JP4705026B2 - 血管内皮増殖促進遺伝子 - Google Patents
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Description
1.以下:
(a)配列番号1に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を含む、ポリヌクレオチド;
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントをコードする配列を含む、ポリヌクレオチド、
(c)配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも1つの変異を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド、;
(d)(a)〜(c)のいずれか1つのポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド;および
(e)(a)〜(c)のいずれか1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも70%である塩基配列からなるポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドであって、ここで、前記ポリヌクレオチドは、血管内皮細胞増殖活性、c−fosプロモーターからの転写促進活性、VEGFプロモーターからの転写促進活性、および血管新生活性からなる群から選択される活性を有するペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
2.配列番号1に記載の塩基配列を有する、項目1に記載のポリヌクレオチド。
3.配列番号2に記載のアミノ酸配列をコードする、項目1に記載のポリヌクレオチド。
4.血管新生活性を有するペプチドをコードする、項目1に記載のポリヌクレオチド。
5.血管内皮細胞増殖活性を有するペプチドをコードする、項目1に記載のポリヌクレオチド。
6.項目1に記載のポリヌクレオチドを含有する、血管新生のための薬学的組成物。
7.項目1に記載のポリヌクレオチドを含有する、血管内皮細胞増殖のための薬学的組成物。
8.項目1に記載のポリヌクレオチドを含有する、閉塞性動脈疾患、閉塞性動脈硬化症、バージャー病、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞、虚血性心疾患、および虚血性脳疾患からなる群から選択される疾患の処置のための薬学的組成物。
9.組織の血管新生を生じさせる方法であって、以下;
(1)血管新生を生じさせる組織を提供する工程;および
(2)該血管内皮細胞に項目1に記載のポリヌクレオチドを含む核酸を導入する工程、を包含する、方法。
10.前記血管新生は、インビボ、エキソビボまたはインビトロで行われる、項目9に記載の方法。
11.前記組織は、閉塞性動脈疾患、閉塞性動脈硬化症、バージャー病、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞、虚血性心疾患、および虚血性脳疾患からなる群から選択される疾患を含む状態にある、項目9に記載の方法。
12.血管内皮細胞を増殖させる方法であって、以下;
(1)血管内皮細胞を提供する工程;および
(2)該血管内皮細胞に項目1に記載のポリヌクレオチドを含む核酸を導入する工程、を包含する、方法。
13.前記血管内皮細胞の増殖は、インビボ、エキソビボまたはインビトロで行われる、項目12に記載の方法。
14.前記血管内皮細胞は、閉塞性動脈疾患、閉塞性動脈硬化症、バージャー病、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞、虚血性心疾患、および虚血性脳疾患からなる群から選択される疾患を含む組織中にある、項目12に記載の方法。
15.項目1に記載のポリヌクレオチドを含む、プラスミド。
16.項目1に記載のポリヌクレオチドを含む、遺伝子導入ベクター。
17.血管内皮細胞を増殖させる方法であって、以下;
(1)血管内皮細胞を提供する工程;および
(2)該血管内皮細胞に項目16に記載の遺伝子導入ベクターを接触させる工程、を包含する、方法。
18.項目1に記載のポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド。
19.以下:
(a)配列番号1に記載の塩基配列またはそのフラグメントによってコードされるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド;
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む、ポリペプチド、
(c)配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも1つの変異を有する改変体ポリペプチド;および
(d)(a)〜(c)のいずれか1つのポリペプチドのアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも70%であるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、からなる群から選択されるポリペプチドであって、ここで、前記ポリペプチドは、血管内皮細胞増殖活性、c−fosプロモーターからの転写促進活性、VEGFプロモーターからの転写促進活性、および血管新生活性からなる群から選択される活性を有する、ポリペプチド。
20.配列番号1に記載の塩基配列によってコードされる、項目19に記載のポリペプチド。
21.配列番号2に記載のアミノ酸配列を有する、項目19に記載のポリペプチド。
22.血管新生活性を有する、項目19に記載のポリペプチド。
23.血管内皮細胞増殖活性を有する、項目19に記載のポリペプチド。
24.項目19に記載のポリペプチドを含有する、血管新生のための薬学的組成物。
25.項目19に記載のポリペプチドを含有する、血管内皮細胞増殖のための薬学的組成物。
26.項目19に記載のポリペプチドを含有する、閉塞性動脈疾患、閉塞性動脈硬化症、バージャー病、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞、虚血性心疾患、および虚血性脳疾患からなる群から選択される疾患の処置のための薬学的組成物。
27.組織の血管新生を生じる方法であって、以下;
(1)血管新生する組織を提供する工程;および
(2)該血管内皮細胞に項目19に記載のポリペプチドを接触させる工程、を包含する、方法。
28.前記血管新生は、インビボ、エキソビボまたはインビトロで行われる、項目27に記載の方法。
29.前記組織は、閉塞性動脈疾患、閉塞性動脈硬化症、バージャー病、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞、虚血性心疾患、および虚血性脳疾患からなる群から選択される疾患を含む状態にある、項目27に記載の方法。
30.血管内皮細胞を増殖させる方法であって、以下;
(1)血管内皮細胞を提供する工程;および
(2)該血管内皮細胞に項目18に記載のポリペプチドを接触させる工程、を包含する、方法。
31.前記血管内皮細胞の増殖は、インビボ、エキソビボまたはインビトロで行われる、項目30に記載の方法。
32.前記血管内皮細胞は、閉塞性動脈疾患、閉塞性動脈硬化症、バージャー病、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞、虚血性心疾患、および虚血性脳疾患からなる群から選択される疾患を含む組織中にある、項目30に記載の方法。
33.項目1に記載のポリヌクレオチドを含む抗菌剤。
34.項目18または19に記載のポリペプチドを含む抗菌剤。
35.項目1に記載のポリヌクレオチドを含む、感染症を処置するための薬学的組成物。
36.項目18または19に記載のポリペプチドを含む、感染症を処置するための薬学的組成物。
37.項目1に記載のポリヌクレオチドを含む、IGF産生増強のための組成物。
38.項目18または19に記載のポリペプチドを含む、IGF産生増強のための組成物。
[図2]図2は、本発明において単離された核酸のc−fosプロモーターアッセイの結果を示す図である。
[図3]図3は、本発明において単離されたクローンp3743の、c−fosプロモーターアッセイおよびVEGFプロモーターアッセイの結果である。
[図4]図4は、ヒト大動脈内皮細胞およびヒト大動脈平滑筋細胞におけるMTSアッセイの結果である。
[図5]図5は、血管新生活性測定の結果を示す写真である。
[図6]図6は、血管新生定量ソフトによる画像解析を示す図である。
[図7]図7は、本発明の候補配列を模式的に示した図である。
[図8]図8は、p3743−f1およびp3743−f2のc−fosプロモーターアッセイを示す結果である。
[図9]図9は、ヒト大動脈血管内皮細胞の増殖に対するF2ペプチドの影響(MTSアッセイ)を示す結果である。
[図10]図10は、種々の濃度のF2ペプチドの、内皮細胞増殖に対する影響を示す結果である。
[図11]図11は、種々の濃度のF2ペプチドの、内皮細胞増殖に対する影響を示す結果である。比較対照として、コントロールペプチドおよびVEGFの結果を示す。
[図12]図12は、F2ペプチドの、インビボでの血管新生促進活性を示す結果である。比較対照として、コントロールペプチドの結果を示す。
[図13]図13は、抗CD31抗体を用いる免疫染色を用いて、F2ペプチドの、インビボでの血管新生促進活性を示す結果である。比較対照として、ネガティブコントロール、コントロールペプチド、およびVEGFの結果を示す。
[図14]図14は、種々の濃度のF2ペプチドと、種々の濃度のLL−37ペプチドとの、内皮細胞増殖に対する影響を示す結果である。
[図15]図15は、種々の濃度のF2ペプチドと、種々の濃度のLL−37ペプチドとの、血管新生促進活性を示す結果である。
[図16]図16は、種々の増殖因子をコードするmRNA発現量に対する、F2ペプチドの影響を示す結果である。
配列表の説明
配列番号2:血管新生活性を有する新規ペプチドF2のアミノ酸配列
配列番号3:プラスミドp3743のインサート配列配列番号4:血管新生活性を有する新規ペプチドF1をコードする核酸配列
配列番号5:血管新生活性を有する新規ペプチドF1のアミノ酸配列
配列番号6:内皮細胞の遊走活性測定のためのコントロールペプチド
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
血性を示す。
Tm(℃)=81.5+16.6(log[Na+])+0.41(%G+C)−600/N−0.72(%ホルムアミド)
ここで、Nは、形成される二重鎖の長さであり、[Na+]は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、%G+Cは、ハイブリッド中の(グアニン+シトシン)塩基のパーセンテージである。不完全に一致したハイブリッドに関して、融解温度は、各1%不一致(ミスマッチ)に対して約1℃ずつ減少する。
の配列に付加が含まれていればギャップが生じることもあるが、ここでの基準配列は付加も欠失もないものとする)と比較したときに、付加または欠失(すなわちギャップ)が含ま
れる場合がある。同一の核酸塩基またはアミノ酸残基がどちらの配列にも認められる位置の数を求めることによって、マッチ位置の数を求め、マッチ位置の数を比較ウィンドウ内の総位置数で割り、得られた結果に100を掛けて同一性のパーセンテージを算出する。検索において使用される場合、相同性については、従来技術において周知のさまざまな配列比較アルゴリズムおよびプログラムの中から、適当なものを用いて評価する。このようなアルゴリズムおよびプログラムとしては、TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTAおよびCLUSTALW(Pearson and Lipman,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(8):2444−2448、Altschul et al.,1990,J.Mol.Biol.215(3):403−410、Thompson et al.,1994,Nucleic Acids Res.22(2):4673−4680、Higgins et al.,1996,Methods Enzymol.266:383−402、Altschul et al.,1990,J.Mol.Biol.215(3):403−410、Altschul et al.,1993,Nature Genetics 3:266−272)があげられるが、何らこれに限定されるものではない。特に好ましい実施形態では、従来技術において周知のBasic Local Alignment Search Tool(BLAST)(たとえば、Karlin and Altschul,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2267−2268、Altschul et al.,1990,J.Mol.Biol.215:403−410、Altschul et al.,1993,Nature Genetics 3:266−272、Altschul et al.,1997,Nuc.Acids Res.25:3389−3402を参照のこと)を用いてタンパク質および核酸配列の相同性を評価する。特に、5つの専用BLASTプログラムを用いて以下の作業を実施することによって比較または検索が達成され得る。
(2)BLASTNでヌクレオチドのクエリー配列をヌクレオチド配列データベースと比較;
(3)BLASTXでヌクレオチドのクエリー配列(両方の鎖)を6つの読み枠で変換した概念的翻訳産物をタンパク質配列データベースと比較;
(4)TBLASTNでタンパク質のクエリー配列を6つの読み枠(両方の鎖)すべてで変換したヌクレオチド配列データベースと比較;
(5)TBLASTXでヌクレオチドのクエリ配列を6つの読み枠で変換したものを、6つの読み枠で変換したヌクレオチド配列データベースと比較。
あるタンパク質分子において、配列に含まれるあるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、カチオン性領域または基質分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのDNAコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応するDNAにおいて行われ得る。
本発明において用いられる配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチドならびにそのフラグメントおよび改変体は、遺伝子工学技術を用いて生産することができる。
Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY、別冊実験医学「遺伝子導入&発現解析実験法」羊土社、1997などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。
本発明のポリペプチドをコードするDNAを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、動物細胞などに由来する形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、本発明のポリペプチドを生成蓄積させ、本発明の培養物より本発明のポリペプチドを採取することにより、本発明に係るポリペプチドを製造することができる。
本発明のポリペプチドのアミノ酸の欠失、置換もしくは付加(融合を含む)は、周知技術である部位特異的変異誘発法により実施することができる。かかる1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加は、Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Current Protocols in Molecular Biology,Supplement 1〜38,JohnWiley & Sons(1987−1997)、Nucleic Acids Research,10,6487(1982)、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,79,6409(1982)、Gene,34,315(1985)、Nucleic Acids Research,13,4431(1985)、Proc.Natl.Acad.Sci USA,82,488(1985)、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,81,5662(1984)、Science,224,1431(1984)、PCT WO85/00817(1985)、Nature,316,601(1985)等に記載の方法に準じて調製することができる。
本明細書におけるペプチド、化学物質、低分子などの因子は、合成化学技術を用いて合成することができる。そのような合成化学技術は、当該分野において周知の技術を用いることができる。そのような周知技術としては、例えば、Fiesers’Reagents for OrganicSynthesis(Fieser’s Reagents forOrganic Synthesis)Tse−Lok Ho,John Wiley & Sons Inc(2002)などを参照することができる。
本発明のポリペプチドを認識する抗体の作製もまた当該分野において周知である。例えば、ポリクローナル抗体の作製は、取得したポリペプチドの全長または部分断片精製標品、あるいは本発明のタンパク質の一部のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原として用い、動物に投与することにより行うことができる。
本発明の抗体は、抗体の合成のために当該分野で公知の任意の方法によって、化学合成によって、または、好ましくは、組換え発現技術によって産生され得る。
本明細書において「スクリーニング」とは、目的とするある特定の性質をもつ生物または物質などの標的を、特定の操作/評価方法で多数を含む集団の中から選抜することをいう。スクリーニングのために、本発明の因子(例えば、抗体)、ポリペプチドまたは核酸分子を使用することができる。スクリーニングは、インビトロ、インビボなど実在物質を用いた系を使用してもよく、インシリコ(コンピュータを用いた系)の系を用いて生成されたライブラリーを用いてもよい。本発明では、所望の活性を有するスクリーニングによって得られた化合物もまた、本発明の範囲内に包含されることが理解される。また本発明では、本発明の開示をもとに、コンピュータモデリングによる薬物が提供されることも企図される。
本発明のポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含む発現ベクターおよび遺伝子導入ベクター、アンチセンス核酸、ポリペプチド、ならびにポリペプチドに対する抗体は、血管内皮細胞増殖促進のため、c−fosプロモーターからの転写促進のため、VEGFプロモーターからの転写促進のため、および血管新生促進のため、ならびに、閉塞性動脈硬化症、バージャー病、末梢血管病、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞、虚血性心疾患、および虚血性脳疾患の処置、予防、診断または予後のための薬学的組成物の成分としても使用することが可能である。
遺伝子治療の方法の一般的な概説については、Goldspielら,Clinical Pharmacy 12:488−505(1993);WuおよびWu,Biotherapy 3:87−95(1991);Tolstoshev,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573−596(1993);Mulligan,Science 260:926−932(1993);ならびにMorganおよびAnderson,Ann.Rev.Biochem.62:191−217(1993);May,TIBTECH 11(5):155−215(1993)を参照のこと。遺伝子治療において使用される一般的に公知の組換えDNA技術は、AuSubelら(編),Current Protcols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,NY(1993);およびKriegler,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY(1990)に記載される。
り直接注入や血管内投与によるターゲティングなどが可能である。またポリペプチドの場合は、HVJ−Eが好ましく、直接投与が効果的であると考えられる。またゼラチンハイドロ
ゲルやアテロコラーゲン、ポリ乳酸に封入して虚血部位の近く(筋肉中、脳内、皮下など)に埋め込み徐放化させる方法もある。
本明細書において使用される技術は、そうではないと具体的に指示しない限り、当該分野の技術範囲内にある、糖鎖科学、マイクロフルイディクス、微細加工、有機化学、生化学、遺伝子工学、分子生物学、微生物学、遺伝学および関連する分野における周知慣用技術を使用する。そのような技術は、例えば、以下に列挙した文献および本明細書において他の場所おいて引用した文献においても十分に説明されている。
本発明はまた、有効量の治療剤の被験体への投与による、疾患または障害(例えば、感染症)の処置および/または予防の方法を提供する。治療剤は、薬学的に受容可能なキャリア型(例えば、滅菌キャリア)と組み合せた、本発明の組成物を意味する。
(ウイルスの調製)
HVJ、Z株を、先に記載のように(Kaneda、Cell Biology:A Laboratory Handbook,J.E.Celis(Ed.),Academic Press,Orlando,Florida,vol.3,pp.50−57(1994))差示的遠心分離により精製した。精製HVJを平衡化塩溶液(BSS:137mM NaCl、5.4mM KCl、10mM Tris−HCl、pH7.5)中に再懸濁し、そしてウイルス力価を、540nmにおける吸光度を測定することにより決定した。540nmにおける光学的密度は、15,000血球凝集単位(HAU)に対応し、融合活性と相関する。
3.56mgホスファチジルコリンおよび0.44mgコレステロールの脂質混合物を、クロロホルム中に溶解し、そしてこの脂質溶液を、ロータリーエバポレーター中で蒸発させた(Uchidaら、J.Cell.Biol.80:10−20(1979))。乾燥脂質混合物を、0.85% NP−40を含む2.0mlの上記素通り画分からのタンパク質溶液(1.6mg)中にボルテックスにより完全に溶解した。次いで、この溶液を0.3Mスクロースおよび1mM KClを含む10mMリン酸緩衝液(pH7.2)に対して透析し、NP−40を除去した。透析は、毎日緩衝液を交換して6日間実施した。この透析された溶液を、0.3M スクロースおよび1mM KClを含む10mMリン酸緩衝液(pH5.2)で平衡化したアガロースビーズ(Bio−Gel A−50m)(Bio−Rad Laboratories、Hercules、CA、USA)にアプライした。540nmにおける光学的密度が1.5を超える画分を再構成融合粒子として集め、そして以下に記載のように10mg脂質から調製された核酸充填リポソームと融合し、遺伝子導入ベクターを調製した。
上記の方法で調製した遺伝子導入ベクターの遺伝子導入活性を確認するために、ヒトHEK293株およびルシフェラーゼ遺伝子を、以下のように用いた。
(1:HVJの増殖)
HVJは鶏の受精卵への種ウイルスの接種により増殖されたものが一般に使用され得るが、サル、ヒトなどの培養細胞、培養組織へのウイルスの持続感染系(トリプシンなどの加水分解酵素を培養液中に添加)を利用して増殖させたもの、クローニングされたウイルスゲノムを培養細胞に感染させ持続感染をおこさせて増殖させたもの、全てが利用可能である。
HVJは、遠心分離による精製方法、カラムによる精製方法、または当該分野において公知のその他の精製方法によって、精製され得る。
(2.1:遠心分離による精製方法)
手短には、増殖させたウイルス液を回収し低速遠心で培養液や漿尿液中の組織・細胞片を除去した。その上清を高速遠心(27,500×g、30分間)とショ糖密度勾配(30〜60%w/v)を利用した超遠心(62,800×g、90分間)により精製した。精製の間にウイルスをできるだけ穏和に扱い、4℃で保存することに注意すべきである。
(2.2:カラムおよび限外濾過による精製方法)
遠心分離による精製方法に代えて、カラムによるHVJの精製も本発明に適用可能である。
HVJの不活性化が必要な場合、以下に記載するように、紫外線照射またはアルキル化剤処理により行った。
HVJ懸濁液1mlを30mm径のシャーレにとり、99または198ミリジュール/cm2を照射した。ガンマー線照射も利用可能である(5〜20グレイ)が完全な不活性化がおこらない。
使用直前に、10mM KH2PO中に0.01% β−プロピオラクトンの調製をした。作業中は低温下に保ち素早く作業を行った。
保存してあったHVJに外来DNA200〜800μgを含む溶液92μlを加えてピペッティングでよく懸濁した。この溶液は、−20℃で、少なくとも3ヶ月保存可能である。HVJとの混合前にDNAに硫酸プロタミンを添加すると、発現効率が2倍以上増強した。
(遺伝子導入方法)
1,000HAU分をエッペンドルフチューブにとり(30μl)、硫酸プロタミン(1mg/ml)5μ1を加えた。BHK−21細胞(前日に、ウェルあたり200,000個で、6つのウェルにまいたもの)の培地を交換し、1ウェルあたり0.5mlの培地(10%FCS−DMEM)を添加した。各ウェルに、上記のベクター(1,000HAU相当)と硫酸プロタミンの混合液を加え、プレートを前後左右にふってベクターと細胞を良く混ぜ合わせ、37℃で、5%CO2インキュベーター中に10分間放置した。
本発明を用いることによって、所望の機能的性質を有する目的遺伝子を分離することが可能である。その分離方法の実施形態の1つを模式的に図1に示す。
クラボウの血管新生キット(Angiogenesis Kit,KZ−1000,倉敷紡績株式会社)を用いて管腔形成を調べた。対照として、ブランク、血管内皮細胞増殖因子−Aタンパク質(VEGF−A)、pVEGFプラスミド(血管内皮細胞増殖因子をコードする遺伝子を含むプラスミド)、pSPORT1(血管内皮細胞増殖因子をコードする遺伝子を含まないプラスミド)を用いた。
配列決定を行ったところ、癌抗原遺伝子として報告のあったSART−2(塩基配列No.1−3958)のC末221個のアミノ酸よりなるポリペプチド断片(SART−2の塩基配列No.2364−3958;配列番号3)であった。このなかで蛋白をコードできる候補は2つあり、それらはSART−2とインフレームであるf1(塩基配列No.2764−3073;配列番号4),SART−2とはフレームがずれているF2(塩基配列No.2660−2750;配列番号1)であったので、これら遺伝子断片をPCRで増幅してCMVプロモーターをもつ発現ベクターpCDNA3.1につないだ(図7)。これら遺伝子の細胞増殖能をc−fosプロモーターアッセイで行ったところ、f1は活性がなく、F2はVEGFと同等の活性を有していた(図8)。なおHGFとVEGFのc−fosプロモーターアッセイ活性化能はほぼ同等であった。そこでF2ペプチドについて以下解析を進めた。
(1.MTSアッセイによるHEAC細胞増殖能の解析)
F2ペプチドを合成し、その様々な量をHAECと接触させ、増殖能をMTSアッセイによって調べた。MTSアッセイとは、MTTアッセイの変法であって、培養中の生細胞によりテトラゾリウム塩(MTS)を発色産物ホルマザンに還元する反応をベースにした生細胞の測定方法である。具体的には、以下のように行う。
・HAECを750細胞/ウェルで96ウェルプレートに播種した
・100μl/ウェルの内皮細胞用培地(1%FBS、EGF添加なし)にそれぞれのサンプルを2μl/ウェルずつ添加した。毎日(6日目まで)2μl/ウェルを添加した(培地交換はしない)。
・1ウェルあたり、測定溶液(Cell Titer 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega社))を20μl添加し、100μlの内皮細胞用培地と混合し、古い培地を吸引して除いた。測定溶液と細胞の混合溶液を1ウェルあたり120μl入れてCO2インキュベーターで1〜5時間インキュベートした。
・プレートリーダーにて490nmの吸光度を測定した。
NC:1% FBSを添加したEBM培地(内皮細胞用培地)のみ。他のサンプルは、この血清添加した培地に、各種ペプチドを添加した。
VEGF−A:組換えVEGF−A(KURABO社)を、終濃度が10ng/mlになるように添加した。
F2−1:F2ペプチドを、終濃度が1ng/mlになるように添加した。
F2−10:F2ペプチドを、終濃度が10ng/mlになるように添加した。
F2−100:F2ペプチドを、終濃度が100ng/mlになるように添加した。
F2−1000:F2ペプチドを、終濃度が1000ng/mlになるように添加した。
その結果、図9に示すように、VEGF蛋白と同様に、用量依存的に、F2ペプチドの細胞増殖能を認めた。この結果は、F2ペプチドがVEGFよりも強いHEAC増殖促進活性を有することを示す。F2ペプチドのアミノ酸配列は、
MLSLIFLHRLKSMRKRLDRKLRFWHRKNYP(配列番号2)の30アミノ酸であり、正に荷電したヘリックスペプチドであり、天然には存在しない人工的活性ペプチドであることが明らかになった。このペプチドは、その構造自体も、さらにその活性の報告も全くない新規物質である。
HEAC内皮細胞の遊走を、改変したBoydenチャンバー(Rikitake,Yら、Arterioscler Thromb Vasc Biol 20,1006−1012(2000))を使用して、アッセイした。8μの孔をを有する、ポリビニルピロリドン(PVP)を含まないポリカーボネートメンブラン(Neuro Probe Inc.,Gaithersburg,MD)を、オーバーナイトで、0.1%ゼラチンでコートし、そしてリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄して、過剰のゼラチンコーティングを除去した。次に、1%のFBSを補添した増殖因子を含まない28μlのEBM2培地を、下部のチャンバーに配置し、その下部チャンバーの上にメンブランを配置し、そして、1×106細胞/mlの細胞を、VEGF−A(50ng/ml、Kurabo、大阪)、F2ペプチド(10ng/ml、100ng/ml、1μg/ml)、またはコントロールペプチド(1μg/ml;アミノ酸配列RSLEGTDRFPFVRLKNSRKLEFKDIKGIKR;配列番号6)のいずれかを含む、50μlのEBM2培地中に懸濁した。Boydenチャンバーを、37℃で4時間インキュベーションした。インキュベーション後、メンブランを除去し、そして、メンブランの上側の細胞を、はがした。メンブランの下側の細胞を、Diff−Quick(Sysmex、兵庫)で染色した。細胞数を、100倍の視野下で、ランダムに選択した8視野について、計数した。
F2ペプチドによる処理によるインビトロでの血管新生促進を調べることによって、F2ペプチドの血管新生活性を確認した。血管形成活性の試験は、実施例3の1.血管新生活性の節に記載される方法に従い、VEGF−A(50ng/ml)、F2ペプチド(0.1,1,10μg/ml)、およびコントロールペプチド(1,10μg/ml)を用いて、行った。
F2ペプチドのインビボ血管新生促進活性を試験するために、マトリゲルプラグアッセイ(Matrigel plug assay;Rikitake,Yら、Arterioscler Thromb Vasc Biol 20,1006−1012(2000))を行った。増殖因子を枯渇したマトリゲル(0.5ml,BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ)を、VEGF−A(50ng/ml)、F2ペプチド(1μg/ml)、コントロールペプチド(1μg/ml)、または何も加えない状態(ネガティブコントロール)のいずれかとともに、40U/mlのヘパリン(Aventis Pharma,東京)と混合した。次に、混合物を、オリエンタルバイオサイエンス社(京都)から得たC57BL/6雌性マウスの皮下に注入した。7日後、マウスを屠殺し、プラグを回収して、メタノール中で固定した。免疫染色のために、切片を、抗CD31(PECAM−1)モノクローナル抗体(1:100希釈、BD Pharmigen,San Diego,CA)と、4℃で、オーバーナイトでインキュベーションし、次に、Alexa Flour488二次抗体(1:1000,Molecular Probes,Eugene,OR)と、写真撮影前に2時間インキュベーションした。全ての実験プロトコールは、大阪大学大学院医学部動物委員会の承認を得た。
F2ペプチドと構造上相同であるタンパク質は、データベースサーチによって見出されなかった。構造分析の結果、F2ペプチドは、α−ヘリックス構造を形成することから、膜と相互作用し、そして抗菌活性を有することが示唆された。LL−37ペプチドは、抗菌活性、血管新生活性、および動脈形成活性を有するペプチドであることが公知である。実際にLL−37ペプチドは、アルギニンに富み、そしてα−ヘリックス構造をとる点において、F2ペプチドと類似する。従って、F2ペプチドとLL−37との効果を比較した。その結果、MTSアッセイを用いる内皮細胞増殖アッセイにおいては、両ペプチドは、同程度の活性を示した。結果を、図14と以下の表3に示す。
本願発明の組成物を用いて、被検体における血管新生を促進することができる。実施例2に従って、HVJエンベロープベクターにF2ペプチド発現ベクターを封入する。SDラット(400−500g;日本チャールズリバー社)に対しベントバルビタール・ナトリウム塩(0.1ml/100mg)を腹腔内投与して麻酔し、保温して自動呼吸器により呼吸を確保する。ラットに左側開胸術を施し、HVJエンベロープベクター(20μl)を30Gの注射針を用いて、心尖に直接、慎重に注入する。
HVJエンベロープベクター(ベクター中のF2ペプチド発現ベクター濃度:10μg/ml)を、ラット冠動脈内皮細胞(細胞数:108個)に感作し、F2ペプチドの産生量をELISA法で測定する。また、対照として、F2ペプチド発現ベクターを含まないエンベロープベクターを用いて、上記と同様な試験を行う。更に、非感作ラット冠動脈内皮細胞についてもF2ペプチド産生量を測定する(無処置群)。HVJエンベロープベクターを感作したラット冠動脈内皮細胞は高いレベルでF2ペプチドを産生し、分泌することを確認する。
F2ペプチド発現プラスミドを含むHVJエンベロープベクターを直接注入したラット心筋、ペプチド発現プラスミドを含まないHVJエンベロープベクターを直接注入したラット心筋及び無処置のラット心筋をHE染色、Azan染色し、検鏡して微小血管数を数える。F2ペプチド発現プラスミドを含むHVJエンベロープベクターを注入したラット心筋では、ペプチド発現プラスミドを含まないHVJエンベロープベクターを注入したラット心筋及び無処置のラット心筋と比較して、有意に微小血管数が増加することを確認する。
10週齢のフィッシャーラットの大腿骨顆間部に直径1.8mmのキルシュナー鋼線を用い軟骨下骨を貫く損傷を作製する。術後1週の時点で、実施例2のHVJエンベロープベクター(100μl/膝)を直接的に関節内へ導入する。コントロールとして、発現プラスミドを含まないHVJエンベロープベクターを同量関節内に投与する。これらの遺伝子等の導入後1、3、4週でラットを屠殺し、組織学的に修復部位を観察する。F2ペプチド発現プラスミドを含むHVJエンベロープベクターの関節内への投与後3週で修復組織に一部にトルイジンブルー染色にて染色されるプロテオグリカンの合成を認める軟骨様細胞の出現を確認する。
実施例5に示したように、F2は、その構造解析の結果から、抗菌活性を有することが予測された。そこで、F2が実際に抗菌活性を有することを確認する。
抗菌活性を、米国National Committee for Clinical Laboratory Standard(NCCL Documents M7−A3)に従って評価する。すなわち、マイクロタイタープレートを用いて、菌の増殖を阻害するペプチドの最小濃度を求める。細菌を、培地で16時間培養した後、A600における吸光度を測定する。予め求めた濁度とcolony forming unit(CFU)との相関から、規定のCFUになるように培地で希釈する。各菌株を5×105CFU/ml(最終濃度)程度になるように添加する。各ペプチドの5mM水溶液、および培地を用いた1.6mM溶液を調製し、ここから段階希釈を行う。菌液50μlを分注したマイクロプレートに各濃度段階のペプチドを50μlずつ分注する(ペプチドの最終濃度は3.1μM〜800μM)。ペプチド無添加のものをネガティブコントロールとする。プレートを37℃で18時間静置培養し、菌の増殖を阻害する最小濃度(最小発育阻止濃度:MIC)を求める。結果として記載される濃度はMIC(μM)である。この方法に従って、F2ペプチドの抗菌活性を測定する。
Claims (5)
- 以下:
(a)配列番号1に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド;および
(c)(a)〜(b)のいずれか1つのポリヌクレオチドに対する同一性が少なくとも95%である塩基配列からなるポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドであって、血管内皮細胞増殖活性、c−fosプロモーターからの転写促進活性、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)プロモーターからの転写促進活性、および、血管新生活性からなる群から選択される活性を有するペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込んだ該ペプチドの発現ベクターを含有する、血管新生のための薬学的組成物。 - 以下:
(a)配列番号1に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド;および
(c)(a)〜(b)のいずれか1つのポリヌクレオチドに対する同一性が少なくとも95%である塩基配列からなるポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドであって、血管内皮細胞増殖活性、c−fosプロモーターからの転写促進活性、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)プロモーターからの転写促進活性、および、血管新生活性からなる群から選択される活性を有するペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込んだ該ペプチドの発現ベクターを含有する、血管内皮細胞増殖のための薬学的組成物。 - 以下:
(a)配列番号1に記載の塩基配列によってコードされるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド;
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
(c)(a)〜(b)のいずれか1つのポリペプチドのアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも95%であるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
からなる群から選択されるポリペプチドを含有する血管新生のための薬学的組成物であって、ここで、前記ポリペプチドは、血管内皮細胞増殖活性、c−fosプロモーターからの転写促進活性、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)プロモーターからの転写促進活性、および血管新生活性からなる群から選択される活性を有する、薬学的組成物。 - 以下:
(a)配列番号1に記載の塩基配列によってコードされるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド;
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
(c)(a)〜(b)のいずれか1つのポリペプチドのアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも95%であるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
からなる群から選択されるポリペプチドを含有する血管内皮細胞増殖のための薬学的組成物であって、ここで、前記ポリペプチドは、血管内皮細胞増殖活性、c−fosプロモーターからの転写促進活性、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)プロモーターからの転写促進活性、および血管新生活性からなる群から選択される活性を有する、薬学的組成物。 - 以下:
(a)配列番号1に記載の塩基配列によってコードされるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド;
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
(c)(a)〜(b)のいずれか1つのポリペプチドのアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも95%であるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
からなる群から選択されるポリペプチドを含有するインスリン様増殖因子−1(IGF−1)の産生増強のための薬学的組成物であって、ここで、前記ポリペプチドは、血管内皮細胞増殖活性、c−fosプロモーターからの転写促進活性、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)プロモーターからの転写促進活性、および血管新生活性からなる群から選択される活性を有する、薬学的組成物。
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