KR20170139020A - 항체 조합물을 이용한 바이러스요법 - Google Patents

항체 조합물을 이용한 바이러스요법 Download PDF

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Abstract

본 명세서에서는 암의 치료 방법에서 사용할 수 있는 바이러스를 개시한다. 보다 구체적으로, 상기 바이러스는 효과적인 항종양 면역 반응을 유도하는 2종 이상의 항체를 발현한다. 상기 바이러스는 또한 진단 방법에서 사용할 수 있다.

Description

항체 조합을 사용한 바이러스 요법
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2015년 3월 18일자로 출원된 미국 가출원 제62/135,096호에 대한 이득 및 우선권을 주장하며, 이 기초 출원의 전체 내용은 참고로 본 명세서에 편입된다.
암은 오직 심장 질환 다음으로, 미국에서 두 번째로 가장 일반적인 사망 원인이다. 미국에서, 암은 사망자 4명마다 1명 꼴로 그 원인이 된다. 1996 내지 2003년에 진단받은 모든 암 환자에 대한 5년간 상대적 생존율은 66%이고, 1975 내지 1977년에는 최대 50%였다(Cancer Facts & Figures American Cancer Society: Atlanta, GA (2008)). 고도로 효율적인 암 치료의 발견이 암 연구의 주요 목표이다.
본 발명은 대체로 인간 암의 치료, 보다 구체적으로 효율적인 항종양 면역 반응을 유도하기 위해 조합시킨 몇몇 치료 양식의 용도에 관한 것이다.
본 명세서에서는, 일부 실시형태에서, 종양에서 세포를 감염시킬 수 있는 재조합 바이러스, 또는 종양에서 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스를 포함하는 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 고형 종양을 치료하기 위한 방법을 개시하고, 상기 바이러스는 (i) 종양 미세환경(TME)을 표적으로 하는 2종 이상의 항체; (ii) TME를 표적으로 하는 2종 이상의 자극성 또는 억제성 단백질; 또는 (iii) TME를 표적으로 하는 적어도 1종의 항체 및 TME를 표적으로 하는 적어도 1종의 자극성 또는 억제성 단백질을 발현한다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 종양세포붕괴성 바이러스이다. 일부 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 백시니아 바이러스이다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 복제 능력있는 종양세포붕괴성 백시니아 바이러스(VACV)이다. 일부 실시형태에서, 상기 바이러스는 TME를 표적으로 하는 2종 이상의 항체를 발현한다. 일부 실시형태에서, 2종 이상의 항체는 (i) 혈관생성 및/또는 혈관신생을 자극하는 단백질에 결합하는 항체, (ii) 상피 성장 인자 수용체(EGFR), Her2/c-neu, Her3 및 Her4로 이루어진 군으로부터 선택된 수용체 티로신 키나제에 결합하는 항체, 및 (iii) 상피-중간엽 상호작용의 발생에 관여하는 단백질에 결합하는 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 2종 이상의 항체는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)에 결합하는 항체, 상피 성장 인자 수용체(EGFR)에 결합하는 항체, 및 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 결합하는 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 2종 이상의 항체 중 1종은 VEGF에 결합하는 항체이다. 일부 실시형태에서, VEGF에 결합하는 항체는 G6-31이다. 일부 실시형태에서, 2종 이상의 항체 중 1종은 EGFR에 결합하는 항체이다. 일부 실시형태에서, EGFR에 결합하는 항체는 항-EGFRVHH이다. 일부 실시형태에서, 2종 이상의 항체 중 1종은 FAP에 결합하는 항체이다. 일부 실시형태에서, FAP에 결합하는 항체는 M036이다. 일부 실시형태에서, 2종 이상의 항체는 VEGF에 결합하는 항체 및 EGFR에 결합하는 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 2종 이상의 항체는 VEGF에 결합하는 항체 및 FAP에 결합하는 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 2종 이상의 항체는 EGFR에 결합하는 항체 및 FAP에 결합하는 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, VACV는 GLV-1h444 및 GLV-1h446에서 선택된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 추가의 암요법을 투여하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 추가의 암요법은 방사선 요법, 화학요법, 면역요법, 광선요법, 및 이들의 조합에서 선택된다. 일부 실시형태에서, 종양은 교아세포종, 유방 암종, 폐 암종, 전립선 암종, 결장 암종, 난소 암종, 신경아세포종, 중추신경계 종양, 및 흑색종에서 선택된다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 대상체에게 정맥내로 전달된다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 종양에 직접 정맥내로 전달되거나, 또는 종양 영역 내로 대상체에게 전달된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 종양에서 세포를 감염시킬 수 있는 적어도 1종의 추가의 바이러스를 대상체에게 제공하는 단계를 더 포함하고, 상기 바이러스는 1종 이상의 (i) 종양 미세환경(TME)을 표적으로 하는 항체 또는 (ii) TME를 표적으로 하는 자극성 또는 억제성 단백질을 발현하고, 적어도 1종의 추가의 바이러스는 (i) 종양 미세환경(TME)을 표적으로 하는 항체 또는 (ii) TME를 표적으로 하는 자극성 또는 억제성 단백질을 발현하는 바이러스와는 상이한 1종 이상의 (i) TME를 표적으로 하는 항체 또는 (ii) TME를 표적으로 하는 자극성 또는 억제성 단백질을 발현한다.
본 명세서에서는, 일부 실시형태에서, 고형 종양에서 세포를 감염시킬 수 있는 재조합 바이러스를 개시하고, 상기 바이러스는 (i) 종양 미세환경(TME)을 표적으로 하는 2종 이상의 항체; (ii) TME를 표적으로 하는 2종 이상의 자극성 또는 억제성 단백질, 또는 (iii) TME를 표적으로 하는 적어도 1종의 항체 및 TME를 표적으로 하는 자극성 또는 억제성 단백질 중 적어도 1종을 발현한다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 종양세포붕괴성 바이러스이다. 일부 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 백시니아 바이러스이다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 복제 능력있는 종양세포붕괴성 백시니아 바이러스(VACV)이다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 2종 이상의 항체를 발현한다. 일부 실시형태에서, 2종 이상의 항체는 (i) 혈관생성 및/또는 혈관신생을 자극하는 단백질에 결합하는 항체, (ii) 상피 성장 인자 수용체(EGFR), Her2/c-neu, Her3 및 Her4로 이루어진 군으로부터 선택되는 수용체 티로신 키나제에 결합하는 항체, 및 (iii) 상피-중간엽 상호작용의 발생에 관여하는 단백질에 결합하는 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)에 결합하는 항체, 상피 성장 인자 수용체(EGFR)에 결합하는 항체, 및 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 결합하는 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 항체를 코딩하거나 또는 발현하는 2 이상의 이종성 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 2종 이상의 항체 중 1종은 VEGF에 결합하는 항체이다. 일부 실시형태에서, VEGF에 결합하는 항체는 G6-31이다. 일부 실시형태에서, 2종 이상의 항체 중 1종은 EGFR에 결합하는 항체이다. 일부 실시형태에서, EGFR에 결합하는 항체는 항-EGFRVHH이다. 일부 실시형태에서, 2종 이상의 항체 중 1종은 FAP에 결합하는 항체이다. 일부 실시형태에서, FAP에 결합하는 항체는 M036이다. 일부 실시형태에서, 2종 이상의 항체는 VEGF 및 EGFR에 결합하는 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 2종 이상의 항체는 VEGF 및 FAP에 결합하는 항체에 결합하는 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 2종 이상의 항체는 EGFR에 결합하는 항체 및 FAP에 결합하는 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, VACV는 GLV-1h444 및 GLV-1h446에서 선택된다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 리스터 균주(lister strain)이다. 일부 실시형태에서, A34R 유전자는 다른 백시니아 바이러스 바이러스주 유래의 A34R로 치환된다. 일부 실시형태에서, A34R 유전자는 백시니아 IHD-J 바이러스주 유래의 A34R 유전자로 치환된다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 A35R 유전자의 결실을 포함한다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 진단 또는 치료 단백질을 코딩하는 추가의 이종성 핵산 분자를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 추가의 이종성 핵산 분자는 진단 단백질을 코딩한다. 일부 실시형태에서, 진단 단백질은 루시퍼라제, 형광발광성 단백질, 철 저장 분자, 철 수송인자, 조영제에 결합하는 철 수용체 또는 조영제에 결합하는 단백질, 발색단 또는 검출할 수 있는 화합물 또는 검출가능 리간드 중에서 선택된다. 일부 실시형태에서, 추가의 이종성 핵산 분자는 치료 단백질을 코딩한다. 일부 실시형태에서, 치료 단백질은 사이토카인, 케모카인, 면역조절성 분자, 항원, 단쇄 항체, 안티센스 RNA, 프로드러그 전환 효소, siRNA, 혈관생성 억제제, 독소, 항종양 올리고펩타이드, 유사분열 억제제 단백질, 항유사분열 올리고펩타이드, 항암 폴리펩타이드 항생제, 및 조직 인자 중에서 선택된다.
본 명세서에서는, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 재조합 바이러스를 포함하는 숙주 세포를 개시한다.
본 명세서에서는, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 재조합 바이러스를 포함하는 종양 세포를 개시한다.
본 명세서에서는, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 재조합 바이러스를 포함하거나 또는 그에 감염된 포유동물 유기체를 개시한다.
본 명세서에서는 대상체에서 종양의 치료를 위한, 본 명세서에 개시된 바와 같은, 재조합 백시니아 바이러스의 용도를 더 개시한다.
본 명세서에서는 대상체에서 종양의 치료를 위한 약학 조성물의 제조를 위한, 본 명세서에 개시된 바와 같은, 백시니아 바이러스의 용도를 개시한다. 일부 실시형태에서, 약학 조성물은 항암 화합물을 더 포함한다.
본 명세서에서는 또한 대상체에서 고형 종양을 치료하기 위한 방법에서, 종양에서 세포를 감염시킬 수 있는 재조합 바이러스, 또는 종양에서 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스를 포함하는 세포의 용도를 개시하고, 상기 방법은 대상체에게 종양에서 세포를 감염시킬 수 있는 재조합 바이러스, 또는 종양에서 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스를 포함하는 세포를 투여하는 단계를 포함하고, 상기 바이러스는 (i) 종양 미세환경(TME)을 표적으로 하는 2종 이상의 항체; (ii) TME를 표적으로 하는 2종 이상의 자극성 또는 억제성 단백질, 및 (iii) TME를 표적으로 하는 적어도 1종의 항체 및 TME를 표적으로 하는 적어도 1종의 자극성 또는 억제성 단백질을 발현한다.
도 1은 항체 및 신규한 VACV의 개략적인 대표도를 예시한다. (a) 항-EGFRVHHFLAG, 항-VEGF scAb(GLAF-2), 및 항-FAP scAb(GLAF-5) 구성체의 개략적인 다이어그램. (b) 부모 바이러스와 함께 신규한 재조합 VACV의 게놈 구조. GLV-1h442 및 GLV-1h282는 각각 PSEL 프로모터의 제어 하에서, 개별적으로 항-EGFRVHHFLAG 및 GLAF-5 카세트로 J2R 유전자좌에서 lacZ 발현 카세트를 치환시켜 GLV-1h68로부터 유도되었다. GLV-1h164는 lacZ 발현 카세트를 PSE 프로모터 하에 hNET으로 J2R 유전자좌에서 그리고 PSL 프로모터 하에 GLAF-2 카세트로 A56R 유전자좌에서 gusA 발현 카세트로 치환시켜 GLV-1h68로부터 유도되었다. GLV-1h444 및 GLV-1h446은 각각 VACV PSEL 프로모터 제어 하에서, 개별적으로 항-EGFRVHHFLAG 및 GLAF-5 발현 카세트로 J2R 유전자좌에서 hNET 발현 카세트를 치환시켜 GLV-1h164에서 유도시켰다. 모든 바이러스는 F14.5L 유전자좌에서 ruc-gfp 발현 카세트를 함유한다. PSE, PSEL, PSL, P11 및 P7.5는 개별적으로 VACV 합성 초기, 합성 초기/후기, 합성 후기, 11K 및 7.5K 프로모터이다.
도 2는 TME를 표적으로 하는 바이러스 발현된 개별 치료 항체가 A549 및 DU145 종양 이종이식편 모델에서 바이러스 요법을 유의하게 강화시킴을 예시한다. (a) GLV-1h164로부터 발현된 VEGF를 표적으로 하는 항체는 유의하게 바이러스 요법을 강화시켰다. A549 이종이식편 종양을 보유하는 마우스(n ≥ 7)를 바이러스 단독, 아바스틴 단독, PBS 단독, 또는 아바스틴과 조합한 바이러스로 처리하였다. 바이러스의 단일 용량(2 × 106 pfu/마우스)을 종양 부피가 450 ㎣에 도달했을 때 정맥내(i.v.)로 제공하였다. 아바스틴은 10 dpi에서 출발하여, 5주 동안 1주 당 2회, 5 ㎎/㎏의 용량으로 i.p. 투여하였다. 화살표는 아바스틴 치료의 시작 및 종료를 의미한다. 통계 분석은 일원 ANOVA를 사용해 수행하였다(***P < 0.001, **P < 0.01, *P <0.05). 별표는 GLV-1h164 그룹(검은색) 및 GLV-1h68+아바스틴 그룹(흰색)과 GLV-1h68 그룹의 비교를 나타낸다. αV는 항-VEGF를 나타낸다. (b) GLV-1h442로부터 발현되는 EGFR을 표적으로 하는 항체는 유의하게 바이러스 요법을 강화시켰다. A549 이종이식편 종양을 보유하는 마우스(n ≥ 7)는 바이러스 단독, 얼비툭스 단독, PBS 단독, 또는 얼비툭스와 조합한 바이러스로 처리하였다. 바이러스의 단일 용량(2 × 106 pfu/마우스)은 종양 부피가 450 ㎣에 도달했을 때 i.v.로 제공하였다. 얼비툭스는 10 dpi에서 출발하여, 5주 동안 1주 당 2회, 3 ㎎/㎏의 용량으로 i.p. 투여하였다. 화살표는 얼비툭스 처리의 시작 및 종료를 나타낸다. 통계 분석은 일원ANOVA를 사용해 수행하였다(**P < 0.01, *P < 0.05). 별표는 GLV-1H442 그룹과 GLV-1h68 그룹의 비교를 나타낸다. αE는 항-EGFR을 의미한다. (c) GLV-1h282로부터 발현되는 FAP를 표적으로 하는 항체는 유의하게 바이러스 요법을 강화시켰다. A549 이종이식편 종양을 보유하는 마우스(n ≥ 7)는 종양 부피가 450 ㎣에 도달했을 때 GLV-1h68 또는 GLV-1h282의 단일 용량(2 × 106 pfu/마우스)을 i.v. 주사하였다. 통계 분석은 일원 ANOVA를 사용해 수행하였다(**P < 0.01, *P < 0.05). 별표는 GLV-1h282 그룹과 GLV-1h68 그룹의 비교를 의미한다. αF는 항-FAP를 의미한다. (d) DU145 종양-보유 마우스(n = 5)는 종양 부피가 450 ㎣에 도달했을 때 각각의 VACV 균주(2 × 106 pfu/마우스)를 i.v. 주사하였고, 종양 부피를 이후에 매주 모니터링하였다. 통계 분석은 일원 ANOVA를 사용해 수행하였다(***P < 0.001, **P < 0.01, *P < 0.05). 별표는 GLV-1h164 그룹(검은색), GLV-1h282 그룹(흰색), 및 GLV-1h442 그룹(회색)과 GLV-1h68 그룹의 비교를 의미한다.
도 3은 TME상의 VEGF, EGFP, 및 FAP를 표적으로 하는 종양내 발현되는 항체의 영향을 예시한다. (a) DU145 종양 내 종양 혈관 구조에 대한 바이러스 처리의 효과(n = 3). 절개부는 CD31 발현(적색)에 대해 염색하였다. GFP 발현(녹색)은 바이러스 감염을 의미한다. (b) 혈관의 정량 분석은 슬라이드 당 8개 비중첩 미시적 시야의 CD31+ 혈관을 계측하여 수행하였다. 통계 분석은 양측 비대응 스튜던트 t-검정법으로 수행하였다(**P < 0.01, *P < 0.05). (c) DU145 종양에서 세포 증식에 대한 바이러스 처리의 효과(n = 3). 절개부는 Ki67 발현(적색)에 대해 염색하였다. GFP 발현(독색)은 바이러스 감염을 의미한다. 기준자는 a,c에서 1 mm를 나타낸다. (d) 세포 증식의 정량 분석은 슬라이드 당 8개 비중첩 미시적 시야에서 Ki67+ 세포를 계측하여 수행하였다. 통계 분석은 양측 비대응 스튜던트 t-검정법으로 수행하였다(**P < 0.01, *P < 0.05). (e) 바이러스 복제 및 기질생성의 면역조직화학적 특징. 포르말린-고정 및 파라핀-삽입된 종양 조직(그룹 당 n = 4-5)을 5-㎛ 절개부로 자르고 H&E 염색을 수행하였다. 인접한 절개부는 VACV에 대해 항-A27, 혈관에 대해 항-CD31 및 FAP+ 기질 세포에 대해 항-FAP로 염색하였다. (f) 막대 그래프는 감염 또는 미감염 영역에서 CD31+ 세포 및 FAP+ 기질 클러스터의 평균 수를 보여준다. 종양 당 5개 비중첩 시야에서 CD31+ 및 FAP+ 기질 클러스터(100× 배율)를 계측하였다. 통계 분석은 양측 비대응 스튜던트 t-검정법으로 수행하였다(**P < 0.01, *P < 0.05).
도 4는 FaDu 종양 성장이 항-FAP scab를 발현하는 GLV-1h282에 의해 어떻게 유의하게 억제되었는지를 예시한다. 그러나, FaDu 종양은 GLV-1h68의 처리에 반응하지 않았다.
도 5는 각각의 재조합 VACV가 어떻게 의도하는 항체를 발현했는지를 예시한다.
도 6은 2종 항체의 발현이 어떻게 바이러스 복제 효율에 대한 부정적 효과를 보이는지를 예시한다. 바이러스 복제 검정법은 0.01의 감염 다중도(MOI)로 A549 세포에서 수행하였다.
도 7은 TME를 표적으로 하는 바이러스 발현된 2종의 치료 항체가 바이러스 요법을 개선시킴을 예시한다. (a) A549 종양-보유 누드 마우스에서 GLV-1h444의 강화된 치료 효과. 마우스(n ≥ 7)는 바이러스 단독, 아바스틴+얼비툭스, PBS 단독, 또는 아바스틴 및 얼비툭스와 조합한 바이러스로 처리하였다. 바이러스의 단일 용량(2 × 106 pfu/마우스)을 종양 부피가 450 ㎣에 도달했을 때 i.v.로 제공하였다. 아바스틴 및 얼비툭스는 각각 10 dpi에서 시작하여, 5주 동안 주 당 2회로, 각각 5 ㎎/㎏ 및 3 ㎎/㎏의 용량으로 i.p. 투여하였다. 화살표는 아바스틴 및 얼비툭스 처리 시작 및 종료를 표시한다. 통계 분석은 일원 ANOVA를 사용해 수행하였다(***P < 0.001, **P < 0.01, *P < 0.05). 별표는 GLV-1h68 그룹과 GLV-1h444 그룹(검은색), GLV-1h68+아바스틴+얼비툭스 그룹(흰색), 및 PBS+아바스틴+얼비툭스 그룹(회색)의비교를 의미한다. (b) A549 종양-보유 누드 마우스에서 이의 부모 바이러스와 비교한 GLV-1h446의 강화된 치료 효과. 마우스(n ≥ 7)는 종양 부피가 450 ㎣에 도달했을 때 2 × 106 pfu/마우스의 용량으로 각 VACV 바이러스주 단독을 i.v. 주사받았다. 통계 분석은 일원 ANOVA를 사용해 수행하였다(***P < 0.001, **P < 0.01, *P < 0.05). 별표는 GLV-1h446 그룹(검은색)과 GLV-1h68 그룹의 비교를 의미한다. (c) DU145 종양-보유 마우스에서 이들의 부모 바이러스와 비교된 GLV-1h444 및 GLV-1h446의 강화된 치료 효과. 마우스(n = 5)는 종양 부피가 450 ㎣에 도달했을 때 2 × 106 pfu/마우스의 용량으로 각 VACV균주로 i.v. 주사되었다. 통계 분석은 일원 ANOVA를 사용해 수행하였다(***P < 0.001, **P < 0.01, *P < 0.05). 별표는 GLV-1h68 그룹과 GLV-1h444 그룹(검은색) 및 GLV-1h446 그룹(흰색)의 비교를 나타낸다. (d-f) VACV 처리 후 A549 종양을 보유하는 마우스에서 종양 부피의 변화 및 마우스 혈청 내 항체의 검출. 혈액 샘플은 안구 뒤에서 7, 21, 및 35 dpi에 채취하였다. 마우스 혈청 내 항체의 농도는 사전 코팅된 FAP, EGFR, 및 VEGF 플레이트로 ELISA를 통해 결정하였다. 종양은 디지털 칼리퍼로 측정하였다. 통계 분석은 양측 미대응 스튜던트 t-검정법으로 수행하였다(***P < 0.001).
도 8은 A549를 보유하는 개별 마우스의 종양 성장 곡선을 예시한다.
도 9는 표준 바이러스 플라크 검정법으로 결정시 14 dpi에서 A549 종양-보유 마우스의 상이한 장기 및 종양 내 바이러스 생체분포를 예시한다.
도 10은 마우스에서 항체-발현 VACV 투여의 가능한 역효과의 평가를 예시한다. 이 평가는 치료 과정 동안 순 체중의 변화를 평가하여 수행하였다. A549 및 DU145 종양 이종이식편 모델 둘 모두에서, 평균 순 체중의 유의한 변화는 임의의 치료 그룹 또는 대조 그룹에서 관찰되지 않았다.
도 11은 GLV-1h444 및 GLV-1h446에 의해 바이러스 발현된 2종 항체가 종양에서 세포 증식의 억제에 기여하는 것을 예시한다. (a) DU145 종양에서 VACV에 의한 세포 증식의 억제(n = 3). GFP 발현(녹색)은 바이러스 감염을 의미한다. 세포 증식은 항-Ki67 항체(적색)로 염색하여 조사하였다. (b, c) 미감염 또는 감염 영역에서 세포 증식의 정량 분석은 슬라이드 당 8개 비중첩 미시적 시야에서 Ki67+ 세포를 계측하여 수행하였다. 통계 분석은 양측 비대응 스튜던트 t-검정법을 사용해 수행하였다(**P < 0.01, *P < 0.05).
도 12는 GLV-1h444 및 GLV-1h446에 의한 바이러스 발현된 2종 항체가 종양에서 혈관생성의 억제에 기여함을 예시한다. (a) DU145 종양에서 VACV에 의해 감소된 종양 혈관구조(n = 3). 절개부는 항-CD31 항체(적색)로 염색하였다. GFP 발현(녹색)은 바이러스 감염을 의미한다. (b, c) 미감염 또는 감염 영역에서 혈관의 정량 분석은 슬라이드 당 8개 비중첩 미시적 시야에서 CD31+ 세포를 계측하여 수행하였다. 통계 분석은 양측 미대응 스튜던트 t-검정법을 사용해 수행하였다(***P < 0.001, **P < 0.01, *P < 0.05). 기준자는 a, d에서 1 mm를 나타낸다.
지난 30년간 항암 치료의 상당한 진보에도 불구하고, 암은 세계의 주요 사망 원인으로 남아있다. 암 성장 및 전이시 종양 미세환경(TME)의 중요 역할의 간과가 완전히 효과적인 암 치료를 찾기 힘들게 하는 이유 중 하나일 수 있다. 종양 기질에서 혈관생성 및 세포의 과증식은 암의 성장을 지원할 뿐만 아니라, 예를 들어, 전이에서 이의 발생의 원인이다.
TME 내 인자들, 예컨대, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 상피 성장 인자 수용체(EGFR), 및 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)은 암 개시 및 발생에서 핵심적인 역할을 한다. VEGF 또는 EGFR의 고수준 발생은 유방, 결장, 폐, 두경부 및 다른 암을 갖는 환자에서 좋지 못한 예후와 상관이 있다. 항-VEGF 단클론성 항체(mAb), 베바시주맙(아바스틴)은 전이성 결장암 및 이후 다른 전이성 암의 치료에 대해 2004년에 미국 식약청(FDA)에 의해 승인되었다. 같은 해에, 항-EGFR mAb, 세툭시맙(얼비툭스)이 또한 전이성 결장암의 치료에 대해 FDA에 의해 승인되었다. 그러나, 아바스틴 및 얼비툭스의 임상 효능은 아마도 불충분한 종양 침투 및 순환계로부터 mAb의 신속한 제거로 인해 어느 정도 제한적이어서, 빈번한 간격 및 광범위한 지속기간에 고용량의 투여를 필요로 하여, 요법이 극도로 값비싸졌다.
TME를 표적으로 하는 현행 mAb 요법제의 약력학적 특성의 개선 및 추가 기능의 동정은 상당히 유리할 수 있다. 예를 들어, G6-31은 아바스틴보다 동물 모델에서 더 나은 결합 친화성 및 강화된 요법 효능을 갖는 파지 디스플레이 라이브러리로부터 유도된 개선된 항-VEGF 항체이다. 종양 침투성을 개선시키기 위해, 라마 유래의 EGFR에 대한 15 kDa의 단일 도메인 항체를 최근에 개발하였다(항-EGFRVHH라고 함). 이러한 라마 나노바디는 마우스에서 비면역원성이었고 EGFR과 EGFR의 결합을 차단하는 것으로 증명되어서, EGFR 신호전달을 억제하고 특이적 종양 표적화를 보였다. 항-EGFRVHH는 분자 영상화 및 치료 적용분야에 사용된다. FAP(세프라제라고도 알려짐)는 고도로 보존된 단백질로서, 공격적인 암의 기질에서 특히 풍부하게 발현된다. 고수준의 FAP 발현은 암 진행과 상관있다. M036, 종-교차-반응성 FAP-특이적 단쇄 항체(scAb)는 순차적 파지 디스플레이로 단리되었고, 인간 종양 이종이식편의 마우스 숙주 기질 및 상이한 인간 암종의 기질 세포 상의 FAP에 결합하는 것으로 확인되었다. M036의 치료 잠재력은 아직 평가되지 않았다.
복제 능력있는 종양세포붕괴성 백시니아 바이러스(VACV) GLV-1h68은 단일 용량의 투여 후 인간 이종이식편 누드 마우스 모델의 종양 세포에 위치하여, 복제하고, 용해시킨다. 추가적으로, 재조합 VACV는 scAb를 포함하여, 기능성 이식유전자를 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다. G6-31의 서열에 따라 디자인된, 항-VEGF scAb GLAF-1을 발현하는 VACV가 부모 바이러스, GLV-1h68과 비교하여 마우스에서 항암 치료 효능이 유의하게 개선되었음이 이전에 확인된 바 있다. 치료 효능은 방사선 요법과 조합하여 더 강화되었다.
따라서, 신규한 TME-표적화된 항증식성 활성을 발현하는 신규한 재조합 VACV가 FAP에 대한 scAb(GLV-1h282) 및 EGFR에 대한 단일 도메인 항체(GLV-1h442)를 코딩하여 구축되었다. 이들 개별 항체를 발현하는 VACV는 이종이식 종양 모델에서 종양 성장을 유의하게 억제하여, 바이러스 발현된 항체의 기능성 및 치료 활성이 입증되었다. 마지막으로, 추가의 재조합 VACV는 VEGF 및 EGFR(GLV-1h444) 또는 VEGF 및 FAP(GLV-1h446)를 표적으로 하는 항증식성 및 항혈관생성 활성 둘 모두를 갖는 2종 항체를 코딩하는 것이 생성되었다. TME를 표적으로 하는 항체를 발현하는 신규한 VACV는 단독으로 또는 조합하여 유의하게 종양세포붕괴성 바이러스 요법의 항종양 효능을 강화시켰다.
또한, 2종 항체-발현 VACV, GLV-1h444(항-EGFR 및 항-VEGF) 또는 GLV-1h446(항-FAP 및 항-VEGF)으로 마우스에서 종양 처리는 놀랍게도 아바스틴(항-VEGF) 및 얼비툭스(항-EGFR)의 연속 투여와 조합한 GLV-1h68과의 병존 처리보다 우수하였다. 바이러스 발현된 항체의 항증식성 및 항혈관생성 효과는 또한 바이러스에 의해 직접 감염된 영역을 넘어서 종양에서 분명하여서, scAb가 국소 발현되면서, 종양 침투를 할 수 있다는 것을 입증해 주었다. 따라서, 우리의 결과는 VACV에 의한 종양세포붕괴성 바이러스 요법이 TME를 표적으로 하는 항증식성 및 항혈관생성 활성을 갖는 바이러스-코딩된 항체들의 공동 발현에 의해 유의하게 강화되었음을 입증하였다. 추가로, 강화된 치료 효과는 복제 능력있는, 재조합 VACV의 단일 투여에 의해 달성되었다.
따라서, VEGF, EGFR, 및 FAP를 표적으로 하는 항체를 발현하는 신규한 재조합 VACV는 단독으로 또는 조합하여, 전임상 동물 모델에서 종양세포붕괴성 바이러스 요법을 유의하게 강화시켰다. 각각 scAb를 발현하는 GLV-1h164, GLV-1h442, 및 GLV-1h282의 치료 효능은 그들 부모 바이러스 GLV-1h68보다 상당히 더 양호하여, 종양세포붕괴성 바이러스 요법이 혈관생성을 억제하기 위해 VEGF에 대항하거나, 세포 증식을 억제하기 위해 EGFR에 대항하거나, 또는 혈관생성을 감소시키고 MSC의 동원을 억제하기 위해 FAP에 대항하는 개별 항체들의 바이러스 발현에 의해 개선됨을 의미한다. 또한, 치료 효능은 하나의 VACV 균주에서 2종의 항체를 발현하여 더욱 강화되었다. VEGF 및 EGFR 둘 모두를 표적으로 하는 항체를 발현하는 GLV-1h444의 치료 효능은 아바스틴 및 얼비툭스의 병용 치료보다 유의하게 더 양호하였고 또한 아바스틴 및 얼비툭스와 조합한 GLV-1h68의 치료보다 우수하였다.
종양에서 VEGF, EGFR, 및 FAP의 고수준 발현은 좋지 않은 예후와 연관된다. 전임상 실험에서 유망한 결과에도 불구하고, 아바스틴 및 얼비툭스는 부분적으로 전신 투여 후 순환계로부터의 신속한 제거를 비롯하여 항체의 불충분한 침투 및 낮은 종양 표적화에 기인하여, 오직 제한된 임상 효능만을 보였다. 종양세포붕괴성 VACV는 종양 세포를 특이적으로 표적화하여 파괴시킬뿐만 아니라 국집된 종양에서 치료 단백질의 국소 생성을 매개하여, 항체 요법제의 사용과 연관된 한계를 피한다. 항체의 연속적인 존재는 1종 또는 2종 항체를 발현하는 VACV로 처리된 마우스의 혈청에서 입증하였다. 항체는 종양이 이미 수축하기 시작할 때 바이러스의 주사 후 후기(35 dpi)보다는 초기(7 및 21 dpi)에 높은 양으로 검출되었다. 또한, 항-FAP(GLAF-5) 및 항-EGFRVHHFLAG 항체는 GLV-1h164로 처리한 마우스의 혈청 내 항-VEGF(GLAF-2)보다는, 각각 GLV-1h282 및 GLV-1h442로 처리한 혈청에서 더 높은 양으로 존재하였다. 이는 종양에서 GLV-1h164보다는 GLV-1h282 및 GLV-1h442의 더 높은 바이러스 역가와 일관적이었다. 종양에서 GLV-1h68의 바이러스 역가가 GLV-1h164보다 유의하게 더 높았지만(P = 0.02), GLV-1h164는 배양시에 GLV-1h68보다 약간 더 빠르게 복제되어, GLAF-2의 발현이 종양에서 바이러스 복제를 감소시켰음을 시사한다. EGFR 또는 FAP를 표적으로 하는 항체의 발현은 종양에서 바이러스 복제에 부정적인 효과를 갖지 않았다.
암 진행은 암 세포의 비제어적인 성장에 의한 것임은 잘 알려져 있다. GLV-1h68의 처리는 종양에서 세포 증식을 억제하였고, VACV 감염의 고유한 특성과 일관되게, 감염된 영역에서 Ki67+ 세포수의 극적인 감소로 입증되었다. 주목할 것은, 항-EGFR 나노바디를 발현하는, GLV-1h442 및 GLV-1h444의 처리는 감염 영역뿐만 아니라 비감염 영역에서 Ki67+ 세포수를 유의하게 감소시켜, 감염 세포로부터 분비된 항-EGFR 나노바디가 비감염 영역으로 확산되어, EGFR+ 세포의 증식을 억제하였음을 시사한다. 항-VEGF 항체를 발현하는 GLV-1h164, 또는 항-FAP 항체를 발현하는 GLV-1h282의 처리가 종양의 감염 영역에서 증식을 유의하게 억제시켰지만, 그 효과는 미감염 영역에서는 단지 경미하여, 유의하지 않았다. 중요한 것은, 항-VEGF 및 항-FAP 둘 모두를 발현하는 GLV-1h446의 처리는 감염 및 미감염 영역 둘 모두에서 증식을 유의하게 억제하여, 세포 증식에 대한 2종 항체 발현의 가산적인 억제성 효과를 입증하였다.
아마 성장 및 발생은 또한 혈관을 통한 영양분의 연속적인 공급을 필요로 한다. 혈관 밀도(BVD)의 감소가 감염 영역에서 관찰되었지만, GLV-1h68-군집 종양의 미감염 영역에서는 관찰되지 않아서, VACV 감염 자체가 종양 혈관구조의 파괴를 초래할 수 있음을 시사한다. 항-VEGF scAb의 발현은 감염 영역에서 혈관 파괴를 강화시킬뿐만 아니라 미감염 영역에서 BVD의 유의한 감소를 야기시켰다. 따라서, 항-EGFR 나노바디와 유사하게, 항-VEGF scAb는 또한 감염 영역에서 미감염 영역으로 확산될 수 있다. FAP를 표적으로 하는 요법은 종양 혈관생성의 억제를 통해 부분적으로 종양 성장을 억제한다. 바이러스 발현된 항-FAP scAb는 FaDu 종양 이종이식 모델에서 감염 및 미감염 영역 둘 모두, 및 DU145 종양 이종이식 모델의 감염 영역에서 BVD를 유의하게 감소시켰다. 항-EGFR 나노바디의 발현이 DU145 종양 이종이식 모델의 감염 또는 미감염 영역에서 BVD에 유의하게 영향을 주지는 않았지만, EGFR이 종양 혈관생성을 촉진한다는 것이 보고된 바 있다.
FAP는 종양 성장을 억제하는 암-연관 섬유아세포(CAF)에 의해 발현되는 마커 중 하나이다. FAP+ CAF의 제거는 종양 성장을 억제하는 것으로 확인되었다. 항-FAP scAb를 발현하는 GSL-1h282로 FaDu 종양 이종이식편을 보유하는 마우스의 처리는 GLV-1h68의 처리와 비교하여 종양의 감염 및 미감염 영역 둘 모두에서 FAP+ 세포수의 상당한 감소를 유발시켰다. GLV-1h282의 강화된 항종양 효과는 FaDu 종양 세포가 FAP를 발현하지 않기 때문에, 암 세포에 대한 것이라기보다는 아마도 CAF에 대한 효과에 기인하는 듯하다.
따라서, 종양세포붕괴성 VACV 감염 자체는 군집된 종양의 혈관분포 및 세포 증식을 상당히 감소시켰다. 이들 항종양 효과는 단독으로 또는 조합하여 재조합 VACV에서 VEGF, EGFR, 및 FAP에 대항하는 scAb의 발현에 의해 유의하게 강화되었다. 항체 또는 항체들의 공동발현의 효과는 단일 투여 및 국소 종양내 전달의 이득과 함께, 임상 항체와 조합된 VACV의 처리와 비슷하거나 또는 그보다 우수하였다. 치료 효과는 감염된 종양 세포의 바이러스 종양붕괴와 TME의 항종양 변경을 조합하였다. 우리 지식에 따르면, 이는 EGFR 및 FAP에 대항한 바이러스 발현된 항체가 단독으로 종양세포붕괴성 바이러스 요법을 강화시키고, 항-VEGF 항체와 조합하여, 항종양 치료 효능을 더욱 개선시킨다는 것을 입증한 최초의 보고이다.
정의
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 대상체는 진단, 스크리닝, 모니터링 또는 치료가 고려되는 임의 동물을 포함한다. 동물은 포유동물, 예컨대, 영장류 및 가축을 포함한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 포유동물이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 마우스, 래트, 토끼, 개 또는 고양이에서 선택되는 포유동물이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 영장류이다. 예시적인 영장류는 인간이다. 환자는 질환 병태를 앓거나 또는 질환 병태로 결정되거나 또는 질환 병태의 위험성이 결정된 대상체, 예컨대, 포유동물, 영장류, 인간, 또는 가축 대상체를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 광범위한 의미로 사용되고, 특히 단클론성 항체(전체 길이 단클론성 항체 포함), 다클론성 항체, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 이중 특이적 T 세포 인게이저(BiTE) 항체, 및 그들이 바람직한 생물학적 활성을 나타내는 한 항체 단편(예를 들어, 단쇄, 나노바디 등)을 포괄한다. 일부 실시형태에서, 항체는 다클론성 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단클론성 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 Fab 단편이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단쇄 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 나노바디이다. 일부 실시형태에서, 항체는 Fab, Fv, F(ab')2, scFV, 다이아바디 및 이중특이적 항체에서 선택된다. 일부 실시형태에서, 항체는 인간화 항체이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 인용된 임의의 항체 실시형태는 특별히 배제한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "바이러스"는 바이러스라고 하는 독립체의 임의의 거대 그룹을 의미한다. 바이러스는 전형적으로 유전 물질의 RNA 또는 DNA 중심을 둘러싼 단백질 피막을 함유하지만, 반투과성막은 없고, 살아있는 세포에서만 성장 및 증식할 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 방법에서 사용하기 위한 바이러스는 제한없이, 폭스바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 뉴캐슬 질환 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 볼거리 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 홍역 바이러스, 레오바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 한타 바이러스, 믹소마 바이러스, 사이토메가로바이러스(CMV), 렌티바이러스, 및 임의의 식물 또는 곤충 바이러스를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 인용된 임의의 바이러스 실시형태는 특별히 배제한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "바이러스 벡터"는 당분야에서 인식되는 의미에 따라 사용된다. 이는 적어도 하나의 바이러스 기원 성분을 포함하고 바이러스 벡터 입자에 포장될 수 있는 핵산 벡터 구성체를 의미한다. 바이러스 벡터 입자는 DNA, RNA 또는 다른 핵산을 시험관내 또는 생체내에서 세포에 전달하는 목적으로 사용될 수 있다. 바이러스 벡터는 제한없이, 레트로바이러스 벡터, 백시니아 벡터, 렌티바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터(예를 들어, HSV), 배큘로바이러스 벡터, 사이토메가로바이러스(CMV) 벡터, 파필로마바이러스 벡터, 유인원 바이러스(SV40) 벡터, 셈리키 포레스트 바이러스 벡터, 파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 및 아데노-회합 바이러스(AAV) 벡터를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "혈액적 악성종양"은 혈액 및 림프계의 종양(예를 들어, 호지킨 질환, 비호지킨 림프종, 버킷 림프종, AIDS-관련 리프종, 악성 면역증식성 질환, 다발성 골수종 및 악성 형질 세포 신생물, 림프성 백혈병, 골수성 백혈병, 급성 또는 만성 림프구성 백혈병, 단핵구성 백혈병, 명시된 세포형의 기타 백혈병, 상세불명 세포형의 백혈병, 림프구, 조혈 및 관련 조직의 기타 및 상세불명 악성 신생물, 예를 들어 미만성 거대 세포 림프종, T-세포 림프종 또는 피하 T-세포 림프종)을 의미한다.
재조합 바이러스 및 사용 방법
본 명세서에서는, 일부 실시형태에서, 대상체에게 종양에서 세포를 감염시킬 수 있는 재조합 바이러스, 또는 종양에서 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스를 포함하는 세포를 제공하는 단계를 포함하는, 고형 종양을 치료하기 위한 방법을 개시하며, 상기 바이러스는 2 이상의 (i) 종양 미세환경(TME)을 표적으로 하는 항체 또는 (ii) TME를 표적으로 하는 자극성 또는 억제성 단백질을 발현한다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 종양세포붕괴성 바이러스이다. 일부 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 백시니아 바이러스이다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 복제 능력있는 종양세포붕괴성 백시니아 바이러스(VACV)이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 대상체에게 추가의 바이러스를 제공하는 단계를 더 포함하고, 상기 추가의 바이러스는 1종 이상의 (i) 종양 미세환경(TME)을 표적으로 하는 항체 또는 (ii) TME를 표적으로 하는 자극성 또는 억제성 단백질을 발현하고, 상기 적어도 1종의 추가의 바이러스는 (i) 종양 미세환경(TME)을 표적으로 하는 항체 또는 (ii) TME를 표적으로 하는 자극성 또는 억제성 단백질을 발현하는 바이러스가 발현하는 것과 상이한, 1종 이상의 (i) TME를 표적으로 하는 항체 또는 (ii) TME를 표적으로 하는 자극성 또는 억제성 단백질을 발현한다.
따라서, 본 명세서에서는 적어도 2종의 치료적 유전자 생성물(즉, 2종 이상의 (i) 종양 미세환경을 표적으로 하는 항체 또는 (ii) 종양 미세환경을 표적으로 하는 자극성 또는 억제성 단백질)을 코딩하는 이종성 핵산 분자를 함유하는 재조합 백시니아 바이러스를 포함하는, 치료 및 진단 용도를 위한 바이러스를 제공한다. 그러한 치료 유전자 생성물은 임의의 적합한 프로모터(예를 들어, 백시니아 프로모터, 예컨대, 백시니아 초기 프로모터, 백시니아 중간 프로모터, 백시니아 초기/후기 프로모터 및 백시니아 후기 프로모터)에 작동적으로 연결될 수 있다.
일부 실시형태에서, 2종 이상의 종양 미세환경을 표적으로 하는 항체(TME)는 (i) 혈관생성 및/또는 혈관신생을 자극하는 단백질에 결합하는 항체, (ii) 상피 성장 인자 수용체(EGFR), Her2/c-neu, Her3 및 Her4(Erb 패밀리)로 이루어진 군으로부터 선택된 수용체 티로신 키나제에 결합하는 항체, 및 (iii) 상피-중간엽 상호작용의 발생에 관여하는 단백질에 결합하는 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 혈관생성 및/또는 혈관신생을 자극하는 예시적인 단백질은 측분비 인자(안지오제닌, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 및 형질전환 성장 인자-β(TGF-β) 및 인테그린을 포함한다. 상피 중간엽 전이의 발생에 관여하는 단백질은 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), HSP47, 콜라겐 1, 콜라겐 2, 비멘틴 FSP1, DDR2, N-카데린, 스네일, 슬러그, 및 트위스, OB-카데린, 인테그린, 신데칸-1, FSP-1, 베타-카테닌, 피브로넥틴, 라미닌 5, ZEB1, LEF-1, Ets-1, FOXC2, 및 구세코이드(Goosecoid)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 2종 이상의 항체는 VEGF, 안지오제닌, FGF, TGF-β, 또는 인테그린(예를 들어, αVβ3, αVβ5 또는 α5β1)에 특이적인 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 2종 이상의 항체는 EGFR, Her2/c-neu, Her3 또는 Her4에 특이적인 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 2종 이상의 항체는 FAP, HSP47, 콜라겐 1, 콜라겐 2, 비멘틴 FSP1, DDR2, N-카데린, 스네일, 슬러그, 및 트위스, OB-카데린, 인테그린s, 신데칸-1, FSP-1, 베타-카테닌, 피브로넥틴, 라미닌 5, ZEB1, LEF-1, Ets-1, FOXC2, 또는 구세코이드에 특이적인 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 단락에 열거된 임의의 항원 실시형태는 특별히 배제한다.
일부 실시형태에서, 2종 이상의 항체는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)에 결합하는 항체, 상피 성장 인자 수용체(EGFR)에 결합하는 항체, 및 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 결합하는 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 2종 이상의 항체 중 1종은 VEGF에 결합하는 항체이다. 일부 실시형태에서, VEGF에 결합하는 항체는 G6-31이다. 일부 실시형태에서, VEGF에 결합하는 항체는 4G3, ab52917, ab68334, ab46154, A-20, OTI4E3, Ab-3. SP28. 베바시주맙, 라니부주맙, 파조파닙, 소라페닙, 수니티닙, 반데테아닙, 카보잔티닙, 포나티닙, 악시티닙, 및 아플리벌셉트, 및 임의의 이들 항체와 동일한 에피토프에 결합할 수 있는 항체에서 선택된다. 일부 실시형태에서, 2종 이상의 항체 중 1종은 EGFR에 결합하는 항체이다. 일부 실시형태에서, EGFR에 결합하는 항체는 항-EGFRVHH이다. 일부 실시형태에서, EGFR에 결합하는 항체는 세툭시맙, 마투주맙, 파니투무맙, 넥시투무맙, 니모투주맙, 트라스투주맙, 잘루투무맙, 528, SC-03, DR8.3, DH8.3, L8A4, Y10, ICR62, ABX-EGF, EMD72000, MM-151, Sym004, mAB 806, 및 임의의 이들 항체와 동일한 에피토프에 결합할 수 있는 항체에서 선택된다. 일부 실시형태에서, 2종 이상의 항체 중 1종은 FAP에 결합하는 항체이다. 일부 실시형태에서, FAP에 결합하는 항체는 M036이다. 일부 실시형태에서, FAP에 결합하는 항체는 ab54651, vF19, ESC11, ESC14, F11-24, SS-13, D394, MAb 클론 427819, M05, M02, M01, LS-C348807, 2F2. 및 임의의 이들 항체와 동일한 에피토프에 결합할 수 있는 항체이다. 일부 실시형태에서, 2종 이상의 항체는 VEGF에 결합하는 항체 및 EGFR에 결합하는 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 2종 이상의 항체는 VEGF에 결합하는 항체 및 FAP에 결합하는 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 2종 이상의 항체는 EGFR에 결합하는 항체 및 FAP에 결합하는 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 단락에 열거된 임의의 특정 항체, 또는 본 단락에 열거된 특정 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 특별히 배제된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 발명은 VEGF에 대항한 항체를 발현하지만, 상피 성장 인자 수용체(EGFR), Her2/c-neu, Her3 및 Her4(Erb 패밀리)로 이루어진 군으로부터 선택된 수용체 티로신 키나제에 결합하는 항체 또는 단백질을 발현하지 않고 상피-중간엽 상호작용의 발생에 관여하는 단백질에 결합하는 항체 또는 단백질을 발현하지 않는 바이러스를 포함하지 않는다.
예시적인 종양세포붕괴성 바이러스는 백시니아 바이러스, 수포성 구내염 바이러스(VSV), 뉴캐슬 질환 바이러스(NDV), 레트로바이러스, 레오바이러스, 홍역 바이러스, 신비스 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV), 백시니아 바이러스, 및 아데노바이러스를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바이러스는 약독화된다. 바이러스를 약독화시키기 위한 기술은 당분야에 공지되어 잇다.
본 명세서에서 제공되는 예시적인 바이러스는 변형된 헤마글루티닌(HA) 유전자, 티미딘 키나제(TK) 유전자, 및 F14.5L 유전자를 함유하는 재조합 백시니아 바이러스를 포함하고, 상기 변형 중 하나 이상은 HA 유전자 유전자좌, TK 유전자 유전자좌, 또는 F14.5L 유전자 유전자좌에 이종성 비코딩 핵산 분자의 삽입을 포함한다. 그러한 바이러스에서, 기능성 HA, TK, 및 F14.5L 폴리펩타이드는 발현되지 않는다.
치료 및 진단 용도를 위한 본 명세서에서 제공되는 예시적인 바이러스는 또한 웨스턴 리저브(WR), 코펜하겐, 타쉬켄트, 티안 탄, 리스터, 와이어스, IHD-J, 및 IHD-W, 브라이튼, 앙카라, MVA, 다롄 I, LIPV, LC16M8, LC16MO, LIVP, WR 65-16, 콘노트, 뉴욕시 위생국을 포함한다. 본 명세서에 기술된 방법에서 사용하기 위한 본 명세서에 기술된 LIVP 백시니아 바이러스는 GLV-1h22, GLV-1h68, GLV-1i69, GLV-1h70, GLV-1h71, GLV-1h72, GLV-1h73, GLV-1h75, GLV-1h81, GLV-1h82, GLV-1h83, GLV-1h84, GLV-1h85, GLV-1h86, GLV-1j87, GLV-1j88, GLV-1j89, GLV-1h90, GLV-1h91, GLV-1h92, GLV-1h96, GLV-1h97, GLV-1h98, GLV-1h104, GLV-1h105, GLV-1h106을 포함한다. 본 명세서에 기술된 방법에서 사용하기 위한 본 명세서에서 제공된 예시적인 LIVP 백시니아 바이러스는 GLV-1h107, GLV-1h108 및 GLV-1h109를 포함한다. 일부 실시형태에서, 기술된 방법에서 사용하기 위한 바이러스는 GLV-1h107, GLV-1h108 및 GLV-1h109에서 선택된다.
일부 실시형태에서, 청구된 바와 같은 바이러스는 GLV-1h444 및 GLV-1h446에서 선택된다.
일부 실시형태에서, 치료 및 진단 용도를 위한 본 명세서에서 제공되는 바이러스는 검출가능한 단백질 또는 검출가능한 신호를 유도할 수 있는 단백질을 코딩하는 이종성 핵산 분자를 함유하는 재조합 백시니아 바이러스를 포함한다. 그러한 단백질의 예는 루시퍼라제, 예컨대, 방아벌레 루시퍼라제, 레닐라(Renilla) 루시퍼라제, 또는 반딧불이 루시퍼라제, 형광발광 단백질, 예컨대, GFP 또는 RFP, 또는 조영제에 결합할 수 있는 단백질, 발색단, 또는 검출할 수 있는 화합물 또는 리간드, 예컨대, 트랜스페린 수용체 또는 페리틴이다. 본 명세서에서는 방아벌레 루시퍼라제(CBG99) 및 RFP(예를 들어, GLV-1h84)를 발현하는 청구하는 바와 같은 재조합 리스터 바이러스주 백시니아 바이러스를 제공한다.
본 명세서에서는 2종 이상의 진단 또는 치료 유전자 생성물을 코딩하는 이종성 핵산 분자를 함유하는 치료 및 진단 용도를 위한 바이러스를 기술하며, 상기 유전자 생성물은 피코르나바이러스 2A 성분에 의해 연결된다. 본 명세서에 기술된 일례에서, 재조합 백시니아 바이러스는 RFP를 코딩하는 제2 이종성 핵산 분자에 피코르나바이러스 2A 성분에 의해 연결된 CBF99를 코딩하는 이종성 핵산 분자를 함유한다(예를 들어, GLV-1h84).
일부 실시형태에서, 본 명세서에서는 다른 백시니아 바이러스 바이러스주 유래의 A34R 유전자로 A34R 유전자의 치환을 함유하는 치료 및 진단 용도를 위한 재조합 백시니아 바이러스를 기술한다. 본 명세서에서는 청구한 바와 같은 리스터 바이러스주 백시니아 바이러스를 제공하고, 상기 A34R 유전자는 백시니아 IHD-J 균주(예를 들어, GLV-1 i69) 유래의 A34R 유전자로 치환된다. 그러한 치환은 백시니아 바이러스의 세포외 외피보유 바이러스(EEV) 형태를 증가시키고 중화 항체에 대한 바이러스의 내성을 증가시킨다.
본 명세서에서는 A35R 유전자의 결실을 함유하는 치료 및 진단 용도를 위한 재조합 백시니아 바이러스를 기술한다.
본 명세서에서는 치료 단백질, 검출가능한 단백질 또는 검출가능한 신호를 유도할 수 있는 단백질을 코딩하는 1종 이상의 추가의 이종성 핵산 분자의 첨가에 의해 더 변형될 수 있는 치료 및 진단 용도를 위한 재조합 백시니아 바이러스를 기술한다. 그러한 단백질의 예는 루시퍼라제, 예컨대, 방아벌레 루시퍼라제, 레닐라 루시퍼라제, 또는 반딧불이 루시퍼라제, 형광발광성 단백질, 예컨대, GFP 또는 RFP, 또는 조영제에 결합할 수 있는 단백질, 발색단, 또는 검출할 수 있는 화합물 또는 리간드, 예컨대, 트랜스페린 수용체 또는 페리틴을 포함한다. 일부 실시형태에서, 진단 단백질은 루시퍼라제, 형광발광성 단백질, 철 저장 분자, 철 수송인자, 철 수용체 또는 조영제에 결합하는 단백질, 발색단 또는 검출할 수 있는 화합물 또는 검출가능한 리간드 중에서 선택된다.
또한 그러한 방법은 치료 유전자 생성물, 예컨대, 사이토카인, 케모카인, 면역조절성 분자, 단쇄 항체, 안티센스 RNA, siRNA, 프로드러그 전환 효소, 생물학적 독소, 항종양 올리고펩타이드, 항암 폴리펩타이드 항생제, 혈관생성 억제제, 또는 조직 인자를 코딩하는 이종성 핵산 분자의 삽입을 포함한다. 예시적인 항원은 종양 특이적 항원, 종양-연관 항원, 조직 특이적 항원, 박테리아 항원, 바이러스 항원, 효모 항원, 진균 항원, 원충 항원, 기생충 항원, 및 미토젠을 포함한다. 치료 단백질, 검출가능한 단백질 또는 검출가능한 신호를 유도할 수 있는 단백질을 코딩하는 1종 이상의 추가의 이종성 핵산 분자는 프로모터, 예컨대, 백시니아 바이러스 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 일부 실시형태에서, 치료 단백질은 사이토카인, 케모카인, 면역조절성 분자, 항원, 단쇄 항체, 안티센스 RNA, 프로드러그 전환 효소, siRNA, 혈관생성 억제제, 독소, 항종양 올리고펩타이드, 유사분열 억제제 단백질, 항유사분열 올리고펩타이드, 항암 폴리펩타이드 항생제, 및 조직 인자 중에서 선택된다.
본 명세서에서는 청구된 바와 같은 재조합 바이러스를 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 예시적인 숙주 세포는 청구된 바와 같은 재조합 바이러스를 함유하는 종양 세포이다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 배양되는 포유동물 세포주이다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 배양되는 인간 세포주이다.
본 명세서에서는 또한 청구되는 바와 같은 재조합 바이러스를 포함하거나 또는 그에 의해 감염된 포유동물 유기체를 개시한다. 일부 실시형태에서, 포유동물 유기체는 마우스, 래트, 토끼, 또는 유인원이다.
본 명세서에서는 청구되는 바와 같은 재조합 바이러스 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 조성물은 의도하는 용도, 예컨대, 요법, 진단 또는 둘 모두, 및 투여 경로에 적합한 바이러스의 양 또는 농도를 함유한다. 본 명세서에서는 국소 또는 전신 투여를 위해 제제화된 그러한 약학 조성물을 제공한다. 본 명세서에서는 2종 이상의 바이러스를 함유하는 그러한 약학 조성물을 제공한다. 본 명세서에서는 백신, 예컨대, 천연두 백신으로서 투여를 위해 제제화되는 그러한 약학 조성물을 제공한다.
본 명세서에서는 대상체, 예컨대, 인간 대상체 또는 동물 대상체에서 종양, 암 또는 전이를 치료하기 위해 사용하기 위한 약학 조성물을 제공한다. 약학 조성물의 투여는 종양 성장을 중지 또는 지연시키거나, 종양 부피의 감소를 야기시키거나 또는 대상체로부터 종양을 제거시킨다.
본 명세서에 개시된 방법 및 약학 조성물은 임의의 고형 종양 또는 혈액적 악성종양을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 방법으로 치료할 수 있는 종양은 제한없이, 방광 종양, 유방 종양, 전립선 종양, 암종, 기저 세포 암종, 담관암, 방광암, 골암, 뇌암, CNS 암, 신경교종 종양, 자궁경부암, 융모막암종, 결장 및 직장 암, 결합 조직 암, 소화계의 암, 자궁내막암, 식도암, 안암, 두경부암, 위암,상피내 신생물, 신장암, 후두암, 백혈병, 간암, 폐암, 림프종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 흑색종, 골수종, 신경아세포종, 구강암, 난소암, 췌장암, 망막아세포종, 횡문근육종, 직장암, 신장암, 호흡계의 암, 육중, 피부암, 위암, 고환암, 갑상선암, 자궁암, 및 비뇨기계의 암, 예컨대, 림프육종, 골육종, 유선 종양, 비만세포종, 뇌종양, 흑색종, 선편평 암종, 유암종 폐종양, 기관지샘 종양, 세기관지 선암종, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 섬유종, 점액연골종, 폐육종, 신경육종, 골종, 유두종, 망막아세포종, 유잉 육종, 빌름 종양, 버킷 림프종, 소교종, 신경아세포종, 파골세포종, 구강 이상증식, 섬유육종, 골육종 및 횡문근육종, 생식기 편평 세포 암종, 전염성 생식기 종양, 고환 종양, 정상피종, 세르톨리 세포 종양, 혈관주위세포종, 조직구종, 녹색종, 과립구육종, 각막 유두종, 각막 편평 세포 암종, 혈관육종, 흉막 중피종, 기저 세포 종양, 흉선종, 위 종양, 부신 암종, 구강 유두종증, 혈관내피종, 낭선종, 여포성 림프종, 장 림프육종, 섬유육종, 및 폐 편평 세포 암종, 백혈병, 혈관주위세포종, 안구 이상증식, 포피 섬유육종, 궤양성 편평 세포 암종, 포피 암종, 결합 조직 이상증식, 비만세포종, 간세포 암종, 림프종, 폐 폐선종증, 폐 육종, 루이스 육종, 세망내피증, 섬유육종, 신아세포종, B-세포 림프종, 림프성 백혈병, 망막아세포종, 간 이상증식, 림프육종, 형질세포양 백혈병, 부레 육종(어류의 경우), 건락성 림프절염, 폐 암종, 인슐린종, 림프종, 육종, 신경종, 췌도 세포 종양, 위 MALT 림프종 및 위 선암종을 포함한다. 일부 실시형태에서, 종양은 교아세포종, 유방 암종, 폐 암종, 전립선 암종, 결장 암종, 난소 암종, 신경아세포종, 중추신경계 종양, 및 흑색종에서 선택된다.
본 명세서에서 제공되는 약학 조성물은 전신, 정맥내, 동맥내, 종양내, 내시경, 병변내, 근육내, 피내, 복강내, 소포내, 관절내, 흉막내, 경피적, 피하, 경구, 비경구, 비내, 기관내, 흡입, 두개내, 전립선내, 유리체내, 국소적, 안구, 질 또는 직장으로 투여될 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 약학 조성물은 항바이러스제, 예컨대, 제한없이, 시도포비어, 시도포비어의 알콕시알킬 에스테르, 글리벡, 간시클로비어, 아시클로비어, 및 ST-26과 함께 투여될 수 있다.
본 명세서에서는 본 명세서에서 제공된 약학 조성물 및 항암제를 함유하는 청구한 바와 같은 조합물을 제공한다. 본 명세서에서 제공되는 조합물에 사용하기 위한 예시적인 항암제는 제한없이, 사이토카인, 케모카인, 성장 인자, 광감작제, 독소, 항암 항생제, 화학요법 화합물, 방사성핵종, 혈관생성 억제제, 신호전달 조정제, 항대사산물제, 항암 백신, 항암 올리고펩타이드, 유사분열 억제제 단백질, 항유사분열 올리고펩타이드, 항암 항체, 항암 항생제, 면역요법제, 고열 또는 고열 요법, 박테리아, 방사선 요법 또는 이들의 조합을 포함한다. 본 명세서에서 제공된 조합물에서 사용하기 위한 예시적인 화학요법 화합물은 본 명세서에서 제공되는 다른 화학요법 화합물 중에서, 제한없이, 알킬화제, 예컨대, 백금 배위결합 착체를 포함한다. 예시적인 백금 배위결합 착체는 제한없이, 시스플라틴, 카보플라트니, 옥살리플라틴, DWA2114R, NK121, IS 3 295, 및 254-S를 포함한다.
본 명세서에서는 청구되는 바와 같은 바이러스 및 항암제, 예컨대, 사이토카인, 케모카인, 성장 인자, 광감각제, 독소, 항암 항생제, 화학요법 화합물, 방사성핵종, 혈관생성 억제제, 신호전달 조정제, 항대사산물제, 항암 백신, 항암 올리고펩타이드, 유사분열 억제제 단백질, 항유사분열 올리고펩타이드, 항암 항체, 항암 항생제, 면역요법제, 고열 또는 고열 요법 또는 박테리아의 조합물을 제공한다. 본 명세서에서는 청구된 바와 같은 바이러스 및 항암제, 예컨대, 시스플라틴, 카보플라틴, 젬시타빈, 이리노테칸, 항-EGFR 항체 및 항-VEGF 항체의 조합물을 제공한다.
본 명세서에서는 화합물 및 바이러스가 2종의 조성물로 개별적으로 제제화되는 청구된 바와 같은 조합물을 제공한다. 본 명세서에서는 화합물 및 바이러스가 단일 조성물로 제제화되는 청구된 바와 같은 조합물을 제공한다.
본 명세서에서는 종양, 암 또는 전이의 치료에 사용하기 위한 본 명세서에서 청구된 바와 같은 바이러스를 제공한다. 본 명세서에서는 또한 종양, 암 또는 전이의 치료를 위한 약학 조성물의 제조를 위한 본 명세서에서 청구된 바이러스의 용도를 제공한다.
본 명세서에서는 암의 치료를 위한 본 명세서에서 청구된 약학 조성물 또는 조합물 및 경우에 따라 이의 투여를 위한 설명서를 함유하는 키트를 제공한다.
본 명세서에서는 본 명세서에서 청구된 재조합 백시니아 바이러스를 함유하는, 백신, 예컨대, 천연두 백신을 제공한다. 또한, 본 명세서에서는 면역 반응의 생성을 위해 대상체에게, 백신, 예컨대, 천연두 백신으로 투여하기 위한 본 명세서에서 청구된 재조합 백시니아 바이러스를 제공한다.
본 명세서에서는, 일부 실시형태에서, 후속 치료 양식에 종양을 감작시키는 방법을 개시한다. 일부 실시형태에 따른 기술의 감작 부분이 본 명세서에 기술된 임의의 접근법을 사용해 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 방사선 요법, 화학요법, 면역요법, 광선요법, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 종양의 감작화는 대상체에게 조사를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조사는 이온화 방사선이다. 일 실시형태에서, 감작화는 국소 종양 조사, 예를 들어 고선량 소분할 방사선 요법(HDHRT)으로 수행된다.
이온화 방사선은 종양 미세환경을 변형시키고 면역 매개 종양 거부를 촉진하는 상당한 잠재력을 갖는다. 구체적으로, 방사선은 비정상 종양 혈관의 리모델링 및 혈관 세포 부착 분자(예를 들어, VCAM-1) 및 케모카인 분비(예를 들어, CXCL16)의 상향조절을 유도하여, 종양으로 효율적인 T-세포 침윤을 유발시킬 수 있다. 방사선의 다른 중요한 효과는 MHC 클래스-I 분자, NKG2D 리간드, 및 Fas/CD95의 상향 조절과, 따라서 암 세포에 T 세포의 결합 및 암 세포의 사멸 증가를 포함한다. 그러나, 이러한 유의한 프로면역원성 효과에도 불구하고, 방사선 그 자체는 종양 제거를 유발시키는 장기간의 강력하고 충분한 항종양 면역 반응을 유도시키는데는 불충분하다.
방사선 요법은 제한없이, 광역학 요법, 방사성핵종, 방사면역요법 및 양자빔 치료를 포함한다.
일부 실시형태에서, 후속 치료 양식은 화학요법 화합물의 투여를 포함한다. 화학요법 화합물은 제한없이,백금; 백금 유사체(예를 들어, 백금 배위결합 착체), 예컨대, 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴, DWA2114R, NK121, IS 3 295, 및 254-S; 안트라세네디온; 빈블라스틴; 알킬화제, 예컨대, 티오테파 및 사이클로스포스파마이드; 알킬 설포네이트, 예컨대, 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 예컨대, 벤조도파, 카보퀴온, 메투레도파 및 우레도파; 알트레타민, 트라이에틸렌멜라민, 트라이에틸렌포스포르아마이드, 트라이에틸렌 및 트라이메틸롤로멜라밈 질소 머스타드를 포함한 에틸렌이민 및 메틸라멜라민, 예컨대, 키오람부실, 클로르나파진, 클로로포스파마이드, 에스트라무스틴, 이포스파마이드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파마이드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예컨대, 칼무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제, 예컨대, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리케아미신, 카라비신, 칼미노마이신, 칼지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-다이아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 말셀로마이신, 미토마이신, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페프로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 켈라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 튜버시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사산물제, 예컨대, 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU); 폴산 유사체, 예컨대, 데놉테린, 메토트렉세이트, 프테롭테린, 트라이메토트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대, 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 칼모퓨어, 시타라빈, 다이데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐, 예컨대, 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항부신제, 예컨대, 아미노글루테티미드, 미토탄, 트라이로스탄; 폴산 보충제, 예컨대, 프롤린산; 아세글락톤; 알도포스파마이드 글리코사이드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트라세이트; 데포파민; 데메콜신; 다이아지퀴온; 엘폴니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 갈륨 나이트레이트; 치환된 우레아; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미토잔트론; 모피다몰; 나이트라크린; 펜토스타틴; 페나멧; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카바진; 항암성 다당류; 다당류-K; 라족산; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트라이아지퀴온; 2,2',2''-트라이클로로트라이에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 시토신 아라비노사이드; 사이클로포스파마이드; 티오테파; 탁소이드, 예컨대, 파클리탁셀 및 도세탁셀; 클로람부실; 젬시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 에토포사이드(VP-16); 이포스파마이드; 미토마이신 C; 미토잔트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포사이드; 다우노마이신; 아미놉테린; XELODA; 이반드로네이트; CPT11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 다이플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노산; 에스퍼라미신; 카페시타빈; 메틸하이드라진 유도체; 엘로티닙(TARCEVA); 수니티닙 말레이트(SUTENT); 및 전술한 것들 중 어느 1종의 약제학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 또한 이 정의에는 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 또는 억제하는 기능을 하는 항호르몬제, 예컨대, 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 억제 4(5)-이미다졸, 4-하이드록시타목시펜, 트라이옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 토레미펜(FARESTON)을 포함하는 항에스트로겐제; 부신피질 억제제; 및 항안드로겐제, 예컨대, 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드 및 고세렐린; 및 전술한 것들 중 어느 1종의 약제학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 본 명세서에서 사용할 수 있는 이러한 화학요법 화합물은 그 독성으로 인해 일반 전신 화학요법 방법에서 그 화합물의 사용이 제외되는 화합물을 포함한다.
일부 실시형태에서, 후속 치료 양식은 국소 종양 조사, 사이토카인 주사, 항체 주사, 및 사이토카인 및/또는 케모카인을 분비하는 줄기 세포의 주사에서 선택된다.
치료 양식의 투여
본 발명의 병용 요법에서 적용되는, 본 명세서에 개시된 재조합 바이러스를 포함하여, 본 명세서에 개시된 치료 양식 각각의 유효 용량은 구체적인 치료, 적용되는 화합물 또는 약학 조성물, 투여 방식, 치료되는 병태, 및 치료되는 병태의 중증도에 따라 가변적일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 치료의 투약 계획은 투여 경로 및 환자의 시장 및 간 기능을 포함한 다양한 인자들에 따라 선택된다. 통상적 기술의 의사, 임상의 또는 수의사가 병태의 진행을 예방하거나, 대응하거나 또는 중지시키는데 필요한 단일 활성 성분의 유효량을 쉽게 결정하여 처방할 수 있다. 독성없이 효능을 산출시키는 범위 내에서 활성 성분의 농도를 획득하는데 있어서 최적 정밀함은 표적 부위에 대한 활성 성분의 이용률의 역학을 기반으로 하는 계획을 요구한다.
본 명세서에 개시된 관련 치료를 포함하는 약학 조성물을 제조하는 방법은 당분야에 공지이고 표준 참고서, 예컨대, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 18th edition (1990)]을 통해, 당분야에서 자명해진다.
실시예
실시예 1 - 재료 및 방법
세포주
아프리카 녹색 원숭이 신장 섬유아세포 CV-1, 인간 폐 암종 A549, 하인두 암종 세포주 FaDu, 및 인간 전립선 암 세포주 DU145를 미국 바이러스주 은행(American Type Culture Collection)에서 입수하였다. CV-1 세포를 DMEM에서 배양하였고, A549 세포는 RPMI 1640에서 배양하였으며, FaDu 및 DU145는 이글(Eagle)의 최소 필수 배지에서 배양하였다. 모든 배지는 10% 태아 소 혈청(Cellgro)을 보충하였다.
플라스미드의 구축 및 항체의 발현
부모 삼중-돌연변이체 VACV GLV-1h68을 이전에 기술된 대로 구축하였다(Zhang et al., Cancer Res. 67:10038-10046). 간략하게, 개별적으로, LIVP 바이러스 게놈의 F14.5L, J2R, 및 A56R 유전자좌에 통합된 레닐라 루시퍼라제-애쿠오레아(Aequorea) GFP 융합 단백질(RUC-GFP), β-갈락토시다제, 및 β-글루쿠로니다제를 코딩하는 3종 외래 유전자-발현 카세트를 함유한다. GLAF-5의 서열은 이전에 기술된 바와 같고(Frentzen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106: 12915-12920), GENEART-Invitrogen에서 합성하였다. DYKDDDDK 태그(gac tac aag gat gac gac gac aag)를 항-EGFRVHH의 C-말단 코딩 영역에 첨가하여, 항-EGFRVHHFLAG를 생성시켰다. DNA 단편은 플라스미드 pCR-TK-P_SEL의 Sal I 및 Pac I 부위에 클로닝되어 플라스미드 pCR-TK-P_SEL(GLAF-5) 및 pCR-TK-P_SEL(항-EGFRVHHFLAG)을 생성시켰고, 이를 이중-상호 크로스오버를 통해 GLV-1h68의 J2R 유전자좌에 상동성 재조합을 위해 사용하여, 각각 GLV-1h282 및 GLV-1h442를 생성시켰다. GLV-1h446 및 GLV-1h444는 동일한 플라스미드 및 부모 바이러스로서 GLV-1h164를 사용하여 유사하게 생성시켰다. 재조합 VACV는 서열을 확인하였다. 모든 VACV는 CV-1 세포에서 증식시켰고 표준 프로토콜을 통한 수크로스 농도구배를 통해 정제하였다.
항체의 발현의 검출을 위해, 세포 샘플은 1의 MOI에서 각 VACV 균주로 감염 후 24시간 후에 수확하였고 12% SDS-PAGE로 분리하였다. 다음의 항체들을 사용하였다: FLAG 태그의 검출용 항-DDDDK 항체(Abcam), scAv의 검출용 주문 제작 항체 G6, 및 VACV의 막 단백질의 검출용 항-A27 항체(GenScript Corporation).
마우스 혈청 중 항체의 농도는 이전에 기술된 바와 같이, 시판되는 재조합 인간 EGFR(Abnova), FAP(R&D system), 및 VEGF(Sigma)를 사용해 표준 ELISA 검정법으로 결정하였다(상기에 언급된 문헌[Frentzen et al.]).
바이러스 복제 검정
세포를 0.01의 MOI로 VACV를 감염시켰고 샘플을 감염 후 각 시점에 삼중으로 수확하였다.
동물 실험
5주령 내지 6주령 누드 숫컷 마우스(Hsd: 무흉선 누드-Foxn1nu 마우스)를 할란(Harlan)(Livermore, CA)에서 구매하였고 익스플로라 바이로랩스의 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee of Explora Biolabs)(San Diego Science Center, 캘리포니아주 샌디에이고 소재)가 승인한 프로토콜 하에 유지시켰다. 1 × 106의 FaDu, 5 × 106의 A549, 또는 1 × 107의 DU145 세포를 마우스의 우측 뒷다리에 피하 이식하였다. 종양 부피는 디지털 캘리퍼를 사용해 3차원으로 매주 측정하였고 ((길이× 너비 ×(높이 - 5))/2)로 계산하였으며, 체중은 매주 측정하였다. 각 동물에 대한 순 체중은 종양의 무게로부터 각 시점의 전체 체중을 빼서 계산하였다(종양 밀도는 1 g/cc로 가정함). 순 체중의 변화율은 백분율로 표시하는, 치료 직전 순 체중으로 나눈, 특정 시점에 각 동물의 순 체중과 치료 직전 이의 순 체중 간 차이이다. 각 VACV 균주의 100-㎕ PBS 중 2 × 106 pfu/마우스의 단일 용량(달리 특정하지 않으면)은 종양 부피가 대략 450 ㎣에 도달했을 때 안구 뒤쪽에 투여하였다. 100 밀리리터의 PBS를 음성 대조군으로 주사하였다.
치료 항체의 처리를 위해, 마우스에게 10 dpi에서 시작하여 5주 동안 1주 당 2회 아바스틴(5 ㎎/㎏) 및/또는 얼비툭스(3 ㎎/㎏)를 복강내(i.p.) 주사하였다.
종양 및 장기를 절제하고 MagNA 라이저(Lyser)(Roche Diagnostics)를 사용해 균질화하였다. 바이러스 역가는 표준 플라크 검정법으로 CV-1 세포에서 결정하였다.
조직학적 분석
표준 탈수 과정에 따라서, FaDu 종양을 절제하고 파라핀-삽입시켰다. 종양 샘플을 5-㎛ 절개부로 자르고 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하였다. 절개부를 탈왁싱시키고 항원 복구를 시트르산나트륨 완충액에서 수행하였다. 다음의 항체들을 사용하였다: 항-FAP(Abcam) 및 항-A27L(GenScript Corporation). 바이오틴화된 2차 항체(염소 항-토끼; Jackson ImmunoResearch Laboratories)를 사용하였고 검출은 벡터스테인 엘리트(Vectorstain Elite ABC) 시약 및 벡터 임팩트(Vector ImmPact) DAB 퍼옥시다제 기질(Vector Laboratories)을 사용해 수행하였다.
DU145 종양을 36 dpi에서 절제하였고, 파라포름알데하이드 고정을 후속한 후, 100-㎛ 절개부로 잘랐다. 혈관 및 세포 증식은 각각 항-CD31 항체(BD Pharmingen) 및 항-Ki67 항체(BD Pharmingen)를 사용해 검출하였다.
종양 절개부의 조사는 디지털 전하 결합 장치 카메라(Leica)가 장착된 MZ16 FA 형광 입체현미경(Leica)으로 수행하였다. 디지털 영상(1,300 내지 1,030-픽셀 영상)은 어도비 포토샵 7.0 소프트웨어를 사용해 처리하였다.
통계 분석
동물 그룹 간 차이의 통계적 유의성은 STATISTICS의 일원 변량 분석(ANOVA) 또는 양측 비대응 스튜던트 t-검정법(Excel 2003; Microsoft, Redmond, WA)을 사용하여 분석하였다. P-값 <0.05을 유의한 것으로 간주하였다.
실시예 2 - EGFR 및 FAP를 표적으로 하는 개별 항체를 코딩하는 재조합 VACV의 구축
VACV(GLV-1h108(ref. 29) 및 GLV-1h164 (Buckel et al., Int. J. Cancer 133:2989-2999)에 의해 발현되는 항-VEGF scAb(GLAF-1 또는 GLAF-2)는 몇몇 인간 종양 이종이식 모델에서 종양 성장을 유의하게 감소시켰고 TME의 혈관분포에 대한 억제 효과를 통한 "아바스틴-유사 작용 기작"을 나타냄이 이전에 보고되었다. EGFR 및 FAP는 종양 개시 및 발생의 조절에 관여하는 TME의 다른 중요한 인자들이다. 종양세포붕괴성 바이러스 요법의 치료 효능에 대해 EGFR 및 FAP를 표적으로 하는 항체의 효과를 평가하기 위해, 2종의 신규한 재조합 VACV는 lacZ 발현 카세트를 GLV-1h68의 J2R 유전자좌에서 항-EGFR 나노바디(항-EGFRVHHFLAG) 발현 카세트 또는 항-FAP scAb(GLAF-5) 발현 카세트를 치환시켜 구축시켜, 각각 GLV-1h442 및 GLV-1h282를 생성시켰고, 둘 모두 VACV 합성 초기/후기(PSEL) 프로모터의 제어 하에 있다(도 1a 및 도 1b).
실시예 3 - VEGF, EGFR, 및 FAP를 표적으로 하는 바이러스 발현된 항체는 바이러스 요법을 유의하게 강화시킨다
항-VEGF, 항-FAP scAb, 또는 항-EGFR 나노바디를 코딩하는 VACV 균주를 처리한 항종양 효과를 마우스에서 조사하였다. VACV 바이러스주 또는 PBS(포스페이트-완충 염수)를 2 × 106 플라크-형성 유닛(PFU)/마우스의 단일 용량으로 상이한 인간 종양 이종이식편을 보유하는 마우스에게 안구뒤로 주사하였다. 아바스틴 또는 얼비툭스는 바이러스 주사 후 10일에 시작하여 5주 기간 동안 복강내(i.p.)로 1주 당 2회 마우스에게 투여되었다(도 2a 내지 도 2c의 화살표로 표시된 바와 같음). A549 이종이식 모델(n ≥ 7)(도 2a 및 도 2b)에서, PBS-처리된 종양은 과도한 종양 부하량으로 인해 마우스를 희생시켜야만 할 때까지 계속된 성장을 보였다. GLV-h168으로 처리된 마우스에서 전형적인 3상의 종양 성장 패턴이 관찰되었다(Zhang et al., cited above). 종양 부피는 시작시에 PBS-처리 그룹을 초과하였고, 이후 유의한 종양 성장 중지와 다음으로 종양 수축이 후속되었다. 아바스틴만을 처리한 마우스는 PBS와 비교하여 종양 부피의 감소를 보였지만, 종양 성장은 계속되었다(도 2a). 아바스틴과 조합하여 GLV-1h68의 처리는 양쪽의 단독 처리보다 개선된 효능을 산출한데 반해 항-VEGF scAb를 발현하는 GLV-1h164의 치료 효능은 아바스틴과 조합한 GLV-1h68의 처리와 비슷하였다. 얼비툭스와 조합한 GLV-1h68의 처리는 얼비툭스 투여 기간 동안 GLV-1h68 단독 처리보다 더 작은 종양을 산출하였지만, 종양 부피는 얼비툭스 처리를 멈춘 후 일시적으로 되돌아왔다(도 2b). 반대로, 항-EGFR 나노바디를 발현하는, GLV-1h442를 처리한 마우스의 종양 성장은 GLV-1h68을 처리한 마우스보다 일관적으로 더 느렸고, 종양 부피의 반등은 관찰되지 않았다. 추가적으로, 항-FAP scAb를 발현하는 GLV-1h282로 마우스의 처리는 또한 GLV-1h68의 처리보다 유의하게 더 작은 종양 부피를 나타냈다(도 2c). 따라서, GLV-1h68과 비교하여, 각각 치료 항체를 발현하는 GLV-1h164, GLV-1h442, 또는 GLV-1h282의 마우스 처리 시에 A549 종양 성장에 대해 강화된 치료 효과가 관찰되었다. 또한, 그 효과는 치료 항체 단독 처리보다 우수하였고 치료 항체 및 GLV-1h68의 조합 처리와 비슷하거나 또는 우수하였다. 유사한 치료 효과가 또한 DU145 종양 이종이식편을 보유하는 마우스에서 관찰되었다(n = 5)(도 2d).
실시예 4- TME에 대한 VEGF, EGFR, 및 FAP를 표적으로 하는 종양내 발현 항체의 영향
종양 혈관 구조에 대한 바이러스 발현되는 항-VEGF scAb의 효과를 VACV의 주사 후 36일(dpi)에 절제한 DU145 종양에서 평가하였다. 종양 절개부의 면역조직화학(IHC) 염색을 수행하여 종양 절개부 내 CD31+ 혈관을 계측하여 결정되는, 혈관 밀도(BVD)를 평가하였다. VACV 감염은 바이러스 발현된 GFP의 형광발광으로 표시되었다(도 3a). VACV 군집화는 PBS-처리 종양 및 동일 종양의 미감염 영역 둘 모두와 비교하여 종양의 감염 영역에서 BVD의 극적인 감소를 유발시켰다(도 3b). 이는 GLV-1h68-처리 종양 및 GLV-1h164-처리 종양 둘 모두에서 진실이었다. 그러나, GLV-1h68-처리 종양의 미감염 영역 내 BVD는 PBS-처리 종양의 것과 유의하게 달랐다. 대조적으로, GLV-1h164의 처리는 GLV-1h68-처리 종양과 비교한 종양의 감염 및 미감염 영역 내 BVD를 유의하게 감소시켰다. 따라서, GLV-1h68에 의한 VACV 감염 단독은 종양에서 BVD를 감소시키면서, 그 효과는 감염 부위에 국재화된 데 반해, VACV 감염과 GLV-1h164에 의한 항-VEGF scAb의 발현의 조합은 종양의 감염 영역에서 BVD를 더 감소시킬 뿐만 아니라 미감염된 영역으로 그 효과가 확장되었다.
EGFR의 과발현이 비제어적인 세포 성장을 초래한다는 것은 잘 알려져 있다. 항-Ki67로 IHC 염색을 수행하여 바이러스 발현된 항-EGFR 나노바디가 종양에서 세포 증식을 억제하는지 여부를 평가하였다. 예상한 대로, 항-EGFR 나노바디를 발현하는 GLV-1h68 또는 GLV-1h442로 종양의 군집화는 PBS-처리 종양과 비교하여 감염 영역에서 Ki67+ 세포의 수를 상당히 감소시켰다(도 3c). 흥미롭게도, GLV-1h442-처리된 종양의 미감염 영역에서 Ki67+ 세포의 수도 역시 GLV-1h68-처리 종양의 미감염 영역과 비교하여 유의하게 감소하였다(도 3d). 이는 GLV-1h442로 감염된 세포로부터 분비된 항-EGFR 나노바디가 역시 미감염 세포에도 작용하여, 그들 증식을 감소시킴을 시사한다.
FAP는 혈관생성에 관여하는 중간엽 줄기 세포(MSC) 마커이다. 종양내에서 발현되는 항-FAP scAb의 효과는 고수준의 FAP를 발현하는 FaDu 종양에서 FAP+ 세포 및 CD31+ 세포를 계측하여 평가하였다. FaDu 종양이 GLV-1h68의 처리에 반응하지 않았지만, 그들 성장은 항-FAP scAb를 발현하는 GLV-1h282에 의해 유의하게 억제되었다(도 4). GLV-1h68-군집화 종양에서, CD31+ 세포 및 FAP+ 세포의 수는 감염 영역에서 상당히 감소된 반면, PBS-처리 종양과 비교하여 비감염 영역에서는 효과가 관찰되지 않았다(도 3e 및 도 3f). 대조적으로, GLV-1h282-처리 종양에서 CD31+ 세포 및 FAP+ 세포의 수는 GLV-1h68-처리 종양과 비교하여 감염 및 비감염 영역 둘 모두에서 유의하게 감소되었다.
실시예 5 - VEGF 및 EGFR 또는 VEGF 및 FAP를 표적으로 하는 2종 항체를 발현하는 추가의 신규 재조합 VACV의 구축
단일 항체를 발현하는 VACV 처리의 긍정적 효과를 기반으로, VEGF 및 EGFR 또는 VEGF 및 FAP를 표적으로 하는 2종의 항체를 발현하는 추가의 신규 재조합 VACV를 구축하였다. 항-EGFR 나노바디(항-EGFRVHHFLAG) 또는 항-FAP scAb(GLAF-5)를 위한 발현 카세트를, 항-VEGF(GLAF-2) 발현 카세트를 또한 함유하는, GLV-1h164의 J2R 유전자좌에 삽입시켜, 인간 노르에피네프린 수송인자(hNET) 발현 카세트를 치환시켜, 각각 GLV-1h444 및 GLV-1h446을 생성시켰다(도 1b). 신규한 재조합 VACV로부터 각각의 항체의 발현을 입증하기 위해, A549 세포를 신규한 VACV 균주로 감염시켰고 세포 용해물을 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 결과는 각각의 항체가 의도하는 대로 각 바이러스로부터 발현되었음을 보여주었다(도 5).
실시예 6 - 바이러스 발현된 2종 항체는 바이러스 복제 효율에 부정적 효과를 보이지 않는다
바이러스 복제 검정은 0.01의 감염 다중도(MOI)로 A549 세포에서 수행하였다(도 6). 단일 또는 2종 항체를 발현하는 재조합 VACV는 감염 후 24시간(hpi)에 GLV-1h68보다 유의하게 더 높은 복제 효율을 보였다. 그러나, 48 또는 72 hpi에서 복제 효율의 유의한 차이는 존재하지 않았다. 유사한 결과가 DU145 세포에서 획득되었다. 따라서, VACV에서 2종 항체의 발현은 세포 배양에서 그들의 전체 복제 효율에 부정적인 효과를 보이지 않았다.
실시예 7 - TME를 표적으로 하는 바이러스 발현된 2종 항체는 바이러스 요법을 더 개선시킨다
TME를 표적으로 하는 단일 항체를 발현하는 재조합 VACV의 결과에 고무되어, 동일한 VACV로부터 발현된 2종 항체가 바이러스 요법을 더 개선시키는지 여부에 관한 평가를 수행하였다. 각각의 VACV 균주의 단일 용량을 A549 종양 이종이식편을 보유하는 마우스에게 주사하였다(도 7a 및 도 7b). 대조군 동물은 PBS 또는 아바스틴과 얼비툭스의 조합으로 처리하였다. 10 dpi에서 시작하여 5주 동안 1주에 2회 아바스틴 및 얼비툭스의 처리는 항체 처리 기간 동안 종양 성장을 지연시켰지만, 종양 성장은 항체 처리의 종료 이후 재개되었다. 놀랍게도, 둘 모두 2종의 항체를 발현하는, GLV-1h444 또는 GLV-1h446으로 처리된 마우스의 종양은 실험 기간 동안 오직 최소의 성장만을 보였다. 대조적으로, 단일 항체를 발현하는 VACV를 처리한 마우스의 종양은 종양 성장이 유의하게 느려진 후, 종양 수축이 되기 전에 초기에 PBS로 처리한 종양만큼 빠르게 성장하거나 또는 그보다 오직 약하게만 느려졌다. 종합적으로, 2종의 항체를 발현하는 GLV-1h444 또는 GLV-1h446으로 처리한 마우스의 종양 부피는 단일 항체를 발현하는 VACV로 처리된 마우스의 종양 부피보다 작았다. A549 종양을 보유하는 개별 마우스의 종양 성장 곡선은 도 8에 도시하였다. 종양 성장의 유사 패턴이 DU145 종양에서 획득되었다(도 7c).
실시예 8 - 바이러스 발현된 항체는 처리된 마우스의 혈청에서 검출가능하다
배양되는 바이러스-감염된 세포에서 항체 발현의 입증 후, 종양-보유 마우스에서 항체의 존재를 또한 조사하였다. 혈청 샘플은 7, 21, 및 35 dpi에서 동일 마우스로부터 안구 뒤에서 채취하였다. 모든 샘플은 항-FAP scAb의 존재에 대해 FAP-사전코팅된 플레이트를 사용하여, 항-EGFR 나노바디의 존재에 대해 EGFR-사전코딩된 플레이트를 사용하여, 그리고 항-VEGF scAb의 존재에 대해 VEGF-사전코딩된 플레이트를 사용하여 시험하였다. 모든 항체는 모든 3가지 시점에서 검출가능하였다(도 7d 내지 도 7f). GLAF-2의 발현은 7 및 21 dpi에서 GLV-1h444 및 GLV-1h446(2종 항체)로 처리된 마우스 보다 GLV-1h164(단일 항체)로 처리한 마우스가 더 낮아서, GLV-1h164-처리 그룹에서 14 dpi에서 종양의 낮은 바이러스 역가와 일관적이었다(도 9). 그럼에도 불구하고, 모든 경우에서, 초기 단계(7일 및 21일)에 항체의 발현은 낮은 종양 부피와 일치하였고 후기(35일)에 종양 수축이 선행되었다.
실시예 9 - 바이러스 발현된 2종 항체는 마우스에서 바이러스 분포 및 독성을 변경시키지 않는다
마우스에서 항체-발현 VACV 투여의 가능한 역효과를 처리 과정 동안 순 체중의 변화를 재서 평가하였다. A549 및 DU145 종양 이종이식 모델 둘 모두에서, 평균 순 체중에서 유의한 변화는 처리 그룹 또는 대조 그룹 어느 것에서도 관찰되지 않았다(도 10a 내지 도 10c). 표준 바이러스 플라크 검정으로 결정시 14 dpi에서 A549 종양-보유 마우스의 상이한 장기 및 종양에서 바이러스 생체분포를 또한 평가하였다(도 9). 모든 처리 종양에서 유의한 바이러스 역가가 검출되었고 다른 장기에서는 역가가 검출되지 않거나 또는 최소 역가가 검출되었다. 통계적으로 유지하지는 않지만, 항-FAP scAb를 발현하는 GLV-1h282, 및 항-EGFR 나노바디를 발현하는 GLV-1h442로 처리한 종양에서 바이러스 역가가 GLV-1h68로 처리한 종양에서 보다 더 높았는데 반해, 종양에서, 항-VEGF scAb를 발현하는 GLV-1h164의 바이러스 역가는 다른 바이러스 바이러스주보다 유의하게 낮았다(GLV-1h164 대 GLV-1h68, P = 0.02, 및 대 GLV-1h446, P = 0.04).
실시예 10 - TME에 대한 VEGF 및 EGFR 또는 VEGF 및 FAP를 표적으로 하는 종양내 발현된 2종 항체의 효과
TME에 대한 2종 바이러스 발현된 항체의 영향은 항-Ki67 및 항-CD31 항체로 36 dpi에서 획득된 종양 절개부를 염색하여 DU145 종양 이종이식편에서 BVD 및 세포 증식을 조사하여 평가하였다. VACV 감염은 GFP 형광발광으로 확인하였다. 증식하는 Ki67+ 세포의 IHC 염색의 대표적인 영상을 도 11a에 도시하였다. 종양의 감염된 영역에서, Ki67+ 세포는 GLV-1h68을 포함한, 임의의 VACV 균주로 처리 후 유의하게 감소되었다(도 11c). VACV-처리된 종양의 미감 염 영역에서, Ki67+ 세포는 단일 항-EGFR 나노-발현 VACV, GLV-1h442, 및 2종 항체-발현 VACV, GLV-1h444 및 GLV-1h446으로 처리한 후에만 유의하게 감소되었다(도 11b).
항-CD31 항체로 염색된 DU145 종양 절개부의 영상은 처리에 사용된 VACV와 무관하게 비감염된 영역과 비교하여 종양의 감염된 영역이 BVD에서 유의하게 감소되었다(도 12a 내지 도 12c). GLV-1h68과 비교하여, BVD에서 유의한 추가 감소가 단독으로 또는 다른 항체와 조합하여, 항-VEGF 항체를 발현하는 VACV(GLAF-2)에서 관찰되었다. 예상한 바와 같이, 항-VEGF가 아닌 항-EGFR을 발현하는, GLV-1h442를 처리한 종양에서 BVD는 GLV-1h68을 처리한 종양과 유의하게 상이하지 않았지만, GLV-1h444 및 GLV-1h446으로 처리된 감염 영역은 추가의 감소된 BVD를 보여주었다.
본 명세서에서 이용된 모든 출판물은 참조로 본원에 편입된다.
본 명세서에서 예시적으로 기술된 본 개시내용은 본원에 특별히 개시하지 않은, 임의의 성분 또는 성분들, 제한 또는 제한들 부재 하에서 적합하게 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 용어 "포함하는", "포괄하는", "함유하는" 등은 확장적으로 제한없이 해석되어야 한다. 부가적으로, 본 명세서에서 적용된 용어들 및 표현들은 설명의 용어로서 사용되며 제한하는 것이 아니고, 도시하고 기술된 특징들의 임의 균등물 또는 이의 일부를 배제하는 그러한 용어 및 표현의 사용을 의도하는 것이 아니며, 청구된 본 개시내용의 범주 내에서 다양한 변형이 가능하다는 것을 인식한다.
다른 실시형태들은 하기 청구범위에 기재된다.

Claims (58)

  1. 대상체에서 고형 종양을 치료하기 위한 방법으로서, 상기 대상체에게 상기 종양에서 세포를 감염시킬 수 있는 재조합 바이러스, 또는 상기 종양에서 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스를 포함하는 세포를 투여하는 단계를 포함하되, 상기 바이러스는 (i) 종양 미세환경(TME)을 표적으로 하는 2종 이상의 항체; (ii) 상기 TME를 표적으로 하는 2종 이상의 자극성 또는 억제성 단백질, 또는 (iii) 상기 TME를 표적으로 하는 적어도 1종의 항체 및 상기 TME를 표적으로 하는 적어도 1종의 자극성 또는 억제성 단백질을 발현하는, 고형 종양을 치료하기 위한 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 바이러스는 종양세포붕괴성 바이러스인, 고형 종양을 치료하기 위한 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 종양세포붕괴성 바이러스는 백시니아 바이러스인, 고형 종양을 치료하기 위한 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 바이러스는 복제 능력있는 종양세포붕괴성 백시니아 바이러스(VACV)인, 고형 종양을 치료하기 위한 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스는 상기 TME를 표적으로 하는 2종 이상의 항체를 발현하는, 고형 종양을 치료하기 위한 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 2종 이상의 항체는 (a) 혈관생성 및/또는 혈관신생을 자극하는 단백질에 결합하는 항체, (b) 상피 성장 인자 수용체(EGFR), Her2/c-neu, Her3 및 Her4로 이루어진 군으로부터 선택된 수용체 티로신 키나제에 결합하는 항체, 및 (c) 상피-중간엽 상호작용의 발생에 관여하는 단백질에 결합하는 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 고형 종양을 치료하기 위한 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 2종 이상의 항체는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)에 결합하는 항체, 상피 성장 인자 수용체(EGFR)에 결합하는 항체, 및 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 결합하는 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 고형 종양을 치료하기 위한 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 바이러스는 VEGF에 결합하는 항체, EGFR에 결합하는 항체, 및 FAP에 결합하는 항체를 발현하는, 고형 종양을 치료하기 위한 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 2종 이상의 항체 중 1종은 VEGF에 결합하는 항체인, 고형 종양을 치료하기 위한 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 VEGF에 결합하는 항체는 G6-31인, 고형 종양을 치료하기 위한 방법.
  11. 제7항에 있어서, 상기 2종 이상의 항체 중 1종은 EGFR에 결합하는 항체인, 고형 종양을 치료하기 위한 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 EGFR에 결합하는 항체는 항-EGFRVHH인, 고형 종양을 치료하기 위한 방법.
  13. 제7항에 있어서, 상기 2종 이상의 항체 중 1종은 FAP에 결합하는 항체인, 고형 종양을 치료하기 위한 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 FAP에 결합하는 항체는 M036인, 고형 종양을 치료하기 위한 방법.
  15. 제7항에 있어서, 상기 2종 이상의 항체는 VEGF에 결합하는 항체 및 EGFR에 결합하는 항체를 포함하는, 고형 종양을 치료하기 위한 방법.
  16. 제7항에 있어서, 상기 2종 이상의 항체는 VEGF에 결합하는 항체 및 FAP에 결합하는 항체를 포함하는, 고형 종양을 치료하기 위한 방법.
  17. 제7항에 있어서, 상기 2종 이상의 항체는 EGFR에 결합하는 항체 및 FAP에 결합하는 항체를 포함하는, 고형 종양을 치료하기 위한 방법.
  18. 제4항에 있어서, 상기 VACV는 GLV-1h444 및 GLV-1h446에서 선택되는, 고형 종양을 치료하기 위한 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 추가의 암 요법을 투여하는 단계를 더 포함하는, 고형 종양을 치료하기 위한 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 추가의 암 요법은 방사선 요법, 화학요법, 면역요법, 광선요법, 및 이들의 조합에서 선택되는, 고형 종양을 치료하기 위한 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양은 교아세포종, 유방 암종, 폐 암종, 전립선 암종, 결장 암종, 난소 암종, 신경아세포종, 중추신경계 종양, 및 흑색종에서 선택되는, 고형 종양을 치료하기 위한 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스는 상기 대상체에게 정맥내로 전달되는, 고형 종양을 치료하기 위한 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 바이러스는 종양에 직접 정맥내로 전달되거나, 또는 종양의 영역 내로 상기 대상체에게 전달되는, 고형 종양을 치료하기 위한 방법.
  24. 제1항에 있어서, 상기 대상체에게 상기 종양에서 세포를 감염시킬 수 있는 적어도 1종의 추가의 바이러스를 제공하는 단계를 더 포함하되, 상기 적어도 1종의 추가의 바이러스는 (i) 상기 종양 미세환경(TME)을 표적으로 하는 항체 또는 (ii) 상기 TME를 표적으로 하는 자극성 또는 억제성 단백질 중 1종 이상을 발현하고, 상기 1종 이상의 추가의 바이러스에 의해 발현되는 상기 1종 이상의 (i) 상기 TME를 표적으로 하는 항체 또는 (ii) 상기 TME를 표적으로 하는 자극성 또는 억제성 단백질은 제1항에 따라 제공되는 상기 바이러스에 의해 발현되는 상기 항체와 비교하여 상이한, 고형 종양을 치료하기 위한 방법.
  25. 제1항에 있어서, 상기 대상체에게 적어도 1종의 추가의 바이러스를 투여하는 단계를 더 포함하되, 상기 적어도 1종의 추가의 바이러스는 (i) 상기 종양 미세환경(TME)을 표적으로 하는 2종 이상의 항체; (ii) 상기 TME를 표적으로 하는 2종 이상의 자극성 또는 억제성 단백질, 또는 (iii) 상기 TME를 표적으로 하는 적어도 1종의 항체 및 상기 TME를 표적으로 하는 적어도 1종의 자극성 또는 억제성 단백질을 발현하고, 상기 적어도 1종의 추가의 바이러스는 제1항에 따라 제공되는 상기 바이러스에 의해 발현되는 것들과는 상이한 (i) 상기 종양 미세환경(TME)을 표적으로 하는 2종 이상의 항체; (ii) 상기 TME를 표적으로 하는 2종 이상의 자극성 또는 억제성 단백질, 또는 (iii) 상기 TME를 표적으로 하는 적어도 1종의 항체 및 상기 TME를 표적으로 하는 적어도 1종의 자극성 또는 억제성 단백질을 발현하는, 고형 종양을 치료하기 위한 방법.
  26. 고형 종양에서 세포를 감염시킬 수 있는 재조합 바이러스로서, 상기 바이러스는 (i) 종양 미세환경(TME)을 표적으로 하는 2종 이상의 항체; (ii) 상기 TME를 표적으로 하는 2종 이상의 자극성 또는 억제성 단백질, 또는 (iii) 상기 TME를 표적으로 하는 적어도 1종의 항체 및 상기 TME를 표적으로 하는 적어도 1종의 자극성 또는 억제성 단백질을 발현하는, 재조합 바이러스.
  27. 제26항에 있어서, 상기 바이러스는 종양세포붕괴성 바이러스인, 재조합 바이러스.
  28. 제27항에 있어서, 상기 종양세포붕괴성 바이러스는 백시니아 바이러스인, 재조합 바이러스.
  29. 제28항에 있어서, 상기 바이러스는 복제 능력있는 종양세포붕괴성 백시니아 바이러스(VACV)인, 재조합 바이러스.
  30. 제26항에 있어서, 상기 바이러스는 2종 이상의 항체를 발현하는, 재조합 바이러스.
  31. 제30항에 있어서, 상기 2종 이상의 항체는 (i) 혈관생성 및/또는 혈관신생을 자극하는 단백질에 결합하는 항체, (ii) 상피 성장 인자 수용체(EGFR), Her2/c-neu, Her3 및 Her4로 이루어진 군으로부터 선택되는 수용체 티로신 키나제에 결합하는 항체, 및 (iii) 상피-중간엽 상호작용의 발생에 관여하는 단백질에 결합하는 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 바이러스.
  32. 제26항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 혈관 내피 성장 인자(VEGF)에 결합하는 항체, 상피 성장 인자 수용체(EGFR)에 결합하는 항체, 및 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 결합하는 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 2종 이상의 항체를 코딩하는 2종 이상의 이종성 핵산을 포함하는, 재조합 바이러스.
  33. 제32항에 있어서, 상기 2종 이상의 항체 중 1종은 VEGF에 결합하는 항체인, 재조합 바이러스.
  34. 제33항에 있어서, 상기 VEGF에 결합하는 항체는 G6-31인, 재조합 바이러스.
  35. 제32항에 있어서, 상기 2종 이상의 항체 중 1종은 EGFR에 결합하는 항체인 재조합 백시니아 바이러스.
  36. 제35항에 있어서, 상기 EGFR에 결합하는 항체는 항-EGFRVHH인, 재조합 바이러스.
  37. 제32항에 있어서, 상기 2종 이상의 항체 중 1종은 FAP에 결합하는 항체인, 재조합 바이러스.
  38. 제37항에 있어서, 상기 FAP에 결합하는 항체는 M036인, 재조합 바이러스.
  39. 제32항에 있어서, 상기 2종 이상의 항체는 VEGF에 결합하는 항체 및 EGFR에 결합하는 항체를 포함하는, 재조합 바이러스.
  40. 제32항에 있어서, 상기 2종 이상의 항체는 VEGF에 결합하는 항체 및 FAP에 결합하는 항체를 포함하는, 재조합 바이러스.
  41. 제32항에 있어서, 상기 2종 이상의 항체는 EGFR에 결합하는 항체 및 FAP에 결합하는 항체를 포함하는, 재조합 바이러스.
  42. 제29항에 있어서, 상기 VACV는 GLV-1h444 및 GLV-1h446에서 선택되는, 재조합 바이러스.
  43. 제26항에 있어서, 상기 바이러스는 리스터 균주(lister strain)인, 재조합 바이러스.
  44. 제28항에 있어서, 상기 A34R 유전자는 다른 백시니아 바이러스 바이러스주 유래의 상기 A34R 유전자로 치환되는, 재조합 바이러스.
  45. 제44항에 있어서, 상기 A34R 유전자는 백시니아 IHD-J 바이러스주 유래의 상기 34R 유전자로 치환되는, 재조합 바이러스.
  46. 제28항에 있어서, 상기 A35R 유전자의 결실을 포함하는, 재조합 바이러스.
  47. 제26항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 진단 또는 치료 단백질을 코딩하는 추가의 이종성 핵산 분자를 더 포함하는, 재조합 바이러스.
  48. 제47항에 있어서, 상기 추가의 이종성 핵산 분자는 진단 단백질을 코딩하는, 재조합 바이러스.
  49. 제48항에 있어서, 상기 진단 단백질은 루시퍼라제, 형광발광성 단백질, 철 저장 분자, 철 수송인자, 철 수용체 또는 조영제에 결합하는 단백질, 발색단 또는 검출할 수 있는 화합물 또는 검출가능한 리간드 중에서 선택되는, 재조합 바이러스.
  50. 제47항에 있어서, 상기 추가의 이종성 핵산 분자는 치료 단백질을 코딩하는, 재조합 바이러스.
  51. 제50항에 있어서, 상기 치료 단백질은 사이토카인, 케모카인, 면역조절성 분자, 항원, 단쇄 항체, 안티센스 RNA, 프로드러그 전환 효소, siRNA, 혈관생성 억제제, 생물학적 독소, 항종양 올리고펩타이드, 유사분열 억제제 단백질, 항유사분열 올리고펩타이드, 항암 폴리펩타이드 항생제, 및 조직 인자 중에서 선택되는, 재조합 바이러스.
  52. 제26항 내지 제51항 중 어느 한 항의 재조합 바이러스를 포함하는 숙주 세포.
  53. 제26항 내지 제51항 중 어느 한 항의 재조합 바이러스를 포함하는 종양 세포.
  54. 제26항 내지 제51항 중 어느 한 항의 상기 재조합 바이러스를 포함하거나, 또는 이로 감염된 포유동물 유기체.
  55. 대상체에서 종양의 상기 치료를 위한 제26항 내지 제51항 중 어느 한 항의 재조합 백시니아 바이러스의 용도.
  56. 대상체에서 종양의 상기 치료를 위한 약학 조성물의 제조를 위한 제26항 내지 제51항 중 어느 한 항의 재조합 바이러스의 용도.
  57. 제56항에 있어서, 상기 약학 조성물은 항암 화합물을 더 포함하는, 재조합 바이러스의 용도.
  58. 대상체에서 고형 종양을 치료하기 위한 방법에서, 종양에서 세포를 감염시킬 수 있는 재조합 바이러스, 또는 종양에서 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스를 포함하는 세포의 용도로서, 상기 방법은 상기 대상체에게 종양에서 세포를 감염시킬 수 있는 상기 재조합 바이러스, 또는 종양에서 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스를 포함하는 상기 세포를 투여하는 단계를 포함하고, 상기 바이러스는 (i) 종양 미세환경(TME)을 표적으로 하는 2종 이상의 항체; (ii) 상기 TME를 표적으로 하는 2종 이상의 자극성 또는 억제성 단백질, 및 (iii) 상기 TME를 표적으로 하는 적어도 1종의 항체 및 상기 TME를 표적으로 하는 적어도 1종의 자극성 또는 억제성 단백질을 발현하는, 용도.
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