中的任一个。在一个实施方案中，缺失包含γ34.5基因和ICP4基因的末端重复。突变，如核苷酸改变，插入和缺失使基因不可表达或产物失活。γ34.5基因可以在其3′UTR中用miRNA靶序列修饰。靶序列结合这样的miRNA，其在肿瘤细胞中表达的水平低于它们在正常对应物中表达的水平。在一些实施方案中，修饰的或突变的γ34.5基因是在体外构建的，并作为病毒基因的替代物插入到oHSV载体中。当修饰的或突变的γ34.5基因仅是一个γ34.5基因的替代时，另一个γ34.5被缺失。γ34.5基因可以包括另外的变化，例如具有外源启动子。在进一步的实施方案中，γ34.5基因可以被翻译调节，例如，通过添加外源性5′UTR，例如大鼠FGF-25′UTR。这种5′UTR形成二级发夹结构，其可以在存在足够的真核起始因子(eIF)4E/eIF4F复合物的情况下解开，导致mRNA的翻译起始。已知eIF4E蛋白(eIF4F复合物的一部分)在多种癌症类型中过表达。在本发明的其它实施方案中，可以通过使用首先阻止病毒进入神经元的突变，例如通过缺失糖蛋白K的氨基酸31-68来阻止神经毒力而不修饰γ34.5基因。

oHSV可以具有另外的突变，其可以包括失能突变(例如，缺失，取代，插入)，其可以影响病毒的毒力或其复制能力。例如，可在ICP6，ICPO，ICP4，ICP27，ICP47，ICP 24，ICP56中的任何一个或多个中进行突变。优选地，这些基因之一中的突变(任选地在基因的两个拷贝中，如果合适的话)导致HSV不能(或降低能力)表达相应的功能多肽。在一些实施方案中，病毒基因的启动子可以被在靶细胞中具有选择性活性的启动子取代，或者在递送诱导物时是可诱导的，或者在细胞事件或特定环境中是可诱导的。在具体的实施方案中，肿瘤特异性启动子驱动HSV复制所必需的病毒基因的表达。在某些实施方案中，ICP4或ICP27或两者的表达由外源启动子，例如肿瘤特异性启动子控制。示例性的肿瘤特异性启动子包括存活素或端粒酶；其它合适的肿瘤特异性启动子可以是对单一肿瘤类型特异的，并且是本领域已知的。可以存在其它元件。在一些情况下，存在增强子如NF-kB/OCT4/SOX2增强子，例如存在于ICP4或ICP27或两者的调节区中。同样，5′UTR可以是外源的，如来自生长因子基因如FGF的5′UTR。

oHSV也可以具有非HSV起源的基因和核苷酸序列。例如，编码前药的序列，编码细胞因子或其它免疫刺激因子的序列，肿瘤特异性启动子，诱导型启动子，增强子，与宿主细胞同源的序列等可以在oHSV基因组中。示例性序列编码IL12，IL15，OX40L，PD-L1阻断剂或PD-1阻断剂。对于编码产物的序列，它们与启动子序列和表达所必需或期望的其它调节序列(例如，增强子，聚腺苷酸化信号序列)可操作地连接。

病毒基因的调节区可以被修饰以包含影响表达的响应元件。示例性响应元件包括NF-κB、Oct-3/4-SOX2的响应元件、增强子、沉默子、cAMP响应元件、CAAT增强子结合序列和绝缘体。也可包括其它响应元件。病毒启动子可以用不同的启动子替代。启动子的选择将取决于许多因素，例如所提议的HSV载体的使用，患者的治疗，疾病状态或病症，以及应用诱导物(对于诱导型启动子)的容易性。为了治疗癌症，通常当启动子被替代时，它将被细胞特异性或组织特异性或肿瘤特异性启动子替代。肿瘤特异性，细胞特异性和组织特异性启动子是本领域已知的。也可修饰其它基因元件。例如，病毒基因的5′UTR可以被外源UTR替代。

B.靶向部分

如上所述，本发明提供了可用于修饰OV，优选OHSV表面的靶向部分。

在本发明的一个实施方案中，产生缺失gC、gD或gG的整个胞外结构域，或者，仅缺失胞外结构域的一部分(例如，少于整个结构域的5、10、20、30、40或50％)的HSV-1突变体。例如，在gC的情况下，可以只缺失胞外结构域1的硫酸乙酰肝素结合部分。用肿瘤靶向剂(肽或抗体)替代全部或部分胞外结构域(例如gC或gG的胞外结构域)导致病毒与非肿瘤细胞(其也表达硫酸乙酰肝素)结合的减少并增强病毒对肿瘤细胞的亲和力。在其它实施方案中，胞外结构域的整个序列可以保留，但是CBP(例如Spycatcher)的一个方面可以在包膜编码结构域之前，之内或之后(例如在信号肽之后)插入。

通过同源重组技术容易地产生在包膜蛋白(例如，gC，gD或gG)的胞外结构域中具有缺失的HSV突变体。具体地，使用在克隆到细菌人工染色体(BAC)中的HSV-1基因组上实施的λRed介导的重组系统进行病毒诱变。

在优选的实施方案中，Spycatcher肽被连接到gC，gD或gG的完整胞外结构域中，或者被连接到截短的gC，gD或gG中，以便用Spycatcher/SpyTag系统进行病毒修饰。Spycatcher/SpyTag标记系统来自在化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)中发现的纤连蛋白结合蛋白FbaB的CnaB2结构域。当N端蛋白片段Spycatcher和C端肽SpyTag混合在一起，与CnaB2分离时，特异性结合并自发地形成异肽键；因此，这两个蛋白质片段共价连接并形成不可逆复合物。另外，这两个结合伴侣之间的弹性相互作用可以在宽的温度和pH范围内发生。

在优选的实施方案中，编码Spycatcher的基因(来自CnaB2结构域的²²D-N¹⁰³)与信号肽下游的gC，gD或gG胞外结构域同框融合。通过合成含有SpyTag(AHIVMVDAYKPTK)，肽接头(GSGGMHAAAAAGS)和针对CEACAM6或EpCAM的抗体的编码序列的DNA序列，产生用于表达SpyTag抗体的构建体。将这些构建体克隆到pET22b载体中，从该载体将这些蛋白与c末端6xHis标签融合。在序列确认后，使用IPTG诱导在细菌Rosetta(DE3)pLacI菌株中表达SpyTag抗体，然后通过钴结合的HiTrap和大小排阻柱纯化。将纯化的SpyTag抗体加入含有Spycatcher的病毒中，然后通过凝胶过滤柱祛去除游离的SpyTag抗体，以获得用抗CEACAM6或EpCAM的抗体修饰的oHSV。

在其它实施方案中，双特异性抗体用于靶向病毒包膜蛋白和肿瘤表面抗原。双特异性抗体将两种抗体的功能性和特异性组合在一个分子中。这两种抗体通过柔性接头连接，并可同时与它们的抗原结合。因此，双特异性抗体将它们的靶标紧密接近以促进随后的生物事件。在本发明中，双特异性抗体用于将oHSV导向癌细胞。在优选的实施方案中，双特异性抗体通过与例如糖蛋白D结合而附着于病毒，糖蛋白D通常介导组织趋向性。这用于将病毒从其天然受体部分地脱靶，并通过位于双特异性抗体另一端的肿瘤-特异性抗体重新靶向其趋向性而使病毒具有高度的癌症特异性。

C.治疗组合物

提供了可用于预防，治疗或改善疾病(例如癌症)的作用的治疗组合物。更具体地，提供了包含至少一种如本文所述的溶瘤病毒的治疗组合物，所述溶瘤病毒已经用靶向部分(例如，如本文所述的肿瘤特异性抗体)修饰。

在某些实施方案中，所述组合物还包含药学上可接受的载体。短语“药学上可接受的载体”是指包括任何载体，稀释剂或赋形剂，其不干扰溶瘤病毒的生物活性的有效性并且对其施用的受试者无毒(一般参见Remington：The Science and Practice of Pharmacy，Lippincott Williams&Wilkins；第21版(2005年5月1日和在美国药典pE1A中：国家配方(USP40-NF 35和补充剂)。

在本文所述的溶瘤病毒的情况下，合适的药物载体的非限制性实例包括磷酸盐缓冲盐水溶液，水，乳剂(如油/水乳剂)，各种类型的润湿剂，无菌溶液等。其它药学上可接受的载体包括凝胶，生物可吸附的基质材料，含有溶瘤病毒的植入元件，或任何其它合适的媒介物，递送或分配装置或材料。这样的载体可以通过常规方法配制并且可以以有效剂量施用于受试者。其它药学上可接受的赋形剂包括但不限于水，盐水，聚乙二醇，透明质酸和乙醇。药学上可接受的盐也可以包括在其中，例如无机酸盐(例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等)和有机酸的盐(例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等)。可用于将oHSV递送至靶癌细胞的这种药学上可接受的(药物级)载体，稀释剂和赋形剂将优选不在接受组合物的个体(受试者)中诱导免疫应答(并且将优选在没有过度毒性的情况下施用)。

本文提供的组合物可以以各种浓度提供。例如，可以提供约10⁶至约10⁹pfu的溶瘤病毒剂量。在进一步的实施方案中，剂量可以在约10⁶至约10⁸pfu/ml的范围内，在每2-3周的治疗中，向具有大病变(例如，＞5cm)的患者中注射多达4ml和具有小病变(例如，＜0.5cm)的患者中注射较小量(例如，多达0.1ml)。

在本发明的某些实施方案中，可以使用低于标准的剂量。因此，在某些实施方案中，可以向患者施用小于约10⁶pfu/ml(每2-3周将多达4ml注射到患者中)。

组合物可以在有助于稳定储存寿命的温度下储存，并且包括室温(约20℃)、4℃、-20℃、-80℃和在液N2中。因为预期用于体内使用的组合物通常不合防腐剂，所以储存通常在较冷的温度下进行。组合物可以干燥(例如冻干)或以液体形式储存。

D.施用

除了本文所述的组合物之外，还提供了使用这种组合物治疗或改善癌症的各种方法，包括向受试者施用有效剂量或有效量的本文所述的靶向部分修饰的OV载体的步骤。

术语“有效剂量”和“有效量”是指足以实现治疗目标癌症的治疗的溶瘤病毒的量，例如，有效降低目标肿瘤大小或负荷或以其它方式阻碍目标肿瘤细胞生长速率的量。更具体地，此术语是指在必要的剂量和治疗期下有效获得所需结果的溶瘤病毒的量。例如，在治疗癌症的上下文中，本文所述的组合物的有效量是诱导缓解、减轻肿瘤负荷和/或防止肿瘤扩散或癌症生长的量。有效量可根据诸如受试者的疾病状态、年龄、性别和体重以及药物制剂、施用途径等因素而变化，但仍可由本领域技术人员常规确定。

将治疗组合物施用于诊断患有癌症或怀疑患有癌症的受试者。受试者可以是人或非人动物。

该组合物用于治疗癌症。本文所用的术语“治疗(treat)”或“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指获得有益或期望结果(包括临床结果)的方法。有益的或期望的临床结果可包括但不限于减轻或改善一种或多种症状或病症、减少疾病程度、稳定(即不恶化)疾病状态、预防疾病传播、延缓或减缓疾病进展、改善或减轻疾病状态、减少疾病复发和缓解(无论是部分或全部)，无论是可检测的或不可检测的。术语“治疗”也可以指与未接受治疗的预期存活相比延长的存活。

癌症的代表性形式包括癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤和肉瘤。其它实例包括但不限于胆管癌，脑癌(例如成胶质细胞瘤)，乳腺癌，子宫颈癌，结肠直肠癌，CNS(例如听神经瘤，星形细胞瘤，颅咽管瘤，室管膜瘤，成胶质细胞瘤，成血管细胞瘤，成髓细胞瘤，脑膜细胞瘤，成神经细胞瘤，少突神经胶质瘤，松果体瘤和视网膜母细胞瘤)，子宫内膜衬癌，造血细胞癌(例如白血病和淋巴瘤)，肾癌，喉癌，肺癌，肝癌，口腔癌，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，皮肤癌(例如黑色素瘤和鳞状细胞癌)、GI(例如食道癌，胃癌和结肠癌)和甲状腺癌。癌症可以包括实体瘤(例如，肉瘤，如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤和成骨肉瘤)、弥漫性肿瘤(例如，白血病)或这些肿瘤的一些组合(例如，具有实体瘤和播散性或弥漫性癌细胞的转移性癌症)。癌症也可以耐受常规治疗(例如常规化学疗法和/或放射疗法)。

良性肿瘤和其它不需要的细胞增殖病症也可被治疗。

本文所述的OV(例如，oHSV)可以通过例如口服，局部，肠胃外，全身，静脉内，肌内，眼内，鞘内，肿瘤内，皮下或透皮途径给药。在某些实施方案中，溶瘤病毒可以通过套管，导管或直接注射来递送。给药部位可以是肿瘤内或远离肿瘤的部位。施用途径通常取决于所靶向的癌症的类型。

溶瘤病毒的最佳或合适的剂量方案在本领域技术的范围内，由主治医师基于患者数据，患者观察结果和各种临床因素，包括例如受试者的大小，体表面积，年龄，性别和所施用的具体溶瘤病毒，施用时间和途径，所治疗的癌症的类型，患者的一般健康状况以及患者所接受的其它药物疗法容易地确定。根据某些实施方案，使用本文所述的溶瘤病毒的受试者的治疗可以与其他类型的治疗组合，例如使用例如化学治疗剂如依托泊苷、异环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、强力霉素等的化学疗法。

OV(例如，oHSV)可以配制为用于临床使用的药物和药物组合物，并且可以与药学上可接受的载体，稀释剂，赋形剂或佐剂组合。制剂将至少部分地取决于施用途径。合适的制剂可以包含在无菌介质中的病毒和抑制剂。制剂可以是液体，凝胶，糊剂或固体形式。可将制剂提供给受试者或医学专业人员。

优选施用治疗有效量。这是足以对受试者显示益处的量。施用的实际量和施用的时程至少部分取决于癌症的性质，受试者的状况，递送的部位和其它因素。

在本发明的其它实施方案中，溶瘤病毒可以通过多种方法施用，例如肿瘤内，静脉内或在肿瘤手术切除后施用。

以下实施例以说明的方式，而不是以限制的方式提供。

实施例

实施例1

高亲和力抗HSV-1gG单一结构域抗体的产生

抗gG单一结构域抗体，即纳米抗体，是通过用灭活的HSV-1病毒免疫美洲鸵(llama)(已知产生重链抗体的几种哺乳动物中的一种)而产生的。美洲鸵用每次免疫100微克病毒蛋白免疫5次(第1、21、35、49和63天)。在免疫过程中，使用标准ELISA方案监测美洲驼的免疫应答，以确保产生特异性重链抗体。在第五次免疫后，从全血中分离外周血单核细胞(PBMC)。使用RNA Blood Mini Kit(QIAGEN)从PBMC中提取RNA，然后使用First-StrandcDNA Synthesis Kit(Thermo Fisher Scientific)合成cDNA。

为了克隆在免疫过程中产生的重链抗体的gG特异性VHH结构域，通过PCR从PBMCcDNA扩增VHH(600bp)和VH(900bp)的可变结构域，并通过凝胶电泳分离两个扩增产物库。对VHH扩增产物进行凝胶纯化，并进行一轮巢式PCR以重新扩增VHH基因片段的全部库。将所得PCR产物连接到噬菌粒载体pMED1中，然后将其用于转化电感受态TG1大肠杆菌细胞。通过用M13K07辅助噬菌体共感染细胞，在拯救后的噬菌体颗粒中表达VHH库。通过进行两轮体外选择来富集特异性识别HSV-1gG蛋白的VHH结构域。为了评估携带抗原特异性VHH的噬菌体颗粒的富集，用从gC抗原包被的孔与未包被的孔洗脱的噬菌体的连续稀释液转染指数生长的TG1细胞。

为了富集靶标特异性纳米抗体，使用重组gG蛋白片段进行两轮纳米抗体淘选。可以使用gG胞外结构域的三种截短形式，对应于氨基酸28-175(SEQ ID NO：1)、氨基酸57-175(SEQ ID NO：2)和氨基酸84-175(SEQ ID NO：3)。在使用前，测试纯化的蛋白质片段以验证重组产物的正确折叠。对于纳米抗体淘选，在每轮中使用0.5-1.0mg的纯重组截短的gG胞外结构域。在噬菌体ELISA中针对重组gG蛋白测试在第二轮淘选后获得的单个菌落。在噬菌体ELISA中评分为阳性的克隆的独特VHH基因被亚克隆到细菌表达载体pET22b中，然后表达和纯化以获得具有超过95％的可证实纯度的纳米抗体。

使用BLItz系统(ForteBio)测试重组gG和每种纳米抗体之间的结合亲和力，所述BLItz系统是用于测量抗体和抗原之间的结合动力学的标准生化设备。从这些结合测定中，所有纳米抗体对重组gG的结合亲和力彼此排序，并且选择具有最高亲和力的抗gG纳米抗体用于随后产生双特异性抗体。

实施例2

用于确定抗体包被的HSV-1病毒体外感染肿瘤细胞的能力的测定

在Vero细胞中产生野生型HSV-1，感染后3天收集合病毒的上清液。使上清液通过0.45微米过滤器后，将过滤的病毒样品与不同浓度的市售抗gG抗体在4℃混合过夜。随后，进行实验以比较野生型和抗gG抗体-包被的病毒在如本文所述的各种肿瘤细胞系中的感染性。3天后，用感染的肿瘤细胞裂解物对Vero细胞进行噬菌斑测定，以确定测试的肿瘤细胞中病毒产生的水平。

实施例3

识别HSV-1和肿瘤抗原的双特异性抗体的产生

在选择了几种高亲和力抗-HSV-1gG纳米抗体之后，通过在体外混合病毒和纯化的纳米抗体蛋白，将野生型HSV-1病毒分别用每种纳米抗体修饰。测试每种纳米抗体修饰的病毒的感染性以选择对病毒感染性表现出最小影响的抗-gG纳米抗体。

用于表达双特异性抗体的构建体通过将所选择的抗gG纳米抗体的编码序列与针对肿瘤抗原的抗体(例如，抗CEACAM6或抗EpCAM抗体)的编码序列连接而产生。通过编码肽接头GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：4)或KRVAPELLGGPS(SEQ ID NO：5)的序列介导连接。肽接头的选择将取决于接头使结合两种靶抗原所必需的双特异性抗体的结构灵活性最大化，同时保持功能性构象的能力。将双特异性抗体构建体序列克隆到pET22b载体中用于表达和纯化。

实施例4

每个病毒颗粒结合oHSV的双特异性抗体量的确定

OHSV在体外与过量纯化的双特异性抗体孵育，并通过凝胶过滤除去任何未结合的抗体来纯化“修饰的”(即包被的)病毒。qPCR用于测量每个测试批次中病毒颗粒的数量，其中使用已知量的携带病毒基因之一的质粒DNA产生标准曲线。

夹心ELISA测定(参见图2)用于测量双特异性抗体和/或gG蛋白的量。在第1天，ELISA板用针对双特异性抗体或gG的捕获抗体在4℃包被过夜。在第2天，将如图2所示的ADOV的裂解物加入到板中，并在室温下孵育2小时。随后，检测探针被用于结合结合的双特异性抗体或未结合的gG以进行定量(使用抗gG-抗CEACAM6双特异性抗体包被的oHSV的例证显示在图1中)。使用已知量的标准物(重量(克))，使用下式计算抗体以及gG分子的量：双特异性抗体或gG分子的量＝分子的测量重量(来自ELISA测定)/分子量。通过以百分比表示的以下公式计算双特异性抗体与gG缀合的效率：结合的双特异性抗体的平均量/gG分子的平均量×100％。用下式计算每个病毒颗粒的缀合的双特异性抗体的量：测量的分子重量/分子量*6.022×10²³/所用病毒颗粒的数量。在纯化PBS和血清中的ADOV之后，在不同的时间点(24、48、72和96小时)进行类似的测定，以测量与ADOV结合的双特异性抗体的稳定性。

实施例5

双特异性抗体功能的体外测试

为了测试双特异性抗体在体外结合两种靶抗原(例如，HSV-1gG和肿瘤特异性CEACAM6或EpCAM)的能力，使用BLItz系统进行结合测定。简言之，用重组gG胞外结构域蛋白包被生物传感器。然后，将包被的生物传感器与纯化的双特异性抗体接触，然后与纯化的CEACAM6或EpCAM蛋白接触。

实施例6

每个病毒颗粒与Spycatcher修饰的oHSV结合的SpyTag抗体的量的确定

用Spycatcher/SpyTag-抗体(抗CEACAM6或抗EpCAM抗体)修饰的oHSV通过将含有Spycatcher的oHSV与纯化的SpyTag融合抗体孵育，然后通过凝胶过滤层析除去未缀合的SpyTag融合抗体来产生和纯化。

进行ELISA测定以定量SpyTag抗体或Spycatcher的量，如图3所示。为了测量结合的SpyTag-抗体，用Spycatcher/SpyTag修饰的病毒的裂解物包被板。识别与SpyTag缀合的抗体的抗体被用作初级抗体，随后是二抗用于定量。为了测量未缀合的(游离的)Spycatcher，用Spycatcher/SpyTag修饰的病毒的相同裂解物包被板。与未缀合的/游离的Spycatcher结合的GFP标记的SpyTag用作”初级抗体”，随后是第二抗GFP抗体用于定量(使用Spycatcher/SpyTag-抗-CEACAM6包被的oHSV的图示显示在图3中)。然后将GFP-标记的Spycatcher克隆到表达载体中用于表达和纯化，如本文所述。使用本文所述的方法计算与Spycatcher缀合的SpyTag抗体的效率和每个病毒颗粒与Spycatcher修饰的oHSV结合的SpyTag抗体的量。

实施例7

Spycatcher-gC或Spycatcher-gG构建体的验证

使用GFP融合的SpyTag验证Spycatcher-gC或Spycatcher-gG构建体。将GFP-SpyTag克隆到表达载体中，其中融合蛋白与TEV(烟草蚀刻病毒)切割位点，6xHis标签和人Fc1顺序连接。在序列确认后，使用PEI转染在2升的游离型293细胞的悬浮培养物中表达重组GFP-SpyTag蛋白。72小时后，收集上清液，通过蛋白质-G和HiTrap钴柱依次纯化融合蛋白，得到0.5-1.0mg纯GFP-SpyTag。将过量纯化的GFP-SpyTag加入Spycatcher-gC或Spycatcher-gG突变体中，使混合物通过凝胶过滤柱以去除未结合的GFP-SpyTag。为了确认病毒已经成功地通过Spycatcher/SpyTag系统用GFP包被，在将病毒附着到允许细胞后，使用流式细胞仪测量GFP⁺病毒。

实施例8

确定HSV-1gG或gC胞外结构域中的缺失对溶瘤HSV-1感染性的影响的测定

构建在gC或gG的胞外结构域中具有缺失的突变HSV-1病毒，并将其用于感染多种肿瘤细胞系，包括人肺癌细胞H460，乳腺癌细胞MDA-MB-231，结肠癌细胞LS174，前列腺癌细胞LNCAP和膀胱癌细胞UMUC3。为了比较，正常细胞(例如，购自ATCC的人成纤维细胞)也被相同的突变体感染；将HSV-1的亲本菌株用作感染性的对照。将细胞与病毒孵育1小时以允许感染，然后用PBS洗涤三次以去除任何剩余的细胞外病毒。在3小时和72小时收集总细胞裂解物，然后进行qPCR以测量病毒拷贝数。感染后3小时的病毒拷贝数显示病毒附着和进入细胞的效率，而感染后72小时的拷贝数反映病毒复制和子代病毒向相邻细胞传播的效率。如果在gG突变体的感染性或复制特性上没有观察到显著变化，而在gC突变体中仅观察到轻微降低的感染性，则可以推测后者可能是由病毒与宿主细胞表面上硫酸乙酰肝素的结合受损引起的，这是由于gC HS结合结构域的去除。

实施例9

抗体修饰oHSV的体外和体内肿瘤特异性测试

将纯化的ADOV和未修饰的oHSV-1与各种肿瘤细胞和非肿瘤细胞一起孵育。24和48小时后，用噬菌斑测定测试感染性和复制动力学。72小时后，用MTT细胞毒性测定测试病毒杀死肿瘤细胞的能力。预期在ADOV和它们的亲本溶瘤病毒之间在体外观察到类似的感染性和细胞杀伤。

将各种效价(10⁴至10⁷pfu)的ADOV或它们的亲本病毒通过尾静脉静脉内注射到携带人肿瘤的裸鼠或SCID小鼠中。在注射后的不同时间点(30分钟，1小时，4小时，12小时，24小时和72小时)对动物进行人性化处死，收集肿瘤组织样品和来自所有主要器官的组织的样品，并通过Q-PCR进行分析，以定量病毒基因组拷贝数，从而测量病毒的生物分布。与来自健康器官的组织相比，预期在肿瘤组织中发现更高的病毒拷贝数。

为了观察功效，允许一些动物在注射ADOV或亲本病毒后存活更长时间。每隔一天测量肿瘤大小。病毒生物分布也在病毒处理后肿瘤消退后在动物中测量。与亲本病毒相比，预期ADOV需要较少量的病毒以实现类似水平的肿瘤抑制。

实施例10

SpyTag-抗-CEACAM6-Spycatcher蛋白缀合物的产生

SpyTag-抗-CEACAM6是包含针对与SpyTag蛋白融合的CEACAM6肿瘤抗原产生的单一结构域抗体的融合蛋白。为了产生用于缀合的重组SpyTag-抗-CEACAM6，在FreeStyle293细胞中表达SpyTag-抗-CEACAM6-Fc蛋白，并使用蛋白G柱纯化，随后是TEV切割以去除Fc标签。重组Spycatcher蛋白在大肠杆菌BL21 DE3 pLysS细胞中表达，并用Colbalt亲和柱从细胞裂解物中纯化。为了缀合纯化的Spycatcher和SpyTag-抗-CEACAM6蛋白，将5μMSpycatcher与10μM SpyTag-抗-CEACAM6混合，并将混合物在4℃下孵育过夜。缀合反应的产物通过SDS/PAGE分析，然后进行考马斯染色。如图4所示，Spycatcher-SpyTag-抗-CEACAM6缀合物(泳道1，顶部条带)相对于未缀合的SpyTag-抗-CEACAM6(泳道2)和Spycatcher(泳道3)蛋白迁移为较高分子量的蛋白。

实施例11

SpyTag-抗-CEACAM6与表达Spycatcher的病毒的结合的定量

进行ELISA测定以定量SpyTag-抗-CEACAM6与经工程改造以表达Spycatcher蛋白的病毒的结合。简言之，将不同浓度的重组SpyTag-抗-CEACAM6预包被到MaxiSorp ELISA板上，并在4℃下孵育过夜。第二天，将表达Spycatcher的病毒或对照病毒加入到ELISA板的每个孔中，并将该板在室温下孵育2小时。然后洗涤板，通过加入小鼠IgG Fc缀合的抗gD单一结构域抗体(抗gD-mFc)，HRP缀合的抗小鼠IgG抗体(抗mFc-HRP)和底物3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)，检测病毒与SpyTag-抗-CEACAM6蛋白的结合，如图5所示。使用酶标仪(Molecular Devices)在450nm下进行吸光度测量。结果示于图5中，其比较了由固定的SpyTag-抗-CEACAM6蛋白(由实心条表示)保留的表达Spycatcher的病毒的量与不表达Spycatcher的对照病毒(由阴影条表示)的量。这些数据表明，经改造以表达Spycatcher蛋白的病毒以剂量依赖性方式特异性结合SpyTag-抗-CEACAM6蛋白。

实施例12

SpyTag-抗-CEACAM6融合蛋白介导的体外病毒重靶向

为了产生用SpyTag-抗-CEACAM6融合蛋白包被的病毒，将经工程改造以表达Spycatcher蛋白的病毒与纯化的重组SpyTag-抗-CEACAM6蛋白孵育；通过使混合物通过旋转柱除去未结合的蛋白质。然后用病毒的连续稀释液评价包被的病毒感染CT26-CEACAM6细胞的能力。简言之，将病毒稀释液与细胞孵育1小时，然后通过用PBS洗涤细胞除去未附着的病毒。制备细胞裂解物，24或48小时后从每个裂解物中提取总DNA样品。使用设计用于与病毒ICP27基因退火的引物，通过对纯化的病毒DNA进行qPCR来测量病毒拷贝数。如图6所示，用SpyTag-抗-CEACAM6蛋白包被的Spycatcher病毒(对应于缩写为“抗-CEACAM6”的样品)在CT26-CEACAM6细胞中始终产生比未包被的病毒对照(对应于缩写为“Spycatcher”的样品)更高的病毒拷贝数。(密集阴影柱代表24小时后提取DNA的样品，而松散阴影柱代表48小时后提取DNA的样品)。这些结果表明，CEACAM的单一结构域抗体能够将病毒靶向CEACAM6肿瘤标志物表达阳性的细胞。

实施例13

o-HSV-1和抗-gD-抗-CEACAM6双特异性抗体之间的相互作用的评价

为了研究o-HSV-1结合抗-gD-抗-CEACAM6双特异性抗体的能力，进行ELISA测定。简言之，将0.25μg的抗-gD-抗-CEACAM6双特异性抗体预包被于MaxiSorp ELISA板上，然后在4℃下孵育过夜。第二天，向每个孔中加入oHSV-1，将板在室温下孵育2小时。然后洗涤板，通过与抗-gD单一结构域抗体(抗-gD-mFc)缀合的小鼠IgG Fc，HRP缀合的抗-小鼠IgG抗体(抗-mFC-HRP)和底物3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)检测oHSV-1与双特异性抗体的相互作用。使用酶标仪(Molecular Devices)在450进行吸光度测量。结果如图7所示，表明病毒与ELISA板的结合高度依赖于固定的抗-gD-抗-CEACAM6双特异性抗体的存在。

实施例14

检测Spycatcher蛋白与病毒蛋白融合的能力

制备表达构建体，其中Spycatcher的编码区与HSV-1gC的N-末端(在氨基酸19和20之间开始)或gG的N-末端(在氨基酸27和28之间开始)的编码区同框融合。Spycatcher的C-末端通过肽接头与病毒抗原的其余部分连接。得到的融合蛋白的简化图示在图8A中给出。Vero细胞用工程改造以表达Spycatcher-gC或Spycatcher-gG融合蛋白的病毒感染。48小时后，将细胞在冰上的RIPA缓冲液中裂解，并在15,000rpm离心10分钟后收集上清液。为了检测融合蛋白，进行Western印迹，其中细胞裂解物在SDS-PAGE上运行，然后转移到硝化纤维膜上。用SpyTag-Neongreen-hFc探测膜，然后与辣根过氧化物缀合的山羊抗人-Fc抗体反应。结果示于图8B中。令人惊奇的是，Spycatcher只能在感染Spycatcher-gC突变病毒的细胞中检测到。这表明Spycatcher插入病毒蛋白的精确位置对于保持Spycatcher抗原性是关键的。

以下是本公开的另外的示例性实施方案：

1)表达共价结合对的一个成员(CBP1)的溶瘤病毒。

2)根据实施方案1所述的溶瘤病毒，其中所述共价结合对的成员(CBP1)编码在所述病毒不负责感染或复制的区域内。在本发明的其它实施方案中，CPB1可以在病毒感染或复制中起作用。

3)根据实施方案2所述的溶瘤病毒，其中所述CBP1编码在所述膜相关病毒表面蛋白(例如包膜蛋白)的细胞外结构域的不负责所述溶瘤病毒感染的任何部分中。在本发明的其它实施方案中，CBP1编码在负责溶瘤病毒感染的细胞外结构域的一部分内。

4)根据实施方案1至3中任一项所述的溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒选自溶瘤腺病毒和溶瘤牛痘病毒。

5)根据实施方案1至3中任一项所述的溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒是溶瘤疱疹病毒。

6)根据实施方案5所述的溶瘤病毒，其中所述溶瘤疱疹病毒包膜蛋白选自gC、gE、gG、gI、gJ、gM、gN、UL24、UL43、UL45、UL56和US9。在进一步的实施方案中，包膜蛋白选自可在病毒感染或复制中起作用的组，例如gB、gD(US6)、gK和UL20。在权利要求1至6的其它实施方案内，CPB的代表性实例包括SpyTag/Spycatcher对。

7)包含两个连接的结合结构域的双特异性抗体，其中第一结合结构域靶向溶瘤病毒的包膜，并且第二结合结构域靶向肿瘤特异性抗原。

8)根据实施方案7所述的双特异性抗体，其中所述溶瘤病毒的包膜是疱疹病毒包膜。

9)根据实施方案8所述的双特异性抗体，其中所述疱疹病毒包膜选自gC、gE、gG、gI、gJ、gM、gN、UL24、UL43、UL45、UL56和US9。在进一步的实施方案中，包膜蛋白选自可在病毒感染或复制中起作用的组，例如gB、gD(US6)、gK和UL20。

10)包含两个连接的结合结构域的双特异性抗体，其中第一结合结构域是CBP的一个成员，并且第二结构域靶向肿瘤抗原。在本文提供的各实施方案内，CPB的代表性实例包括SpyTag/Spycatcher对。

11)根据实施方案10所述的双特异性抗体，其中所述第一结合结构域是SpyTag(AHIVMVDAYKPTK)(SEQ ID No.6)。在其它实施方案中，第一结合结构域是Spycatcher。

12)根据实施方案7-11中任一项所述的双特异性抗体，其中所述肿瘤抗原选自CDK-1、COX-2、CRISP3、ESO-1、HER-2、MAGE-A1、MAGE-2、MAGE-A3、MAGE-B6、MAPPK1、MICA、NY-ES-01、OLIG2、p53、ras、TRP-1、TRP-2、WT-1、XAGE2和ZNF165。

13)根据实施方案7至12中任一项所述的双特异性抗体，其中所述肿瘤抗原是CEACAM6或EpCAM。

14)根据实施方案7至13中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第一结合结构域通过肽接头(GSGGMHAAAAAGS)(SEQ ID No.7)与所述第二结合结构域连接。

15)包含溶瘤病毒和在所述病毒表面上的靶向部分的组合物，其中所述溶瘤病毒不编码或表达所述一种或多种靶向部分。

16)根据实施方案15所述的组合物，其中所述溶瘤病毒选自溶瘤腺病毒，溶瘤疱疹病毒和溶瘤牛痘病毒。

17)根据实施方案15或16所述的组合物，其中所述溶瘤病毒表达共价结合对(CBP)的成员。在各实施方案中，CPB是SpyTag/Spycatcher对。

18)根据实施方案17所述的组合物，其中所述CPB的成员是Spycatcher。在其它实施例内，CPB的所述成员是SpyTag。

19)根据实施方案15至18中任一项所述的组合物，其中所述靶向部分是抗体。

20)根据实施方案19所述的组合物，其中所述抗体是双特异性抗体。

21)根据实施方案19所述的组合物，其中所述双特异性抗体是根据实施方案7至14中任一项所述的双特异性抗体。

22)根据实施方案15至21中任一项所述的组合物，所述组合物还包含抗糖蛋白D抗体。在本发明的相关实施方案中，抗体阻断gD介导的调节HSV趋向性的连接素-1、HVEM和修饰的硫酸乙酰肝素的靶向。

23)药物组合物，其包含根据实施方案1至14中任一项所述的组合物以及药学上可接受的赋形剂。

24)药物组合物，其包含根据实施方案15至22中任一项所述的组合物以及药学上可接受的赋形剂。

25)用于治疗癌症的方法，其包括向患者施用根据实施方案24所述的药物组合物。在进一步的实施方案中，组合物可以通过多种方法递送，例如肿瘤内或静脉内。

26)根据实施方案25所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌，结肠癌或脑癌。

27)根据实施方案25所述的方法，其还包括在施用实施方案15-21中任一项所述的药物组合物的步骤之前，期间或之后施用化学疗法、放射疗法和/或免疫疗法的步骤。

本文引用或提及的所有专利、出版物、科学文章、网站以及其它文献和材料指示本发明所属领域的技术人员的技术水平，并且每个这样的引用文献和材料均通过引用并入本文，其程度如同其通过引用单独整体并入或以其整体示出。申请人保留将来自任何这样的专利，出版物，科学文章，网站，电子可获得的信息和其它参考材料或文献的任何和所有材料和信息物理并入本说明书的权利。

本专利的书面描述部分包括所有权利要求。此外，所有权利要求，包括所有原始权利要求以及来自任何和所有优先权文件的所有权利要求，在此通过引用整体并入到说明书的书面描述部分中，并且申请人保留了将任何和所有这样的权利要求物理并入本申请的书面描述或任何其它部分中的权利。因此，例如，在任何情况下，该专利都不能被解释为声称没提供关于权利要求书的书面描述，声称该权利要求书的精确措辞在该专利的书面描述部分中没有用同样的措辞示出。

权利要求将根据法律进行解释。然而，尽管声称或察觉到解释任何权利要求或其部分的容易或困难，但是在任何情况下，在对导致本专利的一个或多个申请进行审查的过程中，对权利要求或其任何部分的任何调整或修改都不能被解释为对不形成现有技术的一部分的任何和所有等同物丧失任何权利。

本说明书中公开的所有特征可以以任何组合方式组合。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅是等同或类似特征的一般系列的示例。

应当理解，虽然已经结合其详细描述描述了本发明，但是上述描述旨在说明而不是限制由所附权利要求书的范围限定的本发明的范围。因此，从上文可以理解，尽管本文为了说明的目的描述了本发明的特定非限制性实施例，但是可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下进行各种修改。其它方面，优点和修改在所附权利要求的范围内，并且本发明除了由所附权利要求限定之外不受限制。

本文所述的具体方法和组合物是优选的非限制性实施方案的代表，并且是示例性的，并不旨在限制本发明的范围。本领域技术人员在考虑本说明书时将会想到其它目的，方面和实施方案，并且这些目的，方面和实施方案被包括在由权利要求书的范围限定的本发明的精神内。对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的范围和精神的情况下，可以对本文公开的发明进行各种替代和修改。本文中示例性描述的发明适当地可以在缺少任何一个或多个元件，或一个或多个限制(其在本文中没有被具体公开为必要的)的情况下实施。因此，例如，在本文的每个实例中，在本发明的非限制性实施方案或实例中，术语“包含”、“包括”，“含有”等应被扩展地且无限制地理解。在此示例性描述的方法和过程适当地可以以不同的步骤顺序来实施，并且它们不必限于在此或权利要求中指出的步骤顺序。

已经使用的术语和表述被用作描述性的术语而不是限制性的术语，并且在使用这样的术语和表述时没有意图排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同物，但是应当认识到，在所要求保护的本发明的范围内，各种修改是可能的。因此，应当理解，尽管通过各种非限制性实施方案和/或优选的非限制性实施方案和任选的特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以采用的本文公开的概念的任何和所有修改和变化都被认为在由所附权利要求限定的本发明的范围内。

本文中已经广泛和一般地描述了本发明。落入一般性公开内容内的较窄种类和次一般性分组中的每一个也构成本发明的一部分。这包括本发明的一般描述，其条件或负面限制将任何主题从类中去除，而不管所去除的材料是否在本文中具体陈述。

还应理解，如本文和所附权利要求中所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数引用，除非上下文另外清楚地规定，术语“X和/或Y”意指“X”或“Y”或“X”和“Y”两者，并且跟随名词的字母“s”表示该名词的复数和单数形式。此外，在本发明的特征或方面是根据马库什组描述的情况下，预期地并且本领域技术人员将认识到，本发明也包括并由此根据马库什组的任何单个成员和任何成员亚组描述，并且申请人保留修改申请或权利要求的权利以具体地指代马库什组的任何单个成员或任何成员亚组。

其它非限制性实施方案在以下权利要求范围内。该专利不能被解释为限于本文具体和/或明确公开的具体实例或非限制性实施方案或方法。在任何情况下，该专利都不能被解释为由专利商标局的任何审查员或任何其他官员或雇员作出的任何声明所限制，除非该声明被申请人在答复文字中明确地并且没有资格或保留地明确采用。

序列表

<110> 复诺健生物科技加拿大有限公司

<120> 靶向部分修饰的溶瘤病毒

<130> VIRO.405Pc

<150> US 62/587,103

<151> 2017-11-16

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 148

<212> PRT

<213> 单纯疱疹病毒1型（Herpes simplex virus type 1）

<400> 1

Asn Val Ser Ser Thr Thr Gln Pro Gln Leu Gln Thr Thr Gly Arg Pro

1 5 10 15

Ser His Glu Ala Pro Asn Met Thr Gln Thr Gly Thr Thr Asp Ser Pro

20 25 30

Thr Ala Ile Ser Leu Thr Thr Pro Asp His Thr Pro Pro Met Pro Ser

35 40 45

Ile Gly Leu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Ala Gly Asp Gly Glu

50 55 60

His Leu Glu Gly Gly Asp Gly Thr Arg Asp Thr Leu Pro Gln Ser Pro

65 70 75 80

Gly Pro Ala Phe Pro Leu Ala Glu Asp Val Glu Lys Asp Lys Pro Asn

85 90 95

Arg Pro Val Val Pro Ser Pro Asp Pro Asn Asn Ser Pro Ala Arg Pro

100 105 110

Glu Thr Ser Arg Pro Lys Thr Pro Pro Thr Ile Ile Gly Pro Leu Ala

115 120 125

Thr Arg Pro Thr Thr Arg Leu Thr Ser Lys Gly Arg Pro Leu Val Pro

130 135 140

Thr Pro Gln His

145

<210> 2

<211> 119

<212> PRT

<213> 单纯疱疹病毒1型（Herpes simplex virus type 1）

<400> 2

Asp Ser Pro Thr Ala Ile Ser Leu Thr Thr Pro Asp His Thr Pro Pro

1 5 10 15

Met Pro Ser Ile Gly Leu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Ala Gly

20 25 30

Asp Gly Glu His Leu Glu Gly Gly Asp Gly Thr Arg Asp Thr Leu Pro

35 40 45

Gln Ser Pro Gly Pro Ala Phe Pro Leu Ala Glu Asp Val Glu Lys Asp

50 55 60

Lys Pro Asn Arg Pro Val Val Pro Ser Pro Asp Pro Asn Asn Ser Pro

65 70 75 80

Ala Arg Pro Glu Thr Ser Arg Pro Lys Thr Pro Pro Thr Ile Ile Gly

85 90 95

Pro Leu Ala Thr Arg Pro Thr Thr Arg Leu Thr Ser Lys Gly Arg Pro

100 105 110

Leu Val Pro Thr Pro Gln His

115

<210> 3

<211> 92

<212> PRT

<213> 单纯疱疹病毒1型（Herpes simplex virus type 1）

<400> 3

Glu Glu Gly Ala Gly Asp Gly Glu His Leu Glu Gly Gly Asp Gly Thr

1 5 10 15

Arg Asp Thr Leu Pro Gln Ser Pro Gly Pro Ala Phe Pro Leu Ala Glu

20 25 30

Asp Val Glu Lys Asp Lys Pro Asn Arg Pro Val Val Pro Ser Pro Asp

35 40 45

Pro Asn Asn Ser Pro Ala Arg Pro Glu Thr Ser Arg Pro Lys Thr Pro

50 55 60

Pro Thr Ile Ile Gly Pro Leu Ala Thr Arg Pro Thr Thr Arg Leu Thr

65 70 75 80

Ser Lys Gly Arg Pro Leu Val Pro Thr Pro Gln His

85 90

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> 合成的

<400> 4

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 5

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> 合成的

<400> 5

Lys Arg Val Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

1 5 10

<210> 6

<211> 13

<212> PRT

<213> 化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）

<400> 6

Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys

1 5 10

<210> 7

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<221>

<222>

<223> 合成的

<400> 7

Gly Ser Gly Gly Met His Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser

1 5 10

Claims

1.溶瘤病毒，其表达共价结合对的一个成员(CBP1)。

2.如权利要求1所述的溶瘤病毒，其中所述共价结合对的成员(CBP1)编码在病毒不负责感染或复制的区域内。

3.如权利要求2所述的溶瘤病毒，其中所述CBP1编码在不负责所述溶瘤病毒感染的包膜蛋白内。

4.如权利要求1-3中任一项所述的溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒选自溶瘤腺病毒和溶瘤牛痘病毒。

5.如权利要求1-3中任一项所述的溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒是溶瘤疱疹病毒。

6.如权利要求5所述的溶瘤病毒，其中所述溶瘤疱疹病毒包膜蛋白选自gB、gC、gD、gEgC、gD、gE、gG、gI、gJ、gK、gM、gN、UL20、UL24、UL43、UL45、UL56和US9。

7.包含两个连接的结合结构域的双特异性抗体，其中第一结合结构域靶向溶瘤病毒的包膜，并且第二结合结构域靶向肿瘤特异性抗原。

8.如权利要求7所述的双特异性抗体，其中所述溶瘤病毒的包膜是疱疹病毒包膜。

9.如权利要求8所述的双特异性抗体，其中所述疱疹病毒包膜选自gB、gC、gD、gE、gG、gI、gJ、gK、gM、gN、UL20、UL24、UL43、UL45、UL56和US9。

10.包含两个连接的结合结构域的双特异性抗体，其中第一结合结构域是共价结合对的一个成员，并且第二结构域靶向肿瘤抗原。

11.如权利要求10所述的双特异性抗体，其中所述第一结合结构域是SpyTag(AHIVMVDAYKPTK)(SEQ ID No.6)。

12.如权利要求7-11中任一项所述的双特异性抗体，其中所述肿瘤抗原选自CDK-1、COX-2、CRISP3、ESO-1、HER-2、MAGE-A1、MAGE-2、MAGE-A3、MAGE-B6、MAPPK1、MICA、NY-ES-01、OLIG2、p53、ras、TRP-1、TRP-2、WT-1、XAGE2和ZNF165。

13.如权利要求7-12中任一项所述的双特异性抗体，其中所述肿瘤抗原是CEACAM6或EpCAM。

14.如权利要求7至13任一项所述的双特异性抗体，其中所述第一结合结构域通过肽接头(GSGGMHAAAAAGS)(SEQ ID No.7)与所述第二结合结构域连接。

15.组合物，其包含溶瘤病毒和在所述病毒表面上的靶向部分，其中所述溶瘤病毒不编码或表达所述一种或多种靶向部分。

16.如权利要求15所述的组合物，其中所述溶瘤病毒选自溶瘤腺病毒、溶瘤疱疹病毒和溶瘤牛痘病毒。

17.如权利要求15或16所述的组合物，其中所述溶瘤病毒表达共价结合对(CBP)的成员。

18.如权利要求17所述的组合物，其中所述CPB的成员是Spycatcher。

19.如权利要求15至18任一项所述的组合物，其中所述靶向部分是抗体。

20.如权利要求19所述的组合物，其中所述抗体是双特异性抗体。

21.如权利要求19所述的组合物，其中所述双特异性抗体是如权利要求7至14中任一项所述的双特异性抗体。

22.药物组合物，其包含权利要求1至14中任一项所述的组合物以及药学上可接受的赋形剂。

23.药物组合物，其包含权利要求15至21中任一项所述的组合物以及药学上可接受的赋形剂。

24.治疗癌症的方法，其包括向患者施用权利要求22或23所述的药物组合物。

25.如权利要求25所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌、结肠癌或脑癌。

26.如权利要求25所述的方法，其还包括在施用权利要求15-21中任一项所述的药物组合物的步骤之前，期间或之后施用化学疗法、放射疗法和/或免疫疗法的步骤。