JP2023549674A - 癌の処置用の免疫調節治療薬としての免疫細胞におけるｓｒｃ－３の標的化 - Google Patents

Abstract

【課題】Ｔ制御細胞などのＴ細胞を含む免疫細胞におけるＳＲＣ－３の標的化を含む、癌治療に関連する方法および組成物を提供する。【解決手段】本開示は、Ｔ制御細胞などのＴ細胞を含む免疫細胞におけるＳＲＣ－３の標的化を含む、癌治療に関連する方法および組成物に関する。特にＴ制御細胞におけるＳＲＣ－３のターゲティングは、哺乳類における腫瘍を根絶するのに有効である。特定の態様において、Ｔ制御細胞は、養子細胞移植に適した細胞を生産するために、生体外でＣＲＩＳＰＲに供される。ある場合には、ＳＲＣ－３を標的とする１つまたは複数の薬剤も個体に投与され、および／または投与前に細胞に曝露される。【選択図】図１

Description

本出願は、２０２０年１０月２８日に出願された米国仮出願シリアル番号６３／１０６，７７０の優先権を主張し、その全体が参照により本書に組み込まれる。
連邦政府後援の研究開発に関する声明（Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｒｅｇａｒｄｉｎｇ ｆｅｄｅｒａｌｌｙ ｓｐｏｎｓｏｒｅｄ
研究または開発

本発明は、国防総省が授与したＷ８１ＸＷＨ－１３－１－０２８５の下、および国立衛生研究所が授与したＨＤ００８１８８の下、政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明に対して一定の権利を有している。

本開示の実施形態は、少なくとも細胞生物学、分子生物学、免疫学、および癌医学を含む医学の分野に関する。

ステロイド受容体コアクチベーター－３（ＳＲＣ－３）は、乳癌（ＢＣ）の増殖、転移、および標準的な癌治療および内分泌ベースの癌治療に対する抵抗性の主要なドライバーとして機能する。癌遺伝子であるＳＲＣ－３は、癌細胞の増殖と転移に必要なプログラムを駆動する核内受容体やその他の転写因子の多面的なコアクチベーターとして働く。重要なことに、ＳＲＣ－３はまた、宿主免疫系の制御において重要な役割を果たす。

本開示は、独自の方法でＳＲＣ－３を標的とすることによって効果的な癌治療を提供するという、当該技術分野における長い間感じられた必要性に対処する。

本開示は、あらゆる種類の癌を治療する、進行を遅らせる、発症を遅らせる、または癌になるリスクを低減するためのシステム、方法、および組成物に向けられている。特定の実施形態において、本開示は、それを必要とする個体に投与される細胞が、（１）内因性ＳＲＣ－３の発現の破壊を有する；および／または（２）ＳＲＣ－３を標的とする１つまたは複数の薬剤への曝露を有する免疫細胞である養子細胞移入に関する。特定の実施形態において、免疫細胞は、ＣＤ４であるＴ制御細胞（Ｔｒｅｇ）を含む、ＣＤ４＋細胞である。

現在のＴｒｅｇ標的化免疫チェックポイント阻害剤は、主に、他の免疫細胞との細胞表面相互作用を破壊させる（ｄｉｓｒｕｐｔ）表面タンパク質（受容体）に焦点を定めている。本開示は、これと区別される。なぜなら、Ｔｒｅｇ遺伝子標的としてのＳＲＣ－３が、Ｔｒｅｇ核遺伝子発現プログラムを調節するように機能する核タンパク質であるからである。転写マスターレギュレータとしての役割の結果として、マウス遺伝子モデルにおけるＳＲＣ－３の消失が、腫瘍根絶を促進するようにＴｒｅｇ機能を調節する一方、確立された免疫チェックポイント阻害剤により高頻度で観察される通常の重篤な副作用を回避することができることが、本明細書中で示されている。特定の実施形態において、本開示は、遺伝的に修飾されたＴｒｅｇ細胞が、癌を有する個体への養子移入に用いられることを含む、免疫細胞中のＳＲＣ－３遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲベースのアプローチに関する。ゆえに、本開示は、免疫系ベースの腫瘍根絶を支援する独自の方法を提供する。

一実施形態において、ステロイド受容体コアクチベータ３（ＳＲＣ－３）の破壊を含む操作された免疫細胞が存在する。特定の実施形態において、免疫細胞は、制御性Ｔ細胞等のＴ細胞である。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、および／またはＦＯＸＰ３＋であり得る。特定の実施形態において、破壊はさらに、ＳＲＣ－３の発現レベルが低下するように遺伝的に修飾されているか、またはＳＲＣ－３の発現が本質的にない免疫細胞として定義される。特定の場合には、免疫細胞は、１つ以上のガイドＲＮＡおよびＣａｓ９酵素を用いて操作されている。免疫細胞は、個体に対して、自己由来であっても、同種異系であっても、同系であってもよい。

特定の実施形態において、（ａ）本明細書中に包含される任意の免疫細胞、および（ｂ）ＳＲＣ－３を標的とする１つ以上の剤を含む組成物が存在する。場合によっては、（ａ）および（ｂ）は、同じ製剤形態であってもよいが、異なる製剤形態である。特定の実施形態において、ＳＲＣ－３を標的とする剤は、小分子阻害剤、抗体、タンパク質、核酸、またはそれらの組合せである。ＳＲＣ－３の小分子阻害剤は、ブファリン、ゴシポール、ベルカリンＡ、ＳＩ－２、ＳＩ－１０、ＳＩ－１２、それらの機能性誘導体、またはそれらの組合せであり得る。抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよく、具体例として、５Ｅ１１、ＬＳ－Ｃ８０１９２９、ＰＡ１－８４５、ＡＸ１５．３、ＰＡ５－２９８５４、ＥＰＲ４３７４（３）、またはそれらの組合せが挙げられる。

一実施形態において、個体において癌を処置する方法であって、個体に、本明細書中に包含される任意の細胞を治療有効量で投与する工程を含む方法が存在する。癌は、ＳＲＣ－３＋癌であり得る。癌は、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、前立腺癌、胃癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌、または膵臓癌であり得る。

場合によっては、投与工程の前に、細胞は、ＳＲＣ－３を標的とする有効量の１つ以上の剤、例えば、小分子阻害剤（ブファリン、ゴシポール、ベルカリンＡ、ＳＩ－２、ＳＩ－１０、ＳＩ－１２、それらの機能性誘導体、それらの組合せ）、抗体（モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、またはｓｃＦｖ等の断片）、タンパク質、核酸、またはそれらの組合せにエクスビボで曝露される。具体的な抗体として、５Ｅ１１、ＬＳ－Ｃ８０１９２９、ＰＡ１－８４５、ＡＸ１５．３、ＰＡ５－２９８５４、ＥＰＲ４３７４（３）、またはそれらの組合せが挙げられる。場合によっては、個体は、治療有効量の追加の癌治療、例えば、外科手術、放射線、化学療法、ホルモン療法、薬物療法、タンパク質療法、免疫療法、またはそれらの組合せが施される。追加の癌治療は、ＳＲＣ－３を標的とする１つ以上の剤を含み得る。細胞および追加の癌治療は、実質的に同時に、または異なる時点にて、個体に施され得る。細胞および追加の癌治療は、同じ製剤形態であってもよいし、なくてもよい。細胞は、静脈内、腹腔内、動脈内、局所、吸入、筋肉内、胸骨内、関節内注射、または注入によって投与され得る。細胞は、１回または複数回投与され得、複数回投与される場合、投与間の期間は、１～２４時間、１～７日、１～４週、または１～１２ヶ月以内である。

一実施形態において、個体において癌を処置する方法であって、個体に、（ａ）本明細書中に包含される任意の免疫細胞、および（ｂ）ＳＲＣ－３を標的とする１つ以上の剤を含む組成物が挙げられる、治療有効量の本明細書中に包含される任意の組成物を投与する工程を含む方法が存在する。そのような場合には、（ａ）および（ｂ）は、異なる製剤形態で、かつ／または同時に、もしくは異なる時点にて個体に投与されてもよいし、されなくてもよい。異なる時点にて投与される場合、（ａ）と（ｂ）の投与間の期間は、１～２４時間、１～７日、１～４週、または１～１２ヶ月以内であり得る。組成物は、個体に１回または複数回投与され得、組成物が個体に複数回投与される場合、投与間の期間は、１～２４時間、１～７日、１～４週、または１～１２ヶ月以内である。癌はＳＲＣ－３＋であり得る。癌は、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、前立腺癌、胃癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌、または膵臓癌であり得る。特定の場合には、投与工程の前に、（ａ）の細胞は、ＳＲＣ－３を標的とする有効量の１つ以上の剤にエクスビボで曝露される。

一実施形態において、本明細書中に包含される任意の免疫細胞を生成する方法であって、免疫細胞におけるＳＲＣ－３の発現を破壊させる工程を含む方法が存在する。

免疫細胞は、Ｔｒｅｇを含むＴ細胞であり得る。特定の場合には、方法はさらに、（ａ）ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔｒｅｇをそれぞれ得て、（ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔｒｅｇをそれぞれ、Ｔ細胞またはＴｒｅｇにおける内因性ＳＲＣ－３の発現を破壊させる１つ以上の剤に曝露することと定義される。特定の実施形態において、Ｔ細胞またはＴｒｅｇは、脾臓、骨髄、血液、血漿、またはそれらの組合せから得られる。方法はさらに、ＣＤ４＋Ｔ細胞から制御性Ｔ細胞を得る工程を含み得る。特定の場合には、制御性Ｔ細胞は、ＣＤ２５＋および／またはＦｏｘ３ｐ＋である。特定の場合には、Ｔ細胞における内因性ＳＲＣ－３の発現を破壊させる１つ以上の剤は、核酸を含む。特定の態様において、Ｔ細胞における内因性ＳＲＣ－３の発現を破壊させる１つ以上の剤は、ＣＲＩＳＰＲ試薬を含む。方法はさらに、免疫細胞を、ＳＲＣ－３を標的とする有効量の１つ以上の剤にエクスビボで曝露する工程を含み得る。

上記は、以下の詳細な説明がよりよく理解され得るように、本開示の特徴および技術的利点をかなり広く概説している。特許請求の範囲の主題を形成する追加の特徴および利点を、本明細書中で以降に説明する。開示される概念および特定の実施形態は、本設計の同じ目的を実行するために他の構造を修正または設計するための基礎として容易に利用され得ることが当業者によって理解されるべきである。また、そのような等価の構成は、添付の特許請求の範囲に示される精神および範囲から逸脱しないことが当業者によって理解されるべきである。更なる目的および利点と共に、構成および操作方法の双方に関して、本明細書中で開示される設計の特徴であると考えられる新規な特徴は、添付の図面に関連して考慮される場合、以下の説明からよりよく理解されるであろう。しかしながら、各図は、例示および説明のみを目的として提供されており、本開示の制限の定義として意図されないことが明確に理解されるべきである。

次に、本開示をより完全に理解するために、以下の説明を、添付の図面と併せて参照する。

Ｓｒｃ－３遺伝子ノックアウト（ＫＯ）マウスの包括的免疫表現型タイピングが、広範なリンパ球増加症を明らかにする図である。老齢（１６～２０ヶ月）Ｓｒｃ－３ ＫＯマウス（－／－、ｎ＝６）および野生型同腹子（＋／＋、ｎ＝７）由来の末梢血の免疫表現型タイピング。ＳＲＣ－３ノックアウトマウスでは、Ｔ細胞およびＢ細胞、ならびに特定のサブタイプの有意な上昇があった。顆粒球、単球、好酸球、マクロファージ、樹状細胞、およびＮＫ細胞において、統計学的に有意な差はなかった（データは示さず）。

ＳＲＣ－３発現が高度に富化されており、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）においてＦｏｘｐ３と相関している図である。 図２Ａは、ＢｉｏＧＰＳゲノミクスプラットフォーム（１０）における選択された組織からのＮｃｏａ３（Ｓｒｃ－３）プローブ強度（２つのプローブを用いた）の代表的なプロットであり、Ｓｒｃ－３がＴ細胞系統において高度に発現されており、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）における発現が最も高いことを示している。 図２Ｂは、バッチ補正共発現データベースであるＩｍｍｕｎｏ－Ｎａｖｉｇａｔｏｒ（１２）を用いて実行したＴｒｅｇにおけるＦｏｘｐ３発現との、２９６個のＮＵＲＳＡの厳選した共調節因子の相関。Ｎｃｏａ３は、ＴｒｅｇにおけるＦｏｘｐ３発現と強く相関している。

ＳＲＣ－３が、ヒトＴｒｅｇにおけるＦＯＸＰ３発現を調節する図である。 図３Ａは、ヒトＴｒｅｇ（健常ドナー由来）におけるＳＲＣ－３のサイレンシングは、Ｔｒｅｇマーカー遺伝子および免疫チェックポイントメディエータのｍＲＮＡ発現を減少させる。ドナーＴｒｅｇに、ルシフェラーゼ（ｓｈＬｕｃ）またはＳＲＣ－３に対して向けられるｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターを感染させて、ｍＲＮＡレベルをＲＴ－ｑＰＣＲによって測定した。 図３Ｂは、ＳＲＣ－３は、ＦＯＸＰ３プロモータ機能を刺激することができる。ＳＲＣ－３は、一過性形質移入アッセイにおいてＦｏｘＰ３プロモータ駆動レポーター活性を共活性化する。２９３Ｔ細胞に、ＦｏｘＰ３プロモータルシフェラーゼレポーター（ＧＲ Ｌｅｅ ｌａｂ，Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ ２０１６，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．からの贈与）および濃度漸増ＳＲＣ－３発現プラスミドを形質移入した。

Ｆｏｘｐ３発現Ｔｒｅｇ細胞においてＳＲＣ－３が特異的に欠失している遺伝的に操作されたマウスモデルにおいて、Ｅ０７７１ ＢＣ腫瘍が根絶されている図である。 図４Ａは、Ｆｌｏｘｅｄ ＳＲＣ－３マウスを、１０世代にわたってＣ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドに戻し交配し、また、Ｃ５７ＢＬ／６ＪバックグラウンドにあるＦｏｘｐ３－ＥＧＦＰ／ＣＲＥ／ＥＲＴ２ノックインマウスと交配した。タモキシフェンによる処置は、Ｃｒｅの活性化、ならびにＳＲＣ－３遺伝子のエクソン１１および１２の切除をもたらす。 図４Ｂは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ対照マウスおよびＴｒｅｇ：ＳＲＣ－ＫＯマウスを、タモキシフェンにより５日間処置してから、もう３週後に、１×１０６個のルシフェラーゼ発現Ｅ０７７１ ＢＣ腫瘍細胞を、クリアにした乳房脂肪体中に注射した。 図４Ｃは、腫瘍体積を３２日にわたって測定した（左側）。研究終了時の腫瘍および脾臓の画像を右側に示す。

ＳＲＣ－３遺伝子のＣＲＩＳＰＲベースの標的化後のバルクＴリンパ球におけるＳＲＣ－３（ＮｃｏＡ３）ｍＲＮＡの定量化の図である。先で実行したＲＴ－ｑＰＣＲアッセイに、以下のプライマーを用いた。ＮＣｏＡ３プライマー（プローブ１０３）：左側：ＡＡＧ ＡＣＴ ＣＴＴ ＴＡＧ ＧＡＣ ＣＧＣ ＴＴＴ ＴＡＣ Ｔ（配列番号１）。右側：ＡＣＡ ＣＴＧ ＣＧＣ ＣＡＴ ＧＧＴ ＴＡＡ Ｔ（配列番号２）。ＧＡＰＤＨプライマー（プローブ５２）：左側：ＧＧＧ ＴＴＣ ＣＴＡ ＴＡＡ ＡＴＡ ＣＧＧ ＡＣＴ ＧＣ（配列番号３）。右側：ＣＣＡ ＴＴＴ ＴＧＴ ＣＴＡ ＣＧＧ ＧＡＣ ＧＡ（配列番号４）。（ＰＥ－）－非標的細胞；（ＰＥ＋）ＳＲＣ－３遺伝子標的細胞。

養子ＳＲＣ－３ ＫＯ Ｔｒｅｇマウス腫瘍モデルの実験設計の図である。

ＳＲＣ－３ ＫＯ Ｔｒｅｇ細胞の養子移入が、Ｅ０７７１腫瘍を排除する図である。 図７Ａは、ルシフェラーゼ標識乳腺癌Ｅ０７７１腫瘍細胞を、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスのクリアにした脂肪体中に移植した。この後、動物（実験群あたり２頭）に、ＳＲＣ－３ ＫＯ Ｔｒｅｇ、対照（Ｃｏｎｔ）Ｔｒｅｇ、またはＴｒｅｇなし（Ｎｏ ＡＣＴ、野生型細胞に相当）を注射して、ルシフェラーゼ腫瘍イメージングによって腫瘍増殖を監視した。ＳＲＣ－３ ＫＯ Ｔｒｅｇを受けた動物における腫瘍の排除を、矢印で示す。 図７Ｂは、腫瘍ルシフェラーゼイメージング定量化を示す。

Ｉ．定義の例
長年の特許法の慣例に従い、本明細書において、特許請求の範囲を含むｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇという単語と協調して使用される場合、「ａ」および「ａｎ」という単語は、「１つまたは複数」を表す。本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈から明らかにそうでないことが指示されない限り、複数の言及を含む。例えば、「核酸」という用語は、それらの混合物を含む複数の核酸を含む。本開示のいくつかの実施形態は、本開示の１つまたは複数の要素、方法ステップ、および／または方法から構成されるか、またはそれらから本質的に構成され得る。本明細書に記載される任意の方法または組成物が、本明細書に記載される任意の他の方法または組成物に関して実施され得、異なる実施形態が組み合わされ得ることが企図される。

本明細書全体を通して、文脈が他に要求しない限り、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、および「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」（含む、含有する）という語は、述べられたステップもしくは要素またはステップもしくは要素のグループを含むことを意味するが、他のステップもしくは要素またはステップもしくは要素のグループを排除しないことを意味すると理解されるであろう。「からなる」は、フレーズ「からなる」の後に続くものを含み、そしてそれに限定することを意味する。従って、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ」という表現は、記載された要素が必須又は必須であり、他の要素が存在しない可能性があることを示す。「本質的にからなる」とは、フレーズの後に列挙されたあらゆる要素を含むことを意味し、列挙された要素について開示で指定された活性または作用に干渉しないか寄与しない他の要素に限定される。したがって、「本質的にからなる」という表現は、列挙された要素が必須または必須であるが、他の要素は任意であり、列挙された要素の活性または作用に影響を及ぼすか否かに応じて存在してもしなくてもよいことを示す。

本明細書で使用されるように、用語「または」および「および／または」は、互いに組み合わせて、または排他的に複数の構成要素を記述するために利用される。例えば、「ｘ、ｙ、および／またはｚ」は、「ｘ」単独、「ｙ」単独、「ｚ」単独、「ｘ、ｙ、およびｚ」、「（ｘおよびｙ）またはｚ」、「ｘまたは（ｙおよびｚ）」、または「ｘまたはｙまたはｚ」を指し得る。ｘ、ｙ、またはｚが、実施形態から具体的に除外され得ることが特に企図される。

本願を通じて、用語「約」は、細胞および分子生物学の領域におけるその明白かつ通常の意味に従って使用され、値が、値を決定するために採用されるまたは方法についての誤差の標準偏差を含むことを示す。

本明細書全体を通して、「一実施形態」、「ある実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「所定の実施形態」、「追加の実施形態」、または「さらなる実施形態」またはそれらの組み合わせへの言及は、実施形態と関連して説明される特定の特徴、構造または特性が本発明の少なくとも一つの実施形態に含まれることを意味している。したがって、本明細書中の様々な場所での前述のフレーズの出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を指しているわけではない。さらに、特定の特徴、構造、または特性は、１つまたは複数の実施形態において、任意の適切な方法で組み合わせることができる。

本明細書で使用する場合、遺伝子の「破壊」または「改変」とは、改変がない場合の遺伝子産物の発現レベルと比較して、細胞内の対象遺伝子によってコードされる１つまたは複数の遺伝子産物の発現が排除または減少することをいう。例示的な遺伝子産物には、遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ及びタンパク質産物が含まれる。ある場合の改変は一過性又は可逆的であり、他の場合の改変は永続的である。いくつかの場合における改変は、切断されたまたは非機能的な産物が生成される可能性があるという事実にもかかわらず、機能的または完全長のタンパク質またはｍＲＮＡのものである。本明細書のいくつかの実施形態では、発現とは対照的に、遺伝子の活性又は機能が破壊される。遺伝子の破壊または改変は、一般に、人工的な方法、すなわち、化合物、分子、複合体、または組成物の添加または導入によって、および／またはＤＮＡレベルなど、遺伝子の核酸の改変または遺伝子に関連する核酸の改変によって誘導する。遺伝子改変のための例示的な方法には、遺伝子サイレンシング、ノックダウン、ノックアウト、および／または遺伝子編集のような遺伝子改変技術が含まれる。例としては、一般に発現の一過性の減少をもたらすＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、および／またはリボザイムなどのアンチセンス技術、ならびに、例えば、切断および／または相同組換えの誘導による、標的遺伝子の不活性化または改変をもたらす遺伝子編集技術などが挙げられる。例としては、挿入、変異、および／または欠失が挙げられる。破壊または改変は、典型的には、遺伝子によってコードされる正常または「野生型」産物の発現の抑制および／または完全な不在をもたらす。このような遺伝子の破壊または変化の例示は、遺伝子全体の欠失を含む、遺伝子または遺伝子の一部の挿入、フレームシフトおよびミスセンス変異、欠失、ノックイン、およびノックアウトである。このような改変は、コード領域、例えば、１つまたは複数のエキソンにおいて起こり得、その結果、停止コドンの挿入などにより、完全長生成物、機能的生成物、または任意の生成物を生成することができなくなる。このような改変は、遺伝子の転写を妨げるように、プロモーターまたはエンハンサーまたは転写の活性化に影響を与える他の領域の改変によっても起こり得る。遺伝子の破壊または改変には、相同組換えによる標的化遺伝子の不活性化を含む、遺伝子ターゲティングが含まれる。

本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体」は、任意のおよびすべての水性溶媒（例えば、水、アルコール／水溶液、生理食塩水、非経口ビヒクル、例えば塩化ナトリウム、リンガーデキストロースなど）、非水性溶媒（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、及び注射用有機エステル、例えばエチルオレート）、分散媒体、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（例えば、抗菌剤または抗真菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガス）、等張剤、吸収遅延剤、塩、薬剤、薬剤安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、色素、液体および栄養補充剤、このような材料およびその組み合わせであり、当業者に知られているであろうものである。医薬組成物中の様々な成分のｐＨおよび正確な濃度は、周知のパラメータに従って調整される。

本明細書で使用される「被験体」という用語は、一般に、治療を必要とする個体を指す。対象は、哺乳類、例えば、ヒト、実験動物（例えば、霊長類、ラット、マウス、ウサギ）、家畜（例えば、牛、羊、ヤギ、豚、七面鳥、鶏）、家庭用ペット（例えば、犬、猫、ネズミ）、馬、およびトランスジェニック非ヒト動物などの方法または物質の対象となる任意の動物対象であり得る。対象は、患者であり得、例えば、１つまたは複数の癌などの疾患（医学的状態と呼ばれ得る）を有するか、または有する疑いのあるものである。対象は、がん治療を受けているか、または受けたことがある場合がある。用語「個体」は、少なくともいくつかの実施形態において、交換可能に使用され得る。本明細書で使用される「対象」または「個人」は、医療施設に収容されていてもいなくてもよく、医療施設の外来患者として治療されてもよい。個人は、インターネットを介して１つまたは複数の医療用組成物を受け取っていてもよい。個体は、ヒトまたは非ヒト動物の任意の年齢を含んでよく、したがって、成人および幼年（例えば、子供）および幼児の両方を含み、子宮内の個体を含む。個体は、任意の性別または人種もしくは民族のものであってよい。

疾患または状態の「治療」または処置とは、癌を含む疾患の徴候または症状を緩和する努力において、患者に１つまたは複数の薬剤を投与することを含み得るプロトコルを実行することを指す。治療の望ましい効果としては、疾患の進行速度の低下、疾患状態の改善または緩和、寛解または予後の改善などが挙げられる。緩和は、疾患または状態の徴候または症状が現れる前に起こるだけでなく、それらの出現後にも起こり得る。したがって、「治療する」または「処置」は、疾患または望ましくない状態の「予防する」または「防止する」ことを含み得る。さらに、「治療する」又は「処置」は、徴候又は症状の完全な軽減を必要とせず、治癒を必要とせず、特に、患者にわずかな効果しか及ぼさないプロトコルを含む。

本願を通じて使用される「治療上の利益」又は「治療上有効な」という用語は、この状態の医学的治療に関して被験者の健康を促進又は増強するものを指す。これには、疾患の徴候または症状の頻度または重症度の低減が含まれるが、これらに限定されない。例えば、癌の治療は、腫瘍の大きさの減少、腫瘍の浸潤性の減少、癌の成長速度の減少、転移の防止、または転移の発症の遅延を含むことができる。また、癌の治療とは、癌を有する被験者の生存期間を延長することを指す場合もある。
ＩＩ．本開示の実施形態

本開示は、処置された個体に対する重篤な影響を回避する癌治療が挙げられる、効果的な癌治療のための方法および組成物に関する。特定の実施形態において、治療は、エクスビボ様式が挙げられる免疫細胞の修飾、および癌を有する個体への修飾免疫細胞の投与を含む。特定の実施形態における免疫細胞は、Ｔｒｅｇ等の特定のタイプのＴ細胞であり、その修飾は、Ｔｒｅｇの標準的な機能が悪影響を受けないようなものである。

本開示の特定の実施形態は、少なくともＴｒｅｇが挙げられる免疫細胞における重要な標的としてのＳＲＣ－３を包含する。Ｔｒｅｇに関して、特定の区画特異的破壊は、本明細書中に示すように、少なくとも乳癌同系腫瘍モデルにおいて、腫瘍根絶をもたらす。ＴｒｅｇにおいてＳＲＣ－３を破壊させる本戦略を、他の免疫チェックポイント阻害剤と区別する重要な差異は、ＳＲＣ３が核タンパク質であり、本開示における修飾が、他の場合には重篤な副作用をもたらし得る、Ｔｒｅｇに関する全ての活性を失うことなく、Ｔｒｅｇの機能を調節することである。さらに、本開示は、ＣＲＩＳＰＲベースの遺伝子標的化を用いて、Ｔ細胞においてエクスビボでＳＲＣ３を特異的に消失させるアプローチを確立する。ヒトＣＤ４＋リンパ球に応用される特定の実施形態において、例えば、本開示は、癌の処置用の養子Ｔ細胞／Ｔｒｅｇベースの治療薬についての方法を提供する。
ＩＩＩ．免疫細胞

本開示において、免疫細胞は、内因性ＳＲＣ－３の発現を破壊させるように修飾されており、これによりその後、細胞は、細胞のレシピエント個体における癌の処置に有効となり得る。免疫細胞は、あらゆる種類のものであり得るが、特定の実施形態において、少なくともＴｒｅｇおよびＢ細胞が挙げられるあらゆる種類のＴ細胞である。

本開示の実施形態は、Ｔｒｅｇが挙げられるＴ細胞の修飾を含み、修飾により、Ｔ細胞は依然として、その所望の機能を実行し得る（Ｔｒｅｇの場合、自己および外来粒子（抗原）に対する免疫応答を制御し得る）。したがって、本明細書中に包含される方法および組成物は、修飾された制御性Ｔ細胞が挙げられる修飾されたＴ細胞による他の治療と比較して、毒性のリスクが低い癌治療を提供する。

あらゆるタイプのＴ細胞が、本開示の方法および組成物に利用され得る。用語「Ｔ細胞」は、Ｔリンパ球を指し、以下に限定されないが、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、γ：δ＋Ｔ細胞、またはＮＫＴ細胞が挙げられる。ＣＤ４＋Ｔ細胞として、ＴＨ０、ＴＨ１、およびＴＨ２細胞、ならびに制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）が挙げられる。少なくとも３つのタイプの制御性Ｔ細胞：ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ、ＣＤ２５ ＴＨ３ Ｔｒｅｇ、およびＣＤ２５ ＴＲ１ Ｔｒｅｇが存在する。「細胞傷害性Ｔ細胞」は、別の細胞を死滅させることができるＴ細胞を指す。細胞傷害性Ｔ細胞の大部分は、ＣＤ８＋ＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔ細胞である。しかしながら、いくつかの細胞傷害性Ｔ細胞はＣＤ４＋である。特定の実施形態において、本開示のＴ細胞はＣＤ４＋である。

本明細書中で利用されるあらゆるＴ細胞が、１つ以上の特異的マーカーについて選択され得、かつ／または１つ以上の特異的マーカーに対して選択され得る。あらゆる選択工程は、正の選択もしくは負の選択、または双方によって行われ得る。特定の実施形態において、Ｔｒｅｇは、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、および／またはＦＯＸＰ３＋である。特定の場合には、Ｔｒｅｇは、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、およびＦＯＸＰ３＋である。一部の実施形態において、Ｔｒｅｇは、ＣＴＬ関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）＋、Ｃ－Ｃケモカイン受容体７型（ＣＣＲ７）＋、および／またはＣＤ６２抗原リガンド（ＣＤ６２Ｌ）＋である。また、本明細書中に含まれるのは、ＳＲＣ－３遺伝子の破壊により、その後、ＦＯＸＰ３、ＣＤ２５、および／またはＣＤ４＋の発現を中断するＴｒｅｇである。

一部の実施形態において、ＣＤ４＋Ｔ細胞が挙げられるＣＤ４＋免疫細胞は、本開示の方法および組成物により標的とされて、ＳＲＣ－３の発現を破壊させ、少なくとも場合によっては、Ｔｒｅｇがそこからさらに選択されて、治療用細胞として用いられ得る。他の場合には、種々のＣＤ４＋細胞が修飾されて、Ｔｒｅｇを単離する更なる工程なしに、治療用細胞としてまとめて用いられる。

Ｔ細胞が利用される場合には、Ｔ細胞の供給源は、脾臓、骨髄、血液、血漿、またはそれらの組合せが挙げられる適切なあらゆる供給源であり得る。場合によっては、Ｔ細胞は商業的に得られる。いずれの場合も、Ｔ細胞は、レシピエント個体に対して自家由来であってよく、またはレシピエント個体に対して同種異系もしくは同系であってよい。Ｔ細胞は、ＳＲＣ－３を破壊させるように細胞を操作する工程の前にマニピュレートされてよい。場合によっては、細胞は、例えば不所望の成分を除去するように、供給源からプロセシングされる。細胞は、使用前に、個体においてその活性を増強する１つ以上の組成物、例えばＳＲＣ－３を標的とする１つ以上の剤、または他の組成物、例えば１つ以上のサイトカインおよび／もしくは１つ以上の成長因子に曝露されてよい。細胞は、修飾工程の前、間、かつ／または後に、ＳＲＣ－３を標的とする１つ以上の剤に曝露されて、ＳＲＣ－３の発現を破壊させ得る。
ＩＶ．遺伝子発現の修飾

特定の実施形態において、本開示の免疫細胞は、ＳＲＣ－３の発現が変更するように修飾されており、細胞のそのような操作は、適切なあらゆる方法によって行われ得る。操作された細胞は、細胞における内因性ＳＲＣ－３の発現を欠くか、または発現が低下するように遺伝的に修飾されている。発現の低下は、当該技術において標準的な方法によって検出できないレベルにまでなり得る。

一部の実施形態において、変更された遺伝子発現は、遺伝子内の破壊、例えばノックアウト、挿入、ミスセンス、もしくはフレームシフト変異、例えば二対立遺伝子フレームシフト変異、遺伝子の全てもしくは一部、例えば１つ以上のエクソンもしくはその部分の欠失、および／またはノックインを達成することによって実行される。例えば、変更された遺伝子発現は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）および転写活性化因子様エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）等のＤＮＡ結合標的ヌクレアーゼ、ならびにＳＲＣ－３遺伝子またはその一部の配列を標的とするように特異的に設計されたＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（Ｃａｓ）等のＲＮＡガイド型ヌクレアーゼが挙げられる、配列特異的または標的ヌクレアーゼによって達成することができる。

一部の実施形態において、遺伝子の発現、活性、および／または機能の変更は、遺伝子を破壊させることによって実行される。一部の態様において、遺伝子は、その発現が、遺伝子修飾の不在下での、または修飾を達成するように導入された成分の不在下での発現と比較して、少なくとも、または約２０、３０、または４０％、一般に少なくとも、または約５０、６０、７０、８０、９０、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて低下するように修飾される。

一部の実施形態において、変更は、遺伝子の発現が後の時点にて回復するように、一過性または可逆的である。他の実施形態において、変更は、可逆的でも一過性でもなく、例えば永続的である。

一部の実施形態において、遺伝子変更は、ＳＲＣ－３遺伝子における１つ以上の二本鎖切断および／または１つ以上の一本鎖切断の誘導によって、典型的には標的とされて実行される。一部の実施形態において、二本鎖または一本鎖の切断は、ヌクレアーゼ、例えばエンドヌクレアーゼ、例えば遺伝子標的ヌクレアーゼによってなされる。一部の態様において、切断は、遺伝子のコード領域、例えばＳＲＣ－３エクソン内に誘導される。例えば、一部の実施形態において、誘導は、ＳＲＣ－３コード領域のＮ末端部分の近くで、例えば、第１のエクソン内、第２のエクソン内、または後続のエクソン内で起こる。

一部の態様において、二本鎖または一本鎖の切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換え修復（ＨＤＲ）等の細胞修復プロセスを介して修復を受ける。一部の態様において、修復プロセスは、エラーを起こしやすく、フレームシフト変異、例えば二対立遺伝子フレームシフト変異等の遺伝子の破壊をもたらし、これがＳＲＣ－３遺伝子の完全ノックアウトをもたらし得る。例えば、一部の態様において、破壊は、欠失、変異、および／または挿入を誘導することを含む。一部の実施形態において、破壊は、早期終止コドンの存在をもたらす。一部の態様において、挿入、欠失、転座、フレームシフト変異、および／または未熟終止コドンの存在は、遺伝子の発現、活性、および／または機能の破壊をもたらす。

ＳＲＣ－３の発現を破壊させるあらゆる剤が、Ｔｒｅｇが挙げられるあらゆる種類のＴ細胞が挙げられる免疫細胞等のレシピエント細胞に、適切なあらゆる様式で送達され得る。特定の実施形態において、剤は、あらゆる種類のヌクレオフェクション、リポフェクチン、あらゆる種類のエレクトロポレーション、カチオン性ポリマー、非ウイルスベクター（プラスミド等）、ウイルスベクター（アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクターが挙げられる）、シクロアミロースベースの担体、あらゆる種類のナノ粒子（ＰＬＧＡ／ＰＬＡまたはＤＯＤＡＰベースを用いて生成される金属ナノ粒子、無機ナノ粒子、またはポリマーナノ粒子が挙げられる）、リポポリプレックス等によって送達され得る。

一部の実施形態において、遺伝子変更は、アンチセンス技術を用いて、例えば遺伝子の発現を選択的に抑制（ｓｕｐｐｒｅｓｓ，ｒｅｐｒｅｓｓ）するのに用いられるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピン（ｓｈＲＮＡ）、および／またはリボザイムによって達成される。ｓｉＲＮＡ技術は、遺伝子から転写されるｍＲＮＡのヌクレオチド配列と相同な配列、およびヌクレオチド配列と相補的な配列を有する二本鎖ＲＮＡ分子を使用するＲＮＡｉである。ｓｉＲＮＡは、一般に、遺伝子から転写されるｍＲＮＡの１つの領域と相同／相補的であるか、または異なる領域と相同／相補的である複数のＲＮＡ分子を含むｓｉＲＮＡであり得る。一部の態様において、ｓｉＲＮＡは、ポリシストロニック構築体に含まれる。

ＳＲＣ－３の発現を破壊させるように細胞を修飾するための例は、以下の通りである。
Ａ．ＺＦＰおよびＺＦＮ

一部の実施形態において、ＳＲＣ－３を標的とするＤＮＡ標的化分子として、エンドヌクレアーゼ等のエフェクタタンパク質に融合された、１つ以上のジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）または転写アクチベータ様タンパク質（ＴＡＬ）等のＤＮＡ結合タンパク質が挙げられる。例として、ＺＦＮ、ＴＡＬＥ、およびＴＡＬＥＮが挙げられる。

一部の実施形態において、ＤＮＡ標的化分子は、配列特異的にＤＮＡに結合する１つ以上のジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）またはそのドメインを含む。ＺＦＰまたはそのドメインは、構造が亜鉛イオンの配位によって安定する結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である１つ以上のジンクフィンガーを介して配列特異的にＤＮＡに結合するより大きなタンパク質内のタンパク質またはドメインである。用語ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質は、多くの場合、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略される。ＺＦＰの中には、個々のフィンガーのアセンブリによって生成される、典型的には９～１８ヌクレオチド長の特定のＤＮＡ配列を標的とする人工ＺＦＰドメインがある。

ＺＦＰとして、単一フィンガードメインが約３０アミノ酸長であり、そして亜鉛を介して単一ベータターンの２つのシステインと配位した２つの不変ヒスチジン残基を含有し、かつ２、３、４、５、または６本のフィンガーを有するアルファヘリックスを含有するものが挙げられる。一般に、ＺＦＰの配列特異性は、ジンクフィンガー認識ヘリックス上の４つのヘリックス位置（－１、２、３、および６）にてアミノ酸置換を行うことによって変更され得る。ゆえに、一部の実施形態において、ＺＦＰまたはＺＦＰ含有分子は、天然に存在しない、例えば、選択された標的部位に結合するように操作されている。

一部の実施形態において、ＤＮＡ標的化分子は、ＤＮＡ切断ドメインに融合されてジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を形成するジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインであるか、またはこれを含む。一部の実施形態において、融合タンパク質は、少なくとも１つのｌｉＳ型制限酵素由来の切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）および１つ以上のジンクフィンガー結合ドメインを含み、これらは操作されていても、されていなくてもよい。一部の実施形態において、切断ドメインは、ｌｉＳ型制限エンドヌクレアーゼＦｏｋ Ｉに由来する。Ｆｏｋ Ｉは、一般に、ＤＮＡの二本鎖切断を、一方の鎖上の認識部位から９ヌクレオチド、そして他方の鎖上の認識部位から１３ヌクレオチドにて触媒する。

操作された多くの遺伝子特異的ジンクフィンガーが市販されている。例えば、Ｓａｎｇａｍｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）と共同で、ジンクフィンガー構築用のプラットフォーム（ＣｏｍｐｏＺｒ）を開発しており（これにより研究者らは、ジンクフィンガーの構築および検証を全体として回避することが可能となる）、そして数千のタンパク質用の特異的標的ジンクフィンガーを提供している（Ｇａｊ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３１（７），３９７－４０５）。一部の実施形態において、市販のジンクフィンガーが用いられるか、またはカスタム設計される（例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号ＣＳＴＺＦＮＤ、ＣＳＴＺＦＮ、ＣＴｉｌ－ｌＫＴ、およびＰＺＤ００２０参照）。
Ｂ．ＴＡＬ、ＴＡＬＥ、およびＴＡＬＥＮ

一部の実施形態において、ＳＲＣ－３に対するＤＮＡ標的化分子は、例えば転写アクチベータ様タンパク質エフェクタ（ＴＡＬＥ）タンパク質内に、天然に存在するか、または操作された（天然に存在しない）転写アクチベータ様タンパク質（ＴＡＬ）ＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、米国特許出願公開第２０１１／０３０１０７３号明細書（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）参照。

ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインまたはＴＡＬＥは、１つ以上のＴＡＬＥ反復ドメイン／単位を含むポリペプチドである。反復ドメインは、ＴＡＬＥの、その同族標的ＤＮＡ配列への結合に関与する。単一の「反復単位」（「反復」とも称される）は、典型的には３３～３５アミノ酸長であり、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥ反復配列と少なくともいくらかの配列相同性を示す。各ＴＡＬＥ反復単位は、典型的には反復の位置１２および／または１３にて、反復可変二残基（ＲＶＤ）を構成する１つまたは２つのＤＮＡ結合残基を含む。これらのＴＡＬＥのＤＮＡ認識用の天然の（カノニカル）コードは、位置１２および１３でのＨＤ配列がシトシン（Ｃ）への結合に至って、ＮＧがＴに結合し、ＮＩがＡに結合し、ＮＮがＧまたはＡに結合し、ＮＯがＴに結合するように決定されており、そしてまた、非カノニカル（非定型）ＲＶＤも知られている。一部の実施形態において、ＴＡＬＥは、標的ＤＮＡ配列に対する特異性を有するＴＡＬアレイの設計によって、あらゆる遺伝子に標的化され得る。標的配列は、一般に、チミジンで始まる。

一部の実施形態において、分子は、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）等のＤＮＡ結合エンドヌクレアーゼである。一部の態様において、ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬＥ由来のＤＮＡ結合ドメイン、および核酸標的配列を切断するためのヌクレアーゼ触媒ドメインを含む融合タンパク質である。

一部の実施形態において、ＴＡＬＥＮは、遺伝子内の標的配列を認識かつ切断する。一部の態様において、ＤＮＡの切断は、二本鎖切断をもたらす。一部の態様において、切断は、相同組換えまたは非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の速度を刺激する。一般に、ＮＨＥＪは、切断部位にてＤＮＡ配列に変化をもたらすことが多い不完全な修復プロセスである。一部の態様において、修復機構は、直接再ライゲーションまたはいわゆるマイクロホモロジー媒介性末端結合を介した、２つのＤＮＡ末端の残りのものの再結合を含む。一部の実施形態において、ＮＨＥＪを介した修復は、小さな挿入または欠失をもたらし、遺伝子を破壊させることによって抑制するのに用いることができる。一部の実施形態において、修飾は、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、欠失、または付加であり得る。一部の態様において、切断誘導変異誘発事象、すなわちＮＨＥＪ事象に続く変異誘発事象が発生した細胞は、当該技術において周知の方法によって特定かつ／または選択することができる。

一部の実施形態において、ＴＡＬＥ反復は、遺伝子を特異的に標的とするようにアセンブルされる（Ｇａｊ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。１８，７４０個のヒトタンパク質コード遺伝子を標的とするＴＡＬＥＮのライブラリが構築されている（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。カスタム設計されたＴＡＬＥアレイは、Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）、Ｔｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＫＹ，ＵＳＡ）、およびＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）から市販されている。具体的には、ＣＤ３８を標的とするＴＡＬＥＮが市販されている（Ｇｅｎｃｏｐｏｅｉａ、カタログ番号ＨＴＮ２２２８７０－１、ＨＴＮ２２２８７０－２、およびＨＴＮ２２２８７０－３参照）。例示的な分子が、例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１２０６２２号明細書および米国特許出願公開第２０１３／０３１５８８４号明細書に記載されている。

一部の実施形態において、ＴＡＬＥＮは、１つ以上のプラスミドベクターによってコードされるトランス遺伝子として導入される。一部の態様において、プラスミドベクターは、前記ベクターを受けた細胞の特定および／または選択を実現する選択マーカーを含有し得る。

いくつかの実施形態において、ＳＲＣ－３遺伝子編集は、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）を介した変更など、１つ以上のＤＮＡ結合核酸を用いて行われる。例えば、その変更は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）およびＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質を用いて行われ得る。一般に、「ＣＲＩＳＰＲシステム」とは、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子（Ｃａｓ遺伝子をコードする配列を含む）、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性な部分的ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒメイト配列（内在性のＣＲＩＳＰＲシステムの文脈では「直列反復配列」、およびｔｒａｃｒＲＮＡによってプロセシングされた部分的な直列反復配列を包含する）、ガイド配列（内在性のＣＲＩＳＰＲシステムの文脈では「スペーサー」とも称される）、ならびに／またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座由来の他の配列および転写物の発現に関与するかまたはその活性を指示する転写物および他のエレメントのことを総称する。

ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムは、ＤＮＡに配列特異的に結合する非コードＲＮＡ分子（ガイド）ＲＮＡ、およびヌクレアーゼ機能（例えば、２つのヌクレアーゼドメイン）を有するＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）を含み得る。ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上のエレメントが、Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムに由来し得、例えば、内在性のＣＲＩＳＰＲシステムを含む特定の生物（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来し得る。

いくつかの態様において、ＣａｓヌクレアーゼおよびｇＲＮＡ（標的配列に特異的なｃｒＲＮＡと既定のｔｒａｃｒＲＮＡとの融合物を含む）が、細胞に導入される。一般に、ｇＲＮＡの５’末端における標的部位が、相補的な塩基対形成によって、Ｃａｓヌクレアーゼをその標的部位、例えば、遺伝子に標的化する。標的部位は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列（例えば、通常、ＮＧＧまたはＮＡＧ）のすぐ５’の位置に基づいて選択され得る。この点において、ｇＲＮＡは、標的ＤＮＡ配列に対応するようにガイドＲＮＡの最初の２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１４、１２、１１または１０ヌクレオチドを改変することによって、所望の配列に標的化される。一般に、ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的配列の部位においてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメントを特徴とする。通常、「標的配列」とは、一般に、ガイド配列が相補性を有するようにデザインされる配列のことを指し、標的配列とガイド配列とのハイブリダイゼーションが、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。ハイブリダイゼーションを引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性があれば、完全な相補性は必ずしも必要ない。

ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＳＲＣ－３の標的部位における二本鎖切断（ＤＳＢ）に続いて、本明細書中で論じられるような破壊または変更を誘導し得る。他の実施形態では、「ニッカーゼ」とみなされるＣａｓ９バリアントが、標的部位において一本鎖にニックを入れるために使用される。例えば特異性を改善するために、対のニッカーゼを使用することができ、そのニッカーゼの各々は、配列を標的化する異なるｇＲＮＡの対によって導かれ、ニックが同時に導入されると、５’オーバーハングが導入される。他の実施形態では、遺伝子発現に影響するように、触媒的に不活性なＣａｓ９が、転写抑制因子または転写活性化因子などの異種エフェクタードメインに融合される。

ＳＲＣ－３の標的配列は、ＤＮＡポリヌクレオチドまたはＲＮＡポリヌクレオチドなどの任意のポリヌクレオチドを含み得る。標的配列は、細胞のオルガネラ内など、細胞の核または細胞質に位置し得る。一般に、標的配列を含む標的化される遺伝子座への組換えのために使用され得る配列または鋳型は、「編集鋳型」または「編集ポリヌクレオチド」または「編集配列」と称される。いくつかの態様では、外来性の鋳型ポリヌクレオチドが、編集鋳型と称されることがある。いくつかの態様において、組換えは、相同組換えである。

通常、内在性のＣＲＩＳＰＲシステムの文脈では、ＣＲＩＳＰＲ複合体（標的配列にハイブリダイズして１つ以上のＣａｓタンパク質と複合体化するガイド配列を含む）の形成によって、標的配列においてまたは標的配列の近くで（例えば、標的配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０塩基対以内またはそれ以上以内において）一方または両方の鎖の切断が生じる。野生型ｔｒａｃｒ配列の全部もしくは一部（例えば、野生型ｔｒａｃｒ配列の約２０ヌクレオチド、約２６ヌクレオチド、約３２ヌクレオチド、約４５ヌクレオチド、約４８ヌクレオチド、約５４ヌクレオチド、約６３ヌクレオチド、約６７ヌクレオチド、約８５ヌクレオチドもしくはそれ以上または約２０ヌクレオチド超、約２６ヌクレオチド超、約３２ヌクレオチド超、約４５ヌクレオチド超、約４８ヌクレオチド超、約５４ヌクレオチド超、約６３ヌクレオチド超、約６７ヌクレオチド超、約８５ヌクレオチド超もしくはそれ以上）を含み得るかまたはそれらからなり得るｔｒａｃｒ配列も、ガイド配列に作動可能に連結されたｔｒａｃｒメイト配列の全部または一部へのｔｒａｃｒ配列の少なくとも一部に沿ったハイブリダイゼーションなどによって、ＣＲＩＳＰＲ複合体の一部を形成し得る。ｔｒａｃｒ配列は、ハイブリダイズしてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成に参加する、ｔｒａｃｒメイト配列に対して十分な相補性（例えば、最適にアラインメントされたとき、ｔｒａｃｒメイト配列の長さに沿って少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の配列相補性）を有する。

ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上のエレメントの発現によって、１つ以上の標的部位においてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成が指示されるように、そのＣＲＩＳＰＲシステムのそれらのエレメントの発現を駆動する１つ以上のベクターが細胞に導入され得る。また、構成要素がタンパク質および／またはＲＮＡとして細胞に送達され得る。例えば、Ｃａｓ酵素、ｔｒａｃｒメイト配列に連結されたガイド配列、およびｔｒａｃｒ配列がそれぞれ、別個のベクター上の別個の調節エレメントに作動可能に連結され得る。あるいは、同じまたは異なる調節エレメントから発現されるエレメントの２つ以上が、単一ベクターにおいて組み合わされ得、１つ以上のさらなるベクターが、第１のベクターに含まれていないＣＲＩＳＰＲシステムの任意の構成要素を提供する。そのベクターは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列などの１つ以上の挿入部位（「クローニング部位」とも称される）を含み得る。いくつかの実施形態において、１つ以上の挿入部位が、１つ以上のベクターの１つ以上の配列エレメントの上流および／または下流に配置される。複数の異なるガイド配列が使用されるとき、細胞内の異なる複数の対応する標的配列に対してＣＲＩＳＰＲ活性を標的化するために単一の発現構築物が使用され得る。

ベクターは、Ｃａｓタンパク質などのＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に連結された調節エレメントを含み得る。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆｌ、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらのホモログまたはそれらの改変バージョンが挙げられる。これらの酵素は公知であり；例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、アクセッション番号Ｑ９９ＺＷ２としてＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースに見られ得る。

ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ由来のもの）であり得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列内および／または標的配列の相補鎖内などの標的配列の位置での一方または両方の鎖の切断を指示し得る。ベクターは、対応する野生型酵素と比べて変異したＣＲＩＳＰＲ酵素をコードし得、変異したＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列を含む標的ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖を切断する能力を欠く。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメインにおけるアスパラギン酸からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）は、Ｃａｓ９を、両方の鎖を切断するヌクレアーゼからニッカーゼ（一本鎖を切断する）に変換する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ガイド配列、例えば、そのＤＮＡ標的のセンス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれ標的化する２つのガイド配列と組み合わせて使用され得る。この組み合わせは、両方の鎖にニックを入れること、およびＮＨＥＪまたはＨＤＲを誘導するために使用されることができる。

いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列は、真核細胞などの特定の細胞における発現に向けてコドンが最適化される。真核細胞は、特定の生物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌまたは非ヒト霊長類を含むがこれらに限定されない哺乳動物）の細胞またはそれらの生物に由来する細胞であり得る。一般に、コドンの最適化とは、天然のアミノ酸配列を維持しつつ、天然の配列の少なくとも１つのコドンをその宿主細胞の遺伝子においてより高頻度にまたは最も高頻度に使用されるコドンで置き換えることによって、目的の宿主細胞において発現が高まるように核酸配列を改変するプロセスのことを指す。様々な種が、特定のアミノ酸のある特定のコドンについて特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間でのコドン使用頻度の差異）は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関することが多く、その翻訳効率は、とりわけ、翻訳されるコドンの特性および特定の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられている。選択されるｔＲＮＡが細胞内で優勢であることは、通常、ペプチド合成において最も高頻度に使用されるコドンであることを反映する。したがって、コドン最適化に基づいて、遺伝子を所与の生物における最適な遺伝子発現に適応させることができる。

一般に、ガイド配列は、標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズするのに十分およびその標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指示するのに十分な相補性をその標的配列に対して有する任意のポリヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態において、ガイド配列と対応する標的配列との相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを用いて最適にアラインメントしたとき、約５０％、約６０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９９％もしくはそれ以上、または約５０％超、約６０％超、約７５％超、約８０％超、約８５％超、約９０％超、約９５％超、約９７．５％超、約９９％超もしくはそれ以上である。

最適なアラインメントは、配列をアラインメントするための任意の好適なアルゴリズムを使用して決定され得る。そのアルゴリズムの非限定的な例としては、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍに基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎにおいて利用可能）およびＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔにおいて利用可能）が挙げられる。

ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上の異種タンパク質ドメインを含む融合タンパク質の一部であり得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素融合タンパク質は、任意のさらなるタンパク質配列、および必要に応じて任意の２つのドメインの間にリンカー配列を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素に融合され得るタンパク質ドメインの例としては、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、ならびに以下の活性：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性および核酸結合活性のうちの１つ以上を有するタンパク質ドメインが挙げられるがこれらに限定されない。エピトープタグの非限定的な例としては、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ－Ｇタグおよびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが挙げられる。レポーター遺伝子の例としては、グルタチオン－５－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）ベータガラクトシダーゼ、ベータ－グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む自己蛍光タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ分子に結合するかまたは他の細胞分子（マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ－タグ、Ｌｅｘ Ａ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合物、ＧＡＬ４Ａ ＤＮＡ結合ドメイン融合物および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合物を含むがこれらに限定されない）に結合するタンパク質またはタンパク質のフラグメントをコードする遺伝子配列に融合され得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素を含む融合タンパク質の一部を形成し得るさらなるドメインは、参照により本明細書中に援用される米国特許出願公開第２０１１００５９５０２号に記載されている。
Ｖ．使用方法

一部の実施形態において、本開示は、有効量の本開示のＳＲＣ－３破壊免疫細胞を投与することを含む、免疫療法を使用する癌処置方法を提供する。一実施形態において、個体に有効量のＳＲＣ－３破壊細胞療法を施すことによって、個体において癌を処置する、癌の進行を遅延させる、癌の発症を遅延させる、または癌になるリスクを低下させる方法が、本明細書中に包含される。本方法は、固形癌または血液癌の処置に使用され得る。特定の実施形態において、癌はＳＲＣ－３陽性である。癌は、原発性、転移性、治療抵抗性等であり得る。癌は、あらゆるタイプのものであってよく、そしてあらゆるステージのものであってよい。個体は、例えば一般集団の全体にわたって、癌のリスクがあり得、そして癌のリスクがある個体は、個人または家族の病歴のため、個体がタバコユーザーであり、肥満であり、過剰なアルコールを消費しており、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）等のいくつかのタイプのウイルス感染症を有し、１つ以上の発癌物質に曝されており、または太陽からの紫外線が挙げられる放射線に過剰に曝されてきたため、そうなり得る。量は、集団の平均個体よりも大きい場合に、過剰であると考えられ得る。

開示される処置方法が有用である腫瘍として、固形腫瘍または血液腫瘍に見出されるもの等のあらゆる悪性細胞型が挙げられる。例示的な固形腫瘍として、乳房、卵巣、膵臓、結腸、盲腸、胃、脳、頭部、頸部、腎臓、喉頭、肉腫、肺、膀胱、黒色腫、前立腺、胃組織、および子宮内膜からなる群から選択される臓器の腫瘍が挙げられ得るが、これらに限定されない。例示的な血液腫瘍として、骨髄の腫瘍、ＴまたはＢ細胞悪性腫瘍、白血病、リンパ腫、芽細胞腫、骨髄腫等が挙げられる。本明細書中で提供される方法を用いて処置され得る癌の特定の例として、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、および肺扁平上皮癌が挙げられる）、腹膜の癌、胃癌（胃腸癌および消化管間質癌が挙げられる）、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、種々の種類の頭頸部癌、および黒色腫が挙げられるが、これらに限定されない。

癌は、具体的には、以下の組織型のものであり得るが、これらに限定されない。新生物、悪性；癌腫；癌腫、未分化；巨細胞癌および紡錘細胞癌；小細胞癌；乳頭状癌；扁平上皮癌；リンパ上皮癌；基底細胞癌；毛母腫性癌腫；移行細胞癌；乳頭状移行細胞癌；腺癌；ガストリノーマ、悪性；胆管癌；肝細胞癌；混合型肝細胞癌および胆管癌；骨梁腺癌；腺様嚢胞癌；腺腫性ポリープにおける腺癌；腺癌、家族性大腸ポリポーシス；固形癌；カルチノイド腫瘍、悪性；分枝肺胞腺癌；乳頭状腺癌；色素嫌性癌腫；好酸球癌；好酸球腺癌；好塩基球癌；明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾胞腺癌；乳頭腺癌および濾胞腺癌；非被包性硬化性癌；副腎皮質癌；子宮内膜癌；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；脂腺癌；耳腺癌；粘膜表皮癌；嚢胞腺癌；乳頭状嚢胞腺癌；乳頭状漿液性嚢胞腺癌；粘液性嚢胞腺癌；粘液性腺癌；印環細胞癌；浸潤性乳管癌；髄様癌；小葉癌；炎症性癌腫；パジェット病、乳房；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；扁平上皮化生を伴う腺癌；胸腺腫、悪性；卵巣間質腫瘍、悪性；髄膜腫、悪性；顆粒膜細胞腫瘍、悪性；男性芽腫、悪性；セルトリ細胞癌；ライディッヒ細胞腫瘍、悪性；脂質細胞腫瘍、悪性；傍神経節腫、悪性；乳房外傍神経節腫、悪性；褐色細胞腫；乳腺血管肉腫；悪性黒色腫；無色素性黒色腫；表在拡大型黒色腫；黒子悪性黒色腫；先端水晶体黒色腫；結節性黒色腫；巨大色素性母斑における悪性黒色腫；上皮様細胞黒色腫；青色母斑、悪性；肉腫；線維肉腫；線維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児横紋筋肉腫；肺胞横紋筋肉腫；間質肉腫；混合腫瘍、悪性；ミュラー混合腫瘍；腎芽細胞腫；肝芽腫；癌肉腫；間葉腫、悪性；ブレナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑膜肉腫；中皮腫、悪性；未分化胚細胞腫；胚性癌腫；奇形腫、悪性；卵巣ストロマ、悪性；絨毛癌；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；血管周囲細胞腫、悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍皮質性骨肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽細胞腫、悪性；間葉性軟骨肉腫；骨巨細胞性腫瘍；ウイング肉腫；歯原性腫瘍、悪性；エナメル芽細胞性歯肉腫；エナメル芽腫、悪性；エナメル芽細胞線維肉腫；松果体腫、悪性；腱索腫；神経膠腫、悪性；上衣腫；星状細胞腫；原形質性星状細胞腫；線維性星細胞腫；星状芽細胞腫；神経膠芽腫；乏突起膠腫；乏突起芽細胞腫；原神経外胚葉；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽細胞腫；網膜芽細胞腫；嗅覚神経原性腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経鞘腫、悪性；顆粒状細胞腫瘍、悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキン；傍肉芽腫；悪性リンパ腫、小リンパ球性；悪性リンパ腫、大細胞、びまん性；悪性リンパ腫、濾胞性；菌状息肉症；他の特定の非ホジキンリンパ腫；Ｂ細胞性リンパ腫；低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非切断細胞ＮＨＬ；巨大病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；悪性組織球増殖；多発性骨髄腫；肥満細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞性白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥満細胞白血病；巨核芽球性白血病；骨髄性肉腫；有毛細胞白血病；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；ならびに慢性骨髄芽球性白血病。

本開示の特定の実施形態において、免疫細胞は、それを必要とする個体、例えば癌を有するか、または癌を有することが疑われる個体に送達される。次いで、細胞は、個体の免疫系を増強して、それぞれの癌を攻撃する。場合によっては、個体には、１回以上の用量の免疫細胞が提供される。個体に２回またはそれを超える用量の免疫細胞が提供される場合には、投与間の期間は、個体における増殖のための時間を許容するのに十分であるべきであり、特定の実施形態において、用量間の期間は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、またはそれを超える日数である。場合によっては、投与間の期間は、１～２４時間、１～７日、１～４週、１～１２ヶ月、もしくはそれを超える、またはそれらの間で導き出せるあらゆる範囲である。

一部の実施形態において、対象に、免疫細胞療法の前に、骨髄非破壊的リンパ球枯渇化学療法を施すことができる。骨髄非破壊的リンパ球枯渇化学療法は、適切なあらゆる経路によって施すことができるような適切なあらゆる療法であり得る。骨髄非破壊的リンパ球枯渇化学療法は、例えば、特に癌が、転移性であり得る黒色腫であれば、シクロホスファミドおよびフルダラビンの投与を含み得る。シクロホスファミドおよびフルダラビンを投与する例示的な経路は、静脈内である。同様に、適切な任意の用量のシクロホスファミドおよびフルダラビンを投与することができる。特定の態様において、約６０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドが２日間投与され、その後、約２５ｍｇ／ｍ^２のフルダラビンが５日間投与される。

特定の実施形態において、免疫細胞の増殖および活性化を促進する１つ以上の増殖因子および／または１つ以上のサイトカインが、免疫細胞と同時に、または免疫細胞に続いて対象に投与される。免疫細胞増殖因子は、免疫細胞の増殖および活性化を促進する適切なあらゆる増殖因子であり得る。適切な免疫細胞増殖因子の例として、インターロイキン（ＩＬ）－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、およびＩＬ－１２が挙げられ、これらは単独で、またはＩＬ－２およびＩＬ－７、ＩＬ－２およびＩＬ－１５、ＩＬ－７およびＩＬ－１５、ＩＬ－２、ＩＬ－７、およびＩＬ－１５、ＩＬ－１２およびＩＬ－７、ＩＬ－１２およびＩＬ－１５、またはＩＬ－１２およびＩＬ２等の種々の組合せで用いることができる。

治療有効量の免疫細胞は、非経口投与、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、胸骨内もしくは関節内注射、鼻腔内、動脈内が挙げられるいくつかの経路によって、または注入によって投与することができる。

養子細胞療法に用いられる免疫細胞の治療有効量は、処置されることとなる対象において所望の効果を達成する量である。例えば、これは、増殖を阻害するのに、または癌の退縮を引き起こすのに、または癌の少なくとも１つの徴候を改善するのに必須の免疫細胞の量であり得る。

免疫細胞集団は、疾患と一致する処置レジメン、例えば、疾患状態を改善するための１～数日間にわたる単回もしくは数回の用量、または疾患進行を阻害し、かつ疾患再発を予防するための長期間にわたる定期的な用量で投与することができる。また、製剤形態で使用されることとなる正確な用量は、投与経路、および疾患または障害の重篤度によって決まることとなり、施術者の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである。免疫細胞の治療有効量は、処置されることとなる対象、苦痛の重症度およびタイプ、ならびに投与様式によって決まることとなる。一部の実施形態において、ヒト対象の処置に用いられ得る用量は、少なくとも３．８×１０４、少なくとも３．８×１０５、少なくとも３．８×１０６、少なくとも３．８×１０７、少なくとも３．８×１０８、少なくとも３．８×１０９、または少なくとも３．８×１０１０免疫細胞／ｍ２に及ぶ。特定の実施形態において、ヒト対象の処置に用いられる用量は、約３．８×１０９～約３．８×１０１０免疫細胞／ｍ２に及ぶ。追加の実施形態において、免疫細胞の治療有効量は、体重１ｋｇあたり約５×１０６細胞～体重１ｋｇあたり約７．５×１０８細胞、例えば体重１ｋｇあたり約２×１０７細胞～約５×１０８細胞、または体重１ｋｇあたり約５×１０７細胞～約２×１０８細胞で変動し得る。免疫細胞の正確な量は、対象の年齢、体重、性別、および生理学的状態に基づいて、当業者によって容易に決定される。有効用量は、インビトロ試験系または動物モデル試験系から得られる用量反応曲線から外挿することができる。

免疫細胞は、癌の処置用の１つ以上の他の治療剤と組み合わせて投与され得る。併用療法として、１つ以上の抗腫瘍剤またはワクチンが挙げられ得るが、これに限定されない。特定の場合には、化学療法剤（例えば、メトトレキサート、トレオスルファン、ブスルファン）、照射、またはケモカイン、インターロイキン、もしくはそれらの阻害剤（例えば、ＢＡＦＦ、ＩＬ－２、抗ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－４、ＪＡＫキナーゼ阻害剤）が、免疫細胞に加えて施され得る。そのような追加の医薬剤は、所望の効果に応じて、免疫細胞の投与前、投与中、または投与後に投与され得る。細胞および１つ以上の追加の抗癌剤のこの投与は、同じ経路によるものであっても異なる経路によるものであってもよく、同じ部位であっても異なる部位であってもよい。
ＶＩ．医薬組成物

本明細書中で提供されるのは、免疫細胞（例えば、Ｔｒｅｇ細胞等のＴ細胞が挙げられるＳＲＣ－３破壊免疫細胞）および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物および製剤である。一部の実施形態において、（ａ）本明細書中に包含される任意の免疫細胞、および（ｂ）ＳＲＣ－３を標的とする１つ以上の剤を含む組成物が存在する。そのような場合には、（ａ）および（ｂ）は、同じ製剤形態であってもなくてもよく、同じ投与経路によって送達されるように構成されていてもいなくてもよい。

本明細書中に記載される医薬組成物および製剤は、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、所望の純度を有する活性成分（抗体またはポリペプチド等）を、１つ以上の任意の薬学的に許容される担体（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２２ ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１２）と混合することによって調製することができる。薬学的に許容される担体は、一般に、使用される投与量および濃度にて、レシピエントに対して非毒性であり、以下に限定されないが、リン酸、クエン酸、および他の有機酸等のバッファ；アスコルビン酸およびメチオニンが挙げられる酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾール等）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジン等のアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、もしくはデキストリンが挙げられる他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えばＺｎ－タンパク質複合体）；ならびに／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。本明細書中の例示的な薬学的に許容される担体としてさらに、間質性薬物分散剤、例えば、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えばヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）が挙げられる。ｒＨｕＰＨ２０が挙げられる特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰおよび使用方法が、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号明細書および米国特許出願公開第２００６／０１０４９６８号明細書に記載されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼ等の１つ以上の追加のグリコサミノグリカナーゼと組み合わされる。
ＶＩＩ．併用療法

特定の実施形態において、本実施形態の組成物および方法は、少なくとも１つの追加の療法と組み合わせた免疫細胞集団を含む。追加の療法は、放射線療法、外科手術、化学療法、遺伝子療法、ＤＮＡ療法、ウイルス療法、ＲＮＡ療法、免疫療法、骨髄移植、ナノ療法、モノクローナル抗体療法、タンパク質療法、または前述の組合せであり得る。追加の療法は、アジュバント療法またはネオアジュバント療法の形態であり得る。追加の療法は、ＳＲＣ－３を標的とする１つ以上の剤、例えば、あらゆる種類の抗体、小分子阻害剤、核酸、タンパク質、またはそれらの組合せであり得る。

一部の実施形態において、追加の療法は、ＳＲＣ－３の小分子阻害剤または抗転移剤の投与である。一部の実施形態において、追加の療法は、副作用制限剤（例えば、処置の副作用の発生および／または重症度を軽減することが意図される剤、例えば嘔吐抑制剤、その他）の投与である。一部の実施形態において、追加の療法は放射線療法である。一部の実施形態において、追加の療法は外科手術である。一部の実施形態において、追加の療法は、放射線療法および外科手術の組合せである。一部の実施形態において、追加の療法はガンマ線照射である。一部の実施形態において、追加の療法は、ＰＢＫ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路を標的とする療法、ＨＳＰ９０阻害剤、チューブリン阻害剤、アポトーシス阻害剤、および／または化学予防剤である。追加の療法は、当該技術において知られている１つ以上の化学療法剤であり得る。

免疫細胞療法は、追加の癌治療の前、間、後に、または種々の組合せで施され得る。投与は、同時～数分～数時間～数日～数週に及ぶ間隔であり得る。免疫細胞療法が、追加の治療剤とは別に患者に提供される実施形態において、当業者であれば、一般に、２つの化合物が、有利に組み合わされた効果を患者に対して依然として発揮することができるように、重要な期間が各送達時間の間に失効しないことを確実にするであろう。

本実施形態の任意の化合物または療法を患者に施すには、もしあれば剤の毒性を考慮して、そのような化合物の投与のための一般的なプロトコルに従うこととなる。したがって、一部の実施形態において、併用療法に起因する毒性を監視する工程が存在する。
Ａ．化学療法

多種多様な化学療法剤が、本実施形態に従って用いられ得る。用語「化学療法」は、癌を処置するための薬物の使用を指す。「化学療法剤」は、癌の処置の際に投与される化合物または組成物を意味するのに用いられる。当該剤または薬物は、細胞内の活性様式によって、例えば、細胞周期に影響を及ぼすか、そしてどの段階で影響を及ぼすかで分類される。これ以外にも、剤は、ＤＮＡを直接架橋する能力、ＤＮＡ中にインターカレートする能力、または核酸合成に影響を及ぼすことによって染色体異常および有糸分裂異常を誘導する能力に基づいて特徴付けられてよい。

化学療法剤の例として、アルキル化剤、例えば、チオテパおよびシクロホスファミド；スルホン酸アルキル、例えば、ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファン；アジリジン、例えば、ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、およびウレドーパ；エチレンイミンおよびメチルアメラミン（アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、およびトリメチロメラミンが挙げられる）；アセトゲニン（とりわけ、ブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンが挙げられる）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ－１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン、およびビゼレシン合成類似体が挙げられる）；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ－２１８９、およびＣＢ１－ＴＭ１が挙げられる）；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、クロロフォスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、およびウラシルマスタード；ニトロソウレア、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン；抗生物質、例えば、エンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、とりわけ、カリケアマイシンガンマＩＩ（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ ｇａｍｍａＩＩ）、およびカリケアマイシンオメガＩＩ（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ ｏｍｅｇａＩＩ））；ダイネマイシン（ダイネマイシンＡが挙げられる）；ビスホスホナート、例えばクロドロナート；エスペラマイシン；ならびにネオカルジノスタチンクロモフォアおよび関連する色素タンパク質エンジインアンチビオティッククロモフォア、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オートラルマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ－ドキソルビシン、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、２－ピロリノ－ドキソルビシン、およびデオキシドキソルビシンが挙げられる）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えばマイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラルナイシン（ｎｏｇａｌａｒｎｙｃｉｎ）、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、およびゾルビシン；代謝拮抗薬、例えば、メトトレキサートおよび５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）；葉酸類似体、例えば、デノプテリン、プテロプテリン、およびトリメトレキサート；プリン類似体、例えば、フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、およびチオグアニン；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、およびフロクスウリジン；アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、およびテストラクトン；抗副腎剤（ａｎｔｉ－ａｄｒｅｎａｌｓ）、例えば、ミトタンおよびトリロスタン；葉酸補充剤、例えばフロリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクォン；エルフォルミチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；マイタンシノイド、例えば、マイタンシンおよびアンサマイトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモル（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖複合体；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２"－トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（とりわけ、Ｔ－２トキシン、ベラキュリンＡ、ロリジンＡ、およびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；タキソイド、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセルゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；白金配位錯体、例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、およびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼロダ；イバンドロナート；イリノテカン（例えばＣＰＴ－１１）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えばレチノイン酸；カペシタビン；カルボプラチン、プロカルバジン、プリカマイシン、ゲムシタビン、ナベルビン、ファルネシル－タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランス白金、ならびに先のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が挙げられる。
Ｂ．放射線療法

ＤＮＡ損傷を引き起こし、かつ広く用いられている他の因子として、γ線、Ｘ線、および／または腫瘍細胞への放射性同位体の指向性送達として一般に知られているものが挙げられる。また、マイクロ波、陽子ビーム照射（米国特許第５，７６０，３９５号明細書および米国特許第４，８７０，２８７号明細書）、およびＵＶ照射等の他の形態のＤＮＡ損傷因子が企図される。これらの因子は全て、ＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製および修復、ならびに染色体のアセンブリおよび維持に対する広範囲の損傷に影響を及ぼす可能性が最も高い。Ｘ線の線量範囲は、長期間（３～４週）にわたる５０～２００レントゲンの１日線量から２０００～６０００レントゲンの単回線量に及ぶ。放射性同位体の線量範囲は、広く変動し、同位体の半減期、放たれる放射線の強度および種類、ならびに新生物細胞による取込みによって決まる。
Ｃ．免疫療法

当業者であれば、本明細書中に包含されるものに対する追加の免疫療法が、実施形態の方法と併用され得、または組み合わせて用いられ得ることを理解するであろう。癌処置の文脈において、免疫療法は、一般に、癌細胞を標的として破壊するための免疫エフェクタ細胞および分子の使用に依存する。リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））がそのような例である。免疫エフェクタは、例えば、腫瘍細胞の表面上のいくつかのマーカーに特異的な抗体であり得る。抗体は単独で、療法のエフェクタとして機能し得るか、または他の細胞を動員して細胞死に実際に影響を及ぼし得る。また、抗体は、薬物または毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素、その他）にコンジュゲートされて、標的化剤として機能し得る。これ以外にも、エフェクタは、腫瘍細胞標的と直接的または間接的に相互作用する表面分子を担持するリンパ球であり得る。種々のエフェクタ細胞として、細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞が挙げられる。

抗体－薬物コンジュゲートは、癌治療薬の開発への画期的なアプローチとして出現した。癌は、世界における主要な死因の１つである。抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、細胞死滅薬に共有結合したモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を含む。このアプローチは、抗原標的に対するＭＡｂの高い特異性を、高度に強力な細胞傷害性薬物と組み合わせて、抗原レベルが富化された腫瘍細胞にペイロード（薬物）を送達する「武装」ＭＡｂをもたらす。また、薬物の標的送達は、正常組織における曝露を最小限に抑えて、毒性の低下および治療指数の改善をもたらす。ＦＤＡによる２０１１年のＡＤＣＥＴＲＩＳ（登録商標）（ブレンツキシマブベドチン）および２０１３年のＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標）（トラスツズマブエムタンシンまたはＴ－ＤＭ１）という２つのＡＤＣ薬物の承認は、単に例として、当該アプローチを検証した。

免疫療法の一態様において、腫瘍細胞は、標的化に適した、すなわち他の細胞の大部分に存在しない何らかのマーカーを有していなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらはいずれも、本実施形態の文脈における標的化に適し得る。一般的な腫瘍マーカーとして、ＣＤ２０、癌胎児性抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ－７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、ラミニン受容体、ｅｒｂＢ、およびｐ１５５が挙げられる。免疫療法の代替的な態様は、抗癌効果を免疫刺激効果と組み合わせるものである。また、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１２、ＧＭ－ＣＳＦ、ガンマ－ＩＦＮ等のサイトカイン、ＭＩＰ－１、ＭＣＰ－１、ＩＬ－８等のケモカイン、およびＦＬＴ３リガンド等の増殖因子が挙げられる免疫刺激分子が存在する。

一部の実施形態において、免疫療法は、免疫チェックポイント阻害剤であってよい。免疫チェックポイントは、シグナル（例えば共刺激分子）を強くするか、またはシグナルを弱くする。免疫チェックポイント遮断によって標的とされ得る阻害性免疫チェックポイントとして、アデノシンＡ２Ａ受容体（Ａ２ＡＲ）、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６としても知られている）、ＢおよびＴリンパ球アテニュエータ（ＢＴＬＡ）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４、ＣＤ１５２としても知られている）、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、キラー細胞免疫グロブリン（ＫＩＲ）、リンパ球活性化遺伝子－３（ＬＡＧ３）、プログラム死１（ＰＤ－１）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３（ＴＩＭ－３）、ならびにＴ細胞活性化のＶドメインＩｇサプレッサ（ＶＩＳＴＡ）が挙げられる。特に、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１軸および／またはＣＴＬＡ－４を標的とする。本明細書中で提供される方法において標的とされ得る別の免疫チェックポイントは、ＣＤ１５２としても知られている細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）である。一部の実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ－４抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体）、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、またはオリゴペプチドである。
Ｄ．外科手術

癌を有する人の約６０％は、予防的手術、診断手術または病期分類手術、治癒的手術、および緩和手術が挙げられる何らかの種類の外科手術を受けることとなる。治癒的手術として、癌性組織の全てまたは一部が物理的に除去、切除、かつ／または破壊される切除が挙げられ、本実施形態の処置、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法、および／または代替療法等の他の療法と組み合わせて用いることができる。腫瘍切除術は、腫瘍の少なくとも一部の物理的除去を指す。腫瘍切除術に加えて、外科手術による処置として、レーザー手術、凍結手術、電気手術、および顕微鏡下手術（Ｍｏｈｓ手術）が挙げられる。

癌性細胞、組織、または腫瘍の一部または全てを切除すると、体内に空洞が形成されることがある。処置は、追加の抗癌治療による領域の灌流、直接注射、または局所施用によって達成され得る。そのような処置は、例えば、１、２、３、４、５、６、もしくは７日毎、または１、２、３、４、および５週毎、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２ヶ月毎に繰り返すことができる。これらの処置は、同様に、投与量を変えるものであってもよい。
ＶＩＩＩ．操作されたＢ細胞および使用方法

特定の実施形態において、ＳＲＣ－３の破壊を有するように操作される免疫細胞として、Ｂ細胞が挙げられる。特定の実施形態において、ＳＲＣ－３破壊Ｂ細胞は、Ｂ細胞が有効であるあらゆる医学的状態に利用されるが、特定の実施形態において、修飾されたＢ細胞は、例えば、少なくともＢ細胞リンパ腫、および本明細書中の他の箇所に列挙される癌が挙げられる、あらゆる種類の１つ以上の炎症性疾患の処置または癌の処置に利用される。

特定の実施形態において、Ｂ細胞は、商業的に、または処置を必要とする個体から得られる。Ｂ細胞は、同種異系目的で、健常個体から得られ得る。Ｂ細胞は、Ｂ細胞における内因性ＳＲＣ－３の発現を破壊させる標準的な方法によって、エクスビボで操作され得る。場合によっては、操作されたＢ細胞は、必要とする個体に投与されると、Ｂ細胞の有効性を促進するＴＧＦ－□または腫瘍特異的抗原が挙げられる１つ以上の剤に曝露される。

特定の実施形態において、ＳＲＣ－３の発現を欠くか、または非操作Ｂ細胞と比較してＳＲＣ－３の発現が低下している操作されたＢ細胞は、１つ以上の炎症性疾患を有するか、またはこれを有するリスクがある個体に、有効量で投与される。炎症性疾患は、あらゆる種類のものであってよいが、特定の実施形態において、疾患は、単なる例として、アレルギー、喘息、自己免疫疾患、セリアック病、糸球体腎炎、肝炎、炎症性腸疾患、再灌流傷害、移植拒絶、強直性脊椎炎（ＡＳ）、痛風、筋炎、慢性関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ、狼瘡）、骨盤内炎症性疾患、または血管炎である。Ｂ細胞処置は、疾患の重症度を軽減または遅延させる、疾患の発症を遅延させる、疾患の１つ以上の徴候を改善する等し得る。
ＩＸ．製造品またはキット

また、免疫細胞を含む製造品またはキットが本明細書中で提供される。免疫細胞は、Ｔｒｅｇ細胞等のＴ細胞であり得る。キットは、ＳＲＣ－３破壊を有していない細胞、ＳＲＣ－３破壊をもたらす１つ以上の試薬（例えば、ＳＲＣ－３のノックアウトまたはノックダウンを特異的に促進する核酸およびタンパク質が挙げられる）、ＳＲＣ－３破壊を有する細胞、ＳＲＣ－３を標的とする１つ以上の剤、バッファ、塩、使用説明書、またはそれらの組合せを含み得る。特定の実施形態において、キットは、ＳＲＣ－３、制御性Ｔ細胞、または双方を標的とするＣＲＩＳＰＲ試薬を含む。

製造品またはキットはさらに、個体における癌を処置するか、または癌の進行を遅延させるために免疫細胞を用いる説明書を含む添付文書を含み得る。本明細書中に記載される任意の免疫細胞が、製造品またはキットに含まれ得る。適切な容器として、例えば、ボトル、バイアル、バッグ、およびシリンジが挙げられる。容器は、ガラス、プラスチック（ポリ塩化ビニルまたはポリオレフィン等）、または合金（ステンレス鋼またはニッケル－モリブデン合金等）等の種々の材料から形成されていてよい。一部の実施形態において、容器は、製剤およびラベルを容器上に保持するか、または容器に関連付けられて、使用説明書を示し得る。製造品またはキットはさらに、他のバッファ、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および使用説明書入りの添付文書が挙げられる、商業的観点およびユーザーの観点から望ましい他の材料を含み得る。一部の実施形態において、製造品はさらに、１つ以上の別の剤（例えば、化学療法剤および抗悪性腫瘍薬）を含む。１つ以上の剤に適した容器として、例えば、ボトル、バイアル、バッグ、およびシリンジが挙げられる。

以下の実施例は、本開示の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例に開示される技術は、本発明者らによって発見された技術が、本開示の方法および組成物の実施において十分に機能することを表すので、その実施のための特定の様式を構成すると考えることができることが当業者によって理解されるべきである。しかしながら、当業者であれば、本開示に照らして、開示される特定の実施形態において多くの変更を行うことができ、本開示の精神および範囲から逸脱することなく同様な、または類似の結果を依然として得ることができることを理解すべきである。
実施例１
ＳＲＣ－３は免疫細胞集団を制御する

乳癌細胞におけるＳＲＣ－３（遺伝子名：ＮＣＯＡ３）の細胞自律的発癌機能は十分に確立されている（１～９）が、免疫細胞において発現されるＳＲＣ－３の役割はほとんど知られていない。マウスにおけるＳｒｃ－３遺伝子の遺伝子欠失は、リンパ系統の拡大をもたらして、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞、ならびにＢリンパ球の数の増大をもたらす（（１１）において最初に報告されており、この観察結果を要約する最近のデータを図１に示す）。Ｓｒｃ－３ ＫＯマウスの末梢血中では、ＣＸＣＬ２、ＩＬ２、ＩＬ１αおよびβ、ＣＣＬ２、ならびにＧＣＳＦが挙げられるいくつかのサイトカインのレベルが上昇していた（データは示さず）。これらの発見は、ＳＲＣ－３の免疫抑制機能を明らかにし、このことは、ＳＲＣ－３を、新規な転写免疫チェックポイント調節因子として強調しており、免疫細胞におけるＳＲＣ－３の薬理学的阻害が癌細胞を攻撃する能力を強めることができることが強く示唆される。しかしながら、ＳＲＣ－３がこの役割を発揮する正確な免疫細胞集団は、定義されないままであった。公開データセットの遺伝子発現分析により、ＳＲＣ－３発現がＴｒｅｇ細胞において非常に高く、Ｆｏｘｐ３発現と相関することが明らかになった（図２）。Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ａｔｌａｓ（ＮＵＲＳＡ）の２９６個の厳選した共調節因子のうち、ＮＣＯＡ３（Ｓｒｃ－３）が、ＴｒｅｇにおけるＦｏｘｐ３発現と２番目に相関する共活性化因子であった（図３）。
実施例２
ＴｒｅｇにおけるＳＲＣ－３の遺伝的破壊は、ロバストな乳癌腫瘍クリアランスを促進する

ＳＲＣ－３－／－マウスがリンパ増殖性表現型を有すること、そしてＴｒｅｇにおけるＳＲＣ－３発現の破壊が、この細胞型における免疫抑制タンパク質の発現低下をもたらすことを示す、以前に報告されたデータを考えると、本発明者らは、ＳＲＣ－３を、マウス遺伝子モデル系を用いて、「Ｔｒｅｇ区画」において特異的に免疫チェックポイント調節タンパク質として特徴付けた。本発明者らは、ＳＲＣ－３ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスを１０世代の間、純粋なＣ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドに戻し交配してから、このマウスを、既にＣ５７ＢＬ／６ＪバックグラウンドにあるＦｏｘｐ３：ＥＧＦＰ－Ｃｒｅ－ＥＲＴ２マウスと交配して、Ｔｒｅｇ：ＳＲＣ－３ＫＯマウスを作出した。

タモキシフェン処置は、Ｃｒｅを活性化して、Ｔｒｅｇにおいて特異的にＳＲＣ－３遺伝子の破壊をもたらすこととなる。この遺伝的に操作されたマウスモデル系を用いて、ＳＲＣ－３遺伝子破壊の効果を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドと適合する広範な免疫適格同系腫瘍細胞株（以下に示すＥ０７７１マウス乳腺腫瘍株が挙げられる）において試験した。Ｅ０７７１腫瘍は特に侵攻性であり、このモデル系において腫瘍増殖を制御することは困難であることが周知である。しかしながら、ＳＲＣ－３がＴｒｅｇにおいて特異的に破壊した宿主マウスでは、腫瘍は本質的に根絶された一方、野生型宿主動物では、腫瘍は急速に大きなサイズに増殖した（図４）。

この研究の結果は、ＳＲＣ－３が、新たに発見された重要な免疫チェックポイント調節標的であることを強く実証している。この動物モデル実験からの別の予想外の重要な結果は、動物が健康であるように見え、脾臓が正常な大きさであり、体重または活動に何の大きな変化もないことであった。これは、重度の自己免疫表現型を有し、かつ若齢にて死亡するＦｏｘｐ３変異ｓｃｕｒｆｙマウスとは対照的である。特定の実施形態において、Ｔｒｅｇ：ＳＲＣ－３ＫＯマウスは、ｓｃｕｒｆｙマウスとは異なる。なぜなら、Ｆｏｘｐ３細胞におけるＳＲＣ－３の遺伝的破壊は、Ｔｒｅｇの免疫抑制活性のサブセットしか破壊させないからである。診療所における既存の免疫チェックポイント調節薬は、強力、用量制限的、かつ生命を脅かす副作用プロファイルを有する。したがって、特定の実施形態において、ＳＲＣ－３ ＳＭＩによるＴｒｅｇ生物学の特定の態様のみの阻害は、その腫瘍関連免疫抑制のみを標的とすることを可能にし、他の組織における望ましくない免疫系事象を一般に過剰刺激することはない。
実施例３
ＴｒｅｇにおけるＳＲＣ－３のＣＲＩＳＰＲベースの標的化

遺伝的に操作されたマウスモデルは、Ｔｒｅｇ内のＳＲＣ－３を特異的に標的とすることにより、侵攻性乳腺癌が根絶することを実証している。この知見を、臨床的に解釈可能な治療処置に変換するために、本発明者らは、以下に記載されるＣＲＩＳＰＲベースのアプローチを用いて、マウス免疫細胞においてＳＲＣ－３遺伝子を標的とする方法を開発した。特定の実施形態において、遺伝的に変更された細胞が、同系マウスモデル系において乳房腫瘍を排除するための養子療法用のＴ細胞／Ｔｒｅｇの供給源として用いられる。このプロセスは、乳癌または他の癌を有するヒト患者を処置するのに有用な（例えば）ヒトＣＤ４＋細胞に適合可能である。

１２週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスから脾臓を収集した。脾細胞の単一細胞懸濁液を、シリンジのプランジャ端部を用いて４０μｍセルストレーナにより脾臓をつぶすことによって調製した。脾細胞懸濁液をコニカルチューブ内に入れて、遠心分離して（１５００ｒｐｍ、５分）、赤血球ペレットを、ＲＢＣ除去バッファ（Ｓｉｇｍａ Ｒ ７７５７）を用いてＲＢＣ除去して、ベージュ色のリンパ球ペレットを得た。リンパ球を、ＣＤ２８／ＩＬ２／ＭｅＳＨを補充した完全ＲＰＭＩ培地（Ｌ－ｇｌｕ、ＦＢＳ、抗生物質）を用いて、ＣＤ３コーティングしたプレートにプレーティングした。培養の３日後、細胞生存率を評価して（８０％）、バルクリンパ球を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＣＤ４富化キット（１３０－１０４－５４５）を用いてＣＤ４富化した。富化されたＣＤ４細胞（４０Ｍ）を、上記の条件においてもう２日間プレーティングして、細胞集団を、１億個を超える細胞にまで増殖させた。

ヌクレオフェクション：Ｌｏｎｚａ ４Ｄヌクレオフェクタおよび初代細胞ヌクレオフェクションキット（Ｌｏｎｚａ Ｖ４ＸＰ－３０２４）を用いて、ＣＤ４細胞の富化増殖集団を、Ｃａｓ９－ＮＣｏＡ３ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）によりヌクレオフェクションした。蛍光標識されたｔｒｃｒＲＮＡ（ＩＤＴ＃１０７５９２８）を、ｃｒＲＮＡ（ＩＤＴ）と、１：１の比率にて（１１．２５μｌのＴｒｃｒＲＮＡ－ＡＴＴＯ ５５０を、３つの異なるｃｒＲＮＡと（それぞれ３．７５μｌ））混合することによって、ＲＮＰを調製した。ｇＲＮＡ（ｔｒｃｒＲＮＡ＋ｃｒＲＮＡで構成される）を、３７℃にて１５分間インキュベートした。次いで、ｇＲＮＡ（濃度５０μＭ）を、Ｃａｓ９タンパク質（ＩＤＴ＃１０８１０５９、濃度６０μＭ）と３：１の比率にて混合して、過剰のｇＲＮＡ成分を有する１５μＭ ＲＮＰを得た。ＲＮＰを３７℃にて１５分間インキュベートしてから、ヌクレオフェクションバッファと１：５の比率にて混合した。１３個のヌクレオフェクション反応液を調製した。各反応液は、８００～１０００万個のＣＤ４細胞および１３０μｌのＲＮＰ－ヌクレオフェクションバッファミックスを含有していた（ＲＮＰの最終濃度は３．５μＭであり、ｇＲＮＡ成分は３倍過剰である）。各ヌクレオキュベットを製造業者のＥＮ１３８パルスプログラムに供することによって、ヌクレオフェクションを４Ｄヌクレオフェクタ内で実行した。

ヌクレオフェクション後、細胞に培地を供給して、ＣＤ３で覆った培養皿に移した。一晩の回復の後、細胞をフローサイトメトリによってソートして、ヌクレオフェクトされた集団の分離を（蛍光標識されたｇＲＮＡを追跡することによって）可能にした。

ソートされた集団（陽性および陰性）を５日間培養して、遺伝子編集を、そしてタンパク質代謝回転および細胞増殖を起こさせた。続いて、これらの細胞から総ＲＮＡを単離してから、ＳＲＣ－３（遺伝子記号Ｎｃｏａ３）発現の破壊について試験するために、２ステップＲＴ－ｑＰＣＲを行った。

これらの結果は、Ｔリンパ球におけるＳＲＣ－３のＣＲＩＳＰＲベースの破壊がロバストであり、養子Ｔ細胞移入等の更なる下流用途用の高収率の生存可能な増殖可能細胞を生成することを実証している。

当該データは、ＳＲＣ－３がＴｒｅｇにおける重要な標的であることを強く暗示しており、この細胞区画におけるその特異的破壊は、乳癌同系腫瘍モデルにおける腫瘍根絶をもたらす。ＴｒｅｇにおいてＳＲＣ－３を破壊させる本戦略は、他の免疫チェックポイント阻害剤から区別される。なぜなら、ＳＲＣ－３は、その、潜在的に重篤な副作用と関連する機能を完全に消失させることなく、腫瘍根絶を促進するようにＴｒｅｇの機能を調節する核タンパク質であるからである。本開示は、ＣＲＩＳＰＲベースの遺伝子標的化を用いて、マウスから得られるＴ細胞においてエクスビボでＳＲＣ－３を特異的に消失させるアプローチを提供する。ヒトＣＤ４＋リンパ球を用いて施用する場合、当該方法は、ヒト癌の処置用の養子Ｔ細胞／Ｔｒｅｇベースの治療薬としての明確な翻訳可能潜在性を有する。
実施例４
乳癌を有するマウスへの養子ＳＲＣ－３ ＫＯ Ｔｒｅｇ細胞移入

ＳＲＣ－３－／－マウスがリンパ増殖性表現型を有すること、そしてＴｒｅｇにおけるＳＲＣ－３発現の破壊が、この細胞型における免疫抑制タンパク質の発現低下をもたらすことを示す、以前に報告されたデータを考えると、本発明者らは、ＳＲＣ－３を、マウス遺伝子モデル系を用いて、「Ｔｒｅｇ区画」において特異的に免疫チェックポイント調節タンパク質として特徴付けた。本発明者らは、ＳＲＣ－３ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスを１０世代の間、純粋なＣ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドに戻し交配してから、このマウスを、既にＣ５７ＢＬ／６ＪバックグラウンドにあるＦｏｘｐ３：ＥＧＦＰ－Ｃｒｅ－ＥＲＴ２マウスと交配して、Ｔｒｅｇ：ＳＲＣ－３ＫＯ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを作出した。

タモキシフェン処置は、Ｃｒｅを活性化して、Ｔｒｅｇ細胞において特異的にＳＲＣ－３遺伝子の破壊をもたらす。この遺伝的に操作されたマウスモデル系を用いて、ＳＲＣ－３ノックアウト（ＫＯ）Ｔｒｅｇ動物から取り出した脾臓から単離したＳＲＣ－３ ＫＯ Ｔｒｅｇ細胞を生成した。約１６０万個のＳＲＣ－３ ＫＯ Ｔｒｅｇ細胞を、脾臓から単離した。単離されたＳＲＣ－３ ＫＯ Ｔｒｅｇ細胞は、９２％生存可能であった。また、対照として、ＳＲＣ－３ ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ（ＳＲＣ－３^Ｆ／Ｆ）マウスから取り出した脾臓から、Ｔｒｅｇ細胞（約１９０万個）を単離した。単離された対照細胞は、９３％生存可能であった。

単離されたＳＲＣ－３ ＫＯ Ｔｒｅｇ細胞の効果を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける自然発生腫瘍から最初に単離されたマウス乳癌細胞株に由来する、Ｅ０７７１細胞に由来する腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて試験した（図６）。Ｅ０７７１腫瘍は特に侵攻性であり、免疫インタクトＣ５７ＢＬ／６ＪマウスにおいてＥ０７７１腫瘍増殖を抑制することは困難である。しかしながら、Ｅ０７７１腫瘍は、単離されたＳＲＣ－３ ＫＯ Ｔｒｅｇ細胞（９０万個の細胞）で処置したマウスにおいて、養子Ｔｒｅｇ細胞移入なし（Ｎｏ ＡＴ）のＣ５７ＢＬ／６ＪマウスにおけるＥ０７７１腫瘍の増殖と比較して、本質的に根絶された。対照的に、ＳＲＣ－３^Ｆ／Ｆ対照マウス（Ｃｏｎｔ Ｔｒｅｇ、対照ＳＲＣ－３＋Ｔｒｅｇ）由来の９０万個のＴｒｅｇ細胞の移入は、養子Ｔｒｅｇ細胞移入なしのＣ５７ＢＬ／６ＪマウスにおけるＥ０７７１腫瘍の増殖と比較して、Ｅ０７７１細胞の増殖を抑制しなかった（図７）。さらに、養子ＳＲＣ－３ ＫＯ Ｔｒｅｇ細胞移入は、明らかな毒性を引き起こさず、ＳＲＣ－３ ＫＯ Ｔｒｅｇ細胞を受けた動物は、生殖能があるままであった（データは示さず）。

この研究の結果は、ＳＲＣ－３ ＫＯ Ｔｒｅｇ細胞の養子移入が癌処置に有用であり、そして特定の実施形態において、ＳＲＣ－３ ＫＯ Ｔｒｅｇ細胞が、腫瘍増殖を制御かつ／または排除するのに用いられることを実証している。
参考文献

本明細書で言及されるすべての特許および刊行物は、本発明が関係する技術分野の当業者のレベルを示すものである。すべての特許および刊行物は、個々の刊行物が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
1.Geng C, He B, Xu L, Barbieri CE, Eedunuri VK, Chew SA, Zimmermann M, Bond R, Shou J, Li C, Blattner M, Lonard DM, Demichelis F, Coarfa C, Rubin MA, Zhou P, O'Malley BW, Mitsiades N. Prostate cancer-associated mutations in speckle-type POZ protein (SPOP) regulate steroid receptor coactivator 3 protein turnover. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(17):6997-7002. doi: 10.1073/pnas.1304502110. PubMed PMID: 23559371; PMCID: PMC3637757.
2.Eedunuri VK, Rajapakshe K, Fiskus W, Geng C, Chew SA, Foley C, Shah SS, Shou J, Mohamed JS, Coarfa C, O'Malley BW, Mitsiades N. miR-137 Targets p160 Steroid Receptor Coactivators SRC1, SRC2, and SRC3 and Inhibits Cell Proliferation. Mol Endocrinol. 2015;29(8):1170-83. doi: 10.1210/me.2015-1080. PubMed PMID: 26066330; PMCID: PMC4518002.
3.Coarfa C, Fiskus W, Eedunuri VK, Rajapakshe K, Foley C, Chew SA, Shah SS, Geng C, Shou J, Mohamed JS, O'Malley BW, Mitsiades N. Comprehensive proteomic profiling identifies the androgen receptor axis and other signaling pathways as targets of microRNAs suppressed in metastatic prostate cancer. Oncogene. 2016;35(18):2345-56. doi: 10.1038/onc.2015.295. PubMed PMID: 26364608; PMCID: PMC5915337.
4.Wang Y, Lonard DM, Yu Y, Chow DC, Palzkill TG, O'Malley BW. Small molecule inhibition of the steroid receptor coactivators, SRC-3 and SRC-1. Mol Endocrinol. 2011;25(12):2041-53. Epub 2011/11/05. doi: me.2011-1222 [pii] 10.1210/me.2011-1222. PubMed PMID: 22053001; PMCID: 3231837.
5.Tien JC, Liu Z, Liao L, Wang F, Xu Y, Wu YL, Zhou N, Ittmann M, Xu J. The steroid receptor coactivator-3 is required for the development of castration-resistant prostate cancer. Cancer Res. 2013;73(13):3997-4008. Epub 2013/05/08. doi: 0008-5472.CAN-12-3929 [pii] 10.1158/0008-5472.CAN-12-3929. PubMed PMID: 23650284; PMCID: 3732785.
6.Zhou HJ, Yan J, Luo W, Ayala G, Lin SH, Erdem H, Ittmann M, Tsai SY, Tsai MJ. SRC-3 is required for prostate cancer cell proliferation and survival. Cancer Res. 2005;65(17):7976-83. Epub 2005/09/06. doi: 65/17/7976 [pii] 10.1158/0008-5472.CAN-04-4076. PubMed PMID: 16140970.
7.Yan J, Yu CT, Ozen M, Ittmann M, Tsai SY, Tsai MJ. Steroid receptor coactivator-3 and activator protein-1 coordinately regulate the transcription of components of the insulin-like growth factor/AKT signaling pathway. Cancer Res. 2006;66(22):11039-46. Epub 2006/11/17. doi: 66/22/11039 [pii] 10.1158/0008-5472.CAN-06-2442. PubMed PMID: 17108143.
8.Ayala G, Yan J, Li R, Ding Y, Thompson TC, Mims MP, Hayes TG, MacDonnell V, Lynch RG, Frolov A, Miles BJ, Wheeler TM, Harper JW, Tsai MJ, Ittmann MM, Kadmon D. Bortezomib-mediated inhibition of steroid receptor coactivator-3 degradation leads to activated Akt. Clin Cancer Res. 2008;14(22):7511-8. Epub 2008/11/18. doi: 14/22/7511 [pii] 10.1158/1078-0432.CCR-08-0839. PubMed PMID: 19010869; PMCID: 2820291.
9.Yan J, Erdem H, Li R, Cai Y, Ayala G, Ittmann M, Yu-Lee LY, Tsai SY, Tsai MJ. Steroid receptor coactivator-3/AIB1 promotes cell migration and invasiveness through focal adhesion turnover and matrix metalloproteinase expression. Cancer Res. 2008;68(13):5460-8. Epub 2008/07/03. doi: 68/13/5460 [pii] 10.1158/0008-5472.CAN-08-0955. PubMed PMID: 18593949.
10.Wu C, Orozco C, Boyer J, Leglise M, Goodale J, Batalov S, Hodge CL, Haase J, Janes J, Huss JW, 3rd, Su AI. BioGPS: an extensible and customizable portal for querying and organizing gene annotation resources. Genome Biol. 2009;10(11):R130. doi: 10.1186/gb-2009-10-11-r130. PubMed PMID: 19919682; PMCID: PMC3091323.
11.Coste A, Antal MC, Chan S, Kastner P, Mark M, O'Malley BW, Auwerx J. Absence of the steroid receptor coactivator-3 induces B-cell lymphoma. EMBO J. 2006;25(11):2453-64. Epub 2006/05/06. doi: 7601106 [pii] 10.1038/sj.emboj.7601106. PubMed PMID: 16675958; PMCID: 1478181.
12.Vandenbon A, Dinh VH, Mikami N, Kitagawa Y, Teraguchi S, Ohkura N, Sakaguchi S. Immuno-Navigator, a batch-corrected coexpression database, reveals cell type-specific gene networks in the immune system. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016;113(17):E2393-402. doi: 10.1073/pnas.1604351113. PubMed PMID: 27078110; PMCID: PMC4855614.

本開示およびその利点について詳細に説明したが、添付の請求項によって定義される設計の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更、置換および改変を本明細書で行うことができることを理解されたい。さらに、本願の範囲は、本明細書に記載されたプロセス、機械、製造、物質組成、手段、方法およびステップの特定の実施形態に限定されることを意図していない。当業者であれば本開示から容易に理解できるように、本明細書に記載された対応する実施形態と実質的に同じ機能を実行し、または実質的に同じ結果を達成する、現在存在するかまたは後に開発されるプロセス、機械、製造、物質の組成物、手段、方法、またはステップが、本開示に従って利用され得る。したがって、添付の特許請求の範囲は、そのようなプロセス、機械、製造、物質の組成物、手段、方法、またはステップをその範囲内に含むことが意図される。

Claims (60)

1. ステロイド受容体コアクチベータ３（ＳＲＣ－３）の破壊を含む、操作された免疫細胞。
2. Ｔ細胞である、請求項１に記載の免疫細胞。
3. 前記Ｔ細胞が制御性Ｔ細胞である、請求項２に記載の免疫細胞。
4. 前記Ｔ細胞がＣＤ４＋である、請求項２または３に記載の免疫細胞。
5. 前記Ｔ細胞がＣＤ２５＋細胞である、請求項２～４のいずれか一項に記載の免疫細胞。
6. 前記Ｔ細胞がＦＯＸＰ３＋細胞である、請求項２～４のいずれか一項に記載の免疫細胞。
7. 前記破壊がさらに、ＳＲＣ－３の発現レベルが低下するように遺伝的に修飾されているか、またはＳＲＣ－３の発現が本質的にない免疫細胞として定義される、請求項１～６のいずれか一項に記載の免疫細胞。
8. １つ以上のガイドＲＮＡおよびＣａｓ９酵素を用いて操作されている、請求項１～７のいずれか一項に記載の免疫細胞。
9. 個体に対して自己由来である、請求項１～８のいずれか一項に記載の免疫細胞。
10. 個体に対して同種異系である、請求項１～８のいずれか一項に記載の免疫細胞。
11. （ａ）請求項１～１０のいずれか一項に記載の免疫細胞と、
    （ｂ）ＳＲＣ－３を標的とする１つ以上の剤と
    を含む組成物。
12. （ａ）と（ｂ）が、異なる製剤形態である、請求項１１に記載の組成物。
13. （ａ）と（ｂ）が、同じ製剤形態である、請求項１１に記載の組成物。
14. ＳＲＣ－３を標的とする前記剤が、小分子阻害剤、抗体、タンパク質、核酸、またはそれらの組合せである、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の組成物。
15. ＳＲＣ－３の前記小分子阻害剤が、ブファリン、ゴシポール、ベルカリンＡ、ＳＩ－２、ＳＩ－１０、ＳＩ－１２、それらの機能性誘導体、またはそれらの組合せである、請求項１４に記載の組成物。
16. 前記抗体が、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、請求項１４または１５に記載の組成物。
17. 前記抗体が、５Ｅ１１、ＬＳ－Ｃ８０１９２９、ＰＡ１－８４５、ＡＸ１５．３、ＰＡ５－２９８５４、ＥＰＲ４３７４（３）、またはそれらの組合せである、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の組成物。
18. 個体において癌を処置する方法であって、前記個体に、請求項１～１０のいずれか一項に記載の細胞の治療有効量を投与する工程を含む方法。
19. 前記癌がＳＲＣ－３＋癌である、請求項１８に記載の方法。
20. 前記癌が、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、前立腺癌、胃癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌、または膵臓癌である、請求項１８または１９に記載の方法。
21. 前記投与工程の前に、前記細胞が、ＳＲＣ－３を標的とする有効量の１つ以上の剤にエクスビボで曝露される、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の方法。
22. ＳＲＣ－３を標的とする前記剤が、小分子阻害剤、抗体、タンパク質、核酸、またはそれらの組合せである、請求項２１に記載の方法。
23. ＳＲＣ－３の前記小分子阻害剤が、ブファリン、ゴシポール、ベルカリンＡ、ＳＩ－２、ＳＩ－１０、ＳＩ－１２、それらの機能性誘導体、それらの組合せである、請求項２２に記載の方法。
24. 前記抗体が、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、請求項２２または２３に記載の方法。
25. 前記抗体が、５Ｅ１１、ＬＳ－Ｃ８０１９２９、ＰＡ１－８４５、ＡＸ１５．３、ＰＡ５－２９８５４、ＥＰＲ４３７４（３）、またはそれらの組合せである、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記個体に、治療有効量の追加の癌治療が施される、請求項１８～２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記追加の癌治療が、外科手術、放射線、化学療法、ホルモン療法、薬物療法、タンパク質療法、免疫療法、またはそれらの組合せを含む、請求項２６に記載の方法。
28. 前記追加の癌治療が、ＳＲＣ－３を標的とする１つ以上の剤を含む、請求項２６または２７に記載の方法。
29. ＳＲＣ－３を標的とする前記剤が、小分子阻害剤、抗体、タンパク質、核酸、またはそれらの組合せである、請求項２８に記載の方法。
30. ＳＲＣ－３の前記小分子阻害剤が、ブファリン、ゴシポール、ベルカリンＡ、ＳＩ－２、ＳＩ－１０、ＳＩ－１２、それらの機能性誘導体、またはそれらの組合せである、請求項２９に記載の方法。
31. 前記抗体が、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、請求項２９または３０に記載の方法。
32. 前記抗体が、５Ｅ１１、ＬＳ－Ｃ８０１９２９、ＰＡ１－８４５、ＡＸ１５．３、ＰＡ５－２９８５４、ＥＰＲ４３７４（３）、またはそれらの組合せである、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の方法。
33. 前記細胞および前記追加の癌治療が、実質的に同時に前記個体に施される、請求項２６～３２のいずれか一項に記載の方法。
34. 前記細胞および前記追加の癌治療が、異なる時点にて前記個体に施される、請求項２６～３２のいずれか一項に記載の方法。
35. 前記細胞と前記追加の癌治療が、同じ製剤形態である、請求項２６～３４のいずれか一項に記載の方法。
36. 前記細胞と前記追加の癌治療が、異なる製剤形態である、請求項２６～３４のいずれか一項に記載の方法。
37. 前記細胞が、静脈内、腹腔内、動脈内、局所、吸入、筋肉内、胸骨内、関節内注射、または注入によって投与される、請求項１８～３６のいずれか一項に記載の方法。
38. 前記細胞が、１回または複数回投与される、請求項１８～３７のいずれか一項に記載の方法。
39. 前記細胞が前記個体に複数回投与される場合、投与間の期間が、１～２４時間、１～７日、１～４週、または１～１２ヶ月以内である、請求項３８に記載の方法。
40. 個体において癌を処置する方法であって、前記個体に、請求項１１～１７のいずれか一項に記載の組成物の治療有効量を投与する工程を含む方法。
41. （ａ）および（ｂ）が、前記個体に、異なる製剤形態で投与される、請求項４０に記載の方法。
42. （ａ）および（ｂ）が、前記個体に、同じ製剤形態で投与される、請求項４０に記載の方法。
43. （ａ）および（ｂ）が、前記個体に、実質的に同時に投与される、請求項４１に記載の方法。
44. （ａ）および（ｂ）が、前記個体に、異なる時点にて投与される、請求項４１に記載の方法。
45. （ａ）および（ｂ）が前記個体に異なる時点にて投与される場合、（ａ）および（ｂ）の投与間の期間が、１～２４時間、１～７日、１～４週、または１～１２ヶ月以内である、請求項４４に記載の方法。
46. 前記組成物が、前記個体に１回または様々な回数投与される、請求項４０～４５のいずれか一項に記載の方法。
47. 前記組成物が前記個体に異なる時点にて投与される場合、投与間の期間が、１～２４時間、１～７日、１～４週、または１～１２ヶ月以内である、請求項４６に記載の方法。
48. 前記癌がＳＲＣ－３＋癌である、請求項４０～４７のいずれか一項に記載の方法。
49. 前記癌が、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、前立腺癌、胃癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌、または膵臓癌である、請求項４０～４８のいずれか一項に記載の方法。
50. 前記投与工程の前に、（ａ）の前記細胞が、ＳＲＣ－３を標的とする有効量の１つ以上の剤にエクスビボで曝露される、請求項４０～４９のいずれか一項に記載の方法。
51. 請求項１～１０のいずれか一項に記載の免疫細胞を生成する方法であって、前記免疫細胞におけるＳＲＣ－３の発現を破壊させる工程を含む方法。
52. 前記免疫細胞がＴ細胞である、請求項５１に記載の方法。
53. 前記免疫細胞がＴｒｅｇである、請求項５１または５２に記載の方法。
54. （ａ）ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔｒｅｇをそれぞれ得て、
    （ｂ）前記ＣＤ４＋Ｔ細胞または前記ＣＤ４＋Ｔｒｅｇをそれぞれ、前記Ｔ細胞または前記Ｔｒｅｇにおける内因性ＳＲＣ－３の発現を破壊させる１つ以上の剤に曝露すること
    とさらに定義される、請求項５２または５３に記載の方法。
55. 前記Ｔ細胞または前記Ｔｒｅｇが、脾臓、骨髄、血液、血漿、またはそれらの組合せから得られる、請求項５４に記載の方法。
56. 前記ＣＤ４＋Ｔ細胞から制御性Ｔ細胞を得る工程をさらに含む、請求項５４または５５に記載の方法。
57. 前記制御性Ｔ細胞が、ＣＤ２５＋および／またはＦｏｘ３ｐ＋である、請求項５６に記載の方法。
58. 前記Ｔ細胞における内因性ＳＲＣ－３の発現を破壊させる前記１つ以上の剤が、核酸を含む、請求項５４～５７のいずれか一項に記載の方法。
59. 前記Ｔ細胞における内因性ＳＲＣ－３の発現を破壊させる前記１つ以上の剤が、ＣＲＩＳＰＲ試薬を含む、請求項５８に記載の方法。
60. 前記免疫細胞を、ＳＲＣ－３を標的とする有効量の１つ以上の剤にエクスビボで曝露する工程をさらに含む、請求項５１～５９のいずれか一項に記載の方法。