RU2484135C2 - Способ очистки, предназначенный для получения очищенного вируса везикулярного стоматита из клеточной культуры - Google Patents
Способ очистки, предназначенный для получения очищенного вируса везикулярного стоматита из клеточной культуры Download PDFInfo
- Publication number
- RU2484135C2 RU2484135C2 RU2008140137/10A RU2008140137A RU2484135C2 RU 2484135 C2 RU2484135 C2 RU 2484135C2 RU 2008140137/10 A RU2008140137/10 A RU 2008140137/10A RU 2008140137 A RU2008140137 A RU 2008140137A RU 2484135 C2 RU2484135 C2 RU 2484135C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- bbc
- buffer
- nacl
- elution
- purification
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 153
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims description 56
- 208000003265 stomatitis Diseases 0.000 title claims 2
- 208000005925 vesicular stomatitis Diseases 0.000 title claims 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 title abstract 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 106
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 92
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims abstract description 82
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 64
- 238000005352 clarification Methods 0.000 claims abstract description 47
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims abstract description 39
- 239000003011 anion exchange membrane Substances 0.000 claims abstract description 35
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 26
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 18
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 15
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims abstract description 12
- 239000000337 buffer salt Substances 0.000 claims abstract 6
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 claims abstract 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 232
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 142
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 136
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 118
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 112
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 83
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 74
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 74
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 74
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 64
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 46
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 33
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 32
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 claims description 30
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 claims description 28
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 claims description 24
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims description 24
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 19
- 239000002775 capsule Substances 0.000 claims description 17
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 claims description 11
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 11
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 9
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 238000002834 transmittance Methods 0.000 claims description 8
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 claims description 5
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 claims description 2
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 abstract description 69
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 abstract description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 abstract description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 75
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 59
- 239000000047 product Substances 0.000 description 53
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 48
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 35
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 34
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 33
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 28
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 28
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 27
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 23
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 22
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 21
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 21
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 21
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 21
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 21
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 20
- 239000000463 material Substances 0.000 description 18
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 17
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 16
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 15
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 15
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 15
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 14
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 14
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 13
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 13
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 239000013017 sartobind Substances 0.000 description 11
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 10
- 108010034546 Serratia marcescens nuclease Proteins 0.000 description 9
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 238000011173 large scale experimental method Methods 0.000 description 9
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 9
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 8
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 8
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 8
- 238000013461 design Methods 0.000 description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 description 8
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 8
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 8
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 8
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 8
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 8
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 7
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 7
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 7
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 7
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 7
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 7
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 7
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 7
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 7
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 7
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101710177291 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 6
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 6
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 6
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 description 6
- 101150098622 gag gene Proteins 0.000 description 6
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 6
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 5
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 5
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 5
- AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N bicinchoninic acid Chemical compound C1=CC=CC2=NC(C=3C=C(C4=CC=CC=C4N=3)C(=O)O)=CC(C(O)=O)=C21 AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 238000011140 membrane chromatography Methods 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound NCC(O)=O.OCC(N)(CO)CO AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 4
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 239000011247 coating layer Substances 0.000 description 4
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 4
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 4
- 101150030339 env gene Proteins 0.000 description 4
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 4
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 4
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 4
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 4
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 4
- 238000011403 purification operation Methods 0.000 description 4
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 4
- ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 3',5'-cyclic GMP Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=C(NC2=O)N)=C2N=C1 ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 3
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150082239 G gene Proteins 0.000 description 3
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 3
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 3
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 3
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZYFVNVRFVHJEIU-UHFFFAOYSA-N PicoGreen Chemical compound CN(C)CCCN(CCCN(C)C)C1=CC(=CC2=[N+](C3=CC=CC=C3S2)C)C2=CC=CC=C2N1C1=CC=CC=C1 ZYFVNVRFVHJEIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 3
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 3
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 3
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 3
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 3
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 3
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 3
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 3
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 3
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 3
- TVEXGJYMHHTVKP-UHFFFAOYSA-N 6-oxabicyclo[3.2.1]oct-3-en-7-one Chemical compound C1C2C(=O)OC1C=CC2 TVEXGJYMHHTVKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009948 RNA mutation Effects 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 2
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 2
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 2
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 coatings Substances 0.000 description 2
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000012137 double-staining Methods 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 229910052587 fluorapatite Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 2
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004452 microanalysis Methods 0.000 description 2
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 231100000255 pathogenic effect Toxicity 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- FGRBYDKOBBBPOI-UHFFFAOYSA-N 10,10-dioxo-2-[4-(N-phenylanilino)phenyl]thioxanthen-9-one Chemical compound O=C1c2ccccc2S(=O)(=O)c2ccc(cc12)-c1ccc(cc1)N(c1ccccc1)c1ccccc1 FGRBYDKOBBBPOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGZSVBBLLGZHSF-UHFFFAOYSA-N 4,4-diethylpiperidine Chemical compound CCC1(CC)CCNCC1 DGZSVBBLLGZHSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 229920003043 Cellulose fiber Polymers 0.000 description 1
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241001115402 Ebolavirus Species 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000792859 Enema Species 0.000 description 1
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 101001065501 Escherichia phage MS2 Lysis protein Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 1
- 241000606790 Haemophilus Species 0.000 description 1
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 241000701085 Human alphaherpesvirus 3 Species 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241001115401 Marburgvirus Species 0.000 description 1
- 201000005505 Measles Diseases 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000711386 Mumps virus Species 0.000 description 1
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 description 1
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 241000714209 Norwalk virus Species 0.000 description 1
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100034574 P protein Human genes 0.000 description 1
- 101710181008 P protein Proteins 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 101710177166 Phosphoprotein Proteins 0.000 description 1
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 1
- 229920002685 Polyoxyl 35CastorOil Polymers 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 1
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- 241000710799 Rubella virus Species 0.000 description 1
- 241000713311 Simian immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000193985 Streptococcus agalactiae Species 0.000 description 1
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 1
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 208000000389 T-cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000028530 T-cell lymphoblastic leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 1
- DVKFVGVMPLXLKC-PUGXJXRHSA-N [(2s,3r,4s,5s,6r)-2-[(2s,3s,4s,5r)-3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl] dihydrogen phosphate Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@]1(CO)[C@@]1(OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DVKFVGVMPLXLKC-PUGXJXRHSA-N 0.000 description 1
- OHRWHIOLZGLRKH-UHFFFAOYSA-M [Na+].NCC(O)=O.NCC(O)=O.NCC(O)=O.CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O Chemical compound [Na+].NCC(O)=O.NCC(O)=O.NCC(O)=O.CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O OHRWHIOLZGLRKH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- RSENBSORUWTLLP-UHFFFAOYSA-N [Na].NCC(O)=O.NCC(O)=O.NCC(O)=O Chemical compound [Na].NCC(O)=O.NCC(O)=O.NCC(O)=O RSENBSORUWTLLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000032912 absorption of UV light Effects 0.000 description 1
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000003833 bile salt Substances 0.000 description 1
- 229940093761 bile salts Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 1
- 239000012539 chromatography resin Substances 0.000 description 1
- 150000001860 citric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000012459 cleaning agent Substances 0.000 description 1
- 230000003749 cleanliness Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 229940110456 cocoa butter Drugs 0.000 description 1
- 235000019868 cocoa butter Nutrition 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 238000010217 densitometric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002298 density-gradient ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K dihydroxy(stearato)aluminium Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)O[Al](O)O UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 239000007920 enema Substances 0.000 description 1
- 229940079360 enema for constipation Drugs 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012527 feed solution Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012537 formulation buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 1
- IECPWNUMDGFDKC-MZJAQBGESA-N fusidic acid Chemical class O[C@@H]([C@@H]12)C[C@H]3\C(=C(/CCC=C(C)C)C(O)=O)[C@@H](OC(C)=O)C[C@]3(C)[C@@]2(C)CC[C@@H]2[C@]1(C)CC[C@@H](O)[C@H]2C IECPWNUMDGFDKC-MZJAQBGESA-N 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 125000005456 glyceride group Chemical group 0.000 description 1
- XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N glycyl-glycyl-glycine Natural products NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067216 glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 244000052637 human pathogen Species 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 238000013383 initial experiment Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000013411 master cell bank Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 108010004051 measles virus hemagglutinin protein G Proteins 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 238000002620 method output Methods 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 1
- 239000007922 nasal spray Substances 0.000 description 1
- 239000006218 nasal suppository Substances 0.000 description 1
- 230000004719 natural immunity Effects 0.000 description 1
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 1
- 108700004028 nef Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150023385 nef gene Proteins 0.000 description 1
- MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N nitrilotriacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 239000000346 nonvolatile oil Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- QUANRIQJNFHVEU-UHFFFAOYSA-N oxirane;propane-1,2,3-triol Chemical compound C1CO1.OCC(O)CO QUANRIQJNFHVEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 1
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 1
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229960003742 phenol Drugs 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 108700004029 pol Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150088264 pol gene Proteins 0.000 description 1
- 238000005498 polishing Methods 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008389 polyethoxylated castor oil Substances 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000011027 product recovery Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 239000003380 propellant Substances 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 108700004030 rev Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150098213 rev gene Proteins 0.000 description 1
- 238000001223 reverse osmosis Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004513 sizing Methods 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 1
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 108700004027 tat Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150098170 tat gene Proteins 0.000 description 1
- 238000013060 ultrafiltration and diafiltration Methods 0.000 description 1
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 238000009827 uniform distribution Methods 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 description 1
- 101150059019 vif gene Proteins 0.000 description 1
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 108700026215 vpr Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150024249 vpr gene Proteins 0.000 description 1
- 108700026222 vpu Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150090490 vpu gene Proteins 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
- C12N7/02—Recovery or purification
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
- C12N2740/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/20011—Rhabdoviridae
- C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
- C12N2760/20241—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2760/20243—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/20011—Rhabdoviridae
- C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
- C12N2760/20251—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/20011—Rhabdoviridae
- C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
- C12N2760/20251—Methods of production or purification of viral material
- C12N2760/20252—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу очистки вируса везикулярного стоматита (ВВС) из жидкости клеточной культуры. Способ включает осветление жидкости клеточной культуры низкоскоростным центрифугированием при скорости ниже 10000 об/мин или при помощи модуля объемного фильтрования, размер пор которого составляет от 1,0 мкм до 4,5 мкм, с получением ВВС в надосадочной жидкости. Фильтруют надосадочную жидкость через фильтр с отверстиями размером от 0,2 до 0,45 мкм, и получают ВВС в отфильтрованном растворе. Загружают содержащий ВВС отфильтрованный раствор на анионообменный мембранный адсорбер, уравновешенный первым буферным солевым раствором. Первый буферный солевой раствор обладает ионной силой от 100 мМ до 400 мМ. Элюируют ВВС из анионообменного мембранного адсорбера вторым буферным солевым раствором. ВВС элюируется с мембранного адсорбера при добавлении второго буферного солевого раствора в одну стадию. Концентрация соли в одностадийной элюции составляет от 500 мМ до 750 мМ. Собирают элюированные фракции, содержащие ВВС. Очищают ВВС проточной фильтрацией вдоль направления потока (ПФ) с использованием мембраны, предел пропускания по которой от 300 кДа до 1000 кДа и получают ВВС в концентрате. Фильтруют содержащий ВВС концентрат через фильтр с отверстиями размером от 0,2 до 0,22 мкм и получают ВВС в отфильтрованном растворе. Способ очистки не включает использование человеческих эмбрионов. Предложенное изобретение позволяет получить ВВС высокой степени очистки с высоким выходом. 12 з.п. ф-лы, 8 ил., 33 табл., 12 пр.
Description
Вирус везикулярного стоматита (BBC), представляющий собой член семейства рабдовирусов, содержит несегментированный, одноцепочечный геном антисмысловой РНК (- РНК). Его геном размером 11 т.н. (11 тысяч нуклеотидов) включает пять генов, которые кодируют пять структурных белков вируса: нуклеокапсидный белок (N), который требуется в стехиометрических отношениях для инкапсулирования реплицированной РНК; фосфопротеин (Р), являющийся кофактором РНК-зависимой РНК-полимеразы (L); матричный белок (М) и гликопротеин прикрепления (G) (см., например: Gallione et al., 1981, J. Virol., 39:529-535; Rose and Gallione, 1981, J. Virol., 39:519-528; патент США No. 6033886; патент США No. 6168943).
В общем случае BBC не считается патогеном человека и поэтому естественный иммунитет к BBC у людей встречается крайне редко. Таким образом, разработка векторов на основе BBC оказалась целевым направлением в таких областях, как создание иммуногенных композиций (например, вакцин) и доставка генов, кодирующих терапевтические белки. Например, исследования показали, что BBC может служить эффективным вектором для экспрессии белка гемагглютинина вируса гриппа (Roberts et al., 1999 J. Virol., 73:3723-3732), белка Н вируса кори (Schlereth et al., 2000 J. Virol., 74:4652-4657) и белков env и gag ВИЧ-1 (Rose et al., 2001 Cell, 106(5):539-49). Другие характеристики BBC, которые обеспечивают его привлекательность как вектора, включают: (а) способность к эффективной репликации в клеточной культуре; (b) неспособность как интегрироваться в ДНК клетки-хозяина, так и участвовать в генетической рекомбинации; (с) существование нескольких серотипов, что позволяет применять стратегии иммунизации типа прайм-буст; (d) возможность вводить в геном BBC интересующие чужеродные гены, экспрессия которых будет эффективно происходить за счет вирусной транскриптазы; и (е) разработка специализированной системы получения инфекционного вируса из комплементарной ДНК, соответствующей вирусному геному (см., например: патент США No.6033886; патент США No.6168943).
Приготовление иммуногенных композиций на основе BBC вектора обычно включает заражение подходящей клеточной культуры (хозяина) рекомбинантным BBC, культивирование BBC на клеточной культуре, сбор жидкости клеточной культуры в подходящий момент и выделение (очистку) BBC из культуральной жидкости. Использование векторов на основе BBC и содержащих их иммуногенных композиций в клинических целях требует образцов BBC (или доз) подходящей чистоты, которая соответствует требованиям безопасности различных органов надзора за безопасностью лекарственных средств во всем мире (например, Управления по контролю за продуктами и лекарствами (США), Европейского агентства лекарственных средств, Канадского агентства по надзору за лекарственными продуктами и продуктами питания и т.д.).
Однако отделение BBC от загрязняющих веществ, происходящих от клеточной культуры (например, загрязняющих белков и ДНК клеточной культуры), и получение BBC подходящей чистоты и с требуемым выходом при помощи имеющихся в настоящее время способов очистки BBC (например, очисткой центрифугированием в градиенте плотности сахарозы) обычно вызывает затруднения. Например, применение доступных в настоящее время способов очистки обычно приводит к обратному отношению между чистотой и количеством (процентным выходом) получаемых образцов BBC, что усложняет получение достаточных количеств очищенного BBC. Кроме того, при использовании современных процессов с применением биореакторов, увеличение концентраций клеток и увеличение продолжительности культивирования приводит к более высоким титрам BBC с одновременным увеличением концентраций загрязняющих клеточных осколков и органических составляющих в жидкости биореактора, что еще более затрудняет очистку BBC.
С 1964 года стандартным способом очистки вирусов (включая очистку BBC) является ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы (Yamada et al., 2003 BioTechniques, 34(5): 1074-1078, 1080; Brown et al., 1967 J. Immun, 99(1):171-7; Robinson et al., 1965 Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 54(1):137-44; Nishimura et al., 1964 Japan. J. Med. Sci. Biol., 17(6): 295-305). Тем не менее, по мере увеличения концентрации вируса, увеличивается концентрация загрязняющих остатков клеток и, кроме того, также появляются ДНК и белки клеток-хозяев, удаление которых при более высоких их концентрациях с использованием ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы достаточно затруднительно. Кроме того, адаптация способа ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы для крупномасштабного применения обходится недешево. При высоких концентрациях загрязняющих веществ концентрирование и очистка BBC способом осаждения полиэтиленгликолем (ПЭГ) (McSharry et al., 1970 Virol., 40(3):745-6) создает аналогичные проблемы.
Вирус относительно высокого качества был получен при помощи гель-хроматографии (Transfiguracion et al., 2003 Human Gene Ther., 4(12):1139-1153; Vellekamp, et al., 2001 Human Gene Ther., 12(15): 1923-36; Rabotti et al., 1971; Comptes Rendus des Seances de I'Academie des Sciences, Serie D: Sciences Naturelles, 272(2):343-6; Jacoli et al., 1968 Biochim. Biophys. Acta, GenI Subj., 165(2):99-302). Тем не менее себестоимость этого способа и трудности при его осуществлении делают его непригодным для крупномасштабного получения вирусов. Для очистки вирусов иногда применяют аффинную хроматографию, например, с гепарином (Zolotukhin et al., 1999 Gene Ther., 6(6):973-985), лектином (Kaarsnaes et al., 1983 J. Chromatog., 266:643-9; Kristiansen et al., 1976 Prot. Biol. Fluids, 23:663-5) и Matrex(Cellufine(сульфатом (Downing et al., 1992 J. Virol. Meth., 38(2):215-228). Гепарин и пектин не являются предпочтительными лигандами (или не используются) при получении цГМФ-вирусов (cGMP-viruses) из-за возможных проблем с их вымыванием, из-за которых перед выпуском продукта обычно следует проводить дополнительные испытания.
Очистка способом аффинной хроматографии с использованием Matrex(Cellufine(сульфата не является однозначным решением и требует учета эффективности очистки вируса, качества вируса и регенерации колонки. Для очистки BBC нужны очень большие колонки, предназначенные для проведения аффинной хроматографии (например, 0,2 л Matrex(Cellufine(сульфатной смолы на 1 литр клеточной культуры; неопубликованные результаты Wyeth Vaccine). Низкий выход вируса был получен при очистке, как только способом ионообменной хроматографии, так и при ее сочетании с другими типами хроматографической очистки, применяемыми для очистки вирусов (Международная заявка на патент No. WO 2006/011580; Specht et al., 2004 Biotech. Bioeng., 88(4):465-173; Yamada et al., 2003, cited above; Vellekamp et al., 2001 cited above; Zolotukhin et al., 1999, указанные выше; (Международная заявка на патент No. WO 1997/06243; Kaarsnaes et al., 1983, указанные выше).
Таким образом, в данной области техники имеется настоятельная необходимость разработки способов очистки, при помощи которых можно получать BBC необходимой чистоты с необходимой степенью извлечения (выходом).
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способы и композиции, рассматриваемые в настоящем описании, в целом относятся к области вирусологии, микробиологии, иммунологии и технологических разработок. В частности, описаны новые способы очистки, предназначенные для получения вируса везикулярного стоматита (BBC) повышенной степени чистоты и с высоким выходом.
В одном своем аспекте настоящее изобретение относится к способу очистки BBC из жидкости клеточной культуры, полученной из культуры клеток млекопитающего, зараженных BBC, включающему следующие стадии: (а) первичное осветление, (b) вторичное осветление, (с) адсорбцию на анионообменной мембране, (d) проточную фильтрацию вдоль направления потока и (е) фильтрацию. В одном примере реализации стадия (а) включает осветление жидкости клеточной культуры при помощи низкоскоростного центрифугирования с получением BBC в надосадочной жидкости. В еще одном примере реализации стадия (b) включает фильтрование полученной после центрифугирования надосадочной жидкости через фильтр с отверстиями размером от 0,2 до 0,45 мкм, с получением BBC в отфильтрованном растворе. В другом примере реализации стадия (с) включает загрузку отфильтрованного раствора, содержащего BBC, на анионообменный мембранный адсорбер, уравновешенный первым буферным солевым раствором, элюирование BBC из анионообменного мембранного адсорбера вторым буферным солевым раствором и сбор элюированных фракций, содержащих BBC. В еще одном примере реализации стадия (d) включает очистку выделенного BBC посредством проточной фильтрации вдоль направления потока (ПФ, tangential flow filtration (TFF)) с использованием мембраны из полого волокна, предел пропускания по молекулярной массе которого составляет от 300 килодальтон до 1000 килодальтон (кДа), и получение BBC в концентрате. В одном примере реализации стадия (е) включает фильтрование концентрата, содержащего BBC, через фильтр с отверстиями размером от 0,2 до 0,22 мкм и получение BBC в отфильтрованном растворе.
В некоторых примерах реализации клетки культуры клеток млекопитающего выбирают из эмбриональных клеток почки человека (human embryonic kidney (HEK)), клеток HEK 293, клеток яичников Китайского хомячка (Chinese hamster ovary (CHO)), клеток почки новорожденных хомячков (baby hamster kidney (BHK)) и клеток почки Африканской зеленой мартышки (African green monkey kidney (AGMK)), также известных под названием клеток Vero.
В некоторых примерах реализации операцию низкоскоростного центрифугирования в указанном способе очистки проводят при ускорении от 4400×g до 8000×g. В одном из конкретных примеров реализации операцию низкоскоростного центрифугирования проводят при ускорении 6238×g.
В другом примере реализации фильтр с отверстиями размером от 0,2 до 0,45 мкм представляет собой фильтровальное устройство Millipore Millex®-GV, фильтровальное устройство Millipore Millex®-GP, фильтровальное устройство Pall Supor®, фильтровальное устройство Sartorius SartobranTM или фильтровальное устройство Sartorius SartoporeTM 2. В одном из конкретных примеров реализации фильтр представляет собой фильтровальное устройство Sartorius SartobranTM с отверстиями размером 0,2 мкм.
В других примерах реализации анионообменный мембранный адсорбер представляет собой мембранный адсорбер Sartorius SartobindTM Q или мембранный адсорбер Pall MustangTM Q. В одном из конкретных примеров реализации анионообменный мембранный адсорбер представляет собой мембранный адсорбер Pall MustangTM Q.
В некоторых других примерах реализации соль в первом буферном солевом растворе, используемом на стадии (с), представляет собой NaCl или KCl. В другом примере реализации ионная сила NaCl или KCl составляет от 0,1 М до 0,4 М. В одном из конкретных примеров реализации соль представляет собой NaCl, и ионная сила NaCl составляет 0,3 М.
В другом примере реализации соль во втором буферном солевом растворе, используемом на стадии (с), представляет собой NaCl или KCl. В одном из конкретных примеров реализации соль во втором буферном солевом растворе представляет собой NaCl. В одном из конкретных примеров реализации ионная сила NaCl во втором буферном солевом растворе составляет от 0,5 М до 0,75 М.
В другом конкретном примере реализации ионная сила NaCl во втором буферном солевом растворе составляет 0,6 М. В некоторых других примерах реализации ионная сила NaCl во втором буферном солевом растворе составляет 0,75 М. В некоторых других примерах реализации скорость расхода второго буферного солевого раствора при элюировании составляет от 10 объемов капсулы в минуту (ОК/минуту) до 30 ОК/минуту. В других примерах реализации расход при элюировании составляет 20 ОК/минуту.
В некоторых других примерах реализации ионную силу NaCl во втором буферном солевом растворе линейно увеличивают от 0,001 М до 0,75 М при скорости расхода при элюировании, составляющей от 10 ОК/минуту до 30 ОК/минуту. В одном из конкретных примеров реализации линейный градиент скорости расхода при элюировании составляет 20 ОК/минуту.
В некоторых других примерах реализации pKa первого и второго буферных растворов, применяемых на стадии (с), составляет от 6,0 до 8,5. В некоторых других примерах реализации pH первого буферного солевого раствора, применяемого на стадии (с), составляет от 6,5 до 8,0. В одном из конкретных примеров реализации pH первого буферного солевого раствора, применяемого на стадии (с), составляет 7,5. В других примерах реализации, pH второго буферного солевого раствора, применяемого на стадии (с), составляет от 6,5 до 8,0. В одном из конкретных примеров реализации, pH второго буферного солевого раствора равно 7,5.
В некоторых примерах реализации первый и второй буферные растворы, применяемые на стадии (с), представляют собой фосфатные буферы, буферы, на основе N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновой кислоты (HEPES) или трис(гидроксиметил)аминометана (TRIS). В другом примере реализации указанные первый и второй буферные солевые растворы, применяемые на стадии (с), также содержат сахарозу в концентрации от 1,5% до 5%. В одном из конкретных примеров реализации концентрация сахарозы составляет 2%.
В других примерах реализации предел пропускания по молекулярной массе материала мембраны при ПФ составляет 300 кДа. В некоторых других примерах реализации, предел пропускания по молекулярной массе материала мембраны при ПФ составляет 750 кДа. В некоторых других примерах реализации, предел пропускания по молекулярной массе материала мембраны при ПФ составляет по меньшей мере 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 850, 900, 950 или 1000 кДа. В одном из конкретных примеров реализации мембрана ПФ представляет собой мембранный модуль из полого волокна. В другом примере реализации ПФ включает концентрирование BBC, полученного на стадии (с), по меньшей мере в 5 раз, с последующим проведением по меньшей мере однократной замены буфера. В еще одном примере реализации ПФ включает концентрирование BBC, полученного на стадии (с), проводимое по меньшей мере 5 раз, с последующим проведением по меньшей мере пяти операций замены буфера. В одном из конкретных примеров реализации буферный раствор, применяемый для замены буфера, представляет собой фосфатный буфер, буфер, содержащий HEPES, или буфер, содержащий TRIS, причем концентрация указанного буфера составляет от 5 мМ до 15 мМ, а pH составляет 7,2 до 7,5. В другом примере реализации буфер, применяемый для замены буфера, также содержит от 0,10 М до 0,20 М NaCl и от 3,5% до 4,5% сахарозы.
В других примерах реализации стадии очистки (а)-(е) осуществляют при комнатной температуре; при этом комнатную температуру определяют как значение или значения температуры, составляющее или находящиеся в диапазоне от приблизительно 15°С до приблизительно 25°С. В одном из конкретных примеров реализации стадии очистки (а)-(е) осуществляют при 20°С.
В еще одном примере реализации осветление культуральной жидкости клеточной культуры, проводимое на стадии (а), осуществляют при помощи модуля объемного фильтрования, размер пор которого составляет от 1,0 мкм до 4,5 мкм, и из стадии (а) исключают проведение операцию низкоскоростного центрифугирования. В конкретных примерах реализации модуль объемного фильтрования представляет собой модуль Whatman® PolycapTM HD, модуль Sartorius Sartoclear™ P или модуль Millipore® Millistak+®HC.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения, из культуры клеток млекопитающего получают BBC повышенной степени чистоты. В некоторых примерах реализации очищенный BBC по меньшей мере на 90,0% освобожден от загрязняющих его белков и нуклеиновых кислот клеточной культуры. В других примерах реализации, очищенный BBC по меньшей мере на 99,0% освобожден от загрязняющих его белков и нуклеиновых кислот клеточной культуры. В одном из конкретных примеров реализации очищенный BBC по меньшей мере на 99,8% освобожден от загрязняющих его белков и нуклеиновых кислот клеточной культуры.
В соответствии с некоторыми другими примерами реализации получают BBC повышенной степени чистоты, который очищают и выделяют в соответствии с новыми способами очистки, раскрытыми в настоящем описании. В некоторых примерах реализации, очищенный BBC имеет одну или несколько из перечисленных ниже характеристик: выбранный серотип или сочетание серотипов BBC; геномную последовательность, которая содержит по меньшей мере одну мутацию или по меньшей мере две мутации, которые ослабляют патогенные свойства BBC, геномную последовательность, которая содержит последовательность, содержащую открытую рамку считывания (ОРС) чужеродной полинуклеотидной последовательности, кодирующую один или несколько различных белков (терапевтических или иммуногенных), более подробно раскрытую в подробном описании настоящего изобретения.
Другие особенности или преимущества рассматриваемых в настоящем описании композиций и способов более подробно изложены в нижеследующем подробном описании и более очевидны при рассмотрении предпочтительных примеров реализации и Формулы изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На Фиг.1 изображена блок-схема способа очистки (обведенная черными рамками), применяемого для получения BBC повышенной чистоты из культуральной жидкости культуры клеток млекопитающего.
На Фиг.2А изображен гель-электрофорез, показывающий разделение белков BBC при помощи окрашивания серебром, после очистки на мембранном адсорбере Mustang™ Q в присутствии 2% сахарозы, добавленной в буфер для элюирования (10 мМ фосфата натрия, 1,0 М NaCl). Дорожки 1-10 представляют собой следующее: (1) перед центрифугированием (клеточная культура), (2) загрузка, (3) элюирование и промывка, (4) 5%-ный буфер В (фракции 1-5), (5) 60%-ный буфер В (фракции 6-7), (6) 60%-ный буфер В (фракции 8-10), (7) 60%-ный буфер В (фракции 11-25), (8) 100%-ный буфер В (фракции 26-35), (9) регенерация колонки и (10) проведение стандартизации Bio-Rad® Precision Plus Protein™. Скорость потока для модуля Mustang™ Q составлял 3,5 мл/минуту с линейным градиентом элюирования. Анализ SDS-PAGE проводили при помощи 4-20%-ного Трис-глицинового геля; детектирование белков проводили при помощи окрашивания серебром.
На Фиг.2В изображен гель-электрофорез, показывающий разделение белков BBC при помощи вестерн-блоттинга (Western blot), в соответствии с описанием Фиг.2А. Вестерн-блоттинг проводили с использованием анти-BBC политональных антител.
На Фиг.3А изображен электрофорез на геле, показывающий разделение белков BBC при помощи окрашивания серебром и вестерн-блоттинга после очистки на мембранном адсорбере Mustang™ Q без добавления сахарозы в буфер для элюирования (10 мМ фосфата натрия, 1,0 М NaCl). Дорожки 1-9 представляют собой следующее: (1) загрузка, (2) элюирование и промывка, (3) 5%-ный буфер В (фракции 1-5), (4) 60%-ный буфер В (фракции 6-11), (5) 60%-ный буфер В (фракции 12-25), (6) 100%-ный буфер В (фракции 26-35), (7) проведение стандартизации Bio-Rad® Precision Plus Protein™, (8) проведение стандартизации BBC (т.е. BBC, очищенного способом с градиентом плотности сахарозы) и (9) получение объединенной среды после регенерации колонки. Скорость потока для модуля Mustang™ Q составлял 3,5 мл/минуту при ступенчатом градиенте элюирования. Анализ SDS-PAGE проводили при помощи 4-20%-ного геля с Трис-глициновым буфером; детектирование белков проводили при помощи окрашивания серебром.
На Фиг.3В изображен гель-электрофорез, показывающий разделение белков BBC при помощи вестерн-блоттинга после очистки, описанной для Фиг.3А. Вестерн-блоттинг проводили с использованием анти-BBC поликлональных антител. Буфер В (также называемый «буфером для элюирования») содержал 10 мМ фосфата натрия (pH 7,0) и 1 М NaCl.
На Фиг.4А представлен SDS-PAGE анализ (4-20%-ный гель с Трис-глициновым буфером) BBC, проводимый при помощи окрашивания серебром + коллоидного окрашивания (colloidal staining) на каждой стадии способа очистки, показанного на Фиг.1. Дорожки 1-12 представляют собой следующее: (1) перед центрифугированием, (2) после центрифугирования (1° осветления), (3) перед фильтрованием через 0,2-мкм фильтр, (4) после фильтрования через 0,2-мкм фильтр (2° осветления), (5) объединенная среда после прохождения и промывки мембранного адсорбера Mustang™ Q, (6) объединенные фракции после элюирования BBC в мембранном адсорбере Mustang™ Q, (7) концентрат BBC, полученный после ПФ ультрафильтрации/диафильтрации, (8) объединенная среда после концентрирования и диафильтрации, (9) перед фильтрованием через 0,2-мкм фильтр (конечным), (10) после фильтрования через 0,2-мкм фильтр (конечного) (общий концентрат очищенного BBC), (11) стандартизации проведение Bio-Rad® Precision Plus Protein™ и (12) контроль BBC (серия #3, очищенный общий концентрат).
На Фиг.4В представлен SDS-PAGE анализ (4-20%-ный Трис-глициновый гель) BBC при помощи вестерн-блоттинга в соответствии с методикой, описанной для Фиг.4А.
На Фиг.5А представлен SDS-PAGE (4-20% Трис-глициновый гель) сравнение BBC, очищенного при помощи окрашивания серебром + коллоидного окрашивания, описанного в пояснениях к Фиг.1, с BBC, очищенным центрифугированием в градиенте плотности сахарозы (дорожка 11). Дорожки 1-12 представляют собой следующее: (1) культуральная жидкость клеточной культуры, (2) после центрифугирования (осветление 1°), (3) перед фильтрованием через 0,2-мкм фильтр, (4) после фильтрования через 0,2-мкм фильтр (осветление 2°), (5) объединенная среда после прохождения и промывки мембранного адсорбера Mustang™ Q, (6) объединенные фракции после элюирования BBC в мембранном адсорбере Mustang™ Q, (7) концентрат BBC, полученный после ПФ ультрафильтрации/диафильтрации, (8) перед фильтрованием через 0,2-мкм фильтр (конечным), (9) после фильтрования через 0,2-мкм фильтр (конечного) (общий концентрат очищенного BBC), (10) проведение стандартизации Bio-Rad® Precision Plus Protein™, (11) BBC, очищенный центрифугированием в градиенте плотности сахарозы (добавляли лишь половину объема от объема дорожки 9) и (12) контроль BBC (серия #1, очищенный общий концентрат).
На Фиг.5В представлено SDS-PAGE (4-20% Трис-глициновый гель) сравнение BBC, очищенного при помощи Вестерн-блоттинга в соответствии с методикой, описанной для Фиг.1, с BBC, очищенным центрифугированием в градиенте плотности сахарозы (дорожка 11), в соответствии с пояснением к Фиг.5А.
На Фиг.6 приведена гистограмма, показывающая процентный титр выхода BBC, полученный в четырех экспериментальных сериях адаптации методики к крупномасштабному применению (объем клеточной культуры 4,5 л). CR #1 представляет собой экспериментальную Серию 1, CR #2 представляет собой экспериментальную Серию 2, CR #3 представляет собой экспериментальную Серию 3 и ТТ 01 представляет собой экспериментальную Серию 4.
На Фиг.7 приведена гистограмма, показывающая удаление загрязняющих белков в операции очистки при помощи MustangTM Q для конструкции BBCINN4CT1-gag1.
На Фиг.8А изображена гистограмма, показывающая получение BBCNJN4CT1-gag1 при скрининге в ТМАЕ (триметиламиноэтиловая смола) при pH 6,5.
На Фиг.8В изображена гистограмма, показывающая получение BBCNJN4CT1-gag1 при скрининге в ТМАЕ при pH 7,0.
На Фиг.8С изображена гистограмма, показывающая получение BBCNJN4CT1-gag1 при скрининге в ТМАЕ при pH 7,5.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Из-за того, что вирус везикулярного стоматита (BBC) имеет множество характеристик, которые делают привлекательным его применение в качестве вектора в описанных выше иммуногенных композициях и/или для доставки генов, кодирующих терапевтические белки, в данной области техники имеется потребность в разработке способов очистки, при помощи которых из культур клеток млекопитающих можно получать рекомбинантный BBC повышенной степени чистоты. Указанную потребность удовлетворяют композиции и способы, раскрытые в настоящем описании. В нижеследующих Примерах 3-8 описаны усовершенствованные способы очистки и выделения BBC из культуры клеток млекопитающих (см., например, Фиг.1) и BBC, очищенный при помощи таких способов.
I. Получение BBC в культуре клеток млекопитающих
Процедура получения BBC в культуре клеток млекопитающих хорошо известна специалистам в данной области техники, и она обычно включает заражение клеточной культуры (клетки-хозяина) рекомбинантным BBC, культивирование BBC в клеточной культуре и сбор клеточной культуры в подходящий момент. Поскольку BBC выделяется из клеток-хозяев в среду, получаемый BBC собирают в жидкости клеточной культуры.
В способе приготовления BBC из культуры клеток млекопитающего и, следовательно, в новых способах выделения BBC из этой культуры применяют подходящие культуры клеток млекопитающего, используемые для размножения (или роста) BBC (вирус с несегментированной антисмысловой одноцепочечной PHK), известные в данной области техники. Неограничивающие примеры таких клеточных культур включают эмбриональные клетки почки человека (HEK), клетки HEK 293, клетки почки Африканской зеленой мартышки (AGMK), например клетки Vero, клетки яичников Китайского хомячка (СНО) и клетки почки новорожденных хомячков (BHK).
Кроме того, материалы клеточных культур, способы и методики известны специалистам в данной области техники. Например, исходный материал рекомбинантного BBC (например, «спасенный» BBC, см. ниже раздел II) применяют для заражения популяции монослоя клеток-хозяев или популяции клеток-хозяев, имеющей определенную плотность (например, культуры клеток Vero) в биореакторе при заданной множественности заражения; BBC культивируют в клеточной культуре в течение заданного времени и при заданной температуре, и образующееся потомство BBC собирают в составе культуральной жидкости клеток. Как указано далее, термины «культуральная жидкость», «жидкость клеточной культуры», «среда для клеточной культуры», «среда» и/или «жидкость из биореактора» взаимозаменяемы и относятся к среде или раствору, в котором культивируют клеточную культуру.
II. Очистка (получение) BBC из культуры клеток млекопитающих
Рассматриваемые в настоящем описании новые способы получения BBC из культуральной жидкости культуры клеток млекопитающих, зараженных BBC, включают несколько операций очистки. На блок-схеме, показанной на Фиг.1, представлена общая схема способа, который включает следующие операции: (а) первичное осветление, (b) вторичное осветление, (с) адсорбцию на анионообменной мембране, (d) проточную фильтрацию вдоль направления потока и (е) фильтрование. Более конкретно, указанные операции включают (а) осветление жидкости клеточной культуры при помощи низкоскоростного центрифугирования, (b) дальнейшее осветление надосадочной жидкости, полученной после центрифугирования, фильтрованием через фильтр с отверстиями размером от 0,2 до 0,45 мкм, (с) очистку отфильтрованного раствора, содержащего BBC, в анионообменном мембранном адсорбере, (d) замену буфера и концентрирование BBC при помощи проточной фильтрацией вдоль направления потока (ПФ) и (е) конечное фильтрование концентрата, содержащего BBC, через фильтр с отверстиями размером от 0,2 до 0,22 мкм. В некоторых других примерах реализации стадии очистки (а)-(е) осуществляют при комнатной температуре. Как указано выше, «комнатная температура» означает температуру или температуры, составляющие или находящиеся в диапазоне от приблизительно 15°C до приблизительно 25°C. Таким образом, например, подходящая температура проведения операций (а)-(е) включает температуру, составляющую по меньшей мере 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 и включая 25°C, или дробные значения температуры, находящиеся между указанными значениями. В одном из конкретных примеров реализации, операции очистки (а)-(е) проводят при 20°С.
(а) Первичное осветление
В некоторых примерах реализации, культуральную жидкость культуры клеток млекопитающего, зараженных BBC, осветляют при помощи низкоскоростного центрифугирования (или, в альтернативном случае, объемным фильтрованием), и BBC получают в надосадочной жидкости - в настоящем описании эту операцию также называют «первичным (или 1°) осветлением» жидкости клеточной культуры. В некоторых примерах реализации, первичное осветление жидкости клеточной культуры проводят при комнатной температуре.
Способы и оборудование для центрифугирования, применяемые для первичного осветления жидкости клеточной культуры, хорошо известны специалистам в данной области техники. Ниже указано, что «низкоскоростное» центрифугирование представляет собой центрифугирование со скоростью менее 10000 об/мин. В некоторых примерах реализации, скорость низкоскоростного центрифугирования, которое применяют для осветления жидкости клеточной культуры, составляет скорость центрифугирования, находящуюся в диапазоне от 4000×g(±100×g) до 8000×g(±100×g). В других примерах реализации скорость низкоскоростного центрифугирования, применяемого для осветления жидкости клеточной культуры, представляет собой скорость центрифугирования, составляющую по меньшей мере 4000×g, 4500×g, 5000×g, 5500×g, 6000×g, 6500×g, 7000×g, 7500×g или 8000×g или любое количество об./мин, лежащее в указанных диапазонах. В одном из конкретных примеров реализации первичное осветление жидкости клеточной культуры низкоскоростным центрифугированием производят при 6238×g в течение 30 минут при комнатной температуре (Пример 3, Таблица 2).
Как указано выше, в некоторых примерах реализации, культуральную жидкость культуры клеток млекопитающего, зараженных BBC, в альтернативном случае осветляют (1°) объемным фильтрованием (вместо низкоскоростного центрифугирования). Объемное фильтрование может быть использовано, если на стадии (а) первичного осветления не применяют низкоскоростное центрифугирование. Объемное фильтрование (в отличие от поверхностного фильтрования) обычно проводят при помощи «толстых» фильтров, которые иммобилизуют загрязнения внутри своей структуры. Материалы и способы объемного фильтрования хорошо известны специалистам в данной области техники. Например, материал фильтра обычно представляет собой толстую структуру из целлюлозного волокна, заполненного неорганическими фильтрующими добавками, например частицами диатомитовой земли (кизельгура), заполняющими отверстия волокон. Такой материал фильтра имеет большую площадь внутренней поверхности, которая является фактором, определяющим характеристики улавливания частиц и фильтрации. Диаметры пор указанных модулей для объемного фильтрования равны по размеру или находятся в диапазоне от 1,0 мкм до 4,5 мкм, включая размеры отверстий, составляющие по меньшей мере 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0 и 4,5 мкм, а также дробные значения, находящиеся между указанными величинами. Неограничивающие примеры модулей, применяемых для объемного фильтрования, включают модули Whatman® Polycap™ HD (Whatman Inc.; Florham Park, NJ), модули Sartorius Sartoclear™ P (Sartorius Corp.; Edgewood, NY) и модули Millipore® Millistak+® HC (Millipore; Billerica, MA). В одном из конкретных примеров реализации культуральную жидкость очищают при помощи объемного фильтрования (проводимого при комнатной температуре) и BBC получают в составе фильтрата (Пример 3, Таблица 1).
(b) Вторичное осветление
После первичного осветления, проводимого посредством центрифугирования (или объемного фильтрования), жидкость, содержащую BBC (или фильтрат), осветляют далее (2°) при помощи фильтрования или микрофильтрации через фильтр с отверстиями размером от 0,2 до 0,25 мкм, и BBC извлекают в отфильтрованный раствор. В одном из конкретных примеров реализации, микрофильтрацию производят при комнатной температуре, как указано выше. Средства для фильтрования/микрофильтрации изготавливают из различных материалов, и они доступны в различном исполнении и известны специалистам в данной области техники. Неограничивающие примеры установок для микрофильтрации включают установки для фильтрования Millipore Millex®-GV (Millipore; Billerica, MA), установки для фильтрования Millipore Millex®-GP, установки для фильтрования Pall Supor® (Pall Corp.; East Hills, NY), установки для фильтрования Sartorius Sartobran™ (Sartorius Corp.; Edgewood, NY) и установки для фильтрования Sartorius SartoporeTM 2. В некоторых примерах реализации размеры отверстий фильтров указанных установок для фильтрования составляют от 0,2 до 0,45 мкм. Размеры пор указанных установок для фильтрования составляют по меньшей мере 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4 и 0,45 мкм, а также дробные значения, находящиеся между указанными величинами. В одном из конкретных примеров реализации фильтр представляет собой установку для фильтрования Sartorius SartobranTM с размером отверстий, равным 0,2 мкм. Отфильтрованный BBC получают в отфильтрованном растворе.
(с) Адсорбция на анионообменной мембране
После проведения осветления продукта BBC (т.е. стадий осветления 1° и 2°, описанных выше), BBC далее очищают в анионообменном мембранном адсорбере. Материалы, применяемые в мембранных адсорберах, хорошо известны специалистам в данной области техники и поставляются такими производителями, как Sartorius Corp. (Edgewood, NY), Pall Corp. (East Hills, NY) и Sigma-Aldrich Corp. (St. Louis, МО). Неограничивающие примеры анионообменных мембранных адсорберов включают мембранный адсорбер SartobindTM Q (Sartorius Corp.) и мембранный адсорбер Mustang™ Q (Pall Corp.). В одном из конкретных примеров реализации анионообменный мембранный адсорбер представляет собой мембранный адсорбер Pall Mustang™ Q. В общем случае, в мембранной адсорбционной хроматографии могут быть непосредственно использованы способы и буферные растворы, применяемые для традиционной ионообменной хроматографии, которые известны специалистам в данной области техники. В некоторых примерах реализации анионообменную мембранную адсорбционную хроматографию проводят при комнатной температуре, как указано выше.
Таким образом, в некоторых примерах реализации, BBC очищают в анионообменном мембранном адсорбере, в котором отфильтрованный раствор BBC, получаемый после вторичного осветления, загружают в анионообменный мембранный адсорбер, уравновешенный первым буферным солевым раствором (также называемым «уравновешивающим буфером» или «буфером, связывающим BBC»). BBC элюируют с анионообменного мембранного адсорбера с помощью второго буферного солевого раствора («буфером элюирования») с получением фракций, которые содержат BBC (например, см. нижеследующий Пример 6).
В некоторых примерах реализации первый буферный солевой раствор или равновесный буфер представляет собой солевой раствор NaCl или KCl. NaCl или KCl присутствуют в растворе в концентрации, создающей ионную силу, значения которой составляют приблизительно от по меньшей мере 0,1 М до приблизительно 0,4 М. Таким образом, значения ионной силы раствора составляют по меньшей мере 0,1, 0,2, 0,3 и 0,4 М, включая дробные значения, находящиеся между указанными величинами. В одном из конкретных примеров реализации, соль представляет собой NaCl, а ионная сила раствора NaCl составляет 0,3 М. Буферный раствор может представлять собой фосфатный буфер, буфер, который содержит N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновую кислоту (HEPES), или буфер, который содержит трис(гидроксиметил)аминометан (TRIS). В некоторых примерах реализации pH указанных буферных растворов составляет приблизительно от 6,0 до 8,0, т.е. значения pH составляют по меньшей мере 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8 и 8,0 или значения pH, находящиеся между указанными величинами. В одном из конкретных примеров реализации значение pH первого буферного солевого раствора составляет 7,5. В некоторых других примерах реализации значение pKa первого буферного раствора при проведении адсорбции на анионообменной мембране составляет от 6,0 до 8,5, т.е. значение pKa составляет по меньшей мере 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8, 8,0, 8,2, 8,4 и 8,5 или равно значениям pKa, лежащим между указанными значениями.
В конкретных примерах реализации, равновесный буфер также содержит приблизительно от 1% сахарозы до 5% сахарозы. В некоторых примерах реализации, равновесный буфер содержит приблизительно 1% сахарозы. В одном из конкретных примеров реализации, концентрация сахарозы составляет 2%. В другом примере реализации буфер содержит приблизительно 3% сахарозы. В другом примере реализации буфер содержит приблизительно 4% сахарозы. В другом примере реализации буфер содержит приблизительно 5% сахарозы. Тем не менее могут быть использованы и другие значения концентрации сахарозы, находящиеся между указанными целыми значениями.
Второй буферный солевой раствор («буфер элюирования») также может содержать те же буферные компоненты, что и первый (равновесный) буфер. В некоторых примерах реализации второй буферный солевой раствор или буфер элюирования представляет собой солевой раствор NaCl или KCl. В одном из конкретных примеров реализации соль, находящаяся во втором буферном солевом растворе, представляет собой NaCl. NaCl или KCl присутствуют в растворе в концентрации, создающей ионную силу, значения которой составляют приблизительно от по меньшей мере 0,1 М и приблизительно до 0,4 М. Таким образом, значения ионной силы раствора составляют по меньшей мере 0,1, 0,2, 0,3 и 0,4 М, включая дробные значения, находящиеся между указанными величинами. В одном из конкретных примеров реализации соль представляет собой NaCl, а ионная сила раствора NaCl составляет 0,3 М. Буферный раствор может представлять собой фосфатный буфер, буфер, который содержит N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновую кислоту (HEPES), или буфер, который содержит трис(гидроксиметил)аминометан (TRIS). В некоторых примерах реализации значение pH указанных буферных растворов составляет приблизительно от 6,0 до 8,0, т.е. значения pH составляют по меньшей мере 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8 и 8,0 или значения pH, находящиеся между указанными величинами. В одном из конкретных примеров реализации, значение pH второго буферного солевого раствора составляет 7,5. В некоторых других примерах реализации, значение pKa второго буферного раствора при проведении адсорбции на анионообменной мембране составляет от 6,0 до 8,5, т.е. значение pKa составляет по меньшей мере 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8, 8,0, 8,2, 8,4 и 8,5 или равно значениям pKa, лежащим между указанными значениями.
В конкретных примерах реализации, буфер элюирования также содержит приблизительно от 1% сахарозы до 5% сахарозы. В некоторых примерах реализации буфер элюирования содержит приблизительно 1% сахарозы. В одном из конкретных примеров реализации концентрация сахарозы составляет 2%. В другом примере реализации буфер содержит приблизительно 3% сахарозы.
В другом примере реализации буфер содержит приблизительно 4% сахарозы. В другом примере реализации буфер содержит приблизительно 5% сахарозы. Тем не менее могут быть использованы и другие значения концентрации сахарозы, находящиеся между указанными целыми значениями.
Для элюирования BBC из мембраны, концентрацию соли (NaCl или KCl) (ионную силу) в буфере элюирования повышают в соответствии с линейным градиентом или в соответствии с одностадийным способом элюирования (Пример 6). Обе операции одинаково эффективны для элюирования BBC из анионообменного мембранного адсорбера. В одном из конкретных примеров реализации ионная сила NaCl во втором буферном солевом растворе составляет от 0,5 М до 0,75 М. В одном из конкретных примеров реализации ионная сила NaCl во втором буферном солевом растворе составляет 0,6 М. В некоторых других примерах реализации ионная сила NaCl во втором буферном солевом растворе составляет 0,75 М.
В других примерах реализации расход второго буферного солевого раствора при элюировании составляет от 10 объемов капсулы в минуту (ОК/минуту) до 30 ОК/минуту. Таким образом, в некоторых примерах реализации, расход при элюировании составляет по меньшей мере от 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 до 30 ОК/минуту, или равен дробному значению, находящемуся между указанными величинами. В одном из конкретных примеров реализации расход при элюировании составляет 20 ОК/минуту.
В других примерах реализации, ионную силу NaCl во втором буферном солевом растворе линейно увеличивают от 0,001 М до 0,75 М при расходе элюирования, составляющем от 10 ОК/минуту до 30 ОК/минуту, описанном выше. В одном из конкретных примеров реализации, линейный градиент расхода при элюировании составляет 20 ОК/минуту.
(d) Проточная фильтрация вдоль направления потока (ПФ)
После очистки BBC анионообменной мембранной адсорбционной 30 хроматографией BBC далее очищают способом проточной фильтрации вдоль направления потока (ПФ). В общем случае, ПФ представляет собой процесс, протекающий в результате увеличения давления, при котором для разделения компонентов, находящихся в жидком растворе (или суспензии), применяют мембрану (мембраны), и в котором жидкость (поток) перекачивают тангенциально вдоль поверхности мембраны, а прикладываемое давление служит для проталкивания «части» потока через мембрану в сторону фильтрата (через мембраны). В некоторых примерах реализации ПФ проводят при комнатной температуре. При проведении этого способа происходит замена буфера и концентрирование BBC. В одном из примеров реализации ПФ включает по меньшей мере 5-кратное концентрирование BBC, полученного при проведении операции анионообменной мембранной адсорбции с последующей по меньшей мере однократной заменой буфера. В другом примере реализации ПФ включает концентрирование BBC, полученного при проведении операции анионообменной мембранной адсорбции, по меньшей мере от 5 до 10 раз с последующим проведением по меньшей мере пяти или по меньшей мере шести замен буфера. Некоторые другие примеры реализации включают по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, или по меньшей мере шесть замен буфера, проводимых после концентрирования BBC, полученного при проведении операции анионообменной мембранной адсорбции.
Материалы (например, полое волокно, спирально намотанное, плоская пластина) и способы проведения ПФ (например, ультрафильтрация (UF), диафильтрация (DF), микрофильтрация) хорошо известны специалистам в данной области техники. В некоторых примерах реализации, предел пропускания по молекулярной массе мембраны для ПФ составляет 300 кДа. В некоторых других примерах реализации предел пропускания по молекулярной массе мембраны для ПФ составляет 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650 или 700 кДа. В еще одном примере реализации предел пропускания по молекулярной массе мембраны для ПФ составляет 750 кДа. В одном из примеров реализации мембрана для ПФ представляет собой мембранный модуль из полого волокна.
В одном из конкретных примеров реализации буфер, применяемый для замены буфера в ПФ, представляет собой фосфатный буфер, буфер, который содержит HEPES, или буфер, который содержит TRIS, описанные выше. Тем не менее в некоторых примерах реализации концентрация буфера составляет от 5 мМ до 15 мМ, включая концентрации, составляющие по меньшей мере 5 мМ, 6 мМ, 7 мМ, 8 мМ, 9 мМ, 10 мМ, 11 мМ, 12 мМ, 13 мМ, 14 мМ и 15 мМ, а также включая значения концентрации, выраженные в мМ, находящиеся между указанными значениями. В некоторых примерах реализации значение pH буфера составляет приблизительно от 7,2 до 7,5. Так, в одном из примеров реализации значение pH буфера составляет 7,2, 7,3, 7,4 или 7,5 или равно дробным значениям pH, находящимся между указанными значениями. В другом примере реализации, буфер, применяемый для замены буфера, также содержит от 0,10 М до 0,20 М NaCl и от 3,5% до 4,5% сахарозы.
В одном из конкретных примеров реализации (см. Пример 7), фракции BBC, получаемые при проведении анионообменной мембранной адсорбционной очистки, объединяют, и объединенный раствор концентрируют и осуществляют замену буфера помощи ПФ, используя мембранный картридж для ПФ, изготовленный из полого волокна, предел пропускания по молекулярной массе которого составляет 750 кДа (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.; Piscataway, NJ).
(e) Фильтрование
Последняя технологическая операция очистки представляет собой конечную микрофильтрацию концентрата BBC, полученного при ПФ, включающую фильтрование концентрата через фильтр с размером отверстий от 0,2 до 0,25 мкм, описанный выше для операции вторичного осветления путем проведения микрофильтрации, и также описанный ниже в Примере 7. Например, подобная фильтрационная установка может включать фильтр с размером отверстий, равным 0,20, 0,21, 0,22, 0,23, 0,24 или 0,25 мкм или равным дробным значениям, находящимся между указанными значениями.
Очистка BBC в соответствии с рассматриваемыми в настоящем описании новыми способами, подробно описана в нижеследующих Примерах; описание включает первичное (Пример 3) и вторичное (Пример 4) осветление культуральной жидкости, включающее низкоскоростное центрифугирование (или объемное фильтрование) и фильтрование через фильтр с размером отверстий, равным 0,2-0,45 мкм, соответственно.
После проведения операций осветления, BBC далее очищают, последовательно проводя очистку в анионообменном мембранном адсорбере (Пример 6); проточную фильтрацию вдоль направления потока; ультрафильтрацию и диафильтрацию (Пример 7), и фильтрование через фильтр с размером отверстий, равным 0,2-0,22 мкм (Пример 7). Кроме того, в соответствии с рассматриваемыми способами, были проведены четыре крупномасштабных очистки (4,5 л) партии клеточной культуры BBC (для адаптации способа к крупномасштабному производству) (Пример 8), в которых при очистке извлекали более 99,9% и 99,8% белковых загрязнений (Таблица 11) и ДНК (Таблица 13), соответственно.
III. Рекомбинантный вирус везикулярного стоматита
В соответствии с настоящим описанием, BBC повышенной степени чистоты может быть получен из культуры клеток млекопитающего при использовании новых способов очистки, раскрытых в настоящем описании. Под «повышенной степенью чистоты» следует понимать, что очищенный BBC по меньшей мере на 90,0% освобожден от загрязняющих белков и нуклеиновых кислот клеточной культуры. В других примерах реализации очищенный BBC по меньшей мере на 99,0% освобожден от загрязняющих белков и нуклеиновых кислот клеточной культуры. В одном из конкретных примеров реализации, очищенный BBC по меньшей мере на 99,8% освобожден от загрязняющих белков и нуклеиновых кислот клеточной культуры.
В конкретных примерах реализации вирус везикулярного стоматита (BBC), выделяемый из культуральной жидкости клеточной культуры млекопитающего при помощи вышеописанного способа, представляет собой рекомбинантный или генетически модифицированный BBC. Способы получения рекомбинантных РНК, вирусов, например BBC, хорошо известны в данной области техники и называются способами «спасения» или «обратной генетики». Неограничивающие примеры способов спасения BBC включают способы, описанные в патенте США 6033886 и патенте США 6168943, каждый из которых полностью включен в настоящее описание по ссылке. Другие методики спасения вирусов, например BBC, описаны в патенте США 6673572 и международной заявке WO 2004/113517, которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.
BBC повышенной степени чистоты, который очищают и выделяют в соответствии с новыми способами очистки, раскрытыми в настоящем описании, может представлять собой BBC конкретного серотипа. В некоторых примерах реализации, очищенный BBC представляет собой серотип Indiana, серотип New Jersey, серотип San Juan, серотип Isfahan, серотип Glasgow или серотип Chandipura. В некоторых примерах реализации BBC может содержать последовательность из более одного указанного серотипа.
Векторы BBC (и включающие его иммуногенные композиции), очищенные в соответствии с новыми способами очистки, раскрытыми в настоящем описании, часто содержат одну или несколько ослабляющих мутаций, находящихся в геноме BBC. В некоторых примерах реализации очищенный BBC имеет геномную последовательность, которая содержит по меньшей мере одну мутацию, которая ослабляет патогенное действие BBC. В других примерах реализации, очищенный BBC имеет геномную последовательность, которая содержит по меньшей мере две мутации, которые ослабляют патогенное действие BBC. Например, ослабленный BBC содержит две или более известные ослабляющие мутации, например мутации, описанные в Международной патентной заявке No. PCT/US2005/011499 (Международная заявка на патент No. WO 2005/098009), полностью включенной в настоящее описание посредством ссылки. Так, неограничивающие примеры известных ослабляющих мутаций BBC включают мутации перетасовки генов (gene shuffling, включая перетасовку генов BBC, образующих BBC геном и обозначаемых буквами N, P, M, G и L), инсерционные мутации в G-белке, мутации, укорачивающие G-белок, мутации, чувствительные к температуре (и другие точечные мутации), нецитопатические мутации М-гена, мутации G-ствола, мутации «двусмысленной» РНК (ambisense RNA mutations) и мутации, приводящие к делеции гена, каждая из которых описана в Международной патентной заявке No. WO 2005/098009. Так, в некоторых примерах реализации, очищенный BBC содержит одну или несколько ослабляющих мутаций, неограничивающие примеры которых включают мутацию, чувствительную к температуре, точечную мутацию, мутацию перетасовки генов, мутацию G-ствола, нецитопатическую мутацию М-гена, мутацию «двусмысленной» РНК, мутацию, укорачивающую G-белок, инсерционную мутацию G-белка и мутацию, приводящую к делеции гена.
В некоторых примерах реализации, BBC, очищенный в соответствии со способами очистки, раскрытыми в настоящем описании, имеет геномную последовательность, которая содержит одну или несколько чужеродных или гетерологических (или чужеродных) полинуклеотидных последовательностей, например открытую рамку считывания (open reading frame (ORF)) чужеродных РНК. Гетерологические полинуклеотидные последовательности могут быть при необходимости изменены, и их неограничивающие примеры включают ген, кодирующий цитокин (например, интерлейкин), ген, кодирующий антигенную детерминанту Т-клетки-хелпера (хелперную детерминанту), ген, кодирующий антигенную детерминанту CTL, ген, кодирующий адъювант, и ген, кодирующий кофактор, ген, кодирующий рестрикционный маркер, ген, кодирующий терапевтический белок или белок другого микробного патогена (например, вируса, бактерии, паразита или грибка), в особенности белки, способные вызывать желаемую иммунную реакцию. Например, гетерологические полинуклеотидные последовательности, кодирующие белок иного микробного патогена, могут представлять собой один или несколько следующих генов: ген вируса ВИЧ, ген вируса Т-клеточного лейкоза человека (human T cell leukemia virus), ген обезьяньего вируса иммунодефицита (Simian Immunodeficiency Virus), ген вируса RSV (Respiratory Syncytial Virus), ген вируса PIV (Parainfluenza Virus), ген вируса простого герпеса (HSV), ген цитомегаловируса (CMV), ген вируса Эпштейна-Барра, ген вируса Варицелла-Зостер, ген вируса эпидемического паротита, ген вируса кори, ген вируса гриппа, ген полиовируса, ген риновируса, ген вируса гепатита А, ген вируса гепатита В, ген вируса гепатита С, ген вируса Norwalk, ген тогавируса, ген альфавируса, ген вируса краснухи, ген вируса бешенства, ген вируса Марбурга, ген вируса Эбола, ген вируса папилломы, ген вируса полиомы, ген метапневмовируса, ген коронавируса, ген Vibrio cholerae, ген Streptococcus pneumoniae, ген Streptococcus pyogenes, ген Helicobacter pylori, ген Streptococcus agalactiae, ген Neisseria meningitidis, ген Neisseria gonorrheae, ген Corynebacteria diphtheriae, ген Clostridium tetani, ген Bordetelta pertussis, ген Haemophilus, ген Chlamydia и ген Escherichia coll. В некоторых примерах реализации очищенный BBC содержит последовательность гена ВИЧ, причем указанную последовательность ВИЧ выбирают из группы, состоящей из последовательностей генов gag, env, pol, vif, nef, tat, vpr, rev или vpu. В одном из конкретных примеров реализации ген ВИЧ представляет собой ген gag или env.
В некоторых примерах реализации, очищенный BBC содержит и по меньшей мере одну ослабляющую мутацию, и по меньшей мере одну гетерологическую открытую рамку считывания, описанную выше. Например, иммуногенные композиции содержат BBC (т.е. VSVINN4CT9-gag-1), очищенный в соответствии с новыми способами, примеры которых даны в нижеследующем Разделе V (Примеры 2-8), представляет собой рекомбинантный BBC, включающий две ослабляющие мутации и открытую рамку считывания, кодирующую белок gag ВИЧ-1.
В других примерах реализации BBC, очищенный в соответствии с новыми рассмотренными в настоящем описании способами, кодирует ген gag ВИЧ, причем ген gag введен в последовательность генома BBC в положении один (3'-gag1-NPMGL-5'), положении два (3'-N-gag2-PMGL-5'), положении три (3'-NP-gag3-MGL-5'), положении четыре (3'-NPM-gag4-GL-5'), положении пять (3'-NPMG-gag5-L-5') или положении шесть (3'-NPMGL-gag6-5'). В других примерах реализации BBC, очищенный в соответствии с новыми способами, раскрытыми в настоящем описании, кодирует ген env ВИЧ, причем ген env введен в последовательность генома BBC в положении один (3'-env1-NPMGL-5'), положении два (3'-N-env2-PMGL-5'), положении три (3'-NP-env3-MGL-5'), положении четыре (3'-NPM-env4-GL-5'), положении пять (3'-NPMG-env5-L-5') или положении шесть (3'-NPMGL-env6-5').
На основании вышеизложенного, специалист в данной области техники должен понимать, что в соответствии со способами и методиками, предлагаемыми в настоящем описании, могут быть очищены различные виды рекомбинантных BBC.
IV. Иммуногенные и фармацевтические композиции
В некоторых примерах реализации иммуногенные композиции содержат иммуногенную дозу генетически модифицированного BBC, очищенного в соответствии со способами очистки, представленными в настоящем описании. Например, в некоторых примерах реализации, иммуногенная композиция содержит рекомбинантный BBC, очищенный в соответствии со способами очистки, представленными в настоящем описании, причем указанный BBC содержит одну или несколько последовательностей чужеродных РНК, введенных или замещающих участок генома BBC, несущественный для репликации. К указанным иммуногенным композициям могут быть применены любые примеры реализации рекомбинантного BBC, описанные в вышеизложенном Разделе III. Так, в некоторых примерах реализации, иммуногенную композицию, которая содержит очищенный BBC, готовят для введения млекопитающему пациенту (например, человеку).
Такие композиции обычно содержат очищенный вектор BBC и фармацевтически приемлемый носитель. В соответствии с настоящим описанием, термин «фармацевтически приемлемый носитель» включает любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые вещества, изотонические вещества и вещества с отложенным всасыванием, а также подобные им добавки, совместимые с фармацевтическим введением. Применение таких сред и веществ к фармацевтически активным веществам хорошо известно в данной области техники. За исключением любой традиционной среды или традиционного вещества, несовместимого с вектором BBC, остальные среды могут быть использованы для приготовления иммуногенных композиций, рассматриваемых в настоящем описании. В композиции также могут быть введены дополнительные активные соединения.
Таким образом, рецептура рассматриваемой в настоящем описании иммуногенной композиции должна быть совместима с предполагаемым способом введения этой композиции. Примеры способов введения включают: парентеральный (например, внутривенный, внутрикожный, подкожный, внутримышечный, внутрибрюшинный) и мукозальный (например, пероральный, перректальный, интраназальный, буккальный, вагинальный, респираторный) способы введения. Растворы или суспензии, применяемые для парентерального, внутрикожного или подкожного введения, включают следующие компоненты: стерильный разбавитель, например воду для инъекций, солевой раствор, нелетучие масла, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители; антибактериальные вещества, например бензиловый спирт или метилпарабены; антиоксиданты, например аскорбиновую кислоту или бисульфит натрия; хелатирующие агенты, например этилендиаминтетрауксусную кислоту; буферы, например ацетаты, цитраты или фосфаты, и вещества, регулирующие тоничность, например хлорид натрия или декстрозу. Значение pH регулируют добавлением оснований или кислот, например гидроксида натрия или соляной кислоты. Парентеральные препараты могут быть заключены в ампулы, одноразовые шприцы или флаконы для многократных дозировок, изготовленные из стекла или пластика.
Фармацевтические композиции, пригодные для инъекционного применения, включают стерильные водные растворы (если вещества являются водорастворимыми) или дисперсии и стерильные порошки, применяемые для приготовления стерильных водных растворов или дисперсий непосредственно перед введением. Для внутривенного введения подходящие носители включают физиологический раствор, бактериостатическую воду, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ) или фосфатно-солевой буферный раствор (phosphate buffered saline (PBS)). Во всех случаях композиция должна быть стерильной и достаточно текучей, чтобы ее можно было вводить через шприц. Она должна быть стабильна в условиях изготовления и хранения, и, кроме того, композиция должна быть защищена от загрязнения микроорганизмами, например бактериями и грибками. Носитель представляет собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и подобные им вещества) и подходящие смеси указанных веществ. Достаточную текучесть обеспечивают, например, при помощи покрытий, например из лецитина, которые в случае дисперсии позволяют сохранять желаемый размер частиц, и посредством использования поверхностно-активных веществ. Предотвращение воздействия микроорганизмов осуществляют путем добавления различных антибактериальных и противогрибковых веществ, например, парабенов, хлорбутанола, фенола, аскорбиновой кислоты и подобных им соединений. Во многих случаях в композицию предпочтительно включать изотонические добавки, например сахара, полиспирты, например маннит, сорбит, и хлорид натрия. Пролонгированное всасывание инъецируемых композиций обеспечивают за счет включения в композицию добавки, замедляющей всасывание, например моностеарата алюминия и желатина.
Стерильные инъецируемые композиции готовят введением требуемого количества (или дозы) вектора BBC, находящегося в подходящем растворителе, при необходимости - в одном из сочетаний ингредиентов, перечисленных выше, с проведение последующей фильтровальной стерилизацией. Обычно дисперсии готовят введением активного соединения в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты, выбираемые из перечисленных выше. В случае использования стерильных порошков, применяемых для приготовления стерильных инъецируемых растворов, предпочтительно способы их приготовления включают вакуумную сушку и лиофилизацию, при которых порошок активного ингредиента и любого необходимого дополнительного ингредиента получают из предварительно приготовленного раствора указанных ингредиентов, прошедшего фильтровальную стерилизацию.
При введении способом ингаляции, соединения вводят в форме аэрозольных спреев из контейнера или распылительного устройства, находящегося под давлением, которое содержит подходящий газ-вытеснитель (например, такой газ как диоксид углерода или распылитель). Системное введение также может быть осуществлено при помощи мукозальных или трансдермальных средств. Для мукозального или трансдермального введения в состав включают проникающее вещество, пригодное для проникновения через конкретный барьер. Указанные проникающие вещества известны в данной области техники и в случае мукозального введения включают, например, детергенты, соли желчной кислоты и производные фусидовой кислоты. Для трансдермального введения используют назальные спреи или суппозитории. Соединения также готовят в виде суппозиториев (например, на традиционных основах, применяемых для приготовления суппозиториев, таких как масло какао и другие глицериды) или удерживающих клизм, применяемых для перректального введения.
В некоторых примерах реализации, для облегчения введения и равномерного распределения дозировок, композиции, предназначенные для перорального или парентерального введения, удобно приготавливать в виде стандартных лекарственных форм. В соответствии с настоящим описанием стандартной лекарственной формой называются физически дискретные единицы, пригодные для введения в качестве одноразовых доз пациенту, подвергаемому лечению; каждая такая форма содержит заранее определенное количество активного компонента, в соответствии с предварительными расчетами позволяющее получать желаемый терапевтический эффект, в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем. Указанные в настоящем описании технические требования к стандартным лекарственным формам продиктованы и непосредственно определяются уникальными характеристиками активного соединения и особым достигаемым терапевтическим эффектом, а также ограничениями, налагаемыми в соответствии с правилами данной области техники на приготовления подобных активных соединений, предназначенных для лечения индивидуальных пациентов.
ПРИМЕРЫ
Нижеследующие примеры выполнены при помощи стандартных методик, хорошо известных и не вызывающих затруднений у специалистов в данной области техники; исключения подробно рассмотрены в настоящем описании. Нижеследующие примеры даны лишь с целью иллюстрации изобретения и никоим образом не ограничивают область применения композиций и способов, раскрытых в настоящем описании. Примеры 1 и 2 относятся ко всем трем рассматриваемым конструкциям BBC (VSV). Примеры 3-9 относятся только к конструкции VSVIN N4CT9-gag1. Примеры 10-11 относятся только к конструкции VSVIN N4CT1-gag1. Пример 12 относится только к конструкции VSVNJ N4CT1-gag1.
Рекомбинантный BBC (серотип Indiana; rVSVIN), очищаемый в соответствии со следующими примерами, содержит ген ВИЧ gag в первой позиции генома BBC (gag1) и ген N, перетасованный в четвертое положение генома BBC (N4). В одной из конструкций BBC содержит ген G, имеющий усеченный цитоплазматический конец ("СТ9"); такая конструкция обозначена как "VSVIN N4CT9-gag1". В другой конструкции BBC содержит ген G, имеющий усеченный цитоплазматический конец ("CT1"); такая конструкция обозначена как "VSVIN N4CT1-gag1". В других примерах рекомбинантный BBC (серотип New Jersey; rVSVNJ), очищаемый в соответствии со следующими примерами, содержит ген ВИЧ gag в первой позиции генома BBC (gag1), ген N, перемещенный в четвертое положение генома BBC (N4), и ген G, имеющий усеченный цитоплазматический конец ("CT1"); такая конструкция обозначена как "VSVNJ N4CT1-gag1". Указанные конструкции и мутации подробно описаны в Международной патентной заявке No. WO 2005/098009, полностью включенной в настоящее описание по ссылке.
Тем не менее рассматриваемые в настоящем описании новые способы очистки не ограничены конкретной конструкцией рекомбинантного BBC или конкретными серотипами (например, Indiana, New Jersey и т.д.), и, как таковые, эти способы очистки включают очистку конструкций BBC, включающих геномные последовательности «дикого» типа, ослабленные геномные последовательности, последовательности«чужеродных» нуклеиновых кислот или любые другие сочетания перечисленных комбинаций (для обзора таких конструкций BBC см. Раздел III выше). Кроме того, способы получения рекомбинантных РНК вирусов хорошо известны и называются «спасением» или способами «обратной генетики». Примеры способов спасения рекомбинантного BBC описаны выше в Разделе III.
В следующих примерах описана очистка pBBC (рекомбинантного BBC) (на примерах конструкций VSVIN N4CT9-gag1, VSVIN N4CT1-gag1 или VSVNJN4CT1-gag1) из клеток Vero. Тем не менее описанные способы очистки BBC также могут быть применены для очистки BBC из любой подходящей культуры клеток млекопитающего, неограничивающие примеры которых включают эмбриональные клетки почечки человека (human embryonic kidney (HEK)) (например, клетки HEK 293), клетки яичников Китайского хомячка (Chinese hamster ovary (CHO)) и клетки почечки новорожденного хомячка (baby hamster kidney (BHK)).
ПРИМЕР 1: Анализы белков, ДНК и эффективности BBC
Для оценки способов очистки, описанных ниже в Примерах 2-12, применяли следующие аналитические методики.
Общая концентрация белков. Общую концентрацию белков определяли, используя анализ в присутствии бицинхониновой кислоты (БЦК) (Bio-Rad Laboratories Inc.; Hercules, CA), применяя в качестве стандарта белка бычий сывороточный альбумин (БСА).
SDS-PAGE и вестерн-блоттинг анализ. Для отделения и определения белков образцы BBC смешивали с три-глициновым буфером для образцов в отношении 1:1 (для конструкции VSVIN N4CT9-gag1) или 3:1 (для конструкции VSVIN N4CT1-gag1), кипятили в течение 10 минут при 100°С и разделяли при помощи электрофореза на полиакриламидном геле, содержащем 4-20% трис-глицин-додецилсульфата натрия (Tris-glycine sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)), с последующим двойным окрашиванием серебряным красителем (Wako Chemicals USA, Inc.; Richmond, VA) и коллоидным красителем Coomassie® Blue (Invitrogen Corp.; Carlsbad, CA). Чувствительность двойного окрашивания позволяла легко обнаруживать высокомолекулярные примеси в образцах BBC.
После электрофореза на геле, белки переносили электрофоретическим способом на мембрану из нитроцеллюлозы (Amersham Biosciences Corp.; Piscataway, NJ). После блокировки, производимой в течение одного часа в солевом буферном растворе TRIS (трис-буферный солевой раствор; ТБС), содержащем 3% БСА, мембрану инкубировали в растворе антител (1% БСА в ТБС, содержащем 0,05% Tween-20 (ТТБС) и содержащем анти-BBC поликлональные антитела кролика, полученные из клеток ВНК, 1:1000 об./об.), и инкубировали с антителом козы против кролика, связанным с пероксидазой хрена (HRP, 1:1000 (об./об.)) (Bio-Rad Laboratories Inc.; Hercules, CA). После промывания ТТБС и ТБС, для определения добавили реактив, проявляющие окраску HRP (Bio-Rad Laboratories Inc.; Hercules, CA), и реакцию потушили дистиллированной водой. Окрашенный гель и проявленную мембрану фиксировали при помощи системы формирования изображений Alphalmager® (Alpha Innotech Corp.; San Leandro, CA), снабженной программным обеспечением AlphaEaseFC® software.
Эксклюзионная жидкостная хроматозрафия высокого разрешения для разделения по размерам (ЭЖХВР). Для быстрого отделения BBC от загрязняющих белков был разработан протокол эксклюзионной ЖХВР, позволяющий проводить качественный анализ способа очистки BBC. Таким образом, образцы BBC, находящиеся в процессе обработки (100 мкл) and purified bulk concentrate BBC (100 мкл), и очищенный общий концентрат BBC (100 мкл) загружали в аналитическую эксклюзионную колонку для разделения по размерам (колонка TSK-Gel PW G6000PWXL, размер частиц 17 микрон, размер пор 1000 Ангстрем) (Tosho Biosciences LLC; Montgomeryville, PA), уравновешенную фосфатным солевым буфером (без Ca2+ или Mg2+), и проявляли при скорости элюирования, равной 1 мл в минуту. Система работала при помощи системы подачи растворителя Agilent 1100™, управляемой программным обеспечением ChemStationTM (Agilent Technologies Inc.; Palo Alto, CA). Регистрацию УФ-спектров производили при помощи фотодиодного детектора, а хроматограммы получали, регистрируя поглощение УФ-света при 215 нм.
Анализ эффективности BBC. Эффективность BBC оценивали двумя разными способами: традиционным анализом бляшкообразования и иммунофлуоресцентным анализом бляшкообразования. Для проведения традиционного анализа бляшкообразования, клетки Vero, помещенные в DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)+10% телячьей сыворотки крови, высевали в 6-луночные планшеты при концентрации 1×106 клеток/лунка (и 2 мл клеточной культуры на лунку) и инкубировали в течение ночи при 37°С. Клетки проверяли на следующие сутки, чтобы убедиться в образовании сливающихся монослоев. Образцы вируса с неизвестным титром, а также образцы положительного и отрицательного контроля серийно разбавляли в отношении 1:10 следующей средой: DMEM+10 мл/л натриевой соли пировиноградной кислоты + 0,5 мл/л гентамицина (Gentamicin) до получения желаемых значений титра. Образцы положительного контроля представляли собой стандарты BBC с известным титром. Образцы отрицательного контроля (или слепые опыты) содержали только среду. Клеточную среду отсасывали с 6-луночных планшетов, затем в лунки добавляли разбавленный вирус (0,5 мл раствора вируса в лунку), в двух экземплярах. Вирус подвергали адсорбции при комнатной температуре в течение пятнадцати минут, затем инкубировали при 32°С в течение тридцати минут. Планшеты встряхивали вручную каждые 5-10 минут для поддержания монослои клеток во влажном состоянии. Для получения покровного агарового слоя объединяли агарозу (при 50°С) и DMEM (при 37°С, 10 мл/л натриевой соли пировиноградной кислоты + 0,5 мл/л гентамицина) в отношении 1:4. Вирус отсасывали с планшетов, и при помощи пипетки-ретранслятора наносили 3 мл на лунку покровного слоя. Покрытые планшеты охлаждали в вытяжном шкафу при комнатной температуре, затем переносили для инкубации при 32°С в течение 72 часов или до тех пор, пока не образуются ясно видимые бляшки (приблизительно диаметром 1 мм или более). Бляшки пересчитывали, направляя на планшеты свет от источников света. Исходя из подсчитанного количества бляшек, определяли титр каждого образца, который выражали в бляшкообразующих единицах (БОЕ) (plaque forming units (PFU)) на мл.
Анализ второго типа (иммунофлуоресцентный анализ бляшкообразования) проводили BBC заражением монослоев клеток Vero (на 48-луночных планшетах). Спустя двадцать четыре или тридцать шесть часов, клетки Vero фиксировали и сначала, в зависимости от используемой конструкции, производили пробу на VSVIN или VSVNJ с моноклональным антителом, а затем пробу со вторичным антителом, связанным с флуоресцентным красителем. Для определения флуоресцирующих очагов внутри монослоя клеток Vero, инфекционные частицы пересчитывали при помощи флуоресцентной микроскопии. Затем пересчитывали флуоресцирующие очаги, и титр образца выражали в инфекционных единицах (ИЕ) (infectious units (IU)) или бляшкообразующих единицах (БОЕ).
Анализ остаточных ДНК. Количественное и качественное определение ДНК клеток-хозяев проводили с использованием набора для микроанализа PicoGreen® Quant-iT™ DNA (Invitrogen Corp.; Carlsbad, CA). Микроанализ проводили в соответствии с инструкциями производителя, используя в качестве стандарта лямбда-ДНК.
ПРИМЕР 2: Получение BBC в культуре клеток Vero
Экспериментальные партии BBC получали в биореакторе емкостью 10 литров, используя культуры клеток Vero (почечные клетки Африканской мартышки) на микроносителях. Применяемые клетки Vero были предоставлены клеточным банком cGMP Master Cell Bank. Клетки Vero выращивали на микроносителях Cytodex™ I (Amersham Biosciences Corp.; Piscataway, NJ) при плотности 7,5 граммов сухих гранул на литр. Рабочий объем культуры в биореакторе составлял от 5,5 до 6,5 литров. Для инокуляции клетки Vero соединяли с микроносителями CytodexTM I при общем объеме, равном приблизительно 2 литра. Целевая плотность высева культуры составляла 5×105 клеток/мл. Для прикрепления клеток к микроносителям производили переменное циклическое перемешивание в течение 2 часов в указанном сниженном объеме. Культуру перемешивали в течение 5 минут при 40 об/мин, а затем оставляли осаждаться при 0 об/мин в течение четырех полных циклов.
После циклического перемешивания отбирали образцы культуры, и, если прикрепление было удовлетворительным, к культуре добавляли бессывороточную среду для выращивания вируса (Virus Production Serum-Free Medium (VP-SFM)) до получения рабочего объема, равного от 5,5 до 6,5 литров. Клетки выращивали при 2-4×106 клеток/мл при 37°С и 40 об/мин. К покровному слою постоянно подводили воздух со скоростью 50 см3/мин. Кислород и диоксид углерода подводили к покровному слою при необходимости, со скоростью 50 см3/мин. Если объем кислорода, требуемый для развития культуры, превышал объем, поставляемый покровным слоем, кислород вводили в культуру через металлокерамический барботер (scintered sparger) при начальной скорости 6 см3/мин. Скорость повышали вручную по мере увеличения потребности в кислороде. Для контроля pH, значения которого для культуры устанавливали равным 7,30, применяли диоксид углерода (кислоту) и 7,5% (масс./об.) бикарбонат натрия (основание). Свежую культуральную среду в количестве половины исходного объема вливали в культуру каждые сутки, начиная приблизительно спустя 48 часов после начала культивирования. Инфицирование клеток Vero рекомбинантным BBC производили при 32°С при множественности заражения (М3), равной 0,01. Для усиления адсорбции вируса на клетках, сразу после добавления вируса в культуру биореактора производили одночасовой цикл переменного перемешивания. Культуру перемешивали в течение 6 минут при 40 об/мин, а затем оставляли осаждаться в течение 24 часов при 0 об/мин в течение двух полных циклов. После одночасового переменного перемешивания остальной цикл инфицирования проводили в периодическом режиме при 40 об/мин. Для определения цитопатического эффекта (ЦПЭ) образцы инфицированной культуры отбирали каждые 6-16 часов, считали клетки и собирали образцы вирусной жидкости над клетками для определения кинетики роста.
Клеточную культуру собирали спустя приблизительно 44 часа после инфицирования в случае VSVINN4CT9-gag1, спустя приблизительно 48 часов после инфицирования в случае VSVINN4CT1-gag1 и спустя приблизительно 60 часов после инфицирования в случае VSVNJN4CT1-gag1, путем самопроизвольного осаждения микроносителей и сбора культуральной надосадочной жидкости. Для конструкции VSVNJN4CT1-gag1 объединяли жидкость, полученную из двух биореакторов.
ПРИМЕР 3: Способ очистки BBC: Первичное осветление культуральной жидкости, содержащей BBC, для VSVINN4CT9-gag1
После отбора клеточной культуры из биореактора клетки/осколки клеток и другие порошкообразные примеси удаляли способом, известным как «извлечение продукта». Так как BBC выделялся из клеток Vero в культуральную жидкость, BBC получали в осветленной культуральной жидкости. Таким образом, культуральную жидкость, содержащую BBC и находящуюся над осадком (например, приблизительно 4,0-4,5 л из 10-литровой загрузки биореактора), осветляли либо объемным фильтрованием, либо низкоскоростным центрифугированием.
Осветление объемным фильтрованием производили при комнатной температуре, и BBC получали в фильтрате. Проводили испытания следующих модулей для объемного фильтрования: модуля Whatman® Polycap™ HD (Whatman Inc.; Florham Park, NJ), модуля Sartorius Sartoclear™ P (Sartorius Corp.; Edgewood, NY), модуля Millipore® Millistak+® HC (Millipore; Billerica, MA) и модуля CUNO 05/60HP (CUNO Inc., a 3M® company, Meriden, CT). Объемные фильтры загружали фильтратом до полного насыщения фильтра (приблизительно 100-500 мл фильтрата).
Осветляющую эффективность модулей для объемного фильтрования определяли при помощи нефелометра, а количество полученного вируса определяли при помощи анализа бляшкообразования. Характеристики различных фильтров указаны в Таблице 1.
Высокий выход вируса может быть достигнут при использовании модуля Whatman Polycap HD 75. Тем не менее при крупномасштабном производстве наблюдали низкую эффективность удаления мутности и низкую фильтрующую способность. Другие фильтры, поставляемые другими производителями, могут быть подобраны и использованы в указанных способах осветления на основании оценки выхода вирусного продукта при использовании конкретного фильтра.
Таблица 1 | |||||||
Показатели осветления клеточной культуры при использовании различных объемных фильтров | |||||||
Фильтры | Мутность фильтрата1 | Удаление мутности | Эффективность фильтра2 | Полученный титр | |||
Millipore Co НС | 1,24 | 96,3% | >6,5 | 4,4% | |||
Sartorius Sartoclear™ P (1,5 мкм) | 4,0 | 94,0% | >8,0 | 19,3% | |||
Sartorius Sartoclear™ P | 7,0 | 89,6% | >8,7 | 8,4% | |||
(4,0 мкм) | |||||||
Whatman® Polycap™ HD | 13,8 | 79,4% | 1,25 | 82,0% | |||
CUNO 05/60HP | 6,4 | 96,9% | 9,0 | 33,9% | |||
CUNO 05/60HP | 6,7 | 85,4% | >32 | 41,1% | |||
Мутность фильтрата1 = НЕМ (нефелометрическая единица мутности) | |||||||
Эффективность фильтра2 = (литры культуры/фут2) |
Осветление при помощи низкоскоростного центрифугирования производили при 6238×g (5000 об/мин) в течение тридцати минут при комнатной температуре на центрифуге Beckman (5×1 л сосудов для центрифугирования общим объемом 4,5 л); BBC получали в надосадочной жидкости. Как видно из нижеследующей Таблицы 2, низкоскоростное центрифугирование позволяет достичь большего удаления мутности при эквивалентной степени извлечения по сравнению с объемным фильтрованием при помощи модуля Whatman PolyCapTM HD75.
Таблица 2 | |||
Сравнение первичного осветления жидкости клеточной культуры посредством низкоскоростного центрифугирования и объемного фильтрования | |||
Способ осветления | Мутность1 | Удаление мутности | Полученный титр |
Центрифугирование Экспериментальная партия 1 |
8,45 | 74,4% | 67,8% |
Whatman PolyCap™ HD75 Экспериментальная партия 1 |
18,13 | 45,5% | 66,6% |
Центрифугирование Экспериментальная партия 2 |
9,03 | 86,5% | 55,7% |
Whatman PolyCap™ HD75 Экспериментальная партия 2 |
13,8 | 79,4% | 82,0% |
Центрифугирование | 10,13 | 77,6% | 68,3% |
Экспериментальная партия 3 | |||
Центрифугирование | 10,80 | 85,5% | 77,0% |
Экспериментальная партия 4 | |||
Мутность1 = Мутность фильтрата или надосадочной жидкости, НЕМ |
ПРИМЕР 4: Способ очистки BBC: Вторичное осветление культуральной жидкости, содержащей BBC
После выполнения первичного осветления, описанного в Примере 3, надосадочную жидкость (или фильтрат) обрабатывали далее (вторичное осветление) с целью понижения уровня мутности. Испытывали несколько фильтров для микрофильтрации (от 0,2 до 0,25 мкм) (Таблица 3), которые включали фильтровальную установку Millipore Millex®-GV (Millipore; Billerica, MA), фильтровальную установку Millipore Millex®-GP, фильтровальную установку Pall Supor® (Pall Corp.; East Hills, NY), фильтровальную установку Sartorius SartobranTM (Sartorius Corp.; Edgewood, NY) и фильтровальную установку Sartorius SartoporeTM 2. Оптимальный фильтр должен ограниченно связывать или вовсе не связывать BBC, но при этом по возможности полно удалять порошкообразные загрязнения.
Для загрузки в выбранные фильтры для микрофильтрации использовали BBC, полученный до высевания (исходный материал), в который добавляли 1 (глутамат-фосфат сахарозы (ГФС) (sucrose phosphate glutamate (SPG)). Тот же загрузочный материал фильтровали в соответствии с инструкциями, полученными от производителей. Так как количество осветляемого материала клеточной культуры было ограничено, вместо фильтра с высокой производительностью использовали шприц-фильтр или дисковый фильтр. Как показано в Таблице 3, наибольший выход титра BBC получали на стерильных фильтрах Pall Supor® и Sartorius Sartobran™.
Таблица 3 | |
Вторичное осветление - испытание фильтров | |
Фильтровальная установка | Выход* |
Millipore Millex®-GV | 66,13% |
Millipore Millex®-GP | 87,08% |
Pall Acrodic™ Supor™ | 96,08% |
Sartorius Sartobran™ | 94,61% |
Sartorius Sartobran™ 2 | 82,84% |
Выход*: к загрузочному раствору добавляли 1×ГФС раствор. ГФС=глутамат-фосфат сахарозы. |
Далее оценивали вторичное осветление BBC, производимое при помощи фильтровальной установки Sartorius Sartobran™; результаты представлены в Таблице 4.
Таблица 4 | |||
Вторичное осветление с использованием фильтра Sartobran™ | |||
Фильтрование Sartobran™ | Мутность раствора1 | Удаление мутности | Полученный титр |
Эксперимент 1 | 0,62* | 50,8% | 65,8% |
Эксперимент 2 (масс./1×ГФС) | 4,45 | НД | 85,9% |
Эксперимент 3 (масс./1×ГФС) | 6,27 | 54,6% | 110,0% |
Мутность раствора1=НЕМ | |||
0,62*: низкая мутность фильтрата обусловлена низкой мутностью загрузки | |||
НД = недоступно | |||
ГФС = глутамат-фосфат сахарозы. |
Данные Таблицы 4 показывают, что мутность раствора в Эксперименте 2 и Эксперименте 3 была снижена при приемлемом выходе. В этих Экспериментах также было показано, что добавление 1×ГФС к загрузочному раствору (т.е. Эксперимент 2: 85,9% полученного титра и Эксперимент 3: 110% полученного титра) значительно увеличивает выход продукта BBC по сравнению с Экспериментом 1, в котором не добавляли ГФС (65,8% полученного титра).
ПРИМЕР 5: Способ очистки BBC: Хроматография на колонке
После проведения операции вторичного осветления, описанной в Примере 4, очистку фильтрата, содержащего BBC, определяли/сравнивали, используя различные хроматографические смолы. Поскольку размеры BBC превышают размеры загрязняющих белков, испытанию подвергали лишь смолы с большим размером пор, которые включали анионообменную смолу UNOsphere™ Q (Bio-Rad Laboratories Inc.), катионообменную смолу UNOsphere™ S (Bio-Rad Laboratories Inc.), смолу СНТ на основе керамического гидроксиапатита типа I (Bio-Rad Laboratories Inc.), смолу CFT на основе керамического фторапатита типа I (Bio-Rad Laboratories Inc.) и смолу CST I смешанного типа (GE Healthcare). Для сравнения также оценивали две смолы, применяемые в аффинной хроматографии, смолу Matrex™ Cellufine® Sulfate (Millipore) и гепарин-сефарозную смолу (GE Healthcare). Эксперименты проводили в периодическом режиме при комнатной температуре. Образцы, полученные в различных условиях промывки и элюирования, собирали и испытывали при помощи анализа SDS-PAGE и бляшкообразования.
В начальных экспериментах с анионообменной UNOsphere™ Q и катионообменной UNOsphere™ S смолами было показано, что BBC связывается с анионообменной смолой UNOsphere™ Q только при нейтральном pH, что указывает на то, что при нейтральном pH BBC заряжен отрицательно.
Оценка очистки BBC на анионообменной смоле Bio-Rad® UNOsphere™ Q. Очищенный BBC загружали на колонку, содержащую смолу UNOsphere™ Q. На колонке не происходило заметного разделения между продуктом, содержащим BBC, и загрязняющими белками, и большая часть вируса оставалась в связанном состоянии на колонке даже после элюирования 2 М NaCl в 10 мМ буфере, содержащем фосфат натрия (данные не показаны).
Оценка очистки BBC на смоле Bio-Rad® на основе керамического гидроксиапатита типа I (CHT I). BBC эффективно адсорбировался на гидроксиапатитовой колонке. Данные SDS-PAGE (не показаны), указывают на некоторое отделение BBC от загрязняющих белков, но значительная часть BBC оставалась в связанном состоянии на колонке даже после элюирования 0,8 М фосфатом натрия, pH 6,88, после чего связанный BBC был элюирован из колонки при помощи очистки 1 М раствором NaOH.
В другом эксперименте в качестве буфера элюирования использовали 0,9 М раствор фосфата калия. Отделение BBC от загрязняющих белков было незначительным (данные не показаны). Большая часть вируса оставалась в связанном состоянии на колонке, и для элюирования потребовался 1,0 М раствор NaOH. Аналогичные результаты (т.е. плохое отделение от загрязняющих белков и прочное связывание со смолой) наблюдали при использовании смолы на основе керамического фторапатита типа I (CFT) и смолы CST I.
Оценка очистки BBC на смоле для аффинной хроматографии Matrex™ Cellufine® Sulfate. Очищенный раствор, содержащий BBC, загружали на предварительно заполненную равновесным буфером (1,47 мМ фосфат калия, 8,06 мМ фосфат натрия, 140 мМ NaCl, pH 7,0) колонку, заполненную Cellufine™ Sulfate (объем капсулы (ОК)=2 мл) при расходе 3 мл/минута. Колонку промывали 10 OK равновесного буфера, который представлял собой солевой раствор фосфатного буфера (1,47 мМ фосфата калия, 8,06 мМ фосфата натрия, 140 мМ NaCl, pH 7,0). Промывные воды и элюат объединяли. Затем адсорбированные материалы подвергали линейно-градиентному элюированию 30 ОК с до получения 10 мМ фосфата натрия, 1,5 М NaCl, pH 7,0. Анализ SDS-PAGE показал, что разделение между загрязняющими белками и вирусом при элюировании было неэффективным, и BBC обнаружили во всех фракциях элюирования (данные не показаны). Большое количество BBC также оставалось в связанном состоянии на колонке. Общий выход BBC (т.е. из всех собранных фракций элюирования; F3-F25) составил лишь 45,2% (Таблица 5). Аналогичные результаты (т.е. низкий выход BBC) наблюдали при разделении на гепарин-сефарозной смоле.
Таблица 5 | ||||
Очистка BBC на колонке Matrix Cellufine® Sulfate | ||||
Образцы | Объем (мл) | Титр вируса | Полученное количество | |
(БОЕ/мл) | (БОЕ) | |||
Загрузка | 22 | 1,3900×106 | 3,06×107 | - |
Элюирование и промывка | 32 | 4,4100×104 | 1,14×109 | 4,6% |
Ф3-4 | 4 | 1,00×104 | 4,00×104 | 0,1% |
Ф5 | 2 | 1,00×105 | 2,00×105 | 0,7% |
Ф6-9 | 8 | 1,00×105 | 8,00×105 | 2,6% |
Ф10-25 | 32 | 4,00×105 | 1,28×107 | 41,9% |
Итого: | 45,2% | |||
Ф3-Ф25 - фракции элюирования 3-25 |
ПРИМЕР 6: Способ очистки BBC: Анионообменный мембранный адсорбер
Как описано выше в Примере 5, выход BBC оказался относительно низким при очистке фильтрата, получаемого при втором осветлении (т.е. на фильтре Sartobran™ с размером пор 0,2 мкм), на смолах UNOsphere™ Q, UNOsphere™ S, СНТ I, CFT I, CST I, Cellufine® или гепарин-сефарозной смоле. Таким образом, была произведена оценка очистки фильтрата, содержащего BBC и полученного в Примере 4, при помощи двух анионообменных мембранных адсорберов: мембранного адсорбера Sartobind™ Q (Sartorius Corp.; Edgewood, NY) и мембранного адсорбера Mustang™ Q (Pall Corp.; East Hills, NY).
Очистка BBC в мембранном адсорбере Sartobind™ Q. Загрузка BBC (исходного материала), которую очищали при помощи мембранного адсорбера, представляла собой концентрат, полученный на стадии разделения проточной фильтрацией вдоль направления потока (ПФ) (с использованием мембраны для ПФ, предел пропускания по молекулярной массе которой составлял 750 кДа). Концентрат BBC, полученный при ПФ разделении (который включал BBC и примеси/загрязняющие белки и ДНК), затем хранили либо при 4°С, либо при -70°С.
Исходные исследования очистки при помощи мембранного адсорбера Sartobind™ Q проводили на концентрате BBC, который хранили при 4°С, при использовании в качестве равновесного буфера 20 мМ HEPES (pH 7,1); концентрат подвергали адсорбции в мембранном адсорбере Sartobind™ Q (объем мембраны 2,1 мл). Белки примеси были эффективно элюированы буфером для элюирования, содержащим 20 мМ HEPES (pH 7,1) и 1,0 М NaCl (данные не показаны). Тем не менее ни в одной из фракций элюирования не был обнаружен титр BBC. Буфер HEPES заменили буфером, содержащим фосфат натрия, но получили аналогичные результаты (т.е. отсутствие титра BBC во всех собранных фракциях), даже при высоких (1,5 М) концентрациях NaCl в фосфатном буфере для элюирования.
Напротив, если в качестве исходного материала использовали концентрат BBC, который хранили при -70°С а затем подвергали адсорбции в мембранном адсорбере Sartobind™ Q (равновесный буфер: 20 мМ HEPES, pH 7,1), то во фракциях элюирования был обнаружен BBC (буфер для элюирования: 20 мМ HEPES и 1,0 М NaCl), в то время как по данным БЦК, 74,2% загрязняющих белков обнаруживали в элюате и в объединенных промывных водах (данные не показаны). Общий массовый баланс белков показан в нижеследующей Таблице 6.
При использовании линейно-градиентного элюирования 30%-ным буфером В для исходного BBC материала, выдержанного при -70°С, на хроматограмме наблюдали два основных пика (данные не показаны). Буфер А (равновесный буфер) содержал 10 мМ фосфата натрия (pH 7,0) и 0,3 М NaCl. Буфер В (буфер элюирования) содержал 10 мМ фосфата натрия (pH 7,0), 2,0 М NaCl и 10 мМ сахарозы, в то время как 30% В включали приблизительно 0,81 М NaCl.
Первый пик представлял собой BBC (фракции 4-10) относительно высокой чистоты. Второй пик включал ДНК загрязнения клеток-хозяев (фракции 11-20). Результаты анализа PicoGreen® (данные не показаны) указывают на то, что 97,3% остаточных ДНК клеток-хозяев были удалены мембранным адсорбером Sartobind™ Q. Таким образом, полученные данные указывают на то, что мембранный адсорбер Sartobind™ Q обеспечивает эффективное удаление загрязняющих ДНК клеток-хозяев из получаемого BBC. Тем не менее результаты оценки титра BBC (данные не показаны) указывают на то, что выход ВС при очистке в Sartobind™ Q составляет менее 30% титра вируса. Более высокую степень извлечения наблюдали при использовании мембранного адсорбера Mustang™ Q на том же самом исходном материале.
Таблица 6 | ||||
Общий массовый баланс белков после прохождения мембранного адсорбера Sartobind™ Q | ||||
Образцы, отбираемые во время очистки | Объем (мл) | Общее количество белков | Полученное количество | |
(мг/мл) | (мг) | |||
Загрузка | 15 | 115,8 | 1737 | 100% |
Элюирование и промывка | 32,5 | 39,68 | 1289,6 | 74,2% |
Ф3 | 2 | 3,79 | 7,58 | 0,4% |
Ф4-5 | 4 | 24,86 | 99,44 | 5,7% |
Ф6-10 | 10 | 12,27 | 122,7 | 7,1% |
Ф11-20 | 20 | 6,17 | 123,4 | 7,1% |
Ф22-24 | 6 | 4,27 | 25,62 | 1,5% |
Ф36 | 2 | 0 | 0 | 0,0% |
Ф37 | 2 | 17,86 | 35,72 | 2,1% |
Ф38-40 | 6 | 7,38 | 44,28 | 2,5% |
Итого: | 94,6% | |||
Ф3-Ф40 - фракции элюирования 3-40 |
Очистка BBC в мембранном адсорбере Mustang™ Q
В качестве средства для очистки BBC также исследовали мембранный адсорбер The Mustang™ Q. Производили оптимизацию для рабочих условий адсорбера Mustang™ Q, которые описаны ниже.
Сахароза увеличивает выход BBC, элюируемого из мембраны Mustang™ Q. Первоначальные наблюдения, проведенные при оптимизации условий очистки в Mustang™ Q, показали важность включения сахарозы в хроматографический буфер. Например, параллельно были проведены эксперименты по очистке с буферами, приготовленными с добавлением сахарозы (Фиг.2А и 2В) и без добавления сахарозы (Фиг.3А и 3В). Применяли следующие хроматографические буферы: буфер А (равновесный буфер) включал 10 мМ фосфата натрия (pH 7,0) и 300 мМ NaCl. Буфер В (буфер элюирования) включал 10 мМ фосфата натрия (pH 7,0), 1 М NaCl, с добавлением и без добавления сахарозы (т.е. +/-2% сахарозы).
В обоих экспериментах (т.е. +/-2% сахарозы) был получен BBC высокой чистоты. Анализ бляшкообразования (данные не показаны) показал, что степень выход BBC был значительно выше (32,8% в сравнении с 19,0%) в том случае, когда буфер содержал сахарозу.
Показатель pH буфера и связывание BBC с мембраной Mustang™ Q. Для определения значения pH, оптимального для связывания BBC с мембраной Mustang™ Q, испытывали три различных буферных значения pH (pH 6,5, 7,0 и 7,5). В этих экспериментах кондиционированная свежая клеточная культура после осветления была загружена на мембрану Mustang™ Q, уравновешенную либо буфером, содержащим 10 мМ фосфата натрия при pH 6,5, буфером, содержащим 10 мМ фосфата натрия при pH 7,0, либо буфером, содержащим 10 мМ фосфата натрия при pH 7,5 (каждый буфер также включал 300 мМ NaCl и 2% сахарозы).
BBC элюировали из мембраны пошаговым элюированием (буфер элюирования: 10 мМ фосфата натрия (pH 6,5, 7,0 или 7,5), 720 мМ NaCl и 2% сахарозы) со скоростью 3,5 мл в минуту (10 ОК/мин). Чистота BBC, элюируемого из Mustang™ Q (определяли при помощи анализа SDS-PAGE и вестерн-блоттинга; данные не показаны), была сравнима для всех значений pH испытуемого буфера. Тем не менее при pH 6,5 значительное количество BBC было обнаружено в прошедшей среде, промывных водах и фракциях элюирования, полученных при хроматографировании, и при указанном pH (см. Таблицу 7) в объединенных фракциях элюирования был обнаружен более низкий титр BBC.
Таблица 7 | |||
Получение BBC при различных pH связывания | |||
pH связывания | Получение BBC (определение титра) | ||
6,5 | 15% | ||
7,0 | 33% | ||
7,5 | 28% |
Ионная сила и связывание BBC с мембраной Mustang™ Q. При адсорбции BBC на мембране Mustang™ Q определяли влияние двух различных концентраций NaCl (0,15 М NaCl и 0,3 М NaCl) в буфере связывания (равновесном), содержащем 10 мМ фосфата натрия. Лучшее разделение между BBC и загрязняющими белками было обнаружено при концентрации NaCl, равной 0,3 М. Например, при использовании 0,3 М NaCl в буфере связывания, содержащем фосфат натрия, высокомолекулярные примеси извлекались в элюат, в то время как BBC оставался на мембране в связанном состоянии (данные не показаны).
Ионная сила и элюирование BBC из мембраны Mustang™ Q. Ионную силу буфера элюирования (буфера В) (т.е. концентрацию NaCl в буфере элюирования) определяли линейно-градиентным элюированием, при котором концентрацию буфера элюирования (буфера В) повышали от 0% до 60% в 30 OK при расходе, равном 3,5 мл/минуту. Равновесный буфер (буфер А) включал 10 мМ фосфата натрия, pH 7,1, и 300 мМ NaCl, а буфер элюирования (буфер В) включал 10 мМ фосфата натрия, pH 7,1, 2 М NaCl и 10 мМ сахарозы. По хроматограмме видно (данные не показаны), что для элюирования 73,3% BBC из мембранного адсорбера Mustang™ Q требуется концентрация NaCl, равная 0,6 М.
Сравнение линейно-градиентного элюирования с одностадийным элюированием. Высококачественный BBC был получен как при линейно-градиентном элюировании (описано выше), так и «одностадийном» элюировании (данные не показаны). Одностадийное элюирование включает использование равновесного буфера (буфера А; например, 10 мМ фосфата натрия, pH 7,1, 300 мМ NaCl) и буфера элюирования (буфера В; например, 10 мМ фосфата натрия, pH 7,1, 2 М NaCl, 10 мМ сахарозы). В отличие от линейно-градиентного элюирования, одностадийное элюирование позволяет вымывать BBC из мембранного адсорбера непосредственно при добавлении буфера В, имеющего конкретную конечную концентрацию соли (например, мгновенным добавлением буфера В, имеющего конкретную конечную концентрацию NaCl, равную 0,6 М). Одностадийное элюирование позволяет удалять более 99% загрязняющих белков (анализ БЦК; данные не показаны), в то время как 70-95% BBC извлекают во фракциях элюирования (анализ бляшкообразования; данные не показаны). Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением будет использовано одностадийное элюирование, поскольку эта простая одностадийная операция позволяет получать BBC с высоким титром.
Рабочий расход элюата. Было исследовано влияние двух различных скоростей элюирования, т.е. 10 объемов капсулы (ОК) в минуту и 20 ОК/минуту. Ни одна из скоростей не влияла на очистку.
Обработка бензоназой®. Нуклеаза Бензоназа® представляет собой эндонуклеазу, полученную способами генной инженерии. Она разрушает все формы ДНК и РНК (однонитевые, двухнитевые, линейные и кольцевые), но не оказывает протеолитического действия. Ее действие эффективно в широком диапазоне условий и имеет высокую специфичность воздействия. Таким образом, нуклеаза Бензоназа® идеальна для проведения удаления нуклеиновых кислот из рекомбинантных продуктов, и ее применение позволяет соблюдать условия загрязнения нуклеиновых кислот, указанные в руководстве Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (Federal Drug Administration (FDA)).
В соответствии с настоящим изобретением, было обнаружено, что нуклеаза Бензоназа® значительно снижает концентрацию ДНК при проведении очистки BBC и в готовом объединенном концентрате BBC. Тем не менее добавление нуклеазы Бензоназа® до проведения очистки при помощи мембранного адсорбера Mustang™ Q приводит к снижению титра вируса (данные не показаны). Напротив, обработка нуклеазой Бензоназа® после проведения очистки способом мембранной хроматографии не приводит к таким последствиям (т.е. не снижает титра).
Тем не менее, из-за того, что рассматриваемый в настоящем описании способ очистки BBC (например, см. Фиг.1) позволяет удалять более 99% загрязнений, обусловленных клеточной культурой, концентрации ДНК в готовом очищенном объединенном концентрате BBC оказываются ниже уровней, предусмотренных спецификацией (например, спецификация ВОЗ определяет < 10 нг/доза) даже без обработки нуклеазой Бензоназа®. Таким образом, использование обработки нуклеазой Бензоназа® не обязательно для очистки BBC в соответствии с предлагаемым способом, который предоставляет заметные усовершенствования по сравнению с традиционными способами очистки продуктов, содержащих вирус/вирусные вакцины (которые обязательно включают обработку нуклеазой Бензоназа®).
Связывающая способность Mustang™ Q. Связывающую способность мембранного адсорбера Mustang™ Q определяли на основании проскока BBC через мембранный адсорбер Mustang™ Q малого объема (0,35 мл) (т.е. Mustang™ Q coin). При загрузке и очистке кондиционированной культуральной жидкости в Mustang™ Q coin, в конечном итоге было обнаружено, что проскок BBC не может быть определен, исходя из УФ поглощения, поскольку оно перекрывалось УФ поглощением примесей. Таким образом, в указанном эксперименте, фракции элюата, содержащие BBC, собирали и определяли присутствие BBC при помощи анализа SDS-PAGE и определения титра BBC. Равновесный буфер Mustang™ Q включал 10 мМ HEPES при pH 7,5, 0,3 мМ NaCl и 2% сахарозы.
Неожиданно оказалось, что традиционный хроматографический 1%-ный проскок не происходил (см. нижеследующую Таблицу 8) даже после загрузки 400 мл клеточной культуральной жидкости на Mustang™ Q coin (титр культуральной жидкости BBC составлял 6,9×106/мл). Тем не менее, как показано в Таблице 8, в элюате наблюдали более высокий титр BBC при загрузке в Mustang™ Q coin образца культуральной жидкости объемом 400 мл. Кроме того, при возрастании объема загрузки до 400 мл, дифференциальное давление в мембране возрастало до 1,8 бар (185 кПа). Таким образом, на основании эксперимента можно заключить, что загрузочная емкость фильтра составляет 350 мл на 0,35 мл мембранного адсорбера Mustang™ Q, что эквивалентно 500 мл клеточной культуры/мл мембранного адсорбера. В альтернативном случае, связывающая способность Mustang™ Q может быть представлена в виде 6,9×109 БОЕ/мл мембраны. В трех проверочных экспериментах действительная загрузочная емкость (в единицах титра вируса) оказалась несколько выше указанной связывающей способности, что не влияет на характеристики способа. Таким образом, данные показывают, что оцененная связывающая способность представляет собой консервативный коэффициент загрузки и, как таковая, может быть легко использована при расчете крупномасштабного производства.
Таблица 8 | |
Исследование загрузочной емкости Mustang™ Q | |
Объем загрузки1 (мл) | Титр BBC2 в элюате (БОЕ/мл) |
0-200 (Э1) | Не определяли |
200-300 (Э2) | 6,80×103 |
300-350 (Э3) | 8,80×103 |
350-400 (Э4) | 1,30×103 |
Объем загрузки1 рассчитывали, исходя из объема культуры | |
Титр BBC2: титр BBC при загрузке составлял 6,9×106/мл; | |
Объем мембраны фильтра Mustang™ Q составлял 0,35 мл | |
Э1-Э4 - элюаты 1-4, соответственно |
Заключение об эффективности мембранного адсорбера Mustang™ Q. При очистке в мембранном адсорбере Mustang™ Q был получен высококачественный продукт, содержащий BBC. По сравнению с традиционными 20 хроматографическими способами, способ очистки с использованием Mustang™ Q (кроме очевидных преимуществ одностадийности и эффективности) имеет несколько преимуществ. Например, этот способ позволяет получать продукт, содержащий BBC, более высокого качества по сравнению с ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы (например, см. Фиг.6А и 5В). Кроме того, (а) высокая связывающая способность мембранного адсорбера Mustang™ Q позволяет использовать менее крупногабаритное производственное оборудование, что обеспечивает меньшие производственные затраты, (b) более высокая скорость элюирования по сравнению с испытанными выше хроматографическими смолами позволяет увеличить расход и производительность, и (с) использование одноразовых установок, включающих мембранный адсорбер Mustang™ Q, устраняет необходимость проверки чистоты и рабочего состояния оборудования.
Ниже кратко перечислены рабочие условия для Mustang™ Q, обнаруженные при проведении вышеуказанных экспериментов: (а) загрузочная емкость = 0,5 л клеточной культуры на 1 миллилитр объема мембранного адсорбера Mustang™ Q, (b) расход (скорость истечения)=20 объемов капсулы (ОК) в минуту, (с) pH связывания BBC = pH 7,5±0,1 единиц pH, (d) ионная сила связывания BBC = 0,3±0,2 М соли; (е) элюирование BBC = пошаговый градиент через 15 ОК, и (f) ионная сила элюирования BBC = 0,7 М соль.
ПРИМЕР 6: Способ очистки BBC: Проточная фильтрация вдоль направления потока, глубокое фильтрование (polishing), буферный обмен
Концентрирование BBC и буферный обмен производили с использованием системы ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ), обеспечивающей проточную фильтрацию вдоль направления потока (ПФ). Объединенные элюаты BBC, полученные в мембранном адсорбере Mustang™ Q, содержались в буфере, включающем 10 мМ HEPES с высокой концентрацией соли (0,7 М NaCl), которые также содержали следовые количества примесей. Таким образом, для удаления остаточных загрязнений и получения готового продукта, содержащего BBC в подходящем для рецептур буфере, было необходимо провести операцию УФ/ДФ.
Объединенные элюаты из пяти экспериментов, проведенных с использованием Mustang™ Q, объединяли и использовали в следующем эксперименте. Применяли ПФ мембранный картридж из полого волокна площадью 16 см2, предел пропускания по молекулярной массе которого составлял 750 кДа (GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ). Объединенные растворы вначале сконцентрировали до объема 10 мл. Затем произвели пять (5×) обменов буфера на солевой раствор фосфатного буфера (буфер, содержащий 10 мМ фосфата калия (ФСБР) при pH 7,1, и 138 мМ NaCl).
Анализ SDS-PAGE образцов, находящихся в обработке, показал, что BBC присутствовал только в концентрате и промывных водах, и потери BBC в пермеате (фильтрате, который образуется при обратном осмосе) не были обнаружены ни при помощи окрашивания серебром, ни при помощи вестерн-блоттинга (данные не показаны). Данные SDS-PAGE показывают, что выход BBC в указанном способе был приемлемым, и удаление примесей фиксировали после каждой смены буферного раствора (данные не показаны). Для полного удаления примесей требовалось проведение от пяти до шести замен буферного раствора.
Оптимизация рабочих условий УФ/ДФ. Было исследование воздействия состава буферного раствора на характеристики очистки ПФ УФ/ДФ. Во всех экспериментах в качестве загрузки использовали один и тот же объединенный элюат, полученный в Mustang™ Q (Таблица 9). Первые три эксперимента проводили на мембране из полого волокна площадью 16 см2 (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.), в то время как последний эксперимент производили на мембране площадью 420 см2 (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.). Во всех экспериментов качество продукта было аналогичным (на основании анализа SDS-PAGE и Э-ЖХВР).
Таблица 9 | ||
Эксперимент, показывающий влияние состава буферного раствора на ПФ | ||
Номер эксперимен та |
Буфер | Полученное количество (%) |
Эксперимент 1 | 10 мМ HEPES, 0,15 М NaCl, pH 7,4, 4% сахарозы | 100,5 |
Эксперимент 2 | 10 мМ NaPi, pH 7,4, 4% сахарозы | 88,8 |
Эксперимент 3 | 10 мМ NaPi, 0,15 М NaCl, pH 7,4, 4% сахарозы | 80,6 |
Эксперимент 4 | ФСБР, pH 7,2, 4% сахарозы | 80,0 |
Вне зависимости от использованного буферного раствора, в пермеате диафильтрации не был обнаружен продукт, содержащий BBC (на основании анализа SDS-PAGE/окрашивания серебром, данные не показаны). Тем не менее анализ общего количества белка и ДНК указывает на то, что приблизительно 34-41% общего количества белка и 33-40% ДНК были удалены в двух первых объемах, применяемых для диафильтрации. В отношении замены буфера, следует сказать, что пять объемов диафильтрации (ОД) были достаточными для снижения проводимости пермеата до удовлетворительного уровня.
Таким образом, были приняты следующие рабочие условия для ПФ УФ/ДФ:
(a) Мембранный картридж для ПФ: картридж ПФ из полого волокна (750 кДа),
(b) Емкость мембраны для ПФ: 95 л клеточной культуры/т2,
(c) Рабочее давление: р1=3-4 фунт/дюйм2 (3-4×6894,757 Па); р2=1-2 фунт/дюйм2 (1-2×6894,757 Па); трансмембранное давление=1,5-2,5 фунт/дюйм2 (1,5-2,5×6894,757 Па),
(d) Рабочая температура: комнатная температура,
(e) Расход поперечного потока: 700 литров/м2·ч,
(f) Расход пермеата: > 30 литров/м2·ч, и
(д) 5× Концентрирование и 6х диафильтрация в ФСБР + 4% сахарозы (10 мМ фосфат калия, 138 мМ NaCl, pH 7,2);
где р1 представляет собой давление на входе и р2 представляет собой давление на выходе.
ПРИМЕР 8: Способ очистки BBC: Окончательное фильтрование
Последней операцией способа очистки BBC было окончательное фильтрование материала, очищенного ПФ, описанной выше. Для удаления возможных биозагрязнений при минимальных потерях BBC использовали фильтровальную установку Sartorius Sartobran™ с размером пор 0,2 мкм (0,45/0,2 мкм) (Sartorius Corp.; Edgewood, NY) при расходе, равном 100 мл в минуту. Буферный раствор включал 10 мМ фосфат калия (pH 7,1-7,3), 138 мМ NaCl и 7,5% сахарозы.
ПРИМЕР 9: Способ крупномасштабной очистки BBC для конструкции VSVINN4CT9-gag1
Были проделаны четыре крупномасштабных эксперимента с использованием 4,5 л клеточной культуры. Данные этих крупномасштабных экспериментов указаны ниже в Таблице 10 и Таблице 11 и Фиг.6. Были выполнены анализы SDS-PAGE (данные не показаны), общего белка (Таблица 11), титра вируса (Таблица 10 и Фиг.6) и Э-ЖХВР (данные не показаны). В каждом из крупномасштабных экспериментов, проводимых в соответствии со способом, показанным на Фиг.1, были получены стабильные рабочие характеристики (т.е. качество BBC продукта) и удаление примесей.
Таблица 10 | ||||
Крупномасштабные эксперименты | ||||
Экспери мент |
Загрузка | Очищенный объединенный концентрат | ||
Объем (мл) | Титр (БОЕ/мл) | Объем (мл) | Титр (БОЕ/мл) | |
1 | 4192 | 5,60×107 | 475 | 2,40×108 |
2 | 4392 | 9,10×07 | 440 | 3,40×108 |
3 | 4425 | 5,20×107 | 475 | 1,10×108 |
4 | 4450 | 5,01×107 | 435 | 2,00×108 |
Таблица 11 | ||||
Удаление белковых загрязнений при крупномасштабной очистке BBC | ||||
Операция способа | Общее удаление белков (%) | |||
Эксперимент 1 | Эксперимент 2 | Эксперимент 3 | Эксперимент 4 | |
Низкоскоростное центрифугирование | НО | 91,0 | 73,2 | 91,5 |
Предварительное фильтрование через 0,2 мкм фильтр (разбавление) | 89,9 | 75,2 | 71,3 | 68,0 |
Последующее фильтрование через 0,2 мкм фильтр (Sartobran™) | 100,6 | 97,3 | 102,6 | 98,1 |
Mustang™ Q | 0,43 | 0,39 | 0,33 | 0,41 |
УФ/ДФ | 42,7 | 52,0 | 48,7 | 47,5 |
Предварительное фильтрование через 0,2 мкм фильтр | 95,7 | 106,8 | 104,5 | 99,4 |
Последующее фильтрование через 0,2 мкм фильтр (Sartobran™) | 87,7 | 82,7 | 81,5 | 93,8 |
Общее удаление белков (%) | НО | 99,9 | 99,9 | 99,9 |
НО = не определяли |
Анализ способа крупномасштабной очистки BBC
Целью разработки нового способа очистки, рассматриваемого в настоящем описании (например, см. Фиг.1), является получение BBC высокой чистоты с высоким выходом очищенного продукта, содержащего BBC. Ниже дан анализ очистки BBC и его стабильности, приведенный на основании четырех крупномасштабных экспериментов с использованием 4,5 л клеточной культуры.
Анализ SDS-PAGE и удаление загрязняющих белков. Важным аспектом способа очистки было обеднение получаемого BBC загрязняющими белками клеточной культуры (или их удаление). Как указано в Примере 1, приведенный пример конструкции rVSVIN представлял собой конструкцию VSVINN4CT9-gag1. Получаемый BBC отслеживали по присутствию основных белков этого вируса, М (27 кДа), N/P (49 кДа), G (55 кДа) и L (250 кДа). BBC белки М и N/P имели более высокий уровень экспрессии по сравнению с белками G (CTg) и L, и при этом уровень белка L был наиболее низким. Таким образом, полосы белков М и N/P при анализе геля SDS-PAGE были более интенсивными, чем полосы G и L белков. Во всех экспериментах на гель загружали образцы одинаковых объемов (в противном случае это отмечали). Кроме того, вместо способа однократного обнаружения белков, такого как окрашивание серебром или окрашивание Coomassie®, использовали способ двукратного окрашивания серебром/Coomassie® Blue, дающий более точные результаты.
Анализ SDS-PAGE для крупномасштабного эксперимента 4 (Фиг.4А и 4В) показал, что большая часть белков была удалена в первой операции осветления путем низкоскоростного центрифугирования (Фиг.4А, 4В, линии 1 и 2), который позволял удалять осколки клеток. По данным БЦК анализа было удалено 91,5% общего содержания белка; следовательно, низкоскоростное центрифугирование является важной операцией для удаления белковых примесей.
Жидкость, полученную при центрифугировании, разбавляли буфером, содержащим 10 мМ HEPES (pH 7,5 после добавления 1 × глутамат-фосфата сахарозы (ГФС; 7,5% сахарозы, 10 мМ фосфата калия, 5 мМ глутамата)), 0,465 М NaCl и 2% сахарозы (Фиг.4А, 4В, линия 3), при этом из-за разбавления наблюдали более бледную полосу окрашивания. Разбавленный раствор затем прокачивали через фильтр с размерами пор 0,2 мкм для удаления оставшихся порошкообразных загрязнений (в этой операции не производили удаление загрязняющих белков; Фиг.4А, 4В, линия 4). Фильтрат, содержащий BBC, собирали и использовали в качестве загрузки в мембранный адсорбер Mustang™ Q.
В мембранном адсорбере Mustang™ Q производили удаление более 99,5% оставшихся загрязняющих белков (Таблица 11). Определение оставшихся загрязняющих белков производили при помощи анализа SDS-PAGE (Фиг.4А, 4В, линии 4 и 5); при этом из мембраны Mustang™ Q элюировали BBC высокого качества (Фиг.4А, 4В, линия 6).
Элюированный BBC концентрировали и подвергали диафильтрации в буферный раствор ФСБР (+7,5% сахарозы). Более 48% оставшихся загрязняющих белков удаляли при проведении операции УФ/ДФ (Таблица 11), в результате чего наблюдали очень интенсивные полосы белков BBC (Фиг.4А, 4В, линия 7). В объединенном пермеате УФ/ДФ обнаруживали лишь следовые количества загрязняющих белков (Фиг.4А, 4В, линия 8). Как до, так и после конечного фильтрования через фильтр с размером пор 0,2 мкм не наблюдали никаких обнаруживаемых изменений в качестве BBC или профиле загрязняющих белков (Фиг.4А, 4В, линии 9 и 10).
Объединенный очищенный концентрат BBC, полученный в соответствии с предлагаемым способом, также имеет более высокую чистоту и низкий уровень остаточных примесей по сравнению с продуктом, получаемым центрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Например, полосы окрашивания белков BBC (М, N, P, G и L), полученного в соответствии с предлагаемым способом (Фиг.5А, 5В, линия 9), более интенсивны, чем полосы окрашивания белков BBC, очищенного центрифугированием в градиенте плотности сахарозы (Фиг.5А, 5В, линия 11) (при менее интенсивных полосах окрашивания загрязняющих белков), что указывает на получение более высококачественного BBC продукта в соответствии с предлагаемым способом очистки, изображенным на Фиг.1. По данным профиля загрязняющих белков и интенсивности полос окрашивании белков BBC, во всех четырех крупномасштабных экспериментах был получен продукт аналогичного качества (данные не показаны).
Эксклюзионная жидкостная хроматография высокого разрешения (Э-ЖХВР). Был разработан анализ Э-ЖХВР для BBC (см., Пример 1), обеспечивающий простой и удобный способ отделения BBC от загрязняющих белков, а также способ количественного анализа очистки BBC. Для защиты колонки на нее загружали только осветленные образцы. BBC вымывают из колонки с получением пика элюирования, имеющего время удержания, равное 7,5 минут (данные не показаны). Пики примесей загрязняющих белков (имеющих большее время удержания в колонке) вымываются из колонки после вывода пика BBC, и, следовательно, их не нужно удалять/извлекать из получаемого BBC. Большую часть примесей извлекали в элюат и промывные воды, получаемые в Mustang™ Q, что подтверждали результаты анализа SDS-PAGE. При проведении операции УФ/ДФ извлекали примеси, связанные с буфером, и в пермеатах не обнаруживали потерь BBC (данные не показаны). После окончательного фильтрования через фильтр с размером пор 0,2 мкм, полученный BBC элюировали из колонки для Э-ЖХВР в виде одного основного пика, имеющего время удержания, равное 7,5 минут, за которым следовали более мелкие пики, соответствующие холостому буферному раствору (данные не показаны).
Удаление остаточной ДНК клеток-хозяев. ДНК клеточной культуры (клеток-хозяев) являются основными примесями, удаляемыми при очистке с использованием рекомбинантного способа. Общая концентрация ДНК в объединенном очищенном концентрате BBC не должна превышать 10 нг/дозу (107 БОЕ). Профили удаления ДНК, полученные в четырех крупномасштабных экспериментах, приведены в нижеследующей Таблице 12, из которой видно, что на каждом этапе очистки осуществляли постепенное удаление ДНК. Основное удаление ДНК наблюдали на стадии получения продукта (т.е. осветлении 1° путем низкоскоростного центрифугирования с последующим проведением осветления 2° фильтрованием через фильтр с размером пор 0,2 мкм) и на стадии мембранной адсорбции на Mustang™ Q. Более 80% остаточных ДНК удаляли на стадии очистки на Mustang™ Q, и более 60% ДНК удаляли на стадии очистки посредством УФ/ДФ. Общий процент удаления ДНК составлял 99,89±0,03% во всех четырех крупномасштабных экспериментах. Кроме того, остаточная концентрация ДНК составляла гораздо менее 10 нг/дозу (Таблица 13).
Таблица 12 | ||||||
Данные по удалению ДНК клеток-хозяев (%) | ||||||
Операция способа | Эксп.1 | Эксп.2 | Эксп.3 | Эксп.4 | Среднее | Стандартное отклонение |
Выход продукта1 | 95,70 | 93,97 | 96,1 | 93,62 | 94,85 | 1,23 |
Mustang™ Q | 82,69 | 84,7 | 85,43 | 84,61 | 84,36 | 1,17 |
ПФ | 74,51 | 66,63 | 64,42 | 61,80 | 66,89 | 5,45 |
Фильтрова ние |
44,81 | 64,23 | 55,34 | 57,73 | 55,53 | 8,07 |
Всего | 99,90 | 99,89 | 99,91 | 99,84 | 99,89 | 0,03 |
Выход продукта1 представляет собой осветление культуральной жидкости при низкоскоростном центрифугировании с последующим фильтрованием через фильтр с размером пор 0,2 мкм. |
Таблица 13 | |
Данные о концентрации ДНК в объединенном очищенном концентрате BBC | |
Остаточная концентрация ДНК (нг/107 БОЕ-доза) | |
Эксперимент 1 | 1,46 |
Эксперимент 2 | 0,97 |
Эксперимент 3 | 3,00 |
Эксперимент 4 | 1,93 |
Удаление белка gag. Концентрацию белка gag определяли при помощи анализа ELISA, который позволил получить данные для определения остаточной концентрации gag в получаемом BBC. Профиль белка gag, наблюдаемый в способе-очистке, указан в нижеследующей Таблице 14. Большая часть белка Gag была удалена при проведении операции вторичного осветления (т.е. фильтрования через фильтр с размером пор 0,2 мкм) и операции мембранной адсорбции на Mustang™ Q. Как показано в Таблице 15, остаточная концентрация белка Gag в готовом объединенном очищенном концентрате составляла от 0,08 до 8,93 нг/дозу (107БОЕ).
Таблица 14. | ||||
Данные по уменьшению остаточной концентрации gag | ||||
Способ | Объем | Остаточная концентрация gag | Общая степень удаления gag | |
нг/мл | нг | |||
Неосветленная культура | 4425 | 4,330 | 19160,3 | - |
После центрифугирования | 4373 | 3,530 | 15436,7 | 19,43% |
Предварительное фильтрование через 0,2 мкм фильтр | 9272 | 0,750 | 6954,0 | 63,71% |
Последующее фильтрование через 0,2 мкм фильтр | 9200 | 0,690 | 6384,0 | 66,87% |
Элюаты + промывные воды | 9800 | 0,660 | 6468,0 | - |
Элюирование через Mustang™ Q | 1600 | 0,680 | 1088,0 | 94,32% |
Концентрат ПФ | 450 | 4,100 | 1845,0 | 90,37% |
Предварительное фильтрование через 0,2 мкм фильтр | 495 | 3,410 | 1688,0 | 91,19% |
Объединенный очищенный концентрат | 475 | 0,930 | 441,8 | 97,69% |
Таблица 15 | ||
Данные по остаточной концентрации gag в объединенном очищенном концентрате BBC | ||
Удаление gag (%) | Остаточная концентрация gag (нг/107 БОЕ-доза) | |
Эксперимент 1 | 80,0 | 8,93 |
Эксперимент 2 | 87,1 | 6,76 |
Эксперимент 3 | 97,7 | 0,08 |
Эксперимент 4 | 87,1 | 8,50 |
ПРИМЕР 10: Способ крупномасштабной очистки BBC для конструкции VSVINN4CT1-gag1
Изначально разработка способа очистки для конструкции VSVINN4CT1-gag1 была осложнена низким титром продукта в культуральной клеточной жидкости (<106 БОЕ/мл), что приводило к низкому титру продукта и высокому загрязнению ДНК в объединенном готовом концентрате. Тем не менее способ очистки, описанный в Примере 9 для VSVINN4CT9-gag1, был успешно применен к данной конструкции, а объем (культуральной клеточной жидкости) увеличен до 10 л. Применение указанного способа очистки позволило получить BBC продукт высокого качества.
В соответствии со способом очистки операции первичного и вторичного осветления были по существу аналогичны соответствующим операциям, описанным в Примерах 3 и 4. Операцию анионообменной мембранной очистки с использованием адсорбера Mustang™ Q оптимизировали, как описано ниже. Проточную фильтрацию вдоль направления потока производили, применяя систему Quixstand™ или Flexstand™, снабженную мембранными картриджами, изготовленными из полого волокна (GE Healthcare; Piscataway, NJ). В этом исследовании применяли мембраны для ультрафильтрации GE из полиэфирсульфона, имеющие предел пропускания по молекулярной массе, равный 750 кДа. Номинальная площадь фильтрующей поверхности всех мембран составляла 420 см2 или 1200 см2. Эксперименты по мембранной хроматографии проводили с использованием зонда АКТА™ и системы AKTAPilot™ (GE Healthcare; Piscataway, NJ) и мембранных адсорберов Pall Mustang™ Q (Pall Corporation; East Hills, NY).
Первая экспериментальная очистка VSVINN4CT1-gag1 с использованием Mustang™ Q. Адсорбция на Mustang™ Q была проведена с использованием буферных растворов, аналогичных описанным выше для очистки VSVINN4CT9-gag1. Вкратце, клетки и остатки клеток сначала удаляли центрифугированием. После добавления 10 × глутамата-фосфата сахарозы (ГФС) в отношении 1:9 (об./об.) и 2-кратного разбавления буфером, содержащим 10 мМ HEPES, 0,465 М NaCl, при pH 7,5, 2% сахарозы, раствор прокачивали через фильтр с размером пор 0,2 мкм. Фильтрат загрузили на предварительно уравновешенный мембранный адсорбер Pall Mustang™ Q (объем капсулы 0,35 мл) и собирали объединенные элюат и промывные воды. Получаемый BBC извлекали с объединенным элюатом в условиях элюирования, описанных выше для очистки VSVINN4CT9-gag1. Получали вирусный продукт высокого качества (данные не показаны). Тем не менее одну треть продукта обнаруживали в объединенных элюате и промывных водах (Таблица 16), и титр вируса в объединенном элюате из Mustang™ Q был очень низким из-за низкого выхода титра вируса в биореакторе (4,6×105 БОЕ/мл для VSVINN4CT1-gag1 в сравнении с >1,0×107 БОЕ/мл для VSVINN4CT9-gag1).
Таблица 16 | ||||
Анализ способа - выход титра при очистке на Mustang™ Q | ||||
Операция | Объем (мл) | Титр вируса (БОЕ/мл) | Титр вируса (БОЕ) | Выход (%) |
Загрузка | 250 | 9,90×104 | 2,48×107 | 100 |
Элюат и промывные воды | 300 | 3,20×104 | 9,60×108 | 38,8 |
Элюирование | 35 | 5,70×105 | 2,00×107 | 80,6 |
Регенерация | 15 | 1,44×105 | 2,16×108 | 8,7 |
Условия связывания указанной конструкции на адсорбере Mustang™ Q далее были оптимизированы следующим образом. Условия эксперимента описаны в Таблице 17. Во всех экспериментах, на основании pH, ранее установленного для конструкции VSVINN4CT9-gag1, pH загрузки и элюата составлял от 6,5 до 7,5. Кроме того, концентрация NaCl в буфере загрузки в этих экспериментах составляла от 0,28 до 0,32 М, а в буфере элюирования - от 0,6 до 0,7 М. Скорость истечения (расход) составляла 3,5-10,5 мл/мин, что соответствовало 10-30 объемам капсулы (ОК)/мин.
Таблица 17 | |||||
Оптимизированные условия для операции с использованием Mustang™ Q | |||||
Эксп. No. | pH загрузки | NaCl загрузки (М) | pH элюирования | NaCl элюирования (М) | Расход (мл/мин) |
1 | 7,0 | 0,30 | 7,0 | 0,6 | 7,0 |
2 | 6,5 | 0,32 | 6,5 | 0,7 | 3,5 |
3 | 7,5 | 0,32 | 6,5 | 0,5 | 3,5 |
4 | 7,5 | 0,32 | 7,5 | 0,7 | 10,5 |
5 | 6,5 | 0,28 | 6,5 | 0,5 | 10,5 |
6 | 7,5 | 0,28 | 6,5 | 0,7 | 10,5 |
7 | 7,5 | 0,28 | 7,5 | 0,5 | 3,5 |
8 | 7,0 | 0,30 | 7,0 | 0,6 | 7,0 |
9 | 6,5 | 0,28 | 7,5 | 0,7 | 3,5 |
10 | 6,5 | 0,32 | 7,5 | 0,5 | 10,5 |
Посредством анализа SDS-PAGE (не показан), во всех объединенных элюатах, полученных из Mustang™ Q, был обнаружен высококачественный BBC. Результаты, полученные при удалении загрязняющих белков в этой операции, показаны на Фиг.7. В этой единственной операции было извлечено более 99% загрязняющих белков, что превышает значение, полученное при очистке VSVINN4CT9-gag1. Выход способа и результаты и определение ДНК клеток-хозяев в объединенных элюатах показаны в Таблице 18. Остаточная концентрация ДНК в объединенных элюатах в этих экспериментах была чрезвычайно низкой, что указывает на достаточную легкость очистки от ДНК. Тем не менее полученный титр вируса изменялся, в зависимости от условий способа.
Таблица 18 | ||
Полученный титр вируса и остаточная концентрация ДНК в объединенных элюатах Mustang™ Q | ||
No. эксперимента | Полученный титр (%) | Остаточная концентрация ДНК (нг/мл) |
1 | 78,1 | 1 |
2 | 32,2 | Н.П.* |
3 | 23,9 | 1 |
4 | 35,7 | 1 |
5 | 39,1 | Н.П. |
6 | 58,3 | Н.П. |
7 | 52,2 | 3 |
8 | 87,5 | Н.П. |
9 | 55,1 | Н.П. |
10 | 23,7 | Н.П. |
* Н.П. - концентрация ДНК ниже порога определения |
Выход способа был определен на основании титра вируса, определяемого в анализе бляшкообразования. Как видно из контурного графика (данные не показаны), при pH буфера загрузки, составляющем от 6,6 до 7,5, и концентрации NaCl, составляющей от 0,28 до 0,30 М, был получен приемлемый выход продукта. Оптимальное значения параметров буфера было следующим: 0,29 М NaCl в 10 мМ HEPES, 2% сахарозы, pH 7,0. Учитывая, что при загрузке предпочтительно не регулировать pH, для равновесного буфера Mustang™ Q было принято значение pH, равное 7,5. В то же время, в качестве параметров для буфера элюирования в Mustang™ Q были приняты следующие параметры: 0,60-0,70 М NaCl и pH 6,75-7,25. Оптимальные параметры буфера элюирования составляли: 10 мМ HEPES, 0,65 М NaCl, 2% сахарозы, pH 7,0. Параметры буфера элюирования для Mustang™ Q показаны в Таблице 19. При этих параметрах загрязняющие ДНК в объединенных элюатах были снижены до приемлемого уровня (данные не показаны).
Таблица 19 | ||
Параметры буферов для Mustang™ Q | ||
Операция | pH | Концентрация NaCl (M) |
Уравновешивание | 6,6-7,5 | 0,28-0,30 |
Элюирование | 6,75-7,25 | 0,60-0,70 |
Результаты других экспериментов согласовывались с вышеуказанными результатами и показали, что в некоторых примерах реализации предпочтительные параметры буфера в операции связывания, которые обеспечивали высокий выход продукта и приемлемую концентрацию загрязняющих ДНК, включали от 0,28 М до 0,30 М NaCl и pH 7,2-7,5.
ПРИМЕР 11: Способ крупномасштабной очистки BBC для конструкции VSVINN4CT1-gag1
Были проделаны три мелкомасштабных испытания на соответствие техническим условиям с использованием материалов, аналогичных применяемым для разработки параметров очистки на Mustang™ Q. Равновесный буфер включал 10 мМ HEPES, 0,29 М NaCl, pH 7,5, 2% сахарозы, а буфер элюирования - 10 мМ HEPES, 0,65 М NaCl, pH 7,0, 2% сахарозы. Во всех экспериментах поддерживали одинаковые рабочие условия: один и тот же расход, один и тот же объем загрузки и один и тот же объем элюирования. Результаты экспериментов представлены в Таблице 20. На основании выхода продукта, определенного по результатам анализа титра, можно заключить, что разработанный способ имеет устойчивые технические характеристики.
Таблица 20 | |
Испытания Mustang™ Q на соответствие техническим условиям | |
No. эксперимента | Выход (%) |
А | 73,0 |
В | 81,4 |
С | 70,8 |
Увеличение объема очистки VSVINN4CT1-gag1, испытания на соответствие техническим условиям и для внедрения методики в производство
После удаления микроносителей, культуральную клеточную жидкость, содержащую VSVINN4CT1-gag1, использовали в качестве исходного материала для проведения полного способа очистки. Способ включает осветление клеточной культуры посредством низкоскоростного центрифугирования и получение BBC в надосадочной жидкости; фильтрование полученной после центрифугирования надосадочной жидкости, через фильтр с отверстиями размером 0,45/0,2 мкм и получение BBC в отфильтрованном растворе; загрузку отфильтрованного раствора, содержащего BBC, на анионообменный мембранный адсорбер, элюирование продукта, содержащего BBC, и сбор элюированных фракций; очистку выделенного BBC проточной фильтрацией вдоль направления потока (ПФ) с использованием мембраны, предел пропускания по молекулярной массе которой составляет 750 кДа, и получение BBC в концентрате; и, наконец, фильтрование концентрата, содержащего BBC, через фильтр с отверстиями размером 0,2 мкм и получение BBC в отфильтрованном растворе. Были успешно произведены три испытания с увеличенным объемом/ на соответствие техническим условиям (CR), с использованием 6 л культуры, и одно испытание (TTR) с использованием 10 л культуры. Экспериментальные параметры указаны в Таблице 21.
Таблица 21 | |
Испытания с увеличенным объемом/ на соответствие техническим условиям для VSVINN4CT1-gag1 | |
Операция | Условия проведения операции |
Получение продукта центрифугированием | Центрифуга периодического действия, 6238×g, 30 минут, 20-24°С |
Получение продукта фильтрованием | Sartorius Sartobran™ 300 (для 6 литров загрузки), 500 (для 10 литров загрузки), расход: 200 мл/мин (для 6 литров загрузки) и 300 мл/мин (для 10 литров загрузки) |
Хроматография на Mustang™ Q |
Pall Mustang™ Q, 10-мл капсула, расход: 200 мл/мин; Pall Mustang™ Q, 60-мл капсула, расход: 600 мл/мин |
Ультрафильтрация/ диафильтрация | GE Healthcare, молек. масса: 750 кДа, пять буферных обменов; CR: 420 см2, скорость поперечного течения: 500-550 мл/мин, трансмембранное давление: 1,0-2,0 psi; TTR: 1200 см2, скорость поперечного течения: 1800 мл/мин, трансмембранное давление: 2,0 psi |
Конечное фильтрование | Sartorius Sartobran™ 150, 100 мл/мин |
Результаты экспериментов показаны в Таблицах 22 и 23. Был проделан обычный анализ SDS-PAGE (данные не показаны). Различие в выходе операций в различных экспериментах объясняется различением в эффективности анализа (анализ бляшкообразования). Наблюдали хорошее согласование общего выхода способа во всех экспериментах. Также наблюдали хорошее согласование степени удаления белков и загрязняющих ДНК. Во всех экспериментах получали вирусный продукт высокого качества.
Таблица 22 | ||||
Параметры испытаний на соответствие техническим условиям для VSVINN4CT1-gag1 | ||||
Увеличение масштаба | CR#1 | CR#2 | TTR#1 | |
Серия | VSV060405 | VSV060816 | VSV060831 | LP#1 |
Сбор клеточной культуры: объем (мл) | 6612 | 5696 | 5692 | 8000 |
Сбор клеточной культуры: титр (БОЕ/мл) | 5,55×105 | 2,15×105 | 1,69×106 | 8,14×105 |
Очищенный объединенный концентрат: объем (мл) | 280 | 530 | 280 | 850 |
Очищенный объединенный концентрат: титр (БОЕ/мл) | 1,45×106 | 2,08×105 | 3,00×106 | 7,81×105 |
Выход способа (%) | 11,7 | 9,1 | 8,7 | 10,2 |
Остаточные ДНК (нг/мл) | 32 | 12 | 13 | 6 |
Загрязняющие белки (5) | Н.О. | 99,97 | 99,98 | 99,92 |
Н.О. = не определяли |
Таблица 23 | ||||||
Анализ способа по выходу продукта | ||||||
Операция способа | CR#1 | CR#2 | Увеличение масштаба | Среднее1 | Станд. откл.2 | TTR#1 |
Сбор | 100,0 | 100,0 | 100,0 | 100 | ||
Центрифугирование | 56,6 | 70,0 | 79,3 | 68,6 | 11,4 | Н.О. |
Предварительное SB разбавление | 137,0 | 112,5 | Н.О. | 124,8 | 17,3 | 23,7 |
Фильтрование через Sartobran | 96,5 | 71,8 | 98,1 | 88,8 | 14,7 | 257,2 |
Хранение в течение ночи | 89,8 | 41,9 | Н.О. | 65,9 | 33,9 | 48,6 |
Mustang™ Q | 43,4 | 100,1 | 32,9 | 58,8 | 36,2 | 93,0 |
УФ/ДФ | 58,4 | 99,2 | 110,0 | 89,2 | 27,2 | 26,4 |
Фильтрование через 0,2 мкм фильтр | 53,6 | 37,0 | 39,4 | 43,3 | 9,0 | 139,7 |
Общий выход | 9,1 | 8,7 | 11,7 | 9,8 | 1,6 | 10,2 |
1, 2: Среднее и станд. откл. из CR#1-3; | ||||||
Н.О. = не определяли |
Данный способ очистки VSVINN4CT1-gag1 успешно приводит к получению высококачественного продукта. Объем очистки был доведен до 10 л (объем культуральной клеточной жидкости), и параметры способа при этом оставались стабильными. Общий выход способа, рассчитанный на основании титра BBC, полученного при анализе бляшкообразования, был ниже, чем соответствующий выход при очистке VSVINN4CT9-gag1 и VSVNJN4CT1-gag1. Основные потери титра наблюдали при конечном фильтровании через фильтр с размером пор 0,2 мкм и также, возможно, при очистке на Mustang™ Q. Потери титра могут быть объяснены неспецифическим связыванием, в особенности при проведении очистки исходного материала, имеющего низкое значение титра. Чем ниже титр, тем большая часть вируса будет потеряна при фильтровании. Хорошим решением этой проблемы является повышение титра BBC в клеточной культуре. Можно полагать, что специалист в данной области техники, не прибегая к проведению ненужных экспериментов, может произвести в предлагаемой системе очистки изменения, включающие применение других компонентов буферов, наполнителей и условий проведения, которые могут снизить потери титра при очистке, а также применение благоприятной для вирусного продукта буферной среды.
ПРИМЕР 12: Способ крупномасштабной очистки BBC для конструкции VSVNJN4CT1-gag1
К этой конструкции успешно применяли способ очистки, описанный в Примере 9 для VSVINN4CT9-gag1, и затем объем был увеличен до 10 л (объем клеточной культуры). В этом способе очистки был получен BBC высокого качества.
В соответствии с этим способом очистки, операции первичного и вторичного осветления были по существу аналогичны соответствующим операциям, описанным в Примерах 3 и 4. Операцию анионообменной мембранной очистки с использованием адсорбера Mustang™ Q оптимизировали, как описано ниже. Проточную фильтрацию вдоль направления потока производили, применяя систему Quixstand™ или Flexstand™, снабженную мембранными картриджами, изготовленными из полого волокна (GE Healthcare; Piscataway, NJ). В этом исследовании применяли мембраны для ультрафильтрации GE из полиэфирсульфона, имеющие предел пропускания по молекулярной массе, равный 750 кДа. Номинальная площадь фильтрующей поверхности всех мембран составляла 420 см2 или 1200 см2. Эксперименты по мембранной хроматографии проводили с использованием зонда АКТА™ и системы AKTAPilot™ (GE Healthcare; Piscataway, NJ) и мембранных адсорберов Pall Mustang™ Q (Pall Corporation; East Hills, NY).
Первая экспериментальная очистка VSVNJN4CT1-gag1 с использованием условий, описанных выше для очистки VSVINN4CT9-gag1, позволила получить продукт высокого качества, что было подтверждено анализом SDS-PAGE. Тем не менее, в объединенных элюатах, содержащих продукт, были обнаружены высокие концентрации остаточных ДНК. Для достижения высокой степени очистки и получения высококачественного BBC продукта, условия связывания и элюирования на Mustang™ Q были оптимизированы с использованием мембранной хроматографии. Высокая воспроизводимость параметров способа была показана в последующих экспериментах, включавших испытания с увеличенным объемом/ на соответствие техническим условиям (CR), проводимые в следующих условиях.
Способ очистки также был успешно модифицирован для применения в контрактной производственной организации (КПО), где его применяли для получения материала, используемого для клинических испытаний.
Первая экспериментальная очистка VSVNJN4CT1-gag1 с использованием Mustang™ Q. Операция очистки на Mustang™ Q была проведена с использованием клеточной культуральной жидкости и буферных растворов и условиях проведения очистки, аналогичных описанным выше для очистки VSVINN4CT9-gag1. Коротко говоря, клетки и осколки клеток сначала удаляли центрифугированием. После кондиционирования посредством добавления 1X глутамат-фосфата сахарозы (ГФС) и 2-кратного разбавления буфером, содержащим 10 мМ HEPES, 0,465 М NaCl, при pH 7,5, 2% сахарозы, раствор прокачивали через фильтр с размером пор 0,2 мкм. Фильтрат загружали на предварительно уравновешенный мембранный адсорбер Mustang™ Q и собирали объединенные элюат и промывные воды. Получаемый BBC извлекали с объединенным элюатом в условиях элюирования, описанных выше для очистки VSVINN4CT9-gag1. Кроме того, собирали раствор, полученный при регенерации с использованием раствора, включающего 10 мМ HEPES, 1,0 М NaCl, при pH 7,5, 2% сахарозы. Наконец, Mustang™ Q очищали 1,0 М раствором NaOH. В эксперименте наблюдали высокую BBC-связывающую способность. Тем не менее в объединенных элюатах обнаружили лишь небольшое количество продукта (данные не показаны). В основном вирусный продукт обнаруживали в объединенном растворе для регенерации, и более половины вирусного продукта было потеряно (См. Таблицу 24). Как в элюатах, так и в объединенном растворе для регенерации обнаруживали большое количество загрязняющих ДНК. С целью увеличения выхода продукта и снижения концентраций остаточных ДНК, затем были оптимизированы условия связывания и элюирования для Mustang™ Q с учетом новой вирусной конструкции.
Таблица 24 | ||||
Анализ очистки на Mustang™ Q - выход титра и удаления ДНК | ||||
Способ: | Загрузка | Элюирование и промывка | Элюирование | Регенерация |
Объем (мл) | 312 | 330 | 35 | 15 |
Титр вируса (БОЕ/мл) | 6,71×105 | Н.П. | 5,94×105 | 5,00×106 |
Титр вируса (БОЕ) | 2,09×108 | Н.П. | 2,08×107 | 7,50×107 |
Выход вируса (%) | 100,0 | 0,0 | 9,9 | 35,8 |
ДНК (нг/мл) | 123 | 16 | 84 | 782 |
ДНК (нг) | 38376 | 5280 | 2940 | 11730 |
Количество ДНК | 100,0 | 13,76 | 7,66 | 30,57 |
ДНК (нг/доза) | 1833,1 | Н.А. | 1414,1 | 1564,0 |
1 доза = 1,0×107БОЕ; | ||||
Н.П. - ниже порога определения | ||||
Н.А. - не анализировали |
Как уже было упомянуто выше, в очистке VSVINN4CT9-gag1 затруднительным было удаление остаточной ДНК из готового продукта. Для дальнейшей оптимизации условия проведения очистки применяли Merck KGaATM ТМАЕ и Pall MustangTM Q.
Разработка очистки BBC с использованием смолы ТМАЕTM
Было проведено исследование влияния параметров буфера связывания 15 BBC на смоле ТМАЕ™ (триметиламиноэтиловая смола) с использованием полнофакторного эксперимента, как указано в Таблице 25. Загрузкой были осветленные культуральные жидкости, имеющие различные буферные параметры. Количество BBC в элюатах анализировали с помощью вестерн-блоттинга.
Таблица 25 | ||
Полнофакторный эксперимент условий связывания на ТМАЕ™ | ||
Факто ры |
pH | Концентрация NaCl в равновесном буфере (мМ) |
Значе ние |
6,5; 7,0; 7,5 | 0, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400 |
Как показал вестерн-блоттинг (не показано), при концентрации NaCl в равновесном буфере, равной 200 мМ, в объединенных элюатах было обнаружено значительное количество BBC. Для получения достаточной связующей способности ТМАЕ™ по отношению к BBC, концентрация NaCl в равновесном буфере должна быть ниже 200 мМ. Связующая способность BBC при тестируемых значениях pH изменялась незначительно. Тем не менее анализ содержания BBC в объединенных элюатах (оценка при помощи интегрирования площадей под кривыми, полученными при помощи Э-ЖХВР анализа объединенных элюатов ТМАЕ (Фиг.8А, 8В и 8С)), указывает на то, что при одинаковой концентрации NaCl в буфере связывания более высокая связывающая способность достигается при более высоких значениях pH (pH 7,5 по сравнению с pH 7,0 и 6,5).
Экспериментальная очистка BBC с использованием колонки с ТМАЕ
Клетки и осколки удаляли из культуральной клеточной жидкости, содержащей VSVINN4CT9-gag1 центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 минут при 20-24°С. После смешивания полученной жидкости с 10Х количеством маточного раствора в отношении 9 к 1, ее прокачивали через 0,45/0,2-мкм фильтр. Фильтрат использовали для загрузки на колонку с ТМАЕ (2 мл) при скорости истечения, равной 4 мл/мин, колонку предварительно уравновешивали раствором, содержащим 10 мМ HEPES, 0,145 М NaCl, 2% сахарозы и имеющим pH 7,4. После прогона через колонку равновесного буфера в количестве 10 объемов колонки (КО) адсорбированные материалы вымывали из колонки при элюировании линейным градиентом 10 мМ HEPES, 1,5 М NaCl, 2% сахарозы при pH 7,5 в 30 объемах колонки. Собирали различные элюаты.
Таблица 26 | ||
Элюирование BBC из колонки с ТМАЕ | ||
Образцы | Описание | Объем (мл) |
Загрузка | Последующее фильтрование через 0,2-мкм | 130 |
фильтр | ||
Э+ПВ | 150 | |
Элюаты и промывочные растворы | ||
F1 | 16 | |
А3-10 | ||
F2 | 6 | |
А11-В12 | ||
F3 | 22 | |
В11-В1 | ||
F4 | 6 | |
C12-D11 (0,5MNaOH) |
При проведении SDS-PAGE электрофореза на геле (не показан) в профиле элюирования наблюдали два основных пика. Первый пик F1 соответствовал низкому соотношению UV254/280, что указывало на более высокое отношение белки/вирус. Второй пик F2 соответствовал высокому соотношению UV254/280, что указывало на более высокое содержание нуклеиновых кислот. Данные анализа PicoGreen® подтвердили, что концентрация ДНК во фракции F1 чрезвычайно низка (данные не показаны). Таким образом, эту колонку использовали для удаления ДНК. По данным анализа бляшкообразования выход титра в этом пике составлял 81,4%. Тем не менее отмечали высокое содержание загрязняющих белков.
Очистка BBC с использованием мембранного адсорбера MustangTM Q
Выполняли поиск условий связывания BBC на мембранном адсорбере MustangTM Q с использованием полнофакторного эксперимента, данные которого указаны в Таблице 27. Загрузка представляла собой осветленную культуральную жидкость, параметры которой доводили до необходимых буферных значений. Объединенные элюаты, получаемые из MustangTM Q, анализировали при помощи анализа SDS-PAGE (не показан).
Таблица 27 | ||
Полнофакторный эксперимент по поиску условий связывания BBC на Mustang™ Q | ||
Факторы | pH | Концентрация NaCl в равновесном буфере (М) |
Значение | 6,5; 7,0; 7,5 | 0,15; 0,20; 0,22; 0,24; 0,26; 0,28 |
SDS-PAGE анализ поиска условий связывания BBC на адсорбере Mustang™ Q проводили при различных связывающих концентрациях NaCl, соответственно: 0,15; 0,20; 0,22; 0,24; 0,26; 0,28 М. Когда концентрация NaCl в равновесном буфере достигала 0,26 М, высокомолекулярные загрязняющие белки извлекались из элюатов при всех тестируемых значениях pH.
Поиск условий элюирования
Осветленную культуральную жидкость, содержащую VSVINN4CT9-gag1, разбавляли в два раза маточным раствором HEPES (10 мМ HEPES, 0,415 М NaCl, 2% сахарозы, pH 7,25) до достижения конечной концентрации NaCl, равной 0,28 М. Приготовленный раствор использовали в качестве загрузочного в этом эксперименте. Условия эксперимента указаны в Таблице 28. После связывания на Mustang™ Q MA, BBC элюировали буферными растворами для элюирования, имеющими различные концентрации NaCl.
Таблица 28 | ||
Полнофакторный эксперимент по поиску условий элюирования из Mustang™ Q | ||
Факто ры |
pH | Концентрация NaCl в буфере для элюирования (М) |
Значе ние |
6,5; 7,0; 7,5 | 0,55; 0,60; 0,65; 0,70; 0,75 |
Анализ контурного изображения выхода способа (не показан) указывает на то, что для достижения разумного выхода (>55%), параметры буфера элюирования должны быть следующими: pH=6,5-6,9 и концентрация NaCl=0,55-0,70 М. Как показывает SDS-PAGE анализ элюатов, полученных из Mustang™ Q (не показан), при этих параметрах получают высококачественный продукт, содержащий BBC.
Оптимизация условий работы Mustang™ Q при помощи методики DOE
Последующая оптимизация операции очистки на Mustang™ Q позволила увеличить степень связывания BBC и улучшить условия элюирования, что позволило улучшить очистку продукта от ДНК и увеличить выход продукта. Условия эксперимента показаны в Таблице 29. На основании исходных исследований и предыдущих экспериментов с VSVINN4CT9-gag1 были выбраны значения pH для загрузки и элюирования, составляющие от 6,5 до 7,0. По результатам исходных исследований также были выбраны различные концентрации NaCl для загрузочных буферов и буферов элюирования. Расход (скорость истечения) во всех экспериментах был принят равным 7,0 мл/мин, что составляло 20 объемов капсулы (ОК)/мин.
Таблица 29 | ||||
Очистка BBC на адсорбере Mustang™ Q | ||||
No. эксп. | Связывающая концентрация NaCl (М) | pH связывания | Концентрация NaCl для элюирования (М) | РН элюирования |
1 | 0,26 | 6,5 | 0,550 | 6,50 |
2 | 0,26 | 6,5 | 0,700 | 6,75 |
3 | 0,26 | 7,0 | 0,625 | 7,00 |
4 | 0,26 | 7,5 | 0,550 | 6,75 |
5 | 0,26 | 7,5 | 0,700 | 6,50 |
6 | 0,28 | 6,5 | 0,550 | 7,00 |
7 | 0,28 | 6,5 | 0,625 | 6,50 |
8 | 0,28 | 7,0 | 0,550 | 6,50 |
9 | 0,28 | 7,0 | 0,625 | 6,75 |
10 | 0,28 | 7,0 | 0,625 | 6,75 |
11 | 0,28 | 7,0 | 0,625 | 6,75 |
12 | 0,28 | 7,0 | 0,625 | 6,75 |
13 | 0,28 | 7,5 | 0,700 | 7,00 |
14 | 0,30 | 6,5 | 0,550 | 6,50 |
15 | 0,30 | 6,5 | 0,700 | 7,00 |
16 | 0,30 | 7,0 | 0,625 | 6,75 |
17 | 0,30 | 7,0 | 0,700 | 6,50 |
18 | 0,30 | 7,5 | 0,550 | 7,00 |
19 | 0,30 | 7,5 | 0,625 | 6,50 |
Экспериментальные результаты
Выход способа был рассчитан на основании титра продукта, содержащего BBC, определяемого в соответствии с анализом бляшкообразования. Результаты показаны на профиле прогноза (prediction profile) (не показан). Для получения максимального выхода способа были предложены следующие условия проведения адсорбции на Mustang™ Q:
Концентрация NaCl в буфере загрузки: 0,26-0,30 М
pH буфера загрузки: 7,0-7,5
Концентрация NaCl в буфере элюирования: 0,55-0,65
pH буфера элюирования: 6,5-7,0
Остаточные концентрации ДНК в элюатах, поступающих из Mustang™ Q, полученных в различных условиях связывания, показаны на контурных изображениях (не показаны). Параметры буферов для Mustang™ Q были дополнительно уточнены на основании результатов по удалению ДНК:
Концентрация NaCl в буфере загрузки: 0,27-0,29 М
pH буфера загрузки: 7,0-7,5
Концентрация NaCl в буфере элюирования: 0,55-0,65
pH буфера элюирования: 6,5-7,0
Чистоту BBC, получаемого в элюатах, поступающих из Mustang™ Q, оценивали при помощи денситометрии SDS-PAGE (не показана). Анализировали чистоту продукта, полученного в различных условиях связывания и при различных параметрах буферного раствора для элюирования. Учитывая отклонения в денситометрическом анализе, во всех случаях не было обнаружено значительного различия в чистоте получаемого BBC. Во всех экспериментах получали высококачественный BBC.
Диапазон рабочих режимов Mustang™ Q
Параметры буферов связывания и элюирования при проведении мембранной хроматографии на Mustang™ Q были определены посредством экспериментов, в которых исследовали большее количество значений рабочих условий, как внутри, так и вне принятого диапазона; результаты показаны в Таблице 30. Равновесные буферные растворы/буферные растворы элюирования включали 10 мМ HEPES, 2% сахарозы и различные количества NaCl при различных значениях pH. Во всех экспериментах поддерживали одинаковые рабочие условия: один и тот же расход, один и тот же объем загрузки и объем элюирования. Как видно из Таблицы 30, воспроизводимость характеристик проведения способа очистки была хорошей: анализ SDS-PAGE показал, что полученный BBC имеет высокое качество, во всех элюатах, поступающих из Mustang™ Q, были обнаружены допустимые уровни остаточных ДНК и, кроме того, был получен хороший выход продукта.
Таблица 30 | ||||||
Определение диапазон рабочих режимов Mustang™ Q | ||||||
РН загруз ки |
Концентрация NaCl в загрузке (М) | pH элюирования | Концентрация NaCl при элюировании (М) | Выход (%, титр) | Чистота (%, SDS-PAGE) | ДНК (нг/мл) |
7,5 | 0,30 | 6,75 | 0,60 | 52,0 | 72,0 | 34 |
7,0 | 0,30 | 6,75 | 0,60 | 85,7 | 80,0 | 33 |
7,5 | 0,26 | 6,75 | 0,60 | 49,1 | 76,1 | 34 |
7,0 | 0,26 | 6,75 | 0,60 | 68,0 | 73,0 | 39 |
7,5 | 0,28 | 7,00 | 0,65 | 85,7 | 79,6 | 21 |
7,5 | 0,28 | 6,50 | 0,65 | 70,9 | 82,3 | 18 |
7,5 | 0,28 | 6,50 | 0,55 | 49,5 | 82,8 | 15 |
7,5 | 0,28 | 7,00 | 0,55 | 59,9 | 83,3 | 21 |
7,5 | 0,28 | 6,75 | 0,60 | 52,6 | Н.О. | 17 |
7,5 | 0,28 | 6,75 | 0,60 | 107,2 | Н.О. | 30 |
Н.О. = не определено |
Испытания на соответствие техническим условиям для VSVINN4CT1-gag1
Все операции способа были проделаны при очистке культуральной клеточной жидкости, содержащей VSVINN4CT9-gag1. Способ включает: осветление клеточной культуры посредством низкоскоростного центрифугирования и выделение BBC в надосадочную жидкость; фильтрование полученной после центрифугирования надосадочной жидкости, через фильтр с отверстиями размером 0,45/0,2 мкм и получение BBC в отфильтрованном растворе; загрузку фильтрата, содержащего BBC, на анионообменный мембранный адсорбер; элюирование BBC из анионообменного мембранного адсорбера и получение BBC; очистку полученного BBC с применением проточной фильтрации вдоль потока (ПФ) с использованием мембраны, предел пропускания по молекулярной массе которой составляет 750 кДа, и получение BBC в концентрате; и, наконец, фильтрование концентрата, содержащего BBC, через фильтр с отверстиями размером 0,2 мкм и получение BBC в отфильтрованном растворе. Wyeth были произведены испытания на соответствие техническим условиям: одно испытание с использованием 10 л культуры и два испытания с использованием 6 л культуры, и Henogen были произведены два испытания внедрения методики в производство с использованием 10 л культуры. Экспериментальные параметры указаны в Таблице 31.
Таблица 31 | |
Параметры способа для эксперимента с VSVINN4CT9-gag1 | |
Операция | Условия проведения операции |
Получение продукта прицентрифугированием | Центрифуга периодического действия, 6238×g, 30 минут, 20-24°С |
Получение продукта прифильтрованием | Sartorius Sartobran™ 300 (для 6 литров загрузки), 500 (для 10 литров загрузки), расход: 200 мл/мин (для 6 литров загрузки) и 300 мл/мин (для 10 литров загрузки) |
Хроматография на Mustang™ Q | Pall Mustang™ Q, 10-мл капсула, расход: 200 мл/мин; Pall Mustang™ Q, 60-мл капсула, расход: 600 мл/мин |
Ультрафильтрация / диафильтрация | GE Healthcare, молек. масса: 750 кДа, пять буферных обменов; CR: 420 см2, скорость поперечного течения: 500-550 мл/мин, трансмембранное давление: 1,0-2,0 psi; TTR: 1200 см2, скорость поперечного течения: 1800 мл/мин, трансмембранное давление: 2,0 psi |
Конечное фильтрование | Sartorius Sartobran™ 150, расход: 00 мл/мин |
Для выполнения трех испытаний на соответствие техническим условиям (CR) и одного испытания внедрения методики в производство использовали капсулу Mustang™ Q объемом 10 мл. Капсулу Mustang™ Q объемом 60 мл использовали только в одном испытании TTR. Расход для 10-мл капсулы составлял 200 мл/мин, а для 60-мл капсулы - 600 мл/мин. В испытаниях на соответствие техническим условиям использовали ПФ мембрану площадью 420 см2, в то время как для TTR экспериментов использовали ПФ мембрану площадью 1200 см2. Скорость поперечного течения изменяли линейно в соответствии с площадью мембраны.
Результаты экспериментов показаны в Таблицах 32 и 33. Наблюдали хорошее согласование общего выхода способа во всех экспериментах. Различие в выходах операций в различных экспериментах объясняется различением в эффективности анализа (Таблица 33). Во всех экспериментах наблюдали хорошее согласование степени удаления белков и загрязняющих ДНК (Таблица 32). Для оценки способа был проделан обычный анализ SDS-PAGE (данные не показаны). Во всех экспериментах получали вирусный продукт высокого качества.
Таблица 32 | |||||
Параметры испытаний на соответствие техническим условиям для VSVNJN4CT1-gag1 | |||||
CR#1 | CR#2 | CR#3 | TTR#1 | TTR#2 | |
Серия # | VSV060629 | VSV060712 | VSV060728 | Henogen #1 | Henoge n#2 |
Сбор клеточной культуры: объем (мл) | 8927 | 5704 | 5607 | 8072 | 7980 |
Сбор клеточной культуры: титр (БОЕ/мл) | 1,28×107 | 2,81×10 | 2,56×107 | 1,27×107 | 8,14×106 |
Очищенный объединенный концентрат: объем (мл) | 800 | 670 | 600 | 855 | 550 |
Очищенный объединенный концентрат: титр (БОЕ/мл) | 8,22×107 | 1,45×108 | 1,16×108 | 2,86×107 | 5,36×107 |
Выход способа (%) | 57,7 | 60,8 | 55,8 | 23,9 | 45,4 |
Остаточные ДНК (нг/мл) | 18 | 22 | 11 | 51 | 21 |
Загрязняющие белки (5) | 99,83 | 99,84 | 99,89 | 99,72 | Н.Д. |
Н.Д. = недоступно |
Таблица 33 | |||||||
Анализ способа на основании выхода продукта | |||||||
Операция способа | CR#1 | CR#2 | CR#3 | Среднее | Станд. откл.2 |
TTR#1 | TTR#2 |
Сбор | 100 | 100 | 100 | 100 | 0 | 100 | 100 |
Центрифугирова ние |
113,8 | 97,6 | 96,3 | 102,6 | 9,8 | 188,6 | 71,2 |
Фильтрование через Sartobran™ | 106,7 | 90,8 | 123,6 | 107,3 | 16,4 | 23,8 | 71,6 |
Хранение в течение ночи | Н.О. | 76,8 | 85,5 | 81,2 | 6,2 | Н.О. | Н.О. |
Mustang™ Q | 37,5 | 70,7 | 42,7 | 50,3 | 17,9 | 309,3 | 60,2 |
УФ/ДФ | 116,7 | 102,8 | 129,9 | 116,5 | 13,6 | 16,5 | 123,4 |
Фильтрование через 0,2 мкм фильтр | 107,7 | 131,2 | 85,8 | 108,2 | 22,7 | 134,2 | 119,9 |
Общий выход | 57,7 | 60,8 | 48,8 | 55,8 | 6,2 | 23,9 | 45,4 |
1,2: Среднее и станд. откл. из CR#1-3; | |||||||
Н.О. = не определяли |
Таким образом, был успешно разработан способ очистки VSVNJN4CT1-gag1, и обнаруженные условия проведения очистки были адаптированы для объема 10 л (объем клеточной культуры) при сохранении первоначальных технологических характеристик способа очистки. Успешное осуществление способа было подтверждено проведением трех испытаний на соответствие техническим условиям и двух испытаний внедрения методики в производство, включающих использование 10 л и 6 л клеточной культуры, соответственно. При помощи разработанного способа был получен вирусный продукт высокого качества с приемлемым выходом и степенью очистки от примесей.
Все патенты и публикации, цитируемые в настоящем описании, полностью включены в настоящее описание по ссылке.
Claims (13)
1. Способ очистки вируса везикулярного стоматита (ВВС) из жидкости клеточной культуры, полученной из культуры клеток млекопитающего, зараженных ВВС, который включает:
(a) осветление указанной жидкости клеточной культуры при помощи низкоскоростного центрифугирования при скорости ниже 10000 об/мин или при помощи модуля объемного фильтрования, размер пор которого составляет от 1,0 мкм до 4,5 мкм, с получением указанного ВВС в надосадочной жидкости;
(b) фильтрование указанной надосадочной жидкости, полученной на стадии (а), через фильтр с отверстиями размером от 0,2 до 0,45 мкм, и получение указанного ВВС в отфильтрованном растворе;
(c) загрузку содержащего ВВС указанного отфильтрованного раствора, полученного на стадии (b), на анионообменный мембранный адсорбер, уравновешенный первым буферным солевым раствором, при этом первый буферный солевой раствор обладает ионной силой по меньшей мере от примерно 100 мМ до примерно 400 мМ, элюирование указанного ВВС из указанного анионообменного мембранного адсорбера вторым буферным солевым раствором, при этом указанный ВВС элюируется с указанного мембранного адсорбера при добавлении указанного второго буферного солевого раствора в одну стадию, при этом концентрация соли в указанной одностадийной элюции составляет от 500 мМ до 750 мМ, и сбор элюированных фракций, содержащих ВВС;
(d) очистку указанного ВВС, выделенного на стадии (с), проточной фильтрацией вдоль направления потока (ПФ) с использованием мембраны, предел пропускания по молекулярной массе которой составляет от 300 кДа до 1000 кДа, и получение указанного ВВС в концентрате; и
(е) фильтрование содержащего ВВС указанного концентрата, полученного на стадии (d), через фильтр с отверстиями размером от 0,2 до 0,22 мкм и получение указанного ВВС в отфильтрованном растворе,
причем указанный способ очистки не включает использование человеческих эмбрионов.
(a) осветление указанной жидкости клеточной культуры при помощи низкоскоростного центрифугирования при скорости ниже 10000 об/мин или при помощи модуля объемного фильтрования, размер пор которого составляет от 1,0 мкм до 4,5 мкм, с получением указанного ВВС в надосадочной жидкости;
(b) фильтрование указанной надосадочной жидкости, полученной на стадии (а), через фильтр с отверстиями размером от 0,2 до 0,45 мкм, и получение указанного ВВС в отфильтрованном растворе;
(c) загрузку содержащего ВВС указанного отфильтрованного раствора, полученного на стадии (b), на анионообменный мембранный адсорбер, уравновешенный первым буферным солевым раствором, при этом первый буферный солевой раствор обладает ионной силой по меньшей мере от примерно 100 мМ до примерно 400 мМ, элюирование указанного ВВС из указанного анионообменного мембранного адсорбера вторым буферным солевым раствором, при этом указанный ВВС элюируется с указанного мембранного адсорбера при добавлении указанного второго буферного солевого раствора в одну стадию, при этом концентрация соли в указанной одностадийной элюции составляет от 500 мМ до 750 мМ, и сбор элюированных фракций, содержащих ВВС;
(d) очистку указанного ВВС, выделенного на стадии (с), проточной фильтрацией вдоль направления потока (ПФ) с использованием мембраны, предел пропускания по молекулярной массе которой составляет от 300 кДа до 1000 кДа, и получение указанного ВВС в концентрате; и
(е) фильтрование содержащего ВВС указанного концентрата, полученного на стадии (d), через фильтр с отверстиями размером от 0,2 до 0,22 мкм и получение указанного ВВС в отфильтрованном растворе,
причем указанный способ очистки не включает использование человеческих эмбрионов.
2. Способ по п.1, согласно которому фильтрование на стадии (е) осуществляют до достижения степени очистки указанного ВВС от загрязняющих его белков клеточной культуры и нуклеиновых кислот, от по меньшей мере 90,0% до примерно 99,0%.
3. Способ по п.1, согласно которому указанные клетки млекопитающего выбирают из группы, включающей эмбриональные клетки почки человека (НЕК), клетки НЕК 293, клетки яичников Китайского хомячка (СНО), клетки почки новорожденных хомячков (ВНК), клетки почки Африканской зеленой мартышки (AGMK) и клетки Vero AGMK.
4. Способ по п.1, согласно которому скорость указанного низкоскоростного центрифугирования составляет от 4000 × g до 8000 × g.
5. Способ по п.1, согласно которому указанный первый буферный солевой раствор или указанный второй буферный солевой раствор, используемый на стадии (с), независимо обладает одной или более характеристиками, выбранными из группы, состоящей из следующего:
(a) содержит соль, независимо выбранную из NaCl или KCl;
(b) содержит соль, ионная сила раствора которой составляет от 100 мМ до 400 мМ;
(c) содержит буфер, pKa которого составляет от 6,0 до 8,5;
(d) имеет значение рН от 6,5 до 8,0;
(e) содержит буфер, выбираемый из группы, состоящей из фосфатного буфера, буфера, включающего N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновую кислоту (HEPES) или трис(гидроксиметил)аминометан (TRIS); и
(f) содержит сахарозу в концентрации от 1,5% до 5%.
(a) содержит соль, независимо выбранную из NaCl или KCl;
(b) содержит соль, ионная сила раствора которой составляет от 100 мМ до 400 мМ;
(c) содержит буфер, pKa которого составляет от 6,0 до 8,5;
(d) имеет значение рН от 6,5 до 8,0;
(e) содержит буфер, выбираемый из группы, состоящей из фосфатного буфера, буфера, включающего N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновую кислоту (HEPES) или трис(гидроксиметил)аминометан (TRIS); и
(f) содержит сахарозу в концентрации от 1,5% до 5%.
6. Способ по п.5, согласно которому соль в указанном втором буферном солевом растворе представляет собой NaCl и согласно которому указанный ВВС элюируют из указанного мембранного адсорбера добавлением указанного второго рН-буферного солевого раствора в одну стадию, и согласно которому концентрация указанного NaCl при элюировании, проводимом в одну стадию, составляет от 500 мМ до 750 мМ.
7. Способ по п.6, согласно которому скорость элюирования указанным вторым буферным солевым раствором составляет от 10 объемов капсулы в минуту (ОК/минуту) до 30 ОК/минуту.
8. Способ по п.5, согласно которому соль в указанном втором буферном солевом растворе представляет собой NaCl и согласно которому ионную силу указанного второго буферного солевого раствора указанного NaCl линейно увеличивают от 1 мМ до 750 мМ при скорости элюирования, составляющей от 10 ОК/минуту до 30 ОК/минуту.
9. Способ по любому из пп.1-8, согласно которому указанная мембрана ПФ обладает одной или более характеристиками, выбираемыми из группы, состоящей из:
(a) предел пропускания по молекулярной массе, составляющий 300 кДа;
(b) предел пропускания по молекулярной массе, составляющий 750 кДа; и
(c) мембранный модуль изготовленный из полого волокна.
(a) предел пропускания по молекулярной массе, составляющий 300 кДа;
(b) предел пропускания по молекулярной массе, составляющий 750 кДа; и
(c) мембранный модуль изготовленный из полого волокна.
10. Способ по любому из пп.1-8, согласно которому указанная ПФ включает концентрирование указанного ВВС, полученного на стадии (с), проводимое по меньшей мере 5 раз, с последующим проведением по меньшей мере однократной или по меньшей мере пятикратной замены буфера.
11. Способ по п.10, согласно которому указанный буфер, применяемый при буферном обмене, обладает одной или более характеристиками, выбираемыми из группы, состоящей из следующего:
(a) представляет собой фосфатный буфер;
(b) представляет собой буфер, содержащий HEPES;
(c) представляет собой буфер, содержащий TRIS;
(d) концентрация буфера составляет от 5 мМ до 15 мМ, а рН составляет от 7,2 до 7,5; и
(e) буфер также содержит от 100 мМ до 200 мМ NaCl и от 3,5% до 4,5% сахарозы.
(a) представляет собой фосфатный буфер;
(b) представляет собой буфер, содержащий HEPES;
(c) представляет собой буфер, содержащий TRIS;
(d) концентрация буфера составляет от 5 мМ до 15 мМ, а рН составляет от 7,2 до 7,5; и
(e) буфер также содержит от 100 мМ до 200 мМ NaCl и от 3,5% до 4,5% сахарозы.
12. Способ по любому из пп.1-8, 11, согласно которому операции очистки (а)-(е) проводят при значении температуры или значениях температуры, составляющих или находящихся в диапазоне от 15°С до 25°С.
13. Способ по любому из пп.1-8, 11, согласно которому осветление указанной культуральной жидкости клеточной культуры, проводимое на стадии (а), осуществляют при помощи модуля объемного фильтрования, размер пор которого составляет от 1,0 мкм до 4,5 мкм, и при этом из операции (а) исключают проведение низкоскоростного центрифугирования.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US79337606P | 2006-04-20 | 2006-04-20 | |
US60/793,376 | 2006-04-20 | ||
PCT/US2007/009510 WO2007123961A2 (en) | 2006-04-20 | 2007-04-19 | Purification processes for isolating purified vesicular stomatitis virus from cell culture |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2008140137A RU2008140137A (ru) | 2010-05-27 |
RU2484135C2 true RU2484135C2 (ru) | 2013-06-10 |
Family
ID=38625574
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2008140137/10A RU2484135C2 (ru) | 2006-04-20 | 2007-04-19 | Способ очистки, предназначенный для получения очищенного вируса везикулярного стоматита из клеточной культуры |
Country Status (19)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7875446B2 (ru) |
EP (1) | EP2007883B1 (ru) |
JP (1) | JP5129805B2 (ru) |
KR (1) | KR101385927B1 (ru) |
CN (1) | CN101426905B (ru) |
AT (1) | ATE539149T1 (ru) |
AU (1) | AU2007240797B2 (ru) |
BR (1) | BRPI0710820A2 (ru) |
CA (1) | CA2648792C (ru) |
CR (1) | CR10380A (ru) |
DK (1) | DK2007883T3 (ru) |
ES (1) | ES2377356T3 (ru) |
IL (1) | IL194629A (ru) |
MX (1) | MX2008013494A (ru) |
PL (1) | PL2007883T3 (ru) |
PT (1) | PT2007883E (ru) |
RU (1) | RU2484135C2 (ru) |
SI (1) | SI2007883T1 (ru) |
WO (1) | WO2007123961A2 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20220332756A1 (en) * | 2014-05-21 | 2022-10-20 | Unchained Labs | Systems and methods for exchange of buffer solutions |
Families Citing this family (32)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2005322353B2 (en) | 2004-12-23 | 2011-09-01 | Medimmune, Llc | Non-tumorigenic MDCK cell line for propagating viruses |
CN103361319A (zh) | 2006-09-15 | 2013-10-23 | 米迪缪尼有限公司 | 支持病毒生长到高效价的mdck细胞系和采用该细胞系的生物反应器方法 |
EA017322B1 (ru) * | 2007-06-15 | 2012-11-30 | Амген Инк. | Способы обработки сред для культур клеток, применяемых в биореакторах |
WO2009044414A1 (en) * | 2007-10-02 | 2009-04-09 | Gima S.P.A. | Process and system for the industrial scale purification of bacteriophages intended for bacteriophage therapy |
JP2011507523A (ja) * | 2007-12-21 | 2011-03-10 | ワイス・エルエルシー | 遺伝子改変した弱毒化水疱性口内炎ウイルス、組成物およびその使用方法 |
DK3192874T3 (da) * | 2008-06-18 | 2019-12-16 | Oxford Biomedica Ltd | Virusoprensning |
EP2334328A4 (en) * | 2008-09-24 | 2012-08-29 | Medimmune Llc | METHOD FOR CLEANING VIRUSES |
CN103952376A (zh) | 2008-09-24 | 2014-07-30 | 米迪缪尼有限公司 | 培养细胞、增殖和纯化病毒的方法 |
JP2012505863A (ja) * | 2008-10-17 | 2012-03-08 | パシビア エルエルシー. | 高密度細胞における清澄化方法 |
US20100143889A1 (en) * | 2008-12-02 | 2010-06-10 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Rhabdoviridae virus preparations |
CA2750055A1 (en) * | 2009-02-06 | 2010-08-12 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Method for purifying viruses using a density gradient |
WO2011050071A2 (en) * | 2009-10-20 | 2011-04-28 | Abbott Laboratories | Isolation and purification of anti-il-13 antibodies using protein a affinity chromatography |
CN102191226A (zh) * | 2010-03-08 | 2011-09-21 | 北京清大天一科技有限公司 | 细胞培养混合物的分离纯化方法 |
SG188947A1 (en) | 2010-08-12 | 2013-06-28 | Yisheng Biopharma Holdings Ltd | Method for reducing dna impurities in viral compositions |
EA201390812A1 (ru) | 2010-12-02 | 2013-11-29 | Онколитикс Байотек Инк. | Лиофилизированные вирусные составы |
CN103347535B (zh) | 2010-12-02 | 2015-11-25 | 昂科利蒂克斯生物科技公司 | 液体病毒制剂 |
US20130012689A1 (en) * | 2011-07-08 | 2013-01-10 | Emd Millipore Corporation | Depth Filters For Disposable Biotechnological Processes |
US9610346B2 (en) * | 2012-03-23 | 2017-04-04 | International Aids Vaccine Initiative | Recombinant viral vectors |
US9005888B2 (en) | 2012-06-14 | 2015-04-14 | System Biosciences, Llc | Methods for microvesicle isolation and selective removal |
WO2014031690A1 (en) * | 2012-08-20 | 2014-02-27 | Terumo Bct, Inc. | Concentrating components of fluid circulated through a cell growth chamber |
WO2014031480A1 (en) * | 2012-08-24 | 2014-02-27 | Xcellerex, Inc. | Virus purification and formulation process |
FR3010720B1 (fr) | 2013-09-16 | 2017-08-11 | Genethon | Procede de production de virus enveloppes |
FR3014901B1 (fr) | 2013-12-17 | 2017-06-09 | Genethon | Procede de purification de virus ou vecteurs viraux enveloppes |
CN106857498B (zh) * | 2016-12-27 | 2021-05-14 | 科兴(大连)疫苗技术有限公司 | 一种不含二甲基亚砜的细胞冻存保护液及其应用 |
CN107964037A (zh) * | 2017-05-16 | 2018-04-27 | 浙江海隆生物科技有限公司 | 基于cho细胞表达系统的重组猪瘟e2蛋白的纯化方法及应用 |
CN110317832B (zh) * | 2018-03-28 | 2022-07-05 | 西比曼生物科技(香港)有限公司 | Gmp级规模化制备重组慢病毒载体的纯化制剂的方法 |
CN110317791A (zh) | 2018-03-29 | 2019-10-11 | 西比曼生物科技(香港)有限公司 | Gmp级无血清悬浮细胞大规模生产慢病毒的方法 |
AU2019305221A1 (en) * | 2018-07-19 | 2021-02-18 | Helixmith Co., Ltd. | Lyophilized pharmaceutical compositions for naked DNA gene therapy |
CA3107462A1 (en) * | 2018-07-24 | 2020-01-30 | Voyager Therapeutics, Inc. | Systems and methods for producing gene therapy formulations |
TW202043466A (zh) | 2019-01-25 | 2020-12-01 | 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 | 編碼ccl21之重組棒狀病毒 |
CN110305850A (zh) * | 2019-05-15 | 2019-10-08 | 苏州奥特铭医药科技有限公司 | 一种利用293细胞生产制备溶瘤病毒的方法 |
EP4179073A1 (en) | 2020-07-10 | 2023-05-17 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Process for producing a purified rhabdovirus from cell culture |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4556556A (en) * | 1984-03-23 | 1985-12-03 | Advanced Genetics Research Institute | Vaccine for the prevention of vesicular stomatitis virus infection |
US6168943B1 (en) * | 1995-05-04 | 2001-01-02 | Yale University | Methods for making modified recombinant vesiculoviruses |
WO2005098009A2 (en) * | 2004-04-09 | 2005-10-20 | Wyeth | Synergistic attenutation of vesicular stomatitis virus, vectors thereof and immunogenic compositions thereof |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK0702085T4 (da) * | 1994-07-18 | 2010-04-06 | Conzelmann Karl Klaus Prof Dr | Rekombinant infektiøs ikke-segmenteret negativ-strenget RNA-virus |
FR2737730B1 (fr) | 1995-08-10 | 1997-09-05 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Procede de purification de virus par chromatographie |
US6261823B1 (en) * | 1996-12-13 | 2001-07-17 | Schering Corporation | Methods for purifying viruses |
HUP0003911A3 (en) * | 1997-10-09 | 2007-11-28 | Pro Virus | Treatment of neoplasms with viruses |
KR100912362B1 (ko) * | 1998-02-17 | 2009-08-19 | 쉐링 코포레이션 | 바이러스 제제의 정제방법 |
AU2002362761A1 (en) * | 2001-10-09 | 2003-04-22 | University Of Miami | Generation of virus-like particles by vsv |
US20030175688A1 (en) * | 2002-03-15 | 2003-09-18 | Rukmini Pennathur-Das | Method for the purification and production of oncolytic adenoviruses |
US20030180936A1 (en) | 2002-03-15 | 2003-09-25 | Memarzadeh Bahram Eric | Method for the purification, production and formulation of oncolytic adenoviruses |
BR0309659A (pt) * | 2002-04-30 | 2005-02-22 | Oncolytics Biotech Inc | Método para produzir vìrus de uma cultura de células, composição, e, método para produzir reovìrus infeccioso |
DE60335672D1 (de) * | 2002-05-14 | 2011-02-17 | Merck Sharp & Dohme | Verfahren zur reinigung von adenovirus |
US20050009168A1 (en) | 2003-05-12 | 2005-01-13 | Robbins Joan Marie | Methods and apparatus for Adeno associated virus purification |
DE102004004043B4 (de) | 2004-01-27 | 2013-04-18 | Apanovis Biotechnologie Gmbh | Reinigung von hochmolekularen Verbindungen mittels Affinitätsmembranchromatographie |
ES2329607T3 (es) * | 2004-02-23 | 2009-11-27 | Crucell Holland B.V. | Metodos de purificacion de virus. |
WO2006011580A1 (ja) | 2004-07-27 | 2006-02-02 | Genomidea, Inc. | ウイルスエンベロープの精製方法 |
-
2007
- 2007-04-19 ES ES07755685T patent/ES2377356T3/es active Active
- 2007-04-19 AU AU2007240797A patent/AU2007240797B2/en active Active
- 2007-04-19 RU RU2008140137/10A patent/RU2484135C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2007-04-19 EP EP07755685A patent/EP2007883B1/en active Active
- 2007-04-19 BR BRPI0710820-6A patent/BRPI0710820A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2007-04-19 PT PT07755685T patent/PT2007883E/pt unknown
- 2007-04-19 CA CA2648792A patent/CA2648792C/en active Active
- 2007-04-19 KR KR1020087028205A patent/KR101385927B1/ko active IP Right Grant
- 2007-04-19 WO PCT/US2007/009510 patent/WO2007123961A2/en active Application Filing
- 2007-04-19 PL PL07755685T patent/PL2007883T3/pl unknown
- 2007-04-19 SI SI200730829T patent/SI2007883T1/sl unknown
- 2007-04-19 AT AT07755685T patent/ATE539149T1/de active
- 2007-04-19 DK DK07755685.0T patent/DK2007883T3/da active
- 2007-04-19 MX MX2008013494A patent/MX2008013494A/es active IP Right Grant
- 2007-04-19 US US11/788,071 patent/US7875446B2/en active Active
- 2007-04-19 CN CN2007800140908A patent/CN101426905B/zh active Active
- 2007-04-19 JP JP2009506566A patent/JP5129805B2/ja active Active
-
2008
- 2008-10-07 IL IL194629A patent/IL194629A/en active IP Right Grant
- 2008-10-20 CR CR10380A patent/CR10380A/es not_active Application Discontinuation
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4556556A (en) * | 1984-03-23 | 1985-12-03 | Advanced Genetics Research Institute | Vaccine for the prevention of vesicular stomatitis virus infection |
US6168943B1 (en) * | 1995-05-04 | 2001-01-02 | Yale University | Methods for making modified recombinant vesiculoviruses |
WO2005098009A2 (en) * | 2004-04-09 | 2005-10-20 | Wyeth | Synergistic attenutation of vesicular stomatitis virus, vectors thereof and immunogenic compositions thereof |
Non-Patent Citations (8)
Title |
---|
BURKHART С ЕТ AL., Characterization of T-helper epitopes of the glycoprotein of vesicular stomatitis virus, J Virol., 1994, v.68, no.3, p.1573-1580. * |
BURKHART С ЕТ AL., Characterization of T-helper epitopes of the glycoprotein of vesicular stomatitis virus, J Virol., 1994, v.68, no.3, p.1573-1580. HECHT T.T. ЕТ AL., Limitation of VSV infection by the host's response to VSV-associated cellular antigens, J Immunol., 1982, v.129, no.4, p.1736-1741. * |
HECHT T.T. ЕТ AL., Limitation of VSV infection by the host's response to VSV-associated cellular antigens, J Immunol., 1982, v.129, no.4, p.1736-1741. * |
MORENWEISER R., Downstream processing of viral vectors and vaccines, Gene Therapy, 2005, v.12, p.S103-S110. * |
SCHERR M. ЕТ AL., Efficient gene transfer into the CNS by lentiviral vectors purified by anion exchange chromatography. Gene Ther., 2002, v.9, no.24, p.1708-1714. * |
SCHERR M. ЕТ AL., Efficient gene transfer into the CNS by lentiviral vectors purified by anion exchange chromatography. Gene Ther., 2002, v.9, no.24, p.1708-1714. MORENWEISER R., Downstream processing of viral vectors and vaccines, Gene Therapy, 2005, v.12, p.S103-S110. SEGURA M.M. ET AL., Downstream processing of oncoretroviral and lentiviral gene therapy vectors, Biotechnol Adv., v.24, no.3, p.321-323. * |
SEGURA M.M. ET AL., Downstream processing of oncoretroviral and lentiviral gene therapy vectors, Biotechnol Adv., v.24, no.3, p.321-323. * |
YAMADA K. ЕТ AL., Lenti virus vector purification using anion exchange HPLC leads to improved gene transfer, Biotechniques, 2003, v.34, no.5, p.1074-1078. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20220332756A1 (en) * | 2014-05-21 | 2022-10-20 | Unchained Labs | Systems and methods for exchange of buffer solutions |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ES2377356T3 (es) | 2012-03-26 |
SI2007883T1 (sl) | 2012-02-29 |
KR20080111544A (ko) | 2008-12-23 |
JP5129805B2 (ja) | 2013-01-30 |
CA2648792A1 (en) | 2007-11-01 |
CA2648792C (en) | 2016-06-21 |
WO2007123961A3 (en) | 2008-03-06 |
WO2007123961A2 (en) | 2007-11-01 |
RU2008140137A (ru) | 2010-05-27 |
US20070249019A1 (en) | 2007-10-25 |
IL194629A0 (en) | 2011-08-01 |
CN101426905B (zh) | 2013-03-27 |
EP2007883A2 (en) | 2008-12-31 |
PL2007883T3 (pl) | 2012-07-31 |
CR10380A (es) | 2008-12-02 |
AU2007240797B2 (en) | 2013-05-23 |
US7875446B2 (en) | 2011-01-25 |
EP2007883B1 (en) | 2011-12-28 |
AU2007240797A1 (en) | 2007-11-01 |
KR101385927B1 (ko) | 2014-04-24 |
DK2007883T3 (da) | 2012-02-06 |
MX2008013494A (es) | 2009-01-26 |
CN101426905A (zh) | 2009-05-06 |
ATE539149T1 (de) | 2012-01-15 |
BRPI0710820A2 (pt) | 2011-08-23 |
PT2007883E (pt) | 2012-02-17 |
IL194629A (en) | 2013-11-28 |
JP2009534030A (ja) | 2009-09-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2484135C2 (ru) | Способ очистки, предназначенный для получения очищенного вируса везикулярного стоматита из клеточной культуры | |
US11207397B2 (en) | Virus purification | |
US10570376B2 (en) | Method for influenza virus purification | |
US11013794B2 (en) | Method for preparing foot-and-mouth disease vaccines | |
RU2595395C2 (ru) | Способы снижения вирулицидной активности содержащих pcv-2 композиций и содержащие pcv-2 композиции с повышенной иммуногенностью | |
WO2017109211A9 (en) | Chromatography based purification strategies for viruses | |
Sviben et al. | Recovery of infective virus particles in ion-exchange and hydrophobic interaction monolith chromatography is influenced by particle charge and total-to-infective particle ratio | |
EP3371302B1 (en) | Method for the separation of virus compositions including depletion and purification thereof | |
CN105018435A (zh) | 一种病毒样颗粒的纯化方法 | |
WO2022262206A1 (zh) | Gmp级逆转录病毒载体的纯化方法与应用 | |
Kalbfuss-Zimmermann et al. | Viral vaccines purification | |
CN111662883A (zh) | 一种制备及纯化溶瘤病毒的方法及重组溶瘤弹状病毒 | |
RU2445117C2 (ru) | Способ получения комбинированной бивалентной, культуральной, инактивированной, концентрированной, очищенной вакцины для профилактики геморрагической лихорадки с почечным синдромом | |
EA040093B1 (ru) | Технология получения вакцины против геморрагической лихорадки с почечным синдромом | |
RU2120804C1 (ru) | Способ приготовления вакцины против клещевого или японского энцефалита из вирусной суспензии | |
Edeling et al. | Development of methods to purify SARS CoV-2 Virus-like particles at scale | |
WO2023187691A1 (en) | Methods of purifying an enveloped virus | |
RU2067767C1 (ru) | Способ получения субъединичной генноинженерной вакцины против гепатита в |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20140420 |