CN107964037A - 基于cho细胞表达系统的重组猪瘟e2蛋白的纯化方法及应用 - Google Patents

基于cho细胞表达系统的重组猪瘟e2蛋白的纯化方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于CHO细胞表达系统的重组猪瘟E2蛋白的纯化方法，该方法包括以下步骤：(1)利用中空纤维柱澄清CHO细胞培养液，以除去细胞和细胞碎片；(2)利用中空纤维柱将(1)中澄清后的细胞培养液进行切向流过滤处理，以除去杂质后得到纯化后的重组猪瘟E2蛋白；本发明还公开了一种利用flux和0.2μm中空纤维柱澄清CHO细胞培养液的方法；本发明还提供了一种利用flux和30kD中空纤维柱进行切向流过滤处理澄清后的CHO细胞培养液的方法；与传统纯化方法相比，本发明便于放大、成本较低、得率高、纯度较高，能够满足工业化大规模生产所需。

Description

基于CHO细胞表达系统的重组猪瘟E2蛋白的纯化方法及应用
技术领域
本发明涉及到从CHO细胞表达重组蛋白的培养液中分离纯化重组蛋白的方法，特别是从CHO细胞表达重组猪瘟E2蛋白的培养液中分离纯化重组猪瘟E2蛋白的方法，属于生物医药提取技术领域。
背景技术
猪瘟在欧洲称为古典猪瘟(Classical Swine Fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)引起的一种急性、热性、致死性疾病。猪瘟具有高度接触传染性、发病急、高热稽留和小血管壁变性引起广泛出血、梗塞和坏死等病变特征。家养和野生猪是其唯一的天然宿主。世界动物卫生组织(OIE)将其定为A类传染病，我国《动物防疫法》将其列为一类传染病。猪瘟是目前危害我国养猪业发展的主要疫病之一。
猪瘟病毒属于黄病毒科、瘟病毒属成员，为单链线状RNA病毒。病毒粒子略呈圆形，具有脂蛋白囊膜，病毒粒子表面有脆弱的纤突结构。CSFV基因组长约12.5kb，仅含有1个大的开放性阅读框(ORF)，此ORF编码约3898个氨基酸残基、分子量约438kDa的多聚蛋白。此多聚蛋白在翻译的同时和在翻译后经病毒与宿主细胞蛋白酶加工成12种成熟蛋白，其中C,Erns,E1和E2为结构蛋白,其余为非结构蛋白。而E2是CSFV最主要的免疫原性蛋白，能够诱导机体产生中和抗体并且能够保护猪抵抗CSFV强毒株的攻击，也是研究猪瘟基因工程疫苗的重要靶蛋白。
膜过滤是生命科学实验室广泛使用的分离技术之一，根据膜的孔隙度，可分为微滤和超滤两种。微滤膜孔径一般是0.1-10μm，常应用于澄清、灭菌、微粒的去除和细胞的收获。超滤膜的孔径一般是0.001-0.1μm，常应用于可溶性分子(如蛋白质、多肽、核酸及其它生物分子)的脱盐、浓缩、以及缓冲液置换和分馏操作，超滤膜的规格一般采用截留分子量(MWCO)来区分。
微滤和超滤主要有两种过滤模式：(1)直流过滤(DFF)，也称为“死端”过滤，过滤时进样液流垂直于膜表面，液体100％通过膜；(2)切向流过滤(TFF)，也称为错流过滤，过滤时进样液流平行于膜表面，一部分料液通过膜(滤液)，剩余料液(回流液)循环回到进样容器。在DFF中，随着过滤的持续进行，大分子逐渐聚集在膜表面，并堵塞膜孔，从而降低过滤通量，即使增加压力，也只能将聚积层压紧，并不能改善过滤状态。而在TFF中，沿膜表面流动的料液会将膜表面由于浓差极化而形成的凝胶层“扫掠”清除，从而维持膜的过滤状态，保证小分子的通过。因此，相比DFF，TFF更加快速、高效和进一步直线放大
切向流过滤是生物分子分离和纯化的简单、快速、高效的技术之一。TFF可应用于样品的浓缩或脱盐过程，处理量可从几毫升到数千升不等，也可以应用于去除溶液中的内毒素和病毒颗粒、从小分子中分馏大分子、收获细胞悬液、澄清发酵液或细胞裂解液等。选择合适的TFF设备和操作条件必需优化和明确工艺的要求及参数，一旦工艺建立好，可以直线放大工艺，且只需调整膜、设备和流路即可用于处理大多数的相似产品的应用。
本实验室在申请号为201610625392.X的发明专利申请中首次使用CHO表达系统表达重组猪瘟E2蛋白，但在此专利中蛋白纯化使用的依旧是传统的方法，即镍柱纯化后超滤换液，虽然该方法纯化后的蛋白纯度能达到95％，但是该方法在处理细胞培养液时需要离心且后续还需要挂柱和换液，因此在工艺放大方面比较困难且成本很大(不仅需要购置大量大型的离心机和大型的AKTA和镍柱纯化设备，还需要大量的超滤浓缩设备且在洗脱换液后容易残留咪唑等化学分子)，不利于产品的产业化生产和销售(成本高价格相对较高，产品竞争力相对较低)，因此需要开发一种便于放大、成本较低、得率高、纯度较高且可大规模工业化生产的新的纯化方法，以满足工业放大和以后工业化生产的需求。
发明内容
本发明要解决的技术问题是开发一种便于放大、成本较低、得率高、纯度较高且可大规模工业化纯化CHO系统表达的猪瘟E2蛋白的方法，从而满足猪瘟重组E2蛋白亚单位疫苗工业化生产的需求。
本发明提供了一种基于CHO细胞表达系统的重组猪瘟E2蛋白的纯化方法，该方法包括以下步骤：(1)利用flux仪器以及中空纤维柱澄清CHO细胞培养液，以除去细胞和细胞碎片；(2)利用flux仪器以及中空纤维柱将(1)中澄清后的细胞培养液进行切向流过滤处理，以除去杂质后得到纯化后的重组猪瘟E2蛋白。
本发明的技术方案中，优选地，澄清CHO细胞培养液时的中空纤维柱是0.2μm中空纤维柱。
本发明的技术方案中，优选地，利用flux仪器和中空纤维柱澄清CHO细胞培养液的方法包括以下步骤：1)安装Filter，并用dd H2O清洗仪器管道和纤维柱，直至流出液体pH为7；2)仪器校准和测试，其中校准包括Feed pump校准和Permeate pump校准，测试包括管路泄露测试和Fliter水通量测定；3)系统平衡：用缓冲液平衡整个系统管路及Fliter约5min，然后转移多余缓冲液；4)样品澄清：将CHO细胞培养液加入到tank中，启动Feed泵到4000S-1，循环一定时间后经0.2μm中空纤维柱微滤，收集透过液，待用；然后将缓冲液加入tank中的细胞培养液中，重悬，其中缓冲液与细胞培养液的体积比为1:1；开启Feed泵一定时间，收集透过液，得到第一批澄清液，待用；重复操作2次，共得到3批澄清液；将上述透过液及三批澄清液混合均匀，得到混合液，即为澄清后的CHO细胞培养液；5)Filter的清洗和保存，使用缓冲液清洗Filter，清洗完毕后使用0.1M NaOH溶液保存Filter。
本发明的技术方案中，优选地，切向流过滤处理澄清后的细胞培养液时的中空纤维柱是30kD中空纤维柱。
本发明的技术方案中，优选地，利用flux仪器和中空纤维柱进行切向流过滤处理澄清后的CHO细胞培养液的方法包括以下步骤：1)安装Filter，并用dd H2O清洗仪器管道和纤维柱，直至流出液体pH为7；2)仪器校准和测试，其中校准包括Feed pump校准和Transfer pump校准，测试包括管路泄露测试和Fliter水通量测定；3)系统平衡：用缓冲液平衡整个系统管路及Fliter约5min，然后转移多余缓冲液；4)将装有缓冲液的容器连接Transfer pump，缓冲液可通过Transfer pump泵入tank中；5)切向流过滤处理：将澄清后的CHO培养液加入到tank中，启动Mixer，运行2-5min；启动Feed泵，使其达到6,000S-1，打开Retentate valve，待系统全回流5-10min后，适当调节Retentate valve使TMP达到14.5，以透过流速V1收集Permeate液体；打开Transfer pump，缓冲液以流入流速V2流入tank中，其中，所述透过流速V1与所述流入流速V2相同；收集Permeate液体最少直到6倍样品体积时为止，此时tank中剩余液体为纯化后的猪瘟E2蛋白；以及以及6)Filter的清洗和保存，使用缓冲液清洗Filter，清洗完毕后使用0.1M NaOH溶液保存Filter。
本发明的技术方案中，优选地，所述缓冲液为0.01M PBS。
本发明的技术方案中，优选地，所述切向流过滤处理时每次泵入的缓冲液体积与样品体积相同。
本发明的技术方案中，优选地，所述切向流过滤处理次数为6次以上。
本发明的技术方案中，优选地，所述透过流速V1为2ml/min。
本发明还提供了一种纯化CHO系统表达的重组蛋白的应用。
使用本发明的方法在纯化CHO细胞表达的重组猪瘟E2蛋白时，一是可以省略传统纯化时需要离心的步骤(无需够买大量大型的离心机)，二是不需要挂柱、洗脱、换液和浓缩的步骤(无需购买大型的AKTA和镍柱纯化设备以及大量的超滤浓缩设备)，三是可以避免洗脱时引入咪唑等有害的化学或者有机分子，四是在工艺放大时，可以直线放大，不需要进一步深入的研究工艺步骤和参数，五是工艺放大时，能够节省成本(仅需要购置并联使用的中空纤维柱)和时间，六是本方法纯化的蛋白损失可以忽略不计，即得率很高，且纯度能达到80％以上，虽然没有达到镍柱纯化时的95％纯度，但能满足制备疫苗的需求。总之，与传统纯化CHO细胞表达的重组猪瘟E2蛋白时，本发明便于放大、成本较低、得率高、纯度较高，能够满足工业化大规模生产所需。
附图说明
图1表示切向流过滤时及过滤后SDS-PAGE检测结果：1是0CV换液(即过滤前样品)，2是Marker，3是1CV换液(即1倍样品体积换液后样品)，4是2CV换液(即2倍样品体积换液后样品)，5是3CV换液(即3倍样品体积换液后样品)，6是4CV换液(即4倍样品体积换液后样品)，7是5CV换液(即5倍样品体积换液后样品)，8是6CV换液(即6倍样品体积换液后样品)，9是7CV换液(即7倍样品体积换液后样品)，10是8CV换液(即8倍样品体积换液后样品)。
图2表示切向流过滤时及过滤后HPLC检测结果：0CV是过滤前样品；1CV是1倍样品体积换液后样品，2CV是2倍样品体积换液后样品，3CV是3倍样品体积换液后样品，4CV是4倍样品体积换液后样品，5CV是5倍样品体积换液后样品，6CV是6倍样品体积换液后样品，7CV是7倍样品体积换液后样品，8CV是8倍样品体积换液后样品。
具体实施方式
下面用实施例来进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并不限定本发明。
本实施例中使用的试剂和耗材均为市售产品。
0.2μm中空纤维柱、30kD中空纤维柱、flux均购自美国通用电气(GE)公司。
实施例1表达重组猪瘟E2蛋白的CHO培养液的获取
稳定表达重组猪瘟E2蛋白的CHO细胞株的筛选和发酵过程详情见在本实验室申请号为201610625392.X的发明专利申请。
在发酵完成后，从摇瓶中(或发酵罐)中倒(或泵)出CHO细胞培养液，立即进行澄清处理，具体操作见实施例2。
实施例2CHO细胞培养液的澄清(以使用flux仪器以及0.2μm中空纤维柱处理280ml CHO细胞培养液为例说明)
1、开起中控主机，机器下方开关到“ON”位置，机器启动，系统自检，结束后进入HMI触摸屏界面。
2、安装Filter(所用管道尽量短，以减少死体积)
检查Filter外观是否完整无损，Filter用Holder固定。将Pf的出口端用管道连接到Filter的进口端；Filter的回流端接到Pr的进口处；而透过端出口接到Pp进口处或透过端控制阀。(注意：新的Filter使用前要用20％乙醇透过Filter，并浸泡10min，然后用水冲洗管路)
3、将仪器管道和纤维柱用dd H2O清洗，直至流出液体pH为7。
4、实验前校准工作：以下校准每次实验前进行操作
4.1Feed pump校准(Feed pump校准为常规校准)
A：Tank中加入适量纯化水，用一根管道将Pf出口端与Pr进口端连接，形成一个全回流流路。
B：打开Upper drain valve阀门，用量筒来收集流出的水；同时关闭Retentatecontrol valve来阻挡水流回Tank内。
C：调节feed泵转速到30rpm，待转速稳定后，记录一分钟内量筒收集到液体体积，记为V1(L/min)；调节feed泵调到另一较高流速300rpm，待转速稳定后，记录一分钟内量筒收集到液体体积，记为V2(L/min)。
D：点击界面上Settings-Calibration-Feed pump，输入低转速及其对应体积流速V1；再输入高转速及其对应体积流速V2，并输入测定流速时对应压力值，点击Enter，Feedpump校准完成。
4.2Permeate pump校准：可参照Feed pump校准方法。
4.3剪切力和流速设置
点击界面上Settings-Configue-Feed pump，点击shear Rate，即设定Feed pump按照剪切力显示，并设定剪切速率8000sec-1与流速300ml/min的对应关系。同时将permeate pump泵速显示设定为ml/min。
5、管路泄露测试(管路泄露测试为常规测试)
启动Feed泵速，设置为6000sec-1调节泵速使进口压达到工作压力，检查整个管路连接处及与滤器连接处是否有液体渗出；如果有渗出液，重新拧紧接口或者替换新的管道。
6、Fliter水通量测定(Fliter水通量测定为常规测定)
Tank中加满纯化水，启动Feed pump，调节回流阀使TMP到工作压力，用量筒收集透过端流出液体，记录一分钟内流出体积，用来计算Flux/bar；计算出数据可以与Fliter说明书上标准值对比，用来判断膜通透性是否良好。
7、CHO细胞培养液澄清：
7.1系统平衡：用200ml 0.01M PBS平衡整个系统管路及Fliter约5min，然后转移多余PBS，上样品(实施例1中收集的CHO细胞培养液)。
7.2样品澄清：
将280ml CHO细胞培养液加入到tank中，启动Feed泵到4000S-1，循环一定时间后经0.2μm中空纤维柱微滤，收集透过液，待用；
然后将缓冲液(0.01M PBS)加入tank中的细胞培养液中，重悬，其中缓冲液与细胞培养液的体积比为1:1；开启Feed泵一定时间，收集透过液，得到第一批澄清液，待用；
重复操作2次，共得到3批澄清液；
将上述透过液及三批澄清液混合均匀，得到混合液即为澄清后的CHO细胞培养液，此时体积约为500ml。
8、澄清完成后，清洗Filter
A：Tank中装入0.01M PBS，打开Upper drain valve，关闭透过端，打开Feed Pump，冲洗5分钟后，然后打开并冲洗透过端10min，再更换新的PBS循环冲洗5-10分钟，尽量冲洗干净Fliter。
B：将0.01M PBS换成dd H2O，重复A步骤。
C：将Tank中dd H2O换成50℃预热的0.5M NaOH，使Filter在0.5M NaOH中全循环60分钟。
D：测试水通量，参考实验步骤6，测定值与说明书上推荐值进行对比来判断膜清洗效果，若通量不达标，则继续用0.5M NaOH清洗。若通量依然未恢复，则参考中空纤维膜操作手册恢复水通量方法操作。
9、保存Filter
清洗完成后，Tank中装入0.1M NaOH溶液，启动Feed pump，待溶液充分充满滤膜，关闭透过液阀，停止Feed pump，把Fliter从机器上拆卸下来，并用封口膜或者合适堵头封好滤膜进出口，防止NaOH溶液挥发干。利用中空纤维柱将(1)中澄清后的细胞培养液进行切向流过滤处理，除去杂质后得到纯化后的重组猪瘟E2蛋白。
实施例3切向流过滤处理实施例2中澄清后的CHO细胞培养液
1、开起中控主机，机器下方开关到“ON”位置，机器启动，系统自检，结束后进入HMI触摸屏界面。
2、安装Filter(所用管道尽量短，以减少死体积)
检查Filter外观是否完整无损，Filter用Holder固定；将Pf的出口端用管道连接到Filter的进口端；Filter的回流端接到Pr的进口处；而透过端出口接到Pp进口处或透过端控制阀。(注意：新的Filter使用前要用20％乙醇透过Filter，并浸泡10min，然后用水冲洗管路)
3、将仪器管道和纤维柱用dd H2O清洗，直至流出液体pH为7。
4、实验前校准工作：以下校准每次实验前进行操作
4.1Feed pump校准(Feed pump校准为常规校准)
A：Tank中加入适量纯化水。用一根管道将Pf出口端与Pr进口端连接，形成一个全回流流路。
B：打开Upper drain valve阀门，用量筒来收集流出的水；同时关闭Retentatecontrol valve来阻挡水流回Tank内。
C：调节feed泵转速到30rpm，待转速稳定后，记录一分钟内量筒收集到液体体积，记为V1(L/min)；调节feed泵调到另一较高流速300rpm，待转速稳定后，记录一分钟内量筒收集到液体体积，记为V2(L/min)。
D：点击界面上Settings-Calibration-Feed pump，输入低转速及其对应体积流速V1；再输入高转速及其对应体积流速V2，并输入测定流速时对应压力值。点击Enter，Feedpump校准完成。4.2Transfer pump校准：可参照Feed pump校准方法。
4.3剪切力和流速设置
点击界面上Settings-Configue-Feed pump，点击shear Rate，即设定Feed pump按照剪切力显示，并设定剪切速率8000sec-1与流速100ml/min的对应关系。同时将Transfer pump泵速显示设定为ml/min。
5、管路泄露测试(管路泄露测试为常规测试)
启动Feed泵速，设置为6000sec-1调节泵速使进口压达到工作压力，检查整个管路连接处及与滤器连接处是否有液体渗出。如果有渗出液，重新拧紧接口或者替换新的管道。
6、Fliter水通量测定(Fliter水通量测定为常规测定)
Tank中加满纯化水，启动Feed pump，调节回流阀使TMP到工作压力，用量筒收集透过端流出液体，记录一分钟内流出体积，用来计算Flux/bar；计算出数据可以与Fliter说明书上标准值对比，用来判断膜通透性是否良好。
7、切向流过滤处理(也称为换液处理)澄清后的CHO细胞培养液
7.1具体操作过程：
将装有缓冲液(0.01M PBS)的容器连接Transfer pump，缓冲液(0.01M PBS)可通过Transfer pump泵入tank中；
用200ml 0.01M PBS润湿下整个系统管路及Fliter，然后转移多余PBS；
将澄清后的CHO培养液(实施例2中澄清后的CHO培养液)加入到tank中，启动Mixer，运行2-5min；
启动Feed泵，使其达到6,000S-1，打开Retentate valve，待系统全回流5-10min后，适当调节Retentate valve使TMP达到14.5，收集Permeate液体，并测量透过流速V1；
打开Transfer pump并设置流速为V2，使流速V2与透过流速V1相同；
在收集Permeate液体直到8倍样品体积(8CV)为止，每过(换)一个样品体积时收集4ml样品以检测其中的猪瘟E2蛋白含量和纯度以及pH值和电导；此时tank中剩余液体即为纯化后的猪瘟E2蛋白；
7.2SDS-PAGE检测结果：具体结果见图1和表1所示，在连续处理的8次样品中，SDS-PAGE的纯度未见明显变化，一直保持在90％以上；且在蛋白相对含量比较中，变化并不大；这说明澄清前后CHO细胞培养液中猪瘟E2蛋白的SDS-PAGE纯度很高，能达到90％以上，且在切向流过滤处理的过程中，猪瘟E2蛋白(即目的蛋白)未见明显损失。
另外，从图中也可以看出，我们的CHO表达出来的猪瘟E2蛋白SDS-PAGE纯度很高，能达到90％以上，这也是我们使用中空纤维纯化该蛋白的一个重要保障和优势。
表1SDS-PAGE检测相对含量比较
7.3pH值及电导变化：具体结果如表2所示，由表2中可以看出，随着过滤体积的增大，pH逐渐降低，电导逐渐增大，到6CV后，变化幅度很小，最终接近PBS的pH和电导值，因此6倍样品体积过滤换液即可达到换液的目的。
表2pH值及电导率变化
7.4HPLC检测纯度和含量结果：具体结果见图2和表3所示，从图中以及表3中猪瘟E2蛋白峰面积可以看出，随着过滤体积的增大，杂峰数量和面积逐渐减少，主峰面积基本不变，这表明猪瘟E2蛋白纯度逐渐加大，到6CV后逐渐稳定，且HPLC纯度(面积占比代表纯度)能达到80％以上，含量(面积代表含量)在过滤处理过程中基本没有损失。因此，结合7.3的结果，6倍样品体积过滤换液可以满足猪瘟E2蛋白纯化的需求。当然，换液的次数越多，得到的蛋白纯度相对越高，但是会增加纯化的成本和污水处理的成本，综合考虑，将样品换液次数定为6次或以上(根据要求和条件可适当增加换液次数)。
表3HPLC主峰面积变化
8、过滤完成后，清洗Filter
A：Tank中装入0.01M PBS，打开Upper drain valve，关闭透过端，打开Feed Pump，冲洗5分钟后，然后调节Retentate valve及透过端，使回流液体流速和透过液体流速接近，再循环冲洗5-10分钟，尽量冲洗干净Fliter。
B：将0.01M PBS换成dd H2O，重复A步骤。
C：将Tank中0.01M PBS换成50℃预热的0.5M NaOH，使Filter在0.5M NaOH中全循环30-60分钟。
D：测试水通量，参考实验步骤5，测定值与说明书上推荐值进行对比来判断膜清洗效果，若通量不达标，则继续用0.5M NaOH清洗。若通量依然未恢复，则参考中空纤维膜操作手册恢复水通量方法操作。
9、保存Filter
清洗完成后，Tank中装入0.1M NaOH溶液，启动Feed pump，待溶液充分充满滤膜，关闭透过液阀，停止Feed pump。把Fliter从机器上拆卸下来，并用封口膜或者合适堵头封好滤膜进出口，防止NaOH溶液挥发干。
本发明通过上面的实施例进行举例说明，但是，应当理解，本发明并不限于这里所描述的特殊实例和实施方案。在这里包含这些特殊实例和实施方案的目的在于帮助本领域中的技术人员实践本发明。任何本领域中的技术人员很容易在不脱离本发明精神和范围的情况下进行进一步的改进和完善，因此本发明只受到本发明权利要求的内容和范围的限制，其意图涵盖所有包括在由附录权利要求所限定的本发明精神和范围内的备选方案和等同方案。

Claims (10)

1.一种基于CHO细胞表达系统的重组猪瘟E2蛋白的纯化方法，所述纯化方法包括以下步骤：
1)利用flux仪器以及中空纤维柱澄清CHO细胞培养液，以除去细胞和细胞碎片；以及
2)利用flux仪器以及中空纤维柱将步骤1)中澄清后的细胞培养液进行切向流过滤处理，以除去杂质后得到纯化后的重组猪瘟E2蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中的中空纤维柱是0.2μm中空纤维柱。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，利用flux仪器和中空纤维柱澄清CHO细胞培养液的方法包括以下步骤：
1-1)安装Filter，并用dd H2O清洗仪器管道和中空纤维柱，直至流出液体pH为7；
1-2)仪器校准和测试，其中，校准包括Feed pump校准和Permeate pump校准，测试包括管路泄露测试和Fliter水通量测定；
1-3)系统平衡：用缓冲液平衡整个系统管路及Fliter 5min，然后转移多余缓冲液；
1-4)样品澄清：
1-4-1)将CHO细胞培养液加入到tank中，启动Feed泵到4000S-1，循环一定时间后经0.2μm中空纤维柱微滤，收集透过液，待用；
1-4-2)然后将缓冲液加入tank中的细胞培养液中，重悬，其中缓冲液与细胞培养液的体积比为1:1；开启Feed泵一定时间，收集透过液，得到第一批澄清液，待用；
1-4-3)重复步骤1-4-2)2次，共得到3批澄清液；
1-4-4)将上述透过液以及三批澄清液混合均匀，得到澄清后的CHO细胞培养液；以及
1-5)Filter的清洗和保存，使用缓冲液清洗Filter，清洗完毕后使用0.1M NaOH溶液保存Filter。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中的中空纤维柱是30kD中空纤维柱。
5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，利用flux仪器和中空纤维柱进行切向流过滤处理澄清后的CHO细胞培养液的方法包括以下步骤：
2-1)安装Filter，并用dd H2O清洗仪器管道和纤维柱，直至流出液体pH为7；
2-2)仪器校准和测试，其中校准包括Feed pump校准和Transfer pump校准，测试包括管路泄露测试和Fliter水通量测定；
2-3)系统平衡：用缓冲液平衡整个系统管路及Fliter约5min，然后转移多余缓冲液；
2-4)将装有缓冲液的容器连接Transfer pump，缓冲液通过Transfer pump泵入tank中；
2-5)切向流过滤处理：
2-5-1)将澄清后的CHO培养液加入到tank中，启动Mixer，运行2-5min；
2-5-2)启动Feed泵，使其达到6,000S-1，打开Retentate valve，待系统全回流5-10min后，适当调节Retentate valve使TMP达到14.5，以透过流速V1收集Permeate液体；
2-5-3)打开Transfer pump，缓冲液以流入流速V2流入tank中，其中，所述透过流速V1与所述流入流速V2相同；
2-5-4)收集Permeate液体最少直到6倍样品体积时为止，此时tank中剩余液体为纯化后的猪瘟E2蛋白；以及
2-6)Filter的清洗和保存，使用缓冲液清洗Filter，清洗完毕后使用0.1M NaOH溶液保存Filter。
6.根据权利要求3或5所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为0.01M PBS。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述切向流过滤处理时每次泵入的缓冲液体积与样品体积相同。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述切向流过滤处理的次数为6次以上。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述透过流速V1为2ml/min。
10.一种利用权利要求1～9任一权利要求所述的方法纯化CHO系统表达的重组蛋白的应用。
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