KR20080111544A - 정제된 소포성 구내염 바이러스를 세포 배양물로부터 단리하기 위한 정제 방법 - Google Patents

정제된 소포성 구내염 바이러스를 세포 배양물로부터 단리하기 위한 정제 방법 Download PDF

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Abstract

포유동물 세포 배양물로부터 개선된 순도의 소포성 구내염 바이러스 (VSV)를 얻기 위한 신규 정제 방법이 본원에 기재되어 있다. 보다 구체적으로, 특정 실시양태에서, VSV로 감염된 포유동물 세포 배양물의 세포 배양액으로부터 VSV를 정제하는 방법이 기재되어 있으며, 상기 방법은 세포 배양액을 저속 원심분리에 의해 청징화하고, 상등액에서 VSV를 회수하는 단계; 0.2 내지 0.45 ㎛ 필터를 통해 상등액을 여과하고, 여과된 용액에서 VSV를 회수하는 단계; 제1 pH 완충 염 용액으로 평형화된 음이온 교환 막 흡착제 상에 VSV 여과된 용액을 로딩하고, 음이온 교환 막 흡착제로부터 VSV를 제2 pH 완충 염 용액으로 용리하고, 용리된 VSV 분획을 회수하는 단계; 상기 회수된 VSV를 300 kDa 내지 1,000 kDa의 분자량 컷오프를 갖는 TFF 막을 사용하는 접면 유동 여과 (TFF)로 정제하고, 보유액에서 VSV를 회수하는 단계; 및 0.2 내지 0.22 ㎛ 필터를 통해 VSV 보유액을 여과하고, 여과된 용액에서 VSV를 회수하는 단계를 포함한다.
소포성 구내염 바이러스, 정제 방법, 여과, 저속 원심분리, 접면 유동 여과

Description

정제된 소포성 구내염 바이러스를 세포 배양물로부터 단리하기 위한 정제 방법 {PURIFICATION PROCESSES FOR ISOLATING PURIFIED VESICULAR STOMATITIS VIRUS FROM CELL CULTURE}
랍도바이러스과의 구성원인 소포성 구내염 바이러스 (VSV)는 비분절화된, 네거티브-센스, 단일 가닥 RNA 게놈을 갖는다. 그의 11 kb 게놈은 바이러스의 5종의 구조 단백질을 코딩하는 5개의 유전자를 갖는다: 복제된 RNA의 캡시드화를 위해 화학량론적 양으로 필요한, 뉴클레오캡시드 단백질 (N); RNA-의존성 RNA 중합효소 (L)의 보조인자인 인단백질 (P); 매트릭스 단백질 (M) 및 부착 당단백질 (G) (예를 들어, 문헌 [Gallione et al., 1981 J. Virol., 39:529-535]; [Rose and Gallione, 1981, J. Virol., 39:519-528]; 미국 특허 제6,033,886호; 미국 특허 제6,168,943호 참조).
일반적으로, VSV는 인간 병인으로 간주되지 않으므로, VSV에 대한 기존의 면역성은 인간 집단에서는 드물다. 그러므로, VSV 유래 벡터의 개발은 면역원성 조성물 (예를 들어, 백신) 및 치료 단백질을 코딩하는 유전자의 전달과 같은 영역에 촛점을 두고 있다. 예를 들어, VSV가 인플루엔자 바이러스 혈구응집소 단백질 (문헌 [Roberts et al., 1999 J. Virol., 73:3723-3732]), 홍역 바이러스 H 단백질 ( 문헌 [Schlereth et al., 2000 J. Virol., 74:4652-4657]) 및 HIV-1 env 및 gag 단백질 (문헌 [Rose et al., 2001 Cell, 106(5):539-49])을 발현하기 위한 효과적인 벡터로서 작용할 수 있다는 연구가 확립되어 왔다. VSV가 유망한 벡터가 되도록 하는 다른 특징들에는 하기가 포함된다: (a) 세포 배양시 활발하게 복제하는 능력; (b) 숙주 세포 DNA로 통합되지 않거나 또는 유전자 재조합을 겪지 않는 능력; (c) 프라이밍-부스팅 면역화 전략을 가능하도록 하는 다중 혈청형의 존재; (d) 관심대상의 외래 유전자가 VSV 게놈으로 삽입되어 바이러스 전사효소에 의해 다량 발현될 수 있음; 및 (e) 바이러스 게놈의 cDNA 카피로부터 감염성 바이러스의 구조를 위한 특정화된 시스템의 개발 (예를 들어, 미국 특허 제6,033,886; 미국 특허 제6,168,943 참조).
VSV 벡터화된 면역원성 조성물의 제조는 일반적으로 적합한 세포 배양물 (숙주)을 재조합 VSV로 감염시키는 단계, 세포 배양물에서 VSV를 성장시키는 단계, 적절한 시간에 세포 배양액을 수확하는 단계, 및 세포 배양액으로부터 VSV를 정제하는 단계를 포함한다. 임상적 적용에서 VSV 벡터 및 그의 면역원성 조성물의 사용은 세계의 각종 약물 안전성 기관 (예를 들어, 식품 의약품 안전청 (FDA), 유럽 의약청 (EMEA), 캐나다 건강보조식품 및 식품 지부 (HPFB) 등)의 안전성 규제를 충족하기 위해 적절한 순도의 VSV 샘플 (또는 용량)을 필요로 할 것이다.
그러나, 전형적으로 현재 이용가능한 VSV 정제 방법 (예를 들어, 수크로스 기울기 원심분리를 통한 정제)을 사용하여, 세포 배양 오염물 (예를 들어, 세포 배양 불순물 단백질 및 DNA)로부터 VSV를 분리하고, 적절한 순도 및 수율의 VSV를 얻 는 것은 어렵다. 예를 들어, 현재 이용가능한 정제 방법을 사용하는 경우, 전형적으로 VSV 샘플의 순도와 회수율 (퍼센트 수율) 간의 관계는 서로 반대의 관계이며, 이에 의해 충분한 양의 정제된 VSV를 제조하는 것이 곤란하게 된다. 또한, 최근 생물반응기-기재 방법에서, 증가된 세포 농도 및 더 긴 배양 시간은 생물반응기 유체 중 세포 파쇄물 및 유기 성분의 농도의 동반 증가와 함께, 더 높은 VSV 역가를 야기하며, 추가로 VSV 정제 방법을 복잡하게 한다.
수크로스 기울기 초원심분리는 1964년 이래로 바이러스 정제 (VSV 정제 포함)를 위한 표준 방법이었다 (문헌 [Yamada et al., 2003 BioTechniques, 34(5): 1074-1078, 1080]; [Brown et al., 1967 J. Immun., 99(1):171-7]; [Robinson et al., 1965 Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 54(1):137-44]; [Nishimura et al., 1964 Japan. J. Med. Sci. Biol., 17(6):295-305]). 그러나, 바이러스 농도가 증가함에 따라, 세포 파쇄물, 숙주 DNA 및 단백질 불순물의 동반 증가가 또한 야기되며, 이는 더 높은 농도에서 수크로스 기울기 초원심분리를 통해 제거하기가 매우 곤란하다. 또한, 수크로스 기울기 초원심분리는 스케일-업에 대해 극히 고가이다. 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 침전에 의한 VSV의 농축 및 정제 (문헌 [McSharry et al., 1970 Virol., 40(3):745-6])는 높은 불순물 수준의 유사한 문제점을 갖는다.
상대적으로 고품질의 바이러스는 크기 배제 크로마토그래피를 통해 얻었다 (문헌 [Transfiguracion et al., 2003 Human Gene Ther., 14(12):1139-1153]; [Vellekamp, et al., 2001 Human Gene Ther., 12(15): 1923-36]; [Rabotti et al., 1971 Comptes Rendus des Seances de l'Academie des Sciences, Serie D: Sciences Naturelles, 272(2):343-6]; [Jacoli et al., 1968 Biochim. Biophys. Acta, Genl Subj., 165(2):99-302]). 그러나, 공정 비용 및 작동 곤란성으로 인해, 일반적으로 대규모 바이러스 생산을 실행할 수 없다. 헤파린 (문헌 [Zolotukhin et al., 1999 Gene Ther., 6(6):973-985]), 렉틴 (문헌 [Kaarsnaes et al., 1983 J. Chromatog., 266:643-9]; [Kristiansen et al., 1976 Prot. Biol. Fluids, 23:663-5]) 및 마트렉스(Matrex)™ 셀루핀(Cellufine)™ 술페이트 ([Downing et al., 1992 J. Virol. Meth., 38(2):215-228])와 같은 친화성 크로마토그래피는 바이러스 정제에서 일부 사용되어 왔다. 헤파린 및 렉틴은 가능한 침출 문제점 (이는 생성물 방출 전에 추가 시험을 요구할 것임)으로 인해 cGMP 바이러스 생성에 일반적으로 바람직하지 않다 (또는 사용되지 않는다).
마트렉스™ 셀루핀™ 술페이트를 사용하는 바이러스의 친화성 정제는 바이러스 정제의 효율, 바이러스 품질 및 컬럼 재생으로 인해 풀리지 않은 과제이다. VSV 정제를 위해, 매우 큰 친화성 컬럼이 필요하다 (예를 들어, 세포 배양물 리터 당 0.2 L 마트렉스™ 셀루핀™ 술페이트 수지; 와이어쓰 백신(Wyeth Vaccine) 비공개 결과). 이온 교환 크로마토그래피를 통해 단독으로, 또는 바이러스 정제에서 사용되는 다른 유형의 전통적인 크로마토그래피 기술과 조합하여 정제되는 경우, 낮은 바이러스 수율이 관찰되었다 (국제 특허 공개 제WO2006/011580호; 문헌 [Specht et al., 2004 Biotech. Bioeng., 88(4):465-173]; [Yamada et al., 2003, 상기 인용됨]; [Vellekamp et al., 2001 상기 인용됨]; [Zolotukhin et al., 1999, 상기 인용됨]; 국제 특허 공개 제WO1997/06243호; [Kaarsnaes et al., 1983, 상기 인용됨]).
그러므로, 적절한 수준의 순도 및 회수율 (수율)로 VSV를 생성할 수 있는 정제 방법에 대한 필요성이 당분야에 현재 여전히 존재한다.
<발명의 요약>
본원에 기재된 방법 및 조성물은 일반적으로 바이러스학, 미생물학, 면역학 및 방법 개발의 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 개선된 순도 및 수율로 소포성 구내염 바이러스 (VSV)를 얻기 위한 신규 정제 방법이 기재되어 있다.
한 측면에서, VSV로 감염된 포유동물 세포 배양물의 세포 배양액으로부터의 VSV의 정제 방법은 (a) 일차 청징화 단계, (b) 이차 청징화 단계, (c) 음이온 교환 막 흡착 단계, (d) 접면 유동 여과 단계, 및 (e) 여과 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 단계 (a)는 세포 배양액을 저속 원심분리에 의해 청징화하고, 상등액에서 VSV를 회수하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 단계 (b)는 0.2 내지 0.45 ㎛ 필터를 통해 상등액을 여과하고, 여과된 용액에서 VSV를 회수하는 것을 포함한다. 다른 실시양태에서, 단계 (c)는 제1 pH 완충 염 용액으로 평형화된 음이온 교환 막 흡착제 상에 VSV 여과된 용액을 로딩하고, 음이온 교환 막 흡착제로부터 VSV를 제2 pH 완충 염 용액으로 용리하고, 용리된 VSV 분획을 회수하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 단계 (d)는 상기 회수된 VSV를 300 kDa 내지 1,000 kDa의 분자량 컷오프(cutoff)를 갖는 중공사 막을 사용하는 접면 유동 여과 (TFF)로 정제하고, 보유액에서 VSV를 회수하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 단계 (e)는 0.2 내지 0.22 ㎛ 필터를 통해 VSV 보유액을 여과하고, 여과된 용액에서 VSV를 회 수하는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 포유동물 세포 배양물의 세포는 인간 배아 신장 (HEK) 세포, HEK 293 세포, 차이니스 햄스터 난소 (CHO) 세포, 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포 및 아프리카 녹색 원숭이 신장 (AGMK) 세포 (또한, 베로 세포라고도 공지됨)에서 선택된다.
특정 실시양태에서, 정제 방법의 저속 원심분리 단계는 4,400 x g 내지 8,000 x g이다. 한 특정 실시양태에서, 저속 원심분리는 6,238 x g이다.
다른 실시양태에서, 0.2 내지 0.45 ㎛ 필터는 밀리포어 밀렉스(Millipore Millex)®-GV 필터 단위, 밀리포어 밀렉스®-GP 필터 단위, 팔 수포어(Pall Supor)® 필터 단위, 사르토리어스 사르토브란(Sartorius Sartobran)™ 필터 단위 또는 사르토리어스 사르토포어(Sartorius Sartopore)™ 필터 단위이다. 한 특정 실시양태에서, 필터는 0.2 ㎛ 사르토리어스 사르토브란™ 필터 단위이다.
다른 실시양태에서, 음이온 교환 막 흡착제는 사르토리어스 사르토바인드(Sartorius Sartobind)™ Q 막 흡착제 또는 팔 무스탕(Pall Mustang)™ Q 막 흡착제이다. 한 특정 실시양태에서, 음이온 교환 막 흡착제는 팔 무스탕™ Q 막 흡착제이다.
특정 다른 실시양태에서, 단계 (c)에서 제1 pH 완충 염 용액 중 염은 NaCl 또는 KCl이다. 다른 실시양태에서, NaCl 또는 KCl의 이온 세기는 0.1 M 내지 0.4 M이다. 한 특정 실시양태에서, 염은 NaCl이고, NaCl의 이온 세기는 0.3 M이다.
다른 실시양태에서, 단계 (c)에서 제2 pH 완충 염 용액 중 염은 NaCl 또는 KCl이다. 한 특정 실시양태에서, 제2 pH 완충 염 용액 중 염은 NaCl이다. 한 특정 실시양태에서, 제2 pH 완충 염 용액 중 NaCl의 이온 세기는 0.5 M 내지 0.75 M이다. 다른 특정 실시양태에서, 제2 pH 완충 염 용액 중 NaCl의 이온 세기는 0.6 M이다. 또다른 실시양태에서, 제2 pH 완충 염 용액 중 NaCl의 이온 세기는 0.75 M이다. 특정 다른 실시양태에서, 제2 pH 완충 염 용액은 10 캡슐 부피/분 (CV/분) 내지 30 CV/분의 용리 유속을 갖는다. 또다른 실시양태에서, 용리 유속은 20 CV/분이다.
특정 다른 실시양태에서, 제2 pH 완충 염 용액 중 NaCl의 이온 세기는 10 CV/분 내지 30 CV/분의 용리 유속에서 0.001 M로부터 0.75 M까지 선형으로 증가된다. 한 특정 실시양태에서, 선형 용리 기울기 유속은 20 CV/분이다.
또다른 실시양태에서, 단계 (c)의 제1 및 제2 완충제는 6.0 내지 8.5의 pKa를 갖는다. 또다른 실시양태에서, 단계 (c)의 제1 pH 완충 염 용액은 6.5 내지 8.0의 pH를 갖는다. 한 특정 실시양태에서, 제1 pH 완충 염 용액은 7.5의 pH를 갖는다. 다른 실시양태에서, 단계 (c)의 제2 pH 완충 염 용액은 6.5 내지 8.0의 pH를 갖는다. 한 특정 실시양태에서, 제2 pH 완충 염 용액은 7.5의 pH를 갖는다.
특정 다른 실시양태에서, 단계 (c)의 제1 및 제2 완충제는 포스페이트 완충제, N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산 (HEPES) 완충제 또는 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 (TRIS)이다. 다른 실시양태에서, 단계 (c)의 제1 및 제2 pH 완충 염 용액은 1.5％ 내지 5％ 농도의 수크로스를 추가로 포함한다. 한 특정 실시양태에서, 수크로스 농도는 2％이다.
특정 다른 실시양태에서, TFF 막은 300 kDa 분자량 컷오프를 갖는다. 또다른 실시양태에서, TFF 막은 750 kDa 분자량 컷오프를 갖는다. 또다른 실시양태에서, TFF 막은 적어도 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 850, 900, 950 또는 1,000 kDa 분자량 컷오프를 갖는다. 한 특정 실시양태에서, TFF 막은 중공사 막 모듈이다. 다른 실시양태에서, TFF는 단계 (c)로부터 회수된 VSV를 5회 이상 농축한 후, 완충제를 1회 이상 교환하는 것을 포함한다. 또다른 실시양태에서, TFF는 단계 (c)로부터 회수된 VSV를 5회 이상 농축한 후, 완충제를 5회 이상 교환하는 것을 포함한다. 한 특정 실시양태에서, 완충제 교환에서 사용된 완충제는 포스페이트 완충제, HEPES 완충제 또는 TRIS 완충제이며, 여기서 완충제는 5 mM 내지 15 mM의 농도 및 7.2 내지 7.5의 pH를 갖는다. 다른 실시양태에서, 완충제 교환 완충제는 추가로 0.10 M 내지 0.20 M NaCl 및 3.5％ 내지 4.5％ 수크로스를 포함한다.
다른 실시양태에서, 정제 방법 단계 (a) 내지 (e)는 실온에서 수행되며, 여기서 실온은 약 15℃ 내지 약 25℃의 온도(들)로서 정의된다. 한 특정 실시양태에서, 정제 방법 단계 (a) 내지 (e)는 20℃에서 수행된다.
또다른 실시양태에서, 단계 (a)에서 세포 배양액의 청징화는 1.0 ㎛ 내지 4.5 ㎛ 심층 여과(depth filtration) 모듈에 의해 수행되며, 여기서 저속 원심분리는 단계 (a)로부터 생략된다. 특정 실시양태에서, 심층 여과 모듈은 와트만(Whatman)® 폴리캡(Polycap)™ HD 모듈, 사르토리어스 사르토클리어(Sartorius Sartoclear)™ P 모듈 또는 밀리포어® 밀리스택(Millistak)+® HC 모듈이다.
다른 측면에서, 개선된 순도의 VSV는 포유동물 세포 배양물로부터 얻는다. 특정 실시양태에서, 정제된 VSV에는 세포 배양 단백질 및 핵산 오염물이 90.0％ 이상 없다. 다른 실시양태에서, 정제된 VSV에는 세포 배양 단백질 및 핵산 오염물이 99.0％ 없다. 한 특정 실시양태에서, 정제된 VSV에는 세포 배양 단백질 및 핵산 오염물이 99.8％ 없다.
특정 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 신규 정제 방법에 따라 정제되고 단리된, 개선된 순도의 VSV가 제공된다. 특정 실시양태에서, 정제된 VSV는 하기 특징 중 하나 이상을 특징으로 한다: 선택된 VSV 혈청형 또는 혈청형들의 조합; VSV의 병원성을 감쇠시키는 1종 이상의 돌연변이 또는 2종 이상의 돌연변이를 포함하는 게놈 서열, 이는 본 명세서의 발명의 상세한 설명 부분에 상세히 인용된, 1종 이상의 다양한 단백질 (치료 단백질 또는 면역원성 단백질)을 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드 서열 오픈 리딩 프레임 (ORF) 서열을 포함하는 게놈 서열.
본원에 기재된 조성물 및 방법의 다른 특성 및 장점은 하기 발명의 상세한 설명으로부터, 그의 바람직한 실시양태 및 청구의 범위로부터 명백할 것이다.
도 1은 포유동물 세포 배양액으로부터 개선된 순도의 VSV를 얻기 위한 정제 방법을 나타내는 순서도 (블랙 박스로 약술됨)이다.
도 2A는 용리 완충제 (10 mM 인산나트륨, 1.0 M NaCl)에 첨가된 2％ 수크로스에 의한 무스탕™ Q 막 흡착제 상의 정제후, 은 염색에 의한 VSV 단백질의 분리를 나타내는 전기영동 겔이다. 레인 1 내지 10은 (1) 원심분리전 (세포 배양물), (2) 공급, (3) 유동 및 세척, (4) 5％ 완충제 B (분획 1 내지 5), (5) 60％ 완충제 B (분획 6 내지 7), (6) 60％ 완충제 B (분획 8 내지 10), (7) 60％ 완충제 B (분획 11 내지 25), (8) 100％ 완충제 B (분획 26 내지 35), (9) 컬럼 재생 및 (10) 바이오-라드(Bio-Rad)® 프리시젼 플러스 프로테인(Precision Plus Protein)™ 표준이다. 무스탕™ Q에 대한 유속은 선형 용리 기울기로 3.5 ml/분이었다. SDS-PAGE 분석은 4 내지 20％ 트리스-글리신 겔에 의해 수행하고, 단백질 검출은 은 염색에 의해 수행하였다.
도 2B는 도 2A의 기재에 따른, 웨스턴 블럿팅에 의한 VSV 단백질의 분리를 나타내는 전기영동 겔이다. 웨스턴 블럿팅 검출은 항-VSV 폴리클로날 항체에 의해 수행하였다.
도 3A는 용리 완충제 (10 mM 인산나트륨, 1.0 M NaCl)에 첨가된 수크로스 없이 무스탕™ Q 막 흡착제 상의 정제후, 은 염색 및 웨스턴 블럿팅에 의한 VSV 단백질의 분리를 나타내는 전기영동 겔이다. 레인 1 내지 9는 (1) 공급, (2) 유동 및 세척, (3) 5％ 완충제 B (분획 1 내지 5), (4) 60％ B (분획 6 내지 11), (5) 60％ 완충제 B (분획 12 내지 25), (6) 100％ 완충제 B (분획 26 내지 35), (7) 바이오-라드® 프리시젼 플러스 프로테인™ 표준, (8) VSV 표준 (즉, 수크로스 기울기 정제된 VSV) 및 (9) 컬럼 재생 풀이다. 무스탕™ Q에 대한 유속은 단계 용리 기울기로 3.5 ml/분 (10 CV/분)이었다. SDS-PAGE 분석은 4 내지 20％ 트리스-글리신 겔에 의해 수행하고, 단백질 검출은 은 염색에 의해 수행하였다.
도 3B는 도 3A에 기재된 바와 같이 정제후 웨스턴 블럿팅에 의한 VSV 단백질 의 분리를 나타내는 전기영동 겔이다. 웨스턴 블럿팅 검출은 항-VSV 폴리클로날 항체에 의해 수행하였다. 완충제 B ("용리 완충제"라고도 함)는 10 mM 인산나트륨 (pH 7.0) 및 1 M NaCl이었다.
도 4A는 도 1에 기재된 정제 방법의 단계 각각에서 은 + 콜로이드 염색에 의한 VSV의 SDS-PAGE 분석 (4 내지 20％ 트리스-글리신 겔)이다. 레인 1 내지 12는 (1) 원심분리전, (2) 원심분리후 (1°청징화), (3) 0.2 ㎛ 여과전, (4) 0.2 ㎛ 여과후 (2°청징화), (5) 무스탕™ Q 막 흡착제로부터의 유동 및 세척 풀, (6) 무스탕™ Q 막 흡착제로부터의 VSV 용리 분획 풀, (7) TFF UF/DF로부터의 VSV 보유액, (8) 농축물 및 투석여과 풀, (9) 0.2 ㎛ (최종) 여과전, (10) 0.2 ㎛ (최종) 여과후 (VSV 정제된 벌크 농축물), (11) 바이오-라드® 프리시젼 플러스 프로테인™ 표준 및 (12) VSV 대조군 (실행 #3, 정제된 벌크 농축물)이다.
도 4B는 도 4A에 기재된 방법에 따른 웨스턴 블럿팅에 의한 VSV의 SDS-PAGE 분석 (4 내지 20％ 트리스-글리신 겔)이다.
도 5A는 도 1에 기재된 방법에 따라 정제된 은 + 콜로이드 염색에 의한 VSV 대 수크로스 기울기 원심분리에 의해 정제된 VSV (레인 11)의 SDS-PAGE (4 내지 20％ 트리스-글리신 겔) 비교이다. 레인 1 내지 12는 (1) 세포 배양액, (2) 원심분리후 (1°청징화), (3) 0.2 ㎛ 여과전, (4) 0.2 ㎛ 여과후 (2°청징화), (5) 무스탕™ Q 막 흡착제로부터의 유동 및 세척 풀, (6) 무스탕™ Q 막 흡착제로부터의 VSV 용리 분획, (7) TFF UF/DF로부터의 VSV 보유액, (8) 0.2 ㎛ (최종) 여과전, (9) 0.2 ㎛ (최종) 여과후 (VSV 정제된 벌크 농축물), (10) 바이오-라드® 프리시 젼 플러스 프로테인™ 표준, (11) 수크로스 기울기에 의해 정제된 VSV (레인 9의 부피의 절반만을 첨가함) 및 (12) VSV 대조군 (실행 #1, 정제된 벌크 농축물)이다.
도 5B는 도 1에 기재된 공정에 따라 정제된 웨스턴 블럿팅에 의한 VSV 대 도 5A에 기재된 바와 같이 수크로스 기울기 원심분리에 의해 정제된 VSV (레인 11)의 SDS-PAGE (4 내지 20％ 트리스-글리신 겔) 비교이다.
도 6은 4개의 스케일-업 실행 (세포 배양물 부피 4.5 L)으로부터 퍼센트 VSV 역가 회수율을 나타내는 막대 그래프이다. CR #1은 실험 실행 1이고, CR #2는 실험 실행 2이고, CR #3은 실험 실행 3이고, TT 01은 실험 실행 4이다.
도 7은 VSVIN N4CT1-gag1 구축물을 위한 무스탕™ Q 정제 단계에서 불순물 단백질 제거를 나타내는 막대 그래프이다.
도 8A는 pH 6.5에서의 TMAE 조건 스크리닝에서 VSVNJ N4CT1-gag1 회수율을 나타내는 막대 그래프이다.
도 8B는 pH 7.0에서의 TMAE 조건 스크리닝에서 VSVNJ N4CT1-gag1 회수율을 나타내는 막대 그래프이다.
도 8C는 pH 7.5에서의 TMAE 조건 스크리닝에서 VSVNJ N4CT1-gag1 회수율을 나타내는 막대 그래프이다.
소포성 구내염 바이러스 (VSV)는 상기 기재된 바와 같이 면역원성 조성물에서의 사용 및/또는 치료 단백질을 코딩하는 유전자의 전달을 위한 유망한 벡터로 만드는 많은 특징을 갖기 때문에, 포유동물 세포 배양물로부터 개선된 순도의 재조합 VSV를 생성하는 정제 방법에 대한 당분야의 필요성이 여전히 존재한다. 본원에 기재된 조성물 및 방법은 이후 상기 필요성에 대한 것이다. 하기 실시예 3 내지 8에 기술된 바와 같이, 포유동물 세포 배양물로부터의 VSV의 개선된 정제 방법 (예를 들어, 도 1 참조) 및 이에 의해 정제된 VSV가 기재되어 있다.
I. 포유동물 세포 배양물에서 VSV의 생성
포유동물 세포 배양물에서의 VSV의 생성은 당업자에게 익히 공지되어 있으며, 일반적으로 세포 배양물 (숙주 세포)을 재조합 VSV로 감염시키고, 세포 배양물에서 VSV를 성장시키고, 적절한 시간에 세포 배양물을 수확하는 것을 포함한다. VSV가 숙주 세포로부터 배지로 분비되기 때문에, VSV 생성물을 세포 배양액으로부터 수집한다.
따라서, 포유동물 세포 배양물로부터의 VSV의 제조, 및 본원에 기재된 바와 같이 이로부터 VSV를 정제하는 신규 방법은 당분야에 공지된 VSV (비분절화된, 네거티브-센스, 단일 가닥 RNA 바이러스)의 증식 (또는 성장)에 사용되는 적합한 포유동물 세포 배양물을 사용한다. 이러한 세포 배양물로는 인간 배아 신장 (HEK) 세포, 예컨대 HEK 293 세포, 아프리카 녹색 원숭이 신장 (AGMK) 세포, 예컨대 베로 세포, 차이니스 햄스터 난소 (CHO) 세포 및 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포를 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
또한, 세포 배양 물질, 방법 및 기술은 당업자에게 익히 공지되어 있다. 예를 들어, 전면 숙주 세포 집단 또는 특정 밀도의 숙주 세포 집단 (예를 들어, 베로 세포 배양물)을 주어진 감염다중도에서 생물반응기에서 감염시키는데 재조합 VSV 접종 스톡 (예를 들어, 구조된 VSV, 하기 섹션 II 참조)을 사용하고, 세포 배양물에서 주어진 시간 동안 주어진 온도에서 VSV를 성장시키고; 신생의 VSV 자손을 세포 배양액에서 수확한다. 하기 정의된 바와 같이, 용어 "배양액", "세포 배양액", "세포 배양 배지", "배지" 및/또는 "생물반응기 유체"는 상호교환적으로 사용되며, 세포 배양물이 성장되는 배지 또는 용액을 지칭한다.
II. 포유동물 세포 배양물로부터의 VSV의 정제
본원에 기재된, VSV로 감염된 포유동물 세포 배양물의 세포 배양액으로부터 VSV를 정제하는 신규 방법은 특정 정제 단계를 포함한다. 도 1의 순서도는 (a) 일차 청징화 단계, (b) 이차 청징화 단계, (c) 음이온 교환 막 흡착 단계, (d) 접면 유동 여과 단계, 및 (e) 여과 단계를 포함하는, 전체 정제 방식을 요약한다. 보다 구체적으로, 이러한 단계는 (a) 세포 배양액을 저속 원심분리에 의해 청징화하고, (b) 0.2 내지 0.45 ㎛ 필터를 통한 여과에 의해 상등액을 추가로 청징화하고, (c) VSV 여과된 용액을 음이온 교환 막 흡착제 상에서 정제하고, (d) 완충제를 교환하고, 접면 유동 여과 (TFF)를 이용하여 상기 VSV를 농축시키고, (e) 0.2 내지 0.22 ㎛ 필터를 통해 VSV 보유액을 최종 여과하는 것을 포함한다. 특정 다른 실시양태에서, 상기 정제 방법 단계 (a) 내지 (e)를 실온에서 수행한다. 하기 정의된 바와 같이, "실온"은 약 15℃ 내지 25℃의 온도(들)이다. 그러므로, 예를 들어, 단계 (a) 내지 (e)의 수행에 적합한 온도는 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 및 25℃의 온도, 또는 그 사이의 분수의 온도를 포함한다. 한 특정 실시양태에서, 정제 방법 단계 (a) 내지 (e)를 20℃에서 수행한다.
(a) 일차 청징화
특정 실시양태에서, VSV로 감염된 포유동물 세포 배양물의 세포 배양액을 저속 원심분리 (또는, 대안으로 심층 여과)에 의해 청징화하고, 상등액에서 VSV를 회수하여, 이는 또한 본원에서 세포 배양액의 "일차 (또는 1°) 청징화"라고 지칭된다. 특정 실시양태에서, 세포 배양액의 일차 청징화를 실온에서 수행한다.
세포 배양액의 일차 청징화에서 사용되는 원심분리 방법 및 기기는 당업자에게 익히 공지되어 있다. 하기 정의된 바와 같이, "저속" 원심분리는 10,000 rpm 미만의 속도의 원심분리이다. 특정 실시양태에서, 세포 배양액의 청징화에 사용되는 저속 원심분리 속도는 4,000 x g (± 100 x g) 내지 8,000 x g (± 100 x g)의 범위내의 원심분리 속도이다. 특정 다른 실시양태에서, 세포 배양액의 청징화에 사용되는 저속 원심분리 속도는 적어도 4,000 x g, 4,500 x g, 5,000 x g, 5,500 x g, 6,000 x g, 6,500 x g, 7,000 x g, 7,500 x g 또는 8,000 x g, 또는 그 사이의 수치의 rpm의 원심분리 속도이다. 한 특정 실시양태에서, 저속 원심분리에 의한 세포 배양액의 일차 청징화를 30분 동안 실온에서 6,238 x g에서 수행한다 (실시예 3, 표 2).
상기 언급된 바와 같이, 특정 실시양태에서, VSV로 감염된 포유동물 세포 배양물의 세포 배양액을 대안으로 심층 여과 (즉, 저속 원심분리 대신)에 의해 청징화한다 (1°). 심층 여과는 저속 원심분리가 단계 (a)의 일차 청징화로부터 생략되는 경우에 사용될 수 있다. 심층 여과 (표면 여과와 대조적임)는 일반적으로 그의 구조물 내로 오염물을 포획하는 "두꺼운" 필터를 지칭한다. 심층 여과 물질 및 방법은 당업자에게 익히 공지되어 있다. 예를 들어, 필터 물질은 전형적으로 섬유의 개구부에 매립된 규조토 입자와 같은 무기 필터 보조물을 갖는 두껍고 섬유성의 셀룰로스 구조물로 구성된다. 이 필터 물질은 입자 포획 및 필터 용량에 중요한, 큰 내부 표면적을 갖는다. 이러한 심층 여과 모듈은 1.0 ㎛ 내지 4.5 ㎛의 직경 크기의 세공, 예를 들어 적어도 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0 및 4.5 ㎛의 필터 크기, 및 그 사이의 분수의 필터 크기를 함유한다. 예시적인 심층 여과 모듈로는 와트만® 폴리캡™ HD 모듈 (와트만 인크.(Whatman Inc.); 미국 뉴저지주 플로람 파크 소재), 사르토리어스 사르토클리어™ P 모듈 (사르토리어스 코포레이션(Sartorius Corp.); 미국 뉴욕주 에지우드 소재) 및 밀리포어® 밀리스택+® HC 모듈 (밀리포어; 미국 메사추세츠주 빌레리카 소재)을 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 한 특정 실시양태에서, 세포 배양액을 심층 여과를 통해 청징화하고 (실온에서 수행함), VSV를 여과물에서 회수한다 (실시예 3, 표 1).
(b) 이차 청징화
원심분리 (또는 심층 여과)를 통한 일차 청징화 후, VSV 상등액 (또는 여과물)을 여과, 또는 0.2 내지 0.25 ㎛ 필터를 통한 미세여과에 의해 추가로 청징화하고 (2°), VSV를 여과된 용액에서 회수한다. 한 특정 실시양태에서, 미세여과를 상기 정의된 바와 같이 실온에서 수행한다. 여과/미세여과 배지는 당업자에게 공지된 제조사의 광범위한 각종 물질 및 방법에서 이용가능하다. 예시적인 미세여과 필터 단위로는 밀리포어 밀렉스®-GV 필터 단위 (밀리포어; 미국 메사추세츠주 빌레리카 소재), 밀리포어 밀렉스®-GP 필터 단위, 팔 수포어® 필터 단위 (팔 코포레이션(Pall Corp.); 미국 뉴욕주 이스트 힐즈 소재) 사르토리어스 사르토브란™ 필터 단위 (사르토리어스 코포레이션; 미국 뉴욕주 에지우드 소재) 및 사르토리어스 사르토포어™ 2 필터 단위를 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 이들 여과 단위는 0.2 내지 0.45 ㎛ 크기의 필터를 갖는다. 이들 필터는 적어도 0.2, 0.25, 0.3, 0.35, 0.4 및 0.45 ㎛, 및 그 사이의 분수의 크기의 세공을 갖는 필터를 포함한다. 한 특정 실시양태에서, 필터는 0.2 ㎛ 사르토리어스 사르토브란™ 필터 단위이다. 여과된 VSV를 여과된 용액에서 회수한다.
(c) 음이온 교환 막 흡착
VSV 생성물을 청징화 (즉, 상기 기재된 1°및 2°)에 의해 회수하면, VSV를 음이온 교환 막 흡착제 상에서 추가로 정제한다. 막 흡착제 물질은 당업자에게 익히 공지되어 있으며, 사르토리어스 코포레이션 (미국 뉴욕주 에지우드 소재), 팔 코포레이션 (미국 뉴욕주 이스트 힐즈 소재) 및 시그마-알드리히 코포레이션(Sigma-Aldrich Corp.) (미국 미주리주 세인트 루이스 소재)과 같은 제조자로부터 이용가능하다. 예시적인 음이온 교환 막 흡착제로는 사르토바인드™ Q 막 흡착제 (사르토리어스 코포레이션) 및 무스탕™ Q 막 흡착제 (팔 코포레이션)를 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 한 특정 실시양태에서, 음이온 교환 막 흡착제는 팔 무스탕™ Q 막 흡착제이다. 일반적으로, 통상적인 이온 교환 크로마토그래피로부터 공지된 방법 및 완충제는 당업자에게 공지된 막 흡착제 크로마토그래피에 직접 적용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 음이온 교환 막 흡착제 크로마토그래피를 상기 정의된 바와 같은 실온에서 수행한다.
그러므로, 특정 실시양태에서, 음이온 교환 막 흡착제를 통해 VSV를 정제하며, 여기서 이차 청징화로부터의 VSV 여과된 용액을 제1 pH 완충 염 용액 ("평형화 완충제" 또는 VSV "결합 완충제"라고도 함)으로 평형화된 음이온 교환 막 흡착제 상에 로딩한다. VSV를 음이온 교환 막 흡착제로부터 제2 pH 완충 염 용액 ("용리 완충제")으로 용리하고, 용리된 VSV 분획을 회수한다 (예를 들어, 하기 실시예 6 참조).
특정 실시양태에서, 제1 pH 완충 염 용액 또는 평형화 완충제는 NaCl 또는 KCl 염 용액이다. NaCl 또는 KCl은 약 0.1 M 이상 내지 약 0.4 M의 이온 세기로 용액에 존재한다. 그러므로, 염의 이온 세기는 적어도 0.1, 0.2, 0.3 및 0.4 M, 및 그 사이의 분수의 이온 세기를 포함한다. 한 특정 실시양태에서, 염은 NaCl이고, NaCl 용액의 이온 세기는 0.3 M이다. 완충제 용액은 포스페이트 완충제, N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산 (HEPES) 완충제 또는 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 (TRIS) 완충제일 수 있다. 특정 실시양태에서, 이들 완충제는 약 6.0 내지 약 8.0의 pH, 즉, 적어도 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4, 7.6, 7.8 및 8.0의 pH, 또는 그 사이의 수치의 pH를 갖는다. 한 특정 실시양태에서, 제1 pH 완충 염 용액은 7.5의 pH를 갖는다. 또다른 실시양태에서, 음이온 교환 막 흡착 단계의 제1 완충제는 6.0 내지 8.5의 pKa, 즉 적어도 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4, 7.6, 7.8, 8.0, 8.2, 8.4 및 8.5의 pKa, 또는 그 사이의 수치의 pKa를 갖는다.
특정 실시양태에서, 평형화 완충제는 추가로 약 1％ 수크로스 내지 약 5％ 수크로스를 포함한다. 특정 실시양태에서, 평형화 완충제는 약 1％ 수크로스를 포함한다. 한 특정 실시양태에서, 수크로스 농도는 2％이다. 다른 실시양태에서, 완충제는 약 3％ 수크로스를 포함한다. 다른 실시양태에서, 완충제는 약 4％ 수크로스를 포함한다. 다른 실시양태에서, 완충제는 약 5％ 수크로스를 포함한다. 상기 구체적인 정수 사이의 수크로스 농도의 또다른 퍼센트가 유용하다.
제2 pH 완충 염 용액 ("용리 완충제")은 또한 제1 (평형화) 완충제와 동일한 완충 성분을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 제2 pH 완충 염 용액 또는 평형화 완충제는 NaCl 또는 KCl 염 용액이다. 한 특정 실시양태에서, 제2 pH 완충 염 용액 중 염은 NaCl이다. NaCl 또는 KCl은 약 0.1 M 이상 내지 약 0.4 M의 이온 세기로 용액에 존재한다. 그러므로, 염의 이온 세기는 적어도 0.1, 0.2, 0.3 및 0.4 M, 및 그 사이의 분수의 이온 세기를 포함한다. 한 특정 실시양태에서, 염은 NaCl이고, NaCl 용액의 이온 세기는 0.3 M이다. 완충제 용액은 포스페이트 완충제, N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산 (HEPES) 완충제 또는 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 (TRIS) 완충제일 수 있다. 특정 실시양태에서, 이들 완충제는 약 6.0 내지 약 8.0의 pH, 즉 적어도 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4, 7.6, 7.8 및 8.0의 pH, 또는 그 사이의 수치의 pH를 갖는다. 한 특정 실시양태에서, 제2 pH 완충 염 용액은 7.5의 pH를 갖는다. 또다른 실시양태에서, 음이온 교환 막 흡착 단계의 제2 완충제는 6.0 내지 8.5의 pKa, 즉 적어도 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4, 7.6, 7.8, 8.0, 8.2, 8.4 및 8.5의 pKa, 또는 그 사이의 수치의 pKa를 갖는다.
특정 실시양태에서, 용리 완충제는 추가로 약 1％ 수크로스 내지 약 5％ 수크로스를 포함한다. 특정 실시양태에서, 용리 완충제는 약 1％ 수크로스를 포함한다. 한 특정 실시양태에서, 수크로스 농도는 2％이다. 다른 실시양태에서, 완충제는 약 3％ 수크로스를 포함한다. 다른 실시양태에서, 완충제는 약 4％ 수크로스를 포함한다. 다른 실시양태에서, 완충제는 약 5％ 수크로스를 포함한다. 상기 구체적인 정수 사이의 수크로스 농도의 또다른 퍼센트가 유용하다.
막으로부터 VSV를 용리하기 위해, 용리 완충제의 염 (NaCl 또는 KCl) 농도 (이온 세기)는 선형 기울기에 의해 또는 단일 단계 용리 공정으로 증가된다 (실시예 6). 음이온 교환 막 흡착제로부터 VSV를 용리하는데 두 단계 모두가 동일하게 효과적이다. 한 특정 실시양태에서, 제2 pH 완충 염 용액 중 NaCl의 이온 세기는 0.5 M 내지 0.75 M이다. 다른 특정 실시양태에서, 제2 pH 완충 염 용액 중 NaCl의 이온 세기는 0.6 M이다. 또다른 실시양태에서, 제2 pH 완충 염 용액 중 NaCl의 이온 세기는 0.75 M이다.
특정 다른 실시양태에서, 제2 pH 완충 염 용액은 10 캡슐 부피/분 (CV/분) 내지 30 CV/분의 용리 유속을 갖는다. 그러므로, 특정 실시양태에서, 용리 유속은 적어도 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 내지 30 CV/분, 또는 그 사이의 수치의 속도이다. 특정 실시양태에서, 용리 유속은 20 CV/분이다.
특정 다른 실시양태에서, 제2 pH 완충 염 용액 중 NaCl의 이온 세기는 상기 기재된 바와 같이 10 CV/분 내지 30 CV/분의 용리 유속에서 0.001 M으로부터 0.75 M까지 선형으로 증가된다. 한 특정 실시양태에서, 선형 용리 기울기 유속은 20 CV/분이다.
(d) 접면 유동 여과 (TFF)
음이온 교환 막 흡착제 크로마토그래피에 의한 VSV 정제후, VSV를 접면 유동 여과 (TFF)에 의해 추가로 정제한다. 일반적으로, TFF는 막(들)을 사용하여 액체 용액 (또는 현탁액)에서 성분을 분리시키는 압력 구동 공정이며, 여기서 유체 (공급 유동)를 막의 표면을 따라 접면으로 펌핑하고, 가해진 압력은 막을 통과한 유체의 "부분"을 (막의) 여과물 측으로 가압하는 작용을 한다. 특정 실시양태에서, TFF를 실온에서 수행한다. 이 공정에서, 완충제를 교환하고, VSV를 농축한다. 한 실시양태에서, TFF는 음이온 교환 막 흡착 단계로부터 회수된 VSV를 5회 이상 농축한 후, 1회 이상 완충제를 교환하는 것을 포함한다. 다른 실시양태에서, TFF는 음이온 교환 막 흡착 단계로부터 회수된 VSV를 5회 이상 내지 10회 농축한 후, 5회 이상 또는 6회 이상 완충제를 교환하는 것을 포함한다. 또다른 실시양태는 음이온 교환 막 흡착 단계로부터 회수된 VSV의 농축후, 2회 이상, 3회 이상, 4회 이상, 5회 이상 또는 6회 이상의 완충제 교환을 포함한다.
TFF 물질 (예를 들어, 중공사, 나선형으로 감김, 평면 플레이트) 및 방법 (예를 들어, 한외여과 (UF), 투석여과 (DF), 미세여과)은 당업자에게 익히 공지되어 있다. 특정 실시양태에서, TFF 막은 300 kDa 분자량 컷오프를 갖는다. 특정 실시양태에서, TFF 막은 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650 또는 700 kDa 분자량 컷오프를 갖는다. 또다른 실시양태에서, TFF 막은 750 kDa 분자량 컷오프를 갖는다. 한 실시양태에서, TFF 막은 중공사 막 모듈이다.
한 특정 실시양태에서, TFF의 완충제 교환에서 사용되는 완충제는 상기 기재된 바와 같이 포스페이트 완충제, HEPES 완충제 또는 TRIS 완충제이다. 그러나, 특정 실시양태에서, 완충제는 5 mM 내지 15 mM의 농도, 예를 들어 적어도 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 1O mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM 및 15 mM의 농도, 및 추가로 그 사이의 수치의 mM 농도를 갖는다. 특정 실시양태에서, 완충제는 약 7.2 내지 7.5의 pH를 갖는다. 그러므로, 한 실시양태에서, 완충제는 7.2, 7.3, 7.4 또는 7.5의 pH, 또는 그 사이의 분수의 pH 값을 갖는다. 다른 실시양태에서, 완충제 교환 완충제는 추가로 0.10 M 내지 0.20 M NaCl 및 3.5％ 내지 4.5％ 수크로스를 포함한다.
한 특정 실시양태 (실시예 7 참조)에서, 음이온 교환 막 흡착제 정제로부터의 VSV 분획을 풀링하고, 풀링된 용액을 농축하고, 750 kDa의 분자량 컷오프를 갖는 중공사 TFF 막 카트리지를 사용하는 TFF에 의해 완충제를 교환한다 (지이 헬스케어 바이오-사이언시스 코포레이션(GE Healthcare Bio-Sciences Corp.); 미국 뉴저지주 피스캐터웨이 소재).
(e) 여과
정제에서 마지막 공정 단계는 TFF로부터의 VSV 보유액의 최종 미세여과이며, 여기서 보유액을 0.2 내지 0.25 ㎛ 필터를 통해 여과한다 (미세여과를 통한 이차 청징화에 대해 상기 기재되어 있으며, 하기 실시예 7에 추가로 기재됨). 예를 들어, 이러한 여과 세트는 크기 0.20, 0.21, 0.22, 0.23, 0.24 또는 0.25 ㎛의 필터, 또는 그 사이의 분수의 크기의 필터를 사용할 수 있다.
본원에 기재된 신규 방법에 따른 VSV의 정제는 하기 실시예에 상세히 기재되어 있으며, 실시예는 저속 원심분리 (또는 심층 여과) 및 0.2 내지 0.45 ㎛ 여과를 각각 포함하는, 배양액의 일차 청징화 (실시예 3) 및 이차 청징화 (실시예 4)를 포함한다.
청징화 단계후, 음이온 교환 막 흡착제 (실시예 6); 접면 유동 여과; 한외여과 및 투석여과 (실시예 7) 및 0.2 내지 0.22 ㎛ 여과 (실시예 7)에 의해 순서대로 VSV를 추가로 정제한다. 4개의 대규모 (4.5 L) VSV 세포 배양 실행 (스케일-업 실행)을 또한 본원에 기재된 신규 방법에 따라 정제하였으며 (실시예 8), 여기서 단백질 불순물의 99.9％ 초과 (표 11) 및 DNA의 99.8％ 초과 (표 13)가 각각 정제 중에 제거된다.
III. 재조합 소포성 구내염 바이러스
본원에 기재된 바와 같이, 상기 기재된 신규 정제 방법을 사용함으로써 포유동물 세포 배양물로부터 개선된 순도의 VSV를 얻는다. "개선된 순도"는 정제된 VSV에 세포 배양 단백질 및 핵산 오염물이 90.0％ 이상 없다는 것을 의미한다. 다른 실시양태에서, 개선된 순도의 VSV에는 세포 배양 단백질 및 핵산 오염물이 99.0％ 없다. 한 특정 실시양태에서, 개선된 순도의 VSV에는 세포 배양 단백질 및 핵산 오염물이 99.8％ 없다.
특정 실시양태에서, 상기 기재된 방법에 의해 포유동물 세포 배양물의 세포 배양액으로부터 정제된 소포성 구내염 바이러스 (VSV)는 재조합 또는 유전자 작동된 VSV이다. 재조합 RNA 바이러스, 예컨대 VSV의 제조 방법은 익히 공지되어 있으며, 당분야에서 "구조" 또는 "역전 유전학" 방법이라고 지칭된다. 예시적인 VSV의 구조 방법으로는 미국 특허 제6,033,886호 및 미국 특허 제6,168,943호 (상기 특허는 각각 본원에 참고로 도입됨)에 기재된 방법을 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 바이러스, 예컨대 VSV의 구조를 수행하는 추가 기술은 미국 특허 제6,673,572호 및 제WO 2004/113517호에 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 각각 본원에 참고로 도입된다.
본원에 기재된 신규 정제 방법에 따라 정제되고 단리된, 개선된 순도의 VSV는 특정 혈청형의 VSV일 수 있다. 특정 실시양태에서, 정제된 VSV는 인디애나 혈청형, 뉴저지 혈청형, 산후안 혈청형, 이스파한 혈청형, 글라스고우 혈청형 또는 찬디푸라 혈청형이다. 특정 실시양태에서, VSV는 1종 초과의 상기 혈청형으로부터의 서열을 함유할 수 있다.
본원에 기재된 방법에 따라 정제된 VSV 벡터 (및 그의 면역원성 조성물)는 VSV 게놈내에 1종 이상의 감쇠 돌연변이를 종종 포함한다. 특정 실시양태에서, 정제된 VSV는 VSV의 병원성을 감쇠시키는 1종 이상의 돌연변이를 포함하는 게놈 서열을 갖는다. 다른 실시양태에서, 정제된 VSV는 VSV의 병원성을 감쇠시키는 2종 이상의 돌연변이를 포함하는 게놈 서열을 갖는다. 예를 들어, 감쇠된 VSV는 2종 이상의 공지된 감쇠 돌연변이, 예컨대 본원에 참고로 도입된 국제 특허 출원 제PCT/US2005/011499호 (국제 특허 공개 제WO 2005/098009호)에 기재된 감쇠 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 공지된 VSV 감쇠 돌연변이로는 유전자 셔플링 돌연변이 (VSV 게놈을 형성하는 VSV 유전자의 유전자 셔플링을 포함하며, N, P, M, G 및 L이라고 명명됨), G 단백질 삽입 돌연변이, G 단백질 말단절단형(truncated) 돌연변이, 온도 감수성 (ts) 돌연변이 (및 다른 점 돌연변이), 비-세포변성 M 유전자 돌연변이, G-스템 돌연변이, 앰비센스(ambisense) RNA 돌연변이 및 유전자 결실 돌연변이를 들 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 이들은 각각 국제 공개 제WO 2005/098009호에 상세히 기재되어 있다. 그러므로, 특정 실시양태에서, 정제된 VSV는 온도-감수성 (ts) 돌연변이, 점 돌연변이, 유전자 셔플링 돌연변이, G-스템 돌연변이, 비-세포변성 M 유전자 돌연변이, 앰비센스 RNA 돌연변이, 말단절단형 G 유전자 돌연변이, G 유전자 삽입 돌연변이 및 유전자 결실 돌연변이를 포함하나 이에 제한되지 않는, 하나 이상의 감쇠 돌연변이를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 정제 방법에 의해 정제된 VSV는 하나 이상의 외래 또는 이종 (또는 외래) 폴리뉴클레오티드 서열, 예컨대 외래 RNA 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 포함하는 게놈 서열을 갖는다. 이종 폴리뉴클레오티드 서열은 원하는 바와 같이 다양할 수 있으며, 사이토카인 (예컨대, 인터루킨)을 코딩하는 유전자, T-헬퍼 에피토프를 코딩하는 유전자, CTL 에피토프를 코딩하는 유전자, 아쥬반트를 코딩하는 유전자 및 보조인자를 코딩하는 유전자, 제한 마커를 코딩하는 유전자, 치료 단백질 또는 상이한 미생물 병원성의 단백질 (예를 들어 바이러스, 박테리아, 기생충 또는 진균), 특히 바람직한 면역 반응을 유발할 수 있는 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 상이한 미생물 병원성의 단백질을 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 HIV 유전자, HTLV 유전자, SIV 유전자, RSV 유전자, PIV 유전자, HSV 유전자, CMV 유전자, 엡스타인-바르 바이러스 유전자, 수두대상포진 바이러스(Varicella-Zoster virus) 유전자, 볼거리 바이러스 유전자, 홍역 바이러스 유전자, 인플루엔자 바이러스 유전자, 폴리오바이러스 유전자, 리노바이러스 유전자, A형 간염 바이러스 유전자, B형 간염 바이러스 유전자, C형 간염 바이러스 유전자, 노르와크 바이러스 유전자, 토가바이러스 유전자, 알파바이러스 유전자, 루벨라 바이러스 유전자, 광견병 바이러스 유전자, 마르부르그 바이러스 유전자, 에볼라 바이러스 유전자, 유두종 바이러스 유전자, 폴리오마 바이러스 유전자, 메타뉴모바이러스 유전자, 코로나바이러스 유전자, 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae) 유전자, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae) 유전자, 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 유전자, 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 유전자, 스트렙토코쿠스 아갈락티아에(Streptococcus agalactiae) 유전자, 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis) 유전자, 네이세리아 고노레아에(Neisseria gonorrheae) 유전자, 코리네박테리아 디프테리아에(Corynebacteria diphtheriae) 유전자, 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani) 유전자, 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis) 유전자, 헤모필루스(Haemophilus) 유전자, 클라미디아(Chlamydia) 유전자 및 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 유전자일 수 있다. 특정 실시양태에서, 정제된 VSV는 HIV 유전자 서열을 포함하며, 여기서 HIV 서열은 gag, env, pol, vif, nef, tat, vpr, rev 또는 vpu로 구성된 군에서 선택된다. 한 특정 실시양태에서, HIV 유전자는 gag 또는 env이다.
특정 다른 실시양태에서, 정제된 VSV는 상기 기재된 바와 같은 1종 이상의 감쇠 돌연변이 및 1종 이상의 이종 ORF 둘 모두를 함유한다. 예를 들어, 신규 방법에 따라 정제되고, 하기 섹션 V (실시예 2 내지 8)에 예시된, VSV 면역원성 조성물 (즉, VSVIN N4CT9-gag1)은 2종의 감쇠 돌연변이 및 HIV-1 gag 단백질을 코딩하는 ORF를 포함하는 재조합 VSV이다.
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 신규 방법에 따라 정제된 VSV는 HIV gag 유전자를 코딩하며, 여기서 gag 유전자는 위치 1 (3'gag1-NPMGL-5'), 위치 2 (3'-N-gag2-PMGL-5'), 위치 3 (3'-NP-gag3-MGL-5'), 위치 4 (3'-NPM-gag4-GL-5'), 위치 5 (3'-NPMG-gag5-L-5') 또는 위치 6 (3'-NPMGL-gag6-5')에서 VSV 게놈으로 삽입된다. 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 신규 방법에 따라 정제된 VSV는 HIV env 유전자를 코딩하며, 여기서 env 유전자는 위치 1 (3'-env1-NPMGL-5'), 위치 2 (3'-N-env2-PMGL-5'), 위치 3 (3'-NP-env3-MGL-5'), 위치 4 (3'-NPM-env4-GL-5'), 위치 5 (3'-NPMG-env5-L-5') 또는 위치 6 (3'-NPMGL-env6-5')에서 VSV 게놈으로 삽입된다.
당업자는 다양한 재조합 VSV가 상기 기재된 방법 및 공정에 따라 고안되고 정제될 수 있다는 것을 상기 기재로부터 이해할 것이다.
IV. 면역원성 및 제약 조성물
특정 실시양태에서, 면역원성 조성물은 본원에 기재된 정제 방법에 따라 정제된, 유전자 작동된 VSV의 면역원성 용량을 포함한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 면역원성 조성물은 본원에 기재된 정제 방법에 따라 정제된 재조합 VSV를 포함하며, 여기서 VSV는 복제에 비필수적인 VSV 게놈의 영역으로 삽입되거나 또는 대체하는, 하나 이상의 외래 RNA 서열을 포함한다. 상기 섹션 III에 기재된 재조합 VSV의 임의의 실시양태는 이들 면역원성 조성물에서 사용될 수 있다. 그러므로, 특정 실시양태에서, 정제된 VSV 면역원성 조성물은 포유동물 대상체 (예를 들어, 인간)에게 투여하기 위해 제제화된다.
이러한 조성물은 전형적으로 정제된 VSV 벡터 및 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 하기 사용된 용어 "제약상 허용되는 담체"는 제약 투여에 적합한, 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅물, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함하는 것으로 의도된다. 제약상 활성 물질을 위한 상기 매질 및 작용제의 용도는 당분야에 익히 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 VSV 벡터와 비상용성인 경우만 제외하고, 이러한 매질은 본원에 기재된 면역원성 조성물에서 사용된다. 보충 활성 화합물이 또한 조성물에 혼입될 수 있다.
그러므로, 본원에 기재된 VSV 면역원성 조성물은 그의 의도된 투여 경로에 적합하도록 제제화된다. 투여 경로의 예로는 비경구 (예를 들어, 정맥내, 피내(intradermal), 피하, 근육내, 복강내) 및 점막 (예를 들어, 경구, 직장, 비내, 협측, 질, 호흡기)을 들 수 있다. 비경구, 피내 또는 피하 적용에 사용되는 용액 또는 현탁액에는 하기의 성분들이 포함된다: 멸균 희석제, 예컨대 주사용수, 염수 용액, 고정 오일(fixed oil), 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용매; 항박테리아제, 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 중아황산나트륨; 킬레이트제, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충제, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트, 및 등장성 조정제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스. pH는 산 또는 염기, 예컨대 염산 또는 수산화나트륨으로 조절된다. 비경구 제제는 앰플, 1회용 주사기, 또는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 다회 용량 바이알에 포함될 수 있다.
주사용으로 적합한 제약 조성물에는 멸균 수용액 (수용성인 경우) 또는 분산물 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산물의 임시처방 제제용 멸균 분말이 포함된다. 정맥내 투여를 위한, 적합한 담체에는 생리식염수, 정균처리수, 크레모포어(Cremophor) EL™ (바스프(BASF), 미국 뉴저지주 파시패니 소재) 또는 포스페이트 완충 염수 (PBS)가 포함된다. 모든 경우에서, 조성물은 반드시 멸균이어야 하며, 용이한 주사성이 존재할 정도로는 액상이어야 한다. 제조 및 저장 조건 하에서 반드시 안정해야 하며, 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대하여 보존되어야만 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리콜, 프로필렌 글리콜 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 포함하는 용매 또는 분산 매질이다. 적합한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅물의 사용에 의해, 분산물의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지된다. 미생물의 작용 방지는 각종 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산 등으로 성취된다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어, 당, 다가알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 염화나트륨을 조성물 내에 포함하는 것이 바람직하다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함함으로써 성취된다.
멸균 주사가능한 용액은 상기 언급한 성분들 중 하나 또는 이들의 조합과 함께 적절한 용매 중 필요한 양 (또는 용량)의 VSV 벡터를 혼입시킨 후, 필요하다면 멸균 여과하여 제조한다. 일반적으로, 분산물은 염기성 분산 매질 및 상기 언급한 것들로부터의 기타 필요한 성분들을 함유하는 멸균 비히클에 활성 화합물을 혼입시켜 제조한다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 성분과 그의 사전 멸균 여과 용액으로부터의 원하는 임의의 추가 성분의 분말을 제공하는 동결 건조법 및 진공 건조법이다.
흡입에 의한 투여를 위해서는, 적합한 분사제 (예를 들어, 이산화탄소와 같은 기체 또는 연무기)를 함유하는 가압 용기 또는 디스펜서로부터 에어로졸 스프레이의 형태로 화합물을 전달한다. 전신 투여는 또한 점막 또는 경피 수단에 의해 수행될 수 있다. 점막 또는 경피 투여를 위해서는, 투과되는 장벽에 적절한 투과제를 제형에 사용한다. 이러한 투과제는 일반적으로 당분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 점막 투여를 위해, 계면활성제, 담즙산염 및 후시딘산 유도체가 포함된다. 점막 투여는 비강 스프레이 또는 좌제의 사용을 통해 성취된다. 화합물은 또한 좌제 (예를 들어, 통상적인 좌제 기재, 예컨대 코코아 버터 및 기타 글리세리드) 또는 직장 전달을 위한 정체 관장의 형태로 제조된다.
특정 실시양태에서, 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여량 단위 형태로 경구 또는 비경구 조성물을 제제화하는 것이 유리하다. 하기 사용되는 투여량 단위 형태는 치료되는 대상체에 대한 단위 투여량으로서 적합한 물리적으로 분리되어 있는 단위를 지칭하며; 단위 각각은 필요한 제약 담체와 함께 원하는 치료 효과를 제공하도록 계산된 예정된 양의 활성 화합물을 함유한다. 본원에 기재된 투여량 단위 형태에 대한 세부사항은 활성 화합물의 독특한 특징 및 성취하고자 하는 특정 치료 효과, 및 개체의 치료를 위한 상기 활성 화합물의 배합의 분야에서의 고유의 제한에 따라, 및 이에 의존하여 직접적으로 결정된다.
V. 실시예
하기 실시예는 달리 상세히 기재된 경우를 제외하고는 당업자에게 익히 공지된 통상적인 표준 기술을 사용하여 수행하였다. 하기 실시예는 예시 목적으로 제공되며, 본원에 기재된 조성물 및 방법의 범위를 제한하는 어떠한 방식으로도 해석되어서는 안된다. 실시예 1 및 2는 예시된 모든 3개의 VSV 구축물에 관한 것이다. 실시예 3 내지 9는 구체적으로 구축물 VSVIN N4CT9-gag1에 관한 것이다. 실시예 10 및 11은 구체적으로 구축물 VSVIN N4CT1-gag1에 관한 것이다. 실시예 12는 구체적으로 구축물 VSVNJ N4CT1-gag1에 관한 것이다. 하기 실시예에서 정제된 재조합 VSV (인디애나 혈청형; rVSVIN)는 VSV 게놈의 제1 위치에서 HIV gag 유전자 (gag1), 및 VSV 게놈의 제4 위치로 셔플링된 N 유전자 (N4)를 포함한다. 한 구축물에서, VSV는 말단절단형 세포질 테일을 갖는 G 유전자 ("CT9")를 가지며, 여기서 이 구축물은 "VSVIN N4CT9-gag1"이라고 명명된다. 다른 구축물에서, VSV는 말단절단형 세포질 테일을 갖는 G 유전자 ("CT1")를 가지며, 여기서 이 구축물은 "VSVIN N4CT1-gag1"이라고 명명된다. 다른 실시예에서, 하기 실시예에서 정제된 재조합 VSV (뉴저지 혈청형; rVSVNJ)는 VSV 게놈의 제1 위치에서 HIV gag 유전자 (gag1), VSV 게놈의 제4 위치로 셔플링된 N 유전자 (N4), 및 말단절단형 세포질 테일을 갖는 G 유전자 ("CT1")를 포함하며, 여기서 이 구축물은 "VSVNJ N4CT1-gag1"이라고 명명된다. 이들 구축물 및 돌연변이는 본원에 참고로 도입된 국제 특허 공개 제WO 2005/098009호에 상세히 정의되어 있다.
그러나, 본원에 기재된 신규 정제 방법은 특정 rVSV 구축물 또는 혈청형 (예를 들어, 인디애나, 뉴저지 등)으로 제한되지 않으며, 이와 같이 이들 정제 방법은 야생형 게놈 서열, 감쇠된 게놈 서열, "외래" 핵산 서열, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 VSV 구축물 (예를 들어, 이러한 VSV 구축물의 개관에 대해서 상기 섹션 III 참조)의 정제를 포함한다. 또한, "재조합" RNA 바이러스의 제조 방법은 익히 공지되어 있으며, 당분야에서 "구조" 또는 "역전 유전학" 방법이라고 지칭된다. 재조합 VSV의 예시적인 구조 방법은 상기 섹션 III에 기재되어 있다.
하기 실시예에는 베로 세포로부터의 rVSV (예를 들어, VSVIN N4CT9-gag1, VSVIN N4CT1-gag1 또는 VSVNJ N4CT1-gag1 구축물)의 정제가 기재되어 있다. 그러나, 본원에 기재된 VSV 정제 방법은 인간 배아 신장 (HEK) 세포 (예를 들어, HEK 293 세포), 차이니스 햄스터 난소 (CHO) 세포 및 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는, 임의의 적합한 포유동물 세포 배양물로부터의 VSV의 정제에 동등하게 적용가능하다.
실시예 1: 단백질, DNA 및 VSV 효력 검정법
실시예 2 내지 12에 하기 기재된 정제 방법을 평가하는데 하기 검정법을 사용하였다.
총 단백질 농도. 단백질 표준으로서 소 혈청 알부민 (BSA)과 함께 비신코닌산 (BCA) 검정법 (바이오-라드 래보러토리즈 인크.(Bio-Rad Laboratories Inc.); 미국 캘리포니아주 헤르쿨레스 소재)을 사용하여 총 단백질 농도를 결정하였다.
SDS - PAGE 및 웨스턴 블럿팅 분석. 단백질 분리 및 검출을 위해, VSV 샘플을 트리스-글리신 샘플 완충제와 1:1 (VSVIN N4CT9-gag1 구축물에 대해) 또는 3:1 (VSVIN N4CT1-gag1 구축물에 대해) 비율로 혼합하고, 10분 동안 100℃에서 비등시키고, 4 내지 20％ 트리스-글리신 나트륨 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에 의해 분할한 후, 은 염색 (와코 케미칼스 유에스에이, 인크.(Wako Chemicals USA, Inc.); 미국 버지니아주 리치몬드 소재) 및 콜로이드 쿠마시(Coomassie)® 블루 염색 (인비트로젠 코포레이션(Invitrogen Corp.); 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)으로 이중 염색하였다. 이중 염색의 감수성은 VSV 샘플에서 고분자량 불순물을 용이하게 검출하는 것을 가능하게 하였다.
겔 전기영동 후, 단백질을 니트로셀룰로스 막 (아머샴 바이오사이언시스 코 포레이션(Amersham Biosciences Corp.); 미국 뉴저지주 피스캐터웨이 소재)으로 전기영동으로 이동시켰다. 3％ BSA를 함유하는 트리스-완충 염수 (TBS)에서 1시간 동안 차단 후, 막을 항체 용액 (BHK 세포로부터 생성된 토끼 항-VSV 폴리클로날 항체를 함유하는 0.05％ 트윈(Tween)-20 (TTBS)를 갖는 TBS 중 1％ BSA, 1:1000 v/v)에서 인큐베이션하고, 양고추냉이 퍼록시다제 (HRP, 1:1000 (v/v)) (바이오-라드 래보러토리즈 인크.; 미국 캘리포니아주 헤르쿨레스 소재)와 접합된 염소 항-토끼 항체로 프로빙하였다. TTBS 및 TBS로 세척한 후, 검출을 위해 HRP 컬러 현상 시약 (바이오-라드 래보러토리즈 인크.; 미국 캘리포니아주 헤르쿨레스 소재)을 첨가하고, 반응물을 증류수로 켄칭하였다. 염색된 겔 및 현상된 막을 알파이지에프씨(AlphaEaseFC)® 소프트웨어로 알파이미저(AlphaImager)® 이미징 시스템 (알파 이노테크 코포레이션(Alpha Innotech Corp.); 미국 캘리포니아주 샌 린드로 소재)을 통해 포획하였다.
크기-배제 고성능 액체 크로마토그래피 ( SE - HPLC ). 불순물 단백질로부터 VSV를 급속하게 분리하기 위해 크기 배제-HPLC 프로토콜을 개발하였으며, 이에 의해 VSV 정제 방법의 정량 분석이 가능하였다. 그러므로, "공정 중간의" VSV 샘플 (100 ㎕) 및 정제된 벌크 농축물 VSV (100 ㎕)를 분석용 크기 배제 컬럼 (TSK-Gel PW 컬럼 G6000PWXL, 입자 크기 17μ, 세공 크기 1000 Å) (토쇼 바이오사이언시스 엘엘씨.(Tosho Biosciences LLC.); 미국 펜실베니아주 몽고메리빌 소재) 상에 로딩하고, PBS 완충제 (Ca2 + 또는 Mg2 + 비함유)으로 평형화하고, 분당 1 mL의 유속으로 현상하였다. 켐스테이션(ChemStation)™ 소프트웨어 (아길런트 테크놀로지스 인크.(Agilent Technologies Inc.); 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)에 의해 제어되는 아길런트(Agilent) 1100™ 용매 전달 시스템으로 시스템에 동력을 공급하였다. 포토다이오드 검정법 검출기를 통해 UV 스펙트럼을 수집하고, 215 nm에서 UV 흡광도를 모니터링함으로써 크로마토그램을 얻었다.
VSV 효력 검정. 2개의 상이한 방법, 전통적인 플라크 검정법 및 면역형광 플라크 검정법을 통해 VSV 효력을 정량하였다. 전통적인 플라크 검정법을 위해, 1 x 106개 세포/웰 (2 mL 세포 배양물/웰)의 농도에서 6-웰 플레이트 상에 DMEM + 10％ FBS 중 베로 세포를 접종하고, 밤새 37℃에서 인큐베이션하였다. 전면 단일층이 형성되었음을 확인하기 위해 그 다음날에 세포를 체크하였다. 양성 및 음성 대조군과 함께 비공지된 역가의 바이러스 샘플을, DMEM + 10 ml/L 피루브산나트륨 + 0.5 ml/L 겐타마이신에서 예상되는 역가 범위로 1:10으로 계열 희석하였다. 양성 대조군은 공지된 역가의 VSV 표준이었다. 음성 대조군 (또는 블랭크)은 배지만을 함유하였다. 세포 배지를 6-웰 플레이트로부터 흡인한 후, 희석된 바이러스 (0.5 ml 바이러스 용액/웰)를 웰에 이중으로 첨가하였다. 바이러스를 실온에서 15분 동안 흡착시킨 후, 32℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포 단일층 함수를 유지 하기 위해 5분 내지 10분 마다 손으로 플레이트를 살살 흔들었다. 아가로스 (5O℃에서) 및 DMEM (37℃에서, 10 ml/L 피루브산나트륨 및 0.5 ml/L 겐타마이신)을 1:4 비율로 합하여, 한천 중층 배지를 생성하였다. 바이러스를 플레이트로부터 흡인하 고, 반복기 피페트를 사용하여 웰 당 중층 3 ml를 첨가하였다. 중층 플레이트를 후드하에 실온에서 냉각한 후 이동시켜, 플라크가 명확히 보일 때까지 (대략 직경 1 mm 이상) 또는 72시간 동안 32℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 광원으로 가져가서 플라크를 계수하였다. 얻어진 플라크 개수를 사용하여 샘플 각각에 대해 역가를 결정하고, ml 당 플라크 형성 단위 (PFU)로 나타내었다.
베로 세포 단일층 (48-웰 플레이트)을 VSV로 감염시킴으로써 제2 검정법 (면역형광 플라크 검정법)을 수행하였다. 24시간 내지 36시간 후, 베로 세포를 고정시키고, 사용된 구축물에 의존하여, VSVIN 또는 VSVNJ에 대한 모노클로날 항체로 먼저 프로빙한 후, 형광 염료에 접합된 이차 항체로 프로빙하였다. 형광 현미경검사법을 사용하여 감염성 입자를 정량하여, 베로 세포 단일층 내의 형광 중심(foci)을 검출하였다. 형광 중심을 계수하고, 샘플의 역가를 1 mL당 감염성 단위 (IU) 또는 플라크 형성 단위 (PFU)로서 나타내었다.
잔류 DNA 검정법. 피코그린(PicoGreen)® 콴티티(Quant-iT)™ DNA 미세검정법 키트 (인비트로젠 코포레이션; 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)를 사용하여 숙주 세포 DNA를 시험하고 정량하였다. 제조자의 지시사항에 따라 표준으로서 람다 DNA를 사용하여 미세검정법을 수행하였다.
실시예 2: 베로 세포 배양물에서 VSV 의 생성
베로 세포 (아프리카 원숭이 신장 세포) 미세담체 배양을 사용하여, 10-L 생물반응기에서 VSV 실험 실행을 생성하였다. 사용된 베로 세포는 cGMP 마스터 셀 뱅크(Master Cell Bank)로부터 얻었다. 사이토덱스(Cytodex)™ I 미세담체 (아머샴 바이오사이언시스 코포레이션; 미국 뉴저지주 피스캐터웨이 소재) 상에서 베로 세포를 7.5 그램 건조 비드/리터의 밀도로 성장시켰다. 생물반응기 배양을 위한 작동 부피는 5.5 내지 6.5 리터였다. 접종을 위해, 베로 세포를 사이토덱스™ I 미세담체와 대략 2 리터의 총 부피로 합하였다. 배양물의 표적 접종 밀도는 5 x 105개 세포/ml이었다. 이 감소된 부피에서 2시간 간헐적 교반 주기를 수행하여, 미세담체로의 세포 부착을 촉진시켰다. 배양물을 5분 동안 40 rpm에서 교반한 후, 4개의 완전 주기를 위해 20분 동안 0 rpm에서 정치시켰다.
간헐적 교반후 배양물을 샘플링하고, 부착이 만족스러우면, 바이러스 생성 혈청-비함유 배지 (VP-SFM)를 배양물에 5.5 또는 6.5-리터 작업 부피까지 첨가하였다. 37℃ 및 40 rpm에서 2 내지 4 x 106개 세포/ml로 세포를 성장시켰다. 공기를 50 ㎤/분으로 중층으로 일정하게 공급하였다. 이산화탄소 및 산소를 요구시 중층에 50 ㎤/분으로 공급하였다. 배양물의 산소 요구가 중층에 의해 제공되는 것을 초과하는 경우, 소결 분사기를 통해 6 ㎤/분의 초기 속도로 배양물로 산소를 첨가하였다. 산소 요구가 증가함에 따라 속도를 수동으로 증가시켰다. pH 7.30의 배양 설정값을 사용하여, 이산화탄소 (산성) 및 7.5％ 중량/부피 중탄산나트륨 용액 (염기성)을 사용하여 pH를 제어하였다. 대략 48시간의 경과 배양 시간에서 개시하여 1일 당 배양물 부피의 절반을 신선한 배지로 배양물을 관류하였다. rVSV에 의한 베로 세포의 감염은 32℃ 및 0.01의 감염다중도 (MOI)에서 유발되었다. 세포로 의 바이러스 흡착을 촉진하기 위해, 바이러스를 생물반응기 배양물로 첨가한 직후 1-시간 간헐적 교반 주기를 수행하였다. 6분 동안 40 rpm에서 배양물을 교반한 후, 2개의 완전 주기를 위해 24분 동안 0 rpm에서 정치시켰다. 1시간의 간헐적 교반후, 감염의 나머지는 40 rpm에서 배치 방식으로 진행시켰다. 감염된 배양물을 6 내지 16시간 마다 샘플링하여, 정상 역학 결정을 위해 세포변성 효과 (CPE)를 관찰하고, 세포를 계수하고, 바이러스 상등액 샘플을 수집하였다.
미세담체를 정치시키고, 배양액 상등액을 수집함으로써 VSVIN N4CT9-gag1에 대해 감염후 대략 44시간에, VSVIN N4CT1-gag1에 대해 감염후 대략 48시간에, 및 VSVNJ N4CT1-gag1에 대해 감염후 대략 60시간에, 세포 배양물을 수확하였다. 후자 구축물을 위해, 2개의 생물반응기로부터 세포 배양액을 합하였다.
실시예 3: VSV 정제 방법: VSV IN N4CT 9 - gag1 에 대한 VSV 세포 배양액의 일차 청징화
생물반응기로부터 세포 배양물을 수확한 후, 세포/세포 파쇄물 및 다른 미립자 불순물을 "생성물 회수"로서 공지된 공정에서 제거하였다. VSV가 베로 세포로부터 배양액으로 분비되기 때문에, 청징화된 배양액에서 VSV를 회수하였다. 그러므로, VSV 세포 배양액 상등액 (예를 들어, 10 L 생물반응기 실행으로부터 약 4.0 내지 4.5 L)을 심층 여과 또는 저속 원심분리에 의해 청징화하였다.
심층 여과를 통한 청징화를 실온에서 수행하고, 여과물에서 VSV를 회수하였다. 하기 심층 여과 모듈을 시험하였다: 와트만® 폴리캡™ HD 모듈 (와트만 인 크.; 미국 뉴저지주 플로람 파크 소재), 사르토리어스 사르토클리어™ P 모듈 (사르토리어스 코포레이션; 미국 뉴욕주 에지우드 소재), 밀리포어® 밀리스택+® HC 모듈 (밀리포어; 미국 메사추세츠주 빌레리카 소재) 및 CUNO 05/60HP (큐노 인크.(CUNO Inc.), 3M® 캄파니, 미국 코네티컷주 메리덴 소재). 필터가 포화될 때까지 (여과물 대략 100 내지 500 ml) 심층 필터를 여과물로 로딩하였다.
심층 여과 모듈의 청징화 효율은 혼탁도계에 의해 결정하였으나, 바이러스 회수율은 바이러스 플라크 검정법에 의해 평가하였다. 하기 표 1은 상이한 심층 필터의 수행을 요약한다.
높은 바이러스 회수율은 와트만 폴리캡 HD 75를 사용하여 성취할 수 있었다. 그러나, 스케일-업 제조에서, 낮은 혼탁도 제거 효율 및 낮은 필터 용량이 관찰되었다. 그의 바이러스 생성물 회수율의 평가를 기초로 하는 청징화 공정에서 사용하기 위해 여러 제조자로부터의 다른 필터를 선택할 수 있었다.
Figure 112008079669773-PCT00001
베크만(Beckman) 원심분리 (4.5 L의 총 부피에서 5x1 L 원심분리 병) 상에서 6,238 x g (5,000 rpm)에서 30분에서 실온에서 저속 원심분리를 통한 청징화를 수행하였으며, 여기서 상등액에서 VSV를 회수하였다. 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 와트만 폴리캡™ HD75 모듈을 통한 심층 여과와 비교하여, 더 높은 혼탁도 제거 효율 및 등가의 생성물 회수율을 저속 원심분리에 의해 성취하였다.
Figure 112008079669773-PCT00002
실시예 4: VSV 정제 방법: VSV 세포 배양액의 이차 청징화
상기 실시예 3에 기재된 일차 청징화 후, 혼탁도 수준을 감소시키기 위해 상등액 (또는 여과물)을 추가로 가공하였다 (이차 청징화). 밀리포어 밀렉스®-GV 필터 단위 (밀리포어; 미국 메사추세츠주 빌레리카 소재), 밀리포어 밀렉스®-GP 필터 단위, 팔 수포어® 필터 단위 (팔 코포레이션; 미국 뉴욕주 이스트 힐즈 소재), 사르토리어스 사르토브란™ 필터 단위 (사르토리어스 코포레이션; 미국 뉴욕주 에지우드 소재) 및 사르토리어스 사르토포어™ 2 필터 단위를 비롯한, 여러 멸균 미세여과 필터 (0.2 내지 0.25 ㎛)를 평가하였다 (표 3). 최적 필터는 VSV 결합 용량을 제한해야 하나 (또는 제한하지 않아야 하나), 가능한 많은 미립자 오염물을 제거해야 한다.
선택된 미세여과 필터를 위한 공급물 (출발 물질)로서 접종전 생성으로부터의 VSV를 사용하였으며, 이는 1 x 수크로스 포스페이트 글루타메이트 (SPG)로 스파이크하였다. 제조자에 의해 제공된 프로토콜에 따라 동일한 공급물을 여과하였다. 청징화된 세포 배양 물질의 양이 제한되기 때문에, 스케일-업 필터 대신에 주사기 또는 디스크 필터를 사용하였다. 하기 표 3에 나타낸 바와 같이, 팔 수포어® 및 사르토리어스 사르토브란™ 멸균 필터에 의해 최고의 VSV 역가 회수율을 성취하였다.
Figure 112008079669773-PCT00003
사르토리어스 사르토브란™ 필터 단위를 사용하여 VSV의 이차 청징화를 추가로 평가하였으며, 그 결과는 하기 표 4에 요약되어 있다.
Figure 112008079669773-PCT00004
표 4의 데이타는 실험 2 및 실험 3의 용액 혼탁도가 허용되는 수준의 회수율과 함께 추가로 감소되었음을 나타낸다. 또한, 이들 실험에서, 1x SPG를 공급 용액으로 첨가한 것 (즉, 실험 2: 역가 회수율 85.9％ 및 실험 3: 역가 회수율 110％)이, SPG가 첨가되지 않은 실험 1과 비교하여 (역가 회수율 65.8％) VSV 생성물 회수의 수율을 유의하게 개선한다는 것이 확립되었다.
실시예 5: VSV 정제 방법: 컬럼 크로마토그래피
실시예 4에 기재된 이차 청징화 단계 후, 여러 크로마토그래피 수지를 사용하여 VSV 여과물의 정제를 시험/스크리닝하였다. VSV 입자는 오염물 단백질에 대해 상대적으로 크기가 크기 때문에, 유엔오스피어(UNOsphere)™ Q 음이온 교환 수지 (바이오-라드 래보러토리즈 인크.), 유엔오스피어™ S 양이온 교환 수지 (바이오-라드 래보러토리즈 인크.), CHT 세라믹 히드록시아파타이트 유형 I 수지 (바이오-라드 래보러토리즈 인크.), CFT 세라믹 플루오로아파타이트 유형 I 수지 (바이오-라드 래보러토리즈 인크.) 및 CST I 혼합 방식 수지 (지이 헬스케어(GE Healthcare))를 비롯한, 큰 세공 크기를 갖는 수지만을 평가하였다. 비교를 위해, 2종의 친화성 수지, 마트렉스™ 셀루핀® 술페이트 수지 (밀리포어) 및 헤파린 세파로스 수지 (지이 헬스케어)를 또한 평가하였다. 실험을 배치 방식으로 실온에서 수행하였다. 여러가지 세척 및 용리 조건으로부터 샘플을 수집하고, SDS-PAGE 및 플라크 검정법에 의해 분석하였다.
VSV가 중성 pH에서 유엔오스피어™ Q 음이온 교환 수지에만 결합한다는 것이 초기 실험에서 유엔오스피어™ Q 음이온 교환 및 유엔오스피어™ S 양이온 교환 수지에서 관찰되었으며, 이는 VSV가 중성 pH에서 음전하라는 것을 표시한다.
바이오- 라드 ® 유엔오스피어 ™ Q 음이온 교환 수지 상에서의 VSV 정제의 평가. 유엔오스피어™ Q 수지로 충전된 컬럼 상에 청징화된 VSV를 로딩하였다. 컬럼 상에서 VSV 생성물 및 불순물 단백질 간에 식별가능한 분리는 없었으며, 바이러스의 많은 부분은 10 mM 인산나트륨 완충제에서 2 M NaCl로 용리한 후에도 여전히 컬럼에 결합되어 있었다 (데이타 나타내지 않음).
바이오- 라드 ® 세라믹 히드록시아파타이트 유형 I ( CHT I) 수지 상에서의 VSV 정제의 평가. VSV는 히드록시아파타이트 컬럼에 효율적으로 흡착되었다. 오염물 단백질로부터의 VSV의 소정의 분리는 SDS-PAGE에 의해 관찰되었으나 (데이타 나타내지 않음), VSV의 상당한 부분은 0.8 M 인산나트륨 (pH 6.88)으로 용리한 후에도 컬럼 상에 결합된 상태로 남아있었으며, 여기서 결합된 VSV는 1 M NaOH 세정 단계 중에 컬럼으로부터 최종적으로 용리되었다.
다른 실험에서, 0.9 M 인산칼륨 완충제를 용리 완충제로서 사용하였다. VSV 및 불순물 단백질 간의 분리는 거의 성취되지 않았다 (데이타 나타내지 않음). VSV의 많은 부분은 컬럼에 결합된 상태로 남아있었으며, 컬럼으로부터 용리시키는데 1.0 M NaOH가 필요하였다. 세라믹 플루오로아파타이트 (CFT) 유형 I 수지 및 CST I 수지에서 유사한 결과 (즉, 불량한 VSV/오염물 단백질 분리 및 수지에 대한 강한 VSV 결합)를 관찰하였다.
마트렉스 ® 셀루핀 ™ 술페이트 친화성 수지 상에서의 VSV 정제의 평가. 청징화된 VSV 공급 용액을 평형화전 (1.47 mM 인산칼륨, 8.06 mM 인산나트륨, 140 mM NaCl, pH 7.0) 셀루핀™ 술페이트 컬럼 (캡슐 부피 (CV) = 2 ml)에 3 ml/분의 유속으로 로딩하였다. 포스페이트 완충 염수 (1.47 mM 인산칼륨, 8.06 mM 인산나트륨, 140 mM NaCl, pH 7.0)인 평형화 완충제 10 CV로 컬럼을 세척하였다. 유동 및 세척을 풀링하였다. 그 후, 30 CV 선형 기울기로 10 mM 인산나트륨, 1.5 M NaCl, pH 7.0으로 흡착된 물질을 용리하였다. SDS-PAGE 분석은 용리 중에 불순물 단백질 및 바이러스 간의 분리가 효율적이지 않았으며, VSV가 모든 컬럼 용리 분획에서 관찰되었다 (데이타 나타내지 않음)는 것을 나타내었다. 다량의 VSV가 또한 컬럼 상에 남아있었다. 총 VSV 생성물 회수율 (즉, 수집된 모든 용리 분획으로부터; F3-F25)은 단지 45.2％ (표 5)이었다. 유사한 결과 (즉, 낮은 VSV 회수율)가 헤파린 세파로스 수지에서 관찰되었다.
Figure 112008079669773-PCT00005
실시예 6: VSV 정제 방법: 음이온 교환 막 흡착제
상기 실시예 5에 기재된 바와 같이, VSV 회수율은 이차 청징화 단계 (즉, 0.2 ㎛ 사르토브란™ 필터)로부터의 여과물을 유엔오스피어™ Q 수지, 유엔오스피어™ S 수지, CHT I 수지, CFT I 수지, CST I 수지, 셀루핀® 수지 또는 헤파린 세파로스 수지로 정제한 경우 상대적으로 낮았다. 그러므로, 실시예 4로부터의 VSV 여과물의 정제는 2종의 음이온 교환 막 흡착제; 사르토바인드™ Q 막 흡착제 (사르토리어스 코포레이션; 미국 뉴욕주 에지우드 소재) 및 무스탕™ Q 막 흡착제 (팔 코포레이션; 미국 뉴욕주 이스트 힐즈 소재)를 사용하여 추가로 평가하였다.
사르토바인드 ™ Q 막 흡착제 상에서의 VSV 정제
막 흡착제 정제를 위한 VSV 공급물 (출발 물질)은 접면 유동 여과 (TFF) 분리 (750 kDa의 분자량 컷오프를 갖는 TFF 막을 사용함)로부터의 보유액이었다. 그 후, TFF 분리로부터의 VSV 보유액 (VSV 및 불순물/오염물 단백질 및 DNA를 포함함)은 4℃ 또는 -70℃에서 저장하였다.
초기 사르토바인드™ Q 막 흡착제 연구는 4℃에서 저장된 VSV 보유액으로 수행하였으며, 여기서 20 mM HEPES (pH 7.1)를 평형화 완충제로서 사용하고, 보유액을 사르토바인드™ Q 막 흡착제 (2.1 ml 막 부피)에 흡착하였다. 불순물 단백질을 20 mM HEPES (pH 7.1) 및 1.0 M NaCl의 용리 완충제로 효율적으로 용리하였다 (데이타 나타내지 않음). 그러나, VSV 역가는 어떠한 용리 분획에서도 회수되지 않았다. 완충제를 HEPES로부터 인산나트륨 완충제로 바꾸었으나, 포스페이트 용리 완충제 중 높은 (1.5 M) NaCl 농도에서조차 유사한 결과가 관찰되었다 (즉, 수집된 분획 중 VSV 역가 없음).
대조적으로, -70℃에서 저장된 VSV 보유액을 출발 물질로서 사용하고 사르토바인드™ Q 막 흡착제 (20 mM HEPES, pH 7.1으로 평형화됨)에 흡착한 경우, 용리 분획 (용리 완충제 20 mM HEPES 및 1.0 M NaCl)에서 VSV가 관찰되었으며, 여기서 BCA 결과를 기초로 하여 유동 및 세척 풀에서 단백질 불순물의 74.2％가 관찰되었다 (데이타 나타내지 않음). 총 단백질에 대한 질량 균형 분석은 하기 표 6에 나타낸다.
-70℃ VSV 출발 물질을 위한 30％ 완충제 B에 대해 선형 용리 기울기를 사용한 경우, 크로마토그램에서 2개의 주요 피크가 관찰되었다 (데이타 나타내지 않음). 완충제 A (평형화 완충제)는 10 mM 인산나트륨 (pH 7.0) 및 0.3 M NaCl이었다. 완충제 B (용리 완충제)는 10 mM 인산나트륨 (pH 7.0), 2.0 M NaCl 및 10 mM 수크로스이었으며, 여기서 30％ B는 대략 0.81 M NaCl이었다.
제1 피크는 상대적으로 높은 순도를 갖는 VSV (분획 4-10)이었다. 제2 피크는 숙주 DNA 오염물 (분획 11-20)이었다. 피코그린® 검정법 결과 (데이타 나타내지 않음)는 잔류 숙주 DNA의 97.3％가 사르토바인드™ Q 막 흡착제에 의해 제거되었음을 나타내었다. 그러므로, 이들 데이타는 사르토바인드™ Q 막 흡착제가 VSV 생성물로부터 숙주 DNA 오염물을 제거하는데 효율적인 방법을 제공한다는 것을 나타낸다. 그러나, VSV 역가 검정법으로부터의 결과 (데이타 나타내지 않음)는 사르토바인드™ Q 정제 방법으로부터의 VSV 회수율이 바이러스 역가에 의해 30％ 미만이었음을 나타내었다. 동일한 출발 물질로 무스탕™ Q 막 흡착제를 사용하는 경우 더 높은 VSV 회수율이 관찰되었다.
Figure 112008079669773-PCT00006
무스탕™ Q 막 흡착제 상에서의 VSV 정제
무스탕™ Q 막 흡착제를 또한 VSV 정제 수단으로서 연구하였다. 무스탕™ Q 흡착제에 대한 작동 조건은 최적이었으며, 하기 기재되어 있다.
수크로스는 무스탕™ Q 막으로부터 용리된 VSV 의 회수 수율을 개선한다. 무스탕™ Q를 위해 조건을 최적화한 경우 초기 관찰은 크로마토그래피 완충제에 수크로스를 포함시키는 것의 중요성이었다. 예를 들어, 수크로스가 함유된 제제화된 완충제 (도 2A 및 2B) 및 수크로스가 함유되지 않은 제제화된 완충제 (도 3A 및 3B)로 병렬식 정제 실험을 수행하였다. 하기 크로마토그래피 완충제를 사용하였다: 완충제 A (평형화 완충제)는 10 mM 인산나트륨 (pH 7.0) 및 300 mM NaCl이었다. 완충제 B (용리 완충제)는 함유 및 비함유 (즉, +/- 2％ 수크로스) 10 mM 인산나트륨 (pH 7.0), 1 M NaCl이었다.
두 실험 (즉, +/- 2％ 수크로스)에서, 높은 순도의 VSV 생성물을 얻었다. 플라크 검정법 (데이타 나타내지 않음)은 수크로스가 완충제에 포함된 경우 VSV 회수율이 유의하게 높았음 (32.8％ 대 19.0％)을 표시하였다.
완충제 pH 및 무스탕™ Q 막으로의 VSV 결합. 3개의 상이한 완충제 pH 범위 (pH 6.5, 7.0 및 7.5)를 평가하여, 무스탕™ Q 막으로의 VSV 결합을 위한 최적 완충제 pH를 결정하였다. 이들 실험에서, 청징화후 조건화된 신선한 세포 배양물을 10 mM 인산나트륨 완충제 (pH 6.5), 10 mM 인산나트륨 완충제 (pH 7.0) 또는 10 mM 인산나트륨 완충제 (pH 7.5)로 평형화된 무스탕™ Q 막 상에 로딩하였다 (완충제는 각각 300 mM NaCl 및 2％ 수크로스를 또한 포함함).
단계 용리 (용리 완충제: 10 mM 인산나트륨 (pH 6.5, 7.0 또는 7.5), 720 mM NaCl 및 2％ 수크로스)에 의해 분당 3.5 ml (10 CV/min)의 유속으로 VSV를 막으로부터 용리하였다. 무스탕™ Q로부터 용리된 VSV의 순도 (SDS-PAGE 및 웨스턴 블럿팅에 의해 결정함; 데이타 나타내지 않음)는 시험된 완충제 pH 각각에 대해 비교가능하였다. 그러나, pH 6.5에서, 크로마토그래피 공정 중에 유동, 세척 및 용리 단계에서 상당한 양의 VSV가 분산되었으며, 이와 같이, 이 pH에서 용리 풀에서 더 낮은 VSV 역가 회수율이 관찰되었다 (하기 표 7 참조).
Figure 112008079669773-PCT00007
이온 세기 및 무스탕™ Q 막으로의 VSV 결합. 10 mM 인산나트륨 결합 (평형화) 완충제 중 2개의 상이한 NaCl 농도 (0.15 M NaCl 및 0.3 M NaCl)를 무스탕™ Q 막으로의 VSV 흡착에서 시험하였다. VSV 및 불순물 단백질 간의 우수한 분리는 0.3 M NaCl에서 관찰되었다. 예를 들어, 0.3 M NaCl을 인산나트륨 결합 완충제에서 사용한 경우, 고분자량 오염물이 유동 풀에서 제거되었으며, 여기서 VSV는 막에 결합된 상태로 남아있었다 (데이타 나타내지 않음).
이온 세기 및 무스탕™ Q 막으로부터의 VSV 용리. 선형 기울기 용리에 의해 용리 완충제 (완충제 B) 이온 세기 (즉, 용리 완충제 중 NaCl 농도)를 결정하였으며, 여기서 용리 완충제 (완충제 B)의 농도는 3.5 ml/분의 유속으로 30 CV에서 0％로부터 60％까지 증가되었다. 평형화 완충제 (완충제 A)는 10 mM 인산나트륨, pH 7.1, 300 mM NaCl이고, 용리 완충제 (완충제 B)는 10 mM 인산나트륨, pH 7.1, 2 M NaCl, 10 mM 수크로스이었다. 무스탕™ Q 막 흡착제로부터 73.3％ VSV를 용리하는데 0.6 M의 NaCl 농도가 필요하다는 것이 크로마토그램으로부터 관찰되었다 (데이타 나타내지 않음).
선형 기울기 용리 대 단일 단계 용리. 선형 기울기 용리 (상기 기재됨) 및 "단일 단계" 용리 전략 (데이타 나타내지 않음) 둘 모두로부터 고품질 VSV 생성물을 얻었다. 단일 단계 용리 방법은 평형화 완충제 (완충제 A; 예를 들어, 10 mM 인산나트륨, pH 7.1, 300 mM NaCl) 및 용리 완충제 (완충제 B; 예를 들어, 10 mM 인산나트륨, pH 7.1, 2 M NaCl, 10 mM 수크로스)를 포함하였다. 선형 기울기 용리와 대조적으로, 단일 단계 용리 방법은 특정 최종 염 농도에서 완충제 B를 동시에 첨가함으로써 (예를 들어, 0.6 M의 최종 NaCl 농도에서 완충제 B를 동시에 첨가함으로써) 막 흡착제로부터 VSV를 용리하였다. 단일 단계 용리 방법은 불순물 단백질의 99％ 초과를 제거하였으며 (BCA 검정법; 데이타 나타내지 않음), 여기서 VSV의 70 내지 95％를 용리된 분획에서 회수하였다 (플라크 검정법; 데이타 나타내지 않음). 그러므로, 이 단순한 일 단계 용리 전략을 사용하여 높은 VSV 역가를 얻었기 때문에, 단일 단계 용리 방법을 본원에서 사용할 것이다.
작동 유속. 2개의 상이한 유속, 즉, 10 캡슐 부피 (CV)/분 및 20 CV/분을 연구하였다. 어떠한 유속에서도 정제 방법 수행에서 변화가 관찰되지 않았다.
벤조나제 ( Benzonase )® 처리. 벤조나제® 뉴클레아제는 유전자 조작된 엔도뉴클레아제이다. 이는 모든 형태의 DNA 및 RNA (단일 가닥, 이중 가닥, 선형 및 원형)를 분해하나, 단백질분해 활성은 없다. 높은 특정 활성으로 광범위한 조건에 걸쳐 효과적이다. 그러므로, 벤조나제® 뉴클레아제는 핵산 오염에 대한 FDA 지침에 부합하므로 재조합 생성물로부터의 핵산의 제거에 이상적이다.
벤조나제® 뉴클레아제가 VSV 정제 방법 및 최종 VSV 정제된 벌크 농축물에서의 DNA 수준을 유의하게 감소시킨 것으로 관찰되었다. 그러나, 무스탕™ Q 막 흡착제 상에서의 정제 전에 벤조나제® 뉴클레아제의 첨가는 바이러스 역가의 감소를 야기하였다 (데이타 나타내지 않음). 대조적으로, 막 크로마토그래피 정제 단계후 벤조나제® 뉴클레아제 처리는 동일한 효과를 갖지 않았다 (즉, 역가 감소가 관찰되지 않음).
그러나, 본원에 기재된 완전한 VSV 정제 방법 (예를 들어, 도 1 참조)이 세포 배양 오염의 99％ 초과를 제거하기 때문에, 최종 VSV 정제된 벌크 농축물 중 DNA 수준은 벤조나제® 뉴클레아제 처리없이 세부사항 미만이었다 (예를 들어, WHO 세부사항 <10 ng/용량). 그러므로, 벤조나제® 뉴클레아제 처리는 VSV 정제 방법에서 사용될 필요가 없으며, 이는 전통적인 바이러스 생성물/바이러스 백신 정제 방법 (벤조나제® 뉴클레아제 처리를 필요로 함)과 비교하여 유의한 개선이었다.
무스탕™ Q 결합 용량. 작은 부피 (0.35 ml 부피)의 무스탕™ Q 막 흡착제 (즉, 무스탕™ Q 코인)를 사용하는 VSV 파괴에 의해 무스탕™ Q 막 흡착제의 결합 용량을 결정하였다. 무스탕™ Q 코인 상에 조건화된 세포 배양액을 로딩하고 정제하는 경우, UV 흡수 불순물의 유동때문에 UV 흡광도에 의해 VSV 파괴를 측정할 수 없다는 것이 초기에 관찰되었다. 그러므로, 이 실시예에서, VSV 유동 분획을 수집하고, VSV를 SDS-PAGE 및 VSV 역가 검정법에 의해 검출하였다. 무스탕™ Q 평형 완충제는 10 mM HEPES pH 7.5, 0.3 mM NaCl, 및 2％ 수크로스이었다.
놀랍게도, 무스탕™ Q 코인 상으로의 세포 배양액 400 ml의 로딩 후 (VSV 배양액 역가는 6.9 x 106/ml임)에도 통상적인 크로마토그래피 1％ 파괴가 도달되지 않았다 (하기 표 8 참조). 그러나, 표 8에 나타낸 바와 같이, 무스탕™ Q 코인을 배양액 샘플 400 ml로 로딩하는 경우, 유동에서 더 높은 VSV 역가가 관찰되었다. 또한, 로딩 부피가 400 ml에 도달하는 경우, 코인에서 시차 압력이 1.8 Bar로 증가하였다. 그러므로, 이 실험으로부터, 무스탕™ Q 막 흡착제 0.35 ml 당 조건화된 배양액 350 ml가 필터 로딩 용량이었으며, 이는 세포 배양물 500 ml/막 흡착제 ml와 등가라는 결론을 내렸다. 대안으로, 무스탕™ Q 결합 용량을 또한 6.9 x 109 pfu/막 ml로서 기재할 수 있다. 3개의 균일성 실행에서, 실제 로딩 용량 (바이러스 역가)은 이 결합 용량보다 약간 더 높았으며, 이는 공정 수행에 영향을 미치지 않았다. 그러므로, 이 데이타는 결정된 결합 용량이 보존적 용량 수치이며, 이와 같이 스케일-업 제조 생성에서 용이하게 사용될 수 있다는 것을 나타내었다.
Figure 112008079669773-PCT00008
무스탕™ Q 막 흡착제 결론. 무스탕™ Q 막 흡착제에 의해 높은 회수율을 갖는 고품질 VSV 생성물을 성취하였다. "전통적인" 크로마토그래피 공정과 비교하여, 무스탕™ Q 정제 방법 (또한, 간단하고 효율적인 방법임)은 여러 장점을 갖는다. 예를 들어, 상기 방법은 수크로스 기울기 초원심분리에 의한 정제보다 더 높은 품질의 VSV 생성물을 수득한다 (예를 들어, 도 5A 및 5B 참조). 또한, (a) 무스탕™ Q 막 흡착제의 높은 결합 용량은 더 적은 공정 기기 및 더 적은 생산 비용을 의미하고, (b) 시험된 다른 크로마토그래피 수지에 대해 상대적으로 더 높은 유속은 증가된 처리량 및 생산성을 야기하고, (c) 1회용 무스탕™ Q 막 흡착제 단위는 세정 확인 및 저장기간 확인의 필요성을 제거한다.
하기는 상기 개발되고 기재된 무스탕™ Q 작동 조건을 요약한다: (a) 로딩 용량 = 무스탕™ Q 막 흡착제 밀리리터 당 세포 배양물 0.5 L, (b) 유속 = 분당 20 캡슐 부피 (CV), (c) VSV 결합 pH = pH 7.5 + 0.1 pH 단위, (d) VSV 결합 이온 세기 = 0.3 ± 0.2 M 염; (e) VSV 용리 = 15 CV에서의 단계 기울기, 및 (f) VSV 용리 이온 세기 = 0.7 M 염.
실시예 7: VSV 정제 방법: 접면 유동 여과, 연마, 완충제 교환
접면 유동 여과 (TFF) 한외여과/투석여과 (UF/DF) 시스템을 사용하여 VSV 농도 및 완충제 교환을 수행하였다. 무스탕™ Q 막 흡착제로부터의 VSV 용리 풀은 높은 (0.7 M NaCl) 염 농도를 갖는 10 mM HEPES 완충제이었으며, 미량의 불순물을 여전히 가졌다. 그러므로, UF/DF 단계는 적절한 생성물 제제화 완충제에서 잔류 불순물의 제거 및 최종 VSV 생성물의 제조에 필수적이었다.
5개의 무스탕™ Q 실험 실행으로부터 용리 풀을 합하고, 이 실험에서 사용하였다. 750 kDa의 분자량 컷오프를 갖는 16 ㎠ 중공 TFF 막 카트리지를 사용하였다 (지이 헬스케어 바이오-사이언시스 코포레이션, 미국 뉴저지주 피스캐터웨이 소재). 풀링된 용액을 먼저 10 ml로 농축하였다. 포스페이트 완충 염수 (10 mM 인산칼륨 완충제 (PBS) (pH 7.1) 및 138 mM NaCl)에서 5회의 (5x) 완충제 교환을 수행하였다.
공정 중간의 샘플을 위한 SDS-PAGE 분석은 정제된 VSV가 보유액 및 헹굼액에만 존재하고, 투과물 중 VSV 손실이 은 염색 또는 웨스턴 블럿팅 분석에 의해 검출되지 않았음을 (데이타 나타내지 않음) 나타내었다. SDS-PAGE 데이타는 VSV 공정 회수율이 허용가능하고, 불순물이 완충제 교환 각각 후 점차 제거되었음 (데이타 나타내지 않음)을 나타내었다. 잔류 불순물을 완전히 제거하기 위해, 총 5회 내지 6회의 완충제 교환이 필요하였다.
UF / DF 작동 조건 최적화. TFF UF/DF 수행에 대한 완충제 조성물의 효과를 연구하였다. 동일한 무스탕™ Q 용리 풀을 모든 실험을 위한 공급물로서 사용하였다 (표 9). 먼저, 3개의 실험을 16 ㎠ 중공사 TFF 막 (지이 헬스케어 바이오-사이언시스 코포레이션) 상에서 수행하였으나, 마지막 실행은 420 ㎠ TFF 막 (지이 헬스케어 바이오-사이언시스 코포레이션)으로 완료하였다. 모든 실험에 대해, 생성물 품질은 유사하였다 (SDS-PAGE 분석 및 SE-HPLC를 기초로 함).
Figure 112008079669773-PCT00009
사용된 완충제와 독립적으로, 투석여과 투과물에서 관찰된 VSV 생성물은 없었다 (SDS-PAGE/은 염색을 기초로 함; 데이타 나타내지 않음). 그러나, 총 단백질 및 DNA 검정법은 로딩된 약 34 내지 41％ 총 단백질 및 로딩된 33 내지 40％ DNA가 먼저 3-투석여과 부피에서 제거되었음을 나타내었다. 완충제 교환과 관련하여, 5 투석여과 부피 (DV)는 투과물 전도성을 만족스러운 수준으로 감소시키는데 충분하였다.
그러므로, 하기 TFF UF/DF 작동 조건을 다음과 같이 개발하였다:
(a) TFF 막 카트리지: 중공사 TFF 카트리지 (750 kDa),
(b) TFF 막 용량: 95 L 세포 배양/㎡,
(c) 작동 압력: p1 = 3-4 psig; p2 = 1-2 psig; TMP = 1.5-2.5 psig,
(d) 작동 온도: 실온,
(e) 교차 유속: 700 LMH,
(f) 투과물 환류: > 30 LMH, 및
(g) PBS + 4％ 수크로스 (10 mM 인산칼륨, 138 mM NaCl, pH 7.2)로 5x 농축 및 6x 투석여과;
여기서, p1은 입구 압력이고, p2는 출구 압력이고, TMP는 막횡단 압력이고, LMH는 리터/㎡ 시이다.
실시예 8: VSV 정제 방법: 최종 여과
VSV 정제 방법에서 마지막 단계는 상기 기재된 TFF 정제된 물질의 최종 여과이었다. 분당 100 ml의 유속으로 0.2 ㎛ (0.45/0.2 ㎛) 사르토리어스 사르토브란™ 필터 단위 (사르토리어스 코포레이션; 미국 뉴욕주 에지우드 소재)를 사용하여, VSV 생성물의 최소 손실로 가능한 생물적재량을 제거하였다. 완충제는 10 mM 인산칼륨 (pH 7.1 내지 7.3), 138 mM NaCl 및 7.5％ 수크로스이었다.
실시예 9: VSV IN N4CT 9 - gag1 구축물을 위한 VSV 스케일-업 정제
4개의 4.5 L 스케일-업 실행 (즉, 세포 배양물 부피)을 수행하였다. 이들 스케일-업 실행의 요약은 하기 표 10 및 표 11, 및 도 6에 나타낸다. SDS-PAGE (데이타 나타내지 않음), 총 단백질 (표 11), 바이러스 역가 (표 10 및 도 6) 및 SE-HPLC (데이타 나타내지 않음)를 비롯한 검정법을 수행하였다. 도 1에 기재된 공정을 사용하여, 스케일-업 실행 각각에서 일정한 공정 수행 (즉, VSV 생성물 품질) 및 불순물 제거를 성취하였다.
Figure 112008079669773-PCT00010
Figure 112008079669773-PCT00011
VSV 스케일-업 정제 방법의 분석
본원에 기재된 신규 VSV 정제 방법 (예를 들어, 도 1 참조)의 개발의 목적은 정제된 VSV 생성물의 높은 회수율로 높은 순도 VSV를 생성시키는 것이었다. 하기 분석은 4개의 4.5 L 세포 배양 스케일-업 실행에 기초하여 VSV 정제 및 안정성을 기재한다.
SDS - PAGE 분석 및 불순물 단백질 제거. 정제 방법의 중요한 측면은 VSV 생성물로부터 세포 배양 불순물 단백질을 고갈 (또는 제거)시키는 것이었다. 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이, 본원에 예시된 rVSVIN 구축물은 rVSVIN N4CT9-gag1 구축물이었다. VSV 생성물을, 그의 주요 바이러스 단백질, M (27 kDa), N/P (49 kDa), G (55 kDa) 및 L (250 kDa)을 검출함으로써 모니터링하였다. VSV 단백질 중에서, M 및 N/P 단백질이 G (CT9) 및 L 단백질보다 더 높은 수준으로 발현되었으며, 여기서 L 단백질 수준이 가장 낮았다. 그러므로, G 및 L 단백질에 비해 SDS-PAGE 겔 분석에서 매우 더 강한 밴드로 M 및 N/P 단백질이 관찰되었다. 모든 실험에서, 동일한 샘플 부피를 겔에 로딩하였다 (달리 언급되지 않는 한). 또한, 은 염색 또는 쿠마시® 염색과 같은 단일 단백질 검출 방법 대신에, 은/쿠마시® 블루 이중 염색을 사용하였으며, 이에 의해 더 감수성 단백질 검출을 제공하였다.
스케일-업 실행 번호 4에 대한 SDS-PAGE 분석 (도 4A 및 4B)은 대부분의 숙주 단백질이 세포 파쇄물의 제거를 통해 저속 원심분리의 일차 청징화 단계에서 제거되었다는 것을 나타내었다 (도 4A, 4B, 레인 1 및 2). BCA 분석을 기초로, 총 단백질의 91.5％가 제거되었으며, 이는 저속 원심분리가 유의한 불순물 제거 단계라는 것을 나타낸다.
원심분리로부터의 상등액을 10 mM HEPES 완충제 (1x 수크로스 포스페이트 글루타메이트 (SPG; 7.5％ 수크로스, 10 mM 인산칼륨, 5 mM 글루타메이트)의 첨가후 pH 7.5), 0.465 M NaCl 및 2％ 수크로스 (도 4A, 4B, 레인 3)로 희석하였으며, 여기서 희석으로 인해 더 밝은 염색 밴드를 관찰하였다. 그 후, 희석된 용액을 0.2 ㎛ 필터를 통해 펌핑하여, 임의의 남은 미립자 오염물을 제거하였다 (이 단계에서 불순물 단백질은 제거되지 않았음; 도 4A, 4B, 레인 4). VSV 여과물을 무스탕™ Q 단계를 위한 공급물로서 수집하고, 막 흡착제 상에 로딩하였다.
남은 불순물 단백질의 99.5％ 초과를 무스탕™ Q 막 흡착제 상에서 제거하였다 (표 11). SDS-PAGE 분석에 의해 불순물 단백질의 제거를 관찰하였으며 (도 4A, 4B, 레인 4 및 5), 여기서 높은 품질 VSV 생성물을 무스탕™ Q 막으로부터 용리하였다 (도4A, 4B, 레인 6).
용리된 VSV를 농축하고, PBS 완충제 (+ 7.5％ 수크로스)로 투석여과하였다. 남은 단백질 불순물의 48％ 초과를 UF/DF 정제 단계에서 제거하였으며 (표 11), 여기서 매우 강한 VSV 단백질 밴드를 검출하였다 (도 4A, 4B, 레인 7). UF/DF 투과물 풀에서 오직 미량의 불순물 단백질을 관찰하였다 (도 4A, 4B, 레인 8). 최종 0.2 ㎛ 여과 전에 및 후에, VSV 단백질 품질 또는 불순물 단백질 프로파일과 관련하여 검출가능한 변화는 없었다 (도 4A, 4B, 레인 9 및 10).
새로 개발된 공정으로부터의 VSV 정제된 벌크 농축물은 또한 수크로스 기울기 원심분리를 통한 정제와 비교하여 더 높은 순도 및 낮은 잔류 수준을 나타내었다. 예를 들어, 새로 개발된 공정으로부터의 VSV 단백질의 염색 밴드 (M, N, P, G 및 L) (도 5A, 5B, 레인 9)는 수크로스 기울기 원심분리를 통해 정제된 VSV의 염색 밴드 (도 5A, 5B, 레인 11) (덜 강한 불순물 단백질 염색 밴드)보다 더 강하였으며, 이는 더 높은 품질 VSV 생성물이 도 1에 기재된 신규 정제 방법에 의해 성취되었음을 나타낸다. 모든 4개의 스케일-업 실행에서, 불순물 단백질 프로파일 및 VSV 단백질 밴드의 강도를 기초로 하여 유사한 생성물 품질을 성취하였다 (데이타 나타내지 않음).
크기 배제-고성능 액체 크로마토그래피 ( SE - HPLC ) 분석. VSV를 위한 SE-HPLC 분석을 개발하였으며 (실시예 1 참조), 이는 불순물 단백질로부터 VSV를 분리하고, VSV 정제 방법을 정량적으로 분석하는, 단순하고 편리한 방법을 제공한다. 컬럼을 보호하기 위해, 청징화된 샘플만을 컬럼에 주입하였다. VSV는 7.5분의 체류 시간으로 용리 피크로서 컬럼 밖으로 흘러나왔다 (데이타 나타내지 않음). 오염물/불순물 단백질 피크 (더 긴 컬럼 체류 시간을 갖음)는 VSV 피크 후에 컬럼으로부터 용리하였으므로, VSV 생성물로부터 배제/제거될 필요가 있다. 대부분의 불순물을 무스탕™ Q 유동 및 세척에서 제거하였으며, 이는 SDS-PAGE 분석의 결과를 확인하였다. UF/DF 단계에서, 완충제 관련 불순물을 제거하고, VSV는 임의의 투과물에서 손실되었다 (데이타 나타내지 않음). 최종 0.2 ㎛ 여과 후, VSV 생성물은 7.5분의 체류 시간으로 단일 주요 피크로서 SE-HPLC 컬럼으로부터 용리한 후, 완충제 블랭크에 상응하는 2개의 더 작은 피크 (데이타 나타내지 않음)가 용리하였다.
잔류 숙주 DNA 의 제거. 세포 배양 (숙주 세포) DNA는 재조합 기술을 사용하는 정제 방법에서 주요 오염물 중 하나이다. VSV 정제된 벌크 농축물 중 잔류 DNA 수준은 10 ng/용량 (107 pfu) 미만이어야 한다. 4개의 스케일-업 실행을 위한 DNA 제거 프로파일은 하기 표 12에 요약되어 있으며, 여기서 일정한 DNA 제거는 정제 단계 각각에서 성취하였다. 생성물 회수 단계 (즉, 저속 원심분리에 의한 1°청징화 후, 0.2 ㎛ 여과에 의한 2°청징화) 및 무스탕™ Q 막 흡착제 단계에서 주요 DNA 청소율을 관찰하였다. 잔류 DNA의 80％ 초과는 무스탕™ Q 단계에서 제거되었으며, UF/DF 단계에서 60％ 초과의 DNA 청소율을 성취하였다. 총 DNA 제거율 퍼센트는 모든 4개의 스케일-업 실행에서 99.89 ± 0.03％이었다. 또한, 잔류 DNA 수준은 10 ng/용량보다 훨씬 미만이었다 (표 13).
Figure 112008079669773-PCT00012
Figure 112008079669773-PCT00013
Gag 단백질의 제거. Gag 단백질 농도를 ELISA에 의해 결정하였으며, 이는 VSV 생성물 중 잔류 Gag 수준을 정의하는 데이타를 제공하였다. 정제 방법에서 Gag 단백질의 프로파일은 하기 표 14에 요약되어 있다. 대부분의 Gag 단백질은 이차 청징화 단계 (즉, 0.2 ㎛ 여과) 및 무스탕™ Q 막 흡착제 단계에서 제거되었다. 잔류 Gag 단백질 수준은 하기 표 15에 나타낸 바와 같이, 최종 정제된 벌크 농축물 중 0.08 내지 8.93 ng/용량 (107 pfu)의 범위였다.
Figure 112008079669773-PCT00014
Figure 112008079669773-PCT00015
실시예 10: VSV IN N4CT 1 - gag1 구축물을 위한 VSV 스케일-업 정제
VSVIN N4CT1-gag1 구축물을 위한 정제 방법 개발은 초기에 세포 배양액 (<106 pfu/ml) 중 낮은 생성물 역가로 시도하였으며, 이는 최종 정제된 벌크 농축물 중 낮은 생성물 역가 및 높은 DNA 오염을 야기하였다. 그러나, VSVIN N4CT9-gag1를 위한 실시예 9에 기재된 정제 방법을, 이 VSV 구축물 및 10-L 규모 (세포 배양물 부피)로 스케일-업으로 성공적으로 적용하였다. 이 정제 방법을 통해 고품질 VSV 생성물을 제조하였다.
정제 방법에서, 일차 및 이차 청징화 단계는 실시예 3 및 4에 기재된 단계와 실질적으로 유사하였다. 무스탕™ Q 흡착제를 사용하는 음이온 교환 막 흡착 단계를 다음과 같이 최적화하였다. 중공사 막 카트리지 (지이 헬스케어; 미국 뉴저지주 피스캐터웨이 소재)으로 퀵스탠드(Quixstand)™ 또는 플렉스탠드(Flexstand)™ 시스템을 사용하여 접면 유동 여과를 수행하였다. 750 kDa의 분자량 컷오프 (MWCO)를 갖는 GE 폴리에테르술폰 한외여과 막을 또한 이 연구에서 시험하였다. 모든 막은 420 ㎠ 또는 1200 ㎠의 명목상의 여과 표면적을 가졌다. 팔 무스탕™ Q 막 흡착제 (팔 코포레이션; 미국 뉴욕주 이스트 힐즈 소재)로 AKTA™ 익스플로러(explorer) 및 AKTA파일럿(AKTAPilot)™ 시스템 (지이 헬스케어; 미국 뉴저지주 피스캐터웨이 소재)을 사용하여 막 크로마토그래피 실험을 수행하였다.
VSV IN N4CT 1 - gag1 을 위한 제1 무스탕™ Q 정제 시험
VSVIN N4CT9-gag1 정제 방법에서 기재된 바와 동일한 완충제 및 작동 조건을 사용하여 무스탕™ Q 흡착 단계를 수행하였다. 요약하면, 세포 및 파쇄물을 먼저 원심분리를 통해 제거하였다. 1:9 비율 (v/v)로 10X 수크로스 포스페이트 글루타메이트 (SPG)의 첨가, 및 10 mM HEPES, 0.465 M NaCl, pH 7.5, 2％ 수크로스로 2배 희석 후, 0.2 ㎛ 필터를 통해 용액을 펌핑하였다. 평형화전 팔 무스탕™ Q 막 흡착제 (0.35-ml 캡슐 부피) 상에 여과물을 로딩하고, 유동 & 세척 (FT&W) 풀을 수집하였다. VSVIN N4CT9-gag1 공정에 기재된 바와 동일한 용리 조건을 사용하여 VSV 생성물을 용리 풀에서 회수하였다. 높은 품질 바이러스 생성물을 얻었다 (데이타 나타내지 않음). 그러나, 바이러스 생성물의 1/3을 FT&W 풀에서 관찰하였으며 (표 16), 무스탕™ Q 용리 풀 중 바이러스 역가는 생물반응기 중 낮은 바이러스 생성 역가로 인해 매우 낮았다 (VSVIN N4CT1-gag1에 대해 4.6 x 105 pfu/ml, 대 VSVIN N4CT9-gag1에 대해 >1.0 x 107 pfu/ml).
Figure 112008079669773-PCT00016
무스탕™ Q 흡착제 상의 이 구축물에 대한 결합 조건을 다음과 같이 추가로 최적화하였다. 실험 고안은 하기 표 17에 요약되어 있다. 모든 실험에서, VSVIN N4CT9-gag1로부터 이전 경험을 기초로 하여 6.5 내지 7.5의 로딩 및 용리 pH를 선택하였다. 로딩 완충제 중 NaCl 농도는 0.28 내지 0.32 M 범위였으나, 실험에서 0.6 내지 0.7 M의 용리 완충제 중 NaCl 농도를 선택하였다. 유속은 3.5 내지 10.5 ml/min이었으며, 이는 10 내지 30 캡슐 부피 (CV)/min과 등가이었다.
Figure 112008079669773-PCT00017
SDS-PAGE 분석을 기초로 하여 모든 무스탕™ Q 용리 풀에서 고품질 VSV 생성물을 관찰하였다 (나타내지 않음). 이 단계에서의 불순물 단백질 제거 결과는 도 7에 나타낸다. 불순물 단백질의 99％ 초과는 이 단일 단계에서 제거되었으며, 이는 VSVIN N4CT9-gag1 정제 방법에서보다 더 높은 수치였다. 용리 풀에서의 공정 회수율 및 잔류 숙주 DNA 검정법의 결과는 하기 표 18에 요약되어 있다. 용리 풀 중 잔류 DNA 수준은 모든 실험에서 매우 낮았으며, 이는 DNA 청소율이 이 공정에서 문제점이 아니었다는 것을 나타낸다. 그러나, 역가 회수율은 실험 조건에 의존하여 다양하였다.
Figure 112008079669773-PCT00018
플라크 검정법에 의해 결정된 바이러스 역가로부터 공정 회수율을 계산하였다. 로딩 완충제 pH가 6.6 내지 7.5의 범위이고 NaCl 농도가 0.28 내지 0.30 M인 경우, 윤곽 플롯에 나타낸 바와 같이 허용되는 공정 회수율을 성취하였다 (데이타 나타내지 않음). 최적 로딩 완충제 조건은 1O mM HEPES 중 0.29 M NaCl, 2％ 수크로스, pH 7.0이었다. pH 조절이 공급 조건화에서 바람직하지 않다는 것을 고려하여, pH 7.5가 무스탕™ Q 평형화 완충제 pH에 대해 허용되는 것으로 고려하였다. 동시에, 0.60 내지 0.70 M NaCl 및 pH 6.75 내지 7.25를 무스탕™ 용리 완충제 조건으로서 결정하였다. 최적 용리 완충제 조건은 10 mM HEPES, 0.65 M NaCl, 2％ 수크로스, pH 7.0이었다. 무스탕™ Q 완충제 조건은 하기 표 19에 요약되어 있다. 이들 개발된 조건에서, 용리 풀 중 DNA 오염물이 허용되는 수준으로 감소되었다 (데이타 나타내지 않음).
Figure 112008079669773-PCT00019
추가 실험은 이들 결과와 일치하였으며, 특정 실시양태에서, 0.28M 내지 0.30 M NaCl 및 pH 7.2 내지 7.5가 높은 생성물 회수, 및 용리 풀 중 DNA 오염물의 허용되는 감소를 확실하게 하는 바람직한 결합 완충제 조건이었다는 것을 나타내었다.
실시예 11: VSV IN N4CT 1 - gag1 구축물을 위한 VSV 스케일-업 정제
소규모의 3개의 확인 실행을, 상기 개발된 무스탕™ Q 조건을 사용하여 동일한 공급 물질로 완료하였다. 평형화 완충제는 10 mM HEPES, 0.29 M NaCl, pH 7.5, 2％ 수크로스인 반면; 용리 완충제는 10 mM HEPES, 0.65 M NaCl, pH 7.0, 2％ 수크로스였다. 동일한 작동 조건을 모든 실행에서 유지하였다: 동일한 유속, 동일한 로딩 부피 및 동일한 용리 부피. 실험 결과는 하기 표 20에 요약되어 있다. 역가 검정법 결과로부터 계산된 생성물 회수율을 기초로 하여, 매우 일정한 공정 수행을 성취하였다.
Figure 112008079669773-PCT00020
VSV IN N4CT 1 - gag1 정제 방법 스케일-업, 균일성 실행 및 기술 이전
미세담체의 제거후 VSVIN N4CT1-gag1을 함유하는 세포 배양액을 전체 정제 방법에서 출발 물질로서 사용하였다. 공정은 세포 배양액을 저속 원심분리에 의해 청징화하고 상등액에서 VSV를 회수하는 단계; 0.45/0.2 ㎛ 필터를 통해 상등액을 여과하고 여과된 용액에서 VSV를 회수하는 단계; VSV 여과된 용액을 음이온 교환 막 흡착제 상에 로딩하고 용리 풀에서 VSV 생성물을 회수하는 단계; 상기 회수된 VSV를 750 kDa 분자량 컷오프 막을 사용하는 접면 유동 여과 (TFF)를 이용하여 정제하고 보유액에서 VSV를 회수하는 단계; 및 최종적으로 0.2 ㎛ 필터를 통해 VSV 보유액을 여과하고 여과된 용액에서 VSV를 회수하는 단계를 포함하였다. 3개의 6-L 스케일-업/균일성 실행 (CR) 및 1개의 10-L 실행 (TTR)을 성공적으로 완료하였다. 실험 조건은 하기 표 21에 요약되어 있다.
Figure 112008079669773-PCT00021
실험 결과는 하기 표 22 및 23에 요약되어 있다. 공정을 위한 전형적인 SDS-PAGE 분석을 수행하였다 (데이타 나타내지 않음). 상이한 실행 중에 단계 회수율의 다양성은 효력 검정법 (플라크 검정법)의 다양성으로 인한 것이었다. 전체 공정 수율은 수행된 실행과 일치하였다. 단백질 및 DNA 불순물의 일치된 제거율이 관찰되었다. 모든 실행에서, 고품질 바이러스 생성물이 생성되었다.
Figure 112008079669773-PCT00022
Figure 112008079669773-PCT00023
VSVIN N4CT1-gag1을 위한 정제 방법은 높은 품질 생성물의 생성에 성공적이었다. 정제 조건을 일정한 공정 수행으로 10-L 규모 (세포 배양물 부피)까지 규모화하였다. 플라크 검정법으로부터의 VSV 역가를 기초로 하는 전체 공정 수율은 VSVIN N4CT9-gag1 및 VSVNJ N4CT1-gag1로부터 성취된 수율보다 낮았다. 주요 역가 손실이 최종 0.2 ㎛ 여과에서 및 또한 가능하게 무스탕™ Q 단계에서 관찰되었다. 비특이적 결합은 특히 연구가 저역가 출발 물질에 의해 시도되는 경우 손실을 설명할 수 있었다. 역가가 낮을수록, 바이러스의 더 많은 부분이 필터에서 손실되었다. 세포 배양물에서 VSV 역가를 증가시키는 것은 좋은 해결책이었다. 정제 방법에서의 바이러스 역가 손실의 감소 및 바이러스-생성물에 사용하기 용리한 완충제 시스템의 선택을 위해 사용하기 위한, 여러가지 완충제 성분, 부형제 및 작동 조건은 과도한 실험의 필요성 없이 당분야의 기술 내에 있다고 여겨지는 이 정제 시스템에 대한 변형이다.
실시예 12: VSV NJ N4CT 1 - gag1 구축물을 위한 VSV 스케일-업 정제
실시예 9에 기재된 VSVIN N4CT1-gag1을 위한 정제 방법은 이 VSV 구축물에 성공적으로 적용되었으며, 10-L 규모 (세포 배양물 부피)까지 스케일-업되었다. 이 정제 방법을 통해 고품질 VSV 생성물을 제조하였다.
정제 방법에서, 일차 및 이차 청징화 단계는 실시예 3 및 4에 기재된 바와 실질적으로 유사하였다. 무스탕™ Q 흡착제를 사용하는 음이온 교환 막 흡착 단계를 다음과 같이 최적화하였다. 중공사 막 카트리지 (지이 헬스케어; 미국 뉴저지주 피스캐터웨이 소재)가 장착된 퀵스탠드™ 또는 플렉스탠드™ 시스템을 사용하여 접면 유동 여과를 수행하였다. 750 kDa의 분자량 컷오프 (MWCO)를 갖는 GE 폴리에테르술폰 한외여과 막을 이 연구에서 시험하였다. 모든 막은 420 ㎠ 또는 1200 ㎠의 명목상 여과 표면적을 가졌다. 팔 무스탕™ Q 막 흡착제 (팔 코포레이션; 미국 뉴욕주 이스트 힐즈 소재)가 장착된 AKTA™ 익스플로러 및 AKTA파일럿™ 시스템 (지이 헬스케어; 미국 뉴저지주 피스캐터웨이 소재)을 사용하여 막 크로마토그래피 실험을 수행하였다.
VSVNJ N4CT1-gag1을 위한 제1 무스탕™ Q 정제 시험은 VSVIN N4CT9-gag1 정제 방법에 기재된 동일한 작동 조건을 사용하여 SDS-PAGE 분석에 기초하는 높은 품질 생성물을 제조하였다. 그러나, 생성물 용리 풀에서 높은 잔류 DNA 수준이 검출되었다. 막 크로마토그래피를 사용하여, 높은 정제율 및 고품질 VSV 생성물을 성취하기 위해, 무스탕™ Q 결합 및 용리 조건을 개발하였다. 하기 작동 조건을 사용하여, 소규모 실행, 및 스케일-업/균일성 실행을 비롯한 나중 실험에서 높은 공정 수행 균일성이 나타났다. 정제 방법을 또한 임상 시험 물질 제조를 위한 생산 대행 기업 (CMO)으로 성공적으로 이전하였다.
VSV NJ N4CT 1 - gag1 을 위한 제1 무스탕™ Q 정제
VSVIN N4CT1-gag1 정제 방법에 기재된 바와 동일한 완충제 및 작동 조건, 및 세포 배양액을 사용하여, 무스탕™ Q 단계를 수행하였다. 요약하면, 세포 및 파쇄물을 원심분리를 통해 제거하였다. 1X 수크로스 포스페이트 글루타메이트 (SPG)의 첨가, 및 10 mM HEPES, 0.465 M NaCl, pH 7.5, 2％ 수크로스로 2배 희석에 의한 조건화 후, 0.2 ㎛ 필터를 통해 상등액을 펌핑하였다. 평형화전 무스탕™ Q 막 흡착제 상에 여과물을 로딩하고, 유동 및 세척 풀을 수집하였다. VSVIN N4CT9-gag1 정제 방법에 기재된 바와 같은 용리 완충제 및 작동 조건을 사용하여 VSV 생성물을 수득하였다. 10 mM HEPES, 1.0 M NaCl, pH 7.5, 2％ 수크로스를 사용하여 재생물로부터 풀을 또한 수집하였다. 최종적으로, 무스탕™ Q를 1.0 M NaOH 용액으로 세정하였다. 실험에서 높은 VSV 결합 용량이 관찰되었다. 그러나, 용리 풀에서 매우 적은 생성물만을 회수하였다 (데이타 나타내지 않음). 재생 풀에서 바이러스 생성물을 우세하게 검출하였으며, 바이러스 생성물의 절반 이상은 회수되지 않았다 (표 24 참조). 용리 및 재생 풀 둘 모두에서 높은 수준의 DNA 오염물을 검출하였다. 생성물 회수율을 증가시키고 동시에 잔류 DNA 수준을 감소시키는 이 새로운 구축물에 대해, 무스탕™ Q에 대한 결합 및 용리 조건을 추가로 최적화하였다.
Figure 112008079669773-PCT00024
상기 기재된 바와 같이, 최종 생성물로부터의 잔류 DNA 청소율에 의해 VSVIN N4CT9-gag1 정제를 시도하였다. 추가 조건 최적화를 위해 머크(Merck) KGaA™ TMAE 및 팔 무스탕™ Q 를 사용하였다.
TMAE ™ 수지를 사용한 VSV 정제 개발
하기 표 25에 나타낸 바와 같은 완전 공장 실험 고안을 사용하여, TMAE™ 수지 상의 VSV 결합 완충제 조건 스크리닝을 수행하였다. 공급물은 상이한 로딩 완충제 조건으로 조절된 세포 배양 상등액이었다. 웨스턴 블럿팅 분석을 사용하여 유동에서 VSV을 모니터링하였다.
Figure 112008079669773-PCT00025
웨스턴 블럿팅 분석에 의해 나타낸 바와 같이 (나타내지 않음), 평형화 완충제 중 NaCl 농도가 200 mM에 도달한 경우, 유동 풀에서 상당한 양의 VSV가 관찰되었다. TMAE 상의 적당한 VSV 결합 용량을 얻기 위해, 평형화 완충제 중 NaCl 농도는 200 mM 미만이어야 한다. VSV의 결합 행동은 시험된 pH 조건 내에서 극적으로 영향받지 않았다. 그러나, 용리 풀 중 VSV 회수의 분석 (TMAE 용리 풀의 SE-HPLC 피크 통합 구역에 의해 예측함) (도 8A, 8B 및 8C)은 동일한 결합 NaCl 농도에서 더 높은 용량이 더 높은 pH 조건 (pH 7.5 대 pH 7.0 및 6.5)에서 성취되었음을 나타내었다.
TMAE 컬럼을 사용한 VSV 정제 시험
5000 rpm에서 30분 동안 20 내지 24℃에서의 원심분리를 통해 VSVIN N4CT9-gag1을 함유하는 세포 배양액으로부터 세포 및 세포 파쇄물을 제거하였다. 9 대 1의 비율로 10X SPG 스톡 용액과 혼합한 후, 0.45/0.2 ㎛ 필터를 통해 상등액을 펌핑하였다. 여과물을 4 ml/min의 유속으로 TMAE 컬럼 (2 ml)으로 공급으로서 사용하였다. 컬럼을 10 mM HEPES, 0.145 M NaCl, 2％ 수크로스, pH 7.4으로 예비평형화하였다. 평형화 완충제의 10 컬럼 부피 (CV)로 컬럼을 조사한 후, 30 CV 중 10 mM HEPES, 1.5 M NaCl, 2％ 수크로스, pH 7.5로 선형 기울기를 통해 컬럼으로부터 결합된 물질을 용리하였다. 상이한 용리 풀을 수집하였다.
Figure 112008079669773-PCT00026
SDS-PAGE 겔 전기영동법 (나타내지 않음)은 용리 프로파일에서 2개의 주요 피크의 관찰을 수행하였다. 제1 피크 F1은 낮은 UV254/280 비율을 가졌으며, 이는 더 높은 단백질/바이러스 함량을 나타낸다. 제2 피크 F2는 높은 UV254/280 비율을 가졌으며, 이는 더 높은 핵산 함량을 제안한다. 피코그린® 검정법은 분획 풀 F1 중 DNA 수준이 극히 낮다 (데이타 나타내지 않음)는 것을 확인하였다. 그러므로, DNA 제거를 위해 이 컬럼을 사용하였다. 이 피크 중 역가 회수율은 플라크 검정법에 의해 81.4％였다. 그러나, 높은 수준의 단백질 불순물이 나타났다.
무스탕™ Q 막 흡착제를 사용한 VSV 정제
하기 표 27에 나타낸 바와 같은 완전 공장 실험 고안을 사용하여, 무스탕™ Q 막 흡착제 상에서의 VSV 결합 조건 스크리닝을 수행하였다. 공급물은 상이한 로딩 완충제 조건으로 조절된 세포 배양 상등액이었다. SDS-PAGE 분석 (나타내지 않음)을 사용하여 상이한 무스탕™ Q 용리 풀을 모니터링하였다.
Figure 112008079669773-PCT00027
무스탕™ Q 흡착제 상의 VSV 결합 조건 스크리닝의 SDS-PAGE 분석은 상이한 결합 NaCl 농도의 용리 풀을 나타내었다: 0.15, 0.20, 0.22, 0.24, 0.26, 0.28 M. 평형화 완충제 중 NaCl 농도가 0.26 M에 도달하면, 고분자량 단백질 불순물이 모든 시험된 pH 조건에서 용리 풀로부터 제거되었다.
용리 조건 스크리닝
VSVIN N4CT9-gag1을 함유하는 세포 배양 상등액을 0.28 M의 최종 NaCl 농도에 도달할 때까지 HEPES 스톡 용액 (10 mM HEPES, 0.415 M NaCl, 2％ 수크로스, pH 7.25)으로 2배 희석하였다. 실험의 공급물로서 제조된 용액을 사용하였다. 이 연구에 대한 실험 고안은 하기 표 28에 요약되어 있다. 무스탕™ Q MA로의 결합 후, 상이한 NaCl 농도의 용리 완충제로 VSV를 용리하였다.
Figure 112008079669773-PCT00028
공정 회수율의 윤곽 플롯 분석 (나타내지 않음)은 적당한 공정 회수율 (> 55％)을 얻기 위해 용리 완충제 조건이 pH = 6.5-6.9 및 NaCl 농도 = 0.55-0.70 M으로 유지되어야 한다는 것을 나타낸다. 이들 조건으로, 무스탕™ Q 용리 풀을 위한 SDS-PAGE 분석 (나타내지 않음)에서 나타낸 바와 같이 고품질 VSV 생성물이 생성되었다.
DOE 접근법을 사용한 무스탕™ Q 조건 최적화
무스탕™ Q 단계에서의 추가 최적화는 높은 수준의 DNA 청소율 및 높은 공정 수율을 성취하기 위한 우수한 VSV 결합 및 용리 조건을 야기하였다. 실험 고안은 하기 표 29에 나타낸다. VSVIN N4CT9-gag1에서 초기 스크리닝 연구 및 이전 경험을 기초로 하여 6.5 내지 7.0의 로딩 및 용리 pH를 선택하였다. 초기 스크리닝 연구의 결과로부터 로딩 및 용리 완충제 중 상이한 NaCl 농도를 또한 선택하였다. 모든 실험 중 유속을 20 캡슐 부피 (CV)/min인 7.0 ml/min로 유지하였다.
Figure 112008079669773-PCT00029
실험 결과
플라크 검정법에 의해 결정된 VSV 생성물 역가를 기초로 하여 공정 수율을 계산하였다. 결과는 예상 프로파일 (나타내지 않음)에 요약되어 있다. 공정 수율의 최대화를 위해, 무스탕™ Q 흡착에서 하기 완충제 조건을 확인하였다:
로딩 완충제 중 NaCl 농도: 0.26-0.30 M
로딩 완충제 pH: 7.0-7.5
용리 완충제 중 NaCl 농도: 0.55-0.65
용리 완충제 pH: 6.5-7.0
상이한 결합 조건에서 무스탕™ Q 용리 풀 중 잔류 DNA 수준을 윤곽 플롯 (나타내지 않음)으로 보고하였다. DNA 청소율 결과를 기초로 하여 무스탕™ Q 완충제 조건을 추가로 정하였다:
로딩 완충제 중 NaCl 농도: 0.27-0.29 M
로딩 완충제 pH: 7.0-7.5
용리 완충제 중 NaCl 농도: 0.55-0.65
용리 완충제 pH: 6.5-7.0
SDS-PAGE의 농도계측 (나타내지 않음)에 의해 무스탕™ Q 용리 풀 중 VSV 생성물 순도를 예측하였다. 상이한 결합 완충제 조건에서의 생성물 순도 및 상이한 용리 완충제 조건에서의 생성물 순도를 분석하였다. 농도계측 분석의 다양성을 고려하여, 모든 경우에 VSV 생성물 순도의 유의한 차이는 없었다. 모든 실험에서 고품질 VSV 생성물이 제조되었다.
무스탕™ Q 작동 범위
하기 표 30에 나타낸 바와 같이 개발된 조건 내의 추가 작동점 및 외의 추가 작동점으로 시험을 수행함으로써 무스탕™ Q 막 크로마토그래피의 결합 및 용리 완충제 조건을 한정하였다. 평형화/용리 완충제는 다양한 양의 NaCl 및 상이한 pH 조건을 갖는 10 mM HEPES, 2％ 수크로스이었다. 모든 실행에서 동일한 작동 조건을 유지하였다: 동일한 유속, 동일한 로딩 부피 및 동일한 용리 부피. 하기 표 30에 나타낸 바와 같이 일정한 공정 수행을 관찰하였다: SDS-PAGE 분석을 기초로 하여 고품질 VSV 생성물을 제조하였으며; 모든 무스탕™ Q 용리 풀에서 허용되는 수준의 잔류 DNA 청소율을 성취하였으며; 또한 유사한 공정 수율을 얻었다.
Figure 112008079669773-PCT00030
VSV IN N4CT 9 - gag1 균일성 실행
VSVIN N4CT9-gag1을 함유하는 세포 배양액을 사용하여 전체 정제 방법을 수행하였다. 공정은 세포 배양액을 저속 원심분리에 의해 청징화하고, 상등액에서 VSV를 회수하는 단계; 0.45/0.2 ㎛ 필터를 통해 상등액을 여과하고, 여과된 용액에서 VSV를 회수하는 단계; 음이온 교환 막 흡착제 상에 VSV 여과물을 로딩하고, 음이온 교환 막 흡착제로부터 VSV를 용리하고, VSV 생성물을 회수하는 단계; 상기 회수된 VSV를 750 kDa 분자량 컷오프 중공사 막을 사용하는 접면 유동 여과 (TFF)로 정제하고, 보유액에서 VSV를 회수하는 단계; 및 0.2 ㎛ 필터를 통해 VSV 보유액을 여과하고, 여과된 용액에서 VSV를 회수하는 단계를 포함한다. 와이어쓰에서 1개의 10-L 및 2개의 6-L 실행을 완료하고, "균일성 실행" 및 2개의 10-L 실행을 기술 이전 실행으로서 헤노겐(Henogen)에서 성취하였다. 실험 조건은 하기 표 31에 요약되어 있다.
Figure 112008079669773-PCT00031
10-ml 무스탕™ Q 캡슐을 3개의 균일성 실행 (CR) 및 1개의 기술 이전 실행 (TTR)에서 사용하였다. 60-ml 무스탕™ Q 캡슐을 1개의 TTR에서만 사용하였다. 유속은 10-ml 캡슐에 대해 200 ml/min, 및 60-ml 캡슐에 대해 600 ml/min이었다. 420 ㎠ TFF 막을 균일성 실행에서 사용한 반면, 1200 ㎠을 TTR에서 사용하였다. 교차 유속을 막 구역에 따라 선형으로 조절하였다.
실험 결과는 하기 표 32 및 33에 요약되어 있다. 전체 공정 수율은 모든 수행된 실행에서 일치하였다. 상이한 실행 중에서 단계 회수율의 다양성은 효력 검정법의 다양성으로 인한 것이었다 (표 33). 단백질 및 DNA 불순물의 일정한 제거율이 모든 실행에서 관찰되었다 (표 32). 공정에 대한 전형적인 SDS-PAGE 분석을 이 평가와 함께 수행하였다 (나타내지 않음). 이 정제 방법을 통해 고품질 바이러스 생성물을 제조하였다.
Figure 112008079669773-PCT00032
Figure 112008079669773-PCT00033
그러므로, VSVNJ N4CT1-gag1을 위한 정제 방법을 성공적으로 개발하였으며, 동일한 공정 수행을 여전히 유지하면서 개발된 정제 조건을 10-L 규모 (세포 배양물 부피)까지 규모화하였다. 6 내지 10-L 규모 (세포 배양물 부피)에서 3개의 균일성 실행 및 2개의 기술 이전 실행에 의해 공정을 확인하였다. 이 개발된 공정을 통해 허용되는 공정 수율 및 불순물 청소율로 고품질 바이러스 생성물을 제조하였다.
본 명세서에서 인용된 모든 특허 및 공보는 본원에 참고로 도입된다.

Claims (18)

  1. (a) 세포 배양액을 저속 원심분리에 의해 청징화하고, 상등액에서 소포성 구내염 바이러스 (VSV)를 회수하는 단계;
    (b) 0.2 내지 0.45 ㎛ 필터를 통해 상기 단계 (a)의 상등액을 여과하고, 여과된 용액에서 VSV를 회수하는 단계;
    (c) 제1 pH 완충 염 용액으로 평형화된 음이온 교환 막 흡착제 상에 단계 (b)의 VSV 여과된 용액을 로딩하고, 음이온 교환 막 흡착제로부터 VSV를 제2 pH 완충 염 용액으로 용리하고, 용리된 VSV 분획을 회수하는 단계;
    (d) 상기 단계 (c)에서 회수된 VSV를 300 kDa 내지 1,000 kDa의 분자량 컷오프(cutoff)를 갖는 막을 사용하는 접면 유동 여과 (TFF)로 정제하고, 보유액에서 VSV를 회수하는 단계; 및
    (e) 0.2 내지 0.22 ㎛ 필터를 통해 상기 단계 (d)로부터의 VSV 보유액을 여과하고, 여과된 용액에서 VSV를 회수하는 단계
    를 포함하는, VSV로 감염된 포유동물 세포 배양물의 세포 배양액으로부터의 소포성 구내염 바이러스 (VSV)의 정제 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 (e)에서 회수된 VSV에 세포 배양 단백질 및 핵산 오염물이 90.0％ 내지 약 99.0％ 이상 없는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 포유동물 세포가 인간 배아 신장 (HEK) 세포, HEK 293 세포, 차이니스 햄스터 난소 (CHO) 세포, 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포, 아프리카 녹색 원숭이 신장 (AGMK) 세포 및 AGMK 베로 세포에서 선택된 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 저속 원심분리가 4,400 x g 내지 8,000 x g인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서 제1 pH 완충 염 용액 또는 제2 pH 완충 염 용액이 독립적으로
    (a) NaCl 또는 KCl에서 독립적으로 선택된 염을 함유함;
    (b) 100 mM 내지 400 mM의 이온 세기를 갖는 염을 함유함;
    (c) 6.0 내지 8.5의 pKa를 갖는 완충제를 함유함;
    (d) 6.5 내지 8.0의 pH를 가짐;
    (e) 포스페이트 완충제, N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산 (HEPES) 완충제 또는 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 (TRIS)으로 구성된 군에서 선택된 완충제를 포함함; 및
    (f) 1.5％ 내지 5％ 농도의 수크로스를 포함함
    으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 특징을 특징으로 하는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 제2 pH 완충 염 용액의 염이 NaCl이고, VSV가 단일 단계에 서 제2 pH 완충 염 용액의 첨가에 의해 막 흡착제로부터 용리되고, NaCl의 단일 단계 용리 농도가 500 mM 내지 750 mM인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 제2 pH 완충 염 용액의 용리 유속이 10 캡슐 부피/분 (CV/분) 내지 30 CV/분인 방법.
  8. 제5항에 있어서, 제2 pH 완충 염 용액의 염이 NaCl이고, 제2 pH 완충 염 용액 중 NaCl의 이온 세기가 10 CV/분 내지 30 CV/분의 용리 유속으로 1 mM에서부터 750 mM까지 선형으로 증가되는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, TFF 막이
    (a) 300 kDa 분자량 컷오프;
    (b) 750 kDa 분자량 컷오프; 및
    (C) 중공사 막 모듈
    로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 특징을 특징으로 하는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, TFF가 단계 (c)로부터 회수된 VSV를 5회 이상 농축한 후, 완충제 교환을 1회 이상 또는 5회 이상 실시하는 것을 포함하는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 완충제 교환에 사용되는 완충제가
    (a) 포스페이트 완충제;
    (b) HEPES 완충제;
    (c) TRIS 완충제;
    (d) 5 mM 내지 15 mM의 완충제 농도 및 7.2 내지 7.5의 pH; 및
    (e) 100 mM 내지 200 mM NaCl 및 3.5％ 내지 4.5％ 수크로스를 추가로 포함하는 완충제
    로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 특징을 특징으로 하는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 공정 단계 (a) 내지 (e)가 15℃ 내지 25℃의 온도(들)에서 수행되는 것인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)에서 세포 배양액의 청징화가 1.0 ㎛ 내지 4.5 ㎛ 심층 여과(depth filtration) 모듈에 의해 수행되고, 단계 (a)로부터 저속 원심분리가 생략된 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 VSV가 제약 조성물로 제제화되는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 방법에 따라 정제된 VSV.
  16. 제15항에 있어서,
    (a) VSV 인디애나 혈청형, VSV 뉴저지 혈청형, VSV 산후안 혈청형, VSV 이스파한 혈청형, VSV 글라스고우 혈청형 및 VSV 찬디푸라 혈청형으로 구성된 군에서 선택된 혈청형;
    (b) VSV의 병원성을 감쇠시키는 1종 이상 또는 2종 이상의 돌연변이를 포함하는 게놈 서열;
    (c) 감쇠 돌연변이가 온도-감수성 (ts) 돌연변이, 점 돌연변이, 유전자 셔플링 돌연변이, G-스템(G-stem) 돌연변이, 비-세포변성 M 유전자 돌연변이, 앰비센스(ambisense) RNA 돌연변이, 말단절단형(truncated) G 유전자 돌연변이, G 유전자 삽입 돌연변이 및 유전자 결실 돌연변이로 구성된 군에서 선택되는, (b)의 게놈 서열; 및
    (d) gag, env, pol, vif, nef, tat, vpr, rev 또는 vpu로 구성된 군에서 선택된 HIV 유전자, HTLV 유전자, SIV 유전자, RSV 유전자, PIV 유전자, HSV 유전자, CMV 유전자, 엡스타인-바르 바이러스 유전자, 수두대상포진 바이러스(Varicella-Zoster virus) 유전자, 볼거리 바이러스 유전자, 홍역 바이러스 유전자, 인플루엔자 바이러스 유전자, 폴리오바이러스 유전자, 리노바이러스 유전자, A형 간염 바이러스 유전자, B형 간염 바이러스 유전자, C형 간염 바이러스 유전자, 노르와크 바이러스 유전자, 토가바이러스 유전자, 알파바이러스 유전자, 루벨라 바이러스 유전자, 광견병 바이러스 유전자, 마르부르그 바이러스 유전자, 에볼라 바이러스 유전 자, 유두종 바이러스 유전자, 폴리오마 바이러스 유전자, 메타뉴모바이러스 유전자, 코로나바이러스 유전자, 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae) 유전자, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae) 유전자, 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 유전자, 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 유전자, 스트렙토코쿠스 아갈락티아에(Streptococcus agalactiae) 유전자, 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis) 유전자, 네이세리아 고노레아에(Neisseria gonorrheae) 유전자, 코리네박테리아 디프테리아에(Corynebacteria diphtheriae) 유전자, 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani) 유전자, 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis) 유전자, 헤모필루스(Haemophilus) 유전자, 클라미디아(Chlamydia) 유전자, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 유전자, 사이토카인을 코딩하는 유전자, T-헬퍼 에피토프를 코딩하는 유전자, CTL 에피토프를 코딩하는 유전자, 아쥬반트를 코딩하는 유전자, 및 보조인자를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택된 외래 RNA 오픈 리딩 프레임 (ORF) 서열을 포함하는 VSV 게놈 서열
    로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 특징을 갖는 VSV.
  17. 제약상 허용되는 담체 중에 제15항 또는 제16항의 VSV를 포함하는 제약 조성물.
  18. 제약상 허용되는 담체 중에 제15항 또는 제16항의 VSV를 포함하는 면역원성 조성물.
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