KR20230093329A - 암의 치료를 위한 면역조절 치료제로서 면역 세포에서 src-3의 표적화 - Google Patents

암의 치료를 위한 면역조절 치료제로서 면역 세포에서 src-3의 표적화 Download PDF

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Abstract

본원 개시내용은 T 조절 세포와 같은 T 세포를 포함하는 면역 세포에서 SRC-3의 표적화를 포함하는 암 치료와 관련된 방법 및 조성물에 관한 것이다. T 조절 세포에서 SRC-3의 표적화는 특히 포유류에서 종양을 근절시키는데 효과적이다. 특정 경우에, T 조절 세포가 생체외 CRISPR에 적용되어 입양 세포 전달을 위해 적합한 세포를 생성한다. 일부 경우에, SRC-3을 표적화하는 하나 이상의 제제는 또한 개체에게 투여되고/되거나 투여 전 세포에 노출된다.

Description

암의 치료를 위한 면역조절 치료제로서 면역 세포에서 SRC-3의 표적화
[0001] 본 출원은 2020년 10월 28일자로 출원된 미국 가특허 출원 63/106,770에 대한 우선권을 주장하고, 이의 전문이 본원에 참조로 인용된다.
연방 정부 후원 연구 또는 개발에 관한 진술
[0002] 본 발명은 국방부에 의해 허가된 W81XWH-13-1-0285 및 국립보건원에 의해 허가된 HD008188 하에 정부의 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명의 특정 권리를 갖는다.
[0003] 본원의 구현예는 적어도, 암 의학을 비롯한, 세포 생물학, 분자 생물학, 면역학 및 의학 분야에 관한 것이다.
[0004] 스테로이드 수용체 보조활성화인자-3(SRC-3)은 유방암(BC) 증식, 전이 및 표준 및 내분비 기반 암 치료요법에 대한 내성의 주요 동인(driver)으로서 기능한다. 발암 유전자로서 SRC-3는 핵 수용체 및 암 세포 증식 및 전이에 필요한 프로그램을 구동시키는 여러 기타 전사 인자에 대한 다면발현 보조활성화인자로서 작용한다. 중요하게, SRC-3은 또한 숙주 면역계의 조절에 중요한 역할을 수행한다.
[0005] 본원의 개시내용의 특유의 방식으로 SRC-3을 표적화함에 의해 효과적인 치료요법을 제공하는, 당업계의 오랜 염원을 해결한다.
간략한 개요
[0006] 본원의 개시내용은 임의의 종류의 암을 치료하거나, 진행을 지연시키거나, 개시를 지연시키거나, 암에 걸릴 위험을 감소시키기 위한 시스템, 방법 및 조성물에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본원의 개시내용은 이를 필요로 하는 개체에게 투여되는 세포가 (1) 내인성 SRC-3의 발현이 파괴되고/되거나 (2) SRC-3을 표적화하는 하나 이상의 제제에 노출된 면역 세포인, 입양 세포 전달에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 면역 세포는 CD4+인 T 조절 세포(Treg)를 포함하는 CD4+ 세포이다.
[0007] 현재 Treg 표적화 면역 체크포인트 억제제는 다른 면역 세포와의 이들의 세포 표면 상호 작용을 파괴하는 표면 단백질(수용체)에 주로 초점을 맞추고 있다. 본원 개시내용은 Treg 유전자 표적으로서 SRC-3가 Treg 핵 유전자 발현 프로그램을 조절하는 기능을 하는 핵 단백질이기 때문에 이와 구별된다. 전사 마스터 조절인자로서의 역할의 결과로서, 마우스 유전학적 모델에서 SRC-3의 절제는 종양 박멸을 촉진하는 방식으로 Treg 기능을 조절할 수 있는 반면 다른 경우에는 확립된 면역 체크포인트 억제제와 함께 종종 관찰되는 심각한 부작용을 회피할 수 있는 것으로 나타난다. 특정 구현예에서, 본원 개시내용은 유전학적으로 변형된 Treg 세포를 포함하여 면역 세포에서 SRC-3 유전자를 표적화하여 암을 가진 개체로의 입양 전달에 사용될 CRISPR 기반 접근법에 관한 것이다. 따라서, 본원 개시내용은 면역계 기반 종양 박멸을 지원하는 특유의 방식을 제공한다.
[0008] 하나의 구현예에서, 스테로이드 수용체 보조활성화인자-3(SRC-3)의 파괴를 포함하는 가공된 면역 세포가 있다. 특정 구현예에서, 면역 세포는 T 세포, 예를 들어, T 조절 세포이다. T 세포는 CD4+, CD25+, 및/또는 FOXP3+일 수 있다. 특정 구현예에서, 파괴는 감소된 수준의 SRC-3 발현을 갖거나 본질적으로 SRC-3 발현을 갖지 않도록 유전학적으로 변형된 면역 세포로서 추가로 정의된다. 특정 경우에, 면역 세포는 하나 이상의 가이드 RNA 및 Cas9 효소를 사용하여 가공된다. 면역 세포는 개체에 대해 자가, 동종이계 또는 동계일 수 있다.
[0009] 특정 구현예에서, 하기를 포함하는 조성물이 있다: (a) 본원에 포함된 임의의 면역 세포; 및 (b) SRC-3을 표적화하는 하나 이상의 제제. 일부 경우에, (a) 및 (b)는 상이한 제형 중에 있지만 이들은 동일한 제형에 있을 수 있다. 특정 구현예에서, SRC-3을 표적화하는 제제는 소분자 억제제, 항체, 단백질, 핵산 또는 이들의 조합이다. SRC-3의 소분자 억제제는 버팔린(Bufalin), 고시폴(gossypol), 베루카린 (Verrucarin) A, SI-2, SI-10, SI-12, 이들의 기능적 유도체 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체일 수 있고, 구체적인 예는 5E11, LS-C801929, PA1-845, AX15.3, PA5-29854, EPR4374(3) 또는 이들의 조합을 포함한다.
[0010] 하나의 구현예에서, 개체에게 치료학적 유효량의 본원에 포함된 임의의 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 암을 치료하는 방법이 있다. 암은 SRC-3+ 암일 수 있다. 암은 유방암, 난소암, 자궁내막암, 전립선암, 위암, 다발성 골수종, 갑상선암 또는 췌장암일 수 있다.
[0011] 일부 경우에, 투여 단계 이전에, 소분자 억제제(버팔린, 고시폴, 베루카린 A, SI-2, SI-10, SI-12, 이의 기능적 유도체, 이의 조합), 항체(모노클로날 항체 또는 폴리클로날 또는 scFv와 같은 단편), 단백질, 핵산 또는 이의 조합과 같이 SRC-3을 표적화하는 유효량의 하나 이상의 제제에 생체외 노출된다. 특이적 항체는 5E11, LS-C801929, PA1-845, AX15.3, PA5-29854, EPR4374(3), 또는 이의 조합을 포함한다. 일부 경우에 수술, 조사, 화학치료요법, 호르몬 치료요법, 약물 치료요법, 단백질 치료요법, 면역 치료요법 또는 이들의 조합과 같은 추가 암 치료요법의 치료학적 유효량을 개체에게 투여한다. 추가 암 치료요법은 SRC-3을 표적화하는 하나 이상의 제제를 포함할 수 있다. 세포 및 추가적인 암 치료요법은 실질적으로 동시에 또는 상이한 시점에 개체에게 투여될 수 있다. 세포 및 추가 암 치료요법은 동일한 제형 중에 있을 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 세포는 정맥내, 복강내, 동맥내, 국소, 흡입, 근육내, 흉골내, 관절내 주사 또는 주입에 의해 투여될 수 있다. 상기 세포는 1회 또는 수회 투여될 수 있고, 이들이 수회 투여되는 경우 투여 간격은 1-24시간, 1-7일, 1-4주 또는 1-12개월 이내이다.
[0012] 하나의 구현예에서, 개체에서 암을 치료하는 방법이 있고, 상기 방법은 (a) 본원에 포함된 임의의 면역 세포; 및 (b) SRC-3을 표적화하는 하나 이상의 제제를 포함하는 것을 포함하는, 본원에 포함된 치료학적 유효량의 임의의 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 경우에, (a) 및 (b)는 상이한 제형으로 및/또는 동시에 또는 상이한 시점에 개체에게 투여되거나 투여되지 않을 수 있다. 상이한 시점에 투여되는 경우, (a)와 (b)의 투여 간격은 1-24 시간, 1-7일, 1-4주, 또는 1-12개월 이내일 수 있다. 상기 조성물은 1회 또는 수회 투여될 수 있고, 조성물이 수회 개체에게 투여되는 경우 투여 간격은 1-24시간, 1-7일, 1-4주 또는 1-12개월 이내이다. 암은 SRC-3+일 수 있다. 암은 유방암, 난소암, 자궁내막암, 전립선암, 위암, 다발성 골수종, 갑상선암 또는 췌장암일 수 있다. 특정 경우에, 투여 단계 전에, (a)의 세포는 SRC-3을 표적화하는 유효량의 하나 이상의 제제에 생체외 노출된다.
[0013] 하나의 구현예에서, 면역 세포에서 SRC-3의 발현을 파괴하는 단계를 포함하는, 본원에 포함된 임의의 면역 세포를 생성하는 방법이 있다.
[0014] 면역 세포는 Treg를 포함하는 T 세포일 수 있다. 특정 경우에, 방법은 추가로 하기와 같이 정의된다: (a) CD4+ T 세포 또는 CD4+ Treg를 각각 수득하는 단계; 및 (b) CD4+ T 세포 또는 CD4+ Treg 각각을 T 세포 또는 Treg 각각에서 내인성 SRC-3의 발현을 파괴하는 하나 이상의 제제에 노출시키는 단계. 특정 구현예에서, T 세포 또는 Treg는 비장, 골수, 혈액, 혈장 또는 이들의 조합으로부터 수득된다. 상기 방법은 CD4+ T 세포로부터 T 조절 세포를 수득하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 특정 경우에 T 조절 세포는 CD25+ 및/또는 Fox3p+이다. 특정 경우에, T 세포에서 내인성 SRC-3의 발현을 파괴하는 하나 이상의 제제는 핵산을 포함한다. 특정 양상에서, T 세포에서 내인성 SRC-3의 발현을 파괴하는 하나 이상의 제제는 CRISPR 시약을 포함한다. 방법은 면역 세포를 SRC-3을 표적화하는 유효량의 하나 이상의 제제에 생체외 노출시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
[0015] 상기한 내용은, 후술하는 본 발명의 상세한 설명이 보다 잘 이해될 수 있도록, 본 발명의 특징 및 기술적 이점을 다소 광범위하게 개략적으로 기재하였다. 본원의 청구항들의 주제를 형성하는 추가적인 특징 및 이점이 이하에서 기재될 것이다. 당해 분야의 통상의 기술자는, 개시되는 개념 및 구체적인 구현예가 본 발명의 디자인과 동일한 목적을 수행하기 위한 다른 구조를 변형 또는 디자인하기 위한 기초로서 용이하게 이용될 수 있다는 것을 인지해야 한다. 또한, 당해 분야의 통상의 기술자는, 이러한 균등한 구성이 첨부된 청구항들에 제시된 바와 같은 취지 및 범위를 벗어나지 않는다는 것을 이해해야 한다. 추가의 목적 및 이점과 함께 그 구성 및 조작 방법 모두에 대하여 본 발명의 특징인 것으로 간주되는 신규한 특징은 첨부된 도면과 관련하여 고려될 때 하기의 설명으로부터 더 잘 이해될 것이다. 그러나, 각 도면은 예시 및 설명의 목적으로 만 제공되며 본원 개시내용의 범위의 정의로서 의도되지 않는다는 것을 명백하게 이해해야 한다.
[0016] 본원 개시내용을 보다 완전하게 이해하기 위해, 이하에서는 첨부된 도면과 관련하여 주어진 하기 설명을 참조한다.
[0017] 도 1: Src-3 유전자 녹아웃(KO) 마우스의 포괄적인 면역표현형 분석은 광범위한 림프구 증가증을 밝힌다. 노화(16-20개월)된 Src-3 KO 마우스 (-/-, n=6) 및 야생형 한배새끼(+/+, n=7)로부터의 말초 혈액의 면역표현형 분석. SRC-3 녹아웃 마우스에서 특정 서브타입뿐만 아니라 T 및 B 세포의 상당한 상승이 있었다. 과립구, 단핵구, 호산구, 대식세포, 수지상 및 NK 세포에서 통계적으로 유의한 차이는 없었다(데이터는 나타내지 않음).
[0018] 도 2a-2b: SRC-3 발현은 고도로 풍부해지고 조절 T 세포 (Treg)에서의 Foxp3과 상관관계가 있다. 도 2a. BioGPS 게놈 플랫폼에서 선택된 조직 기원의 Ncoa3 (Src-3) 프로브 강도(사용되는 2개의 프로브)의 대표적인 플롯이고(10), 이는 Src-3이 T 세포 계열에서 고도로 발현되고, Foxp3+ CD4+ T 세포 (Treg)에서 최고로 발현됨을 보여준다. 도 2b. 일괄 수정(batch-corrected) 공동 발현 데이터베이스인 임뮤노-네비게이터(Immuno-Navigator)를 사용하여 수행된 Treg에서 Foxp3 발현과 296개의 NURSA 선별 보조조절인자의 상관 관계. Ncoa3은 Treg에서 Foxp3 발현과 강한 상관관계가 있다.
[0019] 도 3a-3b: SRC-3은 사람 Treg에서 FOXP3 발현을 조절한다. 도 3a. 사람 Treg(건강한 공여자로부터)에서 SRC-3의 사일런싱은 Treg 마커 유전자 및 면역 체크포인트 매개인자의 mRNA 발현을 감소시킨다. 공여자 Treg는 루시퍼라제(shLuc) 또는 SRC-3에 대해 지시된 shRNA를 발현하는 렌티바이러스 벡터로 감염되었고 mRNA 수준은 RT-qPCR로 측정하였다. 도 3b. SRC-3은 FOXP3 프로모터 기능을 자극할 수 있다. SRC-3는 일시적인 형질감염 검정에서 FoxP3 프로모터 구동 리포터 활성을 공동 활성화시킨다. 293T 세포를 FoxP3 프로모터 루시퍼라제 리포터(GR Lee lab로부터의 기증, Hwang et al 2016, Nat. Commun.) 및 증가하는 농도의 SRC-3 발현 플라스미드로 형질감염시켰다.
[0020] 도 4a-4c: E0771 BC 종양은 Foxp3 발현 Treg 세포에서 SRC-3이 특이적으로 결실된 유전학적으로 가공된 마우스 모델에서 박멸된다. 도 4a. 플록스된(Floxed) SRC-3 마우스는 10세대에 걸쳐 C57BL/6J 배경으로 역교배하였고 또한 C57BL/6J 배경에서 Foxp3-EGFP/CRE/ERT2 녹인 마우스와 교배하였다. 타목시펜으로 치료하면 Cre가 활성화되고 SRC-3 유전자의 엑손 11 및 12가 절단된다. 도 4b C57BL/6J 대조군 마우스와 Treg:SRC-KO 마우스를 5일 동안 타목시펜으로 치료한 다음 추가 3주 후에 1x106 루시퍼라제 발현 E0771 BC 종양 세포를 제거된 유방 지방 패드에 주사하였다. 도 4c 종양 용적은 32일 기간 (좌측) 동안 측정하였다. 연구 결론에서 종양 및 비장의 이미지는 우측에 나타낸다.
[0021] 도 5: SRC-3 유전자의 CRISPR 기반 표적화 후 벌크 T 림프구에서 SRC-3(NcoA3) mRNA의 정량. 하기의 프라이머는 상기 수행된 RT-qPCR 검정을 위해 사용하였다. NCoA3 프라이머 (프로브 103): 좌측: AAG ACT CTT TAG GAC CGC TTT TAC T (서열번호 1). 우측: ACA CTG CGC CAT GGT TAA T (서열번호 2). GAPDH 프라이머 (프로브 52): 좌측: GGG TTC CTA TAA ATA CGG ACT GC (서열번호 3). 우측: CCA TTT TGT CTA CGG GAC GA (서열번호 4). (PE-) - 비-표적화된 세포; (PE+) SRC-3 유전자 표적화된 세포.
[0022] 도 6: 입양 SRC-3 KO Treg 마우스 종양 모델의 실험 디자인.
[0023] 도 7a-7b: SRC-3 KO Treg 세포의 입양 전달은 E0771 종양을 제거한다. 도 7a. 루시퍼라제 표지된 유선 암종 E0771 종양 세포를 야생형 C57BL/6 마우스의 제거된 지방 패드에 이식하였다. 이후, 동물(실험 그룹 당 2마리)에는 SRC-3 KO Treg, 대조군 (Cont) Treg를 주사하거나, Treg를 주사하지 않고(ACT 부재, 야생형 세포에 상응하는) 종양 성장은 루시퍼라제 종양 이미지화를 통해 모니터링하였다. SRC-3KO Treg를 투여받은 동물에서 종양의 제거는 화살표로 표시한다. 종양 루시퍼라제 이미지화 정량은 도 7b에 나타낸다.
I. 정의의 예시
[0001] 오랫동안 유지되어 온 특허법 협약에 따라, 청구항을 비롯하여 본 명세서에서 단어 "포함하는"과 협력하여 사용될 때의 단수 형태의 단어는 "하나 이상"을 의미한다. 본원 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태 “a,” “an,” 및 “the”는 상기 문단이 달리 명백하게 지적되지 않은 경우 복수에 대한 언급을 포함한다. 예를 들어, 용어 “핵산”은 이의 혼합물을 포함하는 다수의 핵산을 포함한다. 본원 개시내용의 일부 구현예는 본원 개시내용의 하나 이상의 요소, 방법 단계 및/또는 방법으로 이루어지거나 필수적으로 이루어질 수 있다. 본원에 기재된 임의의 방법 또는 조성물은 본원에 기재된 임의의 다른 방법 또는 조성물에 대해 실시될 수 있고, 상이한 구현예가 조합될 수 있는 것으로 고려된다.
[0002] 본원 명세서 전반에 걸쳐, 문맥상 달리 요구하지 않는 경우, “포함한다(comprise)”, “포함한다(comprises)” 및 “포함하는(comprising)”이라는 용어는 언급된 단계 또는 요소, 또는 단계 또는 요소 그룹을 포함하지만 임의의 다른 단계 또는 요소 또는 단계 또는 요소의 그룹을 배제하지는 않음을 의미하는 것으로 이해될 것이다. “로 이루어진”은 “로 이루어진”에 이어지는 무엇이든 포함하지만 이에 제한됨을 의미한다. 따라서, 용어 “로 이루어진”은 열거된 요소들이 요구되거나 의무적이고 어떠한 다른 요소들이 존재하지 않을 수 있음을 지적한다. “필수적으로 이루어진”은 용어 후 열거되고 열거된 요소들에 대해 본원 개시내용에 특정된 활성 또는 작용을 파괴하지 않거나 이에 기여하지 않는 다른 요소로 제한된 임의의 요소를 포함함을 의미한다. 따라서, 용어 “필수적으로 이루어진”은 열거된 요소들이 요구되거나 의무적이지만 어떠한 다른 요소들은 임의의적이지 않고 열거된 요소들의 활성 또는 작용에 영향을 미치는지 또는 미치지 않은지의 여부에 의존하여 존재하거나 존재하지 않을 수 있음을 지적한다.
[0003] 본원에 사용된 바와 같은 용어 “또는” 및 “및/또는”을 사용하여 조합하여 또는 서로 배타적으로 다수의 성분들을 기재한다. 예를 들어, “x, y, 및/또는 z”는 “x” 단독, “y” 단독, “z” 단독, “x, y, 및 z,” “(x 및 y) 또는 z,” “x 또는 (y 및 z),” 또는 “x 또는 y 또는 z”을 언급할 수 있다. 이것은 구체적으로 x, y, 또는 z가 하나의 구현예로부터 배제될 수 있는 것으로 고려된다.
[0004] 본원 전반에 걸쳐, 용어 "약"은 값이 값을 결정하는데 이용되는 장치 또는 방법에 대한 오차의 표준 편차를 포함한다는 것을 명시하기 위해 세포 및 분자 생물학 분야에서 이의 명백하고 통상적인 의미에 따라 사용된다.
[0005] 본원 명세서 전반에 걸쳐 “하나의 구현예”, “구현예”, “특정 구현예”, “관련 구현예”, “특정 구현예”, “추가의 구현예” 또는 “추가의 구현예” 또는 이의 조합에 대한 언급은 상기 구현예와 관련하여 기재된 특정 특성, 구조 또는 특징이 본원 개시내용의 적어도 하나의 구현예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본원 명세서의 다양한 위치에서 이전의 문장의 출현은 모두 동일한 구현예를 필수적으로 언급하지는 않는다. 추가로, 특정 특성, 구조 또는 특징은 하나 이상의 구현예에서 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다.
[0006] 본원에 사용된 바와 같은, 유전자의 "파괴” 또는 “변경”은 변경 부재하에 유전자 생성물의 발현 수준과 비교하여, 세포에서 대상체 유전자에 의해 암호화된 하나 이상의 유전자 생성물의 발현의 제거 또는 감소를 언급한다. 예시적인 유전자 생성물은 유전자에 의해 암호화된 mRNA 및 단백질 생성물을 포함한다. 일부 경우에 변경은 일시적이거나 가역적이고 다른 경우에 영구적이다. 일부 경우에 변경은 절단된 또는 비-기능성 생성물이 생성될 수 있다는 사실에도 불구하고 기능성 또는 전장 단백질 또는 mRNA에 대한 것이다. 본원에서 일부 구현예에서, 발현과는 반대로 유전자 활성 또는 기능은 파괴된다. 유전자 파괴 또는 변경은 일반적으로 인공 방법에 의해, 즉, 화합물, 분자, 복합체 또는 조성물의 첨가 또는 유도에 의해 및/또는 DNA 수준에서와 같이 유전자의 핵산 또는 이와 연관된 핵산의 변경에 의해 유도된다. 유전자 변경을 위한 예시적 방법은 유전자 사일런싱, 녹다운, 녹아웃, 및/또는 유전자 편집과 같은 유전자 변경 기술을 포함한다. 이의 예는 안티센스 기술, 예를 들어, 일반적으로 발현의 일시적 감소를 유도하는, RNAi, siRNA, shRNA, 및/또는 리보자임과 같은 안티센스 기술, 및 예를 들어, 절단 유도 및/또는 상동성 재조합에 의한 표적화된 유전자 불활성화 또는 변경을 유도하는 유전자 편집 기술을 포함한다. 이의 예는 삽입, 돌연변이 및/또는 결실을 포함한다. 상기 파괴 또는 변경은 전형적으로 유전자에 의해 암호화된 정상 또는 “야생형” 생성물 발현의 억제 및/또는 완전한 부재를 유도한다. 상기 유전자 파괴 또는 변경의 예는 삽입, 프레임 전환(frameshift) 및 미스센스 돌연변이, 전체 유전자의 결실을 포함하는, 유전자 또는 유전자 일부의 결실, 녹인 (knock-in) 및 녹아웃(knock-out)이다. 상기 변경은 암호화 영역에서, 예를 들어, 하나 이상의 엑손에서 발생하여 예를 들어, 정진 코돈의 삽입에 의한 것과 같이 전장 생성물, 기능성 생성물 또는 임의의 생성물을 생성하지 못하는 무능력을 유도할 수 있다. 이러한 변경은 유전자의 전사를 방지하기 위해 프로모터 또는 인핸서 또는 전사의 활성화에 영향을 미치는 다른 영역의 변경에 의해 발생할 수도 있다. 유전자 파괴 또는 변경은 상동성 재조합에 의한 표적화된 유전자 불활성화를 포함하는, 유전자 표적화를 포함한다.
[0007] 본원에 사용된 바와 같은, "약제학적으로 허용되는 담체"는 당업자에게 공지된 바와 같이, 임의의 및 모든 수성 용매(예를 들어, 물, 알콜/수용액, 식염수 용액, 비경구 비히클, 예를 들어, 염화나트륨, 링거 덱스트로스 등), 비-수성 용매(예를 들어, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예를 들어, 에틸올레에이트), 분산 매질, 코팅, 계면활성제, 항산화제, 보존제(예를 들어, 항세균 또는 항진균 제제, 항-산화물, 킬레이팅 제제 및 불활성 가스), 등장성 제제, 흡수 지연제, 염, 약물, 약물 안정화제, 겔, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 향제, 염료, 유체 및 영양물 보충제, 상기 유사 물질 및 이의 조합물을 포함한다. 약제학적 조성물 중 다양한 성분들의 pH 및 정확한 농도는 널리 공지된 파라미터에 따라 조정된다.
[0008] 본원에 사용된 바와 같은 용어 “대상체”는 일반적으로 치료를 필요로 하는 개체를 지칭한다. 대상체는 포유류, 예를 들어, 사람, 연구 동물(예를 들어, 영장류, 래트, 마우스, 토끼), 가축(예를 들어, 소, 양, 염소, 돼지, 칠면조 및 닭), 가정용 애완동물(예를 들어, 개, 고양이 및 설치류), 말 및 유전자전이 비-사람 동물을 포함하는 방법 또는 재료의 대상인 임의의 동물 대상체일 수 있다. 대상체는 환자일 수 있고, 예를 들어, 하나 이상의 암과 같은 질환 (의학적 병태로서 언급될 수 있는)을 가질 수 있거나 갖는 것으로 의심될 수 있다. 대상체는 치료를 받고 있는 중이거나 암 치료를 받은 대상체일 수 있다. 용어 “개체”는 적어도 일부 구현예에 상호교환적으로 사용될 수 있다. “대상체” 또는 "개체”는 본원에 사용된 바와 같이 의학 시설에 거주하거나 거주하지 않을 수 있고 의학 설비의 외래 환자로서 치료될 수 있다. 개체는 인터넷을 통해 하나 이상의 의학적 조성물을 투여받을 수 있다. 개체는 임의의 연령의 사람 또는 비-사람 동물을 포함할 수 있고, 따라서 성인 및 청소년(예를 들어, 어린이) 둘다 및 유아를 포함하고, 자궁내 개체를 포함한다. 개체는 어떤 성별이나 인종 또는 민족일 수 있다.
[0009] 질환 또는 병태의 “치료하는" 또는 치료는 암을 포함하는, 질환의 징후 또는 증상을 완화시키는 노력에서 하나 이상의 약물을 환자에게 투여함을 포함할 수 있는 프로토콜을 실행함을 지칭한다. 바람직할 수 있는 치료 효과는 질환 진행율의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 차도 또는 개선된 예후를 포함한다. 완화는 이들의 출현 후 뿐만 아니라 질환 또는 병태의 징후 또는 증상 출현 전에 일어날 수 있다. 따라서, "치료하는" 또는 "치료"는 질환 또는 목적하지 않을 수 있는 병태를 “예방하는” 또는 이의 “예방”을 포함할 수 있다. 추가로, "치료하는" 또는 "치료"는 징후 또는 증상의 완전한 완화를 요구하지 않고, 치유를 요구하지 않으며 구체적으로 환자에 대해 단지 미진한 효과를 갖는 프로토콜을 포함한다.
[0010] 본원 전반에 걸쳐 사용된 바와 같은 용어 "치료학적 이득" 또는 "치료학적 유효량"은 상기 병태의 의학적 치료와 관련하여 대상체의 웰빙을 촉진시키거나 증진시키는 어떠한 것을 언급한다. 이것은 질환의 징후 또는 증상의 빈도 또는 중증도에서의 감소를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 암의 치료는 종양 크기에서의 감소, 종양 공격성에서의 감소, 암 성장율에서의 감소, 전이의 예방 또는 전이 개시 지연을 포함할 수 있다. 암의 치료는 또한 암을 갖는 대상체의 생존을 지연시키는 것을 언급할 수 있다.
II. 본원 개시내용의 구현예
[0011] 본원 개시내용은 치료받는 개체에 대한 심각한 영향을 회피하는 암 치료요법을 포함하는 효과적인 암 치료요법을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 치료요법은 생체외 방식을 포함하는 면역 세포의 변형, 및 암을 앓는 개체에게 변형된 면역 세포의 투여를 포함한다. 특정 구현예에서 면역 세포는 Treg와 같은 특정 유형의 T 세포이고, 이들의 변형은 Treg의 표준 기능이 해로운 영향을 받지 않도록 한다.
[0012] 본원 개시내용의 특정 구현예는 적어도 Treg를 포함하는 면역 세포에서 주요 표적으로서 SRC-3을 포함한다. Treg와 관련하여, 특정 구획-특이적 파괴는 본원에 나타낸 바와 같이 적어도 유방암 동계 종양 모델에서 종양 박멸을 유도한다. 다른 면역 체크포인트 억제제와 Treg에서 SRC-3를 파괴하는 본원 전략을 구별하는 주요 차이점은 SRC3가 핵 단백질이고, 본원 개시내용에서의 변형이 Treg에 대한 모든 활성을 잃지 않고, 다른 경우에는 심각한 부작용을 유도할 수 있는 Treg의 기능을 조절한다는 점이다. 추가로, 본원 개시내용은 CRISPR 기반 유전자 표적화를 사용하여 T 세포에서 SRC3을 생체외에서 특이적으로 제거하는 접근법을 확립한다. 사람 CD4+ 림프구에 적용되는 특정 구현예에서, 예를 들어, 본원의 개시내용은 암의 치료를 위한 입양 T 세포/Treg 기반 치료제에 대한 방법을 제공한다.
III. 면역 세포
[0013] 본원 개시내용에서, 면역 세포는 내인성 SRC-3의 발현을 파괴하도록 변형되어 세포가 세포에 대한 수용자 개체에서 암을 치료하는 데 효과적일 수 있게 한다. 면역 세포는 임의의 종류일 수 있지만, 특정 구현예에서 이들은 적어도 Treg 및 B 세포를 포함하는 임의의 종류의 T 세포이다.
[0014] 본원 개시내용의 구현예는 Treg를 포함하는 T 세포의 변형을 포함하고, 여기서 변형은 여전히 T 세포가 이들의 목적하는 기능을 수행할 수 있게 한다(Treg의 경우, 자기 및 외부 입자(항원)에 대한 면역 반응을 제어하기 위해). 따라서, 본원에 포함된 방법 및 조성물은 변형된 T 조절 세포를 포함하는 변형된 T 세포를 사용한 다른 치료요법과 비교하여 감소된 독성 위험을 갖는 암 치료요법을 제공한다.
[0015] 임의의 유형의 T 세포가 본원 개시내용의 방법 및 조성물에 사용될 수 있다. 용어 “T 세포”는 T 림프구를 지칭하고 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, γ:δ+ T 세포, 또는 NK T 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. CD4+ T 세포는 조절 T 세포 (Treg) 뿐만 아니라 TH0, TH1 및 TH2 세포를 포함한다. 적어도 3개 유형의 조절 T 세포가 있다: CD4+ CD25+ Treg, CD25 TH3 Treg, 및 CD25 TR1 Treg. “세포독성 T 세포”는 또 다른 세포를 사멸시킬 수 있는 T 세포를 지칭한다. 대다수의 세포독성 T 세포는 CD8+ MHC 부류 I-제한된 T 세포이지만 일부 세포독성 T 세포는 CD4+이다. 특정 구현예에서, 본원 개시내용의 T 세포는 CD4+이다.
[0016] 본원에서 사용되는 임의의 T 세포는 하나 이상의 특정 마커에 대해 선택될 수 있고/있거나 하나 이상의 특정 마커에 대해 선택될 수 있다. 임의의 선택 단계는 양성 선택 또는 음성 선택 또는 둘다에 의해 수행할 수 있다. 특정 구현예에서, Treg는 CD4+, CD25+ 및 FOXP3+이다. 특정 경우에, Treg는 CD4+, CD25+, 및 FOXP3+이다. 일부 구현예에서, Treg는 CTL-관련 단백질 4(CTLA4)+, C-C 케모킨 수용체 유형 7(CCR7)+ 및/또는 CD62 항원 리간드(CD62L)+이다. 또한 본원에서는 SRC-3 유전자의 파괴를 통해 이후에 FOXP3, CD25 및/또는 CD4+ 발현을 중단하는 Treg가 포함된다.
[0017] 일부 구현예에서, CD4+ T 세포를 포함하는 CD4+ 면역 세포는 SRC-3의 발현을 파괴하기 위해 본원 개시내용의 방법 및 조성물로 표적화되며, 적어도 일부 경우에 Treg는 치료학적 세포로 사용하기 위해 이로부터 추가로 선택될 수 있다. 대안적인 경우에, Treg를 단리하는 추가 단계 없이 다양한 CD4+ 세포가 변형되고 총체적으로 치료학적 세포로 사용된다.
[0018] T 세포가 사용되는 경우, T 세포의 공급원은 비장, 골수, 혈액, 혈장 또는 이들의 조합을 포함하는 임의의 적합한 공급원일 수 있다. 일부 경우에, T 세포는 상업적으로 수득된다. 임의의 경우에, T 세포는 수용자 개체에 대해 자가일 수 있거나 수용자 개체에 대해 동종이계 또는 동계일 수 있다. T 세포는 SRC-3의 파괴를 갖도록 세포를 가공하는 단계 전에 조작될 수 있다. 일부 경우에, 세포는 예를 들어, 목적하지 않은 성분을 제거하기 위해 공급원으로부터 가공된다. 세포는 SRC-3을 표적화하는 하나 이상의 제제, 또는 하나 이상의 사이토킨 및/또는 하나 이상의 성장 인자와 같은 다른 조성물과 같이, 본원에서 사용 전에 개체에서 이의 활성을 증진시키는 하나 이상의 조성물에 노출될 수 있다. 세포는 SRC-3의 발현을 파괴하기 위한 변형 단계 전, 도중 및/또는 이후에 SRC-3을 표적화하는 하나 이상의 제제에 노출될 수 있다.
IV. 유전자 발현의 변형
[0019] 특정 구현예에서, 본원 개시내용의 면역 세포는 변형되어 SRC-3의 발현이 변경되고, 이러한 세포의 가공은 임의의 적합한 방법에 의해 수행할 수 있다. 가공된 세포는 유전학적으로 변형되어 세포에서 내인성 SRC-3의 발현이 부재이거나 감소된 발현을 갖는다. 발현은 당업계 표준 방법에 의해 검출될 수 없는 수준까지 감소될 수 있다.
[0020] 일부 구현예에서, 변화된 유전자 발현은 유전자 내 파괴, 예를 들어, 녹 아웃, 삽입. 미스센스 또는 프레임 전환 돌연변이, 예를 들어, 양대립형질 프레임 전환 돌연변이, 유전자 전부 또는 일부, 예를 들어, 하나 이상의 엑손 또는 이의 일부의 결실 및/또는 녹 인을 수행함에 의해 수행된다. 예를 들어, 변화된 유전자 발현은 DNA-결합 표적화된 뉴클레아제, 예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN) 및 전사 활성화인자 유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 및 RNA-가이드된 뉴클레아제, 예를 들어, CRlSPR-연합된 뉴클레아제 (Cas)를 포함하고, SRC-3 유전자 또는 이의 일부의 서열에 표적화되도록 특이적으로 디자인된 서열 특이적 또는 표적화된 뉴클레아제에 의해 수행될 수 있다.
[0021] 일부 구현예에서, 유전자의 발현, 활성 및/또는 기능의 변경은 유전자를 파괴함에 의해 수행된다. 일부 양상에서, 유전자는 이의 발현이 유전자 변형의 부재 또는 변형을 수행하기 위해 도입된 성분들의 부재하의 발현과 비교하여 적어도 또는 약 20, 30, 또는 40%, 일반적으로 적어도 또는 약 50, 60, 70, 80, 90, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상까지 감소되도록 변형된다.
[0022] 일부 구현예에서, 상기 변경은 유전자의 발현이 후기 시점에 회복되도록 일시적이거나 가역적이다. 다른 구현예에서, 상기 변경은 가역적이거나 일시적이지 않고, 예를 들어, 영구적이다.
[0023] 일부 구현예에서, 유전자 변경은 전형적으로 표적화된 방식으로 SRC-3 유전자 내 하나 이상의 이중 가닥 절단 및/또는 하나 이상의 단일 가닥 절단의 유도에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 이중 가닥 또는 단일 가닥 절단은 뉴클레아제, 예를 들어, 엔도뉴클레아제, 예를 들어, 유전자-표적화된 뉴클레아제에 의해 수행된다. 일부 양상에서, 상기 절단은 유전자의 암호화 영역 내, 예를 들어, SRC-3 엑손내 유도된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 상기 유도는 SRC-3 암호화 영역의 N-말단 부위 부근에서, 예를 들어, 제1 엑손 내, 제2 엑손 내 또는 후속 엑손 내에서 일어난다.
[0024] 일부 양상에서, 이중 가닥 또는 단일 가닥 파열은 예를 들어, 비-상동성 말단-접합 (NHEJ) 또는 상동성-지시된 복구(HDR)에 의해 세포성 복구 공정을 통해 복구를 진행한다. 일부 양상에서, 상기 복구 공정은 오류 발생 성향이고, SRC-3 유전자의 완전한 녹아웃을 유도할 수 있는, 프레임 전환 돌연변이, 예를 들어, 양대립유전자 프레임 전환 돌연변이와 같은 유전자의 파괴를 유도한다. 예를 들어, 일부 양상에서, 상기 파괴는 결실, 돌연변이 및/또는 삽입을 유도함을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 파괴는 조기 정지 코돈의 존재를 유도한다. 일부 양상에서, 삽입, 결실, 전좌, 프레임전환 돌연변이 및/또는 미성숙한 중지 코돈의 존재는 유전자의 발현, 활성 및/또는 기능의 파괴를 유도한다.
[0025] SRC-3의 발현을 파괴하는 임의의 제제(들)는 Treg를 포함하는 임의의 종류의 T 세포를 포함하는 면역 세포와 같은 수용자 세포에 적합한 임의의 방식으로 전달될 수 있다. 특정 구현예에서, 제제(들)은 임의의 종류의 핵감염, 리포펙틴, 임의의 종류의 전기천공, 양이온성 중합체, 비-바이러스 벡터(플라스미드와 같은), 바이러스 벡터(아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 아데노 관련 바이러스 벡터 포함), 시클로아밀로스 기반 담체, 임의의 종류의 나노입자(PLGA/PLA 또는 DODAP 기반을 사용하여 생성된 금속성 또는 무기성 또는 중합체 나노입자 포함), 리포폴리플렉스 등에 의해 전달될 수 있다.
[0026] 일부 구현예에서, 유전자 변경은 예를 들어, RNA 간섭 (RNAi), 짧은 간섭 RNA (siRNA), 짧은 헤어핀 (shRNA)에 의한 안티센스 기술 및/또는 유전자의 발현을 선택적으로 서프레싱 또는 리프레싱하기 위해 사용되는 리보자임을 사용하여 성취된다. siRNA 기술은 유전자로부터 전사되는 mRNA의 뉴클레오타이드 서열과 상동성인 서열 및 상기 뉴클레오타이드 서열과 상보적인 서열을 갖는 이중 가닥 RNA 분자를 사용하는 RNAi이다. siRNA는 일반적으로 유전자로부터 전사되는 mRNA의 하나의 영역과 상동성/상보성이거나 상이한 영역과 상동성/상보성인 다수의 RNA 분자를 포함하는 siRNA일 수 있다. 일부 양상에서, siRNA는 폴리시스트론성 작제물에 포함된다.
[0027] SRC-3의 발현이 파괴되도록 세포를 변형시키기 위한 예는 다음과 같다:
A. ZFP 및 ZFN
[0028] 일부 구현예에서, SRC-3을 표적화하는 DNA-표적화 분자는 엔도뉴클레아제와 같은 이펙터 단백질에 융합된 하나 이상의 아연 핑거 단백질 (ZFP) 또는 전사 활성화인자-유사 단백질 (TAL)과 같은 DNA-결합 단백질을 포함한다. 예는 ZFN, TALE, 및 TALEN을 포함한다.
[0029] 일부 구현예에서, DNA-표적화 분자는 하나 이상의 아연-핑거 단백질 (ZFP) 또는 서열-특이적 방식으로 DNA에 결합하는 이의 도메인을 포함한다. ZFP 또는 이의 도메인은 이의 구조가 아연 이온의 배위를 통해 안정화되는 결합 도메인 내 아미노산 서열 영역인, 하나 이상의 아연 핑거를 통해 서열-특이적 방식으로 DNA에 결합하는 대형 단백질 내 단백질 또는 도메인이다. 용어 아연 핑거 DNA 결합 단백질은 흔히 아연 핑거 단백질 또는 ZFP로서 축약된다. ZFP 중에는 개별 핑거의 어셈블리에 의해 생성되는 전형적으로 9 내지 18개 뉴클레오타이드 길이의 특이적 DNA 서열을 표적화하는 인공 ZFP 도메인이 있다.
[0030] ZFP는 단일 핑거 도메인이 대략 30개 아미노산 길이이고 단일 베터 턴의 2개 시스테인과 함께 아연을 통해 배위된 2개의 영구 히스티딘 잔기를 함유하고 2, 3, 4, 5 또는 6개 핑거를 갖는 알파 나선을 함유하는 것들을 포함한다. 일반적으로, ZFP의 서열-특이성은 아연 핑거 인지 나선 상에 4개의 나선 위치 (-1, 2, 3 및 6)에서 아미노산을 치환함에 의해 변경될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, ZFP 또는 ZFP-함유 분자는 비-천연적으로 존재하는 것이고, 예를 들어, 선택된 표적 부위에 결합하도록 가공된다.
[0031] 일부 구현예에서, DNA-표적화 분자는 아연-핑거 뉴클레아제 (ZFN)을 형성하기 위해 DNA 절단 도메인에 융합된 아연-핑거 DNA 결합 도메인이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 적어도 하나의 타입 liS 제한 효소로부터 절단 도메인 (또는 절단 절반-도메인) 및 가공될 수 있거나 가공될 수 없는 하나 이상의 아연 핑거를 포함한다. 일부 구현예에서, 절단 도메인은 유형 liS 제한 엔도뉴클레아제 Fok I로부터 유래한다. Fok I는 일반적으로 하나의 가닥 상에 이의 인지 부위로부터의 9개 뉴클레오타이드 및 다른 가닥 상에 이의 인지 부위로부터 13개 뉴클레오타이드에서 DNA의 이중 가닥 절단을 촉매한다.
[0032] 많은 유전자-특이적 가공된 아연 핑거는 시판되고 있다. 예를 들어, 제조원(Sangamo Biosciences (Richmond, CA, USA))은 제조원(Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA))과 협력하에 아연-핑거 작제를 위한 플랫폼 (CompoZr)을 개발하여 연구자가 아연-핑거 작제 및 확증을 함께 우회하도록 하여 수천개의 단백질에 대해 특이적으로 표적화된 아연 핑거를 제공한다(문헌참조: Gaj et al., Trends in Biotechnology, 2013, 31(7), 397-405). 일부 구현예에서, 시판되는 아연 핑거를 사용하거나 맞춤식으로 디자인된다. (문헌참조: 예를 들어, 제조원(Sigma-Aldrich)의 카탈로그 번호 CSTZFND, CSTZFN, CTil-lKT, 및 PZD0020).
B. TAL, TALE 및 TALEN
[0033] 일부 구현예에서, SRC-3에 대한 DNA-표적화 분자는 천연적으로 존재하거나 전사 활성화인자-유사 단백질 이펙터 (TALE) 단백질에서와 같이 가공된 (비-천연적으로 존재하는) 전사 활성화인자 유사 단백질 (TAL) DNA 결합 도메인을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 공개 공보 제2011/0301073호를 참조하고 이의 전문이 본원에 참조로 인용된다.
[0034] TALE DNA 결합 도메인 또는 TALE는 하나 이상의 TALE 반복체 도메인/유닛을 포함하는 폴리펩타이드이다. 반복체 도메인은 TALE의 이의 동족 표적 DNA 서열로의 결합에 관여한다. 단일 "반복체 유닛" (또한 “반복체”로서 언급됨)은 전형적으로 33 내지 35개 아미노산 길이이고 천연적으로 존재하는 TALE 단백질 내 다른 TALE 반복체 서열과 적어도 일부 서열 상동성을 나타낸다. 각각의 TALE 반복체 유닛은 전형적으로 반복체의 위치 12 및/또는 13에서 반복체 가변 이잔기(RVD)를 구성하는 1 또는 2개 DNA-결합 잔기를 포함한다. 이들 TALE의 DNA 인지를 위한 천연 (정준 (canonical)) 코드는 위치 12 및 13에서 HD 서열이 시토신 (C)로의 결합을 유도하도록 결정되었다. NG의 T로의 결합, NI의 A로의 결합, NN의 G 또는 A로의 결합 및 NO의 T로의 결합 및 비-정준 (비전형적) RVD는 또한 공지되어 있다. 일부 구현예에서, TALE는 표적 DNA 서열에 대한 특이성과 함께 TAL 어레이의 디자인에 의해 임의의 유전자에 표적화될 수 있다. 표적 서열은 일반적으로 티미딘으로 시작한다.
[0035] 일부 구현예에서, 상기 분자는 DNA 결합 엔도뉴클레아제, 예를 들어, TALE 뉴클레아제(TALEN)이다. 일부 양상에서, TALEN은 TALE로부터 유래된 DNA-결합 도메인 및 핵산 표적 서열을 절단하기 위한 뉴클레아제 촉매 도메인을 포함하는 융합 단백질이다.
[0036] 일부 구현예에서, TALEN은 유전자 내 표적 서열을 인지하고 절단한다. 일부 양상에서, DNA의 절단은 이중 가닥 파열을 유도한다. 일부 양상에서, 상기 파열은 상동성 재조합 또는 비-상동성 말단 연결 (NHEJ)의 속도를 자극한다. 일반적으로, NHEJ는 불완전 복구 공정이고 이는 흔히 절단 부위에서 DNA 서열에 대한 변화를 유도한다. 일부 양상에서, 복구 기전은 직접적인 재-결찰을 통해 또는 소위 미세상동성-매개된 말단 연결을 통해 2개의 DNA 말단에 잔류하는 것의 재연결을 포함한다. 일부 구현예에서, NHEJ를 통한 복구는 작은 삽입 또는 결실을 유도하고 이를 사용하여 유전자를 파괴하고 이로써 리프레싱할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 변형은 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 치환, 결실 또는 첨가일 수 있다. 일부 양상에서, 절단-유도된 돌연변이유발 이벤트, 즉, NHEJ 이벤트에 연속한 돌연변이유발 이벤트가 일어난 세포는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 동정되고/되거나 선택될 수 있다.
[0037] 일부 구현예에서, TALE 반복체는 유전자를 특이적으로 표적화하도록 어셈블리된다. (Gaj et al., 2013). 18,740 사람 단백질-암호화 유전자를 표적화하는 TALEN의 라이브러리를 작제하였다(문헌참조: Kim et al., 2013). 맞춤 디자인된 TALE 어레이는 제조원(Cellectis Bioresearch (Paris, France), Transposagen Biopharmaceuticals (Lexington, KY, USA), 및 Life Technologies (Grand Island, NY, USA))을 통해 시판되고 있다. 구체적으로, Cd38을 표적화하는 TALEN은 시판되고 있다(참조: Gencopoeia, 카탈로그 번호 HTN222870-l, HTN222870-2, 및 HTN222870-3). 예시적인 분자는 예를 들어, 미국 특허 공개 공보 제2014/0120622호, 및 제2013/0315884호 기재되어 있다.
[0038] 일부 구현예에서, TALEN은 하나 이상의 플라스미드 벡터에 의해 암호화된 트랜스 유전자로서 도입된다. 일부 양상에서, 플라스미드 벡터는 상기 벡터를 수용한 세포의 동정 및/또는 선택을 위해 제공되는 선택 마커를 함유할 수 있다.
C. RGEN (CRISPR/Cas 시스템)
[0039] 일부 구현예에서, SRC-3 유전자의 변경은 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 (RGEN)을 통한 변경과 같은, 하나 이상의 DNA-결합 핵산을 사용하여 수행된다. 예를 들어, 상기 변경은 클러스터링된 규칙적으로 이격된 짧은 팔린드롬 반복체 (CRISPR) 및 CRISPR-연합 (Cas) 단백질을 사용하여 수행될 수 있다. 일반적으로, "CRISPR 시스템"은 총체적으로 Cas 유전자를 암호화하는 서열, tracr (트랜스-활성화 CRISPR) 서열(예를 들어, tracrRNA 또는 활성 부분 tracrRNA), tracr-쌍(mate) 서열 (내인성 CRISPR 시스템과 관련하여 “직접적인 반복체” 및 tracrRNA-가공된 부분 직접적인 반복체), 가이드 서열(또한, 내인성 CRISPR 시스템과 관련하여 “스페이서”로서 언급되는)), 및/또는 CRISPR 유전자좌로부터 다른 서열 및 전사체를 포함하는, CRISPR-연합 (“Cas”) 유전자의 발현에 관여하거나 이의 활성을 지시하는 전사체 및 다른 요소들을 언급한다.
[0040] CRISPR/Cas 뉴클레아제 또는 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템은 뉴클레아제 기능 (예를 들어, 2개의 뉴클레아제 도메인)과 함께 DNA 및 Cas 단백질 (예를 들어, Cas9)에 서열 특이적으로 결합하는 비-암호화 RNA 분자(가이드) RNA를 포함할 수 있다. CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소들은 예를 들어, 내인성 CRISPR 시스템을 포함하는 특정 유기체, 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)로부터 유래된 I형, II형, 또는 III형 CRISPR 시스템으로부터 유래할 수 있다.
[0041] 일부 양상에서, Cas 뉴클레아제 및 gRNA (표적 서열 및 고정된 tracrRNA에 특이적인 crRNA의 융합을 포함하는)는 세포에 도입한다. 일반적으로, gRNA의 5’ 말단에서 표적 부위는 Cas 뉴클레아제를 상보성 염기 쌍형성을 사용하여 표적 부위, 예를 들어, 유전자에 표적화시킨다. 표적 부위는 전형적으로 NGG 또는 NAG와 같은, 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 서열의 바로 5’ 위치를 기준으로 선택될 수 있다. 이와 관련하여, gRNA는 가이드 RNA의 처음 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 14, 12, 11, 또는 10개의 뉴클레오타이드를 표적 DNA 서열에 상응하도록 변형시킴에 의해 목적하는 서열에 표적화된다. 일반적으로, CRISPR 시스템은 표적 서열의 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 촉진시키는 요소들에 의해 특징화된다. 전형적으로, "표적 서열"은 일반적으로 가이드 서열이 상보성을 갖도록 디자인된 서열을 언급하고, 여기서, 표적 서열과 가이드 서열 간의 하이브리드화는 CRISPR 복합체의 형성을 촉진시킨다. 완전한 상보성은 필수적으로 요구되지 않고, 단, 하이브리드화를 유발하고 CRISPR 복합체의 형성을 촉진시키기에 충분한 상보성이 있다.
[0042] CRISPR 시스템은 SRC-3 표적 부위에서 이중 가닥 절단 (DSB)에 이어서 본원에 논의된 바와 같은 파괴 또는 변경을 유도할 수 있다. 다른 구현예에서, “닉카제”로 간주되는 Cas9 변이체를 사용하여 표적 부위에서 단일 가닥을 닉킹(nick)한다. 쌍 형성 닉카제를 사용하여, 예를 들어, 각각의 동시 도입시, 5’ 오버행이 도입되도록 하는 한쌍의 상이한 gRNA 표적화 서열에 의해 지시되는 특이성을 개선시킬 수 있다. 다른 구현예에서, 촉매적 불활성 Cas9는 전사 리프레서 또는 활성화인자와 같은 이종성 이펙터 도메인에 융합되어 유전자 발현에 영향을 미친다.
[0043] SRC-3에 대한 표적 서열은 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오타이드와 같은 임의의 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 표적 서열은 세포의 핵 또는 세포질에, 예를 들어, 세포의 기관 내 위치할 수 있다. 일반적으로, 표적 서열을 포함하는 표적화된 유전자좌로의 재조합을 위해 사용될 수 있는 서열 또는 주형은 "편집 주형" 또는 "편집 폴리뉴클레오타이드" 또는 "편집 서열"로서 언급된다. 일부 양상에서, 외인성 주형 폴리뉴클레오타이드는 편집 주형으로서 언급될 수 있다. 일부 양상에서, 재조합은 상동성 재조합이다.
[0044] 전형적으로, 내인성 CRISPR 시스템과 관련하여, CRISPR 복합체 (표적 서열에 하이브리드화되고 하나 이상의 Cas 단백질과 복합체화된 가이드 서열을 포함하는)의 형성은 표적 서열에서 또는 이의 부근에서 (예를 들어, 이로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50개 이상의 염기쌍 내) 하나의 가닥 또는 가닥 둘다의 절단을 유도한다. 야생형 tracr 서열 전부 또는 일부 (예를 들어, 야생형 tracr 서열의 약 또는 약 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85, 또는 그 이상의 뉴클레오타이드)를 포함할 수 있거나 이들로 이루어질 수 있는 tracr 서열은 또한 예를 들어, tracr 서열의 적어도 일부를 가이드 서열에 작동적으로 연결된 tracr 쌍 서열의 전부 또는 일부에 하이브리드화함에 의해 CRISPR 복합체의 일부를 형성할 수 있다. tracr 서열은 하이브리드화하고 CRISPR 복합체의 형성에 관여하는 tracr 쌍 서열에 충분한 상보성, 예를 들어, 최적으로 정렬되는 경우 tracr 쌍 서열의 길이를 따라 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%또는 99%의 서열 상보성을 갖는다.
[0045] CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소들의 발현을 구동시키는 하나 이상의 벡터는 세포에 도입되어 CRISPR 시스템의 요소들의 발현이 하나 이상의 표적 부위에서 CRISRR 복합체의 형성을 지시할 수 있다. 성분들은 또한 단백질 및/또는 RNA로서 세포에 전달될 수 있다. 예를 들어, Cas 효소, tracr-쌍 서열에 연결된 가이드 서열 및 tracr 서열은 각각 별도의 벡터 상에 별도의 조절 요소들에 작동적으로 연결될 수 있다. 대안적으로, 동일하거나 상이한 조절 요소들로부터 발현되는 2개 이상의 요소들은 제1 벡터에 포함되지 않은 CRISPR 시스템의 임의의 성분들을 제공하는 하나 이상의 추가의 벡터와 함께 단일 벡터에 조합될 수 있다. 벡터는 제한 엔도뉴클레아제 인지 서열 (또한 “클로닝 부위”로서 언급되는)과 같은 하나 이상의 삽입 부위를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 삽입 부위는 하나 이상의 벡터의 하나 이상의 서열 요소들의 업스트림 및/또는 다운스트림에 위치한다. 다수의 상이한 가이드 서열이 사용되는 경우, 단일 발현 작제물은 세포 내 다수의 상이한 상응하는 표적 서열에 CRISPR 활성을 표적화하기 위해 사용될 수 있다.
[0046] 벡터는 Cas 단백질과 같은 CRISPR 효소를 암호화하는 효소-암호화 서열에 작동적으로 연결된 조절 요소를 포함할 수 있다. Cas 단백질의 비제한적인 예는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (또한 Csn1 및 Csx12로서 공지된), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csfl, Csf2, Csf3, Csf4, 이의 상동체 또는 이의 변형된 버전을 포함한다. 이들 효소는 공지되어 있고; 예를 들어, 에스. 피오게네스 Cas9 단백질의 아미노산 서열은 승인 번호 Q99ZW2하에 SwissProt 데이터베이스에서 발견될 수 있다.
[0047] CRISPR 효소는 Cas9 (예를 들어, 에스. 피오게네스로부터 또는 에스. 뉴모니아로부터)일 수 있다. CRISPR 효소는 예를 들어, 표적 서열 내 및/또는 표적 서열의 상보체 내, 표적 서열의 위치에서 가닥 하나 또는 가닥 둘다의 절단을 지시할 수 있다. 상기 벡터는 상응하는 야생형 효소와 관련하여 돌연변이된 CRISPR 효소를 암호화하여 상기 돌연변이된 CRISPR 효소는 표적 서열을 함유하는 표적 폴리뉴클레오타이드의 가닥 하나 또는 가닥 둘다를 절단하는 능력이 부재일 수 있다. 예를 들어, 에스. 피오게네스로부터의 Cas9의 RuvC I 촉매 도메인에서 아스파르테이트에서 알라닌으로의 치환 (D10A)은 가닥 둘다를 절단하는 뉴클레아제로부터 닉카제 (단일 가닥을 절단하는)로 Cas9를 전환시킨다. 일부 구현예에서, Cas9 닉카제는 가이드 서열(들), 예를 들어, 각각 DNA 표적의 센스 및 안티센스 가닥을 표적화하는 2개의 가이드 서열과 조합하여 사용될 수 있다. 상기 조합은 가닥 둘다를 닉킹하도록 하고 NHEJ 또는 HDR을 유도하기 위해 사용된다.
[0048] 일부 구현예에서, CRISPR 효소를 암호화하는 효소 암호화 서열은 특정 세포에서, 예를 들어, 진핵 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화되어 있다. 진핵 세포는 특정 유기체, 예를 들어, 사람, 마우스, 래트, 토끼, 개 또는 비-사람 영장류를 포함하는 포유동물의 세포이거나 이들로부터 유래된 세포일 수 있다. 일반적으로, 코돈 최적화는 고유 서열의 적어도 하나의 코돈을 고유 아미노산 서열을 유지하면서 숙주 세포의 유전자에서 보다 흔하게 또는 가장 흔하게 사용되는 코돈으로 대체함에 의해 관심 대상의 숙주 세포에서 증진된 발현을 위해 핵산 서열을 변형시키는 공정을 언급한다. 다양한 종은 특정 아미노산의 특정 코돈에 대해 특정 편향을 나타낸다. 코돈 편향(유기체 간의 코돈 용법에서의 차이)은 흔히 전령 RNA (mRNA)의 해독 효율과 상호관련되고, 이는 이어서 무엇 보다 해독될 코돈의 성질 및 특정 운반 RNA (tRNA) 분자의 가용성에 의존하는 것으로 사료된다. 세포에서 선택된 tRNA의 우세는 일반적으로 펩타이드 합성에서 가장 흔하게 사용되는 코돈을 반영한다. 따라서, 유전자들은 코돈 최적화를 기준으로 소정의 유기체에서 최적의 유전자 발현을 위해 조정될 수 있다.
[0049] 일반적으로, 가이드 서열은 표적 서열과 하이브리드화하고 CRISPR 복합체의 표적 서열로의 서열-특이적 결합을 지시하기에 충분히 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과 상보성을 갖는 임의의 폴리뉴클레오타이드 서열이다. 일부 구현예에서, 가이드 서열과 이의 상응하는 표적 서열 간의 상보성 정도는 적합한 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬되는 경우 약 또는 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99%이상이다.
[0050] 최적의 정렬은 서열을 정렬시키기위한 임의의 적합한 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있고 상기 알고리즘의 비제한적인 예는 스미스-워터맨 (Smith-Waterman) 알고리즘, 니들맨-운쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘, 버로우-휠러 트랜스폼 (Burrows-Wheeler Transform)을 기반으로 하는 알고리즘 (예를 들어, 버로우 휠러 얼라이너(Burrows Wheeler Aligner), 클러스탈 더블유 (Clustal W), 클러스탈 엑스(Clustal X), BLAT, 노보얼라인(Novoalign) (Novocraft Technologies, ELAND (Illumina, San Diego, Calif.), SOAP (soap.genomics.org.cn에서 가용한), 및 Maq (maq.sourceforge.net에서 가용한)를 포함한다.
[0051] CRISPR 효소는 하나 이상의 이종성 단백질 도메인을 포함하는 융합 단백질의 일부일 수 있다. CRISPR 효소 융합 단백질은 임의의 추가의 단백질 서열 및 임의로 임의의 2개의 도메인 사이의 링커 서열을 포함할 수 있다. CRISPR 효소에 융합될 수 있는 단백질 도메인의 예는 제한 없이, 에피토프 태그, 리포터 유전자 서열, 및 하기의 활성 중 하나 이상을 갖는 단백질 도메인을 포함한다: 메틸라제 활성, 데메틸라제 활성, 전사 활성화 활성, 전사 억제 활성, 전사 방출 인자 활성, 히스톤 변형 활성, RNA 절단 활성 및 핵산 결합 활성. 에피토프 태그의 비제한적인 예는 히스티딘 (His) 태그, V5 태그, FLAG 태그, 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA) 태그, Myc 태그, VSV-G 태그, 및 티오레독신 (Trx) 태그를 포함한다. 리포터 유전자의 예는 글루타티온-5-트랜스퍼라제 (GST), 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT) 베타 갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, 녹색 형광성 단백질 (GFP), HcRed, DsRed, 시안(cyan) 형광성 단백질 (CFP), 황색 형광성 단백질 (YFP), 및 청색 형광 단백질 (BFP)를 포함하는 자가형광 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. CRISPR 효소는 말토스 결합 단백질 (MBP), S-태그, Lex A DNA 결합 도메인 (DBD) 융합체, GAL4A DNA 결합 도메인 융합체 및 헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV) BP 16 단백질 융합체를 포함하지만 이에 제한되지 않는, DNA 분자에 결합하거나 다른 세포 분자에 결합하는 단백질 또는 단백질의 단편을 암호화하는 유전자 서열에 융합될 수 있다. CRISPR 효소를 포함하는 융합 단백질의 일부를 형성할 수 있는 추가의 도메인은 본원에 참조로 인용된 US 20110059502에 기재되어 있다.
V. 사용 방법
[0052] 일부 구현예에서, 본원의 개시내용은 본원의 개시내용의 유효량의 SRC-3-파괴된 면역세포를 투여함을 포함하는 면역치료요법을 사용하는 암 치료 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 유효량의 SRC-3-파괴된 세포 치료요법을 개체에게 투여함으로써 개체에서 암을 치료하거나, 진행을 지연시키거나, 개시를 지연시키거나, 암에 걸릴 위험을 감소시키는 방법이 본원에 포함된다. 본 발명의 방법은 고형 암 또는 혈액 암의 치료를 위해 적용될 수 있다. 특정 구현예에서, 암은 SRC-3 양성이다. 암은 원발성, 전이성, 치료 불응성 등일 수 있다. 암은 임의의 유형 및 임의의 단계일 수 있다. 개체는 일반 집단을 포함하여 암에 걸릴 위험이 있을 수 있고, 암에 걸릴 위험이 있는 개체는 개인 또는 가족력때문일 수 있거나. 개체가 흡연자이거나 비만이거나 과도한 술을 소비하거나 일부 유형의 바이러스 감염, 예를 들어, 사람 파필로마바이러스(HPV)와 같은 바이러스를 갖거나, 하나 이상의 발암 물질에 노출되었거나 태양의 자외선을 포함한 방사선에 과도하게 노출되었기 때문일 수 있다. 양이 집단의 평균 개체보다 큰 경우 과도한 것으로 간주될 수 있다.
[0053] 본원 개시내용의 치료 방법이 유용한 종양은 임의의 악성 세포 유형, 예를 들어, 고형 종양 또는 혈액학적 종양에서 발견되는 것들을 포함한다. 예시적인 고형 종양은 유방, 난소, 췌장, 결장, 맹장, 위, 뇌, 머리, 목, 콩팥, 후두, 육종, 폐, 방광, 흑색종, 전립선, 위 조직 및 자궁내막으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 기관의 종양을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 혈액학적 종양은 골수의 종양, T 또는 B 세포 악성 종양, 백혈병, 림프종, 모세포종, 골수종 등을 포함한다. 본원에 제공된 방법을 사용하여 치료될 수 있는 암의 특정 예는 폐암(소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평 암종을 포함하는), 복막, 위장 또는 위암(위장암 및 위장 기질 암을 포함하는), 췌장암, 자궁암, 난소암, 간암, 방광암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 콩팥 또는 신장암, 전립선암, 음경암, 갑상선암, 다양한 유형의 두경부암 및 흑색종을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
[0054] 상기 암은 구체적으로 하기의 조직학적 유형을 가질 수 있지만 이들에 제한되지 않는다: 악성 신생물; 암종; 미분화된 암종; 거대 및 스핀들 세포 암종; 소세포 암종; 유두 암종; 편평 세포 암종; 림프구상피 암종; 기저 세포 암종; 섬모기질 암종; 이행 세포 암종; 유두 이행 암종; 선암종; 악성 가스트린종; 담관 암종; 간세포 암종; 조합된 간세포 암종 및 담관암종; 섬유주 선암종; 선낭 암종; 선종폴립 내 선암종; 가족성 폴립증 콜리 선암종; 고형 암종; 악성 카시노이드 종양; 세기관지-폐포 선암종; 유두 선암종; 색소형성 암종; 호산성 암종; 호산소성 선암종(oxyphilic adenocarcinoma); 호염기성 암종; 투명 세포 선암종; 과립 세포 암종; 여포성 선암종; 유두 및 여포성 선암종; 비캡슐화 경화 암종; 부신피질 암종; 자궁내막 암종; 피부 부속 암종 (skin appendage carcinoma); 아포크린 선암종(apocrine adenocarcinoma); 피지 선암종; 귀지 선암종(ceruminous adenocarcinoma); 점막상피 암종; 낭선암종; 유두 낭선암종; 유두 장액성 낭선암종(papillary serous cystadenocarcinoma); 점소양 낭선암종; 점소양 선암종; 시그넷 환 세포 암종(signet ring cell carcinoma); 침윤 도관 암종(infiltrating duct carcinoma); 수질 암종; 소엽 암종; 염증성 암종; 유방 파게트 질환(paget's disease, mammary); 소포 세포 암종; 선편평세포 암종; 선암종 w/편평 상피화생; 악성 흉선종thymoma; 악성 난소 기질 종양(ovarian stromal tumor, malignant); 악성 포막종(thecoma, malignant); 악성 과립막 세포 종양(granulosa cell tumor, malignant); 악성 암성모세포종; 세르톨리 세포 암종(sertoli cell carcinoma); 악성 라이디히 세포 종양(leydig cell tumor, malignant); 악성 지질 세포 종양; 악성 부신결정종(paraganglioma, malignant); 악성 유선외 부신결정종(extra-mammary paraganglioma, malignant); 크롬친화세포종(pheochromocytoma); 사구체혈관육종(glomangiosarcoma); 악성 흑색종; 무색소성 흑색종; 표재 확장성 흑색종; 흑색점 악성 흑색종(lentigo malignant melanoma); 선단 흑자성 흑색종(acral lentiginous melanomas); 결절성 흑색종; 거대 색소성모반에서 악성 흑색종; 상피모양 세포 흑색종; 악성 청색모반(blue nevus, malignant); 육종; 섬유육종; 악성 섬유 조직구종; 점액육종(myxosarcoma); 지방육종; 평활근육종(leiomyosarcoma); 횡문근육종; 배아 횡문근육종; 폐포 횡문근육종; 기질 육종; 악성 혼합 종양; 뮬러관 혼합 종양; 신아세포종(nephroblastoma); 간아세포종(hepatoblastoma); 암육종; 악성 중간엽종; 악성 브레너 종양 (brenner tumor, malignant); 악성 엽상 종양(phyllodes tumor, malignant); 활액 육종; 악성 중피종(mesothelioma, malignant); 미분화배세포종(dysgerminoma); 배아 암종(embryonal carcinoma); 악성 기형종(teratoma, malignant); 악성 난소갑상선종(struma ovarii, malignant); 융모암종; 악성 중신종(mesonephroma, malignant); 혈관육종; 악성 혈관내피종; 카포시 육종; 악성 혈관주위세포종(hemangiopericytoma, malignant); 림프관 육종; 골육종; 피질주위 골육종(juxtacortical osteosarcoma); 연골육종; 악성 연골모세포종; 간엽성 연골육종(mesenchymal chondrosarcoma); 골의 거대 세포 종양; 어윙 육종(ewing's sarcoma); 악성 치원성 종양(odontogenic tumor, malignant); 에나멜아세포 치원서육종(ameloblastic odontosarcoma); 악성 에나멜아세포종(ameloblastoma, malignant); 사기질모세포섬유육종; 악성 송과체부종양; 척색종; 악성 신경교종; 뇌실막세포종(ependymoma); 성상세포종; 원형질 성상세포종; 원섬유 성상세포종; 성상모세포종; 교모세포종; 핍지교종; 핍지교모세포종(oligodendroblastoma); 원시 신경외배엽종양; 소뇌 육종; 신경절아세포종(ganglioneuroblastoma); 신경모세포종; 망막모세포종; 후각 신경성 종양; 악성 뇌수막종(meningioma, malignant); 신경섬유육종(neurofibrosarcoma); 악성 신경초종(neurilemmoma, malignant); 악성 과립 세포 종양; 악성 림프종; 호지킨 질환; 호지킨(hodgkin's); 파라육아종(paragranuloma); 소림프구 악성 림프종(malignant lymphoma, small lymphocytic); 대형 세포 확산 악성 림프종(malignant lymphoma, large cell, diffuse); 여포성 악성 림프종(malignant lymphoma, follicular); 균상식육종(mycosis fungoides); 다른 특정 비-호지킨 림프종; B-세포 림프종; 저급/여포성 비-호지킨 림프종(NHL); 소림프구(SL) NHL; 중간 등급/여포 NHL; 중간 등급 확산 NHL; 고등급 면역아구성 NHL; 고등급 림프아구성 NHL; 고등급 소 비-절단된 세포 NHL; 벌크 질환 NHL; 맨틀 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia); 악성 조직구증; 다발성 골수종; 비만 세포 육종; 면역증식성 소장 질환; 백혈병; 림프구 백혈병; 혈장 세포 백혈병; 적백혈병)(erythroleukemia); 림프구육종 세포 백혈병; 골수백혈병; 호염기성 백혈병; 호산성 백혈병; 단핵구 백혈병; 비만 세포 백혈병; 거핵아구 백혈병; 골수 육종; 모발 세포 백혈병; 만성 림프구 백혈병 (CLL); 급성 림프아구성 백혈병 (ALL); 급성 골수 백혈병 (AML); 및 만성 골수아구성 백혈병.
[0055] 본원 개시내용의 특정 구현예에서, 면역 세포는 암을 갖거나 암을 갖는 것으로 의심되는 이를 필요로 하는 개체에게 전달된다. 상기 세포는 이어서 각각의 암을 공격하는 개체의 면역계를 증진시킨다. 일부 경우에, 상기 개체에는 하나 이상의 용량의 면역 세포가 제공된다. 개체에게 2 이상의 용량의 면역 세포가 제공되는 경우에, 투여 사이의 지속 기간은 개체내 증식을 위한 시간을 허용하기 위해 충분해야만 하고 특정 구현예에서, 투여 사이의 지속 기간은 l, 2, 3, 4, 5, 6, 7일 이상이다. 일부 경우에, 투여 간격은 1-24시간, 1-7일, 1-4주, 1-12개월 또는 그 이상 또는 그 사이에서 도출할 수 있는 임의의 범위이다.
[0056] 일부 구현예에서, 대상체에게 면역 세포 치료요법 전에 비골수절제성 림프구고갈 화학치료요법이 투여될 수 있다. 비골수절제성 림프구고갈 화학치료요법은 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있는, 임의의 적합한 상기 치료요법일 수 있다. 비골수절제성 림프구고갈 화학치료요법은 예를 들어, 특히 암이 전이성일 수 있는 흑색종인 경우 사이클로포스파미드 및 플루다라빈의 투여를 포함할 수 있다. 사이클로포스파미드 및 플루다라빈의 예시적 경로는 정맥내이다. 또한, 사이클로포스파미드 및 플루다라빈의 임의의 적합한 용량이 투여될 수 있다. 특정 양상에서, 약 60 mg/kg의 사이클로포스파미드가 2일 동안 투여되고 이후 약 25 mg/m2의 플루다라빈은 5일동안 투여된다.
[0057] 특정 구현예에서, 면역 세포의 성장 및 활성화를 촉진시키는 하나 이상의 성장 인자 및/또는 하나 이상의 사이토킨은 면역 세포와 동시에 대상체에게 또는 후속적으로 면역 세포에 투여된다. 면역 세포 성장 인자는 면역 세포의 성장 및 활성화를 촉진시키는 임의의 적합한 성장 인자일 수 있다. 적합한 면역 세포 성장 인자의 예는 인터류킨 (IL)-2, IL-7, IL-15, 및 Il-12를 포함하고, 이는 단독으로 또는 다양한 조합으로, 예를 들어, IL-2와 IL-7, IL-2와 IL-15, IL-7과 IL-15, IL-2, IL-7와 IL-15, IL-12와 IL-7, IL-12와 IL-15, 또는 IL-12와 IL-2로 사용될 수 있다.
[0058] 치료학적 유효량의 면역 세포는 비경구 투여, 예를 들어, 정맥내, 복막내, 근육내, 흉골내, 또는 관절내 주사, 비강내, 동맥내 또는 주입에 의한 것을 포함하는 다수의 경로에 의해 투여될 수 있다.
[0059] 입양 세포 치료요법에 사용하기 위한 면역 세포의 치료학적 유효량은 치료받는 대상체에서 목적하는 효과를 성취하는 양이다. 예를 들어, 이는 성장을 억제하거나 암 퇴행을 유발하거나 적어도 하나의 암 증상을 개선하는 데 필요한 면역 세포의 양이 될 수 있다.
[0060] 면역 세포 집단은 상기 질환에 맞는 치료 용법, 예를 들어, 질환 상태를 개선하기 위해 1일 내지 수일에 걸쳐 단일 용량 또는 수회 용량 또는 질환 진행을 억제하고 질환 재발을 예방하기 위해 연장된 기간 동안 주기적 용량으로 투여될 수 있다. 제형 중에 사용될 정확한 용량은 또한 투여 경로, 및 질환 또는 장애의 중증도에 의존하고 임상의의 판단 및 각각의 환자의 상황에 따라 결정되어야만 한다. 면역 세포의 치료학적 유효량은 치료받는 대상체, 환부의 중증도 및 유형 및 투여 방식에 의존한다. 일부 구현예에서, 사람 대상체의 치료에 사용될 수 있는 용량은 적어도 3.8×104, 적어도 3.8×105, 적어도 3.8×106, 적어도 3.8×107, 적어도 3.8×108, 적어도 3.8×109, 또는 적어도 3.8×1010 면역 세포/m2의 범위이다. 특정 구현예에서, 사람 대상체의 치료에 사용되는 용량은 약 3.8×109 내지 약 3.8×1010 면역 세포/m2의 범위이다. 추가의 구현예에서, 면역 세포의 치료학적 유효량은 체중 kg 당 약 5×106 세포 내지 체중 kg 당 약 7.5×108 세포, 예를 들어, 체중 kg 당 약 2×107 세포 내지 약 5×108 세포, 또는 체중 kg 당 약 5×107 세포 내지 약 2×108 세포로 다양할 수 있다. 면역 세포의 정확한 양은 대상체의 연령, 체중, 성별 및 생리학적 병태를 기준으로 당업자에 의해 용이하게 결정된다. 유효량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유래된 용량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다.
[0061] 면역 세포는 암의 치료를 위해 하나 이상의 다른 치료학적 제제와 조합하여 투여될 수 있다. 조합 치료요법은 하나 이상의 항-종양 제제 또는 백신을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 특정한 경우, 화학치료요법제(예를 들어, 메토트렉세이트, 트레오설판, 부설판); 조사; 또는 케모킨, 인터류킨 또는 이들의 억제제(예를 들어, BAFF, IL-2, 항-IL-2R, IL-4, JAK 키나제 억제제)가 면역 세포에 추가로 투여될 수 있다. 상기 추가의 약제학적 제제는 목적하는 효과에 의존하여 면역 세포의 투여 전, 투여 동안에 또는 투여 후 투여될 수 있다. 세포 및 하나 이상의 추가의 항암제의 투여는 동일한 경로 또는 상이한 경로에 의해 및 동일 부위에 또는 상이한 부위에 투여될 수 있다.
VI. 약제학적 조성물
[0062] 본원에서는 면역 세포(예를 들어, Treg 세포와 같은 T 세포를 포함하는 SRC-3 파괴된 면역 세포) 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물 및 제형이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 다음을 포함하는 조성물이 있다: (a) 본원에 포함된 임의의 면역 세포; 및 (b) SRC-3을 표적화하는 하나 이상의 제제. 그러한 경우, (a) 및 (b)는 동일한 제형일 수도 있고 아닐 수도 있으며, 동일한 투여 경로에 의해 전달되도록 구성될 수도 있고 구성되지 않을 수도 있다.
[0063] 본원에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물 및 제형은 동결건조된 제형 또는 수용액 형태로, 하나 이상의 임의의 약제학적으로 허용되는 담체와 목적하는 정도의 순도를 갖는 활성 성분 (예를 들어, 항체 또는 폴리펩타이드)을 혼합함에 의해 제조할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences 22nd edition, 2012). 약제학적으로 허용되는 담체는 일반적으로 사용되는 용량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 완충액, 예를 들어, 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩타이드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 겔라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어, 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이팅 제제, 예를 들어, EDTA; 슈가, 예를 들어, 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 역이온, 예를 들어, 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn- 단백질 착물); 및/또는 비-이온 계면활성제, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG). 본원에서 예시적인 약제학적으로 허용되는 담체는 조직 사이의 약물 분산제, 예를 들어, 가용성 중성 -활성 하이알루로니다제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어, 사람 가용성 PH-20 하이알루로니다제 당단백질, 예를 들어, rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.)을 추가로 포함한다. 특정 예시적인 sHASEGP, 및 rHuPH20을 포함하는 사용 방법은 미국 특허 공개 공보 제2005/0260186호 및 제2006/0104968호에 기재되어 있다. 하나의 양상에서, sHASEGP는 콘드로이티나제와 같은 하나 이상의 추가의 글리코스아미노글리카나제와 조합된다.
VII. 조합 치료요법
[0064] 특정 구현예에서, 본 구현예의 조성물 및 방법은 적어도 하나의 추가의 치료요법과 조합된 면역 세포 집단을 포함한다. 추가의 치료요법은 방사선 치료요법, 수술, 화학치료요법, 유전자 치료요법, DNA 치료요법, 바이러스 치료요법, RNA 치료요법, 면역치료요법, 골수 이식, 나노치료요법, 모노클로날 항체 치료요법, 호르몬 치료요법, 암용해 바이러스 또는 이전의 치료 조합일 수 있다. 추가의 치료요법은 보조제 또는 신규보조제 치료요법 형태일 수 있다. 추가의 치료요법은 임의의 종류의 항체, 소분자 억제제, 핵산, 단백질 또는 이들의 조합과 같이 SRC-3을 표적화하는 하나 이상의 제제일 수 있다.
[0065] 일부 구현예에서, 추가의 치료요법은 SRC-3의 소분자 억제제 또는 항-전이성 제제의 투여이다. 일부 구현예에서, 추가의 치료요법은 부작용 제한 제제 (예를 들어, 항오심 제제 등과 같은 치료의 부작용의 발병 및/또는 중증도를 감소시키는 것으로 의도된 제제)의 투여이다. 일부 구현예에서, 추가의 치료요법은 방사선 치료요법이다. 일부 구현예에서, 추가의 치료요법은 수술이다. 일부 구현예에서, 추가의 치료요법은 방사선 치료요법과 수술의 조합이다. 일부 구현예에서, 상기 추가의 치료요법은 감마 방사선 조사이다. 일부 구현예에서, 추가의 치료요법은 PBK/AKT/mTOR 경로, HSP90 억제제, 튜불린 억제제, 아폽토시스 억제제, 및/또는 화학예방제를 표적화하는 치료요법이다. 추가의 치료요법은 당업계에 공지된 하나 이상의 화학치료학적 제제일 수 있다.
[0066] 면역 세포 치료요법은 추가의 암 치료요법과 관련하여, 치료요법 전, 치료요법 동안에, 치료요법 후 또는 다양한 조합으로 투여될 수 있다. 투여는 동시 내지 수분 내지 수시간 내지 수일 내지 수주 범위의 간격일 수 있다. 면역 세포 치료요법이 추가의 치료학적 제제와는 별도로 환자에게 제공되는 구현예에서, 당업자는 일반적으로 각각의 전달 시간 사이에 충분한 시기가 만료되지 않도록 보장하여 2개의 화합물은 여전히 환자에 대한 유리한 조합 효과를 발휘할 수 있다.
[0067] 본 구현예의 임의의 화합물 또는 치료요법의 환자로의 투여는 경우에 따라 제제의 독성을 고려하여 상기 화합물의 투여를 위한 일반 프로토콜에 따른다. 따라서, 일부 구현예에서, 조합 치료요법에 기인할 수 있는 독성을 모니터링하는 단계가 있다.
A. 화학치료요법
[0068] 광범위한 화학치료학적 제제는 본 발명의 구현예에 따라 사용될 수 있다. 용어 “화학치료요법”은 암을 치료하기 위한 약물의 사용을 언급한다. “화학치료학적 제제”는 암의 치료에 투여되는 화합물 또는 조성물을 함축하기 위해 사용된다. 이들 제제 또는 약물은 이들이 세포 주기에 영향을 미칠지 및 어느 단계에서 영향을 미칠지와 같은 세포 내 이들의 활성 방식에 의해 분류된다. 대안적으로, 제제는 DNA를 직접 가교결합시키거나 DNA에 삽입되거나 핵산 합성에 영향을 미침에 의해 염색체 및 유사분열 일탈을 유도하는 이의 능력을 기준으로 특징 분석될 수 있다.
[0069] 화학치료학적 제제의 예는 알킬화제, 예를 들어, 티오테파 및 사이클로스포스파미드; 알킬 설포네이트, 예를 들어, 부설판, 임프로설판, 및 피포설판; 아지리딘, 예를 들어, 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드,트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸롤로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸라멜라민; 아세토게닌(특히 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신(합성 유사체 토포테칸을 포함하는); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (이의 아도젤레신, 카젤레신 및 비젤레신 합성 유사체를 포함하는); 크립토피신(특히, 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 두오카마이신 (합성 유사체 , KW-2189 및 CB1-TM1을 포함하는); 엘레우트레오빈; 판크라티스타틴; 사코딕티인; 스폰기스타틴; 질소 머스타드, 예를 들어, 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 및 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예를 들어, 카무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라님누스틴; 항생제, 예를 들어, 에네디인 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감몰 및 칼리케아미신 오메가I1); 디네미신 A를 포함하는 디네미신; 비스포스포네이트, 예를 들어, 클로드로네이트; 에스퍼라미신; 및 네오카지노스타틴 발색단 및 관련 크로모단백질 에네디인 항생제 발색단, 아클라시노마이신, 액티노마이신, 아우트라르니신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카지노필린, 크로모마이니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신(모르폴리노-독소루비신, 시아노모프폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신을 포함하는), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마셀로마이신, 미토마이신, 예를 들어, 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라르니신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 튜버시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 및 조루비신; 항대사물, 예를 들어, 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예를 들어, 데노프테린, 프테로프테린, 및 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예를 들어, 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 및 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 및 플록스우리딘; 안드로겐, 예를 들어, 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 및 테스톨락톤; 항-부신제(anti-adrenal), 예를 들어, 미토탄 및 트릴로스탄; 엽산 보충제, 예를 들어, 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 이오니다이닌; 메이탄시노이드, 예를 들어, 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카바진; PSK폴리사카라이드 복합체; 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2”-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센(특히, T-2 톡신, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 (“Ara-C”); 사이클로포스파미드; 탁소이드, 예를 들어, 파클리탁셀 및 도세탁셀 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 플라티늄 배위 착물, 예를 들어, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 및 카보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; 이리노테칸 (예를 들어, CPT-11); 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예를 들어, 레티노산; 카페시타빈; 카보플라틴, 프로카바진, 플리코마이신, 겜시타비엔, 나벨빈, 파네실-단백질 트랜스퍼라제 억제제, 트랜스플라티늄, 및 약제학적으로 허용되는 염, 산, 또는 상기 임의의 유도체를 포함한다.
B. 방사선 치료요법
[0070] DNA 손상을 유발하고 광범위하게 사용되어온 다른 인자들은 통상적으로 γ-선, X-선, 및/또는 방사성 동위원소의 종양 세포의 직접적인 전달로서 공지된 것을 포함한다. DNA 손상 인자의 다른 형태가 또한 고려되고, 예를 들어, 마이크로파, 양성자 빔 조사 (미국 특허 제5,760,395호 및 제4,870,287호), 및 UV-조사가 있다. 모든 이들 인자들은 DNA에 대해, DNA의 전구체에 대해, DNA의 복제 및 복구에 대해 및 염색체의 어셈블리 및 유지에 대해 광범위한 손상에 영향을 미칠 가능성이 높다. X-선에 대한 용량 범위는 장기간 (3 내지 4주) 동안 하루 50 내지 200 뢴트겐로부터 2000 내지 6000 뢴트겐의 단일 용량의 범위이다. 방사성 동위원소에 대한 용량 범위는 매우 다양하고 동위원소의 반감기, 방출된 방사선 강도 및 유형, 및 신생물 세포에 의한 흡수에 의존한다.
C. 면역치료요법
[0071] 당업자는 본원에 포함된 것들에 추가의 면역치료요법이 구현예의 방법과 조합하거나 연계하여 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 암 치료와 관련하여, 면역치료제는 일반적으로 암 세포를 표적화하고 파괴하기 위한 면역 이펙터 세포 및 분자에 의존한다. 리툭시맙 (RITUXAN®)은 그러한 예이다. 면역 이펙터는 예를 들어, 종양 세포의 표면 상에 일부 마커에 특이적인 항체일 수 있다. 단독의 항체는 치료요법의 이펙터로서 작용할 수 있거나 이것은 실제로 세포 사멸에 영향을 미치는 다른 세포를 동원할 수 있다. 항체는 또한 약물 또는 독소 (화학치료제, 방사성핵종, 리신 A 쇄, 콜레라 독소, 백일해 독소) 등에 접합될 수 있고 표적화제로서 작용할 수 있다. 대안적으로, 이펙터는 직접적으로 또는 간접적으로 종양 세포 표적과 상호작용하는 표면 분자를 함유하는 림프구일 수 있다. 다양한 이펙터 세포는 세포독성 T 세포 및 NK 세포를 포함한다.
[0072] 항체-약물 접합체는 암 치료제의 개발을 위한 획기적 접근법인 것으로 나타났다. 암은 전세계 사망의 주요 원인 중 하나이다. 항체-약물 접합체 (ADC)는 세포-사멸 약물에 공유적으로 연결된 모노클로날 항체 (Mab)를 포함한다. 상기 접근법은 이들의 항원 표적에 대한 고특이성의 Mab와 상당히 강력한 세포독성 약물을 조합하여 농축된 수준의 항원과 함께 페이로드 (약물)를 종양 세포에 전달하는 “무장된(armed)” Mab를 유도한다. 약물의 표적화된 전달은 또한 정상 조직에서 이의 노출을 최소화하여 감소된 독성 및 개선된 치료학적 지수를 유도한다. 2개의 ADC 약물로서 2011년에 FDA에 의해 승인된 ADCETRIS® (브렌툭시맙 베도틴) 및 2013년에 FDA에 의해 승인된 KADCYLA® (트라스투주맙 엠탄신 또는 T-DM1)은 단지 예로서 상기 접근법을 확증하였다.
[0073] 면역치료요법의 하나의 양상에서, 종양 세포는 표적화에 순응할 수 있는, 즉 대다수의 다른 세포 상에 존재하지 않는 일부 마커를 함유해야만 한다. 많은 종양 마커가 존재하고 임의의 이들 마커는 본 발명의 구현예와 관련하여 표적화를 위해 적합할 수 있다. 통상의 종양 마커는 CD20, 암배아 항원, 티로시나제 (p97), gp68, TAG-72, HMFG, 시알릴 루이스 항원(Sialyl Lewis Antigen), MucA, MucB, PLAP, 라미닌 수용체, erb B, 및 p155를 포함한다. 면역치료요법의 대안적 양상은 항암 효과를 면역 자극 효과와 조합하는 것이다. 면역 자극 분자는 또한 다음을 포함한다: 사이토킨, 예를 들어, IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, 감마-IFN, 케모킨, 예를 들어, MIP-1, MCP-1, IL-8, 및 성장 인자, 예를 들어, FLT3 리간드.
[0074] 일부 구현예에서, 면역치료요법은 면역 관문 억제제일 수 있다. 면역 체크포인트는 신호 (동시-자극 분자)를 상향시키거나 신호를 하향시킨다. 면역 관문 차단에 의해 표적화될 수 있는 억제 면역 관문은 아데노신 A2A 수용체 (A2AR), B7-H3 (또한 CD276로서 공지된), B 및 T 림프구 약화인자 (BTLA), 세포독성 T-림프구-연합 단백질 4 (CTLA-4, 또한 CD152로서 공지된), 인돌아민 2,3-디옥시게나제(IDO), 킬러-세포 면역글로불린 (KIR), 림프구 활성화 유전자-3 (LAG3), 프로그래밍된 사멸 1 (PD-1), T-세포 면역글로불린 도메인 및 뮤신 도메인 3 (TIM-3) 및 T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 서프레서(VISTA)를 포함한다. 특히, 면역 관문 억제제는 PD-1 축 및/또는 CTLA-4를 표적화한다. 본원에 제공된 방법에서 표적화될 수 있는 또 다른 면역 관문은 CD152로서 공지된 세포독성 T-림프구-연합된 단백질 4 (CTLA-4)이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 억제제는 항-CTLA-4 항체(예를 들어, 사람 항체, 사람화된 항체, 또는 키메라 항체), 이의 항원 결합 단편, 면역어드헤신, 융합 단백질 또는 올리고펩타이드이다.
D. 수술
[0075] 암을 갖는 사람의 대략 60%는 동일한 유형의 수술을 진행하고 이는 예방적, 진단학적 또는 단계 결정, 치유적 및 일시적인 수술을 포함한다. 치유적 수술은 암성 조직의 전부 또는 일부가 물리적으로 제거되고, 절제되고/되거나 파괴된 절제술을 포함하고 본 발명의 구현예의 치료, 화학치료요법, 방사성 치료요법, 호르몬 치료요법, 유전자 치료요법 및/또는 대안적 치료요법과 같은 다른 치료요법과 연계하여 사용될 수 있다. 종양 절제술은 종양의 적어도 일부의 물리적 제거를 언급한다. 종양 절제술에 추가로, 수술에 의한 치료는 레이저 수술, 냉동수술, 전기수술, 및 현미경적으로 제어된 수술(모흐 수술(Mohs’ surgery))을 포함한다.
[0076] 암성 세포, 조직 또는 종양의 일부 또는 전부의 절제 시, 공동이 신체에 형성될 수 있다. 치료는 관류, 직접적인 주사 또는 추가의 항암 치료요법을 사용한 영역의 국소 적용에 의해 성취될 수 있다. 상기 치료는 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일 마다, 또는 1, 2, 3, 4, 및 5주 마다, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월 마다 반복될 수 있다. 이들 치료는 또한 다양한 용량일 수 있다.
VIII. 가공된 B 세포 및 사용 방법
[0077] 특정 구현예에서, SRC-3의 파괴를 갖도록 가공된 면역 세포는 B 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, SRC-3-파괴 B 세포는 B 세포가 효과적인 임의의 의학적 병태에 이용되지만, 특정 구현예에서 변형된 B 세포는 하나 이상의 염증성 질환의 치료 또는 예를 들어, 적어도 B 세포 림프종 및 본원의 다른 곳에 열거된 암을 포함하는 임의의 암의 치료에 이용된다.
[0078] 특정 구현예에서, B 세포는 상업적으로 또는 치료를 필요로 하는 개체로부터 수득된다. B 세포는 동종이계 목적을 위해 건강한 대상체로부터 수득될 수 있다. B 세포는 B 세포에서 내인성 SRC-3의 발현을 파괴하는 표준 방법에 의해 생체외에서 가공될 수 있다. 일부 경우에, 가공된 B 세포는 필요한 개체에게 1회 투여된 B 세포의 효능을 촉진시키는 TGF- 또는 종양 특이적 항원을 포함한 하나 이상의 제제에 노출된다.
[0079] 특정 구현예에서, 가공되지 않은 B 세포와 비교하여 SRC-3의 발현이 결여되거나 SRC-3의 발현이 감소된 가공된 B 세포는 하나 이상의 염증성 질환을 갖거나 가질 위험이 있는 개체에게 유효량으로 투여된다. 염증성 질환은 임의의 종류일 수 있지만, 특정 구현예에서 질환은 단지 예로서 알레르기, 천식, 자가면역 질환, 체강 질환, 사구체신염, 간염, 염증성 장 질환, 관류전 손상, 이식 거부, 강직성 척추염(AS), 통풍; 근염, 류마티스 관절염, 피부경화증, 쇼그렌 증후군, 전신성 홍반성 루푸스(SLE, 루푸스), 골반 염증성 질환 또는 혈관염이 있다. B 세포 치료는 질환의 중증도를 감소시키거나 지연시킬 수 있고, 질환의 개시를 지연시키고, 질환의 하나 이상의 증상을 개선시키는 등일 수 있다.
IX. 제품 또는 키트
[0080] 면역 세포를 포함하는 제품 또는 키트가 또한 본원에 제공된다. 면역 세포는 Treg 세포와 같은 T 세포일 수 있다. 키트는 SRC-3 파괴가 없는 세포, SRC-3 파괴를 생성하기 위한 하나 이상의 시약(예를 들어, SRC-3의 녹아웃 또는 녹다운을 구체적으로 촉진하는 핵산 및 단백질 포함), SRC-3이 파괴된 세포, SRC-3을 표적화하는 하나 이상의 제제, 완충액, 염, 사용 지침 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 키트는 SRC-3, T 조절 세포 또는 둘다를 표적화하기 위한 CRISPR 시약을 포함한다.
[0081] 제품 또는 키트는 추가로 개체에서 암을 치료하거나 이의 진행을 지연시키기 위해 면역 세포를 사용하기 위한 지침서를 포함하는 팩키지 삽입물을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 임의의 면역 세포는 제품 또는 키트에 포함될 수 있다. 적합한 컨테이너는 예를 들어, 병, 바이알, 백 및 주사기를 포함한다. 컨테이너는 다양한 재료, 예를 들어, 유리, 플라스틱 (예를 들어, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리올레핀), 또는 금속 합금 (예를 들어, 스테인레스강 또는 니켈-몰리브덴 합금과 같이)으로부터 형성될 수 있다. 일부 구현예에서, 컨테이너는 제형 및 이의 위에 또는 연합된 표지를 보유하고, 상기 컨테이너는 사용 지침을 지적할 수 있다. 제품 또는 키트는 추가로 다른 완충액, 희석제, 충전제, 바늘, 주사기 및 팩키지 삽입물을 사용 지침서와 함께 포함하는, 상업적 및 사용자 견지에서 요구될 수 있는 다른 물질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제품은 추가로 하나 이상의 또 다른 제제 (예를 들어, 화학치료학적 제제 및 항-신생물제)를 포함한다. 하나 이상의 제제를 위해 적합한 컨테이너는 예를 들어, 병, 바이알, 백 및 주사기를 포함한다.
실시예
[0082] 하기 실시예들은 본 개시 내용의 바람직한 실시형태를 입증하기 위해 포함된다. 하기 실시예들에 개시된 기술은 본 개시 내용의 실시에서 잘 기능하도록 발명자에 의해 발견된 기술을 나타내며, 따라서 본 개시 내용의 방법 및 조성물의 실시를 위해 특정 방식을 구성하도록 고려될 수 있다는 것을 당해 분야의 통상의 기술자가 인식해야 한다. 그러나, 본 개시 내용에 비추어, 개시되는 특정 실시형태에서 다수의 변화가 이루어질 수 있으며 본 개시 내용의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 유사하거나 비슷한 결과를 여전히 얻을 수 있다는 것을 당해 분야의 통상의 기술자가 인식해야 한다.
실시예 1
SRC-3은 면역 세포 집단을 제어한다
[0083] 유방암 세포에서 SRC-3(유전자명: NCOA3)의 세포 자율 발암 기능은 잘 확립되어 있지만(1-9), 면역 세포에서 발현되는 SRC-3의 역할은 거의 알려져 있지 않다. 마우스에서 Src-3 유전자의 유전학적 결실은 림프 계통의 확장을 초래하여 B 림프구뿐만 아니라 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 수를 증가시킨다((11)에서 처음으로 보고되었고, 이러한 관찰을 요약한 최근 데이터는 도 1에 나타낸다). Src-3 KO 마우스의 말초 혈액에서 CXCL2, IL2, IL1α 및 β, CCL2 및 GCSF를 포함한 여러 사이토킨의 수준이 상승되었다(데이터는 나타내지 않음). 이들 발견은 SRC-3의 면역억제 기능을 밝히고 새로운 전사 면역 체크포인트 조절인자로 강조되며 면역 세포에서 SRC-3의 약리학적 억제가 암세포를 공격하는 능력을 강화할 수 있음을 강력하게 시사한다. 그러나 SRC-3가 이의 역할을 수행하는 정확한 면역 세포 집단은 아직 정의되지 않았다. 공개 데이터세트의 유전자 발현 분석은 SRC-3 발현이 Treg 세포에서 매우 높고 Foxp3 발현과 상관관계가 있음을 밝혔다(도 2). 핵 수용체 신호전달 Atlas(NURSA)에서 선별된 296개의 공동 조절자 중에서 NCOA3(Src-3)은 Treg에서 Foxp3 발현과 두 번째로 가장 상관관계가 높은 보조 활성화제였다(도 3).
실시예 2
Treg에서 SRC-3의 유전학적 파괴는 강력한 유방암 종양 제거를 촉진시킨다.
[0084] SRC-3-/- 마우스가 림프증식성 표현형을 갖고 Treg에서 SRC-3 발현의 파괴가 상기 세포 유형에서 면역억제 단백질의 감소된 발현을 초래한다는 것을 보여주는 이전에 보고된 데이터를 고려하여, 본원 발명자들은 마우스 유전자 모델 시스템을 사용하여 'Treg 구획'에서 특이적으로 면역 체크포인트 조절 단백질로서 SRC-3을 특징분석하였다. 본원 발명자들은 10세대 동안 SRC-3flox/flox 마우스를 순수한 C57BL/6J 배경으로 역교배한 다음 이 마우스를 이미 C57BL/6J 배경에 있는 Foxp3:EGFP-Cre-ERT2 마우스와 교배하여 Treg:SRC-3KO 마우스를 생성하였다.
[0085] 타목시펜 치료는 Cre를 활성화하여 Treg에서 특이적으로 SRC-3 유전자를 파괴한다. 유전학적으로 가공된 상기 마우스 모델 시스템을 사용하여 SRC-3 유전자 파괴의 효과는 아래 나타낸 E0771 마우스 유선 종양 세포주를 포함하는 C57BL/6J 배경과 상용성인 광범위한 면역적격, 동계 종양 세포주에서 시험하였다. E0771 종양은 특히 공격적이고 상기 모델 시스템에서 종양 성장을 제어하기 어렵다는 것이 잘 알려져 있다. 그러나, SRC-3가 Treg에서 특이적으로 파괴된 숙주 마우스에서는 종양이 본질적으로 근절된 반면, 야생형 숙주 동물에서는 종양이 빠르게 큰 크기로 성장하였다(도 4).
[0086] 이러한 연구의 결과는 SRC-3가 새로 발견된 주요 면역 체크포인트 조절 표적임을 강력하게 입증한다. 상기 동물 모델 실험의 또 다른 예상치 못한 중요한 결과는 동물이 체중이나 활동의 큰 변화 없이 정상적인 크기의 비장을 가지고 건강해 보였다는 것이다. 이는 중증의 자가면역 표현형을 갖고 조기에 사망하는 Foxp3 돌연변이된 스커피(scurfy) 마우스와 대조적이다. 특정 구현예에서, Treg:SRC-3KO 마우스는 Foxp3 세포에서 SRC-3의 유전학적 파괴가 Treg의 면역억제 활성의 서브세트만을 파괴하기 때문에 스커피 마우스와 상이하다. 클리닉의 기존 면역 체크포인트 조절인자 약물은 강력하고 용량 제한적이며 생명을 위협하는 부작용 프로필을 갖고 있다. 따라서, 특정 구현예에서 SRC-3 SMI를 사용한 Treg 생물학의 특정 양상만의 억제는 일반적으로 다른 조직에서 원하지 않는 면역계 이벤트를 과도하게 자극하지 않고 종양 관련 면역억제만을 표적화하는 것을 가능하게 한다.
실시예 3
Treg에서 SRC-3의 CRISPR 기반 표적화
[0087] 유전학적으로 가공된 마우스 모델은 Treg에서 SRC-3의 특이적 표적화가 공격적인 유선 암종을 근절한다는 것을 입증한다. 상기 발견을 임상적으로 해독 가능한 치료학적 치료제로 해독하기 위해, 본원 발명자들은 아래에 설명된 CRISPR 기반 접근법을 사용하여 마우스 면역 세포에서 SRC-3 유전자를 표적화하는 방법을 개발하였다. 특정 구현예에서, 유전학적으로 변경된 세포는 동계 마우스 모델 시스템에서 유방 종양을 제거하기 위한 입양 치료요법을 위한 T 세포/Treg의 공급원으로 사용된다. 상기 공정은 (예를 들어) 유방암이나 다른 암에 걸린 사람 환자를 치료하는 데 유용한 사람 CD4+ 세포에 적용될 수 있다.
[0088] 12주령 수컷 C57BL/6 마우스로부터 비장을 수거하였다. 주사기의 플런저 말단을 사용하여 40 μm 셀 스트레이너를 통해 비장을 으깨서 비장 세포의 단일 세포 현탁액을 제조하였다. 비장 세포 현탁액을 원추형 튜브에 넣고 원심분리(1500rpm, 5분)하고 적혈구 펠릿을 RBC 제거 완충액(Sigma R 7757)을 사용하여 RBC 제거에 적용하여 베이지색 림프구 펠릿을 생성하였다. CD28/IL2/MeSH가 보충된 전체 RPMI 배지(L-glu, FBS, 항생제)를 사용하여 CD3 코팅된 플레이트에 림프구를 분주하였다. 배양 3일 후, 세포 생존율을 평가하고(80%) 벌크 림프구를 Miltenyi CD4 농축 키트(130-104-545)를 사용하여 CD4 농축에 적용하였다. 농축된 CD4 세포(40M)를 상기된 조건에서 추가로 2일 동안 분주하여 세포 집단을 1억개 이상의 세포로 확장시킨다.
[0089] 핵감염: 농축되고 확장된 CD4 세포 집단은 Lonza 4D 뉴클레오펙터 및 1차 세포 핵감염 키트(Lonza V4XP-3024)를 사용하여 Cas9-NCoA3 가이드 RNA(gRNA) 리보핵단백질(RNP)을 사용한 핵감염에 적용하였다. RNP는 형광 표지된 trcrRNA(IDT #1075928)와 crRNA(IDT)를 1:1 비율로 혼합하여 제조하였다(11.25μl TrcrRNA-ATTO 550과 3개의 특유의 crRNA - 각각 3.75μl). gRNA (trcrRNA+crRNA로 구성된)는 15분동안 37℃에서 항온처리하였다. 이어서 gRNA(농도 50μM)를 Cas9 단백질(IDT # 1081059, 농도 60μM)과 3:1의 비율로 혼합하여 과량의 gRNA 성분을 갖는 15μM RNP를 생성하였다. RNP를 37℃에서 15분 동안 항온처리한 다음 1:5 비율로 핵감염 완충액과 혼합하였다. 13개의 핵감염 반응물을 제조하였다 - 각 반응에는 8백만에서 1천만 개의 CD4 세포와 130μl의 RNP-핵감염 완충액 혼합물을 함유하였다(RNP의 최종 농도는 3.5μM이고 gRNA 성분은 3배 과량임). 핵감염은 각 뉴클레오쿠벳(nucleocuvvete)을 제조업체의 EN138 펄스 프로그램에 적용하여 4D 뉴클레오펙터에서 수행되었다.
[0090] 핵감염 후, 세포에 배양 배지를 공급하고 CD3로 덮인 배양 접시로 옮겼다. 밤새 회수한 후, 세포를 유동 세포측정법으로 분류하여 (형광 표지된 gRNA를 추적함으로써) 핵감염된 집단을 분리할 수 있도록 하였다.
[0091] 분류된 집단(양성 및 음성)을 5일 동안 배양하여 유전학적 편집이 일어나고 단백질 전환 및 세포 확장이 일어나도록 하였다. 이어서, 이들 세포로부터 전체 RNA를 단리하고, SRC-3(유전자 기호 Ncoa3) 발현의 파괴를 시험하기 위해 2단계 RT-qPCR을 수행하였다.
[0092] 이들 결과는 T 림프구에서 SRC-3의 CRISPR 기반 파괴가 강력하고 입양 T 세포 전달과 같은 추가 다운스트림 적용을 위해 생존 가능하고 확장 가능한 세포의 높은 수율을 생성한다는 것을 입증한다.
[0093] 상기 데이터는 SRC-3이 Treg에서 주요 표적임을 강력하게 암시하고, 상기 세포 구획의 특정 파괴는 유방암 동계 종양 모델에서 종양 박멸을 유도한다. Treg에서 SRC-3을 파괴하는 본원 개시내용의 전략은 다른 면역 체크포인트 억제제와 구별되는데 그 이유는 SRC-3이 전반적으로 이들의 기능을 제거하는 것 없이 잠재적으로 중증의 부작용과 관련된 종양 근절을 촉진시키는 방식으로 Treg의 기능을 조절하는 핵 단백질이기 때문이다. 본원 개시내용은 CRISPR 기반 유전자 표적화를 사용하여 마우스로부터 수득된 T 세포에서 SRC-3을 생체외에서 특이적으로 제거하는 접근법을 제공한다. 사람 CD4+ 림프구를 사용하여 적용할 때 상기 방법은 사람 암 치료를 위한 입양 T 세포/Treg 기반 치료제로서 명확하고 해독 가능한 잠재력을 갖고 있다.
실시예 4
유방 종양 함유 마우스로 입양 SRC-3 KO Treg 세포 전달
[0094] SRC-3-/- 마우스가 림프증식성 표현형을 갖고 Treg에서 SRC-3 발현의 파괴가 상기 세포 유형에서 면역억제 단백질의 감소된 발현을 초래한다는 것을 보여주는 이전에 보고된 데이터를 고려하여, 본원 발명자들은 마우스 유전자 모델 시스템을 사용하여 "Treg 구획(compartment)"에서 특이적으로 면역 체크포인트 조절 단백질로서 SRC-3을 특징분석하였다. 본원 발명자들은 10세대 동안 SRC-3flox/flox 마우스를 순수한 C57BL/6J 배경으로 역교배한 다음 상기 마우스를 이미 C57BL/6J 배경에 있는 Foxp3:EGFP-Cre-ERT2 마우스와 교배하여 Treg:SRC-3KO C57BL/6J 마우스를 생성하였다.
[0095] 타목시펜 치료는 Cre를 활성화하여 Treg 세포에서 특이적으로 SRC-3 유전자를 파괴한다. 상기 유전학적으로 가공된 마우스 모델 시스템은 SRC-3 KO Treg 동물로부터 제거된 비장으로부터 단리된 SRC-3 녹아웃(KO) Treg 세포를 생산하는 데 사용되었다. 대략 160만 개의 SRC-3 KO Treg 세포가 비장으로부터 단리되었고, 단리된 SRC-3 KO Treg 세포는 92% 생존하였다. 대조군으로서 SRC-3 flox/flox(SRC-3F/F) 마우스에서 제거한 비장에서도 Treg 세포(대략 190만 개)를 단리하였고, 단리된 대조군 세포는 93% 생존하였다.
[0096] 단리된 SRC-3 KO Treg 세포의 효과는 E0771 세포로부터 유래된 종양이 있는 C57BL/6J 마우스에서 시험하였고, E0771 세포는 원래 C57BL/6 마우스의 자발적 종양으로부터 단리된 뮤린 유선암 세포주로부터 유래된다(도 6). E0771 종양은 특히 공격적이고 면역 온전한 C57BL/6J 마우스에서 E0771 종양 성장을 억제하기 어렵다. 그러나, E0771 종양은 입양 Treg 세포 전달(AT 없음)이 없는 C57BL/6J 마우스에서 E0771 종양의 성장과 비교하여 단리된 SRC-3 KO Treg 세포(90만 세포)로 처리된 마우스에서 본질적으로 근절되었다. 대조적으로, SRC-3F/F 대조군 마우스(Cont Treg, Control SRC-3+ Treg)로부터 90만 Treg 세포의 전달은 입양 Treg 세포 전달 없이 C57BL/6J 마우스에서 E0771 종양의 성장과 비교하여 E0771 세포의 성장을 억제하지 않았다(도 7). 추가로, 입양 SRC-3 KO Treg 세포 전달은 명백한 독성을 유발하지 않았고 SRC-3 KO Treg 세포를 받은 동물은 생식가능한 상태를 유지하였다(데이터는 나타내지 않음).
[0097] 본 연구의 결과는 SRC-3 KO Treg 세포의 입양 전달이 암 치료에 유용하고, 특정 구현예에서 SRC-3 KO Treg 세포가 종양 성장을 제어 및/또는 제거하는 데 사용됨을 입증한다.
참고문헌
[0098] 본 명세서에 언급된 모든 특허 및 공보들은 본 발명이 속한 당업자들의 기술 수준을 나타낸다. 모든 특허 및 공보들은 각각의 개별 문헌이 참조로 인용될 구체적으로 및 개별적으로 지적된 것 처럼 동일한 정도로 참조로 인용된다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
[0099] 본원 개시내용 및 이의 이점이 상세하게 설명되었지만, 첨부된 청구들에 의해 정의되는 바와 같은 본원 개시내용의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변경, 대체 및 변형이 본 명세서에서 이루어질 수 있다는 것을 이해해야 한다. 본 출원의 범위는 본 명세서에 기재되는 공정, 기계, 제조, 물질의 조성물, 수단, 방법들 및 단계들의 특정 구현예에 한정하려는 것은 아니다. 당해 분야의 통상의 기술자는 본원 개시 내용으로부터 용이하게 인식할 것이기 때문에, 본원 개시내용에 기재된 상응하는 구현예와 동일한 결과를 실질적으로 달성하거나 동일한 기능을 실질적으로 수행하는 현재 존재하거나 나중에 개발되는 공정, 기계, 제조, 물질의 조성물, 수단, 방법들 또는 단계들이, 본 발명에 따라 이용될 수 있다. 따라서, 첨부된 청구항들은 이러한 공정, 기계, 제조, 물질의 조성물, 수단, 방법들 또는 단계들을 청구 범위내에 포함시키고자 한다.

Claims (60)

  1. 스테로이드 수용체 보조활성화인자(coactivator)-3(SRC-3)의 파괴를 포함하는 가공된 면역 세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 면역 세포가 T 세포인, 면역 세포.
  3. 제2항에 있어서, 상기 T 세포가 T 조절 세포인, 면역 세포.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 T 세포가 CD4+인, 면역 세포.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포가 CD25+ 세포인, 면역 세포.
  6. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포가 FOXP3+ 세포인, 면역 세포.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 파괴가 감소된 수준의 SRC-3 발현을 갖거나 본질적으로 SRC-3 발현을 갖지 않도록 유전학적으로 변형된 면역 세포로서 추가로 정의되는, 면역 세포.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포가 하나 이상의 가이드 RNA 및 Cas9 효소를 사용하여 가공되는, 면역 세포.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포가 대상체에 대해 자가인, 면역 세포.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포가 개체에 대해 동종이계인, 면역 세포.
  11. 하기를 포함하는 조성물:
    (a) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 면역 세포; 및
    (b) SRC-3을 표적화하는 하나 이상의 제제.
  12. 제11항에 있어서, (a) 및 (b)가 상이한 제형으로 있는, 조성물.
  13. 제11항에 있어서, (a) 및 (b)가 동일한 제형으로 있는, 조성물.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, SRC-3을 표적화하는 상기 제제가 소분자 억제제, 항체, 단백질, 핵산 또는 이들의 조합인, 조성물.
  15. 제14항에 있어서, SRC-3의 상기 소분자 억제제가 버팔린(Bufalin), 고시폴(gossypol), 베루카린(Verrucarin) A, SI-2, SI-10, SI-12, 이들의 기능적 유도체 또는 이들의 조합인, 조성물.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체인, 조성물.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 5E11, LS-C801929, PA1-845, AX15.3, PA5-29854, EPR4374(3), 또는 이의 조합인, 조성물.
  18. 치료학적 유효량의 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 세포를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 암을 치료하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 암이 SRC-3+ 암인, 방법.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 암이 유방암, 난소암, 자궁내막암, 전립선암, 위암, 다발성 골수종, 갑상선암 또는 췌장암인, 방법.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여 단계 전에, 상기 세포가 SRC-3을 표적화하는 유효량의 하나 이상의 제제에 생체외 노출되는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, SRC-3을 표적화하는 상기 제제가 소분자 억제제, 항체, 단백질, 핵산 또는 이들의 조합인, 방법.
  23. 제22항에 있어서, SRC-3의 상기 소분자 억제제가 버팔린, 고시폴, 베루카린 A, SI-2, SI-10, SI-12, 이들의 기능적 유도체 또는 이들의 조합인, 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체인, 방법.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 5E11, LS-C801929, PA1-845, AX15.3, PA5-29854, EPR4374(3), 또는 이의 조합인, 방법.
  26. 제18항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체가 치료학적 유효량의 추가의 암 치료요법을 투여받는, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 추가의 암 치료요법이 수술, 조사, 화학치료요법, 호르몬 치료요법, 약물 치료요법, 단백질 치료요법, 면역치료요법 또는 이의 조합을 포함하는, 방법.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 추가의 암 치료요법이 SRC-3을 표적화하는 하나 이상의 제제를 포함하는, 방법.
  29. 제28항에 있어서, SRC-3을 표적화하는 상기 제제가 소분자 억제제, 항체, 단백질, 핵산 또는 이들의 조합인, 방법.
  30. 제29항에 있어서, SRC-3의 상기 소분자 억제제가 버팔린, 고시폴, 베루카린 A, SI-2, SI-10, SI-12, 이들의 기능적 유도체 또는 이들의 조합인, 방법.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체인, 방법.
  32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 5E11, LS-C801929, PA1-845, AX15.3, PA5-29854, EPR4374(3), 또는 이의 조합인, 방법.
  33. 제26항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 및 상기 추가의 암 치료요법이 실질적으로 동시에 개체에 투여되는, 방법.
  34. 제26항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 및 상기 추가의 암 치료요법이 상이한 시점에 개체에 투여되는, 방법.
  35. 제26항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 및 상기 추가의 암 치료요법이 동일한 제형으로 있는, 방법.
  36. 제26항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 및 상기 추가의 암 치료요법이 상이한 제형으로 있는, 방법.
  37. 제18항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 정맥내, 복강내, 동맥내, 국소, 흡입, 근육내, 흉골내, 관절내 주사 또는 주입에 의해 투여되는, 방법.
  38. 제18항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 1회 또는 수회 투여되는, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 세포가 수회 개체에게 투여되는 경우, 투여 간격이 1-24시간, 1-7일, 1-4주 또는 1-12개월 이내인, 방법.
  40. 치료학적 유효량의 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항의 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 암을 치료하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, (a) 및 (b)가 상이한 제형으로 개체에게 투여되는, 방법.
  42. 제40항에 있어서, (a) 및 (b)가 동일한 제형으로 개체에게 투여되는, 방법.
  43. 제41항에 있어서, (a) 및 (b)가 실질적으로 동시에 개체에게 투여되는, 방법.
  44. 제41항에 있어서, (a) 및 (b)가 상이한 시점에 개체에게 투여되는, 방법.
  45. 제44항에 있어서, (a) 및 (b)가 상이한 시점에 개체에게 투여되는 경우, (a) 및 (b)의 투여 간격이 1-24시간, 1-7일, 1-4주 또는 1-12개월 이내인, 방법.
  46. 제40항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 1회 또는 상이한 시점에 개체에게 투여되는, 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 조성물이 상이한 시점에 개체에게 투여되는 경우, 투여 간격이 1-24시간, 1-7일, 1-4주 또는 1-12개월 이내인, 방법.
  48. 제40항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 SRC-3+ 암인, 방법.
  49. 제40항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 유방암, 난소암, 자궁내막암, 전립선암, 위암, 다발성 골수종, 갑상선암 또는 췌장암인, 방법.
  50. 제40항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여 단계 전에, (a)에서의 세포가 SRC-3을 표적화하는 유효량의 하나 이상의 제제에 생체외 노출되는, 방법.
  51. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포에서 SRC-3의 발현을 파괴시키는 단계를 포함하는, 면역 세포를 생성시키는 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 면역 세포가 T 세포인, 방법.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서, 상기 면역 세포가 Treg인, 방법.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서, 상기 방법이 하기와 같이 추가로 정의되는, 방법:
    (a) CD4+ T 세포 또는 CD4+ Treg를 각각 수득하는 단계; 및
    (b) CD4+ T 세포 또는 CD4+ Treg를 각각 T 세포 또는 Treg 각각에서 내인성 SRC-3의 발현을 파괴하는 하나 이상의 제제에 노출시키는 단계.
  55. 제54항에 있어서, 상기 T 세포 또는 Treg가 비장, 골수, 혈액, 혈장 또는 이들의 조합으로부터 수득되는, 방법.
  56. 제54항 또는 제55항에 있어서, CD4+ T 세포로부터 T 조절 세포를 수득하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  57. 제56항에 있어서, 상기 T 조절 세포가 CD25+ 및/또는 Fox3p+인, 방법.
  58. 제54항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포에서 내인성 SRC-3의 발현을 파괴하는 하나 이상의 제제가 핵산을 포함하는, 방법.
  59. 제58항에 있어서, 상기 T 세포에서 내인성 SRC-3의 발현을 파괴하는 하나 이상의 제제가 CRISPR 시약을 포함하는, 방법.
  60. 제51항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포를 SRC-3을 표적화하는 유효량의 하나 이상의 제제에 생체외 노출시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
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