PT2007883E - Processos de purificação para o isolamento do vírus da estomatite vesicular purificado de cultura de células - Google Patents

Processos de purificação para o isolamento do vírus da estomatite vesicular purificado de cultura de células Download PDF

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Description

1
DESCRIÇÃO "PROCESSOS DE PURIFICAÇÃO PARA O ISOLAMENTO DO VÍRUS DA ESTOMATITE VESICULAR PURIFICADO DE CULTURA DE CÉLULAS"
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 vírus da estomatite vesicular (VSV), um membro da família dos rabdovírus, tem um genoma de ARN de cadeia simples não segmentado e de sentido negativo. 0 seu genoma de onze kb tem cinco genes que codificam cinco proteínas estruturais do vírus: a proteína da nucleocápside (N), que é necessária em quantidades estoquiométricas para a encapsidação do ARN replicado; a fosfoproteína (P), que é um cofactor da polimerase de ARN dependente do ARN (L) ; a proteína de matriz (M) e a glicoproteína de ligação (G) (por exemplo, ver Gallione et al. , 1981 J. Virol., 39: 529 - 535; Rose and Gallione, 1981, J. Virol., 39: 519 - 528; a patente US 6 033 886; a patente US 6 168 943).
Em geral, o VSV não é considerado um agente patogénico humano e, como tal, a imunidade pré-existente em relação ao VSV é rara na população humana. Por conseguinte, o desenvolvimento de vetores derivados do VSV tem sido um foco em áreas como as das composições imunogénicas (por exemplo, vacinas) e do fornecimento de genes que codificam proteínas terapêuticas. Por exemplo, estudos estabeleceram que o VSV pode servir de vetor eficaz para expressar a proteína hemaglutinina do vírus da gripe (Roberts et al., 1999 J. Virol., 73: 3723 - 3732), a proteína H do vírus do sarampo (Schlereth et al., 2000 J. Virol., 74: 4652 - 4657) e as proteínas env e gag do HIV-1 (Rose et al., 2001 Cell, 106(5) : 539-49) . Outras características do VSV que o tornam um vetor atrativo incluem: (a) a capacidade robusta de replicação na cultura de células; (b) a incapacidade de integração no ADN da célula hospedeira ou de passar por recombinação genética; (c) a existência de múltiplos 2 serotipos, tornando possível estratégias de imunização de reforço principal; (d) genes exógenos de interesse podem ser inseridos no genoma do VSV e ser expressos de forma abundante pela transcriptase virai; e (e) o desenvolvimento de um sistema especializado para resgatar vírus infeciosos de uma cópia de ADNc do genoma do vírus (por exemplo, ver a patente US 6 033 886; a patente US 6 168 943) . A produção de composições imunogénicas com o VSV como vetor inclui geralmente infetar uma cultura de células apropriada (hospedeira) com o VSV recombinante, fazer o VSV crescer na cultura de células, colher o fluido da cultura de células na altura apropriada e purificar o VSV do fluido da cultura de células. A utilização de vetores do VSV e das respetivas composições imunogénicas em aplicações clínicas requer amostras (ou doses) do VSV com a pureza apropriada, de modo a estar de acordo com as normas de segurança das diferentes autoridades de segurança dos medicamentos a nível mundial (por exemplo, a Food and Drug Administration (FDA), a Agência Europeia de Medicamentos (EMEA), o Canadian Health Products and Food Branch (HPFB), etc.).
No entanto, é normalmente difícil separar o VSV dos contaminantes da cultura de células (por exemplo, impurezas proteicas e de ADN da cultura de células) e obter o VSV com a pureza e o rendimento apropriados, utilizando os processos de purificação do VSV atualmente disponíveis (por exemplo, purificação por meio de centrifugação em gradiente de sacarose). Por exemplo, utilizando os processos de purificação atualmente disponíveis, existe normalmente uma relação inversa entre a pureza e a recuperação (rendimento percentual) das amostras do VSV, fazendo com que seja difícil produzir quantidades suficientes do VSV purificado. Além disso, nos processos atuais com base num biorreator, as maiores concentrações de células e os maiores tempos de cultura têm por resultado maiores títulos do VSV, com aumentos concomitantes de detritos celulares e de 3 concentrações de constituintes orgânicos no fluido do biorreator, complicando ainda mais os processos de purificação do VSV. A ultracentrifugação em gradiente de sacarose tem sido o método padrão da purificação virai (inclusive a purificação do VSV) desde 1964 (Yamada et al., 2003 BioTechniques, 34(5): 1074 - 1078, 1080; Brown et al.r 1967 J. Immun., 99(1): 171-7; Robinson et al., 1965 Proc. Natl. Acad. Sei., EUA, 54(1): 137-44; Nishimura et al., 1964 Japão. J. Med. Sei. Biol. , 17(6) : 295 - 305) . No entanto, uma vez que as concentrações virais aumentam, também se verificam os aumentos concomitantes dos detritos celulares, ADN hospedeiro e impurezas proteicas, que são extremamente difíceis de remover em grandes concentrações através da ultracentrifugação em gradiente de sacarose. Além disso, a ultracentrifugação em gradiente de sacarose é extremamente cara à grande escala. A concentração e a purificação do VSV por meio de precipitação de polietilenoglicol (PEG) (McShany et al., 1970 Virol., 40(3): 745-6) tem problemas semelhantes em termos de elevados níveis de impurezas. Obteve-se uma qualidade virai relativamente elevada por meio de cromatografia de exclusão molecular (Transfiguracion et al. , 2003 Human Gene Ther., 14(12): 1139 - 1153; Vellekamp, et al., 2001 Human Gene Ther., 12(15) : 1923-36; Rabotti et al., 1971 Comptes Rendus des
Seances de l'Academie des Sciences, Serie D: Sciences Naturelles, 272(2): 343-6; Jacoli et al., 1968 Biochim.
Biophys. Ata, Genl Subj., 165(2): 99 - 302). No entanto, devido ao custo do processo e à dificuldade operacional, este método não é geralmente viável no caso da produção virai à grande escala. A cromatografia de afinidade, como a heparina (Zolotukhin et al., 1999 Gene Ther., 6(6): 973 - 985), a lectina (Kaarsnaes et al., 1983 J. Chromatog. , 266: 643-9; Kristiansen et al., 1976 Prot. Biol. Fluids, 23: 663-5) e o sulfato Matrex™ Cellufine™ (Downing et al., 1992 4 J. Virol. Meth., 38(2): 215 - 228), teve alguma aplicabilidade na purificação virai. Geralmente, não se prefere (nem se utiliza) a heparina e a lectina na produção virai de acordo com as cGMP, devido a possíveis problemas de lixiviação, que requerem testes adicionais antes do lançamento do produto. A purificação por afinidade de vírus utilizando o sulfato Matrex™ Cellufine™ é uma questão a ser tratada, devido à eficiência da purificação virai, à qualidade virai e à regeneração de coluna. São necessárias colunas de afinidade muito grandes para a purificação do VSV (por exemplo, 0,2 L de resina de sulfato Matrex™ Cellufine™ por litro de cultura celular; Wyeth Vaccine, resultados não publicados). Observou-se um baixo rendimento virai quando se realizou a purificação por meio de cromatografia de permuta iónica, por si só ou em combinação com outros tipos de técnicas cromatográficas tradicionais empregues na purificação virai (Publicação de Patente Internacional N.° W02006/011580 Specht et al. , 2004 Biotech. Bioeng. , 88(4): 465 - 173; Yamada et al., 2003, acima citados; Vellekamp et al., 2001 acima citados; Zolotukhin et al. , 1999, acima citados; (Publicação de Patente Internacional N.° WO1997/06243 Kaarsnaes et al., 1983, acima citados).
Por conseguinte, existe uma necessidade atual e prevalecente no estado da técnica, relativamente a processos de purificação capazes de gerar o VSV com um grau apropriado de pureza e de recuperação (rendimento).
RESUMO DA INVENÇÃO
Os processos e as combinações descritos no presente documento dizem geralmente respeito às áreas da virologia, da microbiologia, da imunologia e do desenvolvimento de processos. Com maior particularidade, encontram-se descritos novos processos de purificação para obter o vírus 5 da estomatite vesicular (VSV) com uma melhor pureza e um melhor rendimento.
Num aspeto, um processo para purificar o VSV a partir do fluido de cultura celular de mamífero infetada com o VSV compreende as etapas de: (a) clarificação primária, (b) clarificação secundária, (c) adsorção de membrana de permuta aniónica, (d) filtração de fluxo tangencial e (e) filtração. Numa forma de realização, a Etapa (a) compreende a clarificação do fluido de cultura celular por meio de centrifugação a baixa velocidade, e a recuperação do VSV no sobrenadante. Numa forma de realização, a Etapa (b) compreende a filtração do sobrenadante através de um filtro de 0,2 a 0,45 pm e a recuperação do VSV na solução filtrada. Noutra forma de realização, a etapa (c) compreende o carregamento da solução filtrada do VSV num adsorvente de membrana de permuta aniónica, equilibrado com uma primeira solução salina de pH tamponado, a eluição do VSV a partir do adsorvente de membrana de permuta aniónica com uma segunda solução salina de pH tamponado, e a recuperação das frações do VSV eluídas. Numa forma de realização, a Etapa (d) compreende a purificação do VSV recuperado através de filtração de fluxo tangencial (TFF), utilizando uma membrana de fibras ocas, tendo uma separação do peso molecular entre 300 kDa e 1.000 kDa, e a recuperação do VSV no material retido. Numa forma de realização, a Etapa (e) compreende a filtração do material retido que contém VSV através de um filtro de 0,2 a 0,22 μπι e a recuperação do VSV na solução filtrada.
Em certas formas de realização, as células da cultura de células de mamífero são selecionadas de células renais embrionárias humanas (HEK), células HEK 293, células de ovário de hamster chinês (CHO), células renais de cria de hamster (BHK) e células renais do macaco verde africano (AGMK), também conhecidas por células Vero. 6
Em certas formas de realização, a etapa de centrifugação a baixa velocidade do processo de purificação é de 4.400 x g a 8.000 x g. Numa forma de realização particular, a centrifugação a baixa velocidade é de 6.238 x g.
Noutra forma de realização, o filtro de 0,2 a 0,45 pm é uma unidade de filtro Millipore Millex®-GV, uma unidade de filtro Millipore Millex®-GP, uma unidade de filtro Pall Supor®, uma unidade de filtro Sartorius Sartobran™ ou uma unidade de filtro Sartorius Sartopore™ 2. Numa forma de realização particular, o filtro é uma unidade de filtro de 0,2 pm Sartorius Sartobran.
Noutras formas de realização, o adsorvente de membrana de permuta aniónica é um adsorvente de membrana Sartorius Sartobind™ Q ou um adsorvente de membrana Pall Mustang™ Q. Numa forma de realização particular, o adsorvente de membrana de permuta aniónica é um adsorvente de membrana Pall Mustang™ Q.
Noutras determinadas formas de realização, o sal na primeira solução salina de pH tamponado da Etapa (c) é NaCl ou KC1. Noutra forma de realização, a força iónica do NaCl ou do KC1 é de 0,1 M a 0,4 M. Numa forma de realização particular, o sal é NaCl e a força iónica do NaCl é de 0,3 M.
Noutra forma de realização, o sal na segunda solução salina de pH tamponado da Etapa (c) é NaCl ou KC1. Numa forma de realização particular, o sal na segunda solução salina de pH tamponado é NaCl. Numa forma de realização particular, a força iónica do NaCl na segunda solução salina de pH tamponado é de 0,5 M a 0,75 M. Noutra forma de realização particular, a força iónica do NaCl na segunda solução salina de pH tamponado é de 0,6 M. Ainda noutras formas de realização, a força iónica do NaCl na segunda solução salina de pH tamponado é de 0,75 M. Noutras determinadas formas de realização, a segunda solução salina de pH tamponado tem um débito de eluição de 10 volumes de 7 cápsula/minuto (CV/minuto) a 30 CV/minuto. Ainda noutras formas de realização, o débito de eluição é de 20 CV/minuto.
Noutras determinadas formas de realização, a força iónica do NaCl na segunda solução salina de pH tamponado aumentou linearmente de 0,001 M a 0,75 M, com um débito de eluição de 10 CV/minuto a 30 CV/minuto. Numa forma de realização particular, o débito de gradiente de eluição linear é de 20 CV/minuto.
Ainda noutras formas de realização, o primeiro e o segundo tampões da Etapa (c) têm um pKa entre 6,0 e 8,5. Ainda noutras formas de realização, a primeira solução salina de pH tamponado da Etapa (c) tem um pH de 6,5 a 8,0. Numa forma de realização particular, a primeira solução salina de pH tamponado tem um pH de 7,5. Noutras formas de realização, a segunda solução salina de pH tamponado da Etapa (c) tem um pH de 6,5 a 8,0. Numa forma de realização particular, a segunda solução salina de pH tamponado tem um pH de 7,5.
Noutras determinadas formas de realização, o primeiro e o segundo tampões da Etapa (c) são tampão fosfato, tampão de ácido Ν-2-hidroxietilpiperazino-N'-2-etanossulfónico (HEPES) ou tris-(hidroximetil)-aminometano (TRIS). Noutra forma de realização, a primeira e a segunda soluções salinas de pH tamponado da Etapa (c) compreendem ainda sacarose com uma concentração de 1,5% a 5%. Numa forma de realização particular, a concentração de sacarose é de 2%. Noutras determinadas formas de realização, a membrana da TFF tem uma separação do peso molecular de 300 kDa. Ainda noutras formas de realização, a membrana da TFF tem uma separação do peso molecular de 750 kDa. Ainda noutras formas de realização, a membrana da TFF tem uma separação do peso molecular de pelo menos 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 850, 900, 950 ou 1.000 kDa. Numa forma de realização particular, a membrana da TFF é um módulo de 8 membrana de fibras ocas. Noutra forma de realização, a TFF compreende a concentração do VSV recuperado da Etapa (c) de pelo menos 5 x, seguida de pelo menos uma troca do tampão. Ainda noutra forma de realização, a TFF compreende a concentração do VSV recuperado da Etapa (c) de pelo menos 5 x, seguida de pelo menos cinco trocas de tampão. Numa forma de realização particular, o tampão empregue na troca de tampão é um tampão fosfato, tampão HEPES ou tampão TRIS, tendo o tampão uma concentração de 5 mM a 15 mM e um pH de 7,2 a 7,5. Noutra forma de realização, o tampão da troca de tampão compreende ainda NaCl de 0,10 M a 0,20 M e 3,5% a 4,5% de sacarose.
Noutras formas de realização, as etapas processuais de purificação de (a) a (e) são realizadas à temperatura ambiente, sendo a temperatura ambiente definida como uma temperatura ou temperaturas de ou entre cerca de 15°C e cerca de 25°C. Numa forma de realização particular, as etapas processuais de purificação de (a) a (e) são realizadas nos 20°C.
Ainda noutra forma de realização, a clarificação do fluido de cultura celular da Etapa (a) é realizada através de um módulo de filtração com uma profundidade de 1,0 ym a 4,5 ym, sendo a centrifugação a baixa velocidade omitida da Etapa (a). Em formas de realização especificas, o módulo de filtração profunda é um módulo Whatman® Polycap™ HD module, um módulo Sartorlus Sartoclear™P module ou um módulo Millipore® Millistak+® HC module.
Noutro aspeto, obtém-se os VSV com uma pureza melhorada a partir de cultura de células de mamífero. Em certas formas de realização, o VSV purificado está pelo menos 90,0% isento de proteína na cultura de células e de contaminantes de ácidos nucleicos. Noutras formas de realização, o VSV purificado está 99,0% isento de proteína na cultura celular e de contaminantes de ácidos nucleicos. Numa forma de realização particular, O VSV purificado está 99,8% isento 9 de proteína na cultura celular e de contaminantes de ácidos nucleicos.
Fornece-se o VSV com uma pureza melhorada, o qual é purificado e isolado de acordo com os novos processos de purificação descritos no presente documento.
0 VSV purificado é caracterizado por uma ou mais das características que se seguem: um serotipo do VSV selecionado ou uma combinação de serotipos; uma sequência genómica, compreendendo pelo menos uma mutação ou pelo menos duas mutações que atenuam a patogenicidade do VSV, uma sequência genómica compreendendo uma sequência de grelha de leitura aberta (ORF) de uma sequência de polinucleótidos estranha, que codifica uma ou mais proteínas de uma série de proteínas (terapêuticas ou imunogénicas) referidas em detalhe na parte da descrição detalhada da memória descritiva.
Outras características e vantagens das composições e dos processos descritos no presente documento serão aparentes a partir da seguinte descrição detalhada, das respetivas formas de realização preferidas e das reivindicações.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A FIG. 1 é um fluxograma que mostra o processo de purificação (delineado em caixas pretas), para obter o VSV com uma melhor pureza a partir de fluido de cultura de células de mamífero. A FIG. 2A é um gel eletroforético que mostra a separação das proteínas do VSV por coloração pela prata, após purificação num adsorvente de membrana Mustang™ Q, com a adição de 2% de sacarose ao tampão de eluição (fosfato de sódio 10 mM, NaCl 1,0 M) . As faixas 1-10 são: (1) pré-centrifugação (cultura de células), (2) alimentação, (3) passagem e lavagem, (4) 5% do tampão B (frações 1 - 5), (5)
60% do tampão B (frações 6 - 7), (6) 60% do tampão B (frações 8 - 10), (7) 60% do tampão B (frações 11 - 25), (8) 100% do tampão B (frações 26 - 35), (9) regeneração da 10 coluna e (10) padrões Bio-Rad® Precision Plus Protein™. O débito para o Mustang™ Q era de 3,5 mL/minuto, com um gradiente de eluição linear. A análise SDS-PAGE foi com um gel de trisglicina a 4 - 20% e a deteção proteica foi por meio de coloração pela prata. A FIG. 2B é um gel eletroforético, que mostra a separação das proteínas do VSV por Western blot, de acordo com a descrição da Fig. 2A. A deteção por Western Blot foi com anticorpos policlonais anti-VSV. A FIG. 3A é um gel eletrof orético, que mostra a separação das proteínas do VSV por meio de coloração pela prata e Western blot após purificação num adsorvente de membrana Mustang™ Q, sem a adição de sacarose ao tampão de eluição (fosfato de sódio 10 mM, NaCl 1,0 M). As faixas 1-9 são: (1) alimentação, (2) passagem e lavagem, (3) 5% do tampão B (frações 1-5), (4) 60% do tampão B (frações 6 - 11), (5) 60% do tampão B (frações 12 - 25), (6) 100% do tampão B (frações 26 - 35), (7) padrões Bio-Rad® Precision Plus Protein™, (8) padrão do VSV (ou seja, VSV purificado em gradiente de sacarose) e (9) pool de regeneração de coluna. 0 débito para o Mustang™ Q era de 3,5 mL/minuto (10 CV/minuto) com um gradiente de eluição gradual. A análise SDS-PAGE foi com um gel de trisglicina a 4 - 20% e a deteção proteica foi por meio de coloração pela prata. A FIG. 3B é um gel eletrof orético que mostra a separação das proteínas do VSV por meio de Western Blot, após purificação como descrito na Fig. 3A. A deteção por Western Blot foi com anticorpos policlonais anti-VSV. 0 tampão B (também designado por "tampão de eluição") foi fosfato de sódio 10 mM (pH de 7,0) e NaCl 1 M. A FIG. 4A é uma análise de SDS-PAGE (gel de trisglicina a 4 - 20%) do VSV por coloração pela prata + coloidal em cada etapa do processo de purificação, descrito na Fig. 1. As faixas 1-12 são (1) pré-centrifugação, (2) pós-centrifugação (l.a clarificação), (3) pré-filtração de 0,2 11 pm, (4) pós-f iltração de 0,2 pm (2.a clarificação), (5) pool de passagem e de lavagem do adsorvente de membrana
Mustang™ Q, (6) pool de frações de eluição do VSV do adsorvente de membrana Mustang™ Q, (7) material retido do VSV da UF/DF da TFF, (8) concentrado e pool de diafiltração, (9) pré-filtração de 0,2 pm (final), (10) pós-filtração de 0,2 pm (final) (concentrado bruto purificado do VSV), (11) padrões Bio-Rad® Precision Plus Protein™ e (12) controlo do VSV (análise #3, concentrado bruto purificado). A FIG. 4B é uma análise de SDS-PAGE (gel de trisglicina a 4 - 20%) do VSV por Western blot, de acordo com o processo descrito na Fig. 4A. A FIG. 5A é uma comparação da SDS-PAGE (gel de trisglicina a 4 - 20%) do VSV por coloração pela prata + coloidal, purificado de acordo com o processo apresentado na Fig. 1 versus o VSV purificado por centrifugação em gradiente de sacarose (faixa 11) . As faixas 1-12 são (1) fluido de cultura de células, (2) pós-centrifugação (l.a clarificação), (3) pré-filtração de 0,2 pm, (4) pós-filtração de 0,2 pm (2.a clarificação), (5) pool de passagem e de lavagem do adsorvente de membrana Mustang™ Q, (6) frações de eluição do VSV a partir do adsorvente de membrana Mustang™ Q, (7) material retido do VSV da UF/DF da TFF, (8) pré-filtração de 0,2 pm (final), (9) pós-filtração de 0,2 pm (final) (concentrado bruto purificado do VSV), (10) padrões Bio-Rad® Precision Plus Protein™, (11) VSV purificado em gradiente de sacarose (apenas se adicionou metade do volume da faixa 9) e (12) controlo do VSV (análise #1, concentrado bruto purificado). A FIG. 5B é uma comparação de SDS-PAGE (gel de trisglicina a 4 - 20%) do VSV por meio de Western Blot, purificado de acordo com o processo apresentado na Fig. 1 versus o VSV purificado por centrifugação em gradiente de sacarose (faixa 11), como descrito na FIG. 5A. 12 A FIG. 6 é um gráfico de barras que mostra a recuperação do título do VSV percentual das quatro análises à grande escala (4,5 L em volume de cultura de células). CR#1 é a análise experimental 1, CR#2 é a análise experimental 2, CR#3 é a análise experimental 3 e TT 01 é a análise experimental 4. A FIG. 7 é um gráfico de barras que mostra a remoção das impurezas proteicas na etapa de purificação do Mustang™ Q para a construção VSVINN4CTi-gagl. A FIG. 8A é um gráfico de barras que mostra a recuperação do VSVNJN4CTi-gagl na análise das condições da TMAE com um pH de 6,5. que mostra a recuperação condições da TMAE com um que mostra a recuperação condições da TMAE com um A FIG. 8B é um gráfico de barras do VSVNJN4CTi-gagl na análise das pH de 7,0. A FIG. 8C é um gráfico de barras do VSVNJN4CTi-gagl na análise das pH de 7,5.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Devido ao facto de o vírus da estomatite vesicular (VSV) ter muitas características que o tornam atrativo como vetor a ser utilizado em composições imunogénicas, e/ou para fornecer genes que codificam proteínas terapêuticas como acima descrito, prevalece a necessidade no estado da técnica de processos de purificação que produzam o VSV recombinante com uma pureza melhorada a partir de cultura de células de mamífero. As composições e os processos seguidamente descritos dão resposta a essa necessidade. Como abaixo apresentado nos Exemplos 3-8, são descritos processos melhorados para a purificação do VSV a partir de cultura de células de mamífero (por exemplo, ver a FIG. 1) e os VSV purificados desse modo.
I. PRODUÇÃO DO VSV NUMA CULTURA DE CÉLULAS DE MAMÍFERO A produção do VSV numa cultura de células de mamífero é bem conhecida do especialista da técnica, e inclui geralmente 13 infetar a cultura celular (célula hospedeira) com o VSV recombinante, fazer crescer o VSV na cultura celular e colher a cultura celular na altura apropriada. Visto que o VSV é segregado a partir da célula hospedeira para o meio de cultura, recolhe-se o produto do VSV do fluido de cultura celular. A produção do VSV a partir de uma cultura de células de mamífero e, assim, os novos processos para a purificação do VSV a partir dai, como descrito no presente documento, empregam culturas apropriadas de células de mamífero, utilizadas para propagar (ou fazer crescer) o VSV (um vírus de ARN de cadeia simples de sentido negativo, não segmentado), que são conhecidas do estado da técnica. Estas culturas de células incluem, sem ficarem a estas limitadas, células renais embrionárias humanas (HEK) como as células HEK 293, células renais do macaco verde africano (AGMK) como as células Vero, células de ovário de hamster chinês (CHO) e células renais de cria de hamster (BHK).
Além disso, os materiais, os métodos e as técnicas das culturas de células são bem conhecidos de um especialista da técnica. Por exemplo, um lote inicial do VSV recombinante (por exemplo, um VSV resgatado, ver a Secção II abaixo) é utilizado para infetar uma população confluente de células hospedeiras ou uma população de células hospedeiras com uma certa densidade (por exemplo, uma cultura de células Vero) num biorreator com uma certa multiplicidade de infeção, faz-se crescer o VSV numa cultura de células durante um determinado período de tempo e a uma determinada temperatura; e faz-se a colheita dos descendentes do VSV no fluido da cultura celular. Como seguidamente definido, os termos "fluido de cultura", "fluido de cultura celular", "meios de cultura celular", "meios de cultura" e/ou "fluido do biorreator" são utilizados como sinónimos e referem-se aos meios de cultura ou à solução em que se faz a cultura das células. 14
II. PURIFICAÇÃO DO VSV A PARTIR DE UMA CULTURA DE CÉLULAS DE MAMÍFERO
Os novos processos para a purificação do VSV a partir do fluido de cultura de células de um mamífero, infetadas com o VSV, descritos no presente documento, compreendem certas etapas de purificação. 0 fluxograma da FIG. 1 ilustra o esquema geral de purificação, que compreende as etapas de (a) clarificação primária, (b) clarificação secundária, (c) adsorção de membrana de permuta aniónica, (d) filtração de fluxo tangencial e (e) filtração. Mais em particular, estas etapas compreendem (a) a clarificação do fluido de cultura de células por meio de centrifugação a baixa velocidade, (b) a continuação da clarificação do sobrenadante por meio de filtração através de um filtro de 0,2 a 0,45 μιη, (c) a purificação da solução filtrada do VSV num adsorvente de membrana de permuta aniónica, (d) a troca de tampão e a concentração do VSV por meio de filtração de fluxo tangencial (TFF), e (e) uma filtração final do material retido do VSV através de um filtro de 0,2 a 0,22 μιη. Noutras determinadas formas de realização, as etapas processuais de purificação de (a) a (e) anteriores são realizadas à temperatura ambiente. Como seguidamente definido, "temperatura ambiente" é uma temperatura ou temperaturas de ou entre cerca de 15°C e 25°C. Por conseguinte, por exemplo, uma temperatura apropriada para realizar as Etapas de (a) a (e) compreende uma temperatura de pelo menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 e inclusive 25°C ou temperaturas fracionais intermédias. Numa forma de realização particular, as etapas processuais de purificação de (a) a (e) são realizadas nos 20°C. (a) Clarificação primária
Nalgumas formas de realização, o fluido de cultura celular de uma cultura de células de mamífero, infetada com o VSV, é clarificado através de centrifugação a baixa velocidade (ou, em alternativa, por meio de filtração profunda) e o 15 VSV é recuperado no sobrenadante, o que também se designa no presente documento por clarificação primária (ou l.a clarificação) do fluido da cultura celular. Nalgumas formas de realização, realiza-se a clarificação primária do fluido da cultura celular à temperatura ambiente.
Os métodos de centrifugação e o equipamento empregue na clarificação primária do fluido da cultura celular são bem conhecidos do especialista da técnica. Como seguidamente definido, a centrifugação a "baixa velocidade" é uma centrifugação a uma velocidade inferior a 10.000 rpm. Em certas formas de realização, a velocidade da centrifugação a baixa velocidade, utilizada na clarificação do fluido da cultura celular, é uma velocidade de centrifugação na gama de 4.000 x g (± 100 x g) a 8.000 x g (± 100 x g) . Noutras determinadas formas de realização, a velocidade da centrifugação a baixa velocidade, empregue na clarificação do fluido da cultura celular, é uma velocidade de centrifugação de pelo menos 4.000 x g, 4.500 x g, 5.000 x g, 5.500 x g, 6.000 x g, 6.500 x g, 7.000 x g, 7.500 x g ou 8.000 x g ou as rpm intermédias. Numa forma de realização particular, a clarificação primária do fluido da cultura celular, por meio de centrifugação a baixa velocidade, é de 6.238 x g durante trinta minutos à temperatura ambiente (Exemplo 3, Quadro 2).
Como acima referido, nalgumas formas de realização o fluido da cultura celular de uma cultura de células de mamífero, infetada com o VSV, é em alternativa clarificada (l.a) por filtração profunda (ou seja, em vez de centrifugação a baixa velocidade) . É possível utilizar a filtração profunda quando se omite a centrifugação a baixa velocidade na etapa de clarificação primária (a). A filtração profunda (em contraste com a filtração superficial) refere-se geralmente a um filtro "espesso" que captura os contaminantes na sua estrutura. Os materiais e os métodos da filtração profunda são bem conhecidos do especialista da técnica. Por exemplo, 16 o material do filtro é tipicamente composto por uma estrutura celulósica espessa e fibrosa com auxiliares de filtro inorgânicos, como as partículas de diatomito incorporadas nas aberturas das fibras. 0 material do filtro tem uma grande área de superfície interna, que é crucial na captura de partículas e na capacidade de filtro. Estes módulos de filtração profunda contêm poros com diâmetros de ou entre 1,0 pm e 4,5 μιη, inclusive tamanhos do filtro de pelo menos 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0 e 4,5 pm, e tamanhos de filtro fracionais intermédios. Os exemplos de módulos de filtração profunda compreendem, sem ficarem a estes limitados, módulos Whatman® Polycap™ HD modules (Whatman Inc.; Florham Park, NJ) , módulos Sartorius Sartoclear™ P modules (Sartorius Corp.; Edgewood, NY) e módulos Millipore® Millistak+® HC modules (Millipore; Billerica, MA) . Numa forma de realização particular, o fluido da cultura de células é clarificado por meio de filtração profunda (realizada à temperatura ambiente) e recupera-se o VSV no filtrado (Exemplo 3, Quadro 1). (b) Clarificação secundária
Após clarificação primária por meio de centrifugação (ou de filtração profunda), continua-se a clarificar (2.a) o sobrenadante (ou filtrado) do VSV por meio de filtração, ou de microfiltração, através de um filtro de 0,2 a 0,25 pm, e de recuperação do VSV na solução filtrada. Numa forma de realização particular, realiza-se a microfiltração à temperatura ambiente, como acima definido. Os meios de filtração/microfiltração encontram-se disponíveis numa grande variedade de materiais e de métodos de fabrico, que são conhecidos de um especialista da técnica. Os exemplos de unidades de filtro de microfiltração compreendem, sem ficarem a estes limitados, unidades de filtro Millipore Millex®-GV (Millipore; Billerica, MA) , unidades de filtro Millipore Millex®-GP, unidades de filtro Pall Stupor® (Pall Corp.; East Hills, NY), unidades de filtro Sartorius 17
Sartobran™ (Sartorius Corp.; Edgewood, NY) e unidades de filtro Sartorius Sartopore™ 2. Em certas formas de realização, estas unidades de filtração têm filtros com um tamanho entre 0,2 e 0,45 pm. Estes filtros compreendem filtros que têm poros de pelo menos 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4 e 0,45 pm e poros com tamanhos fracionais intermédios. Numa forma de realização particular, o filtro é uma unidade de filtro de 0,2 pm Sartorius Sartobran". Recupera-se o VSV filtrado na solução filtrada. (c) Adsorção de membrana de permuta aniónica Uma vez que o produto do VSV tenha sido recuperado por meio de clarificação (ou seja, a l.a e a 2.a acima descritas), o VSV continua a ser purificado por meio de um adsorvente de membrana de permuta aniónica. Os materiais adsorventes de membrana são bem conhecidos do especialista da técnica e encontram-se disponíveis junto de fornecedores como Sartorius Corp. (Edgewood, NY), Pall Corp. (East Hills, NY) e Sigma-Aldrich Corp. (St. Louis, MO). Os exemplos de adsorventes de membrana de permuta aniónica incluem, sem ficarem a estes limitados, um adsorvente de membrana Sartobind™ Q (Sartorius Corp.) e um adsorvente de membrana Mustang™ Q (Pall Corp.). Numa forma de realização particular, o adsorvente de membrana de permuta aniónica é um adsorvente de membrana Pall Mustang™ Q. Dum modo geral, os métodos e os tampões conhecidos da cromatografia de permuta iónica convencional podem ser diretamente aplicados à cromatografia de adsorvente de membrana, sendo conhecidos do especialista da técnica. Em certas formas de realização, realiza-se a cromatografia em adsorvente de membrana de permuta aniónica à temperatura ambiente, como acima definido.
Por conseguinte, nalgumas formas de realização, o VSV é purificado através de um adsorvente de membrana de permuta aniónica, sendo a solução filtrada do VSV, proveniente da clarificação secundária, carregada no adsorvente de 18 membrana de permuta aniónica equilibrado com uma primeira solução salina de pH tamponado (também designada por "tampão de equilíbrio" ou "tampão de ligação" do VSV) . Elui-se o VSV a partir do adsorvente de membrana de permuta aniónica com uma segunda solução salina de pH tamponado ("o tampão de eluição) e recupera-se as frações eluídas do VSV (por exemplo, ver o Exemplo 6 abaixo).
Em certas formas de realização, a primeira solução salina de pH tamponado ou o tampão de equilíbrio é uma solução salina de NaCl ou de KC1. 0 NaCl ou o KC1 está presente em solução com uma força iónica entre cerca de pelo menos 0,1 M e cerca de 0,4 M. Assim, as forças iónicas dos sais incluem pelo menos 0,1, 0,2, 0,3 e 0,4 M, inclusive forças iónicas fracionais intermédias. Numa forma de realização particular, o sal é NaCl e a força iónica da solução de NaCl é de 0,3 Μ. A solução tampão pode ser um tampão fosfato, um tampão de ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanossulfónico (HEPES) ou um tampão de tris- (hidroximetil)-aminometano (TRIS). Estes tampões têm em certas formas de realização um pH entre cerca de 6,0 e cerca de 8,0, ou seja, um pH de pelo menos 6,0, 6,2, 6,4, 6,6. 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8, e 8,0 ou os respetivos valores de pH intermédios. Numa forma de realização particular, a primeira solução salina de pH tamponado tem um pH de 7,5. Ainda noutras formas de realização, o primeiro tampão da etapa de adsorção de membrana de permuta aniónica tem um pKa entre 6,0 e 8,5, ou seja, um pKa de pelo menos 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8, 8,0, 8,2, 8,4 e 8,5 ou os valores de pKa intermédios. Em formas de realização particulares, o tampão de equilíbrio compreende ainda cerca de 1% de sacarose a cerca de 5% de sacarose. Em algumas formas de realização, o tampão de equilíbrio compreende cerca de 1% de sacarose. Numa forma de realização particular, a concentração de sacarose é de 2%. Ainda noutra forma de realização, o 19 tampão compreende cerca de 3% de sacarose. Noutra forma de realização, o tampão compreende cerca de 4% de sacarose. Noutra forma de realização, o tampão compreende cerca de 5% de sacarose. Também podem ainda ser utilizadas outras percentagens de concentração de sacarose entre os números inteiros acima especificados. A segunda solução salina de pH tamponado (o "tampão de eluição") também poderá compreender os mesmos componentes tampão que o primeiro tampão (de equilíbrio). Em certas formas de realização, a segunda solução salina de pH tamponado ou o tampão de equilíbrio é uma solução salina de NaCl ou de KC1. Numa forma de realização particular, o sal na segunda solução salina de pH tamponado é NaCl. 0 NaCl ou o KC1 está presente em solução com uma força iónica entre cerca de pelo menos 0,1 M a cerca de 0,4 M. Por conseguinte, as forças iónicas dos sais incluem pelo menos 0,1, 0,2, 0,3 e 0,4 M, inclusive forças iónicas fracionais intermédias. Numa forma de realização particular, o sal é NaCl e a força iónica da solução de NaCl é 0,3 Μ. A solução tampão poderá ser um tampão fosfato, um tampão de ácido N-2-hidroxietilpiperazino-N'-2-etanossulfónico (HEPES) ou um tampão de tris-(hidroximetil)-aminometano (TRIS). Estes tampões têm em certas formas de realização um pH entre cerca de 6,0 e cerca de 8,0, ou seja, um pH de pelo menos 6.0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8 e 8,0 ou valores de pH intermédios. Numa forma de realização particular, a segunda solução salina de pH tamponado tem um pH de 7,5. Ainda noutras formas de realização, o segundo tampão da etapa de adsorção de membrana de permuta aniónica tem um pKa entre 6,0 e 8,5, ou seja, um pKa de pelo menos 6.0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8, 8,0, 8,2, 8,4 e 8,5 ou valores de pKa intermédios.
Em formas de realização particulares, o tampão de eluição compreende ainda cerca de 1% de sacarose a cerca de 5% de sacarose. Em certas formas de realização, o tampão de 20 eluição compreende cerca de 1% de sacarose. Numa forma de realização particular, a concentração de sacarose é de 2%. Noutra forma de realização, o tampão compreende cerca de 3% de sacarose. Noutra forma de realização, o tampão compreende cerca de 4% de sacarose. Noutra forma de realização, o tampão compreende cerca de 5% de sacarose. Também se podem empregar ainda outras percentagens de concentração de sacarose entre os números inteiros acima especificados.
Com vista a eluir o VSV da membrana, a concentração de sal (NaCl ou KC1) (força iónica) do tampão de eluição é aumentada por gradiente linear ou num processo de eluição de etapa única (Exemplo 6) . As duas etapas são igualmente eficazes na eluição do VSV a partir do adsorvente de membrana de permuta aniónica. Numa forma de realização particular, a força iónica do NaCl na segunda solução salina de pH tamponado é de 0,5 M a 0,75 M. Noutra forma de realização particular, a força iónica do NaCl na segunda solução salina de pH tamponado é de 0,6 M. Ainda noutras formas de realização, a força iónica do NaCl na segunda solução salina de pH tamponado é de 0,75 M.
Noutras determinadas formas de realização, a segunda solução salina de pH tamponado tem um débito de eluição de 10 volumes de cápsula/minuto (CV/minuto) a 30 CV/minuto. Por conseguinte, em certas formas de realização o débito de eluição é de pelo menos 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 a 30 CV/minuto, ou débitos intermédios. Numa forma de realização particular, o débito de eluição é de 20 CV/minuto.
Noutras determinadas formas de realização, a força iónica do NaCl na segunda solução salina de pH tamponado aumenta linearmente de 0,001 Ma 0,75 M, com um débito de eluição de 10 CV/minuto a 30 CV/minuto, como acima descrito. Numa forma de realização particular, o débito de gradiente de eluição linear é de 20 CV/minuto. 21 (d) Filtração de fluxo tangencial (TFF) A seguir à purificação do VSV por cromatografia de adsorvente de membrana de permuta aniónica, o VSV é sujeito a uma maior purificação por meio de filtração de fluxo tangencial (TFF) . Em geral, a TFF é um processo acionado por pressão, que utiliza uma membrana(s) para separar os componentes numa solução (ou suspensão) liquida, sendo um fluido (o fluxo de alimentação) bombeado tangencialmente ao longo da superfície da membrana, e aplicando-se uma pressão que força uma "porção" do fluido através da membrana, para o lado do filtrado (da membrana). Em algumas formas de realização, realiza-se a TFF à temperatura ambiente. Neste processo, troca-se o tampão e concentra-se o VSV. Numa forma de realização, a TFF compreende uma concentração do VSV recuperado da etapa de adsorção de membrana de permuta aniónica de pelo menos 5 vezes, seguida de pelo menos uma troca de tampão. Noutra forma de realização, a TFF compreende a concentração do VSV recuperado da etapa de adsorção de membrana de permuta aniónica de pelo menos cinco a dez vezes, seguida de pelo menos cinco, ou de pelo menos seis, trocas de tampão. Outras formas de realização compreendem ainda pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco ou pelo menos seis trocas de tampão, seguidas da concentração do VSV recuperado da etapa de adsorção de membrana de permuta aniónica.
Os materiais (por exemplo, fibra oca, estrutura em espiral, placa lisa) e os métodos (por exemplo, ultrafiltração (UF), diafiltração (DF), microfiltração) da TFF são bem conhecidos do especialista da técnica. Em certas formas de realização, a membrana da TFF tem uma separação do peso molecular de 300 kDa. Em certas formas de realização, a membrana da TFF tem uma separação do peso molecular de 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650 ou 700 kDa. Ainda noutra forma de realização, a membrana da TFF tem uma separação do peso 22 molecular de 750 kDa. Numa forma de realização, a membrana da TFF é um módulo de membrana de fibras ocas.
Numa forma de realização particular, o tampão utilizado na troca de tampão da TFF é um tampão fosfato, um tampão HEPES ou um tampão TRIS como acima descrito. No entanto, o tampão em certas formas de realização tem uma concentração de 5 mM a 15 mM, inclusive concentrações de pelo menos 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM e 15 mM, e inclusive ainda concentrações mM intermédias. Em certas formas de realização, o tampão tem um pH entre cerca de 7,2 e 7,5. Assim, numa forma de realização o tampão tem um valor de pH de 7,2, 7,3, 7,4 ou 7,5 ou valores de pH fracionais intermédios. Noutra forma de realização, o tampão da troca de tampão compreende ainda NaCl de 0,10 M a 0,20 M e 3,5% a 4,5% de sacarose.
Numa forma de realização particular (ver o Exemplo 7), as frações do VSV da purificação com o adsorvente de membrana de permuta aniónica são juntadas, e a solução juntada é concentrada e o tampão é trocado por TFF, utilizando um cartucho de membrana de TFF de fibras ocas com uma separação do peso molecular de 750 kDa (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.; Piscataway, NJ). (e) Filtração A última etapa processual na purificação é uma microfiltração final do material retido do VSV da TFF, sendo o material retido filtrado através de um filtro de 0,2 a 0,25 μπι, como acima descrito para a clarificação secundária através de microfiltração, e descrita em maior detalhe abaixo no Exemplo 7. Por exemplo, este conjunto de filtração poderá empregar um filtro com um tamanho de 0,20, 0,21, 0,22, 0,23, 0,24 ou 0,25 pm, ou tamanhos fracionais intermédios. A purificação do VSV, de acordo com os novos processos descritos no presente documento, encontra-se descrita em detalha nos Exemplos abaixo, cuja descrição inclui a 23 clarificação primária (Exemplo 3) e a secundária (Exemplo 4) do fluido da cultura, compreendendo centrifugação a baixa velocidade (ou filtração profunda) e filtração de 0,2 0,45 μπι, respetivamente. A seguir às etapas de clarificação, realiza-se sequencialmente uma maior purificação do VSV através de um adsorvente de membrana de permuta aniónica (Exemplo 6); filtração de fluxo tangencial; ultrafiltração e diafiltração (Exemplo 7) e filtração de 0,2 - 0,22 pm (Exemplo 7). Também se purificou quatro análises de cultura de células do VSV à grande escala (4,5 L) (análises à grande escala) de acordo com o novo processo descrito no presente documento (Exemplo 8), tendo-se removido mais de 99,9% e 99,8% das impurezas proteicas (Quadro 11) e de ADN (Quadro 13), respetivamente, durante a purificação.
III. VÍRUS DA ESTOMATITE VESICULAR RECOMBINANTE
Como descrito no presente documento, os VSV com uma pureza melhorada são obtidos a partir de cultura de células de mamífero, ao utilizar os novos métodos de purificação acima descritos. "Pureza melhorada" significa que o VSV purificado está pelo menos 90,0% isento de proteína da cultura celular e de contaminantes de ácidos nucleicos. Noutras formas de realização, o VSV com uma pureza melhorada está 99,0% isento de proteína da cultura celular e de contaminantes de ácidos nucleicos. Numa forma de realização particular, o VSV com uma pureza melhorada está 99,8% isento de proteína da cultura celular e de contaminantes de ácidos nucleicos.
Em formas de realização particulares, o vírus da estomatite vesicular (VSV), purificado a partir do fluido da cultura de células de uma cultura de células de mamífero, através do processo acima descrito, é um VSV recombinante ou geneticamente modificado. Os métodos para a produção dos vírus de ARN recombinantes, como é o caso do VSV, são bem conhecidos e encontram-se referenciados no estado da 24 técnica como métodos de "resgate" ou "genética inversa". Os exemplos de métodos de resgate do VSV compreendem, sem ficarem a estes limitados, os métodos descritos na patente US 6,033,886 e na patente US 6,168,943. Técnicas adicionais para realizar o resgate dos virus, como o VSV, encontram-se descritas na patente US 6,673,572 e no WO 2004/113517. O VSV com uma pureza melhorada, que é purificado e isolado de acordo com os novos processos de purificação descritos no presente documento, pode ser um VSV com um serotipo especificado. Em certas formas de realização, o VSV purificado é um serotipo do Indiana, um serotipo de New Jersey, um serotipo de San Juan, um serotipo de Isfahan, um serotipo de Glasgow ou um serotipo de Chandipura. Em certas formas de realização, o VSV poderá conter sequências de mais do que um destes serotipos.
Os vetores do VSV (e as respetivas composições imunogénicas), purificados de acordo com os processos descritos no presente documento, compreendem com frequência uma ou mais mutações atenuantes no genoma do VSV. Em certas formas de realização, o VSV purificado tem uma sequência genómica compreendendo pelo menos uma mutação que atenua a patogenicidade do VSV. Noutras formas de realização, o VSV purificado tem uma sequência genómica compreendendo pelo menos duas mutações que atenuam a patogenicidade do VSV. Por exemplo, um VSV atenuado compreende duas ou mais mutações atenuantes conhecidas, como é o caso das mutações atenuantes apresentadas no Pedido de Patente Internacional N.° PCT/US2005/011499 (Publicação de Patente Internacional N.° WO 2005/098009). Por exemplo, as mutações atenuantes do VSV conhecidas compreendem, sem ficarem a estas limitadas, mutações de rearranjo de genes (inclusive rearranjos dos genes do VSV que constituem o genoma do VSV e designados por N, P, M, G e L) , mutações de inserção na proteina G, mutações de truncação da proteina G, mutações sensíveis à temperatura (ts) (e outras mutações pontuais), mutações do 25 gene M não citopáticas, mutações estaminais G, mutações do ARN antissentido e mutações de deleção de genes, estando cada uma delas apresentada em detalhe na Publicação Internacional N. 0 WO 2005/098009. Assim, em certas formas de realização, o VSV purificado compreende uma ou mais mutações atenuantes, inclusive, sem limitação, uma mutação sensível à temperatura (ts), uma mutação pontual, uma mutação de rearranjo de genes, uma mutação estaminal G, uma mutação do gene M não citopática, uma mutação do ARN ambissentido, uma mutação do gene G truncada, uma mutação de inserção do gene G e uma mutação de deleção de genes.
Em certas formas de realização um VSV, purificado pelo processo de purificação descrito no presente documento, tem uma sequência genómica compreendendo uma ou mais sequências estranhas ou polinucleotidicas heterólogas (ou estranhas), como uma grelha de leitura aberta (ORF) de ARN estranho. As sequências polinucleotidicas heterólogas podem variar em função do pretendido e incluem, sem ficarem a estas limitadas, um gene que codifica uma citocina (como uma interleucina), um gene que codifica um epítopo das células auxiliares T, um gene que codifica um epítopo das CTL, um gene que codifica um adjuvante e um gene que codifica um cofator, um gene que codifica um marcador de restrição, um gene que codifica uma proteína terapêutica ou uma proteína de um agente patogénico microbiano diferente (por exemplo, vírus, bactéria, parasita ou fungo), em particular proteínas capazes de provocar respostas imunitárias desejáveis. Por exemplo, as sequências polinucleotidicas heterólogas, que codificam uma proteína de um agente patogénico microbiano diferente, podem ser uma ou mais de um gene do HIV, um gene do HTLV, um gene do SIV, um gene do RSV, um gene do PIV, um gene do HSV, um gene do CMV, um gene do vírus de Epstein-Barr, um gene do vírus Varicella-Zoster, um gene do vírus da papeira, um gene do vírus do sarampo, um gene do vírus da gripe, um gene do vírus da 26 poliomielite, um gene de rinovírus, um gene do virus da hepatite A, um gene do virus da hepatite B, um gene do virus da hepatite C, um gene do virus Norwalk, um gene do togavirus, um gene do alfavírus, um gene do virus da rubéola, um gene do virus da raiva, um gene do virus de
Marburg, um gene do vírus do Ébola, um gene do vírus do papiloma, um gene do polioma vírus, um gene do metapneumovírus, um gene do coronavírus, um gene do vibrião da cólera, um gene da Streptococcus pneumoniae, um gene da Streptococcus pyogenes, um gene da Helicobacter pylori, um gene da Streptococcus agalactiae, um gene da Neisseria meningitidis, um gene da Neisseria gonon-heae, um gene da Corynebacteria diphtheriae, um gene da Clostridium tetani, um gene da Bordetella perlussís, um gene do Haemophilus, um gene da clamídia, um gene da Escherichia coli. Em certas formas de realização, o VSV purificado compreende uma sequência de um gene do HIV, sendo a sequência do HIV selecionada do grupo composto por gag, env, pol, víf, nef, tat, vpr, rev ou vpu. Numa forma de realização específica, o gene do HIV é o gag ou o env.
Noutras determinadas formas de realização, o VSV purificado contém tanto pelo menos uma mutação atenuante como pelo menos um ORF heterólogo, como acima descrito. Por exemplo, a composição imunogénica do VSV (ou seja, VSViNN4CT9-gagl) , purificada de acordo com os novos processos e exemplificada na secção V abaixo (Exemplos 2-8), é um VSV recombinante compreendendo duas mutações atenuantes e um ORF que codifica a proteína gag do HIV-1.
Noutras formas de realização o VSV, purificado de acordo com os novos processos descritos no presente documento, codifica o gene gag do HIV, sendo o gene gag inserido no genoma do VSV na posição um (3' -gagi~NPMGL5') , na posição dois (3 ' -N-gag2-PMGL5') , na posição três (3'-NP-gag3-MGL5'), na posição quatro (3'-NPM-gag4-GL5') , na posição cinco (3'-NPMGgags-L5') ou na posição seis (3'-NPMGL- 27 gage5') . Noutras formas de realização, o VSV, purificado de acordo com os novos processos descritos no presente documento, codifica o gene env do HIV, sendo o gene env inserido no genoma do VSV na posição um (3 '-envi~NPMGL5') , na posição dois (3 ' -N-env2~PMGL5') , na posição três (3'-NP-env3-MGL5'), na posição quatro (3’-NPM-env4-GL5'), na posição cinco (3'-NPMG-envs-L5') ou na posição seis (3'-NPMGL-env6-5') .
Um especialista da técnica entenderá, a partir da descrição anterior, que uma série de VSV recombinantes poderá ser concebida e purificada de acordo com os métodos e os processos acima descritos.
IV. COMPOSIÇÕES IMUNOGÉNICAS E FARMACÊUTICAS
As composições imunogénicas compreendem uma dose imunogénica de um VSV geneticamente modificado, purificado de acordo com os processos de purificação descritos no presente documento. Por exemplo, uma composição imunogénica compreende um VSV recombinante, purificado de acordo com os processos de purificação descritos no presente documento, em que o VSV contém uma ou mais sequências de ARN estranhas, inseridas numa região ou substituindo uma região do genoma do VSV não essencial à replicação. Qualquer uma das formas de realização do VSV recombinante, descritas na secção III anterior, pode ser empregue nestas composições imunogénicas. Por conseguinte, formula-se uma composição imunogénica do VSV purificada para a administração a um sujeito mamifero (por exemplo, a um humano).
Estas composições contêm tipicamente o vetor do VSV purificado e um suporte aceitável em farmácia. Como seguidamente empregue, a linguagem "suporte aceitável em farmácia" incluirá todo e qualquer solvente, meio de dispersão, revestimento, agente antibacteriano e antifúngico, agente isotónico e retardador de absorção e outros do género, compatíveis com a administração farmacêutica. A utilização destes meios e agentes para 28 substâncias de atividade farmacêutica é bem conhecida do estado da técnica. À exceção dos casos em que os meios ou agentes convencionais sejam incompatíveis com o vetor do VSV, utilizar-se-á estes meios nas composições imunogénicas descritas no presente documento. Também se poderá incorporar compostos ativos suplementares nas composições. Por conseguinte, uma composição imunogénica do VSV, descrita no presente documento, é formulada para ser compatível com a via de administração que lhe está destinada. Os exemplos de vias de administração compreendem as parenteral (por exemplo, intravenosa, intradérmica, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal) e mucosal (por exemplo, oral, retal, intranasal, bucal, vaginal, respiratória). As soluções ou as suspensões utilizadas na aplicação parenteral, intradérmica ou subcutânea incluem os seguintes componentes: um diluente estéril como água para injeção, soro fisiológico, óleos fixos, polietilenoglicóis, glicerina, propilenoglicol ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos como o álcool benzílico ou os metilparabenos; antioxidantes como o ácido ascórbico ou o bissulfito de sódio; agentes quelantes como o ácido etilenodiaminotetracético; tampões como acetatos, citratos ou fosfatos, e agentes para ajustar a tonicidade, como o cloreto e sódio ou a dextrose. Ajusta-se o pH com ácidos ou bases, tais como o ácido hidroclórico ou o hidróxido de sódio. A preparação parenteral pode ser fechada em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de múltiplas doses de vidro ou de plástico.
As composições apropriadas para fins de injeção incluem soluções aquosas estéreis (se hidrossolúveis), ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções injetáveis estéreis ou dispersão. Com vista à administração intravenosa, os suportes apropriados incluem soro fisiológico, água bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ) ou soro fisiológico com tampão 29 fosfato (PBS) . Em qualquer dos casos, é necessário que a composição seja estéril e a mesma deverá ser fluida ao ponto de tornar fácil a injeção. Deverá ser estável sob as condições de fabrico e de armazenamento e deverá ser conservada contra a ação contaminante de microrganismos, como bactérias e fungos. 0 suporte é um solvente ou um meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol liquido, e outros do género), e as respetivas misturas apropriadas. A fluidez adequada é mantida através, por exemplo, da utilização de uma cobertura, como a lecitina, da manutenção da granulometria requerida das partículas no caso de dispersão, e através da utilização de agentes tensioativos. Consegue-se prevenir a ação dos microrganismos através de diversos agentes antibacterianos e antifúngicos, como, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, e outros semelhantes. Em muitos casos, é preferível incluir agentes isotónicos, como, por exemplo, açúcares, poliálcoois como manitol, sorbitol, cloreto de sódio, na composição. A absorção prolongada das composições injetáveis é conseguida com a inclusão na composição de um agente que retarda a absorção, como, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.
Prepara-se as soluções injetáveis estéreis através da incorporação do vetor do VSV na quantidade (ou dose) requerida num solvente apropriado, com um ingrediente ou com uma combinação dos ingredientes acima enumerados, em função do necessário, seguida da esterilização por filtração. Em geral, prepara-se as dispersões pela incorporação do composto ativo num veículo estéril, que contém um meio de dispersão básico, e dos demais ingredientes necessários dentre os acima enumerados. No caso dos pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são secagem no vácuo e liofilização, dando origem a um pó 30 do ingrediente ativo mais qualquer outro ingrediente adicional pretendido, proveniente de uma respetiva solução previamente filtrada de forma estéril.
Com vista à administração por inalação, os compostos são fornecidos na forma de um aerossol a partir de um recipiente ou dispensador sob pressão, contendo um agente de expansão apropriado (por exemplo, um gás como o dióxido de carbono, ou um nebulizador). A administração sistémica também pode ser levada a cabo por via mucosal ou transdérmica. Na administração mucosal ou transdérmica, utiliza-se os penetrantes adequados à barreira a ser permeada na formulação. Estes penetrantes são geralmente conhecidos do estado da técnica e incluem, por exemplo, com vista à administração mucosal, detergentes, sais biliares e derivados do ácido fusidico. Consegue-se a administração mucosal através da utilização de pulverizadores nasais ou de supositórios. Também se prepara os compostos na forma de supositórios (por exemplo, com bases de supositório convencionais, tais como manteiga de cacau e outros glicéridos) ou enemas de retenção para o fornecimento por via retal.
Constitui uma vantagem formular as composições orais ou parenterais na forma de unidades de dosagem, para facilitar a administração e a uniformidade da dosagem. A forma das unidades de dosagem, como seguidamente empregue, refere-se a unidades fisicamente discretas, adequadas a dosagens unitárias para o sujeito a ser tratato; indo cada unidade conter uma quantidade predeterminada do composto ativo, calculada para produzir o efeito terapêutico pretendido em ligação com o suporte farmacêutico requerido. A especificação para as formas das unidades de dosagem descritas no presente documento é ditada e depende diretamente das caracteristicas únicas do composto ativo e do efeito terapêutico particular a ser alcançado, e das 31
limitações inerentes na técnica de estruturação de um composto ativo deste tipo para o tratamento de indivíduos. V. EXEMPLOS
Os Exemplos que se seguem foram realizados recorrendo a técnicas padrão, as quais são bem conhecidas e são rotina dos especialistas da técnica, se nada for expresso em contrário de forma pormenorizada. Os exemplos que se seguem são apresentados para fins ilustrativos e não deverão ser considerados de forma alguma limitativos do âmbito das composições e dos processos descritos no presente documento. Os Exemplos 1 e 2 são relativos às três construções do VSV exemplificados. Os Exemplos 3-9 referem-se especificamente à construção VSVIN NÍCTg-gagl. Os exemplos 10 - 11 referem-se especificamente à construção VSVN4CTi~gagl. O Exemplo 12 refere-se especificamente à construção VSVNJ N4CTi-gagl.
Um VSV recombinante (serotipo do Indiana; rVSVIN) , purificado nos exemplos que se seguem, contém o gene gag do HIV na primeira posição do genoma do VSV (gagl), e o gene N rearranjado na quarta posição do genoma do VSV (N4) . Numa construção, o VSV tem um gene G tendo uma cauda citoplasmática truncada ("CTg"), tendo esta construção sido designada por "VSVIN NÍCIg-gagl". Noutra construção, o VSV tem um gene G tendo uma cauda citoplasmática truncada ("CTi"), tendo esta construção sido designada por IIVSVIN N4CTi-gagl". Noutros exemplos, um VSV recombinante (serotipo de New Jersey; rVSVNJ) , purificado nos exemplos que se seguem, contém o gene gag do HIV na primeira posição do genoma do VSV (gagl), o gene N rearranjado na quarta posição do genoma do VSV (N4) , e o gene G tendo uma cauda citoplasmática truncada ("CTi"), tendo esta construção sido designada por "VSVNJ N4CTl-gagl". Estas construções e mutações encontram-se definidas em detalhe na Publicação de Patente Internacional N.° WO 2005/098009. 32
No entanto, os novos processos de purificação, descritos no presente documento, não se encontram de forma alguma limitados a um serotipo ou uma construção rVSV especifica (por exemplo, Indiana, New Jersey, etc.)/· e, como tal, estes processos de purificação incluem a purificação das construções do VSV contendo sequências genómicas de tipo selvagem, sequências genómicas atenuadas, sequências de ácidos nucleicos "exógenas", ou qualquer combinação destes (por exemplo, ver a Secção III anterior para um panorama geral destas construções do VSV) . Além disso, os métodos para a produção dos virus de ARN "recombinantes" são bem conhecidos e encontram-se referenciados no estado da técnica como métodos "de resgate" ou "genética inversa". Os exemplos de métodos de resgate para o VSV recombinante encontram-se acima descritos na secção III.
Os exemplos que se seguem descrevem a purificação do rVSV (como exemplificado com a construção VSViN N4CT9-gagl, o VSVIN N4CTi-gagl ou o VSVNJN4CTi-gagl) de células Vero. No entanto, os processos de purificação do VSV, apresentados no presente documento, são igualmente aplicáveis à purificação do VSV de qualquer cultura de células de mamífero apropriada, inclusive, mas sem ficaram a estas limitadas, células renais embrionárias humanas (HEK) (por exemplo, células HEK 293), células de ovário de hamster chinês (CHO) e células renais de cria de hamster (BHK). EXEMPLO 1: PROTEÍNA, ADN E ENSAIOS DE POTÊNCIA DO VSV
Recorreu-se aos ensaios que se seguem para avaliar os processos de purificação seguidamente descritos nos Exemplos 2 - 12.
Concentração Proteica Total. Determinou-se a concentração proteica total utilizando o ensaio com o ácido bicinconínico (BCA) (Bio-Rad Laboratories Inc.; Hercules, CA), com albumina sérica bovina (BSA) como padrão proteico. SDS-PAGE e análise de Western Blot. Com vista à separação e à deteção proteicas, misturou-se amostras do VSV com um 33 tampão de amostra de triglicina numa relação de 1 : 1 (para a construção VSVIN N4CTg-gagl) ou de 3 : 1 (para a construção VSVIN N4CTi-gagl), deixou-se em ebulição durante dez minutos nos 100°C, e a sua resolução foi por eletroforese em gel a 4 - 20% de trisglicina-sulfato de dodecil-sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE), seguida de dupla coloração com coloração pela prata (Wako Chemicals USA, Inc.; Richmond, VA) e coloração coloidal Coomassie® Blue (Invitrogen Corp.; Carlsbad, CA). A sensibilidade da dupla coloração tornou possível detetar facilmente impurezas de elevado peso molecular nas amostras do VSV.
Após eletroforese em gel, transferiu-se as proteínas eletroforeticamente para uma membrana de nitrocelulose (Amersham Biosciences Corp.; Piscataway, NJ) . Depois de bloqueio durante uma hora em soro fisiológico tritamponado (TBS), contendo BSA a 3%, incubou-se a membrana numa solução de anticorpos (BSA a 1% em TBS com 0,05% de Tween-20 (TTBS), contendo anticorpos policlonais anti-VSV de coelho, produzidos a partir de células BHK, 1 : 1.000 v/v), e sondou-se com um anticorpo de cabra anticoelho conjugado com peroxidase de rábano (HRP, 1 : 1.000 (v/v)) (Bio-Rad Laboratories Inc.; Hercules, CA). Após lavagem com TTBS e TBS, adicionou-se reagente de desenvolvimento colorante HRP (Bio-Rad Laboratories Inc.; Hercules, CA) para fins de deteção, e extinguiu-se a reação com água destilada. O gel corado e a membrana desenvolvida foram capturados com um sistema de imagiologia Alphalmager® (Alpha Innotech Corp.; San Leandro, CA) com o software AlphaEaseFC®.
Cromatografia líquida de alta resolução de exclusão molecular (SE-HPLC). Desenvolveu-se um protocolo de HPLC de exclusão molecular para a separação rápida do VSV das impurezas proteicas, permitindo assim uma análise qualitativa do processo de purificação do VSV. Por conseguinte, as amostras do VSV "em processamento" (100 pL) e o concentrado bruto purificado do VSV (100 pL) foram 34 carregados numa coluna de exclusão molecular analítica (coluna TSK-gel PW column G6000PWXL, granulometria 17 μ, tamanho dos poros 1000 À) (Tosho Biosciences LLC.; Montgomeryville, PA), equilibrada com tampão PBS (sem Ca2+ ou Mg2+) e desenvolvida com um débito de um mL por minuto. O sistema foi acionado com um sistema de fornecimento do solvente Agilent 1100™, controlado com o software ChemStation™ (Agilent Technologies Inc.; Paio Alto, CA). Recolheu-se os espetros de UV com o detetor de ensaio com fotodíodo e obteve-se cromatogramas através da monitorização da absorvância de UV nos 215 nm.
Ensaios de potência do VSV. Quantificou-se a potência do VSV recorrendo a dois métodos diferentes, um ensaio de placas convencional e um ensaio de placas com imunofluorescência. No caso do ensaio com placas convencional, fez-se a cultura de células Vero em DMEM + FBS a 10% em placas de seis poços com uma concentração de 1 x 106 células/poço (com dois mL de cultura celular/poço) e procedeu-se à sua incubação durante a noite nos 37°C. Inspecionou-se as células no dia seguinte, para garantir a formação de monocamadas confluentes. Fez-se a diluição em série de amostras de vírus com um título desconhecido, juntamente com controlos positivos e negativos, numa relação de 1 : 10 até aos valores do título esperados em DMEM + 10 mL/L de piruvato de sódio + 0,5 mL/L de gentamicina. O controlo positivo era um padrão do VSV de título conhecido. O controlo negativo (ou branco) continha apenas meios de cultura. Aspirou-se os meios de cultura de células de placas de seis poços, adicionou-se depois os vírus diluídos (0,5 mL de solução de vírus/poço) aos poços, em duplicado. 0 vírus foi adsorvido à temperatura ambiente durante quinze minutos, e procedeu-se em seguida à sua incubação nos 32°C durante trinta minutos. As placas foram agitadas manualmente de cinco em cinco ou de dez em dez minutos, de modo a manter húmidas as monocamadas de 35 células. Combinou-se agarose (nos 50°C) e DMEM (nos 37°C, 10 mL/L de piruvato de sódio e 0,5 mL/L de gentamicina) numa relação de 1 : 4, de modo a criar meios de cultura de camada de cobertura de ágar-ágar. Aspirou-se o virus das placas e adicionou-se 3 mL de camada de cobertura por poço, com uma pipeta de repetição. As placas cobertas foram arrefecidas sob uma cobertura à temperatura ambiente, depois transferiu-se para incubação nos 32°C durante setenta e duas horas, ou até as placas de células ficarem claramente visíveis (aproximadamente um mm de diâmetro ou mais) . Fez-se a contagem das placas de células, segurando as placas contra uma fonte luminosa. Determinou-se os títulos para cada amostra, utilizando as contagens das placas de células resultantes e a sua expressão assumiu a forma de unidades de formação de placas de células - plaque forming units (PFU) - por mL.
Realizou-se o segundo ensaio (ensaio de placas com imunofluorescência) através da infeção de monocamadas de células Vero (em placas de 48 poços) com o VSV. Passadas vinte e quatro a trinta e seis horas, fixou-se as células Vero e estas foram primeiro sondadas com um anticorpo monoclonal contra o VSVIN ou o VSVNJ, em função da construção utilizada, e depois foram sondadas com um anticorpo secundário, conjugado com um corante fluorescente. Quantificou-se as partículas infeciosas, recorrendo a microscopia de fluorescência para detetar focos de fluorescência na monocamada das células Vero. Contou-se os focos fluorescentes e o titulo da amostra foi expresso na forma de unidades infeciosas (IU) ou de unidades de formação de placas de células (PFU) por mL. Ensaio de ADN residual. Testou-se o ADN da célula hospedeira e quantificou-se o mesmo utilizando o kit de microensaio de ADN PicoGreen® Quant-iT™ (Invitrogen Corp.; Carlsbad, CA) . Realizou-se o microensaio de acordo com as 36 instruções do fabricante, utilizando ADN lambda como padrão.
EXEMPLO 2: PRODUÇÃO DO VSV NA CULTURA DE CÉLULAS VERO
Produziu-se as análises experimentais do VSV num biorreator de 10 litros, utilizando culturas de microssuportes de células Vero (células renais de macaco africano) . Obteve-se as células Vero utilizadas de um cGMP Master Cell Bank. Fez-se a cultura das células Vero em microssuportes de Cytodex™ I (Amersham Biosciences Corp.; Piscataway, NJ) , com uma densidade de 7,5 grama de esférulas secas/litro. O volume de trabalho da cultura do biorreator era de 5,5 a 6,5 litros. Na inoculação, combinou-se as células Vero com os microssuportes de Cytodex™ I até a um volume total de aproximadamente 2 litros. A densidade da cultura alvo era de 5 x 105 células/mL. Realizou-se um ciclo de agitação intermitente de duas horas com este volume reduzido, de modo a promover a ligação das células aos microssuportes. Agitou-se a cultura durante 5 minutos nas 40 rpm, e deixou-se em seguida assentar durante 20 minutos nas zero rpm, durante quatro ciclos completos.
Fez-se a amostragem da cultura a seguir à agitação intermitente e, caso a ligação fosse satisfatória, adicionou-se Virus Production Serum-Free Medíum (VP-SFM) à cultura, até a um volume de trabalho de 5,5 ou de 6,5 litros. Deixou-se a multiplicação das células chegar às 2 -4 x 106 células/mL nos 37°C e nas 40 rpm. Forneceu-se constantemente ar à camada de cobertura de 50 cm3/ minuto. Forneceu-se dióxido de carbono e oxigénio à camada de cobertura quando necessário, com 50 cm3/minuto. Quando a necessidade de oxigénio da cultura excedia o fornecido pela camada de cobertura, adicionava-se oxigénio à cultura através de um aspersor sinterizado com um débito inicial de 6 cm3/minuto. Aumentou-se manualmente o débito, à medida que aumentava a necessidade de oxigénio. Utilizou-se dióxido de carbono (ácido) e 7,5% em peso/volume de solução 37 de bicarbonato de sódio (alcalina) para controlar o pH, utilizando um valor de pH definido para a cultura de 7,30. A cultura foi sujeita a perfusão com meio de cultura fresco com metade do volume da cultura por dia, com inicio aproximadamente passadas 48 horas do tempo de cultura. A infeção das células Vero com o rVSV ocorreu nos 32 °C e a multiplicidade da infeção (MOI) foi de 0,01. Com vista a promover a adsorção virai nas células, realizou-se um ciclo de agitação intermitente de uma hora, logo após a adição do virus à cultura do biorreator. Agitou-se a cultura durante seis minutos nas 40 rpm, deixou-se depois assentar durante vinte e quatro minutos nas zero rpm, durante dois ciclos completos. Depois de uma hora de agitação intermitente, o restante da infeção continuou no modo descontinuo nas 40 rpm. Fez-se a amostragem da cultura infetada de 6 - 16 horas em 6 - 16 horas, de modo a observar o efeito citopático (CPE), a contar as células e a recolher as amostras de sobrenadante virai, com vista a determinar a cinética de crescimento.
Fez-se a colheita da cultura de células aproximadamente 44 horas após a infeção para o VSVINN4CTç)-gagl, aproximadamente 48 horas após a infeção para o VSVINN4CTi-gagl, e aproximadamente 6 0 horas após a infeção para o VSVnjN4CT!-gagl, deixando os microssuportes assentar e colhendo o sobrenadante do fluido de cultura. Combinou-se o fluido de cultura celular dos dois biorreatores para a última construção.
EXEMPLO 3: PROCESSO DE PURIFICAÇÃO DO VSV: CLARIFICAÇÃO PRIMÁRIA DO FLUIDO DA CULTURA CELULAR DO VSV PARA O VSViNN4CT9-gagl
Após a colheita da cultura de células do biorreator, removeu-se as células/os detritos celulares e outras partículas de impurezas no processo conhecido por "recuperação do produto". Devido ao facto de o VSV ser segregado a partir das células Vero para o fluido de 38 cultura, recuperou-se o VSV no fluido de cultura clarificado. Por conseguinte, clarificou-se o sobrenadante do fluido da cultura de células do VSV (por exemplo, cerca de 4,0 - 4,5 L de uma análise do biorreator de 10 L), por meio de filtração profunda ou de centrifugação a baixa velocidade.
Realizou-se a clarificação por filtração profunda à temperatura ambiente e recuperou-se o VSV no filtrado. Testou-se os seguintes módulos de filtração profunda: um módulo Whatman® Polycap™ HD module (Whatman Inc.; Florham Park, NJ) , um módulo Sartorius Sartoclear™ P module (Sartorius Corp.; Edgewood, NY), um módulo Millipore® Millistak+® HC module (Millipore; Billerica, MA) e um CUNO 05/60HP (CUNO Inc, a 3M® company, Meriden, CT). Carregou-se os filtros profundos com filtrado até o filtro ter ficado saturado (aproximadamente 100 - 500 mL de filtrado). Determinou-se a eficiência de clarificação dos módulos de filtração profunda por meio de um medidor da turvação, enquanto se avaliava a recuperação virai por meio de ensaio de placas virais. 0 Quadro 1 abaixo resume o desempenho de diferentes filtros profundos. É possível conseguir uma grande recuperação virai utilizando o Whatman Polycap HD 75. No entanto, na produção à grande escala, observou-se a eficiência de remoção com baixa turvação e a fraca capacidade de filtro. É possível selecionar outros filtros de diferentes fornecedores, com vista à utilização no processo de clarificação, com base numa avaliação da respetiva recuperação do produto virai.
QUADRO 1. DESEMPENHO DE CLARIFICAÇÃO DA CULTURA DE CÉLULAS POR PARTE DE DIFERENTES FILTROS PROFUNDOS
Filtros Turvação do filtrado Remoção da turvação Capacidade de filtro2 Recuperação do titulo Millipore Co HC 1,24 96,3% > 6,5 4, 4% 39
Sartorius Sarloclear™ P (1,5 pm) 4,0 94, 0% O co Λ 19,3% Sartorius Sarloclear™ P (4,0 pm) 7,0 89,6% >8,7 8,4% Whatman PolyCap™ HD75 13,8 79, 4% 1,25 82,0% CUNO™ 05/60HP 6, 4 96,9% 9,0 33,9% CUNO™ 05/60HP 6,7 85, 4% > 32 41,1% Turvação do filtrado1 = NTU (Nephelometric Turbidity Unit) Capacidade do filtro = (cultura L/ft2)
Realizou-se a clarificação por meio de centrifugação a baixa velocidade com 6.238 x g (5.000 rpm), durante trinta minutos à temperatura ambiente, numa centrifugadora Beckman (5 x 1 L garrafas de centrifugação num volume total de 4,5 L) , tendo o VSV sido recuperado no sobrenadante. Como abaixo mostrado no Quadro 2, conseguiu-se uma maior eficiência de remoção da turvação, e uma recuperação equivalente do produto, por meio de centrifugação a baixa velocidade, do que com a filtração profunda com o módulo Whatman PolyCap™ HD75 module. QUADRO 2. COMPARAÇÃO DA CLARIFICAÇÃO PRIMÁRIA DO FLUIDO DA CULTURA DE CÉLULAS POR MEIO DE CENTRIFUGAÇÃO A BAIXA VELOCIDADE E DE FILTRAÇÃO PROFUNDA_ Método de clarificação Turvação1 Remoção da turvação Recuperação do titulo Centrifugação Análise experimental 1 8,45% 74, 4% 67, 8% Whatman PolyCap™ HD75 Análise experimental 1 18,13 45,5% 6 6,6% 40
Centrifugação Análise experimental 2 9,03 86,5% 55, 7% Whatman PolyCap™HD75 Análise experimental 2 13,8 79,4% 82, 0% Centrifugação Análise experimental 3 10,13 77, 6% 68,3% Centrifugação Análise experimental 4 10,80 85, 5% 77, 0% Turvação1 = Filtrado ou turvação do sobrenadante NTU
EXEMPLO 4: PROCESSO DE PURIFICAÇÃO DO VSV: CLARIFICAÇAO SECUNDÁRIA DO FLUIDO DE CULTURA DE CÉLULAS DO VSV
Após a clarificação primária acima descrita no Exemplo 3, continuou-se a processar o sobrenadante (ou o filtrado) (clarificação secundária) para reduzir o nivel de turvação. Avaliou-se vários filtros de microfiltração estéreis (0,2 a 0,25 pm) (Quadro 3), que incluíam uma unidade de filtro Millipore Millex®-GV (Millipore; Billerica, MA) , uma unidade de filtro Millipore Millex®-GP, uma unidade de filtro Pall Supor® (Pall Corp.; East Hills, NY), uma unidade de filtro Sartorius Sartobran™ (Sartorius Corp.; Edgewood, NY) e uma unidade de filtro Sartorius Sartopore™ 2. 0 filtro ótimo deverá ter uma capacidade de ligação do VSV limitada ou não ter essa capacidade, mas remover ao mesmo tempo a quantidade máxima de partículas contaminantes.
Utilizou-se o VSV da produção pré-cultura como a alimentação (matéria-prima) para os filtros de microfiltração selecionados, que foi dopado com 1 x sacarose fosfato glutamato (SPG). A mesma alimentação foi filtrada de acordo com o protocolo fornecido pelos fornecedores. Uma vez que a quantidade do material de cultura de células clarificada era limitada, utilizou-se uma seringa ou um filtro de disco em vez de um filtro à grande escala. Como mostrado no Quadro 3, a maior 41 recuperação do título do VSV foi obtida com os filtros estéreis Pall Supor® e Sartorius Sartobran™.
QUADRO 3. CLARIFICAÇÃO SECUNDÁRIA - SEPARAÇÃO COM FILTRO
Unidade de filtro Recuperação* Millipore Millex®-GV 66,13% Millipore Millex®-GP 87,08% Pall Acrodic™ Supor™ 96,08% Sartorius Sartobran™ 94,61% Sartorius Sartopore™ 2 82,84% Recuperação*: adicionou-se 1 x solução de SPG à solução de alimentação. SPG é sacarose fosfato glutamato
Continuou-se a avaliar a clarificação secundária do VSV, utilizando a unidade de filtro Sartorius Sartobran™, cujos resultados se encontram reunidos abaixo no Quadro 4. 42 QUADRO 4. CLARIFICAÇÃO SECUNDÁRIA UTILIZANDO O FILTRO SARTORIUS SARTOBRAN™
Filtração com o Sartobran™ Turvação do sobrenadante1 Remoção da turvação Recuperação do titulo Experiência 1 0,62 50,8% 65, 8% Experiência 2 (w/1 x SPG) 4, 45 ND 85, 9% Experiência 3 (w/1 x SPG) 6,27 54, 6% 110,0% Turvação do sobrenadante1 = NTU 0,62: a baixa turvação do filtrado deve-se à baixa turvação da alimentação ND = Não Disponível: SPG é sacarose fosfato glutamato
Os dados no Quadro 4 mostram que a turvação da solução da Experiência 2 e da Experiência 3 sofreu uma redução ainda maior com um nível aceitável de recuperação. Também se estabeleceu nestas experiências, que a adição de 1 x SPG à solução de alimentação (ou seja, Experiência 2: 85,9% de recuperação do título e Experiência 3: 110% de recuperação do título) melhora significativamente o rendimento da recuperação do produto do VSV, em relação à Experiência 1, que não tinha adição de SPG (65,8% de recuperação do título).
EXEMPLO 5: PROCESSO DE PURIFICAÇÃO DO VSV: CROMATOGRAFIA DE COLUNA A seguir à etapa da clarificação secundária, descrita no Exemplo 4, testou-se/analisou-se a purificação do filtrado do VSV utilizando várias resinas cromatográficas. Uma vez que a partícula do VSV é de grandes dimensões em comparação com as proteínas contaminantes, avaliou-se apenas as resinas com um grande tamanho dos poros, incluindo a resina de permuta aniónica UNOsphere™ Q (Bio-Rad Laboratories Inc.), uma resina de permuta catiónica UNOsphere™ S (Bio- 43
Rad Laboratories Inc.), uma resina de hidroxiapatita cerâmica CHT tipo I (Bio-Rad Laboratories Inc.)/· resina de fluoroapatita cerâmica CFT tipo I (Bio-Rad Laboratories Inc.) e uma resina de modo misto CST I (GE Healthcare) . Para fins de comparação, também se avaliou duas resinas de afinidade, uma resina do sulfato Matrex™ Cellufine® Sulfate (Millipore) e uma resina de heparina-sepharose (GE Healthcare). Realizou-se as experiências no modo descontínuo à temperatura ambiente. Recolheu-se as amostras de diferentes condições de lavagem e de eluição e testou-se as mesmas por SDS-PAGE e por ensaio em placa.
Observou-se em experiências iniciais com as resinas de permuta aniónica UNOsphere™ Q e de permuta catiónica UNOsphere™ S, que o VSV apenas se liga à resina de permuta aniónica UNOsphere™ Q com um pH neutro, o que indica que o VSV tem carga negativa quando o pH é neutro.
Avaliação da purificação do VSV numa resina de permuta aniónica Bio-Rad® UNOsphere™ Q. Carregou-se VSV clarificado numa coluna preenchida com a resina UNOsphere™ Q. Não se conseguia distinguir uma separação entre o produto do VSV e as impurezas proteicas na coluna, e uma grande parte do vírus ainda estava ligada à coluna, mesmo após a eluição com NaCl 2 M em tampão de fosfato de sódio 10 mM (dados não mostrados).
Avaliação da purificação do VSV numa resina de hidroxiapatita cerâmica Bio-Rad® tipo I (CHT I). O VSV foi adsorvido de forma eficiente na coluna de hidroxiapatita. Observou-se alguma separação do VSV das proteínas contaminantes através de SDS-PAGE (dados não mostrados), mas uma parte significativa do VSV continuou ligada à coluna mesmo após a eluição com fosfato de sódio 0,8 M, pH de 6,88, tendo o VSV ligado sido por fim removido por eluição da coluna durante uma etapa de limpeza com NaOH 1 M. 44
Noutra experiência, utilizou-se tampão de fosfato de potássio 0,9 M como tampão de eluição. Conseguiu-se pouca separação entre o VSV e as impurezas proteicas (dados não mostrados). Uma grande parte do VSV ficou ligada à coluna e requereu NaOH 1,0 M para a sua remoção por eluição da coluna. Observou-se resultados semelhantes (ou seja, fraca separação de VSV/proteínas contaminantes e uma forte ligação do VSV à resina) com a resina de fluoroapatita cerâmica (CFT) tipo I e a resina CST I.
Avaliação da purificação do VSV numa resina de afinidade de Matrex® Cellufine™ Sulfate. Carregou-se uma solução de alimentação do VSV clarificada numa coluna de Cellufine™ Sulfate pré-equilibrada (fosfato de potássio 1,47 mM, fosfato de sódio 8,06 mM, NaCl 140 mM, pH de 7,0) (volume de cápsula (CV) = 2 mL) com um débito de 3 mL/minuto. Lavou-se a coluna com 10 CV de tampão de equilíbrio, que era soro fisiológico tamponado com fosfato (fosfato de potássio 1,47 mM, fosfato de sódio 8,06 mM, NaCl 140 mM, pH de 7,0) . Juntou-se a passagem e a lavagem. Depois, os materiais adsorvidos foram eluídos com um gradiente linear de 30 CV em fosfato de sódio 10 mM, NaCl 1,5 M, pH de 7,0. A análise SDS-PAGE mostrou que a separação entre as impurezas proteicas e o vírus durante a eluição não era eficiente e observou-se o VSV em todas as frações de eluição da coluna (dados não mostrados). Uma grande quantidade do VSV também ficou na coluna. A recuperação total do produto do VSV (ou seja, de todas as frações de eluição recolhidas; F3 - F25) era apenas de 45,2% (Quadro 5) . Observou-se resultados semelhantes (ou seja, uma baixa recuperação do VSV) com a resina de heparina-sepharose. 45
QUADRO 5. PURIFICAÇÃO DO VSV NUMA COLUNA DE MATRIZ DE
CELLUFINE® SULFATE
Amostras Volume (mL) Titulo do virus (pfu/mL) (pfu) Recuperação Alimentação 22 1,39 x 106 3,06 x 107 — FT &M 32 O t—1 X o 1,41 x 106 4, 6% F3-4 4 o t—1 X o o \—1 4,00 x 104 0,1% F5 2 1,00 x 105 2,00 x 105 0,7% F6-9 8 1,00 x 105 8,00 x 105 2,6% F10-25 32 4,00 x 105 1,28 x 107 41,9% Total 45,2% FT&W = Pool de passagem e de lavagem F3 - F25 são as frações de eluição 3-25.
EXEMPLO 6: PROCESSO DE PURIFICAÇÃO DO VSV: ADSORVENTE
DE MEMBRANA DE PERMUTA ANIÓNICA
Como anteriormente descrito no Exemplo 5, a recuperação do VSV foi relativamente baixa quando se purificou o filtrado da etapa de clarificação secundária (ou seja, filtro Sartobran™ de 0,2 μπι) com a resina UNOsphere™ Q, a resina UNOsphere™ S, a resina CHT I, a resina CFT I, a resina CST I, a resina Cellufine® ou a resina de heparina-sepharose. Assim, avaliou-se ainda mais a purificação do filtrado do VSV do Exemplo 4, utilizando dois adsorventes de membrana de permuta aniónica; um adsorvente de membrana Sartobind™ Q (Sartorius Corp.; Edgewood, NY) e um adsorvente de membrana Mustang™ Q (Pall Corp.; East Hills, NY).
Purificação do VSV num adsorvente de membrana Sartobind™ Q A alimentação do VSV (matéria-prima) para a purificação em adsorvente de membrana era o material retido de uma separação por filtração de fluxo tangencial (TFF) (utilizando uma membrana de TFF, tendo uma separação do peso molecular de 750 kDa) . O material retido do VSV da separação por TFF (que contém o VSV e impurezas 46 proteicas/contaminantes proteicos e ADN) foi depois armazenado nos 4°C ou nos -70°C.
Realizou-se estudos iniciais do adsorvente de membrana Sartobind™ Q com o material retido do VSV armazenado nos 4°C, tendo-se utilizado HEPES 20 mM (pH de 7,1) como tampão de equilíbrio e tendo o material retido sido adsorvido no adsorvente de membrana Sartobind™ Q (2,1 mL de volume de membrana). As impurezas proteicas foram eluidas de forma eficiente com um tampão de eluição de HEPES 20 mM (pH de 7,1) e NaCl 1,0 M (dados não mostrados). No entanto, não se recuperou título do VSV em qualquer uma das frações de eluição. Trocou-se o tampão HEPES por tampão de fosfato de sódio, mas os resultados observados foram semelhantes (ou seja, nenhum título do VSV nas frações recolhidas) , mesmo com grandes concentrações de NaCl (1,5 M) no tampão de eluição fosfato.
Em contraste, quando se utilizou o material retido do VSV armazenado nos -70°C como matéria-prima e se fez a sua adsorção num adsorvente de membrana Sartobind™ Q (equilibrado com HEPES 20 mM, pH de 7,1), o VSV foi observado nas frações de eluição (tampão de eluição HEPES 20 mM e NaCl 1,0 M), tendo-se observado 74,2% de impurezas proteicas no pool de passagem e de lavagem com base nos resultados do BCA (dados não mostrados) . A análise do equilíbrio de massa para a proteína total encontra-se no Quadro 6 .
Utilizando um gradiente de eluição linear para 30% do tampão B, para a matéria prima do VSV nos -70°C, observou-se dois picos principais no cromatograma (dados não mostrados). O tampão A (tampão de equilíbrio) era fosfato de sódio 10 mM (pH de 7,0) e NaCl 0,3 Μ. O tampão B (tampão de eluição) era fosfato de sódio 10 mM (pH de 7,0), NaCl 2,0 M e sacarose 10 mM, em que 30% do B era NaCl com uma concentração aproximada de 0,81 M. 47 0 primeiro pico era o VSV (frações 4 - 10) com uma pureza relativamente elevada. O segundo pico era os contaminantes de ADN hospedeiro (frações 11 - 20) . Os resultados do ensaio PicoGreen® (dados não mostrados) indicavam que 97,3% do ADN hospedeiro residual foram removidos com o adsorvente de membrana Sartobind™ Q. Por conseguinte, estes dados indicam que o adsorvente de membrana Sartobind™ Q fornece uma forma eficiente de remover os contaminantes de ADN hospedeiro do produto do VSV. No entanto, os resultados do ensaio do titulo do VSV (dados não mostrados) indicavam que a recuperação do VSV do processo de purificação com o Sartobind™ Q era inferior a 30% por titulo virai. Observou-se uma maior recuperação do VSV utilizando o adsorvente de membrana Mustang™ Q com as mesmas matérias-primas.
QUADRO 6: EQUILÍBRIO DE MASSA DA PROTEÍNA TOTAL PARA O ADSORVENTE SARTOBIND Q
Amostras em Volume Proteína total Recuperação processamento (mL) (ug/mL) (ug) Alimentação 15 115, 8 1.737 100% FT &W 32,5 39,68 1.289,6 74, 2% F3 2 3,79 7, 58 0,4% F4-5 4 24, 86 99, 44 5, 7% F6-10 10 12,27 122, 7 7, 1% Fll-20 20 6,17 123, 4 7, 1% F22-24 6 4, 27 25, 62 1,5% F36 2 0 0 0,0% F37 2 17, 86 35, 72 2,1% P38-40 6 7,38 44, 28 2,5% Total 94,6% FT&W = Pool de passagem e de lavagem F3 - F40 são as frações de eluição 3-40
Purificação do VSV num adsorvente de membrana Mustang™ Q Também se estudou o adsorvente de membrana Mustang™ Q como meio de purificação do VSV. Otimizou-se as condições 48 operacionais para o adsorvente Mustang™ Q e as mesmas encontram-se abaixo descritas. A sacarose melhora o rendimento de recuperação do VSV eluido a partir da membrana Mustang™ Q. Uma observação inicial, ao otimizar as condições para o Mustang™ Q, foi a importância de incluir a sacarose nos tampões cromatográficos. Por exemplo, realizou-se experiências de purificação em paralelo com tampão formulado com sacarose (FIG. 2A e 2B) e sem sacarose (FIG. 3A e 3B) . Utilizou-se os seguintes tampões cromatográficos: o tampão A (tampão de equilíbrio) era fosfato de sódio 10 mM (pH de 7,0) e NaCl 300 mM. 0 tampão B (tampão de eluição) era fosfato de sódio 10 mM (pH de 7.0), NaCl 1 M, com e sem (ou seja, +/- 2% de sacarose).
Nas duas experiências (ou seja, + /- 2% de sacarose), obteve-se um produto do VSV altamente puro. Ensaios de placa (dados não mostrados) indicavam que a recuperação do VSV era significativamente maior (32,8% vs. 19,0%) se a sacarose tivesse sido incluida no tampão. PH do tampão e ligação do VSV à membrana Mustang™ Q.
Avaliou-se três gamas diferentes do pH (pH de 6,5, 7,0 e 7.5) do tampão, de modo a determinar o pH ótimo do tampão para a ligação do VSV à membrana Mustang™ Q. Nestas experiências, carregou-se cultura fresca da cultura de células, condicionada após clarificação numa membrana Mustang Q, equilibrada com tampão de fosfato de sódio 10 mM com um pH de 6,5, tampão de fosfato de sódio 10 mM com um pH de 7,0 ou tampão de fosfato de sódio 10 mM com um pH de 7,5 (cada tampão também continha NaCl 300 mM e 2% de sacarose).
Eluiu-se o VSV da membrana por eluição gradual (tampão de eluição: fosfato de sódio 10 mM (pH de 6,5, de 7,0 ou de 7.5) , NaCl 720 mM e 2% de sacarose) com um débito de 3,5 mL por minuto (10 CV/min). A pureza do VSV eluido da Mustang™ Q (determinada por SDS-PAGE e Western Blot; dados não 49 mostrados) era equiparável para cada um dos pH testados do tampão. No entanto, com um pH de 6,5, uma quantidade significativa do VSV dispersou-se nas etapas de passagem, de lavagem e de eluição, durante o processo cromatográfico e, como tal, observou-se uma recuperação mais baixa do titulo do VSV no pool de eluição com este pH (ver o Quadro 7) . QUADRO 7. RECUPERAÇÃO PROCESSUAL DO VSV SOB DIFERENTES CONDIÇÕES DE PH DE LIGAÇÃO_ pH de ligação Recuperação do VSV (ensaio de título) 6,5 15% 7,0 33% 7,5 28%
Força iónica e ligação do VSV à membrana Mustang Q. Testou-se duas concentrações diferentes de NaCl (NaCl 0,15 M e NaCl 0,3 M) em tampão de ligação (equilíbrio) de fosfato de sódio 10 mM, na adsorção do VSV na membrana Mustang™ Q. Observou-se uma melhor separação entre o VSV e as impurezas proteicas com NaCl 0,3 M. Por exemplo, quando se utilizou NaCl 0,3 M em tampão de ligação de fosfato de sódio, os contaminantes de elevado peso molecular foram removidos no pool de passagem, tendo o VSV ficado ligado à membrana (dados não mostrados).
Força iónica e eluição do VSV da membrana Mustang™ Q. A força iónica do tampão de eluição (tampão B) (ou seja, a concentração de NaCl no tampão de eluição) foi determinada por eluição em gradiente linear, tendo a concentração do tampão de eluição (tampão B) aumentado de 0% para 60% em 30 CV com um débito de 3,5 mL/minuto. 0 tampão de equilíbrio (tampão A) era fosfato de sódio 10 mM, pH de 7,1, NaCl 300 mM, e o tampão de eluição (tampão B) era fosfato de sódio 10 mM, pH de 7,1, NaCl 2 M, sacarose 10 mM. Observou-se, a partir do cromatograma (dados não mostrados), ser 50 necessária uma concentração do NaCl de 0,6 M para eluir 73,3% do VSV a partir do adsorvente de membrana Mustang™ Q. Eluição em gradiente linear vs. eluição de etapa única.
Obteve-se um produto do VSV de elevada qualidade tanto a partir de uma estratégia de eluição em gradiente linear (acima descrita), como de uma estratégia de eluição de "etapa única" (dados não mostrados). O processo de eluição de etapa única compreende um tampão de equilíbrio (tampão A; por exemplo, fosfato de sódio 10 mM, pH de 7,1, NaCl 300 mM) e um tampão de eluição (tampão B; por exemplo, fosfato de sódio 10 mM, pH de 7,1, NaCl 2 M, sacarose 10 mM) . Em contraste com a eluição em gradiente linear, o processo de eluição de etapa única elui o VSV do adsorvente de membrana, ao adicionar instantaneamente o tampão B com uma concentração salina final específica (por exemplo, adição instantânea do tampão B com uma concentração final de NaCl de 0,6 M) . 0 processo de eluição de etapa única removeu mais do que 99% das impurezas proteicas (ensaio BCA; dados não mostrados), tendo-se recuperado 70 - 95% do VSV nas frações eluídas (ensaio de placas; dados não mostrados). Por conseguinte, o processo de eluição de etapa única será utilizado no presente documento, uma vez que se obteve um título elevado do VSV recorrendo a esta estratégia simples de eluição em etapa única. Débito operacional. Estudou-se dois débitos diferentes, ou seja, 10 volumes de cápsula (CV)/minuto e 20 CV/minuto. Não se observou qualquer alteração no desempenho do processo de purificação com qualquer um dos débitos.
Tratamento com Benzonase®. A Benzonase® Nuclease é uma endonuclease manipulada por engenharia genética. Esta degrada todas as formas de ADN e de ARN (de cadeia simples, de cadeia dupla, linear e circular), não tendo ao mesmo tempo atividade proteolítica. É eficaz numa grande variedade de condições, com uma grande atividade específica. Por conseguinte, a Benzonase® nuclease é ideal 51 para a remoção de ácidos nucleicos de produtos recombinantes, permitindo a conformidade com as diretrizes da FDA relativamente à contaminação com ácidos nucleicos. Observou-se neste caso que a Benzonase® nuclease reduziu de forma significativa o nivel de ADN no processo de purificação do VSV e no concentrado bruto purificado do VSV final. Contudo, a adição da Benzonase® nuclease, antes da purificação no adsorvente de membrana Mustang™ Q, teve por resultado a redução do titulo virai (dados não mostrados). Em contraste, o tratamento com a Benzonase® nuclease, após a etapa de purificação por cromatografia de membrana, não produziu o mesmo efeito (ou seja, não se observou redução do titulo).
No entanto, visto que o processo de purificação do VSV completo, descrito no presente documento (por exemplo, ver a FIG. 1), removeu mais de 99% dos contaminantes da cultura de células, o nivel de ADN no concentrado bruto purificado final do VSV era inferior à especificação (por exemplo, especificação WHO < 10 ng/dose) sem tratamento com a Benzonase® nuclease. Por conseguinte, o tratamento com a Benzonase® nuclease não tem de ser utilizado no processo de purificação do VSV, o que foi uma melhoria significativa em comparação com os processos de purificação convencionais do produto viral/de vacinas virais (que requerem o tratamento com a Benzonase® nuclease).
Capacidade de ligação do Mustang™ Q. Determinou-se a capacidade de ligação do adsorvente de membrana Mustang™ Q por saturação com o VSV, utilizando um reduzido volume (0,35 mL de volume) de adsorvente de membrana Mustang™ Q (ou seja, uma moeda Mustang™ Q). Ao carregar e ao purificar o fluido da cultura de células condicionado na moeda Mustang™ Q, observou-se inicialmente que a saturação com o VSV não podia ser medida por absorvância de UV, devido à passagem das impurezas absorventes de UV. Por isso, neste exemplo as frações de passagem do VSV foram colhidas e o 52 VSV foi detetado por SDS-PAGE e ensaio de titulo do VSV. 0 tampão de equilíbrio do Mustang™ Q era composto por HEPES 10 mM pH de 7,5, NaCl 0,3 mM, e 2% de sacarose.
De forma surpreendente, não se atingiu a saturação de 1% da cromatografia convencional (ver o Quadro 8 abaixo) , mesmo depois de carregar 400 mL de fluido da cultura de células na moeda Mustang™ Q (o título do fluido de cultura do VSV era de 6,9 x 106/mL). Contudo, como mostrado no Quadro 8, observou-se um maior título do VSV na passagem quando se carregou a moeda Mustang™ Q com os 400 mL da amostra do fluido da cultura. Além disso, quando o volume de carga chegou aos 400 mL, a pressão diferencial na moeda aumentou para 1,8 Bar. Assim sendo, concluiu-se a partir desta experiência, que 350 mL de fluido de cultura condicionado por 0,35 mL do adsorvente de membrana Mustang™ Q era a capacidade de carga do filtro, que era equivalente a 500 mL da cultura de células/mL de adsorvente de membrana. Em alternativa, a capacidade de ligação do Mustang™ Q também pode ser descrita por 6,9 x 109 pfu/mL de membrana. Em três análises de consistência, a capacidade de carga efetiva (em título virai) era ligeiramente superior à sua capacidade de ligação, o que não afetou o desempenho processual. Por conseguinte, estes dados indicavam que a capacidade de ligação determinada era um número conservador da capacidade e, como tal, podia ser facilmente utilizado na produção à escala industrial. 53
53 XHWWWWWWW QUADRO 8. ESTUDO DA CAPACIDADE DE CARGA DO MUSTANG™ Q Volume de carga1 (mL) Titulo" do VSV na passagem (pfu/mL) ND* 6.80 x 103 8.80 x 103 1,30 x 104 0 - 200 (FT1) 200 - 300 (FT2) 300 - 350 (FT3) 350 - 400 (FT4)
ND = não determinado 0 volume de carga1 teve por base o volume de cultura Título do VSV2: o título da alimentação do VSV foi de 6,9E + 06/mL O volume de membrana do filtro Mustang™ Q era de 0,35 mL FT1 - FT4 são as passagens 1-4, respetivamente
Conclusões relativas ao adsorvente de membrana Mustang™ Q.
Um produto do VSV de elevada qualidade com uma grande recuperação foi conseguido com o adsorvente de membrana Mustang™ Q. Em comparação com os processos cromatográficos "tradicionais", o processo de purificação com o Mustang™ Q (além de ser um processo simples e eficiente) tem diversas vantagens. Por exemplo, o processo dá origem a um produto do VSV com uma qualidade superior à que se obtém com a purificação por ultracentrifugação em gradiente de sacarose (por exemplo, ver as FIG. 5A e 5B) . Além disso, (a) a grande capacidade de ligação do adsorvente de membrana Mustang™ Q significa equipamento processual de menores dimensões e um menor custo de produção, (b) o maior débito, relativo às outras resinas cromatográficas testadas, resulta numa maior passagem e numa maior produtividade e (c) as unidades descartáveis do adsorvente de membrana Mustang™ Q eliminam a necessidade de validação em termos de limpeza e em termos de tempo de vida. 0 que se segue resume as condições operacionais do Mustang™ Q, desenvolvidas e descritas acima: (a) capacidade de carga = 0,5 L de cultura de células por mililitro de adsorvente 54 de membrana Mustang™ Q, (b) débito = 20 volumes de cápsula (CV) por minuto, (c) pH de ligação do VSV = pH de 7,5 ± 0,1 unidade de pH, (d) força iónica de ligação do VSV = sal 0,3 ± 0,2 M; (e) eluição do VSV = gradiente gradual em 15 CV e (f) força iónica de eluição do VSV = sal 0,7 M.
EXEMPLO 7: PROCESSO DE PURIFICAÇÃO DO VSV: FILTRAÇÃO DE FLUXO TANGENCIAL, ACABAMENTO, TROCA DE TAMPÃO Realizou-se a concentração do VSV e a troca de tampão utilizando um sistema de ultrafiltração/de diafiltração (UF/DF) por filtração de fluxo tangencial (TFF). O pool de eluição do VSV do adsorvente da membrana Mustang™ Q estava em tampão HEPES 10 mM com uma grande concentração de sal (NaCl 0,7 M) e, mesmo assim, apresentava uma quantidade vestigial de impurezas. Por isso, foi necessária a etapa de UF/DF para remover as impurezas residuais, e para produzir um produto do VSV final num tampão apropriado de formulação do produto.
Combinou-se os pools de eluição de cinco análises experimentais com o Mustang™ Q e utilizou-se os mesmos nesta experiência. Utilizou-se um cartucho de membrana de TFF oco de 16 cm2, com uma separação do peso molecular de 750 kDa (GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ). Concentrou-se primeiro a solução juntada para 10 mL.
Realizou-se cinco (5 x) trocas de tampão em soro fisiológico tamponado com fosfato (tampão de fosfato de potássio 10 mM (PBS) com um pH de 7,1 e NaCl 138 mM). A análise SDS-PAGE para amostras em processamento indicava que o VSV purificado estava apenas presente no material retido e na parte de lavagem, e a perda do VSV nos permeados não foi detetada nem por coloração pela prata, nem por análise Western Blot (dados não mostrados) . Os dados de SDS-PAGE demonstraram que a recuperação processual do VSV era aceitável e que as impurezas foram gradualmente removidas após cada troca de tampão (dados não mostrados). 55
Para remover completamente as impurezas residuais, foram necessárias cinco a seis trocas de tampão ao todo. Otimização das condições operacionais da UF/DF. Estudou-se o efeito da composição tampão no desempenho da UF/DF da TFF. Utilizou-se o mesmo pool de eluição do Mustang Q que a alimentação de todas as experiências (Quadro 9) . Realizou-se as primeiras três experiências numa membrana da TFF de fibras ocas de 16 cm2 (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.), tendo-se acabado o última análise com uma membrana de TFF de 420 cm2 (GE Healthcare Bio-Sciences Corp). A qualidade do produto era semelhante em todas as experiências (com base na análise SDS-PAGE e SE-HPLC).
QUADRO 9. EXPERIÊNCIA DA COMPOSIÇÃO TAMPÃO DA TFF
Análises experimentais Tampão Recuperação (%) Experiência 1 HEPES 10 mM, NaCl 0,15 M, pH 100,5 Experiência 2 de 7,4, 4% de sacarose 88,8 Experiência 3 NaPi 10 mM, pH de 7,4, 4% de 80,6 Experiência 4 sacarose 80,0 NaPi 10 mM. NaCl 0,15 M. pH de 7,4, 4% de sacarose PBS, pH de 7,2, 4% de sacarose
Independentemente do tampão utilizado, não se observou produto do VSV nos permeados de diafiltração (com base em SDS-PAGE/coloração pela prata; dados não mostrados). No entanto, os ensaios de ADN e da proteína total indicavam que cerca de 34 - 41% de toda a proteína carregada e 33 -40% do ADN carregado foram removidos nos primeiros três volumes de diafiltração. Relativamente à troca de tampão, cinco volumes de diafiltração (DF) foram suficientes para reduzir a condutividade do permeado para um nível satisfatório.
Por conseguinte, desenvolveram-se as seguintes condições operacionais de UF/DF da TFF como se segue: 56 (a) cartucho de membrana de TFF: cartucho de TFF de fibras ocas (750 kDa), (b) capacidade da membrana de TFF: 95 L de cultura de células/m2, (c) Pressão operacional: pl = 3 - 4 psig; p2 = 1 - 2 psig; TMP = 1,5 - 2,5 psig, (d) temperatura operacional: temperatura ambiente, (e) débito cruzado: 700 LMH, (f) fluxo do permeado: > 30 LMH, e (g) 5 x concentração e 6 x diafiltração em PBS + 4% de sacarose (fosfato de potássio 10 mM, NaCl 138 mM, pH de 7.2) ;
sendo pl a pressão de admissão, p2 é a pressão de saida, TMP é a pressão transmembranal e LMH é litros/m2 hora. EXEMPLO 8: PROCESSO DE PURIFICAÇÃO DO VSV: FILTRAÇÃO
FINAL A última etapa no processo de purificação do VSV foi uma filtração final do material purificado por TFF acima descrito. Utilizou-se uma unidade de filtro Sartorius Sartobran™ de 0,2 μπι (0,45/0,2 μπι) (Sartorius Corp.; Edgewood, NY) , com um débito de 100 mL por minuto, para remover a possivel biocarga com a perda minima de produto do VSV. O tampão era fosfato de potássio 10 mM (pH de 7,1 - 7.3) , NaCl 138 mM e 7,5% de sacarose.
EXEMPLO 9: PURIFICAÇÃO À GRANDE ESCALA DO VSV PARA A CONSTRUÇÃO VSVin N4CT8-gagl
Realizou-se quatro análises à grande escala de 4,5 L (ou seja, volume de cultura de células). Os resumos destas análises à grande escala são abaixo mostrados no Quadro 10 e no Quadro 11, e na FIG. 6. Realizaram-se ensaios incluindo SDS-PAGE (dados não mostrados), proteína total (Quadro 11), título virai (Quadro 10 e FIG. 6) e SE-HPLC (dados não mostrados). Conseguiu-se um desempenho processual consistente (ou seja, qualidade do produto do 57
VSV) e uma remoção das impurezas em cada uma das análises à grande escala, utilizando o processo apresentado na FIG. 1. QUADRO 10. ANÁLISES À GRANDE ESCALA
Análise Alimentação Volume (mL) Titulo (pfu/mL) Concentrado bruto purificado Volume (mL) Titulo (pfu/mL) 1 4.192 5,60 x 107 475 2,40 x 108 2 4.392 9,10 x 107 440 3,40 x 108 3 4.425 520 x 107 475 1,10 x 108 4 4.450 5,01 x 107 435 2,00 x 108
QUADRO 11. REMOÇÃO DAS IMPUREZAS PROTEICAS EM ANÁLISES
À GRANDE ESCALA DO VSV
Etapa processual Recuperação proteica total (%) Análise 1 Análise 2 Análise 3 Análise 4 Centrifugação a baixa velocidade ND 91,0 73,2 91,5 Pré-filtração de 0,2 pm (diluição) 89,9 75, 2 71,3 68,0 Pós-filtração de 0,2 pm (Sartobran™) 100,6 97, 3 102,6 98,1 Mustang™ Q 0,43 0,39 0,33 0, 41 UF/DF 42,7 52, 0 48, 7 47, 5 Pré-filtração de 0,2 pm 95, 7 106,8 104, 5 99,4 Pós-filtração de 0,2 pm (Sartobran™) 87, 7 82, 7 81,5 93, 8 Remoção proteica total (%) ND 99,9 99,9 99,9 ND = nao determinado
Análise do processo de purificação à grande escala do VSV 58 0 objetivo de desenvolver o novo processo de purificação do VSV, descrito no presente documento (por exemplo, ver a FIG. 1), foi o de produzir o VSV com elevada pureza e com uma elevada recuperação do produto do VSV purificado. A análise que se segue descreve a purificação e a estabilidade do VSV com base em quatro análises à grande escala de 4,5 L da cultura de células.
Análise SDS-PAGE e remoção das impurezas proteicas. Um aspeto importante do processo de purificação foi reduzir (ou remover) as impurezas proteicas da cultura de células do produto do VSV. Como acima apresentado no Exemplo 1, a construção rVSVIN exemplificada no presente documento foi a construção rVSVIN N4CT9-gagl. Monitorizou-se o produto do VSV através da deteção das suas proteínas virais principais, M (27 kDa) , N/P (49 kDa) , G (55 kDa) e L (250 kDa) . Dentre as proteínas do VSV, as proteínas M e N/P foram expressas com maiores níveis do que as proteínas G (CT9) e L, sendo o nível da proteína L o mais baixo. Assim, observou-se as proteínas M e N/P com bandas muito mais intensas na análise em gel de SDS-PAGE, relativamente às proteínas G e L. Em todas as experiências, carregou-se os mesmos volumes de amostra no gel (se nada for expresso em contrário) . Além disso, em vez de um método de deteção de proteína única, como a coloração pela prata ou a coloração Coomassie®, utilizou-se a coloração dupla prata/Coomassie® Blue, proporcionando uma deteção proteica mais sensivel. A análise SDS-PAGE para a análise à grande escala número 4 (FIG. 4A e 4B) revelou que a maior parte das proteínas hospedeiras foi removida na etapa de clarificação primária da centrifugação a baixa velocidade (FIG. 4A, 4B, faixas 1 e 2), através da remoção de detritos celulares. Com base na análise BCA, removeu-se 91,5% da proteína total, indicando que a centrifugação a baixa velocidade foi uma etapa de remoção de impurezas significativa. 59
Diluiu-se o sobrenadante da centrifugação com tampão HEPES 10 mM (pH de 7,5 após a adição de 1 x sacarose fosfato glutamato (SPG; 7,5% de sacarose, fosfato de potássio 10 mM, glutamato 5 mM) ) , NaCl 0,465 M e 2% de sacarose (FIG. 4A, 4B, faixa 3), tendo-se observado uma banda corada mais clara devido à diluição. A solução diluída foi depois bombeada através de um filtro de 0,2 pm, para remover quaisquer partículas contaminantes que tenham ficado (não se removeu quaisquer impurezas proteicas nesta etapa; FIG. 4A, 4B, faixa 4) . Recolheu-se o filtrado do VSV como a alimentação para a etapa do Mustang™ Q e carregou-se no adsorvente de membrana.
Removeu-se mais de 99,5% das impurezas proteicas que ficaram no adsorvente de membrana Mustang™ Q (Quadro 11). Observou-se a remoção das impurezas proteicas por análise SDS-PAGE (FIG. 4A, 4B, faixas 4 e 5), tendo-se eluído um produto do VSV de elevada qualidade a partir da membrana Mustang™ Q (FIG. 4A, 4B, faixa 6).
Concentrou-se o VSV eluído e diafiltrou-se o mesmo em tampão PBS (+ 7,5% de sacarose). Removeu-se mais de 48% das impurezas proteicas restantes na etapa de purificação de UF/DF (Quadro 11), tendo-se detetado bandas de proteínas do VSV muito intensas (FIG. 4A, 4B, faixa 7). Apenas se observou quantidades vestigiais de impurezas proteicas no pool do permeado da UF/DF (FIG. 4A, 4B, faixa 8) . Antes e após a filtração de 0,2 pm final, não existiam alterações detetáveis relativamente ao perfil da qualidade proteica ou de impurezas proteicas do VSV (FIG. 4A, 4B, faixas 9 e 10). O concentrado bruto purificado do VSV do novo processo desenvolvido também demonstrou uma maior pureza e um nível residual baixo em comparação com a purificação através de centrifugação em gradiente de sacarose. Por exemplo, as bandas coradas das proteínas do VSV (Μ, N, P, G e L) do novo processo desenvolvido (FIG. 5A, 5B, faixa 9) eram mais intensas do que as bandas coradas do VSV purificado por 60 meio de centrifugação em gradiente de sacarose (FIG. 5A, 5B, faixa 11) (com bandas coradas de impurezas proteicas menos intensas), o que indicava que se tinha conseguido um produto do VSV de qualidade superior com o novo processo de purificação apresentado na FIG. 1. Em todas as quatro análises à grande escala, atingiu-se uma qualidade semelhante do produto (dados não mostrados) , com base no perfil de impurezas proteicas e na intensidade das bandas de proteinas do VSV.
Análise por Size Exclusion-High Performance Liquid Chromatography (SE-HPLC) - cromatografia de alta resolução por exclusão molecular. Desenvolveu-se uma análise SE-HPLC para o VSV (ver o Exemplo 1), que proporciona um método simples e conveniente de separar o VSV das impurezas proteicas, e de analisar de forma qualitativa o processo de purificação do VSV. Para proteger a coluna, apenas foram injetadas amostras clarificadas na coluna. 0 VSV flui para fora da coluna na forma de um pico de eluição com um tempo de retenção de 7,5 minutos (dados não mostrados). Os picos de contaminantes proteicos/impurezas proteicas (que têm um maior tempo de retenção na coluna) eluem a partir da coluna após o pico do VSV e, assim, é necessária a sua eliminação/remoção do produto do VSV. A maioria das impurezas foi removida na passagem e na lavagem do Mustang™ Q, o que confirma os resultados da análise SDS-PAGE. Na etapa de UF/DF, removeu-se as impurezas relacionadas com o tampão e não se perdeu qualquer VSV em nenhum dos permeados (dados não mostrados). A seguir à filtração de 0,2 pm final, o produto do VSV foi eluido da coluna de SE-HPLC, na forma de um único pico principal com um tempo de retenção de 7,5 minutos, seguido de dois picos mais pequenos correspondendo ao controlo (blank) do tampão, (dados não mostrados).
Remoção do ADN hospedeiro residual. 0 ADN (célula hospedeira) da cultura de células é um dos contaminantes 61 principais nos processos de purificação que utilizam a tecnologia recombinante. 0 nivel de ADN residual no concentrado bruto purificado do VSV deveria ser inferior a 10 ng/dose (107 pfu) . Os perfis de remoção do ADN para as quatro análises à grande escala encontram-se resumidos em baixo no Quadro 12, tendo-se conseguido uma remoção consistente do ADN em cada etapa de purificação. Observou-se uma enorme eliminação do ADN na etapa de recuperação do produto (ou seja, l.a clarificação por centrifugação a baixa velocidade, seguida da 2.a clarificação por meio de filtração de 0,2 μπι) e na etapa do adsorvente de membrana Mustang™ Q. Removeu-se mais de 80% do ADN residual na etapa do Mustang™ Q e atingiu-se mais de 60% de eliminação do ADN na etapa de UF/DF. A percentagem global da remoção do ADN foi de 99,89 ± 0,03% em todas as quatro análises à grande escala. Além disso, o nivel de ADN residual estava muito abaixo de 10 ng/dose (Quadro 13) . QUADRO 12._RESUMO DA REMOÇÃO DO ADN HOSPEDEIRO (%)
Etapa processual Análise 1 Análise 2 Análise 3 Análise 4 Média Desvio padrão Recuperação do produto1 95, 70 93,97 96, 1 93,62 94, 85 1,23 Mustang™ Q 82,69 84, 7 85, 43 84,61 84, 36 1, 17 TFF 74,51 66,63 64,62 61,80 66,89 5, 45 Filtração 44, 81 64,23 55,34 57, 73 55,53 8, 07 Global 99,90 99,89 99,91 99,84 99, 89 0, 03 Recuperação do produto1 é a etapa de clarificação do fluido de cultura da centrifugação a baixa velocidade, seguida de filtração de 0,2 pm. 62
QUADRO 13. RESUMO DO NÍVEL DE ADN NO CONCENTRADO BRUTO
PURIFICADO DO VSV Nível de ADN residual (ng/107 pfu-dose) Análise 1 1, 46 Análise 2 0,97 Análise 3 3, 00 Análise 4 1,93
Remoção da proteína Gag. Determinou-se a concentração da proteína Gag através de ELISA, que forneceu dados para definir o nível de Gag residual no produto do VSV. 0 perfil da proteína Gag no processo de purificação encontra-se resumido abaixo no Quadro 14. Removeu-se a maior parte da proteína Gag na etapa de clarificação secundária (ou seja, filtração de 0,2 μπι) e na etapa do adsorvente de membrana Mustang™ Q. 0 nível da proteína Gag residual era de 0,08 a 8,93 ng/dose (107 pfu) no concentrado bruto purificado final, como mostrado no Quadro 15.
QUADRO 14._RESUMO DA REMOÇÃO DA GAG RESIDUAL PROCESSO VOLUME (ML) GAG RESIDUAL REMOÇÃO GLOBAL DA GAG NG/ML NG Cultura não clarificada 4.425 4,330 19.160,3 Pós- centrifugação 4.373 3,530 15.436,7 19,43% Pré-filtração de 0,2 pm 9.272 0, 750 6.954,0 63,71% Pós-filtração de 0,2 pm 9.200 0,690 6.348,0 66,87% Passagem + lavagem 9.800 0,660 6.468,0 Eluição do Mustang™ Q 1.600 0,680 1.088,0 94,32% 63
Material retido da TFF 450 4, 100 1.845,0 90,37% Pré-filtração de 0,2 μπι 495 3,410 1.688,0 91,19% Cone. bruto purificado 475 0,930 441, 8 97,69%
QUADRO 15. RESUMO DO NIVEL DE GAG RESIDUAL NO
CONCENTRADO BRUTO PURIFICADO DO VSV
Remoção da Gag (%) Nivel da Gag residual (ng/107 pfu-dose) Análise 1 80,0 8,93 Análise 2 87, 1 6,76 Análise 3 97, 7 0, 08 Análise 4 87, 1 8,50 EXEMPLO 10: Purificação à grande escala do VSV para a construção VSVIN N4CTl-gagl 0 desenvolvimento do processo de purificação para a construção VSVinN4CTi-gagl teve a dificuldade inicial de um baixo titulo do produto no fluido da cultura de células (< 106 pfu/mL), o que resultou num baixo titulo do produto e numa grande contaminação com ADN no concentrado bruto purificado final. No entanto, o processo de purificação, descrito no Exemplo 9 para o VSVINN4CT9-gagl, foi aplicado com êxito a esta construção do VSV e subiu para a escala dos 10 L (em volume de cultura celular) . Produziu-se um produto do VSV de elevada qualidade através deste processo de purificação.
No processo de purificação, as etapas de clarificação primária e secundária eram bastante semelhantes às descritas nos Exemplos 3 e 4. A etapa de adsorção de membrana de permuta aniónica, utilizando o adsorvente Mustang™ Q, foi otimizada da seguinte forma. Realizou-se a filtração de fluxo tangencial utilizando os sistemas 64
Quixstand™ ou Flexstand™ com cartuchos de membrana de fibras ocas (GE Healthcare; Piscataway, NJ). Também se testou neste estudo as membranas de ultrafiltração de poliéter-sulfona da GE, com uma separação do peso molecular (MWCO) de 750 kDa. Todas as membranas tinham uma área de superfície de filtração nominal de 420 cm2 ou de 1.200 cm2. Realizou-se experiências de cromatografia de membrana utilizando os sistemas AKTA™ Explorer e AKTAPilot™ (GE Healthcare; Piscataway, NJ) com adsorventes de membrana Pall Mustang™ Q (Pall Corporation; East Hills, NY).
Primeiro ensaio de purificação com o Mustang™ Q para o VSVINN4CTi-gagl
Realizou-se a etapa de adsorção do Mustang™ Q, utilizando os mesmos tampões e as mesmas condições operacionais que os descritos no processo de purificação do VSVINN4CT9-gagl. Em resumo, removeu-se primeiro a célula e os detritos através de uma centrifugação. Após a adição de 10 X sacarose fosfato glutamato (SPG) numa relação 1 : 9 (v/v) e após uma diluição dupla com HEPES 10 mM, NaCl 0,465 M, pH de 7,5, 2% de sacarose, bombeou-se a solução através de um filtro de 0,2 μπι. Carregou-se o filtrado num adsorvente de membrana Pall Mustang™ Q pré-equilibrado (0,35 mL de volumes de cápsula), e foi recolhido o pool de passagem e lavagem (FT&W) . Recuperou-se o produto do VSV no pool de eluição utilizando as mesmas condições de eluição descritas no processo do VSVINN4CT9-gagl. Obteve-se um produto virai de elevada qualidade (dados não mostrados). No entanto, observou-se um terço do produto virai no pool de FT&W (Quadro 16), e o título virai no pool de eluição do Mustang™ Q era muito baixo, devido ao baixo título de produção virai no biorreator (4,6 x 105 pfu/mL para o VSVINN4CTi-gagl vs. > 1,0 x 107 pfu/mL para o VSVinN4CT9-gagl) .
Quadro 16. Análise processual - recuperação do titulo
na primeira etapa do Mustang™ Q 65
Processo Volume (mL) Titulo virai (pfu/mL) Titulo virai (pfu) Recuperação (%) Alimentação 250 9,90 x 104 2,48 x 107 100 FT&W 300 3,20 x 104 9,60 x 106 38,8 Eluição 35 5,70 x 105 2,00 x 107 80,6 Regeneração 15 1,44 x 105 2,16 x 106 8,7
As condições de ligação para esta construção no adsorvente Mustang™ Q foram ainda mais otimizadas da forma que se segue. A conceção experimental está apresentada no Quadro 17. Em todas as experiências, selecionou-se o pH de carga e de eluição dos valores de 6,5 a 7,5, com base em experiências anteriores do VSVINN4CTç)-gagl. Selecionou-se nas experiências a concentração de NaCl no tampão de carga dentre os valores de 0,28 a 0,32 M, enquanto no tampão de eluição foi dentre os valores de 0,6 a 0,7 Μ. O débito era de 3,5 - 10,5 mL/min, que era equivalente a 10 - 30 volumes de cápsula (CV)/min.
Quadro 17. Conceção otimizada para a etapa do Mustang™ Q _
Exp # pH de carga NaCl de carga (M) pH de eluição NaCl de eluição (M) Débito (mL/min) 1 7,0 0,30 7,0 0,6 7,0 2 6,5 0,32 6,5 0,7 3,5 3 7,5 0,32 6,5 0,5 3,5 4 7,5 0,32 7,5 0,7 10,5 5 6,5 0,28 6,5 0,5 10,5 6 7,5 0,28 6,5 0,7 10,5 7 7,5 0,28 7,5 0,5 3,5 8 7,0 0,30 7,0 0,6 7,0 9 6,5 0,28 7,5 0,7 3,5 10 6,5 0,32 7,5 0,5 10,5
Observou-se um produto do VSV de elevada qualidade em todos os pools de eluição do Mustang™ Q, com base em análise SDS-PAGE (não mostrado). Os resultados da remoção das impurezas proteicas nesta etapa são mostrados na FIG. 7. Removeu-se mais de 99% das impurezas proteicas nesta única etapa, que foi mais do que o verificado no processo de purificação do VSVINN4CT9-gagl. A recuperação processual e os resultados do ensaio de ADN hospedeiro residual nos pools de eluição encontram-se resumidos no Quadro 18. 0 nivel de ADN residual nos pools de eluição era muito baixo em todas as experiências, o que indica que a eliminação do ADN não foi um problema neste processo. No entanto, a recuperação do titulo variou em função das condições experimentais.
Quadro 18. Recuperação do titulo e nivel de ADN residual nos pools de eluição do Mustang™_
Exp# Recuperação do titulo ADN residual (ng/mL) 1 78, 1 1 2 32,2 BD* 3 23,9 1 4 35, 7 1 5 39,1 BD 6 58,3 BD 7 52,2 3 8 87,5 BD 9 55, 1 BD 10 23,7 BD *BD significa que o nivel de ADN fica abaixo do nivel de deteção como
Calculou-se a recuperação processual a partir do titulo virai determinado pelo ensaio em placas. Quando o pH do tampão de carga se encontrava entre 6,6 e 7,5, e a concentração de NaCl entre 0,28 e 0,30 M, atingiu-se uma recuperação processual aceitável, como mostrado num 67 diagrama de contornos (dados não mostrados). A condição do tampão de carga ótima era de NaCl 0,29 M em HEPES 10 mM, 2% de sacarose, pH de 7,0. Visto não haver uma preferência em termos de ajuste do pH nas condições da alimentação, um pH de 7,5 foi considerado aceitável para o pH do tampão de equilíbrio do Mustang™ Q. Ao mesmo tempo, determinou-se NaCl 0,60 - 0,70 M e um pH de 6,75 - 7,25 com as condições do tampão de eluição do Mustang™. A condição ótima do tampão de eluição era de HEPES 10 mM, NaCl 0,65 M, 2% de sacarose, pH de 7,0. As condições do tampão do Mustang™ Q encontram-se resumidas no Quadro 19. Com o desenvolvimento destas condições, reduziu-se os contaminantes de ADN nos pools de eluição para um nível aceitável (dados não mostrados).
Quadro 19: Condições do tampão do Mustang™ Q
Processo pH Concentração de NaCl (M) Equilíbrio 6,6 - 7,5 0,28 - 0,30 Eluição 6,75 - 7,25 0,60 - 0,70
Outras experiências eram consistentes com estes resultados e demonstraram que, nalgumas formas de realização, NaCl 0,28 M a 0,30 M e um pH de 7,2 - 7,5 eram as condições preferidas para o tampão de ligação, de modo a garantir uma grande recuperação do produto, e uma redução aceitável dos contaminantes de ADN nos pools de eluição. EXEMPLO 11: PURIFICAÇÃO À GRANDE ESCALA DA CONSTRUÇÃO VSViNN4CTi-gagl
Completou-se três análises de confirmação à pequena escala com os mesmos materiais de alimentação, utilizando as condições do Mustang™ Q acima desenvolvidas. O tampão de equilíbrio foi o HEPES 10 mM, NaCl 0,29 M, pH de 7,5, 2% de sacarose; enquanto o tampão de eluição foi HEPES 10 mM, NaCl 0,65 M, pH de 7,0, 2% de sacarose. Manteve-se as mesmas condições operacionais para todas as análises: o 68 mesmo débito, o mesmo volume de carga e o mesmo volume de eluição. Os resultados experimentais encontram-se resumidos no Quadro 20. Conseguiu-se um desempenho processual muito consistente, com base na recuperação de produto calculada a partir dos resultados do ensaio do titulo.
Quadro 20. Análises de confirmação do Mustang™ Q
Análises experimentais Recuperação (%) A 73, 0 B 81, 4 C 70, 8
Escala industrial do processo de purificação do VSViNN4CTi-gagi, análises de consistência e transferência de tecnologia
Utilizou-se o fluido de cultura de células contendo o VSVINN4CTi-gagl, após remoção dos microssuportes, como matéria-prima para todo o processo de purificação. 0 processo compreendia a clarificação da cultura de células por meio de centrifugação a baixa velocidade e a recuperação do VSV no sobrenadante; a filtração do sobrenadante através de um filtro de 0,45/0,2 pm e a recuperação do VSV na solução filtrada; o carregamento da solução filtrada do VSV num adsorvente de membrana de permuta aniónica, a recuperação do produto do VSV nos pools de eluição; a purificação do VSV recuperado por meio de filtração de fluxo tangencial (TFF), utilizando uma membrana de separação do peso molecular de 750 kDa, e a recuperação do VSV no material retido e, finalmente, a filtração do material retido do VSV através de um filtro de 0,2 pm e a recuperação do VSV na solução filtrada. Terminou-se com êxito três análises de consistência (CR)/à escala industrial de 6 L e uma análise de 10 L (TTR) . As condições experimentais encontram-se resumidas no Quadro 21. 69
Quadro 21. Condições processuais das análises de consistência/à escala industrial do VSVinN4CTl-gagl_
Processo Condições processuais Recuperação do produto por centrifugação Centrifugadora descontínua 6.238 x g, 30 min, 20 - 24°C Recuperação do produto por filtração Sartorius Sartobran™ 300 (a uma escala de 6 L) , 500 (a uma escala de 10 L); débito: 200 mL/min (a uma escala de 6 L) e 300 mL/min (a uma escala de 10 L) Cromatografia com o Mustang™ Q Cápsula de 10 mL do Pall Mustang™ Q, débito: 200 mL/min; cápsula de 6 0 mL do Pall Mustang™ Q, débito: 600 mL/min Ultracentrifugação/ diafiltração GE Healthcare, MWCO: 750 kDa; cinco trocas de tampão; CR: 420 cm2, CFR: 50 0 - 550 mL/min, TMP = 1,0 - 2,0 psi; TTR: 1.200 cm2, CFR: 1.800 mL/min, TMP =2,0 psi Filtração final Sartorius Sartobran™ 150; 100 mL/min
Os resultados experimentais encontram-se resumidos nos Quadros 22 e 23. Realizou-se uma análise de SDS-PAGE típica para o processo (dados não mostrados). A variação da recuperação gradual entre diferentes análises deveu-se à variação do ensaio de potência (ensaio em placas). 0 rendimento processual global era consistente para as análises realizadas. Observou-se uma remoção consistente das impurezas proteicas e de ADN. Produziu-se um produto virai de elevada qualidade para todas as análises. 70
Quadro 22. Resumo das análises de consistência do VSViNN4CTi-gagl_
Escala industrial CR#1 CR# 2 TTR#1 Carga # VSV060405 VSV060816 VSV060831 LP# 1 Colheita da cultura de células: volume (mL) 6.612 5.696 5.692 8.000 Colheita da cultura de células (pfu/mL) 5,55 x 105 2, 15 x 105 1,69 x 106 8, 14 x 105 Vol. do concentrado bruto purificado (mL) 280 530 280 850 Titulo do concentrado bruto purificado (pfu/mL) 1,45 x 106 2,08 x 105 3,00 x 106 7, 81 x 10° Rendimento processual (%) 11, 7 9,1 8,7 10,2 ADN residual (ng/mL) 32 12 13 6 Remoção das impurezas proteicas (%) N/D 99,97 99,98 99,92 N/D: nao determinado 71
Quadro 23. Análise processual com base na recuperação do produto_
Etapa processual CR#1 CR# 2 Escala industrial Média1 STDEV2 TTR#1 Colheita 100,0 100,0 100, 0 100 Centrifugação 56,6 70,0 79,3 68,6 11,4 N/D Pré-diluição SB 137, 0 112,5 N/D 124, 8 17,3 23, 7 Filtração com o Sartobran 96,5 71,8 98,1 88,8 14, 7 257, 2 Armazenamento durante a noite 89, 8 41,9 N/D 65, 9 33,9 48,6 Mustang Q 43,4 100, 1 32,9 58,8 36,2 93,0 UF/DF 58,4 99,2 110,0 89,2 27, 2 26,4 Filtração de 0,2 mm 53,6 37, 0 39,4 43,3 9,0 139, 7 Rendimento global 9,1 8,7 11, 7 9,8 1,6 10,2 1,2: média de STDEV de CR #1 - 3; N/D: não determinado. 0 processo de purificação para o VSVINN4CTi-gagl conseguiu produzir um produto de elevada qualidade. As condições de purificação subiram para a escala dos 10 L (em volume de cultura de células) com um desempenho processual consistente. 0 rendimento processual global, com base no titulo do VSV do ensaio de placas era inferior ao alcançado a partir do VSVINN4CT9-gagl e do VSVNJN4CTi-gagl. Observou-se a maior perda do titulo na filtração final de 0,2 pm e possivelmente também na etapa do Mustang™ Q. A ligação não especifica poderá explicar a perda, especialmente se o estudo tiver tido a dificuldade à partida de matérias-primas de baixo titulo. Quanto menor o titulo, maior seria a porção virai perdida nos filtros. Aumentar o titulo do VSV na cultura de células foi uma boa decisão. Componentes, 72 excipientes e condições operacionais diferentes do tampão a ser empregues na redução da perda do titulo virai, no processo de purificação, e a seleção de um sistema tampão compatível com o produto virai são modificações a este sistema de purificação, que se pensa estarem dentro da especialidade da técnica, sem se recorrer a experimentação indevida. EXEMPLO 12: PURIFICAÇÃO À ESCALA INDUSTRIAL DO VSV PARA A CONSTRUÇÃO VSVNJN4CTi-gagl 0 processo de purificação, como descrito no Exemplo 9 para o VSVINN4CT9-gagl, foi aplicado com êxito a esta construção do VSV e numa escala de 10 L (em volume de cultura de células). Produziu-se um produto do VSV de elevada qualidade através deste processo de purificação.
No processo de purificação, as etapas de clarificação primária e secundária eram substancialmente semelhantes às descritas nos Exemplos 3 e 4. Otimizou-se a etapa de adsorção de membrana de permuta aniónica, utilizando o adsorvente Mustang™ Q da forma que se segue. Realizou-se a filtração de fluxo tangencial utilizando os sistemas Quixstand™ ou Flexstand™ com cartuchos de membrana de fibras ocas (GE Healthcare; Piscataway, NJ) . Testou-se as membranas de ultrafiltração de poliéter-sulfona da GE com uma separação do peso molecular (MWCO) de 750 kDa neste estudo. Todas as membranas tinham uma área de superfície de filtração nominal de 420 cm2 ou de 1.200 cm2. Realizou-se experiências de cromatografia de membrana utilizando os sistemas AKTA™ Explorer e AKTAPilot™ (GE Healthcare; Piscataway, NJ) , com adsorventes de membrana Pall Mustang™ Q (Pall Corporation; East Hills, NY). O primeiro ensaio de purificação com o Mustang™ Q para o VSVNJN4CTi-gagl produziu um produto de elevada qualidade com base em análise SDS-PAGE, utilizando as mesmas condições operacionais descritas no processo de purificação do VSVINN4CT9-gagl. No entanto, detetou-se um elevado nível de 73 ADN residual no pool de eluição do produto. Utilizando cromatografia de membrana, desenvolveu-se as condições de ligação e de eluição do Mustang™ Q para alcançar um elevado grau de purificação e um produto do VSV de elevada qualidade. Demonstrou-se uma consistência elevada do desempenho processual nas últimas experiências, inclusive análises à pequenas escala, e análises de consistência/à escala industrial, utilizando as seguintes condições operacionais. 0 processo de purificação também foi transferido com êxito para a Contract Manufacturíng Organization (CMO) para a produção de materiais para ensaios clínicos.
Primeira purificação com o Mustang™ Q para o VSVNjN4CTi-gagl
Realizou-se a etapa do Mustang™ Q utilizando o fluido da cultura de células, e os mesmos tampões e as mesmas condições operacionais descritos no processo de purificação para o VSVINN4CT9-gagl. Em resumo, removeu-se a célula e os detritos por meio de centrifugação. Após ser condicionado pela adição de 1 X sacarose fosfato glutamato (SPG) e pela dupla diluição com HEPES 10 mM, NaCl 0,465 M, pH de 7,5, 2% de sacarose, bombeou-se o sobrenadante através de um filtro de 0,2 μπι. Carregou-se o filtrado num adsorvente de membrana pré-equilibrado Mustang™ Q, colheu-se o pool de passagem e de lavagem. Obteve-se o produto do VSV utilizando o tampão de eluição e as condições operacionais descritos no processo de purificação do VSVINN4CTg-gagl. Também se colheu um pool da regeneração utilizando HEPES 10 mM, NaCl 1,0 M, pH de 7,5, 2% de sacarose. Por fim, limpou-se o Mustang™ Q com uma solução de NaOH 1,0 M. Observou-se uma grande capacidade de ligação do VSV na experiência. No entanto, recuperou-se muito pouco produto do pool de eluição (dados não mostrados). Detetou-se predominantemente o produto virai no pool de regeneração e mais de metade do produto virai não foi de todo recuperada (ver o Quadro 24). Detetou-se um elevado nível de contaminantes de ADN tanto 74 nos pools de eluição como de regeneração. Otimizou-se ainda mais as condições de ligação e de eluição do Mustang™Q para esta construção, de modo a aumentar a recuperação do produto e a reduzir ao mesmo tempo o nível de ADN residual. Quadro 24. Análise processual do Mustang™ Q -recuperação do titulo e remoção do ADN_ PROCESSO: Alimentação FT&W Eluição Regeneração Volume (mL) 312 330 35 15 Titulo virai (pfu/mL) 6,71 x 105 BD 5,94 x 105 5,00 x 106 Titulo virai (pfu) 2,09 x 108 BD 2,08 x 107 7,50 x 107 Recuperação virai (%) 100, 0 0, 0 9,9 35, 8 ADN (ng/mL) 123 16 84 782 ADN (ng) 38.376 5.280 2.940 11.730 Recuperação do ADN (%) 100,0 13,76 7, 66 30,57 ADN (ng/dose*) 1.833,1 n/a 1.414,1 1.564,0 * 1 dose = 1,0 x 107 pfu; BD: abaixo do limite de deteção
Como anteriormente descrito, a purificação do VSVinN4CT9-gagl teve como dificuldade a eliminação do ADN residual do produto final. Utilizou-se os Merck KGaA™ TMAE e Pall Mustang™ Q para uma maior otimização das condições. Desenvolvimento da purificação do VSV utilizando a resina TMAE™
Realizou-se a análise das condições do tampão de ligação do VSV na resina TMAE™, utilizando uma conceção experimental fatorial total, como mostrado no Quadro 25. A alimentação era sobrenadante de cultura de células, ajustado a diferentes condições do tampão de carga. Monitorizou-se o VSV na passagem utilizando análise de Western Blot. 75
Quadro 25. Conceção fatorial total para as condições de ligação da TMAE™_
Fatores pH Concentração de NaCl no tampão de equilíbrio (mM) Nível 6,5, 7,0, 7,5 0, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400
Como indicado por análise de Western blot (não mostrada), quando a concentração de NaCl no tampão de equilíbrio atingiu 200 mM, observou-se uma quantidade significativa do VSV nos pools de passagem. De modo a obter uma capacidade razoável de ligação do VSV na TMAE, a concentração de NaCl no tampão de equilíbrio deverá ser inferior a 200 mM. O comportamento de ligação do VSV não foi dramaticamente afetado sob as condições de pH testadas. No entanto, a análise da recuperação do VSV no pool de eluição (estimada por área de integração de pico da SE-HPLC do pool de eluição da TMAE (FiG. 8A, 8B e 8C) ) indicava que, com a mesma concentração de NaCl de ligação, se conseguia uma maior capacidade sob condições de um maior pH (pH de 7,5 vs. pH de 7,0 e de 6,5).
Ensaio de purificação do VSV utilizando a coluna de TMAE
Removeu-se a célula e os detritos celulares do fluido da cultura de células contendo o VSVINN4CT9-gagl, através de uma centrifugação nas 5.000 rpm durante 30 minutos nos 20 -24°C. Bombeou-se o sobrenadante através de um filtro de 0,45/0,2 μπι, após ter sido misturado com 10 X solução-mãe de SPG numa relação de 9 para 1. Utilizou-se o filtrado como a alimentação para a coluna de TMAE (2 mL) , com um débito de 4 mL/min. A coluna foi pré-equilibrada com HEPES 10 mM, NaCl 0,145 M, 2% de sacarose, pH de 7,4. Depois de encher a coluna com 10 volumes de coluna (CV) de tampão de equilíbrio, eluiu-se os materiais de ligação da coluna através de um gradiente linear para HEPES 10 mM, NaCl 1,5 76 Μ, 2% de sacarose, pH de 7,5 em 30 CV. Colheu-se diferentes pools de eluição.
Quadro 2 6. Eluição do VSV de uma coluna de ΤΜΆΕ Amostras Descrição Volume (mL) Alimentação pós-filtro de 0,2 pm 130 FT&W Passagem e lavagem 150 Fl A3-10 16 F2 AI1 - BI2 6 F3 BI1 - BI 22 F 4 Cl2 - Dl1 (NaOH 0,5 M) 6 A eletroforese em gel de SDS-PAGE (não mostrada) permitiu a observação de dois picos principais no perfil de eluição. O primeiro pico F1 tinha uma baixa relação de UV254/280, indicando teores mais elevados de proteína/vírus. 0 segundo pico F2 tinha uma elevada relação de UV254/280, sugerindo maiores teores de ácidos nucleicos. O ensaio PicoGreen® confirmou que o nível de ADN no pool da fração Fl era extremamente baixo (dados não mostrados). Por conseguinte, utilizou-se esta coluna na remoção de ADN. A recuperação do título neste pico era de 81,4% por meio de ensaio de placas. No entanto, registou-se um elevado nível de impurezas proteicas.
Purificação do VSV com o adsorvente de membrana Mustang™ Q
Realizou-se a análise das condições de ligação do VSV no adsorvente de membrana Mustang™ Q, utilizando uma conceção experimental fatorial total como mostrado no Quadro 27. A alimentação era o sobrenadante da cultura de células, ajustado a diferentes condições de tampão de carga. Analisou-se diferentes pools de eluição do Mustang™ Q, recorrendo a análise SDS-PAGE (não mostrada). 77
Quadro 27. Conceção fatorial total para a análise das
condições de ligação do Mustang™ Q
Fatores PH Concentração de NaCl no tampão de equilíbrio (mM) Nível 6,5, 7,0, 7,5 0,15, 0,20, 0,22, 0,24, 0,26, 0,28 A análise SDS-PAGE da análise das condições de ligação do VSV no adsorvente Mustang™ Q mostrou pools de eluição com diferentes concentrações de NaCl de ligação, respetivamente: 0,15, 0,20, 0,22, 0,24, 0,26, 0,28 M.
Quando a concentração de NaCl no tampão de equilíbrio chegou a 0,26 M, as impurezas proteicas de elevado peso molecular foram removidas dos pools de eluição sob todas as condições de pH testadas.
Análise das condições de eluição
Diluiu-se duas vezes o sobrenadante da cultura de células contendo o VSVINN4CT9-gagl com uma solução-mãe de HEPES (HEPES 10 mM, NaCl 0,415 M, 2% de sacarose, pH de 7,25), para atingir uma concentração final de NaCl de 0,28 M. Utilizou-se a solução preparada como a alimentação da experiência. A conceção experimental para este estudo encontra-se resumida no Quadro 28. Após a ligação ao adsorvente de membrana Mustang™ Q, eluiu-se o VSV com tampões de eluição com diferentes concentrações de NaCl. Quadro 28. Conceção fatorial total para o estudo da análise das condições de eluição do Mustang™ Q Fatores pH Concentração de NaCl no de equilíbrio (M) tampão Nível 6,5, 7,0, 7,5 0,55, 0,60, 0,65, 0, 70 e 0,75
Uma análise do diagrama de contornos da recuperação processual (não mostrada) indica que, de modo a conseguir uma recuperação processual razoável (> 55%), as condições 78 do tampão de eluição deverão ser mantidas as seguintes: pH = 6,5 - 6,9 e concentração de NaCl = 0,55 - 0, 70 M. Com estas condições, produziu-se um produto do VSV de elevada qualidade, como mostrado na análise de SDS-PAGE para pools de eluição do Mustang™ Q (não mostrado).
Otimização das condições do Mustang™ Q utilizando abordagens DOE
Uma maior otimização na etapa do Mustang™ Q teve por resultado melhores condições de ligação e de eluição do VSV, de modo a atingir um elevado nivel de eliminação do ADN e um elevado rendimento processual. A conceção experimental é mostrada no Quadro 29. O pH de carga e de eluição de 6,5 a 7,0 foi selecionado com base em estudos de análise inicial e em experiências anteriores no VSVINN4CTg-gagl. Também se escolheu diferentes concentrações de NaCl em tampões de carga e de eluição a partir dos resultados de estudos de análise inicial. O débito em todas as experiências manteve-se nos 7,0 mL/min, que era de 20 volumes de cápsula (CV)/min.
Quadro 29._Purificação do VSV no adsorvente Mustang™ Q
Exp # NaCl de pH de NaCl de pH de ligação (M) ligação eluição (M) eluição 1 0,26 6,5 0,550 6,50 2 0,26 6,5 0,700 6,75 3 0,26 7,0 0,625 O o k* r- 4 0,26 7,5 0,550 6,75 5 0,26 7,5 0,700 6,50 6 0,28 6,5 0,550 O o k* r- 7 0,28 6,5 0,625 6,50 8 0,28 7,0 0,550 6,50 9 0,28 7,0 0,625 6,75 10 0,28 7,0 0,625 6,75 11 0,28 7,0 0,625 6,75 12 0,28 7,0 0,625 6,75 13 0,28 7,5 0,700 O O kh 79 14 0,30 6,5 0,550 6,50 15 0,30 6,5 0,700 7, 00 16 0,30 7,0 0,625 6,75 17 0,30 7,0 0,700 6,50 18 0,30 7,5 0,550 7, 00 19 0,30 7,5 0,625 6,50
Resultados experimentais
Calculou-se o rendimento processual com base no título do produto do VSV, determinado pelo ensaio em placas. Os resultados encontram-se resumidos num perfil de estimativas (não mostrado). Para maximizar o rendimento processual, identificou-se as seguintes condições do tampão na adsorção com o Mustang™ Q:
Concentração de NaCl no tampão de carga: 0,26 - 0,30 M PH do tampão de carga: 7,0 - 7,5
Concentração de NaCl no tampão de eluição: 0,55 - 0,65 PH do tampão de eluição: 6,5 - 7,0
Os níveis de ADN residuais nos pools de eluição do Mustang™ Q com diferentes condições de ligação foram registados em diagramas de contornos (não mostrados). Refinou-se ainda mais as condições do tampão Mustang™ Q com base nos resultados de eliminação do ADN:
Concentração de NaCl no tampão de carga: 0,27 - 0,29 M PH do tampão de carga: 7,0 - 7,5
Concentração de NaCl no tampão de eluição: 0,55 - 0,65 PH do tampão de eluição: 6,5 - 7,0
Estimou-se a pureza do produto do VSV em pools de eluição do Mustang™ Q, por meio de densitometria de SDS-PAGE (não mostrada). Analisou-se a pureza do produto sob diferentes condições de tampão de ligação e sob diferentes condições de tampão de eluição. Tendo em consideração a variação da análise por densitometria, não havia uma diferença significativa na pureza do produto do VSV relativamente a 80 todos os casos. Produziu-se um produto do VSV de elevada qualidade em todas as experiências.
Valores operacionais do Mustang™ Q
As condições do tampão de eluição e de ligação da cromatografia em membrana Mustang™ Q foram definidas pela realização de experiências com mais pontos operacionais dentro e fora das condições desenvolvidas, como mostrado no Quadro 30. 0 tampão de equilibrio/eluição era HEPES 10 mM, 2% de sacarose com diversas concentrações de NaCl e com diferentes condições de pH. Manteve-se as mesmas condições operacionais em todas as análises: o mesmo débito, o mesmo volume de carga e o mesmo volume de eluição. Observou-se um desempenho processual consistente, como mostrado no Quadro 30: produziu-se um produto do VSV de elevada qualidade com base em análise SDS-PAGE; atingiu-se um nível aceitável de eliminação de ADN residual em todos os pools de eluição do Mustang™ Q; também se obteve um rendimento processual semelhante.
Quadro 30. Experiência com os valores operacionais do
Mustang™ Q_ PH de carga NaCl de carga (M) pH de eluição NaCl de eluição (M) Rendimento (%, titulo) Pureza (%, SDS/PAGE) ADN (ng/mL) 7,5 0,30 6,75 0,60 52,0 72,0 34 7,0 0,30 6,75 0,60 85, 7 80,0 33 7,5 0,26 6,75 0,60 49,1 76,1 34 7,0 0,26 6,75 0,60 O co vo 73,0 39 7,5 0,28 7, 00 0,65 85, 7 79,6 21 7,5 0,28 6,50 0,65 70,9 82,3 18 7,5 0,28 6,50 0,55 49,5 82, 8 15 7,5 0,28 7, 00 0,55 59,9 83,3 21 7,5 0,28 6,75 0,60 52,6 ND* 17 7,5 0,28 6,75 0,60 107, 2 ND* 30 N/D: nao determinado 81
Análises de consistência do VSViNN4CTg-gagl
Realizou-se todo o processo de purificação utilizando o fluido da cultura de células que continha o VSVINN4CT9-gagl. 0 processo compreende: a clarificação do fluido da cultura de células por meio de centrifugação a baixa velocidade e a recuperação do VSV no sobrenadante; a filtração do sobrenadante através de um filtro de 0,45/0,2 μπι e a recuperação do VSV na solução filtrada; o carregamento do filtrado do VSV num adsorvente de membrana de permuta aniónica, a eluição do VSV do adsorvente de membrana de permuta aniónica e a recuperação do produto do VSV; a purificação do VSV recuperado por meio de filtração de fluxo tangencial (TFF), utilizando uma membrana de fibras ocas com uma separação do peso molecular de 750 kDa, e a recuperação do VSV no material retido, e a filtração do material retido do VSV através de um filtro de 0,2 μιη, e a recuperação do VSV na solução filtrada. Completou-se uma análise de 10 L e duas de 6 L na Wyeth como "análises de consistência", e conseguiu-se duas análises de 10 L na Henogen como análises de transferência tecnológica. As condições experimentais encontram-se resumidas no Quadro 31.
Quadro 31. Condições processuais para as análises do VSViNN4CT9-gagl__
Processo Condições processuais Recuperação do produto por centrifugação Centrifugadora descontinua: 6.236 x g, 30 min, 20 - 24°C Recuperação do produto por filtração Sartorius Sartobran™ 300 para a escala de 6 L, 500 para a escala de 10 L; débito: 200 mL/min para a escala de 6 L e 300 mL/min para a escala de 10 L Cromatografia no Mustang Q Cápsula de 10 mL do Pall Mustang™ Q, débito: 200 82 mL/min; cápsula de 6 0 mL do Pall Mustangt™ Q, débito: 600 mL/min Ultrafiltração/diafiltração da TFF GE Healthcare, MWCO: 750 kDa, cinco trocas de tampão; CR: 420 cm2, CFR: 500 - 550 mL/min, TMP = 1,0 - 2,0 psi; TTR: 1.200 cm2, CFR: 1.800 mL/min, TMP =2,0 psi Filtração final Sartorius Sartobran™ 150; débito: 100 mL/min
Utilizou-se uma cápsula do Mustang™ Q de 10 mL em três análises de consistência (CR) e uma análise de transferência tecnológica (TTR). A cápsula do Mustang™ Q de 60 mL foi apenas usada numa TTR. 0 débito era de 200 mL/min para uma cápsula de 10 mL e de 600 mL/min para uma cápsula de 6 0 mL. Utilizou-se uma membrana de TFF de 420 cm2 nas análises de consistência, enquanto se utilizou a de 1.200 cm nas TTR. Ajustou-se linearmente o debito cruzado de acordo com a área da membrana.
Os resultados experimentais encontram-se resumidos nos Quadros 32 e 33. 0 rendimento processual global era consistente para todas as análises realizadas. A variação da recuperação gradual entre as diferentes análises, devido à variação do ensaio de potência (Quadro 33). Observou-se uma remoção consistente das impurezas proteicas e de ADN em todas as análises (Quadro 32). Uma análise de SDS-PAGE tipica para o processo acompanhou esta avaliação (não mostrada). Produziu-se um produto virai de elevada qualidade através deste processo de purificação. 83
Quadro 32. Resumo das análises de consistência do VSVNJN4CTi-gagl_ CR#1 CR# 2 CR# 3 TTR#1 TTR#2 Carga # VSV060629 VSV060712 VSV060728 Heno-gen #1 Heno-gen #2 Colheita da cultura de células: volume (mL) 8.927 5.704 5.607 8.072 7.980 Colheita da cultura de células: titulo (pfu/mL) 1,28 x 107 2,81 x 10 2,56 x 107 1,27 x 107 8, 14 x 106 Vol. do concentrado bruto purificado (mL) 800 670 600 855 550 Titulo do concentrado bruto purificado (pfu/mL) 8,22 x 107 1, 45 x 108 1,16 x 108 2,86 x 107 5,36 x 107 Rendimento processual (%) 57, 7 60,8 55, 8 23,9 45, 4 ADN residual (ng/mL) 18 22 11 51 21 Remoção das impurezas proteicas (%) 99, 83 99,84 99,89 99,72 NA NA: nao disponível 84
Quadro 33. Análise processual com base na recuperação do produto_
Etapa processual CR#1 CR# 2 CR# 3 Avg1 STDEV2 TTR# 1 TTR# 2 Colheita 100 100 100 100 0 100 100 Centrifugação 113, 8 97, 6 96,3 102, 6 9,8 188, 6 71,2 Filtração com o Sartobran™ 107, 6 90,8 123, 6 107, 3 16,4 23, 8 71,6 Armazenamento durante a noite N/D 76,8 85, 5 81,2 6,2 N/D N/D Mustang™ Q 37, 5 70,7 42,7 50,3 17, 9 309, 3 60,2 UF/DF 116, 7 102, 8 129, 9 116, 5 13,6 16,5 123, 4 Filtração de 0,2 μπι 107, 7 131, 2 85, 8 108, 2 22,7 134, 2 119, 9 Rendimento global 57, 7 60,8 48,8 55, 8 6,2 23,9 45, 4 1, 2: média e STDEV das CR#l-3; N/D: não determinado.
Por conseguinte, foi com êxito que se desenvolveu um processo de purificação para o VSVNJN4CTi-gagl, e as condições de purificação desenvolvidas subiram para a escala dos 10 L (em volume de cultura de células), mantendo ainda o mesmo desempenho processual. 0 processo foi confirmado por três análises de consistência e por duas análises de transferência tecnológica numa escala de 6 a 10 L (em volume de cultura de células). Produziu-se um produto virai de elevada qualidade através deste processo desenvolvido, com um rendimento processual e com níveis de eliminação de impurezas aceitáveis. 85
DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO
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Claims (14)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a purificação do vírus da estomatite vesicular (VSV), secretado no fluido de cultura celular de uma cultura de células de mamífero infetada com o VSV, sendo que o processo compreende: (a) a clarificação do fluido da cultura de células por meio de centrifugação a baixa velocidade, e a recuperação do VSV no sobrenadante; (b) a filtração do sobrenadante da etapa (a) através de um filtro de 0,2 a 0,45 μπι, e a recuperação do VSV na solução filtrada; (c) o carregamento da solução filtrada que contém VSV da etapa (b) num adsorvente de membrana de permuta aniónica, equilibrado com uma primeira solução salina de pH tamponado, a eluição do VSV do adsorvente de membrana de permuta aniónica com uma segunda solução salina de pH tamponado, e a recuperação das frações eluídas que contêm VSV; (d) a purificação do VSV recuperado na etapa (c) por meio de filtração de fluxo tangencial (TFF), utilizando uma membrana com um corte de peso molecular entre 300 kDa e 1.000 kDa, e a recuperação do VSV no material retido na membrana, e (e) a filtração do material retido que contém VSV da etapa (d) através de um filtro de 0,2 a 0,22 μπι, e a recuperação do VSV na solução filtrada.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o VSV recuperado na etapa (e) está pelo menos de 90,0% a cerca de 99,0% isento de contaminantes de proteína e de de ácidos nucleicos da cultura de células. 2
3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por as células de mamífero serem selecionadas a partir de células renais embrionárias humanas (HEK), de células HEK 293, de células de ovário de hamster chinês (CHO), de células renais de cria de hamster (BHK), de células renais de macaco verde africano (AGMK) e de células Vero de AGMK.
4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por a centrifugação a baixa velocidade ser de 4.400 x g a 8.000 x g.
5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que a primeira solução salina de pH tamponado ou a segunda solução salina de pH tamponado da etapa (c) é caracterizada de forma independente por uma ou mais das características selecionadas do grupo composto por: (a) conter um sal selecionado de forma independente a partir de NaCl ou KC1; (b) conter um sal tendo uma força iónica de 100 mM a 400 mM; (c) conter um tampão tendo um pKa entre 6,0 e 8,5; (d) ter um pH de 6,5 a 8,0; (e) compreender um tampão selecionado a partir do grupo composto por tampão fosfato, tampão de ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanossulfónico (HEPES) ou tris-(hidroximetil)-aminometano (TRIS); e (f) conter sacarose a uma concentração de 1,5% a 5%.
6. Processo de acordo com a reivindicação 5, em que o sal na segunda solução salina de pH tamponado é NaCl, e em que o VSV é eluído a partir do adsorvente de membrana, através da adição da segunda solução salina de pH 3 tamponado numa única etapa, encontrando-se a concentração de NaCl na eluição de etapa única entre 500 mM e 750 mM.
7. Processo de acordo com a reivindicação 6, em que a segunda solução salina de pH tamponado tem um débito de eluição de 10 volumes de cápsula/minuto (CV/minuto) a 30 CV/minuto.
8. Processo de acordo com a reivindicação 5, em que o sal na segunda solução salina de pH tamponado é NaCl, e em que a força iónica do NaCl na segunda solução salina de pH tamponado aumenta linearmente de 1 mM para 750 mM, para um débito de eluição de 10 CV/minuto a 30 CV/minuto.
9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que a membrana da TFF é caracterizada por uma ou mais das caracteristicas selecionadas do grupo composto por: (a) um corte de peso molecular de 300 kDa; (b) um corte de peso molecular de 750 kDa; e (c) um módulo de membrana de fibras ocas.
10 Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que a TFF compreende uma concentração do VSV recuperado da etapa (c) de pelo menos 5 x, seguida de pelo menos uma, ou de pelo menos cinco, troca (s) de tampão.
11. Processo de acordo com a revindicação 10, em que o tampão utilizado na troca de tampão é caracterizado por uma ou mais das características selecionadas do grupo composto por: (a) um tampão fosfato; 4 (b) um tampão HEPES; (c) um tampão TRIS; (d) uma concentração do tampão de 5 mM a 15 mM e um pH de 7,2 a 7,5; e (e) um tampão compreendendo ainda NaCl de 100 mM a 200 mM e 3,5% a 4,5% de sacarose.
12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que as etapas processuais de (a) a (e) são realizadas a uma temperatura ou a temperaturas de ou entre 15°C e 25°C.
13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 - 12, em que a clarificação do fluido da cultura de células da etapa (a) é realizada através de um módulo de filtração com uma profundidade de 1,0 pm a 4,5 pm, omitindo-se a centrifugação a baixa velocidade da etapa (a) .
14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-13, em que o VSV purificado é formulado na forma de uma composição farmacêutica.
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