BRPI0710820A2 - processo para a purificação do vìrus da estomatite vesicular (vsv) do fluido de cultura celular de uma cultura de células de mamìferos infectada com vsv; vsv purificado de acordo com o processo; composição farmacêutica; e composição imunogênica - Google Patents

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Abstract

PROCESSO PARA A PURIFICAçAO DO VIRUS DA ESTOMATITE VESICULAR (VSV) DO FLUIDO DE CULTURA CELULAR DE UMA CULTURA DE CéLULAS DE MAMìFEROS INFECTADA COM VSV; VSV PURIFICADO DE ACORDO COM O PROCESSO; COMPOSIçAO FARMACêUTICA; E COMPOSIçAO IMUNOGêNICA Descrevem-se aqui novos processo de purificação para a obtenção de vírus da estomatite vesicular (VSV) de melhor pureza a partir de cultura de células de mamíferos. Mais particularmente, em certas modalidades, descreve-se um processo para a purificação de VSV do fluído de cultura celular de uma cultura de células de mamíferos infectada com VSV, o processo compreendendo: a clarificação do fluido de cultura celular por centrifugação de baixa velocidade e a recuperação do VSV no sobrenadante; a filtração do sobrenadante através de um filtro de 0,2 a 0,45 pm e recuperação do VSV na solução filtrada; carregamento da solução filtrada de VSV em um adsorvedor de membrana de troca de ânions equilibrado com uma primeira solução de sal de pH tamponado, eluindo-se o VSV do adsorvedor de membrana de troca de ánions com uma segunda solução de sal de pH tamponado e recuperando-se as frações de VSV 4uídas; a purificação do VSV recuperado por filtração de fluxo tangencial (TFF) usando-se uma membrana de TFF com um corte de peso molecular entre 300 kDa e 1.000 kDa e recuperando-se o VSV no material retido, e a filtração do material retido de VSV através de um filtro de 0,2 a 0,22 <109>m e recuperação do VSV na solução filtrada.

Description

"PROCESSO PARA A PURIFICAÇÃO DO VÍRUS DAESTOMATITE VESICULAR (VSV) DO FLUIDO DE CULTURA CELULARDE UMA CULTURA DE CÉLULAS DE MAMÍFEROS INFECTADA COMVSV; VSV PURIFICADO DE ACORDO COM 0 PROCESSO;COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA; E COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA"
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
O vírus da estomatite vesicular (VSV) , ummembro da família Rhabdoviridae, tem um genoma de RNAde fita única, em sentido negativo e não segmentado.Seu genoma de onze kb tem cinco genes que codificamcinco proteínas estruturais do vírus: a proteína denucleocapsídeo (N), que é requerida em quantidadesestequiométricas para a encapsidaçâo do RNA replicado;a fosfoproteína (P), que é um co-fator da RNApolimerase dependente de RNA (L); a proteína de matriz(M) e a glicoproteína de fixação (G) (por exemplo, vejaGallione et al.r 1981 J. Virol., 39:529-535; Rose eGallione, 1981, J. Virol., 39:519-528; patente norte-americana n° 6.033.886; patente norte-americana n°6.168.943).
Em geral, o VSV não é considerado um patógenohumano e, dessa forma, imunidade preexistente contraVSV é rara na população humana. Assim,. odesenvolvimento de vetores derivados de VSV tornou-se ofoco em áreas como composições imunogênicas (porexemplo, vacinas) e a distribuição de genes quecodifiquem proteínas terapêuticas. Por exemplo, estudosestabeleceram que o VSV pode servir como um vetorefidaz para a expressão da proteína hemablutinina dovírus da influenza (Roberts et al.r 1999 J. Virol.,73:3723-3732), proteína H do vírus do sarampo(Schlereth et al.f 2000 J. Virol., 74:4652-4657) eproteínas env e gag de HIV-I (Rose et al., 2001 Cell,106(5) :539-49) . Outras características do VSV que otornam um vetor atraente incluem: (a) a capacidade dese replicar de maneira robusta em uma cultura celular;(b) a capacidade de se integrar no DNA da célulahospedeira ou sofrer recombinação genética; .(c) aexistência de múltiplos serotipos, permitindo apossibilidade de estratégias de imunização primária-reforço; (d) genes de interesse estranhos podem serinseridos no genoma do VSV e expressados pelatranscriptase viral; e (e) o desenvolvimento de umsistema especializado para resgate de vírus infecciososa partir de uma cópia de cDNA do genoma do vírus (porexemplo, veja a patente norte-americana n° 6.033.886;patente norte-americana n° 6.168.943).A produção de composições imunogênicasvetorizadas por VSV inclui genericamente a infecção deuma cultura celular adequada (hospedeira) com VSVrecombinante, o cultivo do VSV em cultura celular, acolheita do fluido de cultura celular no momentoapropriado e a purificação do VSV do fluido de culturacelular. O uso de vetores VSV, e suas composiçõesimunogênicas, em aplicações clinicas requer amostras(ou doses) de VSV de pureza apropriada, para atenderaos regulamentos de segurança das várias autoridades desegurança de fármacos em todo o mundo (por exemplo, oDepartamento de Alimentos e Fármacos (FDA), a AgênciaEuropéia de Medicamentos (EMEA), o DepartamentoCanadense de Produtos Para Saúde e Alimentos (HPFB), eoutros).
Entretanto, é tipicamente difícil separar VSVdos contaminantes da cultura celular (por exemplo,proteínas e DNA de impureza da cultura celular) e obterVSV de pureza e rendimento apropriados usando osprocessos de purificação de VSV atualmente disponíveis(por exemplo, purificação mediante centrifugação comgradiente de sacarose). Por exemplo, usando-se osprocessos de purificação atualmente disponíveis, hátipicamente uma relação inversa entre a pureza e arecuperação (porcentagem de rendimento) das amostras deVSV, tornando, dessa forma, difícil de fabricarquantidades suficientes de VSV purificado. Além disso,nos atuais processos à base de biorreatores, maioresconcentrações de células e tempos de cultura maislongos resultam em títulos mais elevados de VSV, comconcomitantes aumentos de detritos celulares econcentrações de constituintes orgânicos no fluido dobiorreator, complicando ainda mais os processos depurificação de VSV.
A ultracentrifugação com gradiente desacarose é o método padrão para purificação de vírus(incluindo a purificação de VSV) desde 1964 (Yamada etal., 2003 BioTechniques, 34 (5):1074-1078, 1080; Brownet al., 1967 J. Immun., 99(1): 171-7; Robinson et al.,1965 Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 54 (1):137-44;Nishimura et al., 1964 Japan. J. Med. Sei. Biol.,17(6) :295-305). Entretanto, quando as concentrações devírus aumentam, também ocorrem aumentos concomitantesde detritos celulares, DNA de hospdeiro e impurezas deproteínas, que são muito difíceis de remover aconcentrações mais elevadas mediante ultracentrifugaçãocom gradiente de sacarose. Além disso, aultracentrifugação com gradiente de sacarose éextremamente cara para ser feita em escala. Aconcentração e purificação de VSV por precipitação compolietileno glicol (PEG) (McSharry et al., 1970 Virol.,40(3):745-6) tem problemas similares de altos níveis deimpurezas.
Vírus de qualidade relativamente alta foramobtidos mediante cromatografia de exclusão de tamanho(Transfiguracion et al., 2003 Human Gene Ther.,14 (12) :1139-1153; Vellekamp, et al., 2001 Human GeneTher., 12 (15) :1923-36; Rabotti et al., 1971 ComptesRendus des Seances de 1'Academie des Sciences, Serie D:Sciences Naturelles, 272 (2):343-6; Jacoli et al., 1968Biochim. Biophys. Acta, Genl Subj., 165 (2) :99-302) .Entretanto, devido aos custos do processo edificuldades operacionais, em geral não é exeqüívelpara produção de vírus em grande escala. Acromatografia de afinidade, como heparina (Zolotukhinet al., 1999 Gene Ther., 6 (6) : 973-985) , lectina(Kaarsnaes et al., 1983 J. Chromatog., 266:643-9;Kristiansen et al., 1976 Prot. Biol. Fluids, 23:663-5)e Matrex™ Cellufine™ sulfato (Downing et al., 1992 J.Virol. Meth., 38 (2):215-228), encontrou algumaaplicação na purificação de vírus. Heparina e lectinaem geral não são preferidas (ou usadas) para a produçãode vírus cGMP devido a possíveis problemas delixiviação, que requereriam testes adicionais antes daliberação do produto.
A purificação por afinidade de vírus usandoMatrex™ Cellufine™ sulfato é uma questão nãoresolvida, devido à eficiência da purificação do vírus,qualidade do vírus e regeneração da coluna. Para apurificação de VSV, são necessárias colunas deafinidade muito grandes (por exemplo, 0,2 L de resinaMatrex™ Cellufine™ sulfato por litro de culturacelular; resultados não publicados da Wyeth Vaccine).Observou-se um baixo rendimento de vírus quandopurificado mediante cromatografia de troca de íons,isoladamente ou em combinação com outros tipos detécnicas cromatográficas tradicionais usadas napurificação de vírus (Publicação de PatenteInternacional n° W02006/011580; Specht et al., 2004Biotech. Bioeng., 88 (4):465-173; Yamada et al., 2003,citado acima; " Vellekamp et al., 2001, citado acima;Zolotukhin et al., 1999, citado acima; Publicação dePatente Internacional n° W01997/06243; Kaarsnaes etal.,1983, citado acima).
Assim, há uma necessidade atual e nãoatendida na técnica de processos de purificação quepossam gerar VSV em um nivel apropriado de pureza erecuperação (rendimento).
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Os processos e composições aqui descritos sereferem genericamente aos campos de virologia,microbiologia, imunologia e desenvolvimento deprocessos. Mais particularmente, descrevem-se novosprocessos de purificação para a obtenção de virus daestomatite vesicular (VSV) com melhores pureza erendimento.
Em um aspecto, um processo para a purificaçãode VSV de fluido de cultura celular de uma cultura decélulas de mamífero infectadas com VSV compreende asetapas de: (a) clarificação primária, (b) clarificaçãosecundária, (c) adsorção em membrana de troca deânions, (d) filtração de fluxo tangencial e (e)filtração. Em uma modalidade, a etapa (a) compreende aclarificação do fluido de cultura celular porcentrifugação a baixa velocidade e a recuperação do VSVno sobrenadante. Em uma modalidade, a etapa (b)compreende a filtração do sobrenadante através de umfiltro de 0,2 a 0,45 μm e a recuperação do VSV nasolução filtrada. Em outra modalidade, a etapa (c)compreende o carregamento da solução filtrada de VSV emum adsorvedor de membrana de troca de ânionsequilibrada com uma primeira solução de sal de pHtamponado, a eluição do VSV do adsorvedor de membranade troca de ânions com uma segunda solução de sal de pHtamponado e a recuperação das frações de VSV eluidas.Em uma modalidade, a etapa (d) compreende a purificaçãodo VSV recuperado por filtração de fluxo tangencial(TFF), usando-se uma membrana de fibras ocas com umcorte de peso molecular entre 300 kDa e 1.000 kDa, e arecuperação do VSV no material retido. Em umamodalidade, a etapa (e) compreende a filtração domaterial retido de VSV através de um filtro de 0,2 a0,22 μm e a recuperação do VSV na solução filtrada.
Em certas modalidades, as células da culturade células de mamífero são selecionadas de célulasrenais embrionárias humanas (HEK) , células HEK 293,células de ovário de hamster chinês (CHO), célulasrenais de hamster filhote (BHK) e células renais demacaco verde africano (AGMK), também conhecidas comocélulas Vero.
Em certas modalidades, a etapa decentrifugação a baixa velocidade do processo depurificação é entre 4.400 χ g e 8.000 χ g. Em umamodalidade particular, a centrifugação a baixavelocidade é a 6.238 χ g.
Em outra modalidade, o filtro de 0,2 a 0,45μm é uma unidade de filtro Millipore Millex®-GV, umaunidade de filtro Millipore MillexO-GP, uma unidade defiltro Pall Supor®, uma unidade de filtro SartoriusSartobran™ ou uma unidade de filtro SartoriusSartopore™ 2. Em uma modalidade particular, o filtro éuma unidade de filtro Sartorius Sartobran™ de 0,2 μπι.
Em outras modalidades, o adsorvedor demembrana de troca de ânions é um adsorvedor de membranaSartorius Sartobind™ Q ou um adsorvedor de membranaPall Mustang™ Q. Em uma modalidade particular, oadsorvedor de membrana de troca de ânions é umadsorvedor de membrana Pall Mustang™ Q.
Em certas outras modalidades, o sal naprimeira solução de sal de pH tamponado na etapa (c) éNaCl ou KCl. Em outra modalidade, a força iônica doNaCl ou KCl é de 0, 1 M a 0, 4 M. Em uma modalidadeparticular, o sal é NaCl, e a força iônica do NaCl é de0,3 M.
Em outra modalidade, o sal na segunda soluçãode sal de pH tamponado na etapa (c) é NaCl ou KCl. Emuma modalidade particular, o sal na segunda solução desal de pH tamponado é NaCl. Em uma modalidadeparticular, a força iônica do NaCl na segunda soluçãode sal de pH tamponado está entre 0,5 M e 0,75 M. Emoutra modalidade particular, a força iônica do NaCl nasegunda solução de sal de pH tamponado é de 0,6 M. Emainda outras modalidades, a força iônica do NaCl nasegunda solução de sal de pH tamponado é de 0,75 M. Emcertas outras modalidades, a segunda solução de sal depH tamponado tem uma taxa de fluxo de eluição de 10volumes de cápsula/minuto (CV/minuto) a 30 CV/minuto.Em ainda outras modalidades, a taxa de fluxo de eluiçãoé de 20 CV/minuto.
Em certas outras modalidades, a força iônicado NaCl na segunda solução de sal de pH tamponado élinearmente aumentada de 0,001 M a 0,75 M a uma taxa defluxo de eluição de 10 CV/minuto a 30 CV/minuto. Em umamodalidade particular, a taxa de fluxo de gradiente deeluição linear é de 20 CV/minuto.
Em ainda outras modalidades, os primeiro esegundo tampões da etapa (c) têm um pKa entre 6,0 e8,5. Em ainda outras modalidades, a primeira solução desal de pH tamponado da etapa (c) tem um pH de 6,5 a8,0. Em uma modalidade particular, a primeira soluçãode sal de pH tamponado tem um pH de 7,5. Em outrasmodalidades, a segunda solução de sal de pH tamponadoda etapa (c) tem um pH de 6,5 a 8,0. Em uma modalidadeparticular, a segunda solução de sal de pH tamponadotem um pH de 7,5.
Em certas outras modalidades, os primeiro esegundo tampões da etapa (c) são tampão fosfato, tampãoácido Ν-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanossulfônico(HEPES) ou tris(hidroximetil)aminometano (TRIS). Emoutra modalidade, as primeira e segunda soluções de salde pH tamponado da etapa (c) também compreendemsacarose a uma concentração de 1,5% a 5%. Em umamodalidade particular, a concentração de sacarose é de2%.
Em certas outras modalidades, a membrana deTFF tem um corte de peso molecular de 300 kDa. Em aindaoutras modalidades, a membrana de TFF tem um corte depeso molecular de 750 kDa. Em ainda outras modalidades,a membrana de TFF tem um corte de peso molecular depelo menos 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800,850, 900, 950 ou 1.000 kDa. Em uma modalidadeparticular, a membrana de TFF é um módulo de membranade fibras ocas. Em outra modalidade, a TFF compreende aconcentração do VSV recuperado da etapa (c) pelo menos5x, seguida por pelo menos uma troca de tampão. Emainda outra modalidade, a TFF compreende a concentraçãodo VSV recuperado da etapa (c) pelo menos 5x, seguidapor pelo menos cinco trocas de tampão. Em umamodalidade particular, o tampão usado na troca detampão é um tampão fosfato, tampão HEPES ou tampãoTRIS, em que o tampão tem uma concentração de 5 mM a 15mM e um pH de 7,2 a 7,5. Em outra modalidade, o tampãode troca de tampão também compreende de 0,10 M a 0,20 Mde NaCl e de 3,5% a 4,5% de sacarose.
Em outras modalidades, as etapas (a) a (e) doprocesso de purificação são realizadas à temperaturaambiente, em que temperatura ambiente é definida comouma temperatura ou temperaturas de ou entre cerca de15°C e cerca de 25°C. Em uma modalidade particular, asetapas (a) a (e) do processo de purificação sãorealizadas a 20°C.
Em ainda outra modalidade, a clarificação dofluido de cultura celular na etapa (a) é por um módulode filtração profunda de 1,0 μπι a 4,5 μπι, em que acentrifugação a baixa velocidade é omitida da etapa(a) . Em modalidades especificas, o módulo de filtraçãoprofunda é um módulo Whatman® Polycap™ HD, um móduloSartorius Sartoclear™P ou um módulo Millipore®Millistak+® HC.Em outro aspecto, VSV de melhor pureza éobtido de uma cultura de células de mamífero. Em certasmodalidades, o VSV purificado é pelo menos 90,0% livrede contaminantes de proteínas e ácidos nucléicos dacultura celular. Em outras modalidades, o VSVpurificado é 99,0% livre de contaminantes de proteínase ácidos nucléicos da cultura celular. Em umamodalidade particular, o VSV purificado é 99,8% livrede contaminantes de proteínas e ácidos nucléicos dacultura celular.
Em certas outras modalidades, fornece-se VSVde melhor pureza, que é purificado e isolado de acordocom os novos processos de purificação aqui descritos.Em certas modalidades, o VSV purificado é caracterizadopor uma oumais das seguintes características: umserotipo de VSV selecionado ou uma combinação deserotipos; uma seqüência genômica compreendendo pelomenos uma mutação ou pelo menos duas mutações, queatenuem a patogenicidade do VSV, uma seqüência genômicacompreendendo uma seqüência de quadro de leitura aberto(ORF) de seqüência polinucleotídica estranha quecodifique uma ou mais de várias proteínas (terapêuticasou imunogênicas) citadas em detalhes na parte dedescrição detalhada do relatório.Outras características e vantagens dascomposições e processos aqui descritos ficarão clarascom a seguinte descrição detalhada, suas modalidadespreferidas e reivindicações.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
A FIG. 1 é um fluxograma mostrando o processode purificação (delineado por caixas pretas) para aobtenção de VSV de melhor qualidade a partir de Ifuidode cultura de células de mamífero.
A FIG. 2A é um gel eletroforético mostrando aseparação de proteínas de VSV por coloração com prataapós purificação em um adsorvedor de membrana Mustang™Q com 2% de sacarose adicionados ao tampão de eluição(10 mM de fosfato de sódio, 1,0 M de NaCl). As pistas 1- 10 são: (1) pré-centrifugação (cultura celular), (2)alimentação, (3) atravessamento e lavagem, (4) 5% detampão B (frações 1-5), (5) 60% de tampão B (frações6-7), (6) 60% de tampão B (frações 8 - 10), (7) 60%de tampão B (frações 11 - 25), (8) 100% de tampão B(frações 26 - 35), (9) regeneração em coluna e (10)padrões Bio-Rad® Precision Plus Protein™. A taxa defluxo para o Mustang™ Q foi de 3,5 mL/minuto com umgradiente de eluição linear. A análise SDS-PAGE foi comum gel de Tris-Glicina a 4 - 20%, e a detecção deproteínas foi por coloração com prata.
A FIG. 2B é um gel eletroforético mostrando aseparação de proteínas de VSV por Western Blot, deacordo com a descrição da Fig. 2A. A detecção porWestern Blot foi com anticorpos policlonais anti-VSV.
A FIG. 3A é um gel eletroforético mostrando aseparação de proteínas de VSV por coloração com prata eWestern Blot após purificação em um adsorvedor demembrana Mustang™ Q, sem adição de sacarose ao tampãode eluição (10 mM de fosfato de sódio, 1,0 M de NaCl).As pistas 1-9 são: (1) alimentação, (2)atravessamento e lavagem, (3) 5% de tampão B (frações 1- 5), (4) 60% B (frações 6 - 11), (5) 60% de tampão B(frações 12 - 25), (6) 100% de tampão B (frações 26 -35), (7) padrões Bio-Rad® Precision Plus Protein™, (8)padrão de VSV (isto é, VSV purificado por gradiente desacarose) e (9) material reunido da regeneração emcoluna. A taxa de fluxo para o Mustang™ Q foi de 3,5mL/minuto (10 CV/minuto) com um gradiente de eluiçãopor etapas. A análise SDS-PAGE foi com um gel de Tris-Glicina a 4 - 20%, e a detecção de proteínas foi porcoloração com prata.A FIG. 3Β é um gel eletroforético mostrando aseparação de proteínas de VSV por Western Blot apóspurificação conforme descrito na Fig. 3Δ. A detecçãopor Western Blot foi com anticorpos policlonais anti-VSV. O tampão B (também chamado de "tampão de eluição")era 10 mM de fosfato de sódio (pH 7,0) e 1 M de NaCl.
A FIG. 4A é uma análise SDS-PAGE (gel deTris-Glicina a 4 - 20%) de VSV por coloração com prata+ coloidal em cada etapa do processo de purificaçãodescrito na Fig. 1. As pistas 1-12 são: (1) pré-centrifugação, (2) pós-centrifugação (Ia clarificação) ,(3) pré-filtração a 0,2 μm, (4) pós-filtração a 0,2 μπι(2a clarificação), (5) material reunido deatravessamento e lavagem do adsorvedor de membranaMustang™ Q, (6) material reunido de frações de eluiçãode VSV do adsorvedor de membrana Mustang™ Q, (7)material retido de VSV de uma TFF UF/DF, (8) materialreunido de concentrado e diafiltração, (9) pré-filtração a 0,2 μm (final), (10) pós-f iltração a 0,2 μm(final) (concentrado a granel purificado de VSV), (11)padrões Bio-Rad® Precision Plus Protein™ e (12)controle de VSV (operação n° 3, concentrado a granelpurificado).A FIG. 4Β é uma análise SDS-PAGE (gel deTris-Glicina a 4 - 20%) de VSV por Western Blot deacordo com o processo descrito na Fig. 4A.
A FIG. 5A é uma comparação por SDS-PAGE (gelde Tris-Glicina a 4 - 20%) de VSV por coloração comprata + coloidal, purificado de acordo com. o processoexposto na Fig. 1, versus VSV purificado porcentrifugação com gradiente de sacarose (pista 11). Aspistas 1-12 são: (1) fluido de cultura celular, (2)pós-centrifugação (Ia clarificação) , (3) pré-filtraçãoa 0,2 μπι, (4) pós-f iltração a 0,2 μπι (2a clarif icação) ,(5) material reunido de atravessamento e lavagem doadsorvedor de membrana Mustang™ Q, (6) frações deeluição de VSV do adsorvedor de membrana Mustang™ Q,(7) material retido de VSV de uma TFF UF/DF, (8) pré-filtração a 0,2 μπι (final), (9) pós-f iltração a 0,2 μπι(final) (concentrado a granel purificado de VSV), (10)Padrões Bio-Rad® Precision Plus Protein™, (11) VSVpurificado por gradiente de sacarose (apenas metade dovolume da pista 9 foi adicionado) e (12) controle deVSV (operação n° 1, concentrado a granel purificado).
A FIG. 5B é uma comparação por SDS-PAGE (gelde Tris-Glicina a 4 - 20%) de VSV por Western Blot,purificado de acordo com o processo exposto na Fig. 1,versus VSV purificado por centrifugação com gradientede sacarose (pista 11) conforme descrito na FIG. 5A.
A FIG. 6 é um gráfico de barras mostrando aporcentagem de recuperação de titulo de VSV das quatrooperações em escala aumentada (4,5 L de volume decultura celular). CR N0 1 é a Operação experimental 1,CR N0 2 é a Operação experimental 2, CR N0 3 é aOperação experimental 3 e TT 01 é a Operaçãoexperimental 4 .
A FIG. 7 é um gráfico de barras mostrando aremoção de proteínas de impureza na etapa depurificação em Mustang™Q para o construto VSVinN4CTi-gagl.
A FIG. 8A é um gráfico de barras mostrando arecuperação de VSVNJN4CTi-gagl na triagem sob condiçõesTMAE a pH 6,5.
A FIG. 8B é um gráfico de barras mostrando arecuperação de VSVNJN4CTi-gagl na triagem sob condiçõesTMAE a pH 7,0.
A FIG. 8C é um gráfico de barras mostrando arecuperação de VSVNJN4CTi-gagl na triagem sob condiçõesTMAE a pH 7,5.DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Como o vírus da estomatite vesicular (VSV)tem muitas características que o tornam um vetoratraente para uso em composições imunogênicas e/ou paraa distribuição de genes que codifiquem proteínasterapêuticas conforme acima descrito, há umanecessidade não atendida na técnica de processos depurificação que gerem VSV recombinante de melhor purezaa partir de cultura de células de mamífero. Ascomposições e processos descritos a seguir atendem aessa necessidade. Conforme exposto abaixo nos Exemplos3 - 8, descrevem-se processos aperfeiçoados para apurificação de VSV de cultura de células de mamífero(por exemplo, veja FIG. 1) e o VSV assim purificado.
I. PRODUÇÃO DE VSV EM UMA CULTURA DE CÉLULAS DEMAMÍFERO
A produção de VSV em cultura de células demamífero é bem conhecida por aqueles versados natécnica e inclui, genericamente, a infecção da culturacelular (células hospedeiras) com VSV recombinante, ocultivo do VSV em cultura celular e a colheita dacultura celular no momento apropriado. Como VSV ésecretado da célula hospedeira no meio, o produto deVSV é coletado do fluido de cultura celular.A produção de VSV a partir de cultura decélulas de mamífero e, portanto, os novos processospara a purificação de VSV dela conforme aqui descritoempregam culturas de células de mamífero adequadasusadas para propagar (ou crescer) VSV (um vírus de RNAde fita única, em sentido negativo e não segmentada),que são conhecidos na técnica. Essas culturas celularesincluem, mas não se limitam a, células renaisembrionárias humanas (HEK), como células HEK 293,células renais de macaco verde africano (AGMK), comocélulas Vero, células de ovário de hamster chinês (CHO)e células renais de hamster filhote (BHK).
Além disso, materiais, métodos e técnicas decultura celular são bem conhecidos por aqueles versadosna técnica. Por exemplo, um estoque de semeadura de VSVrecorabinante (por exemplo, um VSV resgatado, veja SeçãoII abaixo) é usado para infectar uma população decélulas hospedeiras confluentes ou uma população decélulas hospedeiras a uma certa densidade (por exemplo,uma cultura de células Vero) em um biorreator a umadada multiplicidade de infecção, o VSV é cultivado emcultura celular durante um dado tempo e temperatura; ea descendência de VSV nascente é colhida no fluido decultura celular. Conforme definido mais adiante, ostermos"fluido de cultura", "fluido de cultura celular","meio de cultura celular", "meio" e/ou "fluido debiorreator" são usados de maneira intercambiável e serefere ao meio ou solução em que se cultiva a culturacelular.
II. PURIFICAÇÃO DE VSV DE UMA CULTURA DECÉLULAS DE MAMÍFERO
Os novos processos para purificação de VSV dofluido de cultura celular de uma cultura de células demamífero infectadas com VSV aqui descritos compreendemcertas etapas de purificação. O fluxograma na FIG. 1delineia o esquema de purificação global, que inclui asetapas de: (a) clarificação primária, (b) clarificaçãosecundária, (c) adsorção em membrana de troca deânions, (d) filtração de fluxo tangencial e (e)filtração. Em maior particularidade, essas etapascompreendem: (a) a clarificação do fluido de culturacelular por centrifugação a baixa velocidade, (b) aclarificação adicional do sobrenadante por filtraçãoatravés de um filtro de 0,2 a 0,45 μπι, (c) apurificação da solução filtrada de VSV em um adsorvedorde membrana de troca de ânions, (d) a troca de tampão ea concentração do VSV por filtração de fluxo tangencial(TFF) e (e) uma filtração final do material retido deVSV através de um filtro de 0,2 a 0,22 μπι. Em certasoutras modalidades, as etapas (a) a (e) do processo depurificação above são realizadas à temperaturaambiente. Conforme definido mais adiante, "temperaturaambiente" é uma temperatura ou temperaturas de ou entrecerca de 15°C e 25°C. Assim, por exemplo, umatemperatura adequada para realizar as etapas (a) a (e)inclui uma temperatura de pelo menos 15, 16, 17, 18,19, 20, 21, 22, 23, 24 e 25°C, inclusive, outemperaturas fracionais entre elas. Em uma modalidadeparticular, as etapas (a) a (e) do processo depurificação são realizadas a 20°C.
(a) Clarificação primária
Em certas modalidades, o fluido de culturacelular de uma cultura de células de mamíferoinfectadas com VSV é clarificado por centrifugação abaixa velocidade (ou, alternativamente, por filtraçãoprofunda) , e o VSV é recuperado no sobrenadante, aquitambém chamada de "clarificação primária (ou Ia)" dofluido de cultura celular. Em certas modalidades, aclarificação primária do fluido de cultura celular éconduzida à temperatura ambiente.
Os métodos e equipamentos de centrifugaçãousados na clarificação primária do fluido de culturacelular são bem conhecidos por aqueles versados natécnica. Conforme definido mais adiante, centrifugaçãoa "baixa velocidade" é uma velocidade de centrifugaçãoabaixo de 10.000 rpm. Em certas modalidades, avelocidade da centrifugação a baixa velocidade parausada clarificar o fluido de cultura celular é umavelocidade de centrifugação na faixa de 4.000 χ g (±100 χ g) a 8.000 χ g (± 100 χ g). Em certas outrasmodalidades, a velocidade da centrifugação a baixavelocidade usada para clarificar o fluido de culturacelular é uma velocidade de centrifugação de pelo menos4.000 χ g, 4.500 χ g, 5.000 χ g, 5.500 χ g, 6.000 χ g,6.500 χ g, 7.000 χ g, 7.500 χ g ou 8.000 χ g ou rpmsentre elas. Em uma modalidade particular, aclarificação primária do fluido de cultura celular porcentrifugação a baixa velocidade é a 6.238 χ g durantetrinta minutos à temperatura ambiente (Exemplo 3,Tabela 2).
Conforme acima mencionado, em certasmodalidades, o fluido de cultura celular de uma culturade células de mamífero infectadas com VSV éalternativamente clarificado (Io) por filtraçãoprofunda (isto é, em vez de centrif ugação a baixavelocidade). A filtração profunda pode ser usada quandoa centrifugação a baixa velocidade é omitida daclarificação primária da etapa (a). Filtração profunda(em contraste com a filtração superficial) se referegenericamente a um filtro "grosso" que capturacontaminantes dentro de sua estrutura. Materiais emétodos de filtração profunda são bem conhecidos poraqueles versados na técnica. Por exemplo, o material defiltro é tipicamente composto por uma estruturacelulósica grossa e fibrosa com auxiliares de filtroinorgânicos, como partículas de terra diatomáceaincrustadas nas aberturas das fibras. Esse material defiltro tem uma grande área de superfície interna, o queé a chave para a captura de partículas e capacidade dofiltro. Esses módulos de filtração profunda contêmporos de tamanhos de diâmetro de ou entre 1,0 μm e 4,5μm, incluindo tamanhos de filtro de pelo menos 1,0,1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0 e 4,5 pm, e tamanhos defiltro fracionários entre eles. Módulos de filtraçãoprofunda exemplificativos incluem, mas não se limitama, módulos Whatman® Polycap™ HD (Whatman Inc.; FlorhamPark, NJ) , módulos Sartorius Sartoclear™ P (SartoriusCorp.; Edgewood, NY) e módulos Millipore® Millistak+®HC (Millipore; Billerica, MA). Em uma modalidadeparticular, o fluido de cultura celular é clarificadomediante filtração profunda (realizada à temperaturaambiente), e o VSV é recuperado no filtrado (Exemplo 3,Tabela 1).
(b) Clarificação secundária
Após a clarificação primária mediantecentrifugação (ou filtração profunda), o sobrenadantede VSV (ou filtrado) é adicionalmente clarificado (2a)por filtração, ou microfiltração, através de um filtrode 0,2 a 0,25 μm e recuperação do VSV na soluçãofiltrada. Em uma modalidade particular, amicrofiltração é realizada à temperatura ambiente,conforme acima definido. Meios de
filtração/microfiltração são disponíveis em uma amplavariedade de materiais e métodos de fabricação, que sãoconhecidos por aqueles versados na técnica. Unidades defiltro de microfiltração exemplificativas incluem, masnão se limitam a, unidades de filtro Millipore Millex®-GV (Millipore; Billerica, MA), unidades de filtroMillipore Millex®-GP, unidades de filtro Pall Supor®(Pall Corp.; East Hills, NY), unidades de filtroSartorius Sartobran™ (Sartorius Corp.; Edgewood, NY) eunidades de filtro Sartorius Sartopore™ 2. Em certasmodalidades, essas unidades de filtração possuem filtrocom um tamanho entre 0,2 e 0,45 μm. Esses filtrosincluem filtros com poros de pelo menos 0,2, 0,25, 0,3,0,35, 0,4 e 0,45 pm e tamanhos de poros fracionáriosentre eles. Em uma modalidade particular, o filtro éuma unidade de filtro Sartorius Sartobran™ de 0,2 pm. 0VSV filtrado é recuperado na solução filtrada.
(c) Adsorção em membrana de troca de ânionsUma vez que o produto de VSV tenha sidorecuperado por clarificação (isto é, Ia e 2a acimadescritas), o VSV é adicionalmente purificado em umadsorvedor de membrana de troca de ânions. Materiaisadsorvedores de membrana são bem conhecidos por aquelesversados na técnica e estão disponíveis em fornecedorescomo a Sartorius Corp. (Edgewood, NY), Pall Corp. (EastHills, NY) e Sigma-Aldrich Corp. (St. Louis, MO).Adsorvedores de membrana de troca de ânionsexemplificativos incluem, mas não se limitam a, umadsorvedor de membrana Sartobind™ Q (Sartorius Corp.)e um adsorvedor de membrana Mustang™ Q (Pall Corp.).Em uma modalidade particular, o adsorvedor de membranade troca de ânions é um adsorvedor de membrana PallMustang™ Q. Em geral, métodos e tampões conhecidos emcromatografia de troca de íons convencional podem serdiretamente aplicados à cromatografia de adsorvedor demembrana, o que é conhecido por aqueles versados natécnica. Em certas modalidades, a cromatografia deadsorvedor de membrana de troca de ânions é realizada àtemperatura ambiente, conforme acima definido .
Assim, em certas modalidades, o VSV épurificado mediante um adsorvedor de membrana de trocade ânions, em que a solução filtrada de VSV daclarificação secundária é carregado no adsorvedor demembrana de troca de ânions equilibrado com umaprimeira solução de sal de pH tamponado (também chamadade "tampão de equilibração" ou "tampão de ligação" aVSV) . 0 VSV é eluido do adsorvedor de membrana de trocade ânions com uma segunda solução de sal de pHtamponado ("o tampão de eluição"), e as frações de VSVeluidas são recuperadas (por exemplo, veja Exemplo 6abaixo).
Em certas modalidades, a primeira solução desal de pH tamponado ou tampão de equilibração é umasolução de sal NaCl ou KCl. 0 NaCl ou KCl está presenteem solução a uma força iônica entre cerca de pelo menos0,1 M e cerca de 0,4 M. Assim, as forças iônicas dossais incluem pelo menos 0,1, 0,2, 0,3 e 0,4 M,incluindo forças iônicas fracionárias entre elas. Emuma modalidade particular, o sal é NaCl, e a forçaiônica da solução de NaCl é de 0,3 Μ. A solução detampão pode ser um tampão fosfato, um tampão ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanossulfônico (HEPES) ouum tampão tris(hidroximetil)aminometano (TRIS). Essestampões, em certas modalidades, têm um pH entre cercade 6,0 e cerca de 8,0, isto é, um pH de pelo menos 6,0,6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8 e 8,0 ounúmeros de pH entre eles. Em uma modalidade particular,a primeira solução de sal de pH tamponado tem um pH de7,5. Em ainda outras modalidades, o primeiro tampão daetapa de adsorção em membrana de troca de ânions tem umpKa entre 6,0 e 8,5, isto é, um pKa de pelo menos 6,0,6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8, 8,0, 8,2,8,4 e 8,5 ou números de pKa entre eles. Em modalidades particulares, o tampão deequilibração também compreende de cerca de 1% desacarose a cerca de 5% de sacarose. Em certasmodalidades, o tampão de equilibração compreende cercade 1% de sacarose. Em uma modalidade particular, aconcentração de sacarose é de 2%. Em outra modalidade otampão compreende cerca de 3% de sacarose. Em outramodalidade, o tampão compreende cerca de 4% desacarose. Em outra modalidade o tampão compreende cercade 5% de sacarose. São utilizáveis ainda outrasporcentagens de concentração de sacarose entre osinteiros acima especificados.
A segunda solução de sal de pH tamponado (o"tampão de eluição") também pode compreender os mesmoscomponentes de tamponamento que o primeiro tampão (deequilibração). Em certas modalidades, a segunda soluçãode sal de pH tamponado ou tampão de equilibração é umasolução de sal NaCl ou KCl. Em uma modalidadeparticular, o sal na segunda solução de sal de pHtamponado é NaCl. 0 NaCl ou KCl está presente emsolução a uma força iônica entre cerca de pelo menos0,1 M e cerca de 0,4 M. Assim, as forças iônicas dossais incluem pelo menos 0,1, 0,2, 0,3 e 0,4 M,incluindo forças iônicas fracionárias entre elas. Emuma modalidade particular, o sal é NaCl, e a forçaiônica da solução de NaCl é de 0,3 Μ. A solução detampão pode ser um tampão fosfato, um tampão ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanossulfônico (HEPES) ouum tampão tris(hidroximetil)aminometano (TRIS) . Essestampões em certas modalidades têm um pH entre cerca de6,0 e cerca de 8,0, isto é, um pH de pelo menos 6,0,6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8, e 8,0 ounúmeros de pH entre eles. Em uma modalidade particular,a segunda solução de sal de pH tamponado tem um pH de7,5. Em ainda outras modalidades, o segundo tampão daetapa de adsorção em membrana de troca de ânions tem umpKa entre 6,0 to 8,5, isto é, um pKa de pelo menos 6,0,6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8, 8,0, 8,2,8,4 e 8,5 ou números de pKa entre eles.
Em modalidades particulares, o tampão deeluição também compreende de cerca de 1% de sacarose acerca de 5% de sacarose. Em certas modalidades, otampão de eluição compreende cerca de 1% de sacarose.Em uma modalidade particular, a concentração desacarose é de 2%. Em outra modalidade, o tampãocompreende cerca de 3% de sacarose. Em outramodalidade, o tampão compreende cerca de 4% desacarose. Em outra modalidade, o tampão compreendecerca de 5% de sacarose. São utilizáveis ainda outrasporcentagens de concentração de sacarose entre osinteiros acima especificados.
Para eluir o VSV da membrana, a concentraçãode sal (NaCl ou KCl) (força iônica) do tampão deeluição é aumentada por gradiente linear ou em umprocesso de eluição em uma única etapa (Exemplo 6) .Ambas as etapas são igualmente eficazes para eluir VSVdo adsorvedor de membrana de troca de ânions. Em umamodalidade particular, a força iônica do NaCl nasegunda solução de sal de pH tamponado está entre 0,5 Me 0,75 M. Em outra modalidade particular, a forçaiônica do NaCl na segunda solução de sal de pHtamponado é de 0,6 M. Em ainda outras modalidades, aforça iônica do NaCl na segunda solução de sal de pHtamponado é de 0,75 M.
Em certas outras modalidades, a segundasolução de sal de pH tamponado tem uma taxa de fluxo deeluição de 10 volumes de cápsula/minuto (CV/minuto) a30 CV/minuto. Assim, em certas modalidades, a taxa defluxo de eluição é de pelo menos 10, 12, 14, 16, 18,20, 22, 24, 26, 28 a 30 CV/minuto, ou taxas entre elas.Em uma modalidade particular, a taxa de fluxo deeluição é de 20 CV/minuto.
Em certas outras modalidades, a força iônicado NaCl na segunda solução de sal de pH tamponado élinearmente aumentada de 0,001 M a 0,75 M a uma taxa defluxo de eluição de 10 CV/minuto a 30 CV/minuto,conforme acima descrito. Em uma modalidade particular,a taxa de fluxo de gradiente de eluição linear é de 20CV/minuto.
(d) Filtração de fluxo tangencial (TFF)Após a purificação de VSV por cromatografiaem adsorvedor de membrana de troca de ânions, o VSV éadicionalmente purificado por filtração de fluxotangencial (TFF). Em geral, a TFF é um processoacionado por pressão, que usa uma membrana(s) paraseparar componentes em uma solução (ou suspensão)liquida), em que um fluido (o fluxo de alimentação) ébombeado tangencialmente ao longo da superfície damembrana, e uma pressão aplicada serve para forçar uma"parte" do fluido através da membrana para o lado dofiltrado (da membrana). Em certas modalidades, a TFF érealizada à temperatura ambiente. Nesse processo, otampão é trocado, e o VSV é concentrado. Em umamodalidade, a TFF compreende a concentração do VSVrecuperado da etapa de adsorção em membrana de troca deânions pelo menos 5 times, seguida por pelo menos umatroca de tampão. Em outra modalidade, a TFF compreendea concentração do VSV recuperado da etapa de adsorçãoem membrana de troca de ânions pelo menos cinco a dezvezes, seguida por pelo menos cinco, ou pelo menosseis, trocas de tampão. Ainda outras modalidadesenvolvem pelo menos duas, pelo menos três, pelo menosquatro, pelo menos cinco, ou pelo menos seis trocas detampão após a concentração do VSV recuperado da etapade adsorção em membrana de troca de ânions.Materiais de TFF (por exemplo, fibras ocas,enrolados em espiral, placa plana) e métodos (porexemplo, ultrafiltração (UF), diafiltração (DF),microfiltração) são bem conhecidos por aqueles versadosna técnica. Em certas modalidades, a membrana de TFFtem um corte de peso molecular de 300 kDa. Em certasmodalidades, a membrana de TFF tem um corte de pesomolecular de 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650 ou 700kDa. Em ainda outra modalidade, a membrana de TFF temum corte de peso molecular de 750 kDa. Em umamodalidade, a membrana de TFF é um módulo de membranade fibras ocas.
Em uma modalidade particular, o tampão usadona troca de tampão de uma TFF é um tampão fosfato,tampão HEPES ou tampão TRIS-, conforme acima descrito.Entretanto, o tampão, em certas modalidades, tem umaconcentração de 5 mM a 15 mM, incluindo concentraçõesde pelo menos 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM e 15 mM, e também concentraçõesem mM entre elas. Em certas modalidades, o tampão temum pH entre cerca de 7,2 e 7,5. Assim, em umamodalidade, o tampão tem um pH de 7,2, 7,3, 7,4 ou 7,5ou valores de pH fracionários entre eles. Em outramodalidade, o tampão de troca de tampão tambémcompreende de 0,10 M a 0,20 M de NaCl e de 3,5% a 4,5%de sacarose.
Em uma modalidade particular (veja Exemplo7), as frações de VSV da purificação por adsorvedor demembrana de troca de ânions são reunidas, e a soluçãoreunida é concentrada, e o tampão trocado por TFFusando-se um cartucho de membrana de TFF de fibras ocascom um corte de peso molecular de 750 kDa (GEHealthcare Bio-Sciences Corp.; Piscataway, NJ).
(e) Filtração
A última etapa do processo na purificação éuma microfiltração final do material retido de VSV daTFF, em que o material retido é filtrado através de umfiltro de 0,2 a 0,25 μπι, conforme acima descrito para aclarificação secundária mediante microfiltração eadicionalmente descrito abaixo no Exemplo 7. Porexemplo, esse conjunto de filtração pode empregar umfiltro de tamanho 0,20, 0,21, 0,22, 0,23, 0,24 ou 0,25pm, ou tamanhos fracionários entre eles.
A purificação de VSV de acordo com os novosprocessos aqui descritos é descrita em detalhes nosExemplos abaixo, a descrição incluindo a clarificaçãoprimária (Exemplo 3) e secundária (Exemplo 4) do fluidode cultura, compreendendo centrifugação a baixavelocidade (ou filtração profunda) e filtração a 0,2 -0,45 μm, respectivamente. Após as etapas declarificação, o VSV é adicionalmente purificadoseqüencialmente por um adsorvedor de membrana de trocade ânions (Exemplo 6) ; filtração de fluxo tangencial;ultrafiltração e diafiltração (Exemplo 7) e filtração a0,2 - 0,22 μπι (Exemplo 7) . Quatro operações de culturacelular de VSV em grande escala (4,5 L) (operações emescala aumentada) também foram purificadas de acordocom os novos processos aqui descritos (Exemplo 8), emque mais de 99,9% e 99,8% das impurezas de proteína(Tabela 11) e DNA (Tabela 13), respectivamente, foramremovidas durante a purificação.
III. VÍRUS DA ESTOMATITE VESICULARRECOMBINANTE
Conforme aqui descrito, VSV de melhor purezaé obtido de cultura de células de mamífero por empregodos novos métodos de purificação acima descritos."Melhor pureza" significa que o VSV purificado é pelomenos 90,0% livre de contaminantes de proteínas eácidos nucléicos da cultura celular. Em outrasmodalidades, o VSV de melhor pureza é 99,0% livre decontaminantes de proteínas e ácidos nucléicos dacultura celular. Em uma modalidade particular, o VSV demelhor pureza é 99,8% livre de contaminantes deproteínas e ácidos nucléicos da cultura celular.
Em modalidades particulares, o vírus daestomatite vesicular (VSV) purificado do fluido decultura celular de uma cultura de células de mamíferopelo processo acima descrito é um VSV recorabinante ougeneticamente modificado. Métodos de produção de vírusde RNA recorabinantes, como VSV, são bem conhecidos echamados na técnica como métodos de "resgate" ou"genética reversa". Métodos de resgate exemplificativospara VSV incluem, mas não se limitam a, os métodosdescritos na patente norte-americana n° 6.033.886 epatente norte-americana n° 6,168,943, cada uma aquiincorporada por referência. Técnicas adicionais paraconduzir o resgate de vírus, como VSV, são descritas napatente norte-americana n° 6.673.572 e WO 2004/113517,que são aqui incorporados por referência.
O VSV de melhor pureza, que é purificado eisolado de acordo com os novos processos de purificaçãoaqui descritos, pode ser um VSV de um serotipoespecificado. Em certas modalidades, o VSV purificado éum serotipo Indiana, um serotipo New Jersey, umserotipo San Juan, um serotipo Isfahan, um serotipoGlasgow ou um serotipo Chandipura. Em certasmodalidades, o VSV pode conter seqüências de mais de umdesses serotipos.
Vetores de VSV (e suas composiçõesimunogênicas) purificados de acordo com os processosaqui descritos freqüentemente compreendem uma ou maismutações atenuantes dentro do genoma do VSV. Em certasmodalidades, o VSV purificado tem uma seqüênciagenômica compreendendo pelo menos uma mutação queatenue a patogenicidade do VSV. Em outras modalidades,o VSV purificado tem uma seqüência genômicacompreendendo pelo menos duas mutações que atenuem apatogenicidade do VSV. Por exemplo, um VSV atenuadocompreende duas ou mais mutações atenuantes conhecidas,como as mutações atenuantes apresentadas no Pedido dePatente Internacional n° PCT/US2005/011499 (Publicaçãode Patente Internacional n° WO 2005/098009), aquiincorporado por referência. Por exemplo, mutaçõesatenuantes de VSV conhecidas incluem, mas não selimitam a, mutações de embaralhamento de genes(incluindo embaralhamento de genes dos genes de VSV queforma o genoma do VSV e designados por Ν, Ρ, M, GeL),mutações de inserção de proteína G, mutações detruncamento de proteína G, mutações sensíveis àtemperatura (ts) (e outras mutações pontuais), mutaçõesdo gene M não citopáticas, mutações do tronco G,mutações de RNA ambi-sentido e mutações de deleção degenes, todas expostas em detalhes na PublicaçãoInternacional n° WO 2005/098009. Assim, em certasmodalidades, o VSV purificado compreende uma ou maismutações atenuantes, incluindo, sem limitação, umamutação sensível à temperatura (ts), uma mutaçãopontual, uma mutação de embaralhamento de genes, umamutação de tronco G, uma mutação de gene M nãocitopática, uma mutação de RNA ambi-sentido, umamutação de gene G truncado, uma mutação de inserção degene G e uma mutação de deleção de gene.
Em certas modalidades, um VSV purificado peloprocesso de purificação aqui descrito tem uma seqüênciagenômica compreendendo uma ou mais seqüênciaspolinucleotídicas estranhas ou heterólogas (ouestranhas), como um quadro de leitura aberto (ORF) deRNA estranho. As seqüências polinucleotídicasheterólogas podem variar conforme desejado e incluem,mas não se limitam a, um gene que codifica uma citocina(como uma interleucina), um gene que codifica umepítopo T-auxiliador, um gene que codifica um epítopoCTL, um gene que codifica um adjuvante e um gene quecodifica a co-fator, um gene que codifica um marcadorde restrição, um gene que codifica uma proteínaterapêutica ou uma proteína de um patógeno microbianodiferente (por exemplo, vírus, bactéria, parasita oufungo), particularmente proteínas capazes de provocarrespostas imunes desejáveis. Por exemplo, as seqüênciaspolinucleotídicas heterólogas que codificam umaproteína de um patógeno microbiano diferente podem seruma ou mais de um gene de HIV, um gene de HTLV, um genede SIV, um gene de RSV, um gene de PIV, um gene de HSV,um gene de CMV, um gene do vírus Epstein-Barr, um genedo vírus da Varicella-Zoster, um gene do vírus dacaxumba, um gene do vírus do sarampo, um gene do vírusda influenza, um gene de poliovírus, um gene derhinovírus, um gene do vírus de hepatite A, um gene dovírus de hepatite B, um gene do vírus de hepatite C, umgene do vírus Norwalk, um gene de togavírus, um gene dealfavírus, um gene do vírus da rubéola, um gene dovírus da raiva, um gene do vírus Marburg, um gene dovírus Ebola, um gene do vírus do papiloma, um gene dovírus de polioma, um gene do metapneumovírus, um genedo coronavírus, um gene de Vibrio cholerae, um gene deStreptococcus pneumoniae, um gene de Streptococcuspyogenes, um gene de Helieobaeter pylori, um gene deStreptocoeeus agalaetiae, um gene de Neisseriameningitidis, um gene de Neisseria gonorrheae, um genede Corynebacteria diphtheriae, um gene de Clostridiumtetani, um gene de Bordetella pertussis, um gene deHaemophilus, um gene de Chlamydia e um gene deEscherichia coli. Em certas modalidades, o VSVpurificado compreende uma seqüência de gene de HIV, emque a seqüência de HIV é selecionada do grupo queconsiste em gag, env, pol, vif, nef, tat, vpr, rev ouvpu. Em uma modalidade especifica, o gene de HIV é gagou env.
Em certas outras modalidades, o VSVpurificado contém tanto pelo menos uma mutaçãoatenuante, quanto pelo menos um ORF heterólogo conformeacima descrito. Por exemplo, a composição imunogênicade VSV (IsSto é, VSVin N4CT9-gagl) purificado de acordocom os novos processos, e exemplificado na Seção Vabaixo (Exemplos 2 - 8), é um VSV recombinantecompreendendo duas mutações atenuantes e um ORF quecodifica a proteína gag de HIV-I.
Em outras modalidades, o VSV purificado deacordo com os novos processos aqui descritos codifica ogene gag de HIV, em que o gene gag é inserido no genomade VSV na posição um (3'-gagi-NPMGL-5') , posição dois(3'-N-gag2-PMGL-5') , posição três (3'-NP-gag3-MGL-5') ,posição quatro (3'-NPM-gag4-GL-5') , posição cinco (3'-NPMG-gag5-L-5') ou posição seis (3'-NPMGL-gag6-5') . Emoutras modalidades, o VSV purificado de acordo com osnovos processos aqui descritos codifica o gene env deHIV, em que o gene env é inserido no genoma de VSV naposição um (3'-envi-NPMGL-5') , posição dois (3'-N-env2-PMGL-5') , posição três (3'-NP-env3-MGL-5') , posiçãoquatro (3'-NPM-env4-GL-5') , posição cinco (3'-NPMG-env5-L-5') ou posição seis (3'-NPMGL-env6-5') .
Aqueles versados na técnica entenderão com adescrição acima que vários VSV recombinantes podem serprojetados e purificados de acordo com os métodos eprocessos acima descritos.
IV. COMPOSIÇÕES IMUNOGÊNICAS E FARMACÊUTICAS
Em certas modalidades, as composiçõesimunogênicas compreendem uma dose imunogênica de um VSVgeneticamente modificado purificado de acordo com osprocessos de purificação aqui descritos. Por exemplo,em certas modalidades, uma composição imunogênicacompreende um VSV recombinante purificado de acordo comos processos de purificação aqui descritos, em que oVSV compreende uma ou mais seqüências de RNA estranhasinseridas em ou substituindo uma região do genoma deVSV não essencial para a replicação. Qualquer uma dasmodalidades de VSV recombinante descritas na Seção IIIacima pode ser empregada nessas composiçõesimunogênicas. Assim, em certas modalidades, formula-seuma composição imunogênica de VSV purificado paraadministração a um sujeito mamífero (por exemplo, umser humano).
Essas composições tipicamente compreendem ovetor de VSV purificado e um veículo farmaceuticamenteaceitável. Conforme usado a seguir, a expressão"veículo farmaceuticamente aceitável" pretende incluirquaisquer e todos os solventes, meios de dispersão,revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos,agentes isotônicos e de retardo de absorção e outros,compatíveis com a administração farmacêutica. 0 usodesses meios e agentes para substânciasfarmaceuticamente ativas é bem conhecido na técnica.Exceto na medida em que qualquer meio ou agenteconvencional seja incompatível com o vetor de VSV,esses meios são usados nas composições imunogênicasaqui descritas. Compostos ativos suplementares tambémpodem ser incorporados nas composições.
Assim, uma composição imunogênica de VSV aquidescrita é formulada para ser compatível com sua via deadministração desejada. Exemplos de vias deadministração incluem parenteral (por exemplo,intravenosa, intradérmica, subcutânea, intramuscular,intraperitoneal) e mucosa (por exemplo, oral, retal,intranasal, bucal, vaginal, respiratória). Soluções oususpensões usadas para aplicação parenteral,intradérmica ou subcutânea incluem os seguintescomponentes: um diluente estéril, como água parainjeção, solução salina, óleos fixos, polietilenoglicóis, glicerina, propileno glicol ou outrossolventes sintéticos; agentes antibacterianos, comoálcool benzilico ou metil parabéns; antioxidantes, comoácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentesquelantes, como ácido etilenodiaminatetraacético;tampões, como acetatos, citratos ou fosfatos; e agentespara ajuste da tonicidade, como cloreto de sódio oudextrose. 0 pH é ajustado com ácidos ou bases, comoácido clorídrico ou hidróxido de sódio. Ά preparaçãoparenteral pode ser fechada em ampolas, seringasdescartáveis ou frascos de múltiplas doses feitos devidro ou plástico.
Composições farmacêuticas adequadas para usoinjetável incluem soluções aquosas estéreis (quandosolúveis em água) ou dispersões e pós estéreis para apreparação extemporânea de soluções ou dispersõesinjetáveis estéreis. Para administração intravenosa,veículos adequados incluem salina fisiológica, águabacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ)ou salina tamponada com fosfato (PBS). Em todos oscasos, a composição tem de ser estéril e deve serfluida para haver uma fácil colocação na seringa. Temde ser estável sob as condições de fabricação earmazenamento e tem de ser preservada contra a açãocontaminante de microorganismos, como bactérias efungos. O veículo é um solvente ou meio de dispersãocontendo, por exemplo, água, etanol, poliol (porexemplo, glicerol, propileno glicol e polietilenoglicol líquido e outros) e suas misturas adequadas. Afluidez apropriada é mantida, por exemplo, com o uso deum revestimento, como lecitina, pela manutenção dotamanho de partícula requerido, no caso de umadispersão, e com o uso de surfatantes. A prevenção daação de microorganismos é conseguida por vários agentesantibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabéns,clorobutanol, fenol, ácido ascórbico e outros. Emmuitos casos, é preferível incluir agentes isotônicos,por exemplo, açúcares, poliálcoois, como manitol,sorbitol, cloreto de sódio, na composição. A absorçãoprolongada das composições injetáveis é conseguida pelainclusão, na composição, de um agente gue retarde aabsorção, por exemplo, monoestearato de alumínio egelatina.
Soluções injetáveis estéreis são preparadaspor incorporação do vetor de VSV na quantidade (oudose) requerida, em um solvente apropriado, com um ouuma combinação dos ingredientes enumerados acima,quando necessário, seguida por esterilização porfiltração. Genericamente, as dispersões são preparadaspor incorporação do composto ativo em um veículoestéril que contenha um meio de dispersão básico e osoutros ingredientes regueridos dentre agueles acimaenumerados. No caso de pós estéreis para a preparaçãode soluções injetáveis estéreis, os métodos depreparação preferidos são a secagem a vácuo e aliofilização, que fornece um pó do ingrediente ativomais qualquer ingrediente desejado adicional de umasolução previamente esterilizada por filtração dele.
Para administração por inalação, os compostossão distribuídos na forma de uma pulverização deaerossol por um recipiente ou distribuidor pressurizadoque contenha um propelente adequado (por exemplo, umgás como dióxido de carbono ou um nebulizador). Aadministração sistêmica também pode ser por meio damucosa ou transdérmico. Para administração mucosa outransdérmica, usam-se penetrantes apropriados àbarreira a ser permeada na formulação. Essespenetrantes são genericamente conhecidos na técnica eincluem, por exemplo, para administração mucosa,detergentes, sais biliares e derivados de ácidofusidico. A administração mucosa é realizada medianteuso de sprays nasais ou supositórios. Os compostostambém são preparados na forma de supositórios (porexemplo, com bases convencionais para supositórios,como manteiga de cacau e outros glicerideos) ou enemasde retenção para distribuição retal.
Em certas modalidades, é vantajoso formular composições orais ou parenterais em forma de unidade dedosagem para uma fácil administração e dosagemuniforme. Forma de unidade de dosagem, conforme adianteusado, refer-esse a unidades fisicamente distintas,adequadas como dosagens unitárias para o sujeito a sertratado; cada unidade contendo uma quantidadepredeterminada do composto ativo, calculada paraproduzir o efeito terapêutico desejado, em associaçãocom o veiculo farmacêutico requerido. As especificaçõespara as formas de unidades de dosagem aqui descritassão determinadas por e dependem diretamente dascaracterísticas únicas do composto ativo e do efeitoterapêutico particular a ser atingido e das limitaçõesinerentes à técnica de combinação desse composto ativopara o tratamento de indivíduos.
V. EXEMPLOS
Os exemplos a seguir foram realizados usando-se técnicas padronizadas, que são bem conhecidas erotineiras para aqueles versados na técnica, excetoquando, de outra forma, descritas em detalhes. Osexemplos a seguir são apresentados para finsilustrativos e não devem ser tomados de forma algumacomo limitativos do âmbito das composições e processosaqui descritos. Os Exemplos 1 e 2 se referem a todos ostrês construtos de VSV exemplificados. Os Exemplos 3 -9 se referem especificamente ao construto VSVin N4CT9-gagl. Os Exemplos 10 - 11 se referem especificamente aoconstruto VSVin N4CT1-gag1. O Exemplo 12 se refereespecificamente ao construto VSVnj N4CT1-gag1.
Um VSV recombinante (serotipo Indiana;rVSVIN) purificado nos exemplos a seguir compreende ogene gag de HIV na primeira posição do genoma de VSV(gagl), e o gene N embaralhado para a quarta posição dogenoma de VSV (N4). Em um construto, o VSV tem um geneG com uma cauda citoplasmática truncada ("CT9") , em queesse construto foi designado por "VSVin N4CT9-gagl". Emoutro construto, o VSV tem um gene G com uma caudacitoplasmática truncada ("CT1"), em que esse construtofoi designado por "VSVin N4CTi-gagl". Em outrosexemplos, um VSV recombinante (serotipo New Jersey;rVSVNJ) purificado nos exemplos a seguir compreende ogene gag de HIV na primeira posição do genoma de VSV(gagl), o gene N embaralhado para a quarta posição dogenoma de VSV (N4), e um gene G com uma caudacitoplasmática truncada ("CT1"), em que esse construtofoi designado por "VSVnj N4CTi~gagl". Esses construtos emutações são definidos em detalhes na Publicação dePatente Internacional n° WO 2005/098009, aquiincorporada por referência.
Entretanto, os novos processos de purificaçãoaqui descritos não se limitam de forma alguma a umconstruto ou serotipo de rVSV especifico (por exemplo,Indiana, New Jersey e outros), e, portanto, essesprocessos de purificação incluem a purificação deconstrutos de VSV compreendendo seqüências genômicas dotipo selvagem, seqüências genômicas atenuadas,seqüências de ácidos nucléicos "estranhos" ou qualquercombinação dessas (por exemplo, veja Seção III acimapara uma revisão desses construtos de VSV). Além disso,os métodos de produção de vírus de RNA "recombinantes"são bem conhecidos e chamados na técnica de métodos de"resgate" ou "genética reversa". Métodos de resgateexemplificativos para VSV recombinante são descritosacima na Seção III.
Os exemplos a seguir descrevem a purificaçãode rVSV (conforme exmeplifiçado com o construto VSVinN4CT9-gagl, o VSVin N4CTi-gagl ou o VSVNjN4CT1-gagl) apartir de células Vero. Entretanto, os processos depurificação de VSV aqui expostos também são aplicáveispara a purificação de VSV de qualquer cultura decélulas de mamífero adequadas, incluindo, mas nãolimitadas a, células renais embrionárias humanas (HEK)(por exemplo, células HEK 293), células de ovário dehamster chinês (CHO) e células renais de hamsterfilhote (BHK).
EXEMPLO 1: ENSAIOS DE POTÊNCIA DE PROTEÍNA,DNA E VSV
Os ensaios a seguir foram utilizados paraavaliar os processos de purificação descritos adiantenos Exemplos 2-12.
Concentração de Proteína Total. Aconcentração de proteína total foi de terminada usando-se o ensaio de ácido bicinconinico (BCA) (Bio-RadLaboratories Inc.; Hercules, CA), com albumina séricabovina (BSA) como padrão de proteína.
Análise SDS-PAGE e Western Blot. Paraseparação e detecção de proteínas, amostras de VSVforam misturadas com um tampão de amostra Tris-glicinaa uma razão de 1:1 (para o construto VSVin N4CT9-gagl)ou 3:1 (para o construto VSVin N4CTi-gagl), fervidasdurante dez minutos a IOO0C e resolvidas poreletroforese em 4 - 20% de Tris-glicina dodecil sulfatode sódio-gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), seguido porcoloração dupla com corante prata (Wako Chemicals USA,Inc.; Richmond, VA) e corante coloidal Coomassie® Azul(Invitrogen Corp.; Carlsbad, CA). A sensibilidade dacoloração dupla tornou possível detectar facilmenteimpurezas de alto peso molecular nas amostras de VSV.
Após a eletroforese em gel, as proteínasforam eletroforeticamente transferidas para umamembrana de nitrocelulose (Amersham Biosciences Corp.;Piscataway, NJ) . Após bloqueio durante uma hora emsalina tamponada com Tris (TBS) contendo 3% de BSA, amembrana foi incubada em uma solução de anticorpo (1%de BSA em TBS com 0,05% de Tween-20 (TTBS) contendoanticorpos policlonais de coelho anti-VSV produzidos apartir de células BHK, 1:1000 v/v) e sondada com umanticorpo de cabra anti-coelho conjugado a peroxidasede raiz-forte (HRP, 1:1000 (v/v)) (Bio-Rad LaboratoriesInc.; Hercules, CA). Após lavagem com TTBS e TBS,reagente de revelação de cor de HRP (Bio-RadLaboratories Inc.; Hercules, CA) foram adicionados paradetecção, e a reação foi finalizada com água destilada.O gel tingido e a membrana revelada foram capturadosmediante um sistema de imagem Alphalmager® (AlphaInnotech Corp.; San Leandro, CA) com o softwareAlphaEaseFC®.
Cromatografia Liquida de Alto Desempenho porExclusão de Tamanho (SE-HPLC). Um protocolo de HPLC porexclusão de tamanho foi desenvolvido para separarrapidamente VSV de proteínas de impureza, permitindo,dessa forma, a análise qualitativa do processo depurificação de VSV. Assim, amostras de VSV "emprocesso" VSV (100 μΕ) e VSV concentrado a granelpurificado (100 μL) foram carregadas em uma coluna deexclusão de tamanho analítica (TSK-Gel PW colunaG6000PWXL, tamanho de partícula de 17μ, tamanho de porode 1.000 Â) (Tosho Biosciences LLC.; Montgomeryville,PA) , equilibrada com tampão PBS (sem Ca2+ ou Mg2+) erevelada a uma taxa de fluxo de um mL por minuto. 0sistema foi acionado com um sistema de distribuição desolvente Agilent 1100™ controlado com o softwareChemStation™ (Agilent Technologies Inc.; Palo Alto,CA) . Os espectros UV foram coletados com um detector deensaio de fotodiodo, e os cromatogramas foram obtidospor monitorização da absorbância de UV a 215 nm.
Ensaios de Potência do VSV. A potência do VSVfoi quantificada por dois métodos diferentes: um ensaiode placa tradicional e um ensaio de placa deimunofluorescência. Para o ensaio de placa tradicional,células Vero em DMEM + 10% de FBS foram semeadas emplacas de seis poços a uma concentração de 1 χ IO6células/poço (com dois mL de cultura celular/poço) eincubadas durante uma noite a 37°C. As células foramverificadas no dia seguinte para assegurar quemonocamadas confluentes haviam se formado. Amostras devirus de titulo conhecido, juntamente com controlespositivos e negativos, foram diluídas serialmente a1:10 até as fiaxas de títulos esperadas em DMEM + 10mL/L de piruvato de sódio + 0,5 mL/L de gentamicina. 0controle positivo foi um padrão de VSV de títuloconhecido. 0 controle negativo (ou em branco) continhaapenas meio. 0 meio das células foi aspirado das placasde seis poços, então, o vírus diluído (0,5 mL desolução de virus/poço) foi adicionado aos poços, emduplicata. O virus foi adsorvido à temperatura ambientedurante quinze minutos, então, incubado a 32°C durantetrinta minutos. As placas foram manualmente sacudidas acaca cinco a dez minutos para manter as monocamadas decélulas úmidas. Agarose (a 50°C) e DMEM (a 37°C, 10mL/L de piruvato de sódio e 0,5 mL/L de gentamicina)foram combinados a uma razão de 1:4, para criar um meiode recobrimento de ágar. 0 virus foi aspirado dasplacas, e 3 mL de recobrimento foram adicionados porpoço, usando-se uma pipeta. As placas recobertas foramresfriadas sob uma coifa à temperatura ambiente, então,transferidas para incubação a 32°C durante setenta eduas horas ou até que as placas fosse claramentevisíveis (aproximadamente um mm de diâmetro ou mais).As placas foram contadas segurando-se as placas contrauma fonte de luz. Os títulos foram determinados paracada amostra usando-se as contagens de placasresultantes e expressos em termos de unidadesformadoras de placas (UFP) po mL.
O segundo ensaio (ensaio de placa deimunofluorescência) foi realizado por infecção demonocamadas de células Vero (em placas de 48 poços) comVSV. Após vinte e quatro a trinta e seis horas, ascélulas Vero foram fixadas e primeiro sondadas com umanticorpo monoclonal contra VSVin ou VSVnj, dependendodo construto usado e, então, sondadas com um anticorposecundário conjugado a um corante fluorescente. Aspartículas infecciosas foram quantificadas usando-semicroscopia de fluorescência para detectar focosfluorescentes dentro da monocamada de células Vero. Osfocos fluorescentes foram contados, e o título daamostra foi expresso como unidades infecciosas (UI) ouunidades formadoras de placa (UFP) por mL.
Ensaio de DNA Residual. 0 DNA da célulahospedeira foi testado e quantificado usando-se o kitde microensaio de DNA PicoGreen® Quant-iT™ (InvitrogenCorp.; Carlsbad, CA) . O microensaio foi realizado deacordo com as instruções do fabricante, usando-se DNAlambda como o padrão.
EXEMPLO 2: PRODUÇÃO DE VSV EM CULTURA DECÉLULAS VERO
Operações experimentais de VSV foramproduzidas em um biorreator de 10 litros, usando-seculturas de microcarreador de células Vero (célulasrenais de macaco africano). As células Vero usadasforam obtidas em um Banco de Células Mestras cGMP. Ascélulas Vero foram cultivadas em microcarreadoresCytodex™ I (Amersham Biosciences Corp.; Piscataway,NJ) a uma densidade de 7,5 gramas de glóbulossecos/litro. O volume de trabalho para a cultura debiorreator foi de 5,5 a 6,5 litros. Para a inoculação,as células Vero foram combinadas com microcarreadoresCytodex™ I em um volume total de aproximadamente 2litros. A densidade de semeadura alvo da cultura era de5 χ 105 células/mL. Um ciclo de agitação intermitentede duas horas foi realizado com esse volume reduzidopara promover a fixação das células aosmicrocarreadores. A cultura foi agitada durante 5minutos a 40 rpm, então, deixadas sedimentar durante 20minutos a zero rpm, em quatro ciclos completos.
A cultura foi amostrada após a agitaçãointermitente, e, caso a fixação fosse satisfatória,Meio de Produção de Virus Livre de Soro (VP-SFM) eraadicionado à cultura, até o volume de trabalho de 5,5ou 6,5 litros. As células foram cultivadas até 2 - 4 χ106 células/mL a 37°C e 40 rpm. Supriu-se arconstantemente ao recobrimento a 50 cm3/ minuto.Dióxido de carbono e oxigênio foram supridos aorecobimento sob demanda, a 50 cm3/minuto. Quando ademanda de oxigênio da cultura excedia a fornecida pelorecobrimento, adicionava-se oxigênio à cultura atravésde um borrifador sinterizado a uma taxa inicial de 6cm3/minuto. A taxa foi aumentada manualmente quando ademanda de oxigênio aumentou. Dióxido de carbono(ácido) e solução de bicarbonato de sódio a 7,5% empeso/volume (básica) foram usados para controlar o pH,usando-se um ajuste de cultura de pH 7,30. A culturafoi submetida a uma perfusão com meio fresco de metadedo volume de cultura por dia, começando aproximadamentecom 48 horas de tempo de cultura decorrido. A infecçãodas células Vero com rVSV ocorreu a 32°C e umamultiplicidade de infecção (MOI) de 0,01. Para promovera adsorção dos virus às células, um ciclo de agitaçãointermitente de uma hora foi realizado imediatamenteapós a adição do virus à cultura do biorreator. Acultura foi agitada durante seis minutos a 40 rpm,então, deixada sedimentar durante vinte e quatrominutos a zero rpm, por dois ciclos completos. Após umahora de agitação intermitente, o restante da infecçãoprocedeu no modo de bateladas a 40 rpm. A culturainfectada foi amostrada a cada 6-16 horas para seobservar o efeito citopático (CPE) , contar as células ecoletar amostras do sobrenadante viral paradeterminação da cinética de crescimento..A cultura celular ofi colhida aproximadamente44 horas após a infecção para" VSVINN4CT9-gagl,aproximadamente 48 horas após a infecção paraVSVINN4CT1-gag1 e aproximadamente 60 horas após ainfecção para VSVNJN4CT1-gag1, deixando-se osmicrocarreadores sedimentarem e coletando-se osobrenadante do fluido de cultura. Para o últimoconstruto, o fluido de cultura celular de doisbiorreatores foram combinados.
EXEMPLO 3: PROCESSO DE PURIFICAÇÃO DE VSV:CLARIFICAÇÃO PRIMÁRIA DE FLUIDO DE CULTURA CELULAR DEVSV PARA VSVinN4CTg-gag1
Depois de colher a cultura celular dobiorreator, células/detritos celulares e outrasimpurezas em partículas foram removidas no processoconhecido como "recuperação de produto". Como o VSV foisecretado pelas células Vero no fluido de cultura, oVSV foi recuperado no fluido de cultura clarificado.Assim, o sobrenadante do fluido de cultura celular deVSV (por exemplo, cerca de 4,0 - 4,5 L de uma operaçãode biorreator de 10 L) foi clarificado por filtraçãoprofunda ou centrifugação a baixa velocidade.
A clarificação por filtração profunda foirealizada à temperatura ambiente, e o VSV foirecuperado no filtrado. Foram testados os seguintesmódulos de filtração profunda: um módulo Whatman®Polycap™ HD (Whatman Inc.; Florham Park, NJ), um móduloSartorius Sartoclear™ P (Sartorius Corp.; Edgewood,NY) , um módulo Millipore® Millistak+® HC (Millipore;Billerica, MA) e um CUNO 05/60HP (CUNO Inc, a 3M®company, Meriden, CT). Os filtros profundos foramcarregados com o filtrado até que o filtro estivessesaturado (aproximadamente 100 - 500 mL de filtrado).
A eficiência de clarificação dos módulos defiltração profunda foi determinada por um medidor deturvação, ao passo que a recuperação de virus foiavaliada por ensaio de placa viral. A Tabela 1 abaixoresumo o desempenho de diferentes filtros profundos.
Pode-se conseguir uma alta recuperação devirus usando-se Whatman Polycap HD 75. Entretanto, naprodução em grande escala, observaram-se baixaeficiência de remoção de turvação e baixa capacidade dofiltro. Outros filtros de diferentes fornecedores podemser selecionados para uso no processo de clarificaçãocom base em uma avaliação de sua recuperação de produtode virus.TABELA 1. DESEMPENHO DE CLARIFICAÇÃO DE CULTURA CELULARDE DIFERENTES FILTROS PROFUNDOS
<table>table see original document page 60</column></row><table>
Turvação do Filtrado = NTU (Unidade de TurvaçãoNefelométrica)
Capacidade do Filtro2 = (L de cultura/m2 (L decultura/ft2) )
A clarificação mediante centrifugação a baixavelocidade foi realizada a 6.238 χ g (5.000 rpm)durante trinta minutos à temperatura ambiente em umacentrifuga Beckman (5 χ garrafas de centrifugação de 1L a um volume total de 4,5 L) , em que o VSV foirecuperado no sobrenadante. Conforme mostrado abaixo naTabela 2, conseguiram-se uma maior eficiência de remoção de turvação e uma recuperação de produtoequivalente por centrifugação a baixa velocidade, emcomparação com a filtração profunda com o móduloWhatman PolyCap™ HD7 5.
TABELA 2. COMPARAÇÃO DA CLARIFICAÇÃO PRIMÁRIA DE FLUIDODE CULTURA CELULAR POR CENTRIFUGAÇÃO A BAIXA VELOCIDADEE FILTRAÇÃO PROFUNDA
<table>table see original document page 61</column></row><table><table>table see original document page 62</column></row><table>
Turvação1 = Turvação do Filtrado ou Sobrenadante, NTU
EXEMPLO 4: PROCESSO DE PURIFICAÇÃO DE VSV:CLARIFICAÇÀO SECUNDÁRIA DE FLUIDO DE CULTURA CELULAR DEVSV
Após a clarificação primária descrita acimano Exemplo 3, o sobrenadante (ou filtrado) foiadicionalmente processado (clarificação secundária)para reduzir o nivel de turvação. Vários filtros demicrofiltração estéril (0,2 a 0,25 μπι) foram avaliados(Tabela 3), que incluíram uma unidade de filtroMillipore Millex®-GV (Millipore; Billerica, MA) , umaunidade de filtro Millipore Millex®-GP, uma unidade defiltro Pall Supor® (Pall Corp.; East Hills, NY), umaunidade de filtro Sartorius Sartobran™ (SartoriusCorp.; Edgewood, NY) e uma unidade de filtro SartoriusSartopore™ 2. 0 filtro ótimo deve ter uma capacidade deligação a VSV limitada (ou nenhuma), embora removatanto contaminação em partículas quanto possível.
VSV de produção pré-semeadura foi usado comoalimentação (material de partida) para os filtros demicrofiltração escolhidos, que recebeu a adição de 1 χfosfato glutamato de sacarose (SPG). A mesmaalimentação foi filtrada seguindo-se o protocoloapresentado pelos fornecedores. Como a quantidade dematerial de cultura celular clarificado era limitada,usou-se uma seringa ou filtro de disco, em vez de umfiltro em grande escala. Conforme mostrado na Tabela 3,o título de recuperação de VSV mais alto foi conseguidocom os filtros estéreis Pall Supor® e SartoriusSartobran™.
TABELA 3. TRIAGEM DE FILTROS DE CLARIFICAÇÃO SECUNDÁRIA
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Recuperação*: 1 χ solução de SPG foi adicionada àsolução de alimentação. SPG é fosfato glutamato desacarose.A clarificação secundária do VSV foiadicionalmente avaliada usando-se a unidade de filtroSartorius Sartobran™, cujos resultados são resumidosabaixo na Tabela 4.
TABELA 4. CLARIFICAÇÃO SECUNDÁRIA USANDO FILTROSARTORIUS SARTOBRAN™
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Turvação do Sobrenadante1 = NTU
0,62*: a baixa turvação do filtrado é devida à baixaturvação da alimentação
NA = Não Disponível;
SPG é fosfato glutamato de sacarose
Os dados na Tabela 4 mostram que a turvaçãodas soluções do Experimento 2 e Experimento 3 foireduzida ainda mais com um nível aceitável derecuperação. Também se estabeleceu nesses experimentosque a adição de Ix SPG à solução de alimentação (istoé, Experimento 2: 85,9% de título de recuperação eExperimento 3: 110% de titulo de recuperação) melhorasignificativamente o rendimento da recuperação deproduto de VSV, com relação ao Experimento 1 que nãoteve adição de SPG (65,8% de titulo de recuperação).
EXEMPLO 5: PROCESSO DE PURIFICAÇÃO DE VSV:CROMATOGRAFIA EM COLUNA
Depois da etapa de clarificação secundáriadescrita no Exemplo 4, a purificação do filtrado de VSVfoi testada/triada usando-se várias resinascromatográf icas. Como a partícula de VSV é de tamanhogrande com relação a proteínas contaminantes, apenasresinas com um grande tamanho de poro foram avaliadas,que incluíram uma resina de troca de ânions UNOsphere™Q (Bio-Rad Laboratories Inc.), uma resina de troca decátions UNOsphere™ S (Bio-Rad Laboratories Inc.), umaresina cerâmica de hidroxiapatita tipo I CHT (Bio-RadLaboratories Inc.), uma resina cerâmica defluoroapatita tipo I CFT (Bio-Rad Laboratories Inc.) euma resina CST I de modo misto (GE Healthcare). Paracomparação, duas resinas de afinidade também foramavaliadas: uma resina Matrex™ Cellufine® Sulfato(Millipore) e uma resina de heparina Sepharose (GEHealthcare). Os experimentos foram realizados no modode bateladas à temperatura ambiente. As amostras dediferentes condições de lavagem e eluição foramcoletadas e ensaiadas por SDS-PAGE e ensaio de placa.
Observou-se em experimentos iniciais com asresinas de troca de ânions UNOsphere™ Q e de troca decátions UNOsphere™ S, que o VSV só se ligava à resinade troca de ânions UNOsphere™ Q a pH neutro, indicandoque o VSV está negativamente carregado em pH neutro.
Avaliação da purificação de VSV em resina detroca de ânions Bio-Rad® UNOsphere™ Q. VSV clarificadofoi carregado em uma coluna cheia da resina UNOsphere™Q. Não houve nenhuma separação distinguivel entre oproduto de VSV e as proteínas de impureza na coluna, euma grande parte dos vírus ainda estava ligada àcoluna, mesmo após eluição com NaCl a 2 M em 10 mM detampão fosfato de sódio (dados não mostrados).
Avaliação da purificação de VSV em resinacerâmica de hidroxiapatita tipo I Bio-Rad® (CHT I) .VSV foi eficientemente adsorvido à coluna dehidroxiapatita. Alguma separação do VSV das proteínascontaminantes foi observada por SDS-PAGE (dados nãomostrados), mas uma parte significativa do VSVpermaneceu ligada à coluna, mesmo após eluição com 0,8M de fosfato de potássio, pH 6,88, em que o VSV ligadofoi finalmente eluido da coluna durante uma etapa delimpeza com NaOH a 1 M.
Em outro experimento, usaram-se 0,9 M detampão fosfato de potássio como o tampão de eluição.Conseguiu-se pouca separação entre o VSV e as proteínasde impureza (dados não mostrados). Uma grande parte doVSV permaneceu ligada à coluna e requereu NaOH a 1,0 Mpara ser eluída da coluna. Resultados similares (istoé, separação ruim de VSV/proteína contaminante e forteligação do VSV à resina) foram observados com a resinacerâmica de fluoroapatita (CFT) tipo I e com a resina CST I.
Avaliação da purificação de VSV em uma resinade afinidade Matrex® Cellufine™ Sulfato. Uma soluçãode alimentação de VSV clarificada foi carregada em umacoluna Cellufine™ Sulfato pré-equilibrada (1,47 mM defosfato de potássio, 8,06 mM de fosfato de sódio, 140mM de NaCl, pH 7,0) (volume da cápsula (CV) = 2 mL) auma taxa de fluxo de 3 mL/minuto. A coluna foi lavadacom 10 CV de tampão de equilibração, que era salinatamponada com fosfato (1,47 mM de fosfato de potássio,8,06 mM de fosfato de sódio, 140 mM de NaCl, pH 7,0). Oatravessamento e a lavagem foram reunidos. Os materiaisadsorvidos foram, então, eluídos com 30 CV de gradientelinear a 10 mM de fosfato de sódio, 1,5 M de NaCl, pH7,0. A análise SDS-PAGE mostrou que a separação entreas proteínas de impureza e os vírus durante a eluiçãonão foi eficiente, e se observou VSV em todas asfrações de eluição da coluna (dados não mostrados). Umagrande quantidade de VSV também permaneceu na coluna. Arecuperação de produto de VSV total (isto é, de todasas frações de eluição coletadas; F3-F25) foi de apenas45,2 % (Tabela 5). Resultados similares (isto é, baixarecuperação de VSV) foram observados com a resina deheparina Sepharose.
TABELA 5. PURIFICAÇÃO DE VSV EM UMA COLUNA DE MATRIZ DECELLUFINE® SULFATO
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FT&W = Atravessamento e lavagem reunidos
F3 - F25 são as frações de eluição 3-25.EXEMPLO 6: PROCESSO DE PURIFICAÇÃO DE VSV:ADSORVEDOR DE MEMBRANA DE TROCA DE ÂNIONS
Conforme acima descrito no Exemplo 5, arecuperação de VSV foi relativamente baixa quando ofiltrado da etapa de clarificação secundária (isto é,filtro Sartobranw de 0,2 μιη) foi purificado com aresina UNOsphere™ Q, a resina UNOsphere™ S, a resinaCHT I, a resina CFT I, a resina CST I, a resinaCellufine® ou a resina de heparina Sepharose. Assim, apurificação do filtrado de VSV do Exemplo 4 foiadicionalmente avaliada usando-se dois adsorvedores demembrana de troca de ânions; um adsorvedor de membranaSartobind™ Q (Sartorius Corp.; Edgewood, NY) e umadsorvedor de membrana Mustang™ Q (Pall Corp.; EastHills, NY).
Purificação de VSV em um adsorvedor demembrana Sartobind™ Q
A alimentação de VSV (material de partida)para a purificação em adsorvedor de membrana foi omaterial retido da separação por filtração de fluxotangencial (TFF) (usando-se uma membrana de TFF com umcorte de peso molecular de 750 kDa). 0 material retidode VSV de uma seeparação por TFF (que compreende VSV eimpurezas/proteínas contaminantes e DNA) foi, então,armazenado a 4°C ou -70°C.
Estudos iniciais com o adsorvedor de membranaSartobind™ Q foram realizados com o material retido deVSV armazenado a 4°C, em que 20 mM de HEPES (pH 7,1)foram usados como o tampão de equilibração, e omaterial retido foi adsorvido ao adsorvedor de membranaSartobind™ Q (2,1 mL de volume de membrana) . Asproteínas de impureza foram eluídas eficientemente comum tampão de eluição de 20 mM de HEPES (pH 7,1) e 1,0 Mde NaCl (dados não mostrados). Entretanto, nenhumtítulo de VSV foi recuperado em nenhuma das frações deeluição. O tampão foi trocado de HEPES para tampãofosfato de sódio, mas resultados similares foramobservados (isto é, nenhum título de VSV nas fraçõescoletadas), mesmo a altas (1,5 M) concentrações de NaClno tampão de eluição fosfato.
Em contraste, quando se usou o materialretido de VSV armazenado a -70°C como o material departida, que foi adsorvido ao adsorvedor de membranaSartobind™ Q (equilibrado com 20 mM de HEPES, pH 7,1),observou-se VSV nas frações de eluição (tampão deeluição 20 mM de HEPES e 1,0 M de NaCl), em que 74,2%das impurezas de proteínas foram observadas no materialreunido de atravessamento e lavagem com base nosresultados de BCA (dados não mostrados). A análise debalanço de massa para proteína total é mostrada abaixona Tabela 6.
Usando-se um gradiente de eluição linear a30% de tampão B para o material de partida de VSV a -70°C, observaram-se dois picos maiores no cromatograma(dados não mostrados). O tampão A (tampão deequilibração) era 10 mM de fosfato de sódio (pH 7,0) e0,3 M de NaCl. O tampão B (tampão de eluição) era 10 mMde fosfato de sódio (pH 7,0), 2,0 M de NaCl e 10 mM desacarose, em que 30% de B eram aproximadamente 0,81 Mde NaCl.
O primeiro pico era VSV (frações 4 - 10) comuma pureza relativamente alta. O segundo pico eramcontaminantes de DNA de hospedeiro (frações 11 - 20) .Os resultados do ensaio PicoGreen® (dados nãomostrados) indicaram que 97,3% do DNA de hospedeiroresidual foram removidos com o adsorvedor de membranaSartobind™ Q. Assim, esses dados indicam que oadsorvedor de membrana Sartobind™ Q proporciona umamaneira eficiente para remover contaminantes de DNAhospedeiro do produto de VSV. Entretanto, resultados deum ensaio de título de VSV (dados não mostrados)indicaram que a recuperação de VSV do processo depurificação com Sartobind™ Q foi de menos de 30% emtítulo de vírus. Observou-se uma recuperação de VSVmais elevada usando-se o adsorvedor de membranaMustang™ Q, com os mesmos materiais de partida.
TABELA 6: BALANÇO DE MASSA DE PROTEÍNA TOTAL PARA O
ADSORVEDOR DE MEMBRANA SARTOBIND Q
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FT&W = Atravessamento e lavagem reunidos
F3 - F40 são as frações de eluição 3-40Purificação de VSV em um adsorvedor demembrana Mustang™ Q
0 adsorvedor de membrana Mustang™ Q tambémfoi investigado como um meio de purificação de VSV. Ascondições operacionais para o adsorvedor Mustang™ Qforam otimizadas e estão descritas abaixo.
A sacarose melhora o rendimento derecuperação de VSV eluido de membrana Mustang™ Q. Umaobservação inicial quando se otimizaram as condiçõespara o Mustang™ Q foi a importância da inclusão desacarose nos tampões cromatográficos. Por exemplo,realizaram-se experimentos de purificação lado a ladocom tampão formulado com sacarose (FIGs. 2A e 2B) e semsacarose (FIGs. 3A e 3B) . Foram usados os seguintestampões cromatográficos: o tampão A (tampão deequilibração) era 10 mM de fosfato de sódio (pH 7,0) e300 mM de NaCl. O tampão B (tampão de eluição) era 10mM de fosfato de sódio (pH 7,0), 1 M de NaCl, com e sem(isto é, +/- 2%) de sacarose.
Em ambos os experimentos (isto é, +/- 2% desacarose), obteve-se um produto de VSV de alta pureza.Ensaios de placa (dados não mostrados) indicaram que arecuperação de VSV era significativamente mais alta(32,8% versus 19,0%) quando se incluía sacarose notampão.
pH do tampão e ligação de VSV à membranaMustang™ Q. Três faixas diferentes de pH de tampão (pH6,5, 7,0 e 7,5) foram avaliadas para se determinar o pHde tampão ótimo para a ligação de VSV à membranaMustang™ Q. Nesses experimentos, cultura celularfresca condicionada após a clarificação foi carregadaem uma membrana Mustang™ Q equilibrada com 10 mM detampão fosfato de sódio a pH 6,5, 10 mM de tampãofosfato de sódio a pH 7,0 ou 10 mM de tampão fosfato desódio a pH 7,5 (cada tampão também compreendia 300 mMde NaCl e 2% de sacarose).
O VSV foi eluído da membrana por eluição poretapas (tampão de eluição: 10 mM de fosfato de sódio(pH 6,5, 7,0 ou 7,5), 720 mM de NaCl e 2% de sacarose)a uma taxa de fluxo de 3,5 mL por minuto (10 CV/min) . Apureza do VSV eluído da Mustang™ Q (determinada porSDS-PAGE e Western Blot; dados não mostrados) eracomparável para cada um dos pH's de tampão testados.Entretanto, a pH 6,5, uma quantidade significativa doVSV foi dispersada nas etapas de atravessamento,lavagem e eluição durante o processo cromatográfico, e,portanto, observou-se um menor título de recuperação deVSV no material de eluição reunido a esse pH (vejaTabela 7).
TABELA 7. PROCESSO DE RECUPERAÇÃO DE VSV A DIFERENTES
CONDIÇÕES DE.PH DE LIGAÇÃO
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Força iônica e ligação de VSV à membranaMustang™ Q. Duas concentrações diferentes de NaCl(0,15 M de NaCl e 0,3 M de NaCl) em tampão de ligação(equilibração) fosfato de sódio a 10 mM foram testadasna adsorção de VSV à membrana Mustang™ Q. Uma melhoraseparação entre o VSV e as proteínas de impureza foiobservada a 0,3 M de NaCl. Por exemplo, quando se usou0,3 M de NaCl em tampão de ligação fosfato de sódio, oscontaminantes de alto peso molecular foram removidos nomaterial reunido de atravessamento, em que o VSVpermaneceu ligado à membrana (dados não mostrados).
Força iônica e eluição do VSV da membranaMustang™ Q. A força iônica do tampão de eluição(Tampão B) (isto é, a concentração de NaCl no tampão deeluição) foi determinada por eluição de gradientelinear, em que a concentração do tampão de eluição(Tampão B) foi aumentada de 0% a 60% em 30 CV a umataxa de fluxo de 3,5 mL/minuto. O tampão deequilibração (Tampão A) era 10 mM de fosfato de sódio,pH 7, 1, 300 mM de NaCl, e o tampão de eluição (TampãoB) era 10 mM de fosfato de sódio, pH 7,1, 2 M de NaCl,10 mM de sacarose. Observou-se no cromatograma (dadosnão mostrados), que uma concentração de NaCl de 0,6 Mera requerida para eluir 73,3% de VSV do adsorvedor demembrana Mustang™ Q.
Eluição de gradiente linear versus eluição emetapa única. Um produto de VSV de alta qualidade foiobtido tanto com uma eluição de gradiente linear (acimadescrita), quanto com uma estratégia de eluição em"etapa única" (dados não mostrados). O processo deeluição em etapa única compreende um tampão deequilibração (Tampão A; por exemplo, 10 mM de fosfatode sódio, pH 7, 1, 300 mM de NaCl) e um tampão deeluição (Tampão B; por exemplo, 10 mM de fosfato desódio, pH 7,1, 2 M de NaCl, 10 mM de sacarose). Emcontraste com a eluição de gradiente linear, o processode eluição em etapa única elui o VSV do adsorvedor demembrana por adição instantânea de Tampão B a umaconcentração de sal final especifica (por exemplo,adição instantânea de Tampão B a uma concentração finalde NaCl de 0,6 Μ). O processo de eluição em etapa únicaremou mais de 99% das proteínas de impureza (ensaioBCA; dados não mostrados), em que 70 - 95% do VSV foramrecuperados nas frações eluídas (ensaio de placa; dadosnão mostrados) . Assim, o processo de eluição em etapaúnica será aqui usado, pois um alto título de VSV foiobtido usando-se essa estratégia de eluição simples ede uma etapa.
Taxa de fluxo operacional. Foram investigadasduas taxas de fluxo diferentes, isto é, 10 volumes decápsula (CV)/minuto e 20 CV/minuto. Não se observounenhuma alteração no desempenho do processo depurificação com qualquer das taxas de fluxo.
Tratamento com Benzonase®. Benzonase®Nuclease é uma endonuclease geneticamente manipulada.Ela degrada todas as formas de DNA e RNA (fita única,fita dupla, linear e circular), não apresentando, aomesmo tempo, nenhuma atividade proteolígica. É eficazem uma ampla gama de condições, com alta atividadeespecífica. Assim, Benzonase® nuclease é ideal para aremoção de ácidos nucléicos de produtos recombinantes,permitindo atender às diretrizes do FDA paracontaminação com ácidos nucléicos.Observou-se aqui que a Benzonase® nucleasereduzia significativamente o nível de DNA no processode purificação de VSV e no concentrado a granelpurificado final de VSV. Entretanto, a adição deBenzonase® nuclease antes da purificação no adsorvedorde membrana Mustang™ Q resultou na redução do títulode vírus (dados não mostrados) . Em contraste, otratamento com Benzonase® nuclease depois da etapa depurificação por cromatografia em membrana não teve omesmo efeito (isto é, não se observou nenhuma reduçãode título).
Entretanto, como o processo de purificação deVSV completo aqui descrito (por exemplo, veja FIG. 1)removeu mais de 99% dos contaminantes de culturacelular, o nível de DNA no concentrado a granelpurificado final de VSV estava abaixo dasespecificações (por exemplo, especificações do OMS <10ng/dose) sem o tratamento com Benzonase®nuclease.Assim, o tratamento com Benzonase® nuclease não tem deser usado no processo de purificação de VSV, o que foium aperfeçoamento significativo em comparação com osprocessos tradicionais de purificação de produtos devírus/vacinas virais (que requerem tratamento comBenzonase® nuclease) .Capacidade de ligação da Mustang™ Q. Acapacidade de ligação do adsorvedor de membranaMustang™ Q foi determinada por penetração de VSVusando-se um pequeno volume (0,35 mL de volume) deadsorvedor de membrana Mustang™ Q (isto é, uma moedade Mustang™ Q) . Quando se carrega e purifica fluido decultura celular condicionado na moeda de Mustang™ Q,observa-se inicialmente que a penetração de VSV nãopodia ser medida por absorbância de UV, por causa doatravessamento de impurezas que absorvem UV. Assim,neste exemplo, as frações de atravessamento de VSVforam coletadas, e o VSV foi detectado por SDS-PAGE eensaio de titulo de VSV. 0 tampão de equilíbrioMustang™ Q era 10 mM de HEPES, pH 7,5, 0,3 mM de NaCl,e 2% de sacarose.
Surpreendentemente, a penetraçãocromatográfica convencional de 1% não foi atingida(veja Tabela 8 abaixo), mesmo após o carregamento de400 mL de fluido de cultura celular na moeda deMustang™ Q (o título do fluido de cultura de VSV erade 6,9 χ 106/mL). Entretanto, conforme mostrado naTabela 8, um título de VSV mais elevado noatravessamento foi observado quando a moeda deMustang™ Q foi carregada com os 400 mL de amostra defluido de cultura. Além disso, quando o volume decarregamento atingiu 400 mL, a pressão diferencial namoeda aumentou para 1,8 Bar. Assim, concluiu-se poresse experimento, que 350 mL de fluido de culturacondicionado por 0,35 mL de adsorvedor de membranaMustang™ Q era a capacidade de carga do filtro, queera equivalente a 500 mL de cultura celular/mL deadsorvedor de membrana. Alternativamente, a capacidadede ligação do Mustang™ Q também pode ser descrita como6,9 χ IO9 ufp/mL de membrana. Em três operações deconsistência, a capacidade de carga real (em titulo devirus) era ligeiramente maior que essa capacidade deligação, o que não afetou o desempenho do processo.
Assim, esses dados indicaram que a capacidade deligação determinada era um número de capacidadeconservador e, portanto, podia ser facilmente usada naprodução por fabricação em grande escala.TABELA 8. ESTUDO DA CAPACIDADE DE CARGA DE MUSTANG™ Q
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ND* = não determinado
O Volume de Carga1 se baseou no volume de culturaTítulo de VSV2: o titulo de alimentação de VSV foi de6β,9E+06/mL
O volume da membrana de filtro Mustang™ Q foi de 0,35mL
FTl - FT4 são os Atravessamentos 1-4, respectivamente
Conclusões do adsorvedor de membranaMustang™ Q. Um produto de VSV de alta qualidade comuma alta recuperação foi conseguido com o adsorvedor demembrana Mustang™ Q. Em comparação com processoscromatográficos "tradicionais", o processo depurificação com Mustang™ Q (além de ser um processodireto e eficiente) tem várias vantagens. Por exemplo,o processo fornece um produto de VSV de maior qualidadedo que a purificação por ultracentrifugação comgradiente de sacarose (por exemplo, veja FIGs. 5A e5Β) . Além disso, (a) a alta capacidade de ligação doadsorvedor de membrana Mustang™ Q significa menorequipamento de processo e menor custo de produção, (b)a taxa de fluxo mais elevada, com relação às outrasresinas cromatográficas testadas, resulta em maioresprodução e produtividade, e (c) as unidades deadsorvedor de membrana descartáveis Mustang™ Qeliminam a necessidade de validação de limpeza evalidação de vida útil.
A seguir, resumem-se as condições operaçõesdesenvolvidas para a Mustang™ Q e acima descritas: (a)capacidade de carga = 0,5 L de cultura celular pormililitro de adsorvedor de membrana Mustang™ Q, (b)taxa de fluxo = 20 volumes de cápsula (CV) por minuto,
(c) pH de ligação a VSV = pH 7,5 ± 0,1 unidade de pH,
(d) força iônica de ligação a VSV = 0,3 ± 0,2 M de sal;
(e) eluição de VSV = gradiente por etapas em 15 CV; e'
(f) força iônica de eluição de VSV = 0,7 M de sal.
EXEMPLO 7: PROCESSO DE PURIFICAÇÃO DE VSV:FILTRAÇÃO DE FLUXO TANGENCIAL, POLIMENTO, TROCA DETAMPÃO
A concentração de VSV e a troca de tampãoforam realizadas usando-se um sistema de filtração defluxo tangencial (TFF) ultrafiltração/diafiltração(UF/DF). O material de eluição de VSV reunido doadsorvedor de membrana Mustang™ Q estava em 10 mM detampão HEPES com uma alta concentração de sal (0,7 M deNaCl) e ainda tinha uma quantidade residual deimpurezas. Assim, uma etapa de UF/DF era necessáriapara remover as impurezas residuais e produzir umproduto de VSV final em um tampão de formulação deproduto apropriado.
Os materiais de eluição reunidos de cincooperações experimentais com Mustang™ Q foramcombinados e usados neste experimento. Utilizou-se umcartucho de membrana de TFF oco de 16cm2 com um cortede peso molecular de 750 kDa (GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ). A solução reunida foiprimeiro concentrada a 10 mL. Foram realizadas cinco(5x) trocas de tampão em salina tamponada com fosfato(10 mM de tampão fosfato de potássio (PBS) a pH 7,1 e 138 mM de NaCl).
A análise SDS-PAGE para amostras em processoindicou que o VSV purificado só estava presente nomaterial retido e enxágüe, e que a perda de VSV nospermeados não era detectada por coloração com prata ouanálise de Western Blot (dados não mostrados). Os dadosde SDS-PAGE demonstraram que a recuperação de VSV doprocesso era aceitável, e que as impurezas eramremovidas gradualmente após cada troca de tampão (dadosnão mostrados). Para remover completamente as impurezasresiduais, foi necessário um total de cinco a seistrocas de tampão.
Otimização das condições de operação deUF/DF. Investigou-se o efeito da composição do tampãosobre o desempenho de TFF UF/DF. 0 mesmo material deeluição reunido de Mustang™ Q foi usado como aalimentação para todos os experimentos (Tabela 9) . Ostrês primeiros experimentos foram relaizados em umamembrana de TFF de fibras ocas de 16 cm2 (GE HealthcareBio-Sciences Corp.), ao passo que a última operação foifinalizada com uma membrana de TFF de 420 cm2 (GEHealthcare Bio-Sciences Corp). Para todos osexperimentos, a qualidade de produto era similar (combase na análise SDS-PAGE e SE-HPLC).TABELA 9. EXPERIMENTO DE COMPOSIÇÃO TAMPÃO DE-TFF
<table>table see original document page 85</column></row><table>
Independentemente do tampão usado, não havianenhum produto de VSV observado nos permeados dediafiltração (com base em SDS-PAGE/coloração com prata;dados não mostrados). Entretanto, ensaios de proteínatotal e DNA indicaram que cerca de 34 - 41% da proteínatotal carregada e 33 40% do DNA carregado foramremovidos nos primeiros três volumes de diafiltração.
Com relação à troca de tampão, cinco volumes dediafiltração (DV) foram suficientes para reduzir acondutividade do permeado a um nível satisfatório.
Assim, foram desenvolvidas as seguintescondições operacionais de TFF UF/DF:
(a) Cartucho de Membrana de TFF: Cartucho deTFF de Fibras Ocas (750 kDa),(b) Capacidade da Membrana de TFF: 95 de Lcultura celular/m2,
(c) Pressão Operacional: pl = 20,7 - 27,6 kPa(3-4 psig) ; p2 = 6, 9 - 13,8 kPa (1-2 psig) ; TMP =10,3 - 17,2 IPa (1,5 - 2,5 psig),
(d) Temperatura Operacional: temperaturaambiente,
(e) Taxa de Fluxo Cruzado: 700 LMH,
(f) Fluxo de Permeado: > 30 LMH, e
(g) 5x Concentração e 6x Diafiltração em PBS+ 4% de sacarose (10 mM de fosfato de potássio, 138 mMde NaCl, pH 7,2);
em que pl é a pressão de entrada, p2 é apressão de saida, TMP é a pressão transmembrana, e LMHé litros/m2 hora.
EXEMPLO 8: PROCESSO DE PURIFICAÇÃO DE VSV:
FILTRAÇÃO FINAL
A última etapa no processo de purificação deVSV foi uma filtração final de um material purificadopor TFF acima descrito. Uma unidade de filtro SartoriusSartobran™ de 0,2 μM(0,4 5/0,2 μπι) (Sartorius Corp.;Edgewood, NY) a uma taxa de fluxo de 100 mL por minutofoi usada para remover uma possível biocarga com umaperda mínima de produto de VSV. 0 tampão era 10 mM defosfato de potássio (pH 7,1 - 7,3), 138 mM de NaCl e7,5% de sacarose.
EXEMPLO 9: PURIFICAÇÃO EM ESCALA AUMENTADA DEVSV PARA 0 CONSTRUTO VSVin N4CT9-GAG1
Foram realizadas quatro operações em escalaaumentada de 4,5 L (isto é, volume de cultura celular).Os resumos das operações em escala aumentada sãomostrados abaixo na Tabela 10 e Tabela 11 e na FIG. 6.Realizaram-se ensaios incluindo SDS-PAGE (dados nãomostrados), proteína total (Tabela 11), título de vírus(Tabela 10 e FIG. 6) e SE-HPLC (dados não mostrados) .Um desempenho de processo consistente (isto é,qualidade do produto de VSV) e remoção de impurezasforam conseguidos em cada uma das operações em escalaaumentada usando-se o processo exposto na FIG. 1.
TABELA 10. OPERAÇÕES EM ESCALA AUMENTADA
<table>table see original document page 87</column></row><table>TABELA 11. REMOÇÃO DE IMPUREZAS DE PROTEÍNA EMOPERAÇÕES DE ESCALA AUMENTADA DE VSV
<table>table see original document page 88</column></row><table>
ND = Não Determinado
Análise do Processo de Purificação de VSV em
Escala Aumentada
O objetivo de se desenvolver o novo processode purificação de VSV aqui descrito (por exemplo, vejaFIG. 1) foi o de produzir VSV de alta pureza, com umaalta recuperação do produto de VSV purificado. Aanálise a seguir descreve a purificação de VSV e aestabilidade com base em quatro operações em escalaaumentada de 4,5 L de cultura celular.
Análise SDS-PAGE e Remoção de Proteínas deImpureza. Um importante aspecto do processo depurificação era a depleção (ou remoção) das proteínasde impureza de cultura celular do produto de VSV.Conforme exposto acim ano Exemplo 1, o construto rVSVINaqui exemplificado foi o construto rVSVIN N4CT9-gagl. 0produto de VSV foi monitorizado por detecção de suasproteínas de vírus maiores: M (27 kDa), N/P (49 kDa), G(55 kDa) e L (250 kDa) . Dentre as proteínas de VSV, asproteínas M e N/P eram expressadas em maiores níveisque as proteínas G (CT9) e L, em que o nível deproteína L era o menor. Conseqüentemente, as proteínasM e N/P foram observadas com bandas muito mais intensasna análise em gel de SDS-PAGE, com relação às proteínasGeL. Em todos os experimentos, os mesmos volumes deamostra foram carregados no gel (a menos que indicadode outra forma) . Além disso, em vez de um único métodode detecção de proteína, como coloração com prata oucoloração com Coomassie®, utilizou-se coloração comprata/Coomassie® Azul, proporcionando, dessa forma,uma detecção de proteína mais sensível.A análise SDS-PAGE para a operação em escalaaumentada número 4 (FIGs. 4A e 4B) revelou que a maiorparte das proteínas do hospedeiro foram removidas naetapa de clarificação primária da centrifugação a baixavelocidade (FIGs. 4A, 4B, pistas 1 e 2) medianteremoção de detritos celulares. Com base na análise BCA,91,5% da proteína total foram removidos, indicando quea centrifugação a baixa velocidade era uma etapa deremoção de impurezas significativa.
O sobrenadante da centrifugação foi diluídocom 10 mM de tampão HEPES (pH 7,5 após a adição de 1xfosfato glutamato de sacarose (SPG; 7,5% de sacarose,10 mM de fosfato de potássio, 5 mM de glutamato) ) ,0, 465 M de NaCl e 2% de sacarose (FIGs. 4A, 4B, pista3) , em que se observou uma banda de coloração maisclara devido à diluição. A solução diluída foi, então,bombeada através de um filtro de 0,2 μm para removerquaisquer contaminantes restantes (nenhuma proteína deimpureza foi removida nessa etapa; FIGs. 4A, 4B, pista4) . O filtrado de VSV foi coletado como a alimentaçãopara a etapa de Mustang™ Q e carregado no adsorvedorde membrana.
Mais de 99,5% das proteínas de impurezarestantes foram removidas no adsorvedor de membranaMustang™ Q (Tabela 11) . A remoção das proteínas deimpureza foi observada por análise SDS-PAGE (FIGs. 4A,4B, pistas 4 e 5) , em que um produto de VSV de altaqualidade foi eluído da membrana Mustang™ Q (FIGs. 4A,4B, pista 6) .
O VSV eluído foi concentrado e diafiltrado emtampão PBS (+ 7,5% de sacarose) . Mais de 48% dasimpurezas de proteína restantes foram removidas naetapa de purificação UF/DF (Tabela 11), em que foramdetectadas bandas de proteínas de VSV muito intensas(FIGs. 4A, 4B, pista 7). Apenas quantidades residuaisde proteínas de impureza foram observadas no materialpermeado reunido de UF/DF (FIGs. 4A, 4B, pista 8).Antes e depois da filtração final a 0,2 μm, não houvenenhuma alteração detectável com relação à qualidade daproteína de VSV ou perfil de proteínas de impureza(FIGs. 4A, 4B, pistas 9 e 10).
O concentrado a granel purificado de VSV doprocesso recém desenvolvido também demonstrou maiorpureza e baixo nível residual em comparação com apurificação por centrifugação com gradiente desacarose. Por exemplo, as bandas de coloração deproteínas de VSV (Μ, Ν, P, G e L) do processo recémdesenvolvido (FIGs. 5A, 5B, pista 9) eram mais intensasdo que as bandas de coloração do VSV purificado porcentrifugação com gradiente de sacarose (FIGs. 5A, 5B,pista 11) (com bandas de coloração de proteínas deimpureza menos intensas), indicando que um produto deVSV de maior qualidade foi consegiudo com o novoprocesso de purificação exposto na FIG. 1. Em todas asquatro operações de escala aumentada, conseguiu-se umaqualildade de produto similar (dados não mostrados) combase no perfil de proteínas de impureza e intensidadedas bandas de proteínas de VSV.
Análise de Cromatografia Líquida de AltoDesempenho por Exclusão de Tamanho (SE-HPLC).Desenvolveu-se uma análise SE-HPLC para VSV (vejaExemplo 1), que proporciona um método simples econveniente para separar VSV de proteínas de impureza eanalisar qualitativamente o processo de purificação deVSV. Para proteger a coluna, apenas amostrasclarificadas foram injetadas na coluna. O VSV flui parafor a da coluna como um pico de eluição com um tempo deretenção de 7,5 minutos (dados não mostrados). Os picosde proteínas contaminantes/de impureza (que têm umtempo de retenção em coluna mais longo) eluem da colunadepois do pico de VSV e, conseqüentemente, precisam sereliminados/removidos do produto de VSV. A maior partedas impurezas foi removida no atravessamento e lavagemde Mustang™ Q, o que confirma os resultados daanállise SDS-PAGE. Na etapa UF/DF, impurezasrelacionadas ao tampão foram removidas, e nenhum VSVfoi perdido em nenhum dos permeados (dados nãomostrados) . Depois da filtração final a 0,2 μπι, oproduto de VSV eluiu da coluna de SE-HPLC como um únicopico maior com um tempo de retenção de 7,5 minutos,seguido por dois picos menores correspondendo a umcontrole de tampão, (dados não mostrados).
Remoção de DNA de Hospedeiro Residual. O DNAde cultura celular (de células hospedeira) é um dosmaiores contaminantes em processos de purificaçãousando tecnologia recombinante. 0 nivel de DNA residualno concentrado a granel purificado de VSV deve estarabaixo de 10 ng/dose (IO7 ufp). Os perfis de remoção deDNA para as quatro operações em escala aumentada estãoresumidos abaixo na Tabela 12, em que uma remoçãoconsistente de DNA foi conseguida em cada etapa depurificação. Uma grande depuração de DNA foi observadana etapa de recuperação de produto (isto é, Iaclarificação por centrifugação a baixa velocidadeseguida pela 2a clarificação por filtração a 0,2 μπι) ena etapa de adsorvedor de membrana Mustang™ Q. Mais de80% do DNA residual foram removidos na etapa deMustang™ Q, e mais de 60% de depuração de DNA foramconseguidos na etapa UF/DF. A porcentagem global deremoção de DNA foi de 99,89 ± 0,03% em todas as quatrooperações em escala aumentada. Além disso, o nivel deDNA residual estava muito abaixo de 10 ng/dose (Tabela13).
TABELA 12. SUMÁRIO DA REMOÇÃO DE DNA DE HOSPEDEIRO (%)
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Recuperação de Produto1 é a etapa de clarificação dofluido de cultura da centrifugação a baixa velocidadeseguida por filtração a 0,2 μm.TABELA 13. SUMÁRIO DO NÍVEL DE DNA NO CONCENTRADO AGRANEL PURIFICADO DE VSV
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Remoção de Proteína Gag. A concentração deproteína Gag foi determinada por ELISA, gue forneceudados para definir o nível de Gag residual no produtode VSV. O perfil de proteína Gag no processo depurificação é resumido abaixo na Tabela 14. A maiorparte da proteína Gag foi removida na etapa declarificação secundária (isto é, filtração a 0,2 μm) ena etapa de adsorvedor de membrana Mustang™ Q. O nívelde proteína Gag residual variou de 0,08 a 8,93 ng/dose(10^7 ufp) no concentrado a granel purificado final,conforme mostrado na Tabela 15.
TABELA 14. SUMÁRIO DA REMOÇÃO DE GAG RESIDUAL
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TABELA 15. SUMÁRIO DO NÍVEL DE GAG RESIDUAL NOCONCENTRADO A GRANEL PURIFICADO DE VSV
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Exemplo 10: Purificação de VSV em EscalaAumentada Para o Construto VSViNN4CTi-gaglO desenvolvimento do processo de purificaçãopara o construto VSVINN4CT1-gagl inicialmente apresentouo desafio de um baixo titulo de produto no fluido decultura celular (<10^6 ufp/mL), o que resultou em umbaixo titulo de produto e alta contaminação com DNA noconcentrado a granel purificado final. Entretanto, oprocesso de purificação conforme descrito no Exemplo 9para VSVINN4CTg-gagl foi aplicado com sucesso a esseconstruto de VSV e passado a uma escala de 10 L (devolume de cultura celular) . Um produto de VSV de altaqualidade foi produzido com esse processo depurificação.
No processo de purificação, as etapas declarificação primária e secundária foramsubstancialmente similares às descritas nos Exemplos 3e 4. A etapa de adsorção em membrana de troca de ânionsusando o adsorvedor Mustang™ Q foi otimizada daseguinte maneira. Conduziu-se a filtração de fluxotangencial usando-se sistemas Quixstand™ ou Flexstand™com cartuchos de membrana de fibras ocas (GEHealthcare; Piscataway, NJ). As membranas deultrafiltração de polietersulfona GE com corte de pesomolecular (MWCO) de 750 kDa também foram testadas nesseestudo. Todas as membranas tinham uma área desuperfície de filtração nominal de 420 cm2 ou 1200 cm2.Conduziram-se experimentos de cromatografia em membranausando-se sistemas AKTA™ explorer e AKTAPilot™ (GEHealthcare; Piscataway, NJ) com adsorvedores demembrana Pall Mustang™ Q (Pall Corporation; East Hills,NY) .
Primeiro ensaio de purificação em Mustang™ Qpara VSVINN4CTi~gagl
A etapa de adsorção em Mustang™ Q foirealizada usando-se os mesmos tampões e condiçõesoperacionais conforme descritos no processo depurificação de VSVINN4CT9-gagl. Resumidamente, ascélulas e detritos foram primeiro removidos mediantecentrifugação. Após a adição de IOX fosfato glutamatode sacarose (SPG) em uma razão de 1:9 (v/v) e diluiçãode 2 vezes com 10 mM de HEPES, 0,465 M de NaCl, pH 7,5,2% de sacarose, a solução foi bombeada através de umfiltro de 0,2 μπι. O filtrado foi carregado em umadsorvedor de membrana pré-equilibrado Pall Mustang™ Q(0,35 mL de volume de cápsula), o material reunido deatravessamento e lavagem (FT&W) foi coletado. 0 produtode VSV foi recuperado no material de eluição reunidousando-se as mesmas condições de eluição descritas noprocesso de VSVINN4CTg-gagl. Obteve-se um produto devírus de alta qualidade (dados não mostrados).Entretanto, um terço do produto de vírus foi observadono material reunido FT&W (Tabela 16) , e o título devírus no material de eluição reunido de Mustang™ Q eramuito baixo devido ao baixo título de produção de vírusno biorreator (4,6 χ IO5 ufp/mL para VSVINN4CTi-gaglversus >1,0 χ IO7 ufp/mL para VSVINN4CT9-gagl) .
TABELA 16. ANÁLISE DE PROCESSO - TÍTULO DE RECUPERAÇÃONA PRIMEIRA ETAPA DE MUSTANG™ Q
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As condições de ligação para esse construtono adsorvedor Mustang™ Q foram adicionalmenteotimizadas da seguinte maneira. O projeto experimentalé delineado na Tabela 17. Em todos os experimentos, opH de carregamento e de eluição de 6,5 a 7,5 foiselecionado com base em experiências anteriores comVSVINN4CT9-gagl. As concentrações de NaCl no tampão decarregamento variando de 0,28 a 0,32 M, ao passo que,no tampão de eluição, de 0,6 a 0,7 M foram escolhidasexperimentos. A taxa de fluxo foi de 3,5 - 10,5 mL/min,que era equivalente a 10 - 30 volumes da cápsula(CV)/min.
TABELA 17. PROJETO OTIMIZADO PARA A ETAPA DE MUSTANG™ Q
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Um produto de VSV de alta qualidade foiobservado em todas as eluições reunidas de Mustang™Qcom base na análise SDS-PAGE (não mostrada) . Osresultados de remoção de proteínas de impureza nessaetapa são mostrados na FIG. 7. Mais de 99% dasproteínas de impureza foram removidas nessa únicaetapa, o que foi mais do que no processo de purificaçãode VSVINN4CTg-gagl. A recuperação de processo e osresultados do ensaio de DNA de hospedeiro residual naseluições reunidas são resumidos na Tabela 18. O nivelde DNA residual nas eluições reunidas era muito baixoem todos os experimentos, o que indica que a depuraçãode DNA não era um problema nesse processo. Entretanto,o titulo de recuperação variou dependendo das condiçõesexperimentais.
TABELA 18. TÍTULO DE RECUPERAÇÃO E NÍVEL DE DNA
RESIDUAL NAS ELUIÇÕES REUNIDAS DE MUSTANG™ Q
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*BD indica que o nivel de DNA está abaixo do nivel dedetecçãoO recuperação do processo foi calculada apartir do título de vírus determinado pelo ensaio deplaca. Quando o pH do tampão de carregamento estava nafaixa de 6,6 a 7,5, e a concentração de NaCl era de0,28 a 0,30 M, conseguia-se uma recuperação de processoaceitável conforme mostrado em um gráfico de contorno(dados não mostrados). As condições ótimas de tampão decarregamento eram 0,29 M de NaCl em 10 mM de HEPES, 2%de sacarose, pH 7,0. Considerando-se que nenhum ajustede pH era preferível no condicionamento da alimentação,o pH 7,5 foi considerado aceitável para o pH do tampãode equilibração de Mustang™ Q. Ao mesmo tempo, 0,60 -0,70 M de NaCl e pH 6,75 - 7,25 foram determinados comoas condições do tampão de eluição do Mustang™. Ascondições ótimas do tampão de eluição era 10 mM deHEPES, 0,65 M de NaCl, 2% de sacarose, pH 7,0. Ascondições do tampão de Mustang™ Q são resumidas naTabela 19. Com essas condições desenvolvidas, oscontaminantes de DNA nos materiais de eluição reunidosforam reduzidos a um nível aceitável (dados nãomostrados).TABELA 19. CONDIÇÕES DO TAMPÃO DE MUSTANG™
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Experimentos adicionais foram consistentescom esses resultados e demonstraram que, em certasmodalidades, 0,28 M a 0,30 M de NaCl e um pH de 7,2 -7,5 eram as condições preferidas do tampão de ligaçãopara assegurar uma elevada recuperação de produto e umaredução aceitável nos contaminantes de DNA nosmateriais de eluição reunidos.
EXEMPLO 11: PURIFICAÇÃO DE VSV EM ESCALAAUMENTADA PARA O CONSTRUTO VSVinN4CTi-GAG1
Três operações de confirmação em pequenaescala foram completadas com os mesmos materiais dealimentação, usando-se as condições de Mustang™Q acimadesenvolvidas. O tampão de equilibração era 10 mM deHEPES, 0,29 M de NaCl, pH 7,5, 2% de sacarose; ao passoque o tampão de eluição era 10 mM de HEPES, 0,65 M deNaCl, pH 7,0, 2% de sacarose. As mesmas condiçõesoperacionais foram mantidas para todas as operações:mesma taxa de fluxo, mesmo volume de carga e mesmovolume de eluição. Os resultados experimentais estãoresumidos na Tabela 20. Conseguiu-se um desempenho deprocesso muito consistente com base na recuperação deproduto calculada a partir dos resultados de ensaio detitulo.
TABELA 20. OPERAÇÕES DE CONFIRMAÇÃO DE MUSTANG™ Q
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Processo de purificação de VSVINN4CT1-gag1 emescala aumentada, operações de consistência etransferência de tecnologia
O fluido de cultura celular contendoVSVINN4CT1-gag1 após a remoção dos microcarreadores foiusado como material de partida para o processo depurificação inteiro. O processo compreendia aclarificação do fluido de cultura celular porcentrifugação a baixa velocidade e recuperação do VSVno sobrenadante; a filtração do sobrenadante através deum filtro de 0,45/0,2 μm e a recuperação do VSV nasolução filtrada; o carregamento da solução filtrada deVSV em um adsorvedor de membrana de troca de ânions, arecuperação do produto de VSV nos materiais de eluiçãoreunidos; a purificação do VSV recuperado por filtraçãode fluxo tangencial (TFF) usando-se uma membrana decorte de peso molecular de 750 kDa e a recuperação doVSV no material retido, e, finalmente, a filtração domaterial retido de VSV através de um filtro de 0,2 μι ea recuperação do VSV na solução filtrada. Trêsoperações de escala aumentada para 6 L/consistência(CR) e uma operação de 10 L (TTR) foram completadas comsucesso. As condições experimentais são resumidas naTabela 21.
TABELA 21. CONDIÇÕES DE PROCESSO DAS OPERAÇÕES DEESCALA AUMENTADA/CONSISTÊNCIA PARA VSVinN4CTI-GAG1
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Os resultados experimentais estão resumidosnas Tabelas 22 e 23. Realizou-se uma análise SDS-PAGEtípica para o processo (dados não mostrados). Avariação da etapa recuperação entre as diferentesoperações foi devida à variação do ensaio de potência(ensaio de placa). O rendimento de processo global eraconsistente para as operações realizadas. Observou-seuma remoção consistente de impurezas de proteína e DNA.
Para todas as operações, produziu-se um produto devírus de alta qualidade.TABELA 22. SUMÁRIO DAS OPERAÇÕES DE CONSISTÊNCIA PARA
VS VinN 4 CT1-GAGl
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N/D: não determinado
TABELA 23. ANÁLISE DE PROCESSO COM BASE NA RECUPERAÇÃODE PRODUTO
<table>table see original document page 107</column></row><table><table>table see original document page 108</column></row><table>
1, 2: Método e DP de CR N0 1-3; N/D: não determinado.
O processo de purificação para VSVINN4CTi-gaglfoi bem sucedido na produção de um produto de altaqualidade. As condições de purificação foram aumentadaspara uma escala de 10 L (de volume de cultura celular)com um desempenho de processo consistente. O rendimentode processo global com base no titulo de VSV do ensaiode placa era menor que o conseguido com VSVINN4CTg-gagle VSVNJN4CTi-gagl. A maior perda de titulo foi observadana filtração final a 0,2 μπι e também possivelmente naetapa de Mustang™ Q. A ligação não especifica poderiaexplicar a perda, particiularmente quando o estudotinha o desafio de materiais de partida de baixotitulo. Quanto menor o titulo, maior a parte de virusque seria perdida nos filtros. O aumento do titulo deVSV na cultura celular foi uma boa solução. Diferentescomponentes de tampão, excipentes e condiçõesoperacionais para uso na redução da perda de titulo devirus no processo de purificação e a seleção de umsistema tampão amigável para o produto de virus sãomodificações do sistema de purificação que se acreditaque estejam ao alcance daqueles versados na técnica semrecorrer a experimentação excessiva.
EXEMPLO 12: PURIFICAÇÃO EM ESCALA AUMENTADA DEVSV PARA O CONSTRUTO VSVnjN4CTi-GAGl
O processo de purificação conforme descritona Exemplo 9 para VSVINN4CT9-gagl foi aplicado comsucesso a esse construto de VSV e aumentado a umaescala de 10 L (de volume de cultura celular).Produziu-se um produto de VSV de alta qualidade comesse processo de purificação.
No processo de purificação, as etapas declarificação primária e secundária foramsubstancialmente similares às descritas nos Exemplos 3e 4. A etapa de adsorção em membrana de troca de ânionsusando-se o adsorvedor Mustang™ Q foi otimizada daseguinte maneira. Conduziu-se a filtração de fluxotangencial usando-se sistemas Quixstand™ ou Flexstand™com cartuchos de membrana de fibras ocas (GEHealthcare; Piscataway, NJ) . As membranas deultrafiltração de polietersulfona GE com corte de pesomolecular (MWCO) de 750 kDa foram testadas nesseestudo. Todas as membranas tinham uma área desuperfície de filtração nominal de 420 cm2 ou 1200 cm2.Conduziram-se experimentos de cromatografia em membranausando-se sistemas AKTA™ explorer e AKTAPiIot™ (GEHealthcare; Piscataway, NJ) com adsorvedores demembrana Pall Mustang™ Q (Pall Corporation; East Hills,NY) .
O primeiro ensaio de purificação com Mustang™Q para VSVWJN4CTi-gagl produziu um produto de altaqualidade com base na análise SDS-PAGE, utilizando-seas mesmas condições operacionais descritas no processode purificação de VSVINN4CT9-gagl. Entretanto, um altonivel de DNA residual foi detectado no produto deeluição reunido. Usando-se cromatografia em membrana,as condições de ligação e de eluição em Mustang™ Qforam desenvolvidas para se conseguir uma altapurificação e um produto de VSV de alta qualidade. Umaalta consistência de desempenho do processo foidemonstrada em experimentos posteriores, incluindooperações em pequena escala e operações de escalaaumentada/consistência, usando as seguintes condiçõesoperacionais. 0 processo de purificação também foitransferido com sucesso para uma organização defabricação por contrato (CMO) para a produção demateriais para ensaios clínicos.
Primeira Purificação Mustang™ Q ParaVSVNJN4CT1-gaglA etapa de Mustang™ Q foi realizada usando-seo fluido de cultura celular e os mesmos tampões econdições operacionais conformes descritos no processode purificação de VSVINN4CT9-gagl. Resumidamente, ascélulas e detritos foram removidos por centrifugação.Depois de condicionados pela adição de IX fosfatoglutamato de sacarose (SPG) e diluição de 2 vezes commM de HEPES, 0, 465 M de NaCl, pH 7,5, 2% desacarose, o sobrenadante foi bombeado através de umfiltro de 0,2 μM. 0 filtrado foi carregado em umadsorvedor de membrana pré-equilibrado Mustang™ Q, omaterial reunido de atravessamento e lavagem foicoletado. O produto de VSV foi obtido usando-se otampão de eluição e as condições operacionais conformedescrito no processo de purificação de VSVINN4CTg-gagl.O material reunido da regeneração usando-se 10 mM deHEPES, 1,0 M de NaCl, pH 7,5, 2% de sacarose, tambémfoi coletado. Finalmente, limpou-se o Mustang ™Q comsolução de NaOH a 1,0 M. Observou-se uma altacapacidade de ligação a VSV no experimento. Entretanto,muito pouco produto foi recuperado no material deeluição reunido (dados não mostrados). 0 produto devirus foi principalmente detectado no material deregeneração reunido, e mais da metade do produto devirus não foi recuperada (veja Tabela 24) . Um altonível de contaminantes de DNA foi detectado tanto nosmateriais reunidos de eluição, quanto de regeneração.As condições de ligação e eluição para Mustang™ Q foramadicionalmente otimizadas para esse novo construto,para aumentar a recuperação de produto e reduzir onível de DNA residual ao mesmo tempo.
TABELA 24. ANÁLISE DO PROCESSO DE MUSTANG™ Q - TÍTULODE RECUPERAÇÃO E REMOÇÃO DE DNA
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*1 dose = 1,0 χ 10 ufp; BD: abaixo do limite dedetecção
Conforme anteriormente descrito, apurificação de VSVINN4CT9-gagl teve o desafio dadepuração de DNA residual do produto final. Merck KGaA™TiVIAE e Pall Mustang™ Q foram usados para otimizaçãoadicional das condições.
Desenvolvimento da Purificação de VSV Usando-se Resina TMAE™
A triagem das condições do tampão de ligaçãode VSV em resina TMAE™ foi realizada usando-se umprojeto experimental completamente fatorial, conformemostrado na Tabela 25. A alimentação era sobrenadantede cultura celular ajustado a diferentes condições detampão de carregamento. O VSV no atravessamento foimonitorizado usando-se análise Western Blot.
TABELA 25. PORJETO COMPLETAMENTE FATORIAL PARA ASCONDIÇÕES DE LIGAÇÃO A TMAE™
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Conforme indicado pela análise Western Blot(não mostrado), quando a concentração de NaCl no tampãode equilibração atigiu 200 mM, uma quantidadesignificativa de VSV foi observada nos materiais deatravessamento reunidos. Para se obter uma capacidadede ligação de VSV razoável na TMAE, a concentração deNaCl no tampão de equilibração deve estar abaixo de 200mM. O comportamento de ligação de VSV não foidramaticamente afetado dentro das condições de pHtestadas. Entretanto, a análise da recuperação de VSVno material de eluição reunido (estimada pela área deintegração do pico de SE-HPLC do material de eluiçãoreunido de TMAE (FIGs. 8A, 8B e 8C) ) indicou que, àmesma concentração de NaCl de ligação, conseguia-se umamaior capacidade sob condições de pU mais elevado (pH7,5 versus pH 7,0 e 6,5).
Ensaio de Purificação de VSV Usando Coluna de TMAE
As células e detritos celulares foramremovidos do fluido de cultura celular contendoVSViNN4CTg-gagl mediante uma centrifugação a 5.000 rpmdurante 30 minutos a 20 - 24°C. O sobrenadante foibombeado através de um filtro de 0,45/0,2 μπι depois demisturado com 10X solução de estoque de SPG a uma razãode 9 para 1. 0 filtrado foi usado como a alimentaçãopara a coluna de TMAE (2 mL) a uma taxa de fluxo de 4mL/min. A coluna foi pré-equilibrada com 10 mM deHEPES, 0,145 M de NaCl, 2% de sacarose, pH 7,4. Depoisde correr a coluna com 10 volumes de coluna (CV) detampão de equilibração, os materiais ligados forameluidos da coluna através de um gradiente linear a 10mM de HEPES, 1,5 M de NaCl, 2% de sacarose, pH 7,5 em30 CV. Foram coletados diferentes materiais de eluiçãoreunidos.
TABELA 26: ELUIÇÃO DE VSV DE UMA COLUNA DE TMAE
<table>table see original document page 115</column></row><table>
A electroforese em gel de SDS-PAGE (naomostrada) permitiu a observacao de dois picosprincipais no perfil de eluição. O primeiro pico, Fl,tinha baixa razão de UV254/280, indicando maioresteores de proteina/virus. O segundo pico, F2, tinhaalta razão de UV254/280, sugerindo maiores teores deácidos nucléicos. O ensaio PicoGreen® confirmou que onivel de DNA na fração reunida Fl era extremamentebaixo (dados não mostrados). Conseqüentemente, essacoluna foi usada para remoção de DNA. 0 titulo derecuperação nesse pico era de 81,4% pelo ensaio deplaca. Entretanto, notou-se um alto nivel de impurezasde proteína.Purificação de VSV Usando o Adsorvedor de
Membrana Mustang™ Q
A triagem das condições de ligação de VSV no
adsorvedor de membrana Mustang™ Q foi realizada usando-
se um projeto experimental completamente fatorial,
conforme mostrado na Tabela 27. A alimentação era o
sobrenadante de cultura celular ajustado a diferentes
condições de tampão de carregamento. Diferentes
materiais de eluição reunidos de Mustang™ Q foram
analisados usando-se análise SDS-PAGE (não mostrada)
TABELA 27. PROJETO COMPLETAMENTE FATORIAL PARA A
TRIAGEM DE CONDIÇÕES DE LIGAÇÃO A MUSTANG™ Q
<table>table see original document page 116</column></row><table>
A análise SDS-PAGE da triagem das condiçõesde ligação de VSV no adsorvedor Mustang™ Q mostroumateriais de eluição reunidos a diferentesconcentrações de NaCl de ligação, respectivamente:0,15, 0,20, 0,22, 0,24, 0,26, 0,28 M. Quando aconcentração de NaCl no tampão de equilibração atingiu0,26 M, as impurezas de proteínas de alto pesomolecular foram removidas dos materiais de eluiçãoreunidos em todas as condições de pH testadas.Triagem das Condições de Eluição0 sobrenadante de cultura celular contendoVSVINN4CTg-gagl foi diluído duas vezes com uma soluçãode estoque de HEPES (10 mM de HEPES, 0,415 M de NaClf2% de sacarose, pH 7,25) para atingir uma concentraçãode NaCl final de 0,28 Μ. A solução preparada foi uadacomo a alimentação do experimento. O projetoexperimental para esse estudo é resumido na Tabela 28.Após ligação a Mustang™ Q MA, o VSV foi eluido comtampões de eluição a diferentes concentrações de NaCl.
TABELA 28. PROJETO COMPLETAMENTE FATORIAL DESIGN PARAESTUDO DE TRIAGEM DE CONDIÇÕES DE ELUIÇÃO COM MUSTANG™
<table>table see original document page 117</column></row><table>
Uma análise do gráfico de contorno darecuperação do processo (não mostrada) indica que que,para se conseguir uma recuperação de processo razoável(> 55%), as condições do tampão de eluição devem sermantidas como: pH = 6,5 - 6,9 e concentração de NaCl =0,55 - 0,70 M. Com essas condições, produziu-se umproduto de VSV de alta qualidade, conforme mostrado naanálise SDS-PAGE para materiais de eluição reunidos deMustang™ Q (não mostrado).
Otimização das Condições de Mustang™ Q UsandoAbordagens DOE
Uma otimização adicional na etapa de Mustang™Q resultou em melhores ligação de VSV e condições deeluição para se conseguir um alto nivel de depuração deDNA e elevado rendimento de processo. 0 projetoexperimental é mostrado na Tabela 29. 0 pH decarregamento e de eluição de 6,5 a 7,0 foi selecionadocom base em estudos de triagem iniciais e experiênciasanteriores com VSVINN4CT9-gagl. Diferentes concentraçõesde NaCl nos tampões de carregamento e eluição tambémforam escolhidas dos resultados dos estudos de triageminiciais. A taxa de fluxo em todos os experimentos foimantida em 7,0 mL/min, que era de 20 volumes da cápsula(CV)/min.
TABELA 29. PURIFICAÇÃO DE VSV EM ADSORVEDOR MUSTANG™ Q
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Resultados Experimentais
O rendimento do processo foi calculado combase no titulo de produto de VSV determinado peloensaio de placa. Os resultados são resumidos em umperfil de predição (não mostrado) . Para maximizar orendimento do processo, foram identificadas asseguintes condições de tampão na adsorção em Mustang™ Q:
Concentração de NaCl no tampão decarregamento: 0,26 - 0,30 M
pH do tampão de carregamento: 7,0 - 7,5Concentração de NaCl no tampão de eluição:0,55 - 0,65
pH do tampão de eluição pH: 6,5-7,0Os níveis de DNA residual nos materiais deeluição reunidos de Mustang™ Q nas diferentes condiçõesde ligação foram relatados em gráficos de contorno (nãomostrados) . As condições de tampão do Mustang™ Q foramadicionalmente refinadas com base nos resultados dedepuração de DNA:
Concentração de NaCl no tampão decarregamento: 0,27 - 0,29 M
pH do tampão de carregamento: 7,0 - 7,5Concentração de NaCl no tampão de eluição:0,55 - 0,65
pH do tampão de eluição pH: 6,5 - 7,0A purezado do produto de VSV nos materiais deeluição reunidos de Mustang™ Q foi estimada pordensitometria de SDS-PAGE (não mostrada). Analisou-se apureza do produto sob diferentes condições do tampão deligação e diferentes condições do tampão de eluição.Considerando-se a variação da análise de densitometria,não havia nenhuma diferença significativa na pureza doproduto de VSV em todos os casos. Produziu-se umproduto de VSV de alta qualidade em todos osexperimentos.
Faixas de Operação do Mustang™ QAs condições do tampão de ligação e deeluição da cromatografia em membrana por Mustang™ Qforam definidas por realização dos experimentos commais pontos operacionais dentro e fora das condiçõesdesenvolvidas, conforme mostrado na Tabela 30. O tampãode equilibração/eluição era 10 mM de HEPES, 2% desacarose, com várias quantidades de NaCl e diferentescondições de pH. As mesmas condições operacionais forammantidas em todas as operações: mesma taxa de fluxo,mesmo volume de carregamento e mesmo volume de eluição.Observou-se um desempenho de processo consistente,conforme mostrado na Tabela 30: produziu-se um produtode VSV de alta qualidade com base na análise SDS-PAGE;um nivel aceitável de DNA residual foi conseguido emtodos os materiais de eluição reunidos de Mustang™ Q;também se obteve um rendimento de processo similar.TABELA 30. EXPERIMENTO DE FAIXAS OPERACIONAIS DE
MUSTANG™ Q
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N/D: não determinado
Operações de Consistência de VSVINN4CT9-gagl
O processo de purificação inteiro foirealizado usando-se fluido de cultura celular contendoVSVINN4CTg-gagl. O processo compreende: a clarificaçãodo fluido de cultura celular por centrifugação a baixavelocidade e recuperação do VSV no sobrenadante; a filtração do sobrenadante através de um filtro de0,45/0,2 μπΐ e a recuperação do VSV na solução filtrada;o carregamento do filtrado de VSV em um adsorvedor demembrana de troca de ânions, eluição do VSV doadsorvedor de membrana de troca de ânions e recuperaçãodo produto de VSV; a purificação do VSV recuperado porfiltração de fluxo tangencial (TFF) usando-se umamembrana de fibras ocas com um corte de peso molecularde 750 kDa e a recuperação do VSV no material retido, ea filtração do material retido de VSV através de umfiltro de 0,2 μιτι e recuperação do VSV na soluçãofiltrada. Uma operação de 10 L e duas de 6 L foramcompletadas na Wyeth como as "operações deconsistência", e duas operações de 10 L foramrealizadas na Henogen como as operações detransferência de tecnologia. As condições experimentaisestão resumidas na Tabela 31.
TABELA 31. CONDIÇÕES DE PROCESSO PARA AS OPERAÇÕES DEVSVINN4CT9-GAG1
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Usou-se uma cápsula Mustan™ Q de 10 mL emtrês operações de consistência (CRs) e uma operação detransferência de tecnologia (TTR). A cápsula Mustang™ Qde 60 mL só foi usada em uma TTR. A taxa de fluxo foide 200 mL/min para a cápsula de 10 mL e de 600 mL/minpara a cápsula de 60 mL. Usou-se uma membrana de TFF de420 cm2 nas operações de consistência, ao passo que seusou uma de 1.200 cm2 nas TTRs. A taxa de fluxo cruzadofoi ajustada linearmente de acordo com a área damembrana.
Os resultados experimentais estão resumidosnas Tabelas 32 e 33. 0 rendimento de processo globalera consistente para todas as operações realizadas. Avariação da etapa recuperação entre as diferentesoperações é devida à variação do ensaio de potência(Tabela 33) . Observou-se uma remoção consistente dasimpurezas de proteína e DNA em todas as operações(Tabela 32) . Uma análise SDS-PAGE típica para oprocesso acompanhou essa avaliação (não mostrada).Produziu-se um produto de vírus de alta qualidade comesse processo de purificação.
TABELA 32. SUMÁRIO DAS OPERAÇÕES DE CONSISTÊNCIA PARA
VSVnjN 4 CT1-GAGl
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NA: não disponível
TABELA 33. ANÁLISE DE PROCESSO COM BASE NA RECUPERAÇÃODE PRODUTO
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1, 2: Média e DP de CR N0 1-3; N/D: não determinado.
Assim, desenvolveu-se com sucesso um processode purificação para VSVNJN4CTi-gagl, e as condições depurificação desenvolvidas foram aumentadas para umaescala de 10 L (de volume de cultura celular) , aindamantendo o mesmo desempenho de processo. O processo foiconfirmado por três operações de consistência e duasoperações de transferência de tecnologia em uma escalade 6 a 10 L (de volume de cultura celular) . Um produtode virus de alta qualidade foi produzido pelo processodesenvolvido, com rendimento de processo e depuraçõesde impurezas aceitáveis.
Todas as patentes e publicações citadas nesterelatório são aqui incorporadas por referência.

Claims (18)

1. Processo para a purificação do vírus daestomatite vesicular (VSV) do fluido de cultura celular deuma cultura de células de mamíferos infectada com VSV7 oprocesso caracterizado pelo fato de que compreende:(a) a clarificação do fluido de cultura celularpor centrifugação de baixa velocidade e a recuperação do VSVno sobrenadante;(b) a filtração do sobrenadante da etapa (a)através de um filtro de 0,2 a 0,45 μπι e recuperação do VSVna solução filtrada;(c) o carregamento da solução filtrada de VSV daetapa (b) em um adsorvedor de membrana de troca de ânionsequilibrado com uma primeira solução de sal de pH tamponado,eluindo-se o VSV do adsorvedor de membrana de troca deânions com uma segunda solução de sal de pH tamponado, erecuperando-se as frações de VSV eluídas;(d) a purificação do VSV recuperado na etapa (c)por filtração de fluxo tangencial (TFF) usando-se umamembrana com um corte de peso molecular entre 300 kDa e-1.000 kDa e recuperando-se o VSV no material retido, e(e) a filtração do material retido de VSV da etapa(d) através de um filtro de 0,2 a 0,22 μπ\ e recuperação doVSV na solução filtrada.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o VSV recuperado na etapa (e)é pelo menos 90,0% a cerca de 99,0% livre de contaminantesde proteína e ácido nucléico de cultura celular.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou-2, caracterizado pelo fato de que as células de mamífero sãoselecionadas de células renais embrionárias humanas (HEK),células HEK 293, células de ovário de hamster chinês (CHO),células renais de hamster filhote (BHK), células renais demacaco verde africano (AGMK) e células AGMK Vero.
4. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que acentrifugação de baixa velocidade é entre 4.400 χ g e 8.000χ g.
5. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que aprimeira solução de sal de pH tamponado ou a segunda soluçãode sal de pH tamponado na etapa (c) é independentementecaracterizada por uma ou mais das característicasselecionadas do grupo que consiste em:(a) conter um sal independentemente selecionado deNaCl ou KCl;(b) conter um sal com uma força iônica de 100 mM a-400 mM;(c) conter um tampão com um pKa entre 6,0 e 8,5;(d) ter um pH de 6,5 a 8,0;(e) compreender um tampão selecionado do grupo queconsiste em tampão fosfato, tampão ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanossulfônico (HEPES) outris(hidroximetil)aminometano (TRIS); e(f) compreender sacarose a uma concentração de-1, 5-s a 5"o.
6. Processo, de acordo com a reivindicação 5,caracterizado pelo fato de que o sal na segunda solução desal de pH tamponado é NaCl, e pelo fato de que o VSV éeluido do adsorvedor de membrana por adição da segundasolução de sal de pH tamponado em uma única etapa, em que aa concentração do NaCl na eluição de etapa única está entre-500 mM e 750 mM.
7. Processo, de acordo com a reivindicação 6,caracterizado pelo fato de que a segunda solução de sal depH tamponado tem uma taxa de fluxo de eluição de 10 volumesde cápsula/minuto (CV/minuto) a 30 CV/minuto.
8. Processo, de acordo com a reivindicação 5,caracterizado pelo fato de que os sal na segunda solução desal de pH tamponado é NaCl, e pelo fato de que a forçaiônica do NaCl na segunda solução de sal de pH tamponado élinearmente aumentada de 1 mM para 7 50 mM a uma taxa defluxo de eluição de 10 CV/minuto a 30 CV/minuto.
9. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 8, caracterizado pelo fato de que amembrana de TFF se caracterizada por uma ou mais dascaracterísticas selecionadas do grupo que consiste em:(a) um corte de peso molar de 300kDa;(b) um corte de peso molecular de 750 kDa; e(c) um módulo de membrana de fibras ocas.
10. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 9, caracterizado pelo fato de que aTFF compreende uma concentração do VSV recuperado da etapa(c) de pelo menos 5x, seguida por pelo menos uma, ou pelomenos cinco trocas de tampão.
11. Processo, de acordo com a reivindicação 10,caracterizado pelo fato de que o tampão usado na troca detampão se caracterizada por uma ou mais das característicasselecionadas do grupo que consiste em:(a) um tampão fosfato;(b) um tampão HEPES;(c) um tampão TRIS;(d) uma concentração de tampão de 5 mM a 15 mM eum pH de 7,2 a 7,5; e(e) um tampão também compreendendo de 100 mM a 200mM de NaCl e 3,5% a 4,5% de sacarose.
12. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 11, caracterizado pelo fato de que asetapas de processo de (a) a (e) são realizadas a umatemperatura ou a temperaturas de ou entre 15°C e 25°C.
13. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 12, caracterizado pelo fato de que aclarificação do fluido de cultura celular na etapa (a) é porum módulo de filtração profunda de 1,0 μιιι a 4,5 μιη, em que acentrifugação de baixa velocidade é omitida da etapa (a).
14. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 13, caracterizado pelo fato de que oVSV purificado é formulado em uma composição farmacêutica.
15. VSV, caracterizado pelo fato de que épurificado pelo processo de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes.
16. VSV, de acordo com a reivindicação 15,caracterizado pelo fato de que tem pelo menos umacaracterística selecionada do grupo que consiste em:(a) um serotipo selecionado do grupo que consisteno serotipo VSV Indiana, serotipo VSV New Jersey, serotipoVSV San Juan, serotipo VSV Isfahan, serotipo VSV Glasgow eserotipo VSV Chandipura;(b) uma seqüência genômica compreendendo pelomenos uma, ou pelo menos duas mutações que atenuem apatogenicidade do VSV;(c) uma seqüência genômica de (b) , em que asmutações atenuantes são selecionadas do grupo que consisteem uma mutação sensível à temperatura (ts), uma mutaçãopontual, uma mutação de embaralhamento de gene, uma mutaçãode tronco G, uma mutação do gene M não citopática, umamutação de RNA ambissentido, uma mutação de gene G truncado,uma mutação de inserção de gene G e uma mutação de deleçãode gene; e(d) em que a seqüência genômica do VSV compreendeuma seqüência de quadro de leitura aberto (ORF) de RNAestranha, selecionada do grupo que consiste em um gene deHIV selecionado do grupo que consiste em gag, env, pol, vif,nef, tat, vpr, rev ou vpu, um gene de HTLV, um gene de SIV,um gene de RSV, um gene de PIV, um gene de HSV, um gene deCMV, um gene do vírus Epstein-Barr, um gene do vírusVaricela-Zoster, um gene do vírus da caxumba, um gene dovírus do sarampo, um gene do vírus da influenza, um gene depoliovírus, um gene de rinovírus, um gene do vírus dahepatite A, um gene do vírus da hepatite B, um gene do vírusda hepatite C, um gene do vírus Norwalk, um gene detogavírus, um gene de alfavírus, um gene do vírus darubéola, um gene do vírus da raiva, um gene do vírusMarburg, um gene do vírus Ebola, um gene do vírus depapiloma, um gene do vírus de polioma, um gene demetapneumovírus, um gene de coronavírus gene, um gene deVibrio cholerae, um gene de Streptococcus pneumoniae, umgene de Streptococcus pyogenes, um gene de Helieobaeterpylorí, um gene de Streptococcus agalactiae, um gene deNeisseria meningitidis, um gene de Neisseria gonorrheae, umgene de Corynebacteria diphtheriae, um gene de Clostridiumtetani, um gene de Bordetella pertussis, um gene deHaemophilus, um gene de Chlamydia, um gene de Escherichiacoli, um gene que codifique uma citocina, um gene quecodifique um epitopo de T auxiliador, um gene que codifiqueum epitopo de CTL, um gene que codifique um adjuvante e a umgene que codifique um co-fator.
17. Composição farmacêutica, caracterizada pelofato de que compreende um VSV de acordo com a reivindicação15 ou 16 em um veiculo farmaceuticamente aceitável.
18. Composição imunogênica, caracterizada pelofato de que compreende um VSV de acordo com a reivindicação-15 ou 16 em um veiculo farmaceuticamente aceitável.
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