JP2016501538A - 非複製型ウイルス由来粒子及びその使用 - Google Patents

Abstract

不死化細胞に対する指向性を有しながら、細胞の間で拡散する能力を欠く、非複製型ラブドウイルス由来粒子が詳述される。前記非複製型ラブドウイルス由来粒子は、不死化細胞に対し細胞溶解性の指向性を有してもよい。また、細胞の間で拡散する能力を欠くが、自然及び／又は適応免疫刺激特性を有する非複製型ラブドウイルス由来粒子も詳述される。【選択図】図１Ａ

Description

本開示は、概して、非複製型ウイルス由来粒子と、抗癌剤としてのその使用に関する。

以下の背景技術の考察は、以下に述べたことが、先行技術、又は、いずれの国における当業者の知識の一部であることと認めるものではない。

腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）は、腫瘍形成における二つの重要な特徴である、損なわれた免疫応答及び増強した代謝活性を備えた細胞においてのみウイルスが複製できるように、突然変異又は欠失を減弱させることによって操作されてきた。現在の高度な腫瘍溶解性治療の例としては、単純ヘルペスウイルスＯｎｃｏＶＥＸＧＭ−ＣＳＦ及びワクシニアウイルス（ＪＸ５９４）などが挙げられる。現在までのＯＶ分野の主たる焦点は、生ウイルスが局所腫瘍環境内における優先的な複製／拡散能力を有するプラットフォームの発展であった。

水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）及びマラバ（Ｍａｒａｂａ）などの、ラブドウイルス（ＲＶ）が、抗癌治療として現在探究されている。腫瘍において、ウイルスの増殖は、抑制されない代謝活性及び損なわれた抗ウイルスプログラムによって可能となっている。ＲＶ治療への腫瘍感受性は、ウイルスによって媒介されるアポトーシスの素因によって、さらに増強される。

ラブドウイルスの分野において、現在までに発展してきた腫瘍溶解性のプラットフォームは、腫瘍細胞の間で拡散する複製可能なウイルスを利用する。事実、癌に対する直接的なウイルス療法としての生の複製／発現可能なラブドウイルスの使用を詳述したレポートでは、測定可能な有効性が観測されない非複製／非発現ウイルスと有効性を比較している。これらのレポートにおいて、ラブドウイルスゲノム複製及び／又は発現は、腫瘍細胞毒性及び治療有効性の必要不可欠な構成要素であると結論付けている。

これらの従来の研究における腫瘍溶解性効果の欠如は、使用されるウイルス粒子の数においてだけでなく、ウイルスゲノム複製及び／又は発現を妨害するために使用される方法においても反映されている。実際に、これらの従来の方法がウイルスゲノム複製及び／又は発現を妨害するために使用された場合、ウイルスの生物活性は観測されなかった。さらに、これらの研究において、非複製型ウイルスコントロールは、各細胞が非複製型粒子と遭遇することを保証するため、それに対応する生ウイルスよりも高い用量ではない同用量で用いられる。

ほとんどの形態の癌を治すため、その代わりとなる、好ましくはより効果的なアプローチが望まれる。例えば、急性リンパ芽球性白血病又は急性骨髄性白血病を患う成人患者の大多数の転帰は、悲惨なままである。この一因として、疾病の顕著な免疫不全を伴うことが挙げられる。少数の患者において、抗腫瘍免疫応答は、骨髄破壊的移植前治療の後の同種幹細胞移植を通じて部分的に回復する。この治療は潜在的に効果があるが、頻繁な有害現象と著しい治療関連死亡率を伴う。慢性期の慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の多くの患者にとって、標的チロシンキナーゼ阻害薬（ＴＫＩ）治療は良好な病害防除を提供する。しかしながら、急性白血病急性転化への進行が発生すると、多剤耐性、及び、この種の難治性白血病の急激なキネティクスのため、治療の選択肢は非常に限られる。

したがって、特に免疫不全状態の患者のための代替となる抗癌剤が必要となる。前記抗癌剤は、その設計と構成要素によって、現在の未だ治療法がない臨床ニーズに取り組み、及び／又は、上述の問題点のうち少なくともいくつかを解決するであろう。

次の概要は、本願に詳述される一つ以上の発明を読者に紹介するためのものであり、いずれの発明を規定するものではない。これらの発明は、本明細書に記載されている特徴のどんな組み合わせにも属することができる。

様々な腫瘍の種類を治療する生ＯＶ戦略が追求される中、特に造血気腫瘍においてそれらを適応することは、様々な要因のために複雑となる。白血病細胞間の限られたビリオン産生及び減少された拡散は、これらの無効性を克服するため高用量のウイルス療法を必要とする。しかしながら、特に免疫抑制状態の患者において、正常組織における非制御の生ウイルスの拡散及びオフターゲット効果は、このアプローチの安全性を損なう。

生ウイルスの使用に関連する問題は以下を含む。１）安全性。健康な組織に影響を与えず、腫瘍細胞においてのみ拡散する生ラブドウイルスの能力に依存する。２）低用量投与。患者への生の拡散性ウイルスの導入は、安全性を保証するため、これらの生ウイルス剤の比較的低用量の投与が必要となる。３）抗腫瘍免疫応答の有効性を効果的に減少させる、生ウイルスに対する腫瘍からの免疫転換（ｉｍｍｕｎｅ ｄｉｖｅｒｓｉｏｎ）。４）腫瘍を好むように設計された生ウイルスは、野生型ウイルスと比べて生産能力が損なわれているため、処方効率及び生産コストが産生の観点からみて準最適である。

以前より示されているように、最終的なビリオンアセンブリー及び拡散を防ぐ、糖蛋白質遺伝子（ＶＳＶΔＧ）を欠失するように操作されたＶＳＶの腫瘍内投与は、抗腫瘍免疫応答を誘発する。しかしながら、ＶＳＶΔＧを用いた治療は、治療上有効な用量の産生及び送達ができないこともあり、播種性の腫瘍量を著しく減少させることができない。

著者らは、抗癌治療としての非複製型及び非発現型ラブドウイルス由来プラットフォームの使用について詳述しているレポートを認識していない。本開示の非複製型ウイルス由来粒子（ＮＶＲＰ）、及び、特に非複製型ラブドウイルス由来粒子（ＮＲＲＰ）は、細胞の間を拡散する能力を欠くように改変された野生型ウイルスである。一度改変されると、非複製型ウイルス由来粒子（ＮＶＲＰ）は、ビリオン複製を継続できなくなる。

ＮＶＲＰは、指向性などの向性を不死化細胞に対して保持するという点で独特である。これは、ＮＶＲＰが、腫瘍又は癌細胞などの不死化細胞、及び、癌化した不死化細胞において、細胞死を優先的に誘導することを意味する。ＮＶＲＰの具体例は、不死化細胞に対して、自然及び／又は適応的な免疫刺激特性を有する。

一つの態様において、本開示は、不死化細胞に対する向性を有しながら、細胞の間を拡散する能力を欠く、非複製型ラブドウイルス由来粒子について詳述する。前記向性は、細胞溶解の指向性であってもいい。前記非複製型ラブドウイルス由来粒子は、不死化細胞に対して、自然又は適応的な免疫刺激特性を有してもいい。

別の態様において、本開示は、高増殖性細胞又は癌細胞の集団を処理するための非複製型ラブドウイルス由来粒子の使用を提供する。前記高増殖性細胞の集団は、好ましくは造血性であり、好ましくは白血病細胞である。前記高増殖性細胞の集団は、固形の腫瘍細胞であってもよい。

さらに別の態様において、本開示は、高増殖性細胞又は癌細胞の集団を有する患者の治療方法について詳述する。前記方法は、患者に非複製型ラブドウイルス由来粒子を投与することを含む。前記高増殖性細胞の集団は、好ましくは造血性であり、好ましくは白血病細胞である。前記高増殖性細胞の集団は、固形の腫瘍細胞であってもいい。

本開示のその他の態様及び特徴は、付随する図面とあわせて、特定の実施形態に関する以下の明細書見直すことで、当業者にとって明らかとなるだろう。

概して、本開示は非複製型ウイルス由来粒子と抗癌剤としてのその使用を提供する。非複製型ウイルス由来粒子（ＮＲＶＰ）は、細胞へ結合し、内部移行できるウイルス由来粒子であるが、前記ＮＲＶＰが細胞内にある場合に、新生ウイルス粒子の形成を防ぐため、又は実質的に形成を減少させるために改変されてきた。ＮＲＶＰの一つの例として、非複製型ラブドウイルス由来粒子（ＮＲＲＰ）が挙げられる。

本開示の実施形態は、添付の図面を参照し、例としてここに詳述される。

Ｖｅｒｏ細胞及びＨＤＦＮ細胞におけるＮＲＲＰ細胞毒性に対するＵＶ線量の効果を示すグラフである。ＵＶによるＮＲＲＰ産生後は、ＧＦＰシグナルは検出されなかった。感染から７２時間後に、レサズリン試験を用いて生存率を定量化した。この実験におけるＭＯＩは、１細胞あたり１００粒子に設定した。エラーバーは三重試験結果における標準偏差を表す。 Ｖｅｒｏ細胞及びＨＤＦＮ細胞において、ＮＲＲＰによって誘導される細胞毒性に対するＭＯＩの効果を示すグラフである。当該グラフは、生存率対ＭＯＩとして表した。生存率は、感染から７２時間後にレサズリン試験を用いて定量化した。エラーバーは三重試験における標準偏差を表す。 Ｖｅｒｏ不死化細胞に対するＮＲＲＰの細胞毒性を示す一連のイメージである。当該イメージは、ＰＢＳ処理、生ＶＳＶ−ＧＦＰ感染、又はＮＲＲＰ感染から２４及び７２時間後のＶｅｒｏ細胞の蛍光顕微鏡及び明視野顕微鏡イメージのセットである。これらの実験では、感染多重度（ＭＯＩ）を１細胞あたり１００粒子に設定した。 処理から７２時間後にレサズリン試験を用いて定量した生存率であり、ＮＲＲＰの細胞毒性を示すグラフである。エラーバーは三重試験における標準偏差を表す。 生産されるウイルス力価を示すグラフである。ＮＡＮは、ビリオンが検出されなかったこと、すなわち“数値ではない（not as a number）”ことの意である。 ＰＢＳ、生マラバウイルス、及びマラバウイルス由来ＮＲＲＰで処理した白血病細胞（Ｌ１２１０）及びＶｅｒｏ細胞の、処理から２４時間後に撮影した一連の蛍光顕微鏡イメージ（４Ｘ）である。 腫瘍細胞から得られたウイルス力価を示すグラフである。 感染から７２時間後のＬ１２１０白血病細胞及びＨＤＦ正常細胞の細胞生存率を、レサズリン試験を用いて定量化したグラフである。 ＰＢＳ、生ＶＳＶ−ＧＦＰ、又はＮＲＲＰで処理したＬ１２１０白血病細胞及びＶｅｒｏ細胞の蛍光イメージである。 Ｌ１２１０急性白血病細胞及びＶｅｒｏ不死化細胞から得られたウイルス力価を示すグラフである。 細胞毒性の喪失が認められる、２０，０００ｍＪ／ｃｍ^２のＵＶ線量を照射したウイルスのゲノム発現と比較した、ＮＲＲＰのゲノム発現のウエスタンブロットイメージである。コントロールには生ウイルスを用いた。１ｘ又は２ｘは、ゲルにロードした蛋白量を表す。蛋白質は感染から１５時間後に抽出した。 化学的に産生したＮＲＲＰ、又はブスルファンによって産生したＮＲＲＰで処理したＶｅｒｏ細胞の蛍光び明視野イメージのセットである。 図６ＡにおいてＮＲＲＰ産生に用いた用量と同じ用量のブスルファンのみで１５時間処理したＶｅｒｏ細胞の明視野イメージである。 生ＶＳＶ−ＧＦＰで処理したＶｅｒｏ細胞の蛍光及び明視野イメージセットである。 １Ｅ１０の凍結野生型ＶＳＶを１５ｋＧｙのコバルト６０で照射して産生したＮＲＲPで処理したＶｅｒｏ細胞の明視野及び蛍光イメージセットである。 生の野生型ＶＳＶ−ＧＦＰで処理したＶｅｒｏ細胞の明視野及び蛍光イメージセットである。 ＰＢＳ中のＶｅｒｏ細胞の明視野及び蛍光イメージセットである。 ＰＢＳ又はＭＯＩ＝１００でＮＲＲＰ処理したＬ１２１０及びＨＦＤ細胞の明視野イメージである。 白血病細胞株及び正常細胞株の生存率をレサズリン試験を用いて定量化したグラフである。マウス細胞株を＊で示す。 ＰＢＳ、生ＶＳＶ-ＧＦＰ、又はＮＲＲＰで処理したヒトＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞急性白血病、マウスＡ２０ Ｂ細胞リンパ芽球性白血病、Ａ３０1 Ｔ細胞リンパ芽球性白血病、ＨＬ６０急性前骨髄球性白血病、及び、ＧＭ３８及びＨＤＦ正常細胞株の蛍光顕微鏡イメージである。 ＰＢＳ又はＮＲＲＰで処理したＬ１２１０細胞を、アネキシンＶ−ＡＰＣ及び７−ＡＡＤ染色によるフローサイトメトリーで解析した結果を示すグラフである。 Ｌ１２１０急性白血病細胞株を、ＵＶ−産生ＮＲＲＰで処理、及びＵＶ−産生ＮＲＲＰとベンダムスチン（３００μＭ）を組み合わせて処理してから７２時間後に、レサズリン試験を行って生存率を定量化したグラフである。 Ｌ１２１０急性白血病細胞株を、ＵＶ−産生ＮＲＲＰで処理、及びＵＶ−産生ＮＲＲＰとデキサメサゾン（４５μＭ）を組み合わせて処理してから７２時間後に、レサズリン試験を行って生存率を定量化したグラフである。 Ｌ１２１０急性白血病細胞株を、ＵＶ−産生ＮＲＲＰで処理、及びＵＶ−産生ＮＲＲＰとドキソルビシン（０．０２５μＭ）を組み合わせて処理してから７２時間後に、レサズリン試験を行って生存率を定量化したグラフである。 Ｌ１２１０急性白血病細胞株を、ＵＶ−産生ＮＲＲＰで処理、及びＵＶ−産生ＮＲＲＰとビンクリスチン（０．０１２５μＭ）を組み合わせて処理してから７２時間後に、レサズリン試験を行って生存率を定量化したグラフである。 Ｋ５６２Ｐｈ−陽性骨髄性白血病細胞株を、ＵＶ−産生ＮＲＲＰで処理、及びＵＶ−産生ＮＲＲＰとイダルビシン（０．０５μＭ）を組み合わせて処理してから１５時間後に、レサズリン試験を行って生存率を定量化したグラフである。 Ｌｅ Ｂｏｅｕｆらによって提唱された、正常細胞及び抗ウイルスシグナル伝達経路が障害された腫瘍細胞におけるＮＲＲＰの細胞毒性をシミュレートしたモデル図である。ＮＲＲＰのキネティクスを説明するために、オリジナルモデルからウイルス増殖（Ｘ）を削除する改変を行った。破線は腫瘍細胞と関連したＩＦＮ−欠損を表す。 抗ウイルスシグナル伝達経路の障害と、ＮＲＲＰで処理してから７２時間後の生存率との関係をシミュレートしたグラフである。 正常ＨＤＦ細胞において、ＭＯＩと、ＩＦＮの存在下又は非存在下でＮＲＲＰをインビトロで感染させてから７２時間後の生存率との関係を示すグラフである。 Ｌ１２１０白血病細胞において、ＭＯＩと、ＩＦＮの存在下又は非存在下でＮＲＲＰをインビトロで感染させてから７２時間後の生存率との関係を示すグラフである。 急性転化した慢性白血病患者に由来する２種類のサンプルを、ＰＢＳ又はＮＲＲＰで処理した明視野顕微鏡イメージである。 急性白血病患者（ＣＭＬ急性転化）の末梢血サンプルの蛍光性顕微鏡イメージ（４Ｘ）である。当該サンプルは、ＰＢＳ、生ＶＳＶ−ＧＦＰ、又はＧＦＰをコードするＮＲＲＰで処理した末梢血サンプルを濃縮して調製した。イメージはＭＯＩ＝１００で感染させてから２４時間後のものである。 図１６Ａ及び図１６Ｂに示したデータを補足する、フローサイトメトリーのダイアグラムである。急性転化ＣＭＬ患者に由来する２種類のサンプルを、ＰＢＳ又はＮＲＲＰ（ＭＯＩ＝１００）で処理してから４８時間後に、アネキシンＶ及びＣＤ３３染色によるフローサイトメトリーを行った。当該ＣＤ３３陽性の芽球細胞集団は、前記細胞を長期培養することで濃縮した。 前記ＰＢＳ又はＮＲＲＰで処理した２種類のＣＭＬ急性転化患者サンプルに対し、ＣＤ３３染色によるフローサイトメトリーで解析した結果を表すグラフである。 ＰＢＳ又はＮＲＲＰで１８時間処理した健康な骨髄サンプルの明視野顕微鏡イメージである。 ＰＢＳ又はＮＲＲＰで６５時間処理した健康な骨髄サンプルにおける、アネキシンＶ染色の定量結果を示すグラフである。 マウスの急性転化処理モデルにおける生存曲線を示すグラフである。１日目にマウスにＬ１２１０を曝露した後、ＮＲＲＰ又はＰＢＳを１日３回投与した。 Ｌ１２１０を有するマウスにおいて、急性転化期に、ＮＲＲＰによって誘導されたサイトカインをルミネックスに基づいて定量化したグラフである。同定されたサイトカインは全て、ＮＲＲＰ処理したマウスでは２倍以上誘導されており、統計的に有意であった（ｎｏｎ−ｐａｉｒｅｄ ｔ−ｔｅｓｔ ｐＶ＜０．０５）。ｐＶは多重仮説検定を考慮して補正した（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ＆Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法）。 免疫原性アポトーシスモデルであるイミューノコンピテントな（ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）マウスの生存曲線を示すグラフである。１日目のＬ１２１０曝露に先立って、ＮＲＲＰ存在下又は非存在下で培養し且つガンマ線照射したＬ１２１０細胞を、週１回、計３回マウスに投与した。 骨髄腫細胞株ＭＰＣ−１１及びＲＰＭＩ−８２２６を、ＰＢＳ又はＮＲＲＰで処理してから１５時間後の明視野顕微鏡イメージである。ＮＲＲＰはＭＯＩ＝２５０で投与した。これは、正常細胞に対し、生存率に影響しないことが確認されている用量である。 骨髄腫細胞株ＭＰＣ−１１及びＲＰＭＩ−８２２６をＭＯＩ＝２５０でＮＲＲＰ処理してから１５時間後に、レサズリン試験を用いて生存率を定量化したグラフである。ＳＲ４９８７は正常な骨髄間質細胞株である。 多発性骨髄腫細胞株ＭＰＣ−１１を、ＵＶ−産生ＮＲＲＰで処理、及びＵＶ−産生ＮＲＲＰとメルファラン（２０μＭ）を組み合わせて処理してから７２時間後に、レサズリン試験を行って生存率を定量化したグラフである。 多発性骨髄腫細胞株ＭＰＣ−１１を、ＵＶ−産生ＮＲＲＰで処理、及びＵＶ−産生ＮＲＲＰとＳｅｃｏｎｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ−ｄｅｒｉｖｅｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｃａｓｐａｓｅ（ＳＭＡＣ）類似物質であるＬＣＬ１６１（１５μＭ）を組み合わせて処理してから７２時間後に、レサズリン試験を行って生存率を定量化したグラフである。 多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ−８２２６を、ＵＶ−産生ＮＲＲＰで処理、及びＵＶ−産生ＮＲＲＰとカルフィルゾミブ（５ｎＭ）を組み合わせて処理してから７２時間後に、レサズリン試験を行って生存率を定量化したグラフである。 ＰＢＳ又はＮＲＲＰで処理してから２４時間後のマウス遅発性（ｄｅｌａｙｅｄ）脳腫瘍グリオブラストーマ細胞株（ＤＢＴ）の明視野顕微鏡イメージである。 ＰＢＳ又はＮＲＲＰで処理してから２４時間後の星状細胞腫細胞株（Ｋ１４９１）の明視野顕微鏡イメージである。 ＰＢＳ又はＮＲＲＰで処理してから２４時間後のマウスグリオーマ細胞株（ＧＬ２６１）の明視野顕微鏡イメージである。 正常コントロールＨＤＦＮに対する脳癌細胞株ＤＢＴ、Ｋ１４９１、Ｋ１４９２、ＣＴ２Ａ及びＧＬ２６１の細胞生存率を、レサズリン試験を用いて定量化したグラフである。 ＣＴ２Ａグリオブラストーマ細胞株を、ＵＶ−産生ＮＲＲＰで処理、及びＵＶ−産生ＮＲＲＰとＨＤＡＣ阻害剤であるＳＡＨＡ（１０μＭ）を組み合わせて処理してから７２時間後に、レサズリン試験を行って生存率を定量化したグラフである。 抵抗性固形腫瘍細胞株における、ＮＲＲＰによる腫瘍細胞毒性を示す蛍光性顕微鏡イメージセット（４Ｘ）である。このイメージセットは、ＰＢＳ、生ＶＳＶ、及びＮＲＲＰで処理してから２４時間後の、マウス乳癌細胞（４Ｔ１）及びヒト腎臓癌細胞（７８６−０）を表す。 ＰＢＳ、生ＶＳＶ、及びＮＲＲＰで処理（感染）してから７２時間後の抵抗性固形腫瘍細胞株、乳癌（４Ｔ１）及び腎臓癌（７８６−０）細胞における、ＮＲＲＰの腫瘍細胞毒性を示す明視野顕微鏡イメージである。 ＰＢＳ、生ＶＳＶ、及びＮＲＲＰで処理（感染）してから７２時間後の抵抗性固形腫瘍細胞株、乳癌（４Ｔ１）及び腎臓癌（７８６−０）細胞の細胞生存率を、レサズリン試験を用いて定量化したグラフである。 皮下ＣＴ−２６大腸癌の埋め込みから１６日、１８日、及び２１日後に、２Ｅ９ ＵＶ−産生ＮＲＲＰで処理したマウスにおける延命効果を示すグラフである。

前記ＮＲＶＰは、ウイルス由来粒子が細胞の表面に結合して内部移行するのに十分な数の機能的Ｇ蛋白質を表面に有するエンベロープを有する。前記ＮＲＶＰは、新生ウイルス粒子のアセンブリーに必要な全タンパク質をコードする配列を有するＲＮＡポリヌクレオチド、及び、前記ＲＮＡポリヌクレオチドを取り囲む構造体を形成する蛋白質混合物をも有する。しかしながら、前記ＮＲＶＰゲノムが新生ウイルスの形成に必要な前記蛋白質を産生できないように、前記ＮＲＶＰのＲＮＡ構造は、十分に架橋されるか、あるいは、ＲＮＡの不連続なセグメントを形成するよう切断される。例えば、前記粒子が細胞内にある場合、前記ＲＮＡ配列は、ｍＲＮＡへの転写、蛋白質への翻訳、あるいはその両方が行われないかもしれない。転写及び／又は翻訳が損なわれる又は欠如するということは、細胞において不十分な蛋白質が産生され、新生ウイルス粒子のアセンブリーができないということを意味する。

機能的Ｇ蛋白質は、下記に示される配列番号１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を含む配列を含んでもよい。前記配列は、水疱性口内炎インディアナウイルスの成熟糖蛋白質ペプチドの配列である。この機能的Ｇ蛋白質のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＰ ９５５５４８．１である。
kftivfphnq kgnwknvpsn yhycpsssdl nwhndligta iqvkmpkshk aiqadgwmch
askwvttcdf rwygpkyitq sirsftpsve qckesieqtk qgtwlnpgfp pqscgyatvt
daeavivqvt phhvlvdeyt gewvdsqfin gkcsnyicpt vhnsttwhsd ykvkglcdsn
lismditffs edgelsslgk egtgfrsnyf ayetggkack mqyckhwgvr lpsgvwfema
dkdlfaaarf pecpegssis apsqtsvdvs liqdverild yslcqetwsk iraglpispv
dlsylapknp gtgpaftiin gtlkyfetry irvdiaapil srmvgmisgt tterelwddw
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eslffgdtgl sknpielveg wfsswkssia sfffiiglii glflvlrvgi hlciklkhtk
krqiytdiem nrlgk (SEQ ID NO: 1)

代わりに、前記機能的Ｇ蛋白質は、細胞表面に結合して当該粒子の内部移行が可能な限り、配列番号１の配列と少なくとも７５％同一の配列を含んでもよい。例えば、細胞の表面へ結合し、前記粒子の内部移行を効する前記蛋白質の能力を阻害することなく、アミノ酸の保存的置換を行うことができる。保存的置換の例は、下記の表１に示される。

膜貫通ドメインなどの細胞表面結合に参加しない前記Ｇ蛋白質の一部において行われる保存的置換は少ないが、一方で、Ｇ蛋白質受容体と相互作用する前記蛋白質の一部においてはより多くの保存的置換が必要となり得る。Ｇ蛋白質は、当該技術分野において既知であり、当業者は、細胞の表面に結合して、前記粒子が内部移行する前記蛋白質の能力を阻害しないアミノ酸置換を見出すことができる。

前記ＲＮＡを取り囲む構造体を形成する蛋白質混合物が、少なくともＮ、Ｐ、Ｍ、及びＬ蛋白質を含んでもよい。Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｇ及びＬ蛋白質を有するＮＲＶＰは、ラブドウイルス由来ＮＲＶＰを含んでもよい。ラブドウイルス由来ＮＲＶＰは、非複製型ラブドウイルス由来粒子（ＮＲＲＰ）として規定されてもよい。本開示の目的のため、“ラブドウイルス（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）”（ＮＣＢＩ タクソノミー ＩＤ：１１２７０）という用語は、次のウイルス及びそれらの変異体の属のいずれか一つを含んでもよい：サイトラブドウイルス（Ｃｙｔｏｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）（ＮＣＢＩ タクソノミー ＩＤ：１１３０５）、エフェメロウイルス（Ｅｐｈｅｍｅｒｏｖｉｒｕｓ）（ＮＣＢＩ タクソノミー ＩＤ：３２６１３）、ベシクロウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）（ＮＣＢＩ タクソノミー ＩＤ：１１２７１）、未分類ジマラブドウイルススーパーグループ（ｕｎｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ Ｄｉｍａｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓｓｕｐｅｒｇｒｏｕｐ）（ＮＣＢＩ タクソノミー ＩＤ：３４９１６６）、リッサウイルス（Ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ）（ＮＣＢＩ タクソノミー ＩＤ：１１２８６）、ノビラブドウイルス（Ｎｏｖｉｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）（ＮＣＢＩ タクソノミー ＩＤ：１８６７７８）、ヌクレオラブドウイルス（Ｎｕｃｌｅｏｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）（ＮＣＢＩ タクソノミー ＩＤ：１１３０６）、アサインされていないラブドウイルス（ｕｎａｓｓｉｇｎｅｄ ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）（ＮＣＢＩ タクソノミー ＩＤ：６８６６０６）、及び、未分類ラブドウイルス（ｕｎｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）（ＮＣＢＩ タクソノミー ＩＤ：３５３０３）。ラブドウイルスファミリーにおける種は、マラバウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）及びファーミントンウイルス（Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ ｖｉｒｕｓ）を含むが、これらに限定されない。

前記Ｎ蛋白質は、以下に示される配列番号２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を含む配列を含んでもよい。前記配列は、水疱性口内炎インディアナウイルスのヌクレオカプシド蛋白質の配列である。このＮ蛋白質のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＣ ０４１７１２．１である。
msvtvkriid ntvivpklpa nedpveypad yfrkskeipl yinttkslsd lrgyvyqglk
sgnvsiihvn sylygalkdi rgkldkdwss fginigkagd tigifdlvsl kaldgvlpdg
vsdasrtsad dkwlplyllg lyrvgrtqmp eyrkklmdgl tnqckmineq feplvpegrd
ifdvwgndsn ytkivaavdm ffhmfkkhec asfrygtivs rfkdcaalat fghlckitgm
stedvttwil nrevademvq mmlpgqeidk adsympylid fglsskspys svknpafhfw
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tgglttnapp qgrdvvewlg wfedqnrkpt pdmmqyakra vmslqglrek tigkyaksef
dk (SEQ ID NO: 2)

代わりに、前記Ｎ蛋白質は、前記蛋白質構造体の形成に参加できる限り、配列番号２の配列と少なくとも８０％同一の配列を含んでもよい。例えば、前記蛋白質構造体の形成に参加する蛋白質の能力を阻害することなく、アミノ酸の保存的置換を行うことができる。保存的置換の例は、表１に示される。

前記Ｐ蛋白質は、以下に示される配列番号３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を含む配列を含んでもよい。前記配列は、水疱性口内炎インディアナウイルスのＮＳ蛋白質の配列である。このＰ蛋白質のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＣ ０４１７１３．１である。
mdnltkvrey lksysrldqa vgeideieaq raeksnyelf qedgveehtk psyfqaadds
dtesepeied nqglyaqdpe aeqvegfiqg plddyadeev dvvftsdwkp pelesdehgk
tlrltspegl sgeqksqwls tikavvqsak ywnlaectfe asgegvimke rqitpdvykv
tpvmnthpsq seavsdvwsl sktsmtfqpk kaslqpltis ldelfssrge fisvggdgrm
shkeaillgl rykklynqar vkysl (SEQ ID NO: 3)

代わりに、前記Ｐ蛋白質は、前記蛋白質構造体の形成に参加できる限り、配列番号３の配列と少なくとも８０％同一の配列を含んでもよい。例えば、前記蛋白質構造体の形成に参加する蛋白質の能力を阻害することなく、アミノ酸の保存的置換を行うことができる。保存的置換の例は、表１に示される。

前記Ｍ蛋白質は、以下に示される配列番号４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）を含む配列を含んでもよい。前記配列は、水疱性口内炎インディアナウイルスのマトリックス蛋白質の配列である。このＭ蛋白質のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＣ ０４１７１４．１である。
msslkkilgl kgkgkkskkl giapppyeed tsmeyapsap idksyfgvde mdtydpnqlr
yekffftvkm tvrsnrpfrt ysdvaaavsh wdhmyigmag krpfykilaf lgssnlkatp
avladqgqpe yhthcegray lphrmgktpp mlnvpehfrr pfniglykgt ieltmtiydd
esleaapmiw dhfnsskfsd frekalmfgl ivekkasgaw vldsishfk (SEQ ID NO: 4)

代わりに、前記Ｍ蛋白質は、前記蛋白質構造体の形成に参加できる限り、配列番号４の配列と少なくとも８０％同一の配列を含んでもよい。例えば、前記蛋白質構造体の形成に参加する蛋白質の能力を阻害することなく、アミノ酸の保存的置換を行うことができる。保存的置換の例は、表１に示される。

前記Ｌ蛋白質は、以下に示される配列番号５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）を含む配列を含んでもよい。前記配列は水疱性口内炎インディアナウイルスのポリメラーゼ蛋白質の配列である。前記Ｌ蛋白質のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＣ ０４１７１６．１である。
mevhdfetde fndfneddya treflnpder mtylnhadyn lnsplisddi dnlirkfnsl
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代わりに、前記Ｌ蛋白質は、前記蛋白質構造体の形成に参加できる限り、配列番号５と少なくとも７０％同一の配列を含んでもよい。例えば、前記蛋白質構造体の形成に参加する蛋白質の能力を阻害することなく、アミノ酸の保存的置換を行うことができる。保存的置換の例は、表１に示される。

いくつかの実施例において、前記ＮＲＶＰが結合し、細胞に内部移行した後、前記ＮＲＶＰは機能的Ｎ、Ｐ、Ｍ及びＧ蛋白質を産生し得る。しかしながら、前記ＮＲＶＰは機能的Ｌ蛋白質を産生する能力を欠く、又は、その能力が低い。機能的Ｌ蛋白質なしで、あるいは、正確な量の機能的Ｌ蛋白質なしでは、新生ウイルス粒子をアセンブルさせることができない。

その他の例において、前記ＮＲＶＰが結合し、細胞に内部移行した後、前記ＮＲＶＰは機能的Ｎ、Ｐ及びＭ蛋白質を産生し得る。しかしながら、前記ＮＲＶＰは機能的Ｇ及びＬ蛋白質を産生する能力を欠く、又は、その能力が低い。機能的Ｇ及びＬ蛋白質なしで、あるいは、正確な量又は比率の機能的Ｇ及びＬ蛋白質なしでは、新生ウイルス粒子をアセンブルさせることができない。

その他の例において、前記ＮＲＶＰが結合し、細胞に内部移行した後、前記ＮＲＶＰは機能的Ｎ及びＰ蛋白質を産生し得る。しかしながら、前記ＮＲＶＰは機能的Ｍ、Ｇ及びＬ蛋白質を産生する能力を欠く、又は、その能力が低い。機能的Ｍ、Ｇ及びＬ蛋白質なしで、あるいは、正確な量又は比率の機能的Ｍ、Ｇ及びＬ蛋白質なしでは、新生ウイルス粒子をアセンブルさせることができない。

その他の例において、前記ＮＲＶＰが結合し、細胞に内部移行した後、前記ＮＲＶＰは機能的Ｎ蛋白質を産生し得る。しかしながら、前記ＮＲＶＰは機能的Ｐ、Ｍ、Ｇ及びＬ蛋白質を産生する能力を欠く、又は、その能力が低い。機能的Ｐ、Ｍ、Ｇ及びＬ蛋白質なしで、あるいは、正確な量又は比率の機能的Ｐ、Ｍ、Ｇ及びＬ蛋白質なしでは、新生ウイルス粒子をアセンブルさせることができない。

その他の例において、前記ＮＲＶＰは機能的Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｇ及びＬ蛋白質を産生する能力を欠く、又は、その能力が低い。機能的Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｇ及びＬ蛋白質なしで、あるいは、正確な量又は比率の機能的Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｇ及びＬ蛋白質なしでは、新生ウイルス粒子はアセンブルさせることができない。

前記非複製型ウイルス由来粒子が細胞の表面へ結合し、内部移行できるようになるために、前記ＮＲＶＰはウイルス粒子のエンベロープに十分な数の機能的Ｇ蛋白質を有さなければならない。前記野生型ウイルス粒子上に見い出されるＧ蛋白質の少なくとも５％のＧ蛋白質を有する前記ＮＲＶＰは、細胞へ結合し、内部移行することが可能になると期待される。前記ＮＲＶＰが前記野生型ウイルス粒子で発見されたＧ蛋白質の少なくとも５０％のＧ蛋白質を有することが好ましく、前記ＮＲＶＰが前記野生型ウイルス粒子で発見されたＧ蛋白質の少なくとも１００％のＧ蛋白質を有することがより好ましい。具体的な例において、前記ＮＲＶＰは１粒子あたり少なくとも６０の機能的Ｇ蛋白質、１粒子あたり少なくとも６００の機能的Ｇ蛋白質、又は、１粒子あたり少なくとも１２００の機能的Ｇ蛋白質を有する。

上述の通り、前記ＮＶＲＰは、新生ウイルス粒子アセンブリーに必要な全ての蛋白質をコードする配列を有するＲＮＡを含む。前記ＮＶＲＰが細胞内にある場合、前記ＲＮＡ配列がこれらの蛋白質を産生できなくなる原因の一つは、前記ＲＮＡがそのような程度まで架橋されると蛋白質の産生が減少する、又は、止まってしまうからである。いくつかの例において、前記ＲＮＡ配列から蛋白質の産生を減少させる、又は、止めるためには、少なくとも０．０５％の架橋されたヌクレオチドで十分である。その他の例において、前記架橋されたＲＮＡは架橋されたヌクレオチドを少なくとも０．５％含んでもよい。少なくとも１％のヌクレオチドを架橋させることが好ましく、少なくとも１０％又は少なくとも２０％のヌクレオチドを架橋させることがより好ましい。

前記ヌクレオチドの架橋は、Ｇ蛋白質が細胞表面へ結合できなくなる可能性を増加させ得る。したがって、８０％より少ない前記ヌクレオチドを架橋させることが好ましい。

前記ＲＮＡ構造のヌクレオチドは、他のＲＮＡヌクレオチド、ＲＮＡを取り囲む蛋白質構造体の蛋白質におけるアミノ酸、あるいは、その両方へ架橋されてもよい。

前記架橋されたＲＮＡ構造に加えて、ＲＮＡを取り囲む蛋白質構造体はアミノ酸を有してもよい。前記アミノ酸は、前記蛋白質構造体の別の蛋白質に架橋される、又は、同一の蛋白質の別のアミノ酸に架橋される、又は、前記ＲＮＡ構造に架橋される、あるいは、その組み合わせのいずれかである。

さらに、前記ＮＲＶＰ ＲＮＡ構造は、前記Ｐ及びＬ蛋白質によってコードされる前記ＮＲＶＰ ＲＮＡポリメラーゼ活性機能を喪失させることによって複製ができなくなってもよい。これは、ＲＮＡ構造にＰ及びＬ蛋白質を十分に架橋させることによって、又は、その他の蛋白質へＰ及びＬ蛋白質を架橋させることによって、あるいは、Ｐ及びＬ蛋白質の機能が損なわれるようにＮＲＶＰ蛋白質構造体を損傷することによって、達成できる。

前記ＮＲＶＰが細胞内にある場合、前記ＲＮＡ配列がこれらの蛋白質を産生できなくなる別の原因は、前記ＲＮＡ構造がＲＮＡの不連続なセグメントを形成するよう切断されるからである。ラブドウイルスなどのＲＮＡウイルスは、ウイルス複製に必要な蛋白質をコードする全ての遺伝子の配列を含む一つの連続するＲＮＡポリヌクレオチドを有する。一つの連続するポリヌクレオチドを二つ以上の不連続なＲＮＡポリヌクレオチドに切断することは、不完全なゲノム転写、翻訳、あるいはその両方につながる。転写開始点のないポリヌクレオチド上にコードされた蛋白質は、転写することができない。さらに、ゲノムは、全長複製すること、及び、新生ウイルス粒子に適切に取り込まれることができなくなり、ウイルス粒子産生を阻害する。

ＮＲＶＰは、少なくとも２の不連続なＲＮＡポリヌクレオチドを含んでもよく、それらは転写開始点を有するものに限る。しかしながら、前記ＲＮＡは２以上のセグメントに切断することが好ましい。したがって、ＮＲＶＰは、少なくとも５、より好ましくは少なくとも１０、さらに好ましくはすくなくとも１００の不連続なＲＮＡポリヌクレオチドを含むことが好ましい。

ＲＮＡウイルスは、約１１，０００のヌクレオチドを持つＲＮＡ配列を有してもよい。１１，０００又はそれ以上のヌクレオチドを持つＲＮＡ配列を有するＲＮＡウイルスにおいて、１０，０００より少ないヌクレオチドを持つセグメントになるように前記ＲＮＡを切断することが望ましい。１１，０００のヌクレオチドを持つＲＮＡウイルスの切断によって生じるＮＲＶＰは、１０，０００より少ないヌクレオチドを持つＲＮＡセグメントを少なくとも一つ有し、１，０００より少ないヌクレオチドを持つ別のＲＮＡセグメントを有することができるようになる。一つのセグメントのみが転写開始点を有するため、又は、配列をコードする蛋白質が不連続であるため、その他のセグメントは転写又は翻訳することができず、そのセグメントにコードされたいずれの蛋白質も産生されない。

前記ＲＮＡをより小さく切断することが好ましい。例えば、前記の不連続なＲＮＡポリヌクレオチドは、７０００より少ない、５０００より少ない、３０００より少ない、又は、１０００より少なくてもよい。

非複製型ウイルス由来粒子は、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｇ及びＬ蛋白質をコードする配列を有するＲＮＡを含む生ウイルスから産生される。前記非複製型ウイルス由来粒子は、前記ウイルス由来粒子をＵＶ吸収化合物から任意で分離して、前記生ウイルスをＲＮＡ構造に架橋するため、又は、ＲＮＡ構造を切断するためにＲＮＡ傷害剤に曝露して、前記ＲＮＡが新生ウイルス粒子のアセンブリーに必要な蛋白質を産生することを阻害することによって産生される。

前記ウイルス由来粒子が細胞内にある場合、前記ＲＮＡポリヌクレオチドからｍＲＮＡへの転写が減少する、及び／又は、当該ｍＲＮＡから蛋白質への翻訳が減少するように、前記生ウイルスのＲＮＡ構造は十分に架橋される。同様に、前記ウイルス由来粒子が細胞内にある場合、前記ＲＮＡポリヌクレオチドからｍＲＮＡへの転写が減少、及び／又は、当該ｍＲＮＡから蛋白質への翻訳が減少するように、前記生ウイルスのＲＮＡ構造は十分に不連続なＲＮＡセグメントへ切断される。

前記ＲＮＡの架橋は、前記生ウイルスを電磁放射に曝露することで達成され得る。前記電磁放射は、約１ｍｍより短い波長であってもよい。電磁放射に係るエネルギーは、前記波長が短くなるにつれて増加する。増加したエネルギーはＤＮＡへの傷害と関連する。これは、ＵＶ線、Ｘ線及びガンマ線への曝露による発癌率の増加によって証明される。したがって、前記電磁放射は、約５００ｍｍより短い波長であることが好ましく、約２８０ｍｍより短い波長であることがより好ましい。具体的な例において、前記波長は約０．１ピコメートルから２８０ｎｍの間である。

蛋白質の架橋よりヌクレオチドの架橋を優先的に誘導するような波長である、約１００から約２８０ｎｍの間の波長を有する電磁放射を使用することが望ましい。前記電磁放射がＵＶスペクトル内にある場合、つまり約１００ｎｍと約４００ｎｍの間の波長である時、前記生ウイルスを含む溶液は約１００ｍＪ／ｃｍ^２と８，０００ｍＪ／ｃｍ^２の間の線量の電磁放射線に曝露されてもよい。好ましくは、前記線量は約１５０ｍＪ／ｃｍ^２と約５，０００ｍＪ／ｃｍ^２の間である。より好ましくは、前記線量は約１５０ｍＪ／ｃｍ^２と約１，０００ｍＪ／ｃｍ^２の間である。さらに好ましくは、前記線量は約１５０ｍＪ／ｃｍ^２と約５００ｍＪ／ｃｍ^２の間である。最も好ましくは、前記線量は約１５０ｍＪ／ｃｍ^２と約３００ｍＪ／ｃｍ^２の間である。

実際の線量は、前記溶液の特性に依存してもよい。例えば、もし前記溶液がＵＶ線を吸収する色素を含む場合、より多くの線量が必要となる。同様に、もし前記溶液が一点から放射され、その容器が大きい場合、ＵＶ線の最大強度に曝露されない生ウイルスが存在するかもしれない。このような状況において、より多くの線量、又は、前記溶液の攪拌が有益となり得る。当業者は、適切な線量を提供するために必要なパラメータを決定することができるであろう。

前記生ウイルスを保持する媒体が濁っている、色素を含んでいる、あるいは、ＵＶ線を吸収する場合、Ｘ線（すなわち、０．０１と１０ｎｍの間の波長を有する電磁放射）、又は、ガンマ線（すなわち、１０ピコメートルより短い波長を有する電磁放射）で前記生ウイルスを電磁放射することが望ましい。前記電磁放射がガンマ線照射である場合、前記生ウイルスは約１ｋＧｙと約５０ｋＧｙの間の線量に曝露されてもよい。より好ましくは、前記線量は約５ｋＧｙと約２０ｋＧｙの間である。前記ガンマ線は、コバルト６０から産生されてもよい。

前記生ウイルスは４℃又はそれ以下の温度で前記電磁放射に曝露されてもよい。例えば、前記生ウイルスは、約４℃でＵＶ線照射に曝露されてもよい。他の例において、前記生ウイルスは、約−８０℃でガンマ線照射に曝露されてもよい。さらに他の例において、前記生ウイルスは、約−１３０℃でガンマ線照射に曝露されてもよい。

上述の通り、ＲＮＡのｍＲＮＡへの転写、又は、ｍＲＮＡの蛋白質への翻訳、あるいはその両方を減少させる又は阻害するため、前記ＲＮＡ構造は架橋される、又は、十分に不連続なＲＮＡセグメントに切断されてもよい。上述した前記電磁照射に加えて、ＲＮＡ架橋能を有するアルキル化剤、又は、ＲＮＡ切断能を有するフリーラジカル発生剤などの、化学薬剤に前記生ウイルスを曝露することでも達成できる。このような架橋剤の例としては、ブスルファン、シクロフォスファミド、メルファラン、ホルムアルデヒド、カルボジイミド及びビススルホスクシンイミジルスベラートが挙げられる。フリーラジカル発生剤の例としては、パーオキサイド、臭化水素、過酸化アンモニウム及びヒドロキシルラジカルが挙げられる。

前記ウイルス粒子を産生するために使用される増殖培地を分画することによって、前記生ウイルスをＵＶ吸収化合物から分離させてもよい。前記増殖培地は、例えばスクロース密度勾配中で分画されてもよい。前記ＮＲＶＰの調製後、前記ウイルス由来粒子を含む希釈液を分画又は濾過することで、前記ＮＲＶＰを分離させることができる。前記希釈液は、例えばスクロース密度勾配中で分画、又は、タンジェンシャルフローフィルトレーション（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によって濾過されてもよい。

本開示は、上述の非複製型ウイルス由来粒子を患者に投与することで、免疫応答を刺激する方法も含む。前記ＮＲＶＰの投与は、患者内にサイトカインの発現及び放出を誘導する。患者内に放出され得る代表的なサイトカインの例として、インターロイキン、インターフェロン、炎症性サイトカイン、ＣＸＣケモカインファミリーメンバー、腫瘍壊死因子ファミリーメンバー、又はこれらのあらゆる組み合わせが挙げられる。これらのファクターが、腫瘍抗原を提示又は認識させる。

本開示は、患者内の癌性細胞の細胞死を誘導する方法を含む。前記方法は、上述の非複製型ウイルス由来粒子を患者に投与することを含む。

本開示は、癌性細胞又は非癌性細胞の細胞死を好ましく誘導する方法も含む。前記方法は、上述の非複製型ウイルス由来粒子を患者に投与することを含む。

前記細胞死は、例えば前記ＮＲＶＰ、又は、前記ＮＲＶＰの構成物の存在によって細胞内で起こるアポトーシスによるものであってもよい。また、細胞死は自然免疫エフェクター細胞、適応免疫エフェクター細胞、又はこれらのあらゆる組み合わせのリクルートによるものであり、例えば細胞によって放出されたサイトカインによって引き起こされてもよい。前記適応免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、あるいはその両方であってもよい。前記自然免疫エフェクター細胞は、マスト細胞、食細胞（マクロファージ、好中球、又は樹状細胞など）、好塩基球、好酸球、ナチュラルキラー細胞、γδＴ細胞、又はこれらのあらゆる組み合わせであってもよい。

免疫応答を刺激するため、又は、癌性細胞の細胞死を誘導するため、患者は十分な数のＮＲＶＰで治療される。前記ＮＲＶＰは生ウイルス粒子を形成しないため、複製可能なウイルスを用いた治療よりも多い量で前記ＮＲＶＰを投与することが望ましい。前記患者は、１Ｅ１０から１Ｅ１５の非複製型ウイルス由来粒子を投与されてもよい。好ましい例において、前記患者は、１Ｅ１１から１Ｅ１３の非複製型ウイルス由来粒子を投与されてもよい。

ＮＲＶＰを用いた患者の治療及び化学療法剤を用いた治療を組み合わせる時、相乗効果が生まれることもある。前記化学療法は、例えば、ベンダムスチン、デキサメタゾン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、イマチニブ、ダサチニブ、又は、イダルビシンであってもよい。これらの薬剤は、ＮＲＶＰによって媒介されるアポトーシスの感受性の向上、サイトカイン分泌の増強、抗腫瘍免疫応答の向上、血管遮断の促進、又はこれらのあらゆる組み合わせを行うことが期待できる。

ＮＲＶＰは、固形腫瘍又は白血病などの非固形腫瘍を治療するために使用されてもよい。しかしながら、ＮＲＶＰは細胞内で生ウイルスを形成しないため、注入されたＮＲＶＰに全ての癌細胞を曝露することが特に望ましい。これは、複製可能なウイルスが投与された場合には、癌細胞の一部が注入されたウイルスに曝露されると新たなウイルスが産生され、残りの癌細胞が該ウイルス粒子にさらに曝露される結果となることとは対照的である。

ウイルス粒子の産生の欠如を考慮すると、前記ＮＲＶＰの静脈内投与は白血病細胞が実質的に前記粒子に曝露される結果になるため、白血病の治療にＮＲＶＰを使用することが好ましい。対照的に、固形腫瘍では、前記固形腫瘍の細胞の一部は注入されたＮＲＶＰに曝露されない。前記非複製型ウイルス由来粒子の投与の様式は、治療される癌によって決定されてもよい。前記ＮＲＶＰは患者に、腫瘍内投与、鼻腔内投与、筋肉内投与、皮内投与、腹腔内投与、動脈内投与、静脈内投与、皮下投与、又は頭蓋内投与されてもよい。

本開示の非複製型ウイルス由来粒子（ＮＲＶＰ）は、細胞間で拡散する能力を欠くように改変された野生型ラブドウイルス粒子から形成されてもよい。前記非複製型ラブドウイルス由来粒子は複製可能な野生型ラブドウイルス粒子から由来するものであってもよい。一度改変されると、前記ＮＲＲＰはビリオン複製を継続できなくなる。ＮＲＲＰは、不死化細胞に対して指向性を保持してもよい。ＮＲＲＰの具体的な例は、不死化細胞に対して、自然及び／又は適応免疫刺激特性を有する。

本開示の目的のため、“不死化細胞（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ ｃｅｌｌ）”という表現は、細胞分裂が抑制されない細胞であり、高増殖性細胞、腫瘍又は癌細胞、及び癌化した不死化細胞を含むが、これらに限定されない。高増殖性細胞はいかなる新生物、又は、いかなる慢性感染細胞又は組織であってもよい。前記新生物は、例えば、良性新生物、嚢胞性新生物、上皮内がん、悪性新生物、転移性新生物、又は、続発性新生物であってもよい。前記高増殖性細胞は、造血性癌細胞又は固形腫瘍からの細胞であってもよい。

本開示に係るＮＲＲＰは、不死化細胞に対する指向性を保持してもよい。これは、ＮＲＲＰが、腫瘍細胞又は癌細胞、及び、癌化した不死化細胞などの不死化細胞において、優先的に細胞死を誘導することを意味する。

前記野生型ラブドウイルスは、そのゲノム複製及び／又は発現を妨害する手段によって、前記ＮＲＲＰを産生するために改変されてもよい。これは、ゲノム複製及び／又は発現が親株の発現量よりも減少していることを意味する。ゲノム発現は喪失されてもよい。

前記野生型ラブドウイルスのゲノム発現を妨害するために、電磁（ＥＭ）放射が使用されてもよい。電磁放射は、ＵＶ、赤外線、Ｘ線、ガンマ線、及び、ＵＶＣ（２００−２８０ナノメートル）などのＥＭスペクトルにおけるその他の放射を含んでもよい。化学的に誘導した妨害は、前記野生型ラブドウイルスのゲノム発現を妨害するために使用されてもよい。例えば、ブスルファンなどのゲノム傷害剤が使用されてもよい。

前記野生型ラブドウイルスのゲノム発現を十分に妨害するために必要な前記ＥＭ放射線量は、方法に依存し、ウイルス濃度、ウイルスストック調製の濁度、使用された用量、ウイルスストック調製の夾雑物の存在又は純度、使用された希釈剤、及び、この工程のために保存されたウイルス調製の容器（プラスチック、ガラス、など）などのパラメータによって異なる。化学的投与も様々なパラメータから影響を受ける。

一つの実施例において、スクロースクッション法で精製された、５０μｌの前記野生型ラブドウイルスの１Ｅ１０ ＰＦＵ／ｍｌストックが、２５０ｍＪ／ｃｍ^２で（約４０秒間）放射された。

本開示は、さらに、野生型ラブドウイルス由来粒子から作られた非複製型ウイルス由来粒子をを提供する。前記野生型ウイルスは、細胞間で拡散する能力を欠くように改変されるが、自然及び／又は適応免疫刺激特性は保持するように改変される。

本開示は、ＮＲＶＰの使用を提供し、特に不死化細胞の集団を処理するためのＮＲＲＰを提供する。

本開示の目的のため、“治療する（ｔｒｅａｔ）”とは、放射線療法、化学療法、免疫療法、外科手術、腫瘍溶解性ウイルスベース療法、又は、その他のウイルスベース療法で、前記ＮＲＶＰ又はＮＲＲＰが単体又は組み合わせで使用される適応のことを意味する。

当業者は、“化学療法（ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｉｅｓ）”を、有糸分裂阻害剤、レナリドミド又はポマリドミドなどのＩＭｉＤＳ、クロマチン改変剤、ＳＡＨＡなどのＨＤＡＣ阻害剤、脱メチル化剤、アルキル化剤、ｍＴＯＲ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、代謝拮抗剤、ＤＮＡ傷害剤又はＤＮＡ制御剤、ホスホジエストラーゼ阻害剤、ＬＣＬ１６１などのＳＭＡＣ類似物質、コルチコステロイド、及び、サイトカイン／ケモカインの使用を伴う治療を含むが、これらに限定されないと理解するであろう。

例えば、化学療法は、アルキル化剤、ＤＮＡ傷害剤又はＤＮＡ制御剤、有糸分裂阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、ＩＭｉＤＳ、代謝拮抗剤、ｍＴＯＲ阻害剤、クロマチン改変剤、ＨＤＡＣ阻害剤、脱メチル化剤、ホスホジエストラーゼ阻害剤、コルチコステロイド及びサイトカイン／ケモカインを使用する療法を含む。特定の化学療法は、ベンダムスチン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロフォスファミド、ダカルバジン、ロムスチン、メルファラン、テモゾロミド、チオテパ、オキサリプラチン、プロカルバジン、ペントスタチン、クラドリビン、クロファラビン、シタラビン、フルダラビン、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メルカプトプリン、ネララビン、フルオロウラシル、ブレオマイシン、アクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ドキソルビシンリポソーム、イダルビシン、ミトキサントロン、カペシタビン、トポテカン、イリノテカン、エトポシド、パクリタキセル、テニポシド、チオグアニン、オマセタキシン、アルトレタミン、アスパラギナーゼ、アスパラギナーゼ、ペグアスパラガーゼ、イソトレチノイン、レチノイン酸、ヒ素、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンクリスチンリポソーム、ボスチニブ、ダサチニブ、イマチニブ、ニロチニブ、スニチニブ、ベムラフェニブ、レゴラフェニブ、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、サリドマイド、レナリドミド、ポマリドミド、メトトレキサート、プララトレキサート、エベロリムス、テムシロリムス、ボリノスタット、ロミデプシン、バルプロ酸、デシタビン、アザシチジン、アナグレリド、コルチゾン、デキサメタゾン、プレドニゾン及びトリアムシノロン、インターフェロン アルファ２ａ、インターフェロン アルファ２ｂ、ペグインターフェロン アルファ２ｂ、インターフェロン ベータ１ｂ、アルデスロイキン／ＩＬ−２、デニロイキンジフチトクス、顆粒球コロニー刺激因子、及び、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を含むが、これらに限定されない。

本開示の目的のため、“免疫療法（ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｉｅｓ）”という用語は、ＣＤ２０（リツキシマブ、イブリツモマブチウキセタン及びトシツモマブなど）、ＣＤ４７、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＳ１、ＣＤ５２（アレムツズマブなど）、ＶＥＧＦ（ベバシズマブなど）、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ（トラスツズマブなど）、ＥＧＦＲ（セツキシマブ及びニモツズマブなど）、ＣＴＬＡ４（イピリムマブなど）、又は、ＩＧＦ−１（ガニツマブなど）を標的とする免疫療法を意味する。当業者にとって周知のその他の免疫療法も、“免疫療法”という用語の範囲内に含まれてもよい。

“腫瘍溶解性ウイルスベース療法（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｖｉｒｕｓ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）”という用語は、ポックスウイルスベース療法（ワクチニアベースウイルス）、単純ヘルペスウイルスベース療法（ＯｎｃｏＶＥＸＧＭ−ＣＳＦ）、ラブドウイルスベース療法（ＭＧ１、ＶＳＶ−ＩＦＮｂ、ＶＳＶｄ５１）、レオウイルス（Ｒｅｏｌｙｓｉｎ）、アデノウイルスベース療法（ＯＮＹＸ０１５）、麻疹ウイルスベース療法、ニューカッスル病ウイルスベース療法、アルファウイルスベース療法、及び、パルボウイルス種ベース療法を含む当該技術分野において既知のものを含む。

ＮＲＶＰ及びＮＲＲＰは腫瘍内投与、鼻腔内投与、筋肉内投与、皮内投与、腹腔内投与、動脈内投与、静脈内投与、皮下投与、又は頭蓋内投与されてもよい。

二種類の異なるラブドウイルス由来株、及び、患者サンプルを含むいくつかの異なる細胞型を使用したいくつかの異なるインビトロ及びインビボモデルにおけるＮＲＲＰの腫瘍溶解性が、以下に詳述される。

腫瘍特異的細胞毒性は、細胞表現型顕微鏡観察、レザズリンによる細胞毒性の定量化、及び、傷害された腫瘍細胞のフローサイトメトリーを含むいくつかの分析方法によって調べられる。

Ｌ１２１０に対する免疫防御モデルを使用することは、プログラム細胞死経路のＮＲＲＰの活性化が、腫瘍に対する自然及び適応免疫応答を発生させることにつながることを示唆する。したがって、ＮＲＲＰを使用した治療は、有効性を維持するために各細胞が感染しなくてもよいため、単体の治療として、又は、抗癌療法レジメンのアジュバントとして使用されてもよい。

Ｌ１２１０を有するマウスにおいて、急性転化期に、ＮＲＲＰによって誘発されたサイトカインをルミネックスに基づいて定量化を行った。同定されたサイトカインは全て、ＮＲＲＰ処理したマウスでは２倍以上誘導されており、統計的に有意であった（ｎｏｎ−ｐａｉｒｅｄ ｔ−ｔｅｓｔ ｐＶ＜０．０５）。ｐＶは多重仮説検定を考慮して補正した（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ＆Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法）

この実験は、高いＮＲＲＰ対細胞比（すなわち、＞１）で投与した時に、ＮＲＲＰが最も有効となることを示す。このようなより高い用量で投与された場合には、大部分の細胞が細胞毒性ＮＲＲＰと遭遇することを保証される。これは、ウイルス拡散に依存して治療効率が向上し、低いＯＶ対細胞比でレシピエントへ安全に送達できる、生ウイルスを用いた治療と対照的である。

図１Ａを除く全ての図面において、ＮＲＲＰは、１Ｅ１０ ＰＦＵ／ｍｌの生ＶＳＶ−ＧＦＰ、５０μｌサンプルを２５０ｍＪ／ｃｍ^２のＵＶＣ照射し、該ウイルス溶液を水の中で２０％のスクロースクッション（５ｍｌ）法を用いて１４８，０００×ｇで１２０分間遠心して精製することにより調製した。

実施例１：電磁放射によって産生したＶＳＶベースＮＲＲＰ

ラブドウイルスにＵＶフォトニックダメージを与えることで、生物活性を保持した非複製型ウイルス由来粒子を産生してもよい。高線量のＵＶ照射を行うと、前記ラブドウイルスのゲノムが切断され、該ウイルスは生物学的に不活性になる。しかしながら、当該ウイルスは依然として細胞に結合して内部移行するが、該細胞内で新しいウイルス粒子を産生する能力を失う、又は該能力が大幅に減少するような線量でＵＶ照射を行えることが、既に明らかにされている。すなわち、ウイルスの複製能は失われるが、生物学的活性は保持される。

ＧＦＰ蛋白質を発現する精製したＶＳＶ（ラブドウイルス）に約１００−約１０００ｍＪ／ｃｍ^２のＵＶフルエンスを照射すると、不死化細胞に対する指向性は保持しているが（図１Ａ及び１Ｂ）、細胞間伝播能力を欠いた（図２Ａ）ＮＲＲＰが得られることが明らかとなった。

本開示に従い、ＶＳＶベース ＮＲＲＰを得るために、ＶＳＶ野生株に２５０ｍＪ／ｃｍ^２のＵＶを照射した。図１Ａ中、１Ｅ２のＵＶ照射量は１００ｍＪ／ｃｍ^２に相当する。２５０ｍＪ／ｃｍ^２で照射されると、ＶＳＶ−ｅＧＦＰの発現能力は失われたが、不死化された増殖性細胞株（Ｖｅｒｏ）に対する強い細胞毒性は保持されていた（図２Ｂ）。生ウイルスを感染させた場合とは極めて対照的に、前記ウイルス粒子は前記細胞中で複製できなかったことが、感染後のウイルス力価測定によって確認された（図２Ｃ）。当該効果は、ラブドウイルス科に属する他のメンバーを用いた場合にも同様に観察された（図３Ａ、３Ｂ、及び３Ｃ）。

図１Ａに示される線量効果曲線により、細胞毒性はＵＶ線量が１０００ｍＪ／ｃｍ^２を超えると減少し、１０、０００ｍＪ／ｃｍ^２で完全に消失することが示される。当該線量で細胞毒性が消失するのは、前記処理されたウイルスが前記細胞表面に結合できない、及び／又は前記細胞に内部移行できない程、Ｇ蛋白質が架橋されるためと考えられている。正常ヒト新生児皮膚線維芽細胞（Ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ；ＨＤＦ）と比べると該細胞とは異なり、細胞毒性は、非癌性細胞よりも癌性細胞に優先的なようである（図１Ａ及び１Ｂ）。実際に、非癌性細胞がＮＲＲＰによって媒介される細胞毒性に感受性になるには、約１０倍ものウイルスを要するようである（図１Ｂ）。

急性白血病細胞においてＮＲＲＰの複製と伝播が起こらないことを確認するために、マウスの中悪性度リンパ芽球性白血病細胞株（Ｌ１２１０）とＶｅｒｏ コントロール細胞株（正常腎臓上皮細胞）をインビトロでともに処理したのち、ＧＦＰ産生とウイルス力価を定量化した。当該処理を施した両細胞株において、検出できるレベルの生ウイルスは認められなかった（図４Ａ及び４Ｂ）。

ウイルスゲノムのウェスタンブロット解析により、ＮＲＲＰｓではゲノム発現が全体的に減少していることが示された（図５）。ビリオン産生を阻止してゲノム発現を減少させるＵＶ線量は、明瞭な腫瘍溶解活性と相関している。これらの実験では、各腫瘍細胞がＮＲＲＰに遭遇して至る所で激しい細胞死を確実に起こすように、（１以上の）高い感染多重度（ＭＯＩ）、すなわち粒子対細胞比（図１Ｂ）を用いてもよい。

実施例２：ＲＮＡアルキル化剤への曝露によって産生したＶＳＶベースＮＲＲＰ

別の例において、ＮＲＲＰは、４℃で６ｍｇ／ｍＬのブスルファンでＶＳＶを２４時間処理することで化学的に産生され、２４時間、Ｖｅｒｏ細胞に加えられた。処理後、４％より少ないＶｅｒｏ細胞が生存可能な状態を維持した（図６Ａ）。ブスルファンのみで２４時間処理した場合にＶｅｒｏ細胞が約８２％生存可能な状態を維持したため、前記効果はＮＲＲＰに起因し得る（図６Ｂ）。図６Ｃは、２４時間、生ＶＳＶ−ＧＦＰに感染したＶｅｒｏ細胞の細胞変性効果を示し、前記ＮＲＲＰが由来する当該生ウイルスストック（ＶＳＶ−ＧＦＰ）は、ＧＦＰ発現により実際に複製可能であることが証明された。

実施例３：ガンマ線への曝露によって産生されたＶＳＶベースＮＲＰＰ

他の実施例において、ＮＲＲＰは、１Ｅ１０の凍結野生型ＶＳＶを−８０℃で１５ｋＧｙのコバルト６０で照射して産生され、４８時間、Ｖｅｒｏ細胞に１細胞あたり１０００の粒子が加えられた。同様に、これらの不死化細胞に対しても細胞変性効果は明白であった（図７Ａ）。細胞アポトーシス及び細胞死のＮＲＲＰによって誘導された形態変化は、同じく４８時間にわたって生ＶＳＶ−ＧＦＰで同じ細胞を処理した時の細胞変性効果と比べられる（図７Ｂ）。ＰＢＳのみで処理されたＶｅｒｏ細胞は、細胞変性効果を示すことなく生存可能な状態を維持し、蛍光性を示さなかった（図７Ｃ）。

実施例４：ＮＲＲＰＳはインビトロで白血病細胞に対して効果的な処置である。

白血病細胞がＮＲＲＰによって媒介される細胞死に対する感受性を有するどうかを、ＵＶ法によって産生されたＶＳＶベースＮＲＲＰと共に試験した。第一に、Ｌ１２１０細胞株に誘導された細胞毒性、及び、正常なヒト皮膚繊維芽細胞（ＨＤＦ）において観測されたものが決定された。両方の細胞株が生ウイルス感染に対する感受性を有していたが、ＮＲＲＰは白血病Ｌ１２１０細胞においてのみ死を誘導した（図８Ａ）。細胞の長径の減少、“しわのよった（ｓｈｒｉｖｅｌｅｄ）”外観を持つ多数のアポトーシス小体、及び断片化されたＤＮＡを特徴とする典型的なアポトーシス様相が、急性白血病Ｌ１２１０細胞において観測された。様々なヒト及びマウスの細胞株において、細胞毒性が標準的なレザズリン試験を用いて定量化された。これらの実験において、急性白血病細胞は、正常細胞の生存率を保ちながら、ＮＲＲＰによって媒介される細胞死に対する高い感受性を有していた（図８Ｂ）。代わりのラブドウイルス株であるマラバベースＮＲＲＰを用いても、同様の結果が得られた（図３Ａ及び図３Ｂ）。ゲノム発現がなかったことが、蛍光顕微鏡イメージによって確認された（図８Ｃ）。

Ｌ１２１０細胞株におけるアポトーシスのレベルは、フローサイトメトリーによって定量化された。処理してから３０時間後、ＮＲＲＰは広範な（集団の８４％）早期／晩期（ｅａｒｌｙ／ｌａｔｅ）アポトーシスを誘導した（図９）。ＶＳＶに誘導されたアポトーシスは、小胞体（ＥＲ）ストレスのレベルと直接相関するように示されている（１０）。興味深いことに、細胞のＥＲストレスを緩和する細胞能力が破綻した時、免疫原性アポトーシスが誘導され得る（１６）。ＮＲＲＰは、後述される通り、細胞死の独特な形態を誘導する。

その他の実施例において、Ｌ１２１０白血病細胞は、ＮＲＲＰと、３００μＭのベンダムスチン（図１０）、４５μＭのデキサメサゾン（図１１）、０．０２５μＭのドキソルビシン（図１２）、又は、０．０１２５μＭのビンクリスチン（図１３）と組み合わせて７２時間処理された。ＮＲＲＰは通常の様式でＮＲＲＰ自身に細胞毒性効果を誘導するが、上述の薬剤と組み合わせることで、付加及び／又は相乗細胞毒性効果が観測された。つまり、ＮＲＲＰ療法をその他の化学療法／薬理学と組み合わせた場合、独特な治療増強効果をもたらすことを意味する。

その他の実施例において、Ｋ５６２Ｐｈ−陽性骨髄性白血病細胞株がＵＶ−製造ＮＲＲＰと０．０５μＭのイダルビシンを組み合わせて７２時間処理された（図１４）。この実施例においても、ＮＲＲＰとこの種類の化学療法を組み合わせて用いた場合、骨髄性白血病細胞株はＮＲＲＰによって媒介される細胞死に対する感受性を有し、増強効果が再度観測された。これらの観測は、ＮＲＲＰ療法が付加治療を用いることで増強され得ることを示す。このことは、とりわけ、高められた有効性を得るために独特な組み合わせのアプローチを用いる必要がある難治性の癌などに対する代替の戦略を示している。

実施例５：ＮＲＲＰ抗腫瘍特異性を示すモデリング

抗ウイルスシグナル経路が障害された細胞に対するＮＲＲＰ特異性を説明するために用いられたモデルは、Ｌｅ Ｂｏｕｅｆらによって詳述された我々の先行研究から適応された（図１５Ａ）。簡潔にいえば、当該モデルは６つの常微分方程式のサブセットによって表される。前記常微分方程式は、環境におけるＮＲＲＰ（Ｎ）及びインターフェロン（ＩＦＮ）の濃度に依存する細胞集団（ＵＰ、ＩＰ、ＡＰ及びＰＰ）の推移を表す。これらの方程式は以下の通りである。

上記方程式に使用されるパラメータは、ＮＲＲＰ内部移行率（Ｋ_ＮＩ）、ＩＦＮ‐シグナル伝達活性化の比率（Ｋ_{ＩＦＮ ｏｎ}）、ＩＦＮ−シグナル伝達不活性化の比率（Ｋ_{ＩＦＮ ｏｆｆ}）、ＩＦＮのＥＣ_５０（ＥＣ_５０）、細胞死の比率（γｃ）及びＮＲＲＰ排除の比率（Ｋ_ＮＣ）を表す。

次の方程式のサブセットはＮＶＲＰ（Ｎ）及びインターフェロン（ＩＦＮ）のダイナミクスを表す。

上記方程式において使用されるパラメータは、ＮＲＲＰ内部移行の比率（Ｋ_ＮＩ）、ＮＲＲＰ分解（γ_Ｎ）、ＩＰ、ＡＰ及びＰＰからのＩＦＮ産生（Ｋ_ＩＦＮ１、Ｋ_{ＩＦＮ２．１}及びＫ_{ＩＦＮ２．２}）及びＩＦＮ分解（γ_ＩＦＮ）を表す。

Ｍｏｎｔｅ Ｃａｒｌｏシミュレーションは、文献及び実験証拠（１８）から由来する生理学的パラメータに隣接する１ログウィンドウ（ｌｏｇ ｗｉｎｄｏｗ）（表２）の範囲内で、上記パラメータを無作為に変えて行われた。シミュレーションは、非負の制約を課すＯＤＥ１５ｓを用いたＭａｔｌａｂで行われた。図１５Ｂにおいて示されるトレンドは、１０００を超えるシミュレーションの中央値を示す。これらのシミュレーションにおいて使用された細胞の数は２．５Ｅ５であり、媒体の容積は１ｍｌにセットされ、ＰＦＵ対細胞比は１つの細胞あたり１００粒子にセットされた。これらのシミュレーションにおいて、ＩＦＮ−シグナル伝達経路の障害は、それらの元の値の１００％から１％に減少するＫ_ＩＦＮ１、Ｋ_{ＩＦＮ２．１}、Ｋ_{ＩＦＮ２．２}、Ｋ_ＶＣ及びＫ_{ＩＦＮ ｏｎ}によってシミュレートされた。

腫瘍細胞に対する特異性が達成されたメカニズムを調査するため、本開示の著者らは正常及び腫瘍細胞におけるＮＲＲＰによって誘導される細胞毒性をシミュレートした。近年、本開示の著者らは、正常及び腫瘍細胞における細胞毒性と生腫瘍溶解性ウイルス複製ダイナミクス（ｌｉｖｅ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｖｉｒｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｄｙｎａｍｉｃｓ）の関係を示す集団ベースのモデルを開発した。このモデルによれば、細胞の非感染集団（ＵＰ）がビリオンに遭遇することで、感染サイクルが始まる。これによってＵＰ集団が感染し、生ウイルスの上で、ビリオン及びインターフェロン（ＩＦＮ）として知られるサイトカインが環境へ放出される。

ＩＦＮが次第に増えることで、細胞集団は抗ウイルスシグナル伝達（ＡＰ）を活性化させる。これによって、細胞集団はウイルス感染を排除し、更なる傷害から保護される（ＰＰ）。ＮＲＲＰにこのモデルを適応するために、本開示の著者らは前記モデルからウイルス複製ダイナミクスを除き、ＮＲＲＰによって媒介される細胞毒性と、８０％の癌に発生する工程であるＩＦＮ−シグナル伝達経路における障害の範囲の関係をシミュレートした。これらの障害は、ＩＦＮ産生の比率、ＩＦＮシグナル伝達の活性化の比率、及び、腫瘍細胞と正常細胞の間のＮＲＲＰ排除の比率を減少させることでシミュレートした。この観測が系統的となることを保証するため、Ｍｏｎｔｅ Ｃａｒｌｏシミュレーションプラットフォームが利用された。ここで、すべてのキネティックパラメータは、文献的及び実験証拠から由来する推定値に隣接する１ログウィンドウの範囲内で変更された（表２）。

１０００の無作為なパラメータのペアリングに及ぶ次のシミュレーションにおいて（図１５Ｂ）、本開示の著者らは、癌細胞が、ＩＦＮにシグナルを送る又は応答する能力を失うにつれて、これらの細胞がＮＲＲＰによって媒介される細胞毒性に対してより敏感になると決定づけた。この観測を確証するために、本開示の著者らは、正常細胞（ＨＤＦ）及び白血病細胞（Ｌ１２１０）におけるＮＲＲＰによって媒介される細胞毒性へのＩＦＮのインパクトを調査した。興味深いことに、イントロンＡ（遺伝子組み換え型ＩＦＮ）がＮＲＲＰ傷害に対する正常細胞の保護をさらに増やす一方で（図１５Ｃ）、イントロンＡの白血病細胞に対するインパクトは検出されなかった（図１５Ｄ）。

表２：Ｌｅ Ｂｏｕｅｆら（２０１３）によって提唱された実験的及び文献的証拠を含む推定値を示すパラメータのリスト。

実施例６：ＡＭＬ急性転化におけるＮＲＲＰ活性

臨床サンプルにおいて、ＮＲＲＰプラットフォームの翻訳能が調べられた。重度の急性転化期の二名のヒト患者より末梢血単核細胞を採取し、ＮＲＲＰによって媒介される細胞死に対する感受性を試験した。前記患者らは、ＣＤ３３陽性表現型の循環型芽細胞を有していた。両患者は慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の治療を受け、チロシンキナーゼ阻害薬（ＴＫＩ）治療に対する耐性を有していた。Ｌ１２１０芽細胞における観測と同様に、患者サンプルは、典型的な形態を表すと共にＮＲＲＰに誘導された明白なアポトーシスを起こした（図１６Ａ）。蛍光顕微鏡イメージは、ＮＲＲＰゲノム発現の不在を確認した（図１６Ｂ）。ＮＲＲＰ処理後、これらのＣＤ３３＋白血病細胞は、アポトーシスマーカーであるアネキシンＶで強く染色された（図１６Ｃ）。非培養の患者サンプルが、この応答の特異性を評価するために用いられた。両患者ともに、ＮＲＲＰ処理後には優勢だった白血病ＣＤ３３＋集団が消失し、前記サンプル中で正常細胞が優位になった（図１６Ｄ）。

ＮＲＲＰが正常な白血球細胞に影響を及ぼさないように、健常ドナーより単離された骨髄単核細胞は、ＰＢＳ又はＮＲＲＰで処理された。１８時間後、及び、６５時間後の時点で、これらのサンプルにおいてＮＲＲＰはアポトーシスを誘導しなかった（図１７Ａ及び図１７Ｂ）。

実施例７：インビボのＮＲＲＰ抗白血病活性

治療剤としてのＮＲＲＰの能力を評価するために、白血病急性転化期のマウスモデルが使用された。１日目、ＤＢＡ／２マウスは、１×１０^６の用量のＬ１２１０芽細胞でチャレンジされた。次の日から３日連続で３×１０^９のＮＲＲＰの静脈投与のレジメンが開始され、生存が確認できた。並行して、別のマウスのコホートは１回の注入あたりＭＴＤの２×１０^６のウイルスで生ＶＳＶ処理（１９）、又は、同様の治療スケジュールでＰＢＳ処理された。ＮＲＲＰ処理されたマウスは４０日目まで８０％生存し、ＰＢＳ（Ｐ≦０．００４５）又は生ウイルス（Ｐ≦０．０４４）で処理されたマウスと比較して著しい優位性を示した（図１８Ａ）。ＮＲＲＰは十分な耐容性を示し、特にこの実験では、生ウイルスのＭＴＤより１５００倍高い用量を示した、投与可能な最大用量で投与された。急性白血病が頻繁に中枢神経系へ播種し、野生型ＶＳＶの神経毒性が高いことから、ＮＲＲＰ及び生ウイルスの頭蓋内投与が行われた。マウスが最大産生用量１×１０^８粒子投与の頭蓋内投与を耐えることができる一方で、全てのマウスが１×１０^４の生ウイルス投与で急死した。

ＮＲＲＰ処理による有効性と差次的なＭＴＤによって促され、免疫系が次の処理で活性化されるかを知ることは興味深い。ＰＢＳ又はＮＲＲＰ処理してから２０時間後のＬ１２１０腫瘍を有するマウスから、マウス血清を採取した（図１８Ｂ）。この分析において、Ｔ細胞をリクルートし分化することで知られるサイトカインが、次のＮＲＲＰ処理で誘導される。ＮＲＲＰ処理によって誘導されたこれらの免疫調節サイトカインの例としては、白血病抑制因子ＬＩＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＣＣＬ−２、ＲＡＮＴＥＳ及びＭＩＰ−１αが挙げられる（図１８Ｂ）。

特にＴ細胞活性化などの免疫系刺激を確認するため、本開示の著者らは先の公開に記載されているワクチン戦略を採用した。実験的に、このプラットフォームはイミューノコンピテントな動物へのアポトーシス細胞の注入、及び、次の腫瘍チャレンジに対する保護的な適応免疫の測定からなる。実際に、ＮＲＲＰで処理されたＬ１２１０細胞は、アネキシンＶ染色の増加によって、図１６Ｃに見られるような著しいアポトーシスを示した。したがって、この典型的な実験的アプローチは、ＮＲＲＰが免疫原性アポトーシスの引き金を引くかどうかを探究するために採用された。

ＤＢＡ／２マウス（Ｌ１２１０と同系）の二つのコホートが、ＮＲＲＰで前処理され１×１０^６ガンマ照射されたＬ１２１０細胞の静脈投与を、週１回、計３回受けた。別のコホートはガンマ照射されたＬ１２１０細胞を同じ量受けた。このレジメンの１週間後、Ｌ１２１０白血病チャレンジ（１×１０^６細胞）が尾静脈を介して投与され、生存が記録された。ＮＲＲＰ処理されたＬ１２１０細胞の投与を受けたコホートは、白血病チャレンジの後８０％生存したが、未処理のＬ１２１０投与を受けたコホートにおいては一様に致死的であった（図１９）。マウスの生存は１５０日後まで維持され、継続的な生存が保証された。これは、ＮＲＲＰで処理された急性白血病細胞が免疫原性アポトーシスを起こすということと矛盾しない。

急性リンパ芽球性白血病細胞株及び急性骨髄性白血病株の使用、及び、重度の前治療を施した急性転化期のＣＭＬ患者の一次白血病細胞の使用も同様に、ＮＲＲＰが少なくとも白血病特定の細胞溶解剤であることを示す。上述のインビトロ及びインビボ実験において、ＮＲＲＰは、多様式の治療プラットフォームを提供することが確認された。

実施例８：多発性骨髄腫、脳腫瘍及び大腸癌細胞株におけるＮＲＲＰ活性

上述の実験に加えて、細胞株がＰＢＳ又はＶＳＶ由来ＮＲＲＰで１５時間処理された場合、ＮＲＲＰは多発性骨髄腫細胞株ＭＣＰ−１１及びＲＰＭＩ−８２２６において細胞変性を有することが示される（図２０）。特に、図２１は、ＭＯＩ＝２０５で投与されたＮＲＲＰで処理してから７２時間後に採取された骨髄腫細胞株の、アラマーブルー（Ａｌａｍａｒ ｂｌｕｅ）細胞毒性又はレザズリン試験を用いた細胞生存率を示している。当該実験において、ＳＲ４９８７は正常な骨髄基質細胞株である。図２１に見られるように、ＳＲ４９８７は非悪性細胞であるため、ＮＲＲＰに対し耐性を示す。ウイルスにコードされたＧＦＰが産生されなかったため、ＮＲＲＰが産生された時、ＮＲＲＰ又はＶＳＶゲノム複製は発見されなかった（データ未記載）。

他の実施例において、ＭＣＰ−１１多発性骨髄腫細胞株は、ＮＲＲＰと組み合わせて、２０μＭのメルファラン（図２２）又は１５μＭのＳＭＡＣ類似物質であるＬＣＬ１６１（図２３）で処理された。併用療法は、両方の場合においてＮＲＲＰの細胞変性効果を増加させた。ＳＭＡＣ類似物質とＮＲＲＰの間の相乗活性は、有望なアプローチを表す。ＳＭＡＣ類似の抗腫瘍活性が著しく強化される、又は、場合によってはＮＲＲＰの同時投与に本質的に依存することが観測された。

その他の実施例において、ＲＰＭＩ−８２２６多発性骨髄腫細胞株は増強細胞毒性効果を有する５ｎＭのカルフィルゾミブで処理された（図２４）。アルキル化剤（メルファランなど）、プロテアソーム阻害剤（カルフィルゾミブなど）又はＳＭＡＣ類似物質（ＬＣＬ１６１）とＮＲＲＰの同時投与は、様々な癌に対する代替の治療戦略を示し、特に多発性骨髄腫などの造血性の癌において有望である。

抗癌治療としてのＮＲＲＰの有用性は、脳腫瘍細胞株への影響によってさらに示される。ＮＲＲＰによって媒介される細胞毒性は、これらの細胞がＰＢＳ又はＮＲＲＰで２４時間処理された場合、ＨＤＦＮ正常細胞と比べて、グリオブラストーマ細胞株ＣＴ２Ａ、遅発性（ｄｅｌａｙｅｄ）脳腫瘍グリオブラストーマ細胞株（ＤＢＴ）（図２５Ａ）、星状細胞腫細胞株Ｋ１４９１（図２５Ｂ）及びＫ１４９２、及び、マウスグリオーマ細胞株（ＧＬ２６１）（図２５Ｃ）において決定された（図２６）。

また、その他の実施例において、グリオブラストーマ細胞株ＣＴ２ＡはＮＲＲＰと組み合わせて１０μＭのＨＤＡＣ阻害剤であるＳＡＨＡで処理され、ＰＢＳで処理したＮＲＲＰと比べて、増強細胞変性効果が観測された（図２７）。ＨＤＡＣ阻害は、抗癌剤としての見込みを少しだけ示した。しかしながら、ＮＲＲＰを組み合わせることで有意な活性が記録され、未だ治療法がない臨床ニーズであるグリオブラストーマベースの悪性腫瘍の治療に対するとても有望なアプローチを示す。

腎臓癌（７８６−０）及び乳癌（４Ｔ１）細胞株は、ＮＲＲＰの細胞変性効果に対し等しい感受性を有する（図２８Ａ、図２８Ｂ及び図２８Ｃ）。この一連の実験において、細胞株はＭＯＩ＝２５０でＮＲＲＰ処理され、７２時間後にレザズリン試験を用いて生存率を定量化した。実験を通して撮られた蛍光顕微鏡イメージはゲノム発現の不存在を確認した。

他の実施例において、皮下ＣＴ−２６大腸癌がマウスに埋め込まれた。マウスは腫瘍の埋め込みから１６日、１８日、及び２１日後に２Ｅ９ ＮＲＲＰで処理された（図２９）。ＮＲＲＰ処理の前の大きな腫瘍量にもかかわらず、腫瘍内又は静脈内経路でＮＲＲＰが投与された場合、延長された生存及び治癒が得られた。ＰＢＳ処理されたコントロールマウスは全て急激にエンドポイントに達した。このモデルは、固形腫瘍がＮＲＲＰベースのレジメンに受け入れられ得ることの付加証拠を示す。

上記の実施例はインシリコ及びインビトロ試験を通して、ほとんどの腫瘍に共通する自然免疫経路における欠損を活用するとすれば、生ウイルスと類似するＮＲＲＰは腫瘍選択的であることを示す。しかしながら、ＮＲＲＰプラットフォームによって提供された安全域は、高力価頭蓋内ＮＲＲＰ投与がマウスレシピエントによって十分に耐えられたという観測によって例証された。

急性リンパ芽球性性白血病又は急性骨髄性白血病を患う大多数の成人患者の転帰は、悲惨なままである。少数の患者にとって、骨髄破壊的前処置に続く同種幹細胞移植は潜在的に効果があるが、この方法は頻繁な有害現象と著しい治療関連死亡率を伴う。慢性期の慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の多くの患者にとって、標的チロシンキナーゼ阻害剤療法は良好な病害防除を提供する。急性白血病急性転化への進行が発生すると、多剤耐性、及び、この種の難治性白血病の急激なキネティクスのため、治療の選択肢は非常に限られる。

ＮＲＲＰは、多発性急性白血病マウスモデルにおいて、直接的な細胞溶解性及び免疫原性の特性を共に表す。特異なプログラム細胞死では、死んで行く細胞に対する免疫応答の誘導を伴う。一般に免疫原性アポトーシスと呼ばれるこの工程は、様々な現在の化学療法の有効性において必須であり、生ＲＶを含むウイルス感染に対する宿主防御においても必要である。上記のインビボの結果は、同様の工程がＮＲＲＰによって誘導され、治療有効性を推進する要因であることを示す。

より関連することとして、ＣＭＬ急性転化期の患者に由来する多剤耐性の一次骨髄芽球は、ＮＲＲＰ処理によって、アポトーシスへと向かわされ、最終的に根絶するということが観測された。加えて、健常な骨髄から採取した非白血病白血球は悪影響を受けなかった。この観測は、ＮＲＲＰが強力な殺腫瘍性活性を有するにもかかわらず、標準的な誘導及び強化化学療法の後によく見られる白血球減少症が回避できることを示唆する。このことは、治療関連の有害現象を著しく減少させることができるであろう。さらに、ＮＲＲＰによる白血病細胞切除中に正常白血球が保存できるとすれば、効果的な抗白血病免疫応答の同時誘導は、同種幹細胞移植に続く高用量の放射線化学療法の対象とならない患者の大多数において達成できるであろう。ＮＲＲＰによる免疫原性アポトーシスの誘導に続いて、耐久性のある治療反応を達成するための重要な要素である、免疫調節性サイトカインの幅広い種類が放出され、効果的な適応免疫活性の発達に役立つとみられる。

前記実施例は、高力価ＮＲＲＰの産生を実証する。主にプログラム細胞死経路を介した細胞溶解の誘導、ナチュラルキラー細胞活性化及び樹状細胞活性化を含む系統的腫瘍内免疫応答、又は、腫瘍内の血管遮断を通じて、ＮＲＲＰはいくつもの抗癌特性を有する。これらの特徴は、ＮＲＲＰ単独での使用、又は、放射線療法、化学療法、免疫療法、外科的手術、腫瘍溶解性ウイルス由来又はその他のウイルス由来療法プラットフォームと組み合わせたアジュバントとして、利用できる。

前述の記載において、実施例をよく理解するために数多くの詳細が明記されている。しかしながら、当業者にとってこれらの特定の詳細は必要ないことが明らかとなるであろう。

上述の実施例は代表的なもののみである。当業者は、ここに付随する請求の範囲によって規定される範囲から逸脱せずに、特定の実施例に変更や修正を加えることができる。

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３．Ｌｉｕ ＢＬ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｍ，Ｈａｎ Ｚ−，Ｂｒａｎｓｔｏｎ ＲＨ，Ｅｎｇｌｉｓｈ Ｃ，Ｒｅａｙ Ｐ，ｅｔ ａｌ．ＩＣＰ３４．５ ｄｅｌｅｔｅｄ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ，ｉｍｍｕｎｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ，ａｎｄ ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００３；１０：２９２−３０３．

４．Ｓｅｎｚｅｒ Ｎ，Ｂｅｄｅｌｌ Ｃ，Ｎｅｍｕｎａｉｔｉｓ Ｊ．ＯｎｃｏＶＥＸＧＭ−ＣＳＦ．Ａｒｍｅｄ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｖｉｒｕｓ．Ｄｒｕｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ ２０１０；３５：４４９−４５５．

５．Ｐａｒｋ Ｂ−，Ｈｗａｎｇ Ｔ，Ｌｉｕ Ｔ−，Ｓｚｅ ＤＹ，Ｋｉｍ Ｊ−，Ｋｗｏｎ Ｈ−，ｅｔ ａｌ．Ｕｓｅ ｏｆ ａ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｐｏｘｖｉｒｕｓ，ＪＸ−５９４，ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｐｒｉｍａｒｙ ｏｒ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ：ａ ｐｈａｓｅ Ｉ ｔｒｉａｌ．Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２００８；９：５３３−５４２．

６．Ｂｒｅｉｔｂａｃｈ ＣＪ，Ｔｈｏｒｎｅ ＳＨ，Ｂｅｌｌ ＪＣ，Ｋｉｒｎ ＤＨ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ ａｎｄ ａｒｍｅｄ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ：Ｔｈｅ ｌｅａｄ ｅｘａｍｐｌｅ ｏｆ ＪＸ−５９４．Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１２；１３：１７６８−１７７２．

７．Ｂｒｅｉｔｂａｃｈ ＣＪ，Ｂｕｒｋｅ Ｊ，Ｊｏｎｋｅｒ Ｄ，Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ Ｊ，Ｈａａｓ ＡＲ，Ｃｈｏｗ ＬＱＭ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａ ｍｕｌｔｉ−ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｐｏｘｖｉｒｕｓ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ ２０１１；４７７：９９−１０４．

８．Ｂａｒｂｅｒ ＧＮ．ＶＳＶ−ｔｕｍｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．Ｏｎｃｉｇｅｎｅ ２００５；２４：７７１０−７７１９．

９．Ｓｔｏｊｄｌ ＤＦ，Ｌｉｔｃｈｙ ＢＤ，ＴｅｎＯｅｖｅｒ ＢＲ，Ｐａｔｅｒｓｏｎ ＪＭ，Ｐｏｗｅｒ ＡＴ，Ｋｎｏｗｌｅｓ Ｓ，ｅｔ ａｌ．ＶＳＶ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｉｔｈ ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ ｔｈｅｉｒ ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｓｈｕｔｄｏｗｎ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｒｅ ｐｏｔｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ ａｇｅｎｔｓ．Ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ２００３；４：２６３−２７５．

１０．Ｍａｈｏｎｅｙ ＤＪ，Ｌｅｆｅｂｖｒｅ Ｃ，Ａｌｌａｎ Ｋ，Ｂｒｕｎ Ｊ，Ｓａｎａｅｉ Ｃ，Ｂａｉｒｄ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｕｓ−Ｔｕｍｏｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ Ｓｃｒｅｅｎ Ｒｅｖｅａｌｓ ＥＲ Ｓｔｒｅｓｓ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｃａｎ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｃａｎｃｅｒｓ ｆｏｒ Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ Ｖｉｒｕｓ−Ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ Ｃａｓｐａｓｅ−２ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２０１１；２０：４４３−４５６．

１１．Ｓａｌｏｕｒａ Ｖ，Ｗａｎｇ Ｌ−Ｓ，Ｆｒｉｄｌｅｎｄｅｒ ＺＧ，Ｓｕｎ Ｊ，Ｃｈｅｎｇ Ｇ，Ｋａｐｏｏｒ Ｖ，ｅｔ ａｌ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−β ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ｍａｇｌｉｎａｎｔ ｐｌｅｕｒａｌ ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ：Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｉｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ ｄｅｆｉｎｅｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｅｆｆｉｃａｃｙ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０１０；２１：５１−６４．

１２．Ｂｒｕｎ Ｊ，ＭｃＭａｎｕｓ Ｄ，Ｌｅｆｅｂｖｒｅ Ｃ，Ｈｕ Ｋ，Ｆａｌｌｓ Ｔ，Ａｔｋｉｎｓ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍａｒａｂａ ｖｉｒｕｓ ａｓ ａｎ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１０；１８：１４４０−１４４９．

１３．Ｗｉｌｌｍｏｎ ＣＬ，Ｓａｌｏｕｒａ Ｖ，Ｆｒｉｄｌｅｎｄｅｒ ＺＧ，Ｗｏｎｇｔｈｉｄａ Ｐ，Ｄｉａｚ ＲＭ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＩＦＮ−β ｅｎｈａｎｃｅｓ ｂｏｔｈ ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００９；６９：７７１３−７７２０．

１４．Ｇａｌｉｖｏ Ｆ，Ｄｉａｚ ＲＭ，Ｗｏｎｇｔｈｉｄａ Ｐ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｊ，Ｋｏｔｔｋｅ Ｔ，Ｂａｒｂｅｒ Ｇ，ｅｔ ａｌ．Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｙｃｌｅ ｖｉｒａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｒａｔｈｅｒ ｔｈａｎ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ，ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ＶＳＶ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｂ１６ ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０１０；１７：１５８−１７０．

１５．Ｓｗａｒｎａ Ｂａｉｓ，Ｅｒｉｃ Ｂａｒｔｅｅ，Ｍａｒｍｕｄｕｒ Ｍ．Ｒａｈｍａｎ，Ｇｒａｎｔ ＭｃＦａｄｄｅｎ，Ｃｈｉｒｓｔｏｐｈｅｒ Ｒ．Ｃｏｇｌｅ．Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ Ｖｉｒｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０１２；８．

１６．Ｚｉｔｖｏｇｅｌ Ｌ，Ｋｅｐｐ Ｏ，Ｓｅｎｏｖｉｌｌａ Ｌ，Ｍｅｎｇｅｒ Ｌ，Ｃｈａｐｕｔ Ｎ，Ｋｒｏｅｍｅｒ Ｇ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｆｏｒ ｏｐｔｉｍａｌ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ：Ｔｈｅ ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｐａｔｈｗａｙ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１０；１６：３１００−３１０４．

１７．Ｅｂｅｒｔ Ｏ，Ｈａｒｂａｒａｎ Ｓ，Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ Ｋ，Ｗｏｏ ＳＬＣ．Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ ｂｙ ｍｕｔａｎｔ ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｅ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｍｉｃｅ．Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００５；１２：３５０−３５８．

１８．Ｆｉｎｋｅ Ｊ，Ｎａｇｌｅｒ Ａ．Ｖｉｅｗｐｏｉｎｔ：Ｗｈａｔ ｉｓ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｅｒａ ｏｆ ｒｅｄｕｃｅｄ−ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ − Ｉｓ ｔｈｅｒｅ ｓｔｉｌｌ ａｎ ｕｐｐｅｒ ａｇｅ ｌｉｍｉｔ？Ａ ｆｏｃｕｓ ｏｎ ｍｙｅｌｏｉｄ ｎｅｏｐｌａｓｉａ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２００７；２１：１３５７−１３６２．

１９．Ｄａｅｎｅｎ Ｓ，Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｈｏｌｔ Ｂ，Ｄｅｋｋｅｒ ＡＷ，Ｗｉｌｌｅｍｚｅ Ｒ，Ｒｉｊｎｅｖｅｌｄ ＡＷ，Ｂｉｅｍｏｎｄ ＢＪ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｏｕｔｃｏｍｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｏｖｅｒ ｔｈｅ ａｇｅ ｏｆ ４０：Ａ ｐｈａｓｅ ＩＩ ｓｔｕｄｙ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ ｂｙ ＨＯＶＯＮ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２０１２；２６：１７２６−１７２９．

２０．Ｇｉｌｅｓ ＦＪ，Ｏ‘Ｄｗｙｅｒ Ｍ，Ｓｗｏｒｄｓ Ｒ．Ｃｌａｓｓ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２００９；２３：１６９８−１７０７．

２１．Ｈｅｈｌｍａｎｎ Ｒ．Ｈｏｗ Ｉ ｔｒｅａｔ ＣＭＬ ｂｌａｓｔ ｃｒｉｓｉｓ．Ｂｌｏｏｄ ２０１２；１２０：７３７−７４７．

Claims (75)

1. ウイルス由来粒子が細胞の表面に結合して内部移行するのに十分な数の機能的Ｇ蛋白質を表面に有するエンベロープ、
   新生ウイルス粒子のアセンブリーに必要な全タンパク質をコードする配列を有するＲＮＡポリヌクレオチド、及び、
   前記ＲＮＡポリヌクレオチドを取り囲む構造体を形成する蛋白質混合物、
   を有する非複製型ウイルス由来粒子であって、
   前記ＲＮＡポリヌクレオチドは、
   （ａ）前記細胞内で、新生ウイルス粒子のアセンブリーに必要な十分な巨大分子を産生するために、当該ＲＮＡ配列から完全なゲノムを転写できない、及び／又は、当該ＲＮＡ配列から前記全タンパク質を翻訳できないように、
   十分に架橋された構造を有している、
   及び／又は、
   （ｂ）前記細胞内で、新生ウイルス粒子のアセンブリーに必要な十分な巨大分子を産生するために、当該ＲＮＡ配列から完全なゲノムを転写できない、及び／又は、当該ＲＮＡ配列から前記全タンパク質を翻訳できないように、
   十分に不連続である、
   非複製型ウイルス由来粒子。
2. 前記Ｇ蛋白質が、
   配列番号１の配列を有する、又は、
   配列番号１の配列と少なくとも７５％同一の配列を有し、且つ、細胞表面に結合して当該粒子の内部移行を可能にすることができる、
   請求項１に記載の非複製型ウイルス由来粒子。
3. 前記ＲＮＡポリヌクレオチドを取り囲む構造体を形成する蛋白質混合物が、少なくともＮ、Ｐ、Ｍ、及びＬ蛋白質を含む、
   請求項１又は２に記載の非複製型ウイルス由来粒子。
4. 前記Ｎ蛋白質が、
   配列番号２の配列を有する、又は、
   配列番号２の配列と少なくとも８０％同一の配列を有し、且つ、前記蛋白質構造体の形成に参加することができる、
   請求項３に記載の非複製型ウイルス由来粒子。
5. 前記Ｐ蛋白質が、
   配列番号３の配列を有する、又は、
   配列番号３の配列と少なくとも８０％同一の配列を有し、且つ、前記蛋白質構造体の形成に参加することができる、
   請求項３又は４に記載の非複製型ウイルス由来粒子。
6. 前記Ｍ蛋白質が、
   配列番号４の配列を有する、又は、
   配列番号４の配列と少なくとも８０％同一の配列を有し、且つ、前記蛋白質構造体の形成に参加することができる、
   請求項３−５のいずれかに記載の非複製型ウイルス由来粒子。
7. 前記Ｌ蛋白質が、
   配列番号５の配列を有する、又は、
   配列番号５の配列と少なくとも７０％同一の配列を有し、且つ、前記蛋白質構造体の形成に参加することができる、
   請求項３−６のいずれかに記載の非複製型ウイルス由来粒子。
8. 前記ＲＮＡ配列が、細胞への結合及び該粒子の内部移行においてＮ、Ｐ、Ｍ、及びＧ蛋白質を産生し、且つ、機能的なＬ蛋白質を産生する能力を欠いている、
   請求項３−７のいずれかに記載の非複製型ウイルス由来粒子。
9. 前記ＲＮＡ配列が、細胞への結合及び該粒子の内部移行においてＮ、Ｐ、及びＭ蛋白質を産生し、且つ、機能的なＧ及びＬ蛋白質を産生する能力を欠いている、
   請求項３−７のいずれかに記載の非複製型ウイルス由来粒子。
10. 前記ＲＮＡ配列が、細胞への結合及び該粒子の内部移行においてＮ及びＰ蛋白質を産生し、且つ、機能的なＭ、Ｇ、及びＬ蛋白質を産生する能力を欠いている、
    請求項３−７のいずれかに記載の非複製型ウイルス由来粒子。
11. 前記ＲＮＡ配列が、細胞への結合及び該粒子の内部移行においてＮ蛋白質を産生し、且つ、機能的なＰ、Ｍ、Ｇ、及びＬ蛋白質を産生する能力を欠いている、
    請求項３−７のいずれかに記載の非複製型ウイルス由来粒子。
12. 前記ＲＮＡ配列が、機能的なＮ、Ｐ、Ｍ、Ｇ、及びＬ蛋白質を産生する能力を欠いている、
    請求項３−７のいずれかに記載の非複製型ウイルス由来粒子。
13. 前記エンベロープの表面に、少なくとも１粒子あたり６０の機能的Ｇ蛋白質を有する、
    請求項１−１２のいずれかに記載の非複製型ウイルス由来粒子。
14. 前記エンベロープの表面に、少なくとも１粒子あたり６００の機能的Ｇ蛋白質を有する、
    請求項１−１２のいずれかに記載の非複製型ウイルス由来粒子。
15. 前記エンベロープの表面に、少なくとも１粒子あたり１２００の機能的Ｇ蛋白質を有する、
    請求項１−１２のいずれかに記載の非複製型ウイルス由来粒子。
16. 前記架橋されたＲＮＡポリヌクレオチドが、架橋されたヌクレオチドを少なくとも０．０５％含む、
    請求項１−１５のいずれかに記載の非複製型ウイルス由来粒子。
17. 前記架橋されたＲＮＡポリヌクレオチドが、架橋されたヌクレオチドを少なくとも０．５％含む、
    請求項１−１５のいずれかに記載の非複製型ウイルス由来粒子。
18. 前記架橋されたＲＮＡポリヌクレオチドが、架橋されたヌクレオチドを少なくとも１％含む、
    請求項１−１５のいずれかに記載の非複製型ウイルス由来粒子。
19. 前記架橋されたＲＮＡポリヌクレオチドが、架橋されたヌクレオチドを少なくとも１０％含む、
    請求項１−１５のいずれかに記載の非複製型ウイルス由来粒子。
20. 前記架橋されたＲＮＡポリヌクレオチドが、架橋されたヌクレオチドを少なくとも２０％含む、
    請求項１−１５のいずれかに記載の非複製型ウイルス由来粒子。
21. 前記架橋されたＲＮＡポリヌクレオチドが、架橋されたヌクレオチドを少なくとも８０％含む、
    請求項１６−２０のいずれかに記載の非複製型ウイルス由来粒子。
22. 前記ＲＮＡ構造が、
    ＲＮＡと架橋されている、及び／又は、前記ＲＮＡポリヌクレオチドを取り囲む構造体中の蛋白質と架橋されている、
    請求項１−２１のいずれかに記載の非複製型ウイルス由来粒子。
23. 前記ＲＮＡポリヌクレオチドを取り囲む構造体が、
    当該構造体の別の蛋白質と架橋された蛋白質、
    内部架橋された蛋白質、
    前記ＲＮＡ構造と架橋された蛋白質、又は、
    これらを任意に組み合わせた蛋白質、
    を含む、請求項１−２１のいずれかに記載の非複製型ウイルス由来粒子。
24. 前記ＲＮＡポリヌクレオチドが、少なくとも２の不連続なＲＮＡポリヌクレオチドを含む、
    請求項１−１５のいずれかに記載の非複製型ウイルス由来粒子。
25. 前記ＲＮＡポリヌクレオチドが、少なくとも５の不連続なＲＮＡポリヌクレオチドを含む、
    請求項１−１５のいずれかに記載の非複製型ウイルス由来粒子。
26. 前記ＲＮＡポリヌクレオチドが、少なくとも１０の不連続なＲＮＡポリヌクレオチドを含む、
    請求項１−１５のいずれかに記載の非複製型ウイルス由来粒子。
27. 前記ＲＮＡポリヌクレオチドが、少なくとも１００の不連続なＲＮＡポリヌクレオチドを含む、
    請求項１−１５のいずれかに記載の非複製型ウイルス由来粒子。
28. 前記ＲＮＡポリヌクレオチドが、１０００以下のヌクレオチドからなる不連続なＲＮＡポリヌクレオチドを含む、
    請求項１−１５のいずれかに記載の非複製型ウイルス由来粒子。
29. 前記ＲＮＡポリヌクレオチドが、３０００以下のヌクレオチドからなる不連続なＲＮＡポリヌクレオチドを含む、
    請求項１−１５のいずれかに記載の非複製型ウイルス由来粒子。
30. 前記ＲＮＡポリヌクレオチドが、５０００以下のヌクレオチドからなる不連続なＲＮＡポリヌクレオチドを含む、
    請求項１−１５のいずれかに記載の非複製型ウイルス由来粒子。
31. 前記ＲＮＡポリヌクレオチドが、７０００以下のヌクレオチドからなる不連続なＲＮＡポリヌクレオチドを含む、
    請求項１−１５のいずれかに記載の非複製型ウイルス由来粒子。
32. 前記ＲＮＡポリヌクレオチドが、１０、０００以下のヌクレオチドからなる不連続なＲＮＡポリヌクレオチドを含む、
    請求項１−１５のいずれかに記載の非複製型ウイルス由来粒子。
33. Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｇ、又はＬ蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含むＲＮＡポリヌクレオチドを有する生ウイルスから非複製型ウイルス由来粒子を産生する方法であって、
    該方法は、
    任意で、前記生ウイルスをＵＶ吸収化合物から分離する工程、
    前記生ウイルスをＲＮＡ傷害剤に曝露して、下記（ａ）−（ｃ）のいずれかを行う工程；
    （ａ）前記ウイルス由来粒子が細胞内にある場合に、前記ＲＮＡポリヌクレオチドからｍＲＮＡへの転写が減少、及び／又は、当該ｍＲＮＡから蛋白質への翻訳が減少することで、新生ウイルスのアセンブリーに必要な十分な蛋白質の産生が阻害されるように、
    前記生ウイルスのＲＮＡ構造を十分に架橋する工程、
    （ｂ）前記ウイルス由来粒子が細胞内にある場合に、前記ＲＮＡポリヌクレオチドからｍＲＮＡへの転写が減少、及び／又は、当該ｍＲＮＡから蛋白質への翻訳が減少することで、新生ウイルスのアセンブリーに必要な十分な蛋白質の産生が阻害されるように、
    前記生ウイルスのＲＮＡ構造を不連続なＲＮＡセグメントに切断する工程、
    （ｃ）前記（ａ）及び（ｂ）工程、
    を含む、前記生ウイルスから非複製型ウイルス由来粒子を産生する方法。
34. 前記Ｇ蛋白質が、
    配列番号１の配列を有する、又は、
    配列番号１の配列と少なくとも７５％同一の配列を有し、且つ、細胞表面に結合して当該粒子の内部移行を可能にすることができる、
    請求項３３に記載の非複製型ウイルス由来粒子を産生する方法。
35. 前記Ｎ蛋白質が、
    配列番号２の配列を有する、又は、
    配列番号２の配列と少なくとも８０％同一の配列を有し、且つ、前記蛋白質構造体の形成に参加することができる、
    請求項３３又は３４に記載の非複製型ウイルス由来粒子を産生する方法。
36. 前記Ｐ蛋白質が、
    配列番号３の配列を有する、又は、
    配列番号３の配列と少なくとも８０％同一の配列を有し、且つ、前記蛋白質構造体の形成に参加することができる、
    請求項３３−３５のいずれかに記載の非複製型ウイルス由来粒子を産生する方法。
37. 前記Ｍ蛋白質が、
    配列番号４の配列を有する、又は、
    配列番号４の配列と少なくとも８０％同一の配列を有し、且つ、前記蛋白質構造体の形成に参加することができる、
    請求項３３−３６のいずれかに記載の非複製型ウイルス由来粒子を産生する方法。
38. 前記Ｌ蛋白質が、
    配列番号５の配列を有する、又は、
    配列番号５の配列と少なくとも７０％同一の配列を有し、且つ、前記蛋白質構造体の形成に参加することができる、
    請求項３３−３７のいずれかに記載の非複製型ウイルス由来粒子を産生する方法。
39. 前記生ウイルスをＲＮＡ傷害剤に曝露する工程が、前記生ウイルスを電磁放射に曝露する工程を含む、
    請求項３３−３８のいずれかに記載の非複製型ウイルス由来粒子を産生する方法。
40. 前記電磁放射が約１ｍｍより短い波長を有する、
    請求項３９に記載の非複製型ウイルス由来粒子を産生する方法。
41. 前記電磁放射が約５００ｎｍより短い波長を有する、
    請求項３９に記載の非複製型ウイルス由来粒子を産生する方法。
42. 前記電磁放射が約２８０ｎｍより短い波長を有する、
    請求項３９に記載の非複製型ウイルス由来粒子を産生する方法。
43. 前記電磁放射が約１ピコメートルと約３００ｎｍの間の波長を有する、
    請求項３９に記載の非複製型ウイルス由来粒子を産生する方法。
44. 前記電磁放射が約１００ｎｍと約４００ｎｍの間の波長を有し、且つ、
    前記生ウイルスを約１００ｍＪ／ｃｍ^２と約８，０００ｍＪ／ｃｍ^２の間の線量の電磁放射に曝露する、
    請求項３９に記載の非複製型ウイルス由来粒子を産生する方法。
45. 前記電磁放射が約１００ｎｍと約４００ｎｍの間の波長を有し、且つ、
    前記生ウイルスを約１００ｍＪ／ｃｍ^２と約１，０００ｍＪ／ｃｍ^２の間の線量の電磁放射に曝露する、
    請求項３９に記載の非複製型ウイルス由来粒子を産生する方法。
46. 前記電磁放射が約１００ｎｍと約４００ｎｍの間の波長を有し、且つ、
    前記生ウイルスを約１５０ｍＪ／ｃｍ^２と約５００ｍＪ／ｃｍ^２の間の線量の電磁放射に曝露する、
    請求項３９に記載の非複製型ウイルス由来粒子を産生する方法。
47. 前記電磁放射が約１００ｎｍと約２８０ｎｍの間の波長を有し、且つ、
    前記生ウイルスを約１５０ｍＪ／ｃｍ^２と約３００ｍＪ／ｃｍ^２の間の線量の電磁放射に曝露する、
    請求項３９に記載の非複製型ウイルス由来粒子を産生する方法。
48. 前記電磁放射がガンマ線照射であり、且つ、
    前記生ウイルスを約１ｋＧｙと約５０ｋＧｙの間の線量の電磁放射に曝露する、
    請求項３９に記載の非複製型ウイルス由来粒子を産生する方法。
49. 前記電磁放射がガンマ線照射であり、且つ、
    前記生ウイルスを約５ｋＧｙと約２０ｋＧｙの間の線量の電磁放射に曝露する、
    請求項３９に記載の非複製型ウイルス由来粒子を産生する方法。
50. 前記生ウイルスを前記ＲＮＡ傷害剤に３７℃以下で曝露する、
    請求項３３−４９のいずれかに記載の非複製型ウイルス由来粒子を産生する方法。
51. 前記生ウイルスを前記ＲＮＡ傷害剤に約２５℃で曝露する、
    請求項４４−４７のいずれかに記載の非複製型ウイルス由来粒子を産生する方法。
52. 前記生ウイルスを前記ＲＮＡ傷害剤に約−８０℃で曝露する、
    請求項４８又は４９に記載の非複製型ウイルス由来粒子を産生する方法。
53. 前記生ウイルスを前記ＲＮＡ傷害剤に曝露する工程が、前記生ウイルスをＲＮＡ傷害化学薬剤に曝露する工程を含む、
    請求項３３−３８のいずれかに記載の非複製型ウイルス由来粒子を産生する方法。
54. 前記ＲＮＡ傷害化学薬剤が、ＲＮＡ架橋能を有するアルキル化剤である、
    請求項５３に記載の非複製型ウイルス由来粒子を産生する方法。
55. 前記ＲＮＡ傷害化学薬剤が、ブスルファン、シクロホスファミド、メルファラン、ホルムアルデヒド、カルボジイミド、又はビススルホスクシンイミジルスベレートである、
    請求項５３に記載の非複製型ウイルス由来粒子を産生する方法。
56. 前記ＲＮＡ傷害化学薬剤が、ＲＮＡ切断能を有するフリーラジカル発生剤である、
    請求項５３に記載の非複製型ウイルス由来粒子を産生する方法。
57. 前記フリーラジカル発生剤が、パーオキサイド、臭化水素、過酸化アンモニウム、又はヒドロキシルラジカルである、
    請求項５６に記載の非複製型ウイルス由来粒子を産生する方法。
58. 前記生ウイルスをＵＶ吸収化合物から分離する工程が、前記生ウイルスを含む増殖培地をスクロース密度勾配中で分画する工程を含む、
    請求項３３−５７のいずれかに記載の非複製型ウイルス由来粒子を産生する方法。
59. 請求項１−３２のいずれかに記載の非複製型ウイルス由来粒子を、患者内の細胞集団に投与する工程を含む方法であって、
    前記細胞集団は癌性細胞及び非癌性細胞を含み、且つ、前記投与によって前記患者内でサイトカインの放出が誘導される方法。
60. 前記患者内で放出されるサイトカインが、
    インターロイキン、インターフェロン、炎症性サイトカイン、ＣＸＣケモカインファミリーメンバー、腫瘍壊死因子ファミリーメンバー、又はこれらのあらゆる組み合わせである、
    請求項５９に記載の方法。
61. 患者内の癌性細胞の細胞死を誘導する方法であって、
    請求項１−３２のいずれかに記載の非複製型ウイルス由来粒子を、前記患者に投与する工程を含む方法。
62. 請求項１−３２のいずれかに記載の非複製型ウイルス由来粒子を、患者内の細胞集団に投与する工程を含む方法であって、
    前記細胞集団は癌性細胞及び非癌性細胞を含み、且つ、前記投与によって前記非癌性細胞よりも前記癌性細胞に優先的に細胞死が誘導される方法。
63. 前記細胞死がアポトーシスによる細胞死である、
    請求項６１又は６２に記載の方法。
64. 前記細胞死が自然免疫エフェクター細胞及び／又は適応免疫エフェクター細胞による細胞死である、
    請求項６１、６２、又は６３に記載の方法。
65. 前記適応免疫エフェクター細胞がＴ細胞及び／又はＢ細胞である、
    請求項６４に記載の方法。
66. 前記自然免疫エフェクター細胞が、マスト細胞、食細胞、好塩基球、好酸球、ナチュラルキラー細胞、γδＴ細胞、又はこれらのあらゆる組み合わせである、
    請求項６５に記載の方法。
67. 前記食細胞が、マクロファージ、好中球、樹状細胞、又はこれらのあらゆる組み合わせである、
    請求項６６に記載の方法。
68. １Ｅ１０から１Ｅ１５の非複製型ウイルス由来粒子を前記患者に投与する工程を含む、
    請求項５９−６７のいずれかに記載の方法。
69. １Ｅ１１から１Ｅ１３の非複製型ウイルス由来粒子を前記患者に投与する工程を含む、
    請求項５９−６７のいずれかに記載の方法。
70. さらに、前記患者に化学療法剤を投与する工程を含む、
    請求項５９−６９のいずれかに記載の方法。
71. 前記化学療法剤が、ベンダムスチン、デキサメサゾン、ドキソルビン、ビンクリスチン、イダルビシン、カルフィルゾミブ、ヒドロキサミン酸サブエロイルアニド、メルファラン又はＳＭＡＣ類似物質であるＬＣＬ１６１である、
    請求項７０に記載の方法。
72. 前記化学療法剤が、ベンダムスチン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロフォスファミド、ダカルバジン、ロムスチン、メルファラン、テモゾロミド、チオテパ、オキサリプラチン、プロカルバジン、ペントスタチン、クラドリビン、クロファラビン、シタラビン、フルダラビン、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メルカプトプリン、ネララビン、フルオロウラシル、ブレオマイシン、アクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ドキソルビシンリポソーム、イダルビシン、ミトキサントロン、カペシタビン、トポテカン、イリノテカン、エトポシド、パクリタキセル、テニポシド、チオグアニン、オマセタキシン、アルトレタミン、アスパラギナーゼ、アスパラギナーゼ、ペグアスパラガーゼ、イソトレチノイン、レチノイン酸、ヒ素、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンクリスチンリポソーム、ボスチニブ、ダサチニブ、イマチニブ、ニロチニブ、スニチニブ、ベムラフェニブ、レゴラフェニブ、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、サリドマイド、レナリドミド、ポマリドミド、メトトレキサート、プララトレキサート、エベロリムス、テムシロリムス、ボリノスタット、ロミデプシン、バルプロ酸、デシタビン、アザシチジン、アナグレリド、コルチゾン、デキサメタゾン、プレドニゾン、トリアムシノロン、インターフェロンアルファ２ａ、インターフェロンアルファ２ｂ、ペグインターフェロンアルファ２ｂ、インターフェロンベータ１ｂ、アルデスロイキン／ＩＬ−２、デニロイキンジフチトクス、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ４７、抗ＣＤ３３、抗ＣＤ３８、抗ＣＤ１３８、抗ＣＳ１、抗ＣＤ５２、抗ＶＥＧＦ、抗Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、抗ＥＧＦＲ、抗ＣＴＬＡ４又は抗ＩＧＦ−１である、
    請求項７２に記載の方法。
73. 前記癌が、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、腎癌、乳癌、大腸癌又はグリオブラストーマである、
    請求項５９−７２のいずれかに記載の方法。
74. 前記癌が、肝細胞癌、前立腺癌、肺癌、中皮腫、子宮癌、子宮頸癌、膀胱癌、卵巣癌、膵臓癌、メラノーマ、基底細胞癌、メラノーマ、扁平上皮癌、食道癌、胃癌、骨肉腫、軟骨肉腫、軟部組織癌、頭部癌、頸部癌、甲状腺癌、網膜芽細胞腫又は口腔癌である、
    請求項５９−７２のいずれかに記載の方法。
75. 前記非複製型ウイルス由来粒子を、腫瘍内投与、鼻腔内投与、筋肉内投与、皮内投与、腹腔内投与、動脈内投与、静脈内投与、皮下投与、又は頭蓋内投与によって前記患者に投与する工程を含む、
    請求項５９−７４のいずれかに記載の方法。